CN102304518A

CN102304518A - 人甲状旁腺激素1-34的制备方法

Info

Publication number: CN102304518A
Application number: CN201110232464A
Authority: CN
Inventors: 范文超; 柳鹏福; 吴黎诚; 刘萍
Original assignee: HUZHOU RESEARCH CENTER OF INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES CHINESE ACADEMY OF SCIENCES
Current assignee: HUZHOU RESEARCH CENTER OF INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES CHINESE ACADEMY OF SCIENCES
Priority date: 2011-08-15
Filing date: 2011-08-15
Publication date: 2012-01-04

Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域，涉及一种基因工程方法构建人甲状旁腺激素1-34重组工程菌，进而发酵、纯化制备人甲状旁腺激素(1-34)的方法。本发明将编码人甲状旁腺激素的基因与硫氧还蛋白标签融合表达，并进一步构建完成能高表达人甲状旁腺激素的基因工程菌；采用在发酵过程中添加IPTG和曲拉通X-100的化学渗透发酵技术，提高蛋白质在发酵过程释放至胞外，有利于其继续合成、避免胞内蛋白酶的攻击，从而促进蛋白高产量胞外积累；同时，针对硫氧还融合蛋白的热稳定性，在发酵到达终点时，对发酵液进行热处理，这样离心后，可以直接从发酵液上清夜中回收得到初步纯化的目标蛋白。

Description

人甲状旁腺激素1-34的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，涉及一种基因工程方法构建人甲状旁腺激素(1-34)重组工程菌，进而发酵、纯化制备人甲状旁腺激素(1-34)的方法。

背景技术

人甲状旁腺素（human parathyroid hormone，称hPTH）是由人甲状旁腺分泌的活性多肽，其主要生理功能是通过调节骨细胞和肾细胞维持血钙平衡，是调节钙磷代谢的重要肽类激素，调节骨吸收和骨合成的速率，影响骨代谢。甲状旁腺激素能高效、选择性地增加成骨细胞的活性及数量而促进骨生长。它不仅可预防雌激素水平下降而导致的骨量丢失，且能逆转骨量丢失，从而可达到治疗骨质疏松的目的。

天然人PTH含有84个氨基酸，简称PTH(1-84)，分子量在9400左右。PTH的氨基端是其活性端，与靶组织受体结合引起生物学效应，只要有PTH氨基端的 1-34个氨基酸片段即有完全的PTH(1-84)活性。人工合成的PTH(1-34)动物和临床试验结果显示其能使骨质疏松的成年大鼠全身钙和骨骼质量增加。

PTH(1-34)的制备主要有化学合成法和基因工程法，其中化学合成 PTH(1-34)成本高、价格昂贵，而且对环境造成有害的影响，不利于大规模生产。用基因重组技术生产的人 PTH(1-34)是解决这个问题的有效途径, 通常将编码PTH的基因克隆到大肠杆菌中，通过大规模发酵基因工程大肠杆菌来大量表达目标蛋白，进而通过分离纯化，得到符合要求的PTH。尽管大肠杆菌表达系统具有稳定性好、易于基因操作及表达量高等优点，这一表达系统也存在缺点。其中一个明显的缺点是大肠杆菌缺乏合适的蛋白质分泌机制，这使得绝大多数在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白只能在胞内积累。外源蛋白在胞内滞留会影响到其继续合成、容易遭受胞内蛋白酶的攻击、也导致后续的分离纯化变得困难。另外，多肽因其分子小，直接表达存在困难，一般需要采用融合表达技术。目前研究采用的融合表达分为自身串联融合表达和与其它载体蛋白融合表达两种，大都在胞内积累，易形成包涵体，而从包涵体复性具有生物活性的蛋白，需要经过一系列的变性复性过程，其代价是非常昂贵的。如何经济有效地利用大肠杆菌来生产小分子量多肽一直是一个难题。

发明内容

本发明的目的是为解决上述技术问题，提供一种人甲状旁腺激素(1-34)的制备方法。

本发明的上述技术目的具体是通过以下技术方案得以实现的：

人甲状旁腺激素(1-34)的制备方法，包括以下步骤：

①设计并合成PTH（1-34）的基因序列，具体序列如下，GGTACCGACGACGACGACAAATCTGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCATAACCTGGGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAGAAACTGCAGGATGTTCACAACTTCTAAGCTT；

