CN113004375B - 一种高效介导重组多肽形成包涵体的小分子蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种高效介导重组多肽形成包涵体的小分子蛋白。本发明提供的高效介导重组多肽形成包涵体的小分子蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。该小分子蛋白可以作为融合标签提高重组多肽的包涵体表达水平，在介导抗菌多肽等的表达方面效果显著，具有较大的市场价值与应用前景。本发明还提供了一种包涵体分离纯化的方法，该方法操作非常简便，且不影响目的多肽的生物活性，该技术可广泛应用于多肽的工业化生产、纯化及科学研究工作。

Description

一种高效介导重组多肽形成包涵体的小分子蛋白
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种高效介导重组多肽形成包涵体的小分子蛋白。
背景技术
大肠杆菌表达系统是目前使用较广泛的重组蛋白表达系统。该系统培养周期短，培养条件容易满足，不同基因表达产物形成包涵体的能力存在差异。包涵体(inclusionbody，IB)是具有非天然构象的蛋白质聚集体，重组蛋白以包涵体形式存在具有诸多优点，如重组蛋白稳定、抗蛋白酶降解能力增强、简化后续提取纯化工艺、易于毒性蛋白表达等。一些短肽重组表达时极易被蛋白酶降解，使用融合标签协助其形成包涵体，可显著提高其表达量，同时以包涵体形式存在还具有较高的蛋白纯度，因此筛选高效形成包涵体的融合标签具有重要的应用价值。
虽然原核系统中包涵体的表达有众多优势，但是在重组蛋白的表达中，包涵体形式表达的目的蛋白纯化成为难题。从包涵体纯化目的蛋白需要三个步骤：从细胞中提取包涵体，溶解和重新折叠。但是重新折叠非常耗时，也并不是所有溶解蛋白都可以正确地重新折叠。而融合标签对于目的蛋白的表达有一定的促进作用，但是获取目的蛋白时仍然需要去除辅助的融合标签，一般选择在目的蛋白与融合标签之间设计特异性的酶切位点。从包涵体中回收目的蛋白，需要合适的溶解过程，常用的包涵体溶解剂为表面活性剂或变性剂。表面活性剂可以通过破坏疏水键，从而破坏包涵体的蛋白结构，将包涵体溶解；而变性剂的包涵体溶解原理是破坏蛋白内的氢键，促进蛋白的可溶性。有研究表明，偏酸的环境或偏碱的环境中能够有效促进包涵体的溶解，已报道的经典包涵体溶解方法包括盐酸胍溶解、Tris-HCl溶液配合有机溶剂溶解，尿素溶解、强阴离子洗涤剂SDS、强pH环境溶解以及使用物理的方法帮助溶解，后续都需要结合亲和层析纯化、金属催化反应、脱盐、溶解液浓度稀释等，操作繁琐，难以有一个合适的酶切环境去除融合标签，探索酶切包涵体的合适反应条件、简化蛋白分离纯化的操作，是目前研究热点与难点之一。
发明内容
为克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种高效介导重组多肽形成包涵体的小分子蛋白，该小分子蛋白可作为融合标签，能显著提高重组多肽的包涵体的表达水平。
本发明的另一目的在于提供编码上述小分子蛋白的基因。
本发明的再一目的在于提供上述小分子蛋白的应用。
本发明的第四个目的在于提供一种包涵体分离纯化的方法，该方法操作非常简便。
本发明的上述目的通过如下方案予以实现：
一种高效介导重组多肽形成包涵体的小分子蛋白，其氨基酸序列如下所示：
FHLSLQITLTVNPGSLTVQLHLSIQVNPGSVTFQMTVHITFNPGSVTFSWHMTFQF；
编码上述小分子蛋白的基因，其核苷酸序列如下所示：
TTCCACCTGTCTCTGCAGATCACCCTGACCGTTAACCCGGGTTCTCTGACCGTTCAGCTG CACCTGTCTATCCAGGTTAACCCGGGTTCTGTTACCTTCCAGATGACCGTTCACATCACCTTCA ACCCGGGTTCTGTTACCTTCTCTTGGCACATGACCTTCCAGTTC；
所述的小分子蛋白作为融合标签的应用；
所述的小分子蛋白在制备包涵体中的应用；
一种重组表达载体，包含编码上述小分子蛋白的基因的核苷酸序列，用于将目的多肽与其融合表达；
所述的重组表达载体的构建方法，包含如下步骤：
将编码上述小分子蛋白的基因的核苷酸序列、编码目的多肽的基因的核苷酸序列和表达载体融合构建，得到重组表达载体；
所述的表达载体优选为pET系列载体；
一种包含上述重组表达载体的重组表达系统，是将上述重组表达载体转化表达宿主得到；
所述的表达宿主优选为大肠杆菌，进一步优选为大肠杆菌BL21(DE3)；
一种包涵体分离纯化的方法，包含如下步骤：
