CN117343200B - 一种包含淀粉样核心多肽的融合蛋白、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种包含淀粉样核心多肽的融合蛋白、制备方法及其应用，具体将淀粉样核心作为促表达标签，促进目的蛋白的表达，提高表达量，形成包涵体，可以使原本不易表达的目的蛋白在添加促表达标签后可以进行表达。本申请生产工艺利于目的蛋白下游的分离纯化，有利于药用多肽大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种包含淀粉样核心多肽的融合蛋白、制备方法及其在制备蛋白质聚集体中的应用。
背景技术
在大肠杆菌表达重组蛋白或多肽以可溶性或包涵体形式在细胞内存在，小于100个氨基酸的多肽在重组表达过程中易被大肠杆菌细胞内蛋白酶降解，在表达多肽N端加上促包涵体形成融合标签（inclusion body IB inducer）可以促进表达，促进所表达的高纯度融合蛋白均以不溶性的包涵体形式存在，生成蛋白质聚集体可有效降低宿主细胞中的蛋白酶对融合蛋白的降解作用，有利于目的蛋白的纯化。一般IB inducer 多为疏水氨基酸形成βsheets或α螺旋短肽形成α螺旋束（alpha helix bundle）以促进多肽聚集体形成。
朊病毒是一种特殊的淀粉样蛋白，本不具有感染性和致病性，在某些条件下突变可以产生传染型朊病毒，可以将正常的朊病毒异构为传染型朊病毒，造成蛋白聚集堆积在细胞内，无法被细胞内溶酶体中的蛋白酶分解，在溶酶体中大量积累。朊病毒负责哺乳动物的神经病理学，但它们也可以是功能性的，如酵母朊病毒。这些最后的蛋白质向朊病毒状态的转化是由朊病毒形成结构域(pfd)驱动的，pfd通常是大的、内在无序的、富含谷氨酰胺/天冬酰胺并且缺乏疏水残基。
在大肠杆菌中表达重组酵母朊病毒（prion）完整蛋白，可观测到包涵体形成。通过对酵母朊病毒的深入广泛研究，prion序列中朊病毒形成结构域 PFD（prion formingdomain）对于“催化”蛋白质结构性改变，聚合成纤维状蛋白束起着关键作用。
因此，利用prion开发一种促进目的蛋白表达的促表达标签具有重要的意义。
发明内容
为克服现有技术中存在的不足，本发明提供了一种淀粉样核心多肽作为促表达标签的应用。具体的，所述的淀粉样核心多肽与目的蛋白相连，促进蛋白质聚集体的形成，进而促进目的蛋白的表达。
本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白包含淀粉样核心多肽和目的蛋白，所述的淀粉样核心多肽为SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列。
优选的，所述的淀粉样核心多肽连接在目的蛋白的N端或C端。
优选的，所述的淀粉样核心多肽和目的蛋白直接或间接连接，进一步优选的，所述的淀粉样核心多肽和目的蛋白通过接头序列连接。
优选的，所述的接头序列包括酶切位点，用于分离目的蛋白。例如牛肠激酶酶切序列、SUMO蛋白酶酶切序列、免疫球蛋白降解酶酶切序列或3C蛋白酶酶切序列。
更优选的，所述的接头序列的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
优选的，所述的淀粉样核心多肽促进蛋白质聚集体的形成，进而促进目的蛋白的表达。
优选的，所述的编码淀粉样核心多肽的核苷酸序列包括SEQ ID NO：3或4所示的核苷酸序列、其互补或简并序列，或与SEQ ID NO：3或4具有80%以上同源性的核苷酸序列，并编码具有相同功能的淀粉样核心多肽。
优选的，所述的目的蛋白包括β折叠或α螺旋结构。
在一个具体实施方式中，所述的目的蛋白包括但不限于GLP1、GLP2、PTH或PepM，所述的目的蛋白包括SEQ ID NO：16、18-20任一所示的序列。
本发明的第二方面，提供了一种蛋白质聚集体，所述蛋白质聚集体包括上述的融合蛋白。
优选的，所述蛋白质聚集体不溶于水。
本发明的第三方面，提供了一种生物材料，所述生物材料包括：