②将合成的基因序列用KpnI和HindIII酶切，装载于同样酶切的载体pET32a上，用DNA连接酶连接后，转化大肠杆菌，得到大肠杆菌转化子，抽提该大肠杆菌转化子的质粒，然后构建完成表达载体pET32a-PTH；

③将上述表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3），得到基因工程菌；

④对该基因工程菌进行发酵，发酵过程中加入IPTG和曲拉通X-100；

⑤利用融合蛋白耐高温的特性，将发酵液加热处理，然后离心除去杂蛋白，初步纯化并浓缩目的蛋白；

⑥将浓缩后的目的蛋白加入缓冲液，过层析柱，使得含有6×His标签的融合蛋白得以进一步浓缩，除去杂蛋白，得到高纯度的融合蛋白；

⑦在合适的酶切条件下，利用肠激酶酶切高纯度的融合蛋白，使得融合标签和人甲状旁腺激素（1-34）断裂。

作为上述技术方案的优选，它还包括以下步骤：

⑧经肠激酶酶切后的蛋白，配制成溶液后再过层析柱，使得融合标签与树脂结合，目标产物富集于穿透液中；

⑨收集上述穿透液，过凝胶层析柱，除去残留的肠激酶及其它残留杂蛋白，收集目标产物;

⑩将上述溶液冻干，得到纯的多肽产品。

作为上述技术方案的优选，步骤④中曲拉通X-100的加入量为0.1%(m/V)。

作为上述技术方案的优选，步骤⑥所述中层析柱为Ni²⁺亲和层析柱。

作为上述技术方案的优选，步骤⑧所述中层析柱为Ni²⁺亲和层析柱。

本发明具有以下有益效果：

本发明将编码人甲状旁腺激素的基因与硫氧还蛋白标签融合表达，并进一步构建完成能高表达人甲状旁腺激素的基因工程菌；采用在发酵过程中添加IPTG和曲拉通X-100的化学渗透发酵技术，提高蛋白质在发酵过程释放至胞外，有利于其继续合成、避免胞内蛋白酶的攻击，从而促进蛋白高产量胞外积累；同时，针对硫氧还融合蛋白的热稳定性，在发酵到达终点时，对发酵液进行热处理，这样离心后，可以直接从发酵液上清夜中回收得到初步纯化的目标蛋白。

附图说明

图1为添加了0.1%曲拉通的人甲状旁腺激素(1-34)基因工程菌发酵生长曲线；

图 2为添加了0.1%曲拉通的人甲状旁腺激素(1-34)发酵液上清产量变化曲线。

具体实施方式

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

1）人甲状旁腺激素基因工程菌的构建：

①以人甲状旁腺激素(1-34)（PTH）氨基酸序列为基础，重新设计PTH的基因序列，具体序列如下，下划线的序列即为前后的酶切位点KpnI和HindIII位点，阴影部分的核酸序列对应的氨基酸残基即为肠激酶的识别序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的切割位点

GGTACCGACGACGACGACAAATCTGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCATAACCTGGGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAGAAACTGCAGGATGTTCACAACTTCTAAGCTT；

②将合成的基因序列用KpnI和HindIII从载体上切下，装载于同样酶切的载体pET32a上，用T4 DNA连接酶于16℃连接5小时，转化大肠杆菌。抽提上述大肠杆菌转化子的质粒，酶切验证后，进一步测序验证，构建完成表达载体pET32a-PTH；将上述两种正确的表达载体转入表达宿主大肠杆菌BL21（DE3），得到基因工程菌。