将上述重组表达载体转化进大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到包含重组表达载体的重组表达系统；然后将其培养至OD600为0.5～0.7，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达并离心收集菌体；然后加入裂解缓冲液悬浮细胞并将其破碎，离心取沉淀，获得表达重组多肽的包涵体并进一步纯化；
所述的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的终浓度优选为0.6mM；
所述的诱导表达的条件优选为37℃诱导表达24h；
所述的离心收集菌体的条件优选为5000g、4℃离心10min；
所述的裂解缓冲液优选为1×Lysis Buffer(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/LNaCl，20mmol/L imidazole，pH＝8.0)；
所述的裂解缓冲液的用量优选为每1g菌体加入100ml裂解缓冲液；
所述的离心取沉淀的条件优选为10000g、4℃离心30min；
所述的纯化的具体操作优选为：
将表达重组多肽的包涵体经乙酸溶液-Tween20溶液溶解后，采用蛋白酶TEV切割融合蛋白、并采用三氟乙酸沉淀和磷酸盐回收目的多肽，进而实现重组多肽的分离纯化；
所述的纯化的具体操作进一步优选为：
按10mg：1ml的比例将表达重组多肽的包涵体与200mmol乙酸溶液混合，，实现包涵体的溶解；溶解样品中按2％体积百分比添加Tween-20，37℃振荡2h进一步促溶；然后调节体系pH至4.5，按10％体积百分比添加蛋白酶TEV，25℃酶切12h；酶切后按20％体积百分比添加4℃的三氟乙酸，离心去上清，使用4℃乙醇洗涤沉淀；最后添加0.1mmol、pH 5.8的磷酸盐缓冲液温浴沉淀，进而实现目的多肽的分离纯化；
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明根据蛋白聚集的结构特点，设计了一个高效介导重组多肽形成包涵体的小分子蛋白(Am)，该小分子蛋白可提高包涵体表达量。本发明参考大肠杆菌密码子的偏好性通过基因合成技术合成其基因，然后将其作为融合标签与目的多肽融合表达，建立大肠杆菌的重组表达系统，获得表达重组多肽的包涵体。本发明提供的Am具有较强的疏水性，显著提高了重组多肽在表达过程中的包涵体形成，并提高重组多肽的表达水平，在介导抗菌多肽等的表达方面效果显著，具有较大的市场价值与应用前景。
(2)本发明提供的包涵体分离纯化的方法包含包涵体溶解与重组多肽的纯化两部分，简化了重组多肽的分离纯化过程，且不影响目的多肽的生物活性，该技术可广泛应用于小肽的工业化生产、纯化及科学研究工作。
(3)本发明提供了一个新的蛋白融合标签与包涵体分离纯化技术，可显著推动蛋白质工程的发展与应用，同时该技术可应用于蛋白质科学，推动该领域的技术进步。
附图说明
图1是菌落PCR鉴定结果图。
图2是18％SDS-PAGE检测重组多肽的表达量结果图，其中，Marker：低分子量蛋白Marker，kDa(千道尔顿)：蛋白分子量单位；1：重组多肽PagP-100-Metch表达24h后收集的菌体；2：重组多肽Am-Metch表达24h后收集的菌体。
图3是利用Image J软件对重组多肽的表达量进行半定量的分析图，其中，以重组多肽PagP-100-Metch表达量定为“1”，Am-Metch表达量与其作比较。
图4是18％SDS-PAGE检测重组多肽在表达过程中的包涵体形成结果图，其中，Marker：低分子量蛋白Marker；1：在大肠杆菌中重组表达24h后收集菌体；2：蛋白表达24h后收集的菌体破碎后上清；3：细胞破碎后分离得到的包涵体(Am-Metch)。
图5是18％SDS-PAGE检测包涵体溶解的效果图，其中，Marker：低分子量蛋白Marker；1：100mM乙酸溶解的包涵体；2：200mM乙酸溶解的包涵体。
图6是Tricine-SDS-PAGE检测重组多肽Am-Metch纯化效果图，其中，Marker：低分子量蛋白Marker；1：重组多肽Am-Metch包涵体；2：包涵体经蛋白酶TEV切割后分离纯化的短肽Metch；3：包涵体经蛋白酶TEV切割后产生的融合标签Am。
图7是纯化的Metch对金黄色葡萄球菌的抑菌实验结果图，其中，1：20μL0.1mmol的pH 5.8磷酸盐缓冲液；2：20μl的0.6mg/ml Metch样品，3、4、5：20μl的1.2mg/ml Metch样品(三次重复)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1pET28b-Am-Metch表达载体的构建