（A）一种核酸，所述核酸包含编码上述融合蛋白的核酸分子；
（B）一种载体，所述载体包含（A）所述的核酸；
（C）一种宿主菌，所述宿主菌包含（A）所述的核酸或（B）所述的载体。
优选的， 所述的生物材料表达目的蛋白。
在一个具体实施方式中，所述的目的蛋白包括但不限于GLP1、GLP2、PTH或PepM，所述的目的蛋白包括SEQ ID NO：16、18-20任一所示的序列。
本发明的第四方面，提供了上述生物材料在制备融合蛋白或蛋白质聚集体中的应用。
本发明的第五方面，提供了一种制备上述融合蛋白的方法，所述的方法包括：
1）合成编码所述融合蛋白的基因，构建表达载体，并将表达载体转入宿主菌中；
2）培养宿主菌，表达融合蛋白。
本发明的第六方面，提供了一种制备上述蛋白质聚集体的方法，所述的方法包括：
1）合成编码所述融合蛋白的基因，构建表达载体，并将表达载体转入宿主菌中；
2）培养宿主菌，表达融合蛋白；
3）裂解表达融合蛋白的宿主菌，获得蛋白质聚集体，将所述蛋白质聚集体与所述宿主菌的水溶性内容物分离。
进一步，在本发明第五和/或第六方面，
优选的，所述的步骤2）的方法包括摇瓶表达或高密度发酵。
优选的，所述的摇瓶表达方法包括将宿主菌过夜培养后，继续转接到培养基中并加入诱导剂过夜培养。
优选的，所述的摇瓶表达方法中菌液：培养基的转接比例为1：（50-200），例如1：（50、70、100、120、150、170、200）。更优选的，所述比例为质量比。
优选的，所述的摇瓶表达方法中培养条件为24-37℃（例如24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37℃）、150-250rpm（例如150、180、200、210、220、230、240、250rpm）。
优选的，所述的菌液培养至OD600为1.0-2.0（例如1.0、1.3、1.5、1.7、1.9、2.0）后加入诱导剂。
优选的，所述的诱导剂包括但不限于IPTG、AHL、四环素或阿拉伯糖。
优选的，所述的诱导剂浓度为0.1-1.0 mM（例如0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mM）。
在一个具体实施方式中，所述的步骤2）包括将宿主菌在LB培养基中培养过夜，按照菌液：培养基的1:100比例加入TB培养基中，220rpm 37℃培养至OD600为2.0左右，加入IPTG至终浓度为1mM,诱导重组蛋白表达, 220rpm 37℃诱导过夜。
优选的，所述的高密度发酵方法包括将构建好的宿主菌在发酵罐中进行初步的发酵，通过流加碳源和氮源的方式补充营养成分。
优选的，所述的碳源包括糖类，例如葡萄糖。
优选的，所述的氮源包括有机氮源，例如酵母。
优选的，所述的碳源和氮源比例包括（1-2）：（1-2），例如，1：1、1：1.2、1：1.5、1：2、1.2：1、1.5：1或2：1。
优选的，所述的高密度发酵方法还包括加入其他营养成分，所述的营养成分包括但不限于一水合柠檬酸、硫酸铵、磷酸二氢钾、无水氯化钙、七水合硫酸铁、硫酸镁、以及其他微量元素。
在一个具体实施方式中，高密度发酵培养基包括：酵母浸粉3-18g/L，一水合柠檬酸0 .5-3g/L，硫酸铵3-15g/L，磷酸二氢钾5-12 g/L，无水氯化钙0 .001-0 .01 g/L，七水合硫酸铁0 .02-0 .1g/L，葡萄糖8-12 g/L，硫酸镁5-15g/L以及微量元素储液，补料培养基包括30-50%的葡萄糖和5-25%的酵母浸粉。
优选的，所述的高密度发酵菌液培养至OD600为60-150（例如60、80、100、120、150）后加入诱导剂。
优选的，所述的高密度发酵诱导温度为23-37℃（例如23℃、25℃、30℃、33℃、35℃、37℃）。
优选的，所述的高密度发酵诱导pH为5.5-7.5（例如5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）。
优选的，所述的诱导剂包括但不限于IPTG、AHL、四环素或阿拉伯糖。