2）人甲状旁腺激素基因工程菌株的发酵

挑取人甲状旁腺激素(1-34)基因工程菌单菌落接种至LB种子培养基中， 37℃摇床培养过夜，将一级种子以5%的接种量接入加入卡那霉素的二级种子培养基，37℃摇床振荡培养至OD₆₀₀3左右，以5%的接种量接至已灭好菌的发酵培养基中。发酵条件为：发酵温度37℃，发酵pH用25%（m/v）的氨水维持在6.8。在OD₆₀₀达到20左右时用0.2mM的IPTG诱导，加入0.1%曲拉通，并将发酵罐降温至25℃培养，确保蛋白的有效折叠。当本底甘油耗完时开始补料采用恒定的流速4.2g/L.H的速率加入补料液液，发酵过程中定时取样测定OD_600，对样品进行离心去菌体并采用考马斯亮蓝法检测样品上清液中可溶总蛋白的含量。如图1，2所示，从图中可以看出上清液中可溶蛋白的产量在24 h时达到最大，浓度为1476 mg/L，此时菌体浓度为OD₆₀₀=89.3。

3）人甲状旁腺激素的分离纯化

组合多种蛋白质纯化技术，从发酵上清液中分离纯化得到高纯度的目标多肽。具体流程为：

利用融合蛋白包含硫氧还蛋白，能耐高温的特性，将发酵液100℃煮15分钟，12 000rpm离心20分钟，大多数杂蛋白会变性沉淀，而目的蛋白仍在上清液中，达到初步纯化目的蛋白的目的；加0.8%的活性炭至热处理后的上清液，室温搅拌半小时，抽滤除去残留的两性剂曲拉通及色素成分；将蛋白加20mM咪唑，流加至镍柱顶端，用5倍体积30mM的咪唑溶液洗涤，再用250mM的咪唑溶液洗脱，使得含有6×His标签的融合蛋白得以浓缩，除去绝大多数杂蛋白，得到高纯度的融合蛋白；将洗脱后的蛋白溶液过凝胶脱盐柱，除去高浓度咪唑，并替换为肠激酶缓冲液；采用的酶切条件为0.1units/50ul 蛋白，酶切时间4小时；酶切后的蛋白溶液再过镍亲和层析柱，使得含有6×His标签的硫氧还蛋白融合标签与亲和层析树脂结合，而目标产物人甲状旁腺激素（1-34）富集于穿透液中；将上述穿透液用Sephacryl　S-200HR凝胶层析进一步纯化，除去残留融合标签、肠激酶等杂蛋白，进一步富集纯化目标，将上述溶液冻干，得纯的多肽产品。

Organization Applicant

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Street : 开发区红丰路1366号

City : 湖州市

State : 浙江省

Country : 中国

PostalCode : 313000

PhoneNumber :

FaxNumber :

EmailAddress :

<110> OrganizationName : 中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心

Application Project

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<120> Title : 基因序列

<130> AppFileReference :

<140> CurrentAppNumber :

<141> CurrentFilingDate : ____-__-__

Sequence

--------

<213> OrganismName : 人工序列

<400> PreSequenceString :

ggtaccgacg acgacgacaa atctgtttct gaaatccagc tgatgcataa cctgggtaaa 60

cacctgaact ctatggaacg tgttgaatgg ctgcgtaaga aactgcagga tgttcacaac 120

ttctaagctt 130

<212> Type : DNA

<211> Length : 130

SequenceName : GGTACCGACGACGACGACAAATCTGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCATAACCTGGGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAGAAACTGCAGGATGTTCACAACTTCTAAGCTT

SequenceDescription :

Claims

1.人甲状旁腺激素的制备方法，包括以下步骤：

①设计并合成PTH1-34的基因序列，具体序列如下，GGTACCGACGACGACGACAAATCTGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCATAACCTGGGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAGAAACTGCAGGATGTTCACAACTTCTAAGCTT；

⑦在合适的酶切条件下，利用肠激酶酶切高纯度的融合蛋白，使得融合标签和人甲状旁腺激素1-34断裂。

2.根据权利要求1所述的人甲状旁腺激素的制备方法，其特征在于，它还包括以下步骤：

⑩将上述溶液冻干，得到纯的多肽产品。

3.根据权利要求1所述的人甲状旁腺激素的制备方法，其特征在于：步骤④中曲拉通X-100的加入量为0.1%。

4.根据权利要求1所述的人甲状旁腺激素的制备方法，其特征在于：步骤⑥所述中层析柱为Ni²⁺亲和层析柱。

5.根据权利要求2所述的人甲状旁腺激素的制备方法，其特征在于：步骤⑧所述中层析柱为Ni²⁺亲和层析柱。