(1)编码高效介导重组多肽形成包涵体的小分子蛋白(Am)的基因的体外合成
根据不同氨基酸的疏水与亲水特性及其形成β折叠的倾向性，优化改造大肠杆菌棕榈酰磷脂转移酶(PagP)的C-末端序列(100-161位氨基酸)(PagP-100)，设计易于形成包涵体的融合标签(Am)，并依照大肠杆菌密码子偏好性设计编码Am的基因的核苷酸序列。其中，编码Am的基因的核苷酸序列由北京睿博生物科技有限公司广州分公司合成。
PagP-100的核苷酸序列：
AATTTTCATTTAGGTCTGGGATTCACCGCTGGCGTAACGGCACGCGATAACTGGAATTACATCCCTCTCCCGGTTCTACTGCCATTGGCCTCCGTGGGTTATGGCCCAGTGACTTTTCAGATGACCTACATTCCGGGTA CCTACAACAATGGCAATGTGTACTTTGCCTGGATGCGCTTTCAGTTT；
Am的氨基酸序列如下所示：
FHLSLQITLTVNPGSLTVQLHLSIQVNPGSVTFQMTVHITFNPGSVTFSWHMTFQF；
编码Am的基因的核苷酸序列如下所示(后续为了酶切，合成时，两侧分别添加了Nco I与EcoR I的酶切位点)：
ccatggTTCCACCTGTCTCTGCAGATCACCCTGACCGTTAACCCGGGTTCTCTGACCGTTC AGCTGCACCTGTCTATCCAGGTTAACCCGGGTTCTGTTACCTTCCAGATGACCGTTCACATCAC CTTCAACCCGGGTTCTGTTACCTTCTCTTGGCACATGACCTTCCAGTTCgaattc；
(2)表达载体pET28b-Am-Metch的构建
抗菌肽Metchnikowin(Metch)基因合成：由NCBI获得该抗菌多肽的氨基酸序列，根据大肠杆菌偏爱的密码子设计其编码基因，同时在其5’端添加编码TEV蛋白酶识别位点(ENLYFQ)的核苷酸序列(GAAAACCTGTACTTTCAG)，该序列两侧分别有EcoR I与HindIII的酶切位点，由北京睿博生物科技有限公司广州分公司合成。
Metch的氨基酸序列如下所示：
HRHQGPIFDTRPSPFNPNQPRPGPIY
Metch的核苷酸序列如下所示：
CACCGTCACCAGGGTCCGATCTTCGACACCCGTCCGTCTCCGTTCAACCCGAACCAGCCGCGTCCGGGTCCGATCTAC
TEV蛋白酶酶切识别位点的氨基酸序列如下所示：
ENLYFQ
TEV蛋白酶酶切识别位点的核苷酸序列如下所示：
GAAAACCTGTACTTTCAG
TEV蛋白酶酶切识别位点+Metch的核苷酸序列如下所示：
gaattcGAAAACCTGTACTTTCAGCACCGTCACCAGGGTCCGATCTTCGACACCCGTCCG TCTCCGTTCAACCCGAACCAGCCGCGTCCGGGTCCGATCTACaagctt
1)使用Takara的限制性内切酶进行酶切：将获得的编码Am的基因的核苷酸序列与表达载体pET28b(购Novagen公司)分别用Nco I与EcoR I酶切，连接获得含Am的表达载体pET28b-Am。
2)使用Takara的限制性内切酶进行酶切：将获得的TEV蛋白酶酶切识别位点+Metch的核苷酸序列与表达载体pET28b-Am分别都用EcoR I与HindIII酶切，连接获得pET28b-Am-Metch表达载体。另，同样方法制备pET28b-PagP-100-Metch表达载体作为对照。
按照下表1配制酶切体系(10μl)，冰上操作，37℃酶切12h。
表1DNA的酶切体系
Figure BDA0002976965620000061
按照Tiangen公司DNA纯化试剂盒说明书纯化回收酶切后酶切产物，使用Takara的T4连接酶，按照摩尔数比(1:2)～(1:4)加入载体和需要连接的目的片段，按照下表(表2)配制连接体系(10μl)，冰上操作，16℃连接12h。菌落PCR、酶切鉴定，测序。
表2DNA体外连接体系
Figure BDA0002976965620000062
通过琼脂糖凝胶电泳进行菌落PCR扩增检测，如图1所示，所得条带大小为460bp左右(pET载体的通用引物扩增，编码基因的两侧增加序列197bp)，说明该菌落为阳性菌落，选取若干阳性菌落扩大培养并提取载体测序，测序结果经鉴定，pET28b-Am-Metch表达载体成功构建。