优选的，所述的诱导剂浓度为0.1-1.0 mM（例如0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mM）。
优选的，所述的步骤3）包括离心收集菌体，裂解菌体，离心分离蛋白质聚集体。
优选的，所述的裂解菌体方式包括离心、超声、搅拌或共均质匀浆裂菌。
本发明的第七方面，提供了一种淀粉样核心多肽在促进目的蛋白表达中的应用，将编码所述的淀粉样核心多肽的核苷酸序列与编码目的蛋白的核苷酸序列连接，转入宿主菌，在宿主菌中表达包含淀粉样核心多肽和目的蛋白的融合蛋白，所述的淀粉样核心多肽为SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列。
优选的，所述的目的蛋白包括β折叠或α螺旋结构。
优选的，所述的融合蛋白形成蛋白质聚集体。
优选的，所述蛋白质聚集体不溶于水。
优选的，所述的融合蛋白如第一方面所述，或者获得如第二方面所述的蛋白质聚集体。
本发明术语“蛋白质聚集体”是一种包含包涵体的聚集体，蛋白质聚集指错折叠的蛋白质分子间通过疏水作用形成非晶态聚合物的过程。而包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性。
本发明术语“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。
本发明的有益效果：
本申请选取阮病毒蛋白的朊病毒形成结构域中的淀粉样核心作为促表达标签，连接多肽编码基因，插入表达质粒，在大肠杆菌中诱导表达。淀粉样核心促进目的蛋白的表达，提高表达量，形成包涵体，可以使原本不易表达的多肽在添加促表达标签后可以进行表达。本申请生产工艺利于目的蛋白下游的分离纯化，有利于药用多肽，尤其是小分子药用多肽的大规模工业化生产。
附图说明
图1：融合蛋白示意图。
图2：PFD1-5的SDS-PAGE电泳分析结果，其中，S为可溶性蛋白，P为非可溶性蛋白，M为Marker。
图3：GelAnalyzer软件对图2相对应条带分析结果。
图4：GLP1、AC1-GLP1和AC2-GLP1的SDS-PAGE电泳分析结果，其中，T为全菌蛋白，S为可溶性蛋白，P为非可溶性蛋白，M为Marker。
图5：GelAnalyzer软件对图4相对应条带分析结果。
图6：GLP1显微镜下细胞形态。
图7：AC1-GLP1显微镜下细胞形态，箭头所指为包涵体。
图8：AC2-GLP1显微镜下细胞形态，箭头所指为包涵体。
图9：未诱导前细胞形状状态。
图10：AC1高密度流加发酵诱导后细胞形状状态，箭头所指为包涵体。
图11：AC2高密度流加发酵诱导后细胞形状状态，箭头所指为包涵体。
图12：高密度流加发酵后SDS-PAGE电泳分析结果，M为Marker。
图13：GLP2, PTH和PepM多肽在添加AC1和AC2的情况下SDS-PAGE电泳分析结果，其中，T为全菌蛋白，S为可溶性蛋白，P为非可溶性蛋白，M为Marker。
图14：GelAnalyzer软件对图13相对应条带分析结果。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 包含淀粉样核心多肽的融合蛋白的表达
1、融合蛋白设计
本研究首先确定了包含促进目的蛋白表达的融合蛋白的组成，如图1所示。选取不同prion（朊病毒）蛋白的prion formation domain（朊病毒形成结构域）中amyloid core（淀粉样核心）作为促表达标签，通过酶切序列连接多肽表达序列。如选取牛肠激酶酶切序列（氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示：DDDDK，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示），用于在后续纯化操作中去除促表达标签。
2、表达质粒的构建及转化
表达序列经大肠杆菌密码子优化转换为DNA序列，经合成作为目的基因通过NdeI和XhoI插入大肠杆菌表的载体pET11质粒中，通过热激法将表达质粒转化如大肠杆菌BL21(DE3)中。经氨苄抗性筛选得到表达菌株。
3、融合蛋白的表达
（1）摇瓶表达
各表达菌株在加有氨苄抗生素的LB培养基中培养过夜，菌液：培养基按照1:100比例加入到加有氨苄的TB培养基中，220rpm 37℃培养至OD600为2.0左右，加入IPTG至终浓度为1mM,诱导重组蛋白表达, 220rpm 37℃诱导过夜。收集未诱导和诱导过夜后的表达菌体，通过显微镜观察细胞形态；离心收集菌体，进行超声波破壁，离心后对可溶性蛋白及非可溶性蛋白进行SDS-PAGE电泳分析。
具体结果如下：
本研究在amyloid core序列的筛选过程中，首先对选取的12种酵母PFD（wildtype和mutant）amyloid core序列根据其集聚能力（pWaltz Score）进行排序，如表1所示。
表1 amyloid core序列信息
选取评分最高的5个amyloid core序列作为表达标签，测试是否能够促进重组多肽在大肠杆菌中的表达。将这5个amyloid core序列作为多肽促包涵体表达标签连接GLP1进行了表达测试，GLP1氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示。在TB培养基中37℃，1mM IPTG诱导4小时收集菌体。超声裂菌后通过SDS-PAGE电泳分析蛋白表达，发现其中两个序列能明显促进表达，即PFD1和PFD3（图2），具体表达量分析如图3所示。这两个序列能使得表达多肽在大肠杆菌细胞内形成明显包涵体。这两个序列被命名为促表达标签AC1和AC2，其中AC1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，AC2的核苷酸序列如SEQID NO：4所示。
通过GelAnalyzer软件对表达条带进行分析，以marker15kDa条带为100%，计算得出相对表达量如图3所示。
以AC1-GLP1和AC2-GLP1表达为例，具体表达预测结果如表2所示，其中以marker15kDa条带为100%。
表2 融合蛋白预测结果
诱导过夜（22小时）后的SDS-PAGE电泳分析蛋白表达结果如图4所示，对SDS-PAGE电泳结果也进行条带分析，结果见图5。
结果显示GLP1多肽在没有促表达标签时不能表达，AC1和AC2能促进GLP1以包涵体形式表达。对于仅有30个氨基酸残基的短肽GLP1在没有连接amyloid core序列时，在宿主菌中无法检测到该多肽的表达，而增加amyloid core序列后可检测到该多肽的表达。
显微镜观察融合蛋白的表达结果如图6-8所示。显微镜观察细胞形态，所有表达菌种在为诱导之前显微镜下观察均成典型短杆状，细胞内密度分布均匀。诱导过夜后细胞内显微镜下可见由大量重组多肽表达堆叠形成的致密包涵体。
2、高密度发酵
将构建好的重组工程菌株在发酵罐中进行初步的发酵研究，通过流加碳源和氮源的方式补充适量的营养成分，其中，发酵培养基的成分包括：酵母浸粉3-18g/L，一水合柠檬酸0 .5-3g/L，硫酸铵3-15g/L，磷酸二氢钾5-12 g/L，无水氯化钙0 .001-0 .01 g/L，七水合硫酸铁0 .02-0 .1g/L，葡萄糖8-12 g/L，硫酸镁5-15g/L，微量元素储液。
补料培养基的成分包括：30-50%的葡萄糖和5-25%的酵母浸粉。碳源和氮源比例为（1-2）：（1-2），优选为1：1.5，高密度发酵菌液培养至OD600为60-150（优选为100）后，加入1.0mM的IPTG诱导，高密度发酵诱导温度为23-37℃（优选为37℃），高密度发酵诱导pH为5.5-7.5（优选为7.0）。
发酵结果显示目的蛋白同样以包涵体形式表达。显微镜下观察细胞结果如图9-11所示，AC1-GLP1、AC2-GLP2高密度流加发酵诱导前显微镜下观察细胞成杆状，胞质均匀分布，未诱导前细胞形状状态相同。SDS-PAGE电泳分析结果如图12所示，对SDS-PAGE电泳结果进行定量检测。高密度流加发酵后菌液经离心破碎可分离出非可溶性包涵体。AC1每升可表达包涵体湿重61g；AC2每升可表达包涵体湿重33g。