实施例2诱导重组多肽在大肠杆菌中以包涵体形式表达
将上述构建的pET28b-Am-Metch表达载体与对照pET28b-PagP-100-Metch表达载体(PagP-100替换Am)分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单个克隆，接种至液体LB培养基中培养过夜，按体积比1:100扩大培养至0D600为0.5～0.7，加入终浓度为0.6mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，于37℃诱导蛋白表达24h。在5000g、10min、4℃条件下离心收集菌体，获得表达重组多肽的菌体。
通过18％SDS-PAGE来检测重组多肽的表达情况，结果如图2所示，Am-Metch表达量明显优于PagP-100-Metch。
18％SDS-PAGE检测重组多肽的表达量结果并利用Image J软件对重组多肽的表达量进行半定量分析，结果如图3所示，Am-Metch表达量是PagP-100-Metch表达量的2.8倍。
通过18％SDS-PAGE来检测Am-Metch在表达过程中的包涵体形成情况，结果如图4所示，重组多肽Am-Metch以包涵体形式大量积累。
实施例3包涵体的溶解与目的多肽Metch的分离纯化
(1)以1×Lysis Buffer(50mmol NaH2PO4，300mmol NaCl，20mmol imidazole,pH8.0)悬浮实施例2收集的表达重组多肽的菌体，将其超声破碎，在5000g、30min、4℃条件下，离心取沉淀，获得表达重组多肽的包涵体；
(2)按10mg：1ml的比例将包涵体与100或200mmol乙酸溶液混合，实现包涵体的溶解。通过SDS-PAGE来检测溶解样品中包涵体的溶解情况，如图5所示，200mmol乙酸溶液溶解后Am-Metch包涵体溶解效果良好。
(3)溶解样品中按2％体积百分比添加Tween-20，37℃振荡2h进一步促溶；然后使用NaOH调pH至4.5，按10％体积百分比加入TEV酶，25℃酶切12h，然后按20％体积比的终浓度添加4℃的三氟乙酸沉淀蛋白，离心去上清，使用4℃乙醇洗涤沉淀；最后添加0.1mmol的pH 5.8磷酸盐缓冲液悬浮沉淀，室温放置6h后离心分离上清与沉淀，实现目的多肽的分离纯化(溶解于上清中)。
通过Tricine-SDS-PAGE来检测目的多肽的分离纯化情况，如图6所示，包涵体经溶解、TEV酶切后，可较好地分离融合标签与目的多肽Metch，获得纯化的多肽，纯度达到80％以上。
实施例4纯化多肽Metch的活性检测
(1)将对数生长期的金黄色葡萄球菌(编号ATCC 6538，购自明舟生物)菌液30μL与100mL的半固体培养基(琼脂0.8g/100mL)混匀倒平板，凝固后使用已灭菌的打孔器打孔。
(2)滴加实施例3纯化的目的多肽Metch，点样20μL 0.6mg/ml与1.2mg/ml两种浓度的目的多肽Metch，置于37℃恒温培养箱1～2h，待溶液完全被吸收后将平板倒置继续培养10h，观察抑菌结果。
纯化后的目的多肽Metch活性如图7所示，抑菌效果良好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种高效介导重组多肽形成包涵体的小分子蛋白
<130> 1
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 56
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 高效介导重组多肽形成包涵体的小分子蛋白
<400> 1
Phe His Leu Ser Leu Gln Ile Thr Leu Thr Val Asn Pro Gly Ser Leu
1 5 10 15
Thr Val Gln Leu His Leu Ser Ile Gln Val Asn Pro Gly Ser Val Thr
20 25 30
Phe Gln Met Thr Val His Ile Thr Phe Asn Pro Gly Ser Val Thr Phe
35 40 45
Ser Trp His Met Thr Phe Gln Phe
50 55
<210> 2
<211> 168
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 编码小分子蛋白的基因
<400> 2
ttccacctgt ctctgcagat caccctgacc gttaacccgg gttctctgac cgttcagctg 60