实施例2 淀粉样核心多肽作为促表达标签在其他多肽中的应用
其它多肽如GLP2, PTH和在研多肽PepM在无促表达标签时不能表达，AC1和AC2能促进包涵体形式表达。GLP2氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示，PTH氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示，PepM氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。参照实施例1中的步骤1-3，GLP2, PTH和PepM具体表达预测结果如表3所示，其中以marker 15kDa条带为100%。
表3 GL2，PTH和PepM融合蛋白预测结果
SDS-PAGE电泳分析结果如图13所示，GL2, PTH和PepM多肽在添加AC1和AC2的情况下均能以包涵体形式表达。将SDS-PAGE电泳结果通过GelAnalyzer软件对表达条带进行分析，计算得出相对表达量如图14所示。
结果显示发现针对同样是氨基酸残基比较少的多肽，GLP2（33个氨基酸残基）、PTH（34个氨基酸残基）和PepM（45个氨基酸残基），AC1和AC2片段可以促进GLP2、PTH和PepM以包涵体形式表达。GLP1，GLP2，PTH及PepM结构均以α螺旋为主。以大肠杆菌为宿主的重组表达中，在未加促表达标签时，4个短肽均不能表达。对于GLP1，GLP2，PTH及PepM在没有连接amyloid core序列时，在宿主菌中无法检测到多肽的表达，而增加amyloid core序列后可检测到多肽的表达。
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包含淀粉样核心多肽和目的蛋白，所述的淀粉样核心多肽为SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的淀粉样核心多肽连接在目的蛋白的N端或C端，所述淀粉样核心多肽与目的蛋白直接或者间接连接。
3.一种蛋白质聚集体，其特征在于，所述蛋白质聚集体包括权利要求1-2任一所述的融合蛋白。
4.根据权利要求3所述的蛋白质聚集体，其特征在于，所述蛋白质聚集体不溶于水。
5.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料包括：
（A）一种核酸，所述核酸包含编码权利要求1-2任一所述融合蛋白的核酸分子；
（B）一种载体，所述载体包含（A）所述的核酸；
（C）一种宿主菌，所述宿主菌包含（A）所述的核酸或（B）所述的载体。
6.权利要求5所述的生物材料在制备融合蛋白或蛋白质聚集体中的应用。
7.一种制备权利要求1-2任一所述融合蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括：
1）合成编码所述融合蛋白的基因，构建表达载体，并将表达载体转入宿主菌中；
2）培养宿主菌，表达融合蛋白。
8.一种制备权利要求3-4任一所述蛋白质聚集体的方法，其特征在于，所述的方法包括：
1）合成编码所述融合蛋白的基因，构建表达载体，并将表达载体转入宿主菌中；
2）培养宿主菌，表达融合蛋白；
3）裂解表达融合蛋白的宿主菌，获得蛋白质聚集体，将所述蛋白质聚集体与所述宿主菌的水溶性内容物分离。
9.一种淀粉样核心多肽在促进目的蛋白表达中的应用，其特征在于，将编码所述的淀粉样核心多肽的核苷酸序列与编码目的蛋白的核苷酸序列连接，转入宿主菌，在宿主菌中表达包含淀粉样核心多肽和目的蛋白的融合蛋白，所述的淀粉样核心多肽为SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的融合蛋白如权利要求1-2任一所述，或者获得如权利要求3-4任一所述的蛋白质聚集体。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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