cacctgtcta tccaggttaa cccgggttct gttaccttcc agatgaccgt tcacatcacc 120
ttcaacccgg gttctgttac cttctcttgg cacatgacct tccagttc 168
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<213> Artificial
<220>
<223> PagP-100的核苷酸序列
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aattttcatt taggtctggg attcaccgct ggcgtaacgg cacgcgataa ctggaattac 60
atccctctcc cggttctact gccattggcc tccgtgggtt atggcccagt gacttttcag 120
atgacctaca ttccgggtac ctacaacaat ggcaatgtgt actttgcctg gatgcgcttt 180
cagttt 186
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<220>
<223> Metch的氨基酸序列
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Pro Asn Gln Pro Arg Pro Gly Pro Ile Tyr
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Claims (10)

1. 一种高效介导重组多肽形成包涵体的小分子蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
2. 编码权利要求1所述的小分子蛋白的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.权利要求1所述的小分子蛋白作为表达抗菌肽Metchnikowin的融合标签的应用。
4.权利要求1所述的小分子蛋白在制备抗菌肽Metchnikowin包涵体中的应用。
5.一种重组表达载体，其特征在于包含权利要求2所述的编码小分子蛋白的基因的核苷酸序列，用于将抗菌肽Metchnikowin与其融合表达。
6.权利要求5所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于包含如下步骤：
将权利要求2所述的编码小分子蛋白的基因的核苷酸序列、编码抗菌肽Metchnikowin的基因的核苷酸序列和表达载体融合构建，得到重组表达载体。
7.一种包含重组表达载体的重组表达系统，其特征在于是将权利要求5所述的重组表达载体转化表达宿主得到。
8.一种包涵体分离纯化的方法，其特征在于包含如下步骤：
将权利要求5所述的重组表达载体转化进大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，得到包含重组表达载体的重组表达系统；然后将其培养至OD600为0.5~0.7，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导蛋白表达并离心收集菌体；然后加入裂解缓冲液悬浮细胞并将其破碎，离心取沉淀，获得表达抗菌肽Metchnikowin的包涵体并进一步纯化。
9.根据权利要求8所述的包涵体分离纯化的方法，其特征在于：
所述的纯化的具体操作为：
将表达抗菌肽Metchnikowin的包涵体经乙酸溶液-Tween20溶液溶解后，采用蛋白酶TEV切割融合蛋白、并采用三氟乙酸沉淀和磷酸盐回收目的多肽，进而实现抗菌肽Metchnikowin的分离纯化。
10.根据权利要求9所述的包涵体分离纯化的方法，其特征在于：
所述的纯化的具体操作为：
按10mg：1ml的比例将表达抗菌肽Metchnikowin的包涵体与200 mmol乙酸溶液混合，实现包涵体的溶解；溶解样品中按2%体积百分比添加Tween-20，37℃振荡2h进一步促溶；然后调节体系pH至4.5，按10% 体积百分比添加蛋白酶TEV，25℃酶切12h；酶切后按20%体积百分比添加4℃的三氟乙酸，离心去上清，使用4℃乙醇洗涤沉淀；最后添加0.1 mmol、pH 5.8的磷酸盐缓冲液温浴沉淀，进而实现抗菌肽Metchnikowin的分离纯化。
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