CN110128542A

CN110128542A - Pth融合蛋白、其制备方法、含有其的检测试剂、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN110128542A
Application number: CN201810127224.7A
Authority: CN
Inventors: 饶微; 李婷华; 陈城; 何海华; 李武; 毛龙; 卢东林
Original assignee: Shenzhen New Industries Biomedical Engineering Co Ltd
Current assignee: Shenzhen New Industries Biomedical Engineering Co Ltd
Priority date: 2018-02-08
Filing date: 2018-02-08
Publication date: 2019-08-16
Anticipated expiration: 2038-02-08
Also published as: CN110128542B

Abstract

本发明提供了一种PTH融合蛋白、其制备方法、含有其的检测试剂、试剂盒及应用。该PTH融合蛋白包括：标签序列；以及PTH 1‑84位全长氨基酸序列，其中，标签序列位于PTH1‑84位全长氨基酸序列的C‑末端或N‑末端。通过采用具有标签序列的全长PTH融合蛋白，在与抗体结合时能提供更全面的结合区域，进而提高检测准确性。在此基础上，在本申请优选的实施例中，通过选择特定种类的稳定液，并通过优化各组分之间的含量比例，筛选得到上述全长PTH融合蛋白的稳定液。上述PTH融合蛋白在该稳定液中不仅可以在常温下以液态形式存在，而且能够长期稳定存在，不仅提高了临床检测检测的准确性，而且提高了检测的便利性。

Description

PTH融合蛋白、其制备方法、含有其的检测试剂、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及免疫检测试剂领域，具体而言，涉及一种PTH融合蛋白、其制备方法、含有其的检测试剂、试剂盒及应用。

背景技术

PTH(甲状旁腺激素)可用于诊断高、低钙血症的病因以及区分是否与甲状旁腺有关，还可监测甲状旁腺相关疾病的疗效。PTH通常与血钙联合检测，两者对于了解血钙平衡、甲状旁腺对血钙的反馈机制都有非常重要意义。若PTH与钙严重失衡或长期失衡，医生将采取治疗措施。

PTH由位于甲状腺后方的4个甲状旁腺产生。正常情况下，当机体出现低血钙时甲状旁腺将分泌PTH放入血循环。随后PTH通过可三条途径使血钙上升到正常水平，分别为促进骨骼释放钙；促进肾脏活化维生素D(活化维生素D可增加肠道对钙的吸收)；抑制钙从尿液排出(保钠排磷)。当血钙升高时，PTH的水平下降。当PTH由甲状旁腺释放入血液后，随即会裂解为多种片段(它的半衰期小于5分钟)。

PTH是一种由84个氨基酸组成(亦称PTH(1-84))的肽类激素，在骨代谢的调节中发挥重要的生理作用。PTH的生理功能主要是刺激肾对钙的重吸收、磷的分泌和骨的重建，导致合成和分解作用。临床上如果PTH的分泌量过高，血液中PTH浓度异常，会导致甲旁亢，从而引起骨的脱矿质化。如果PTH的活性片段在较低或中等液量的浓度下长时间作用于骨，则会刺激骨的形成，并且通过诱导骨中的合成作用而有效地治疗骨质疏松症。PTH还可通过细胞膜钙通道对心血管产生作用。研究表明PTH的活性中心位于N端的1-34氨基酸肽段，它通过与肾骨组织中专一性受体结合而发挥作用。

PTH不含半胱氨酸，在体内很不稳定，且含量低，其分离纯化困难。一些报道已经描述了在大肠杆菌中直接表达PTH的方法。如BreyeL和MoreLLe等人尝试在大肠杆菌中直接表达PTH，但由于RNA和蛋白质的不稳定性，因此其制备的PTH产量非常有限(<500μg/L)。另外，Born等人使用前PTH原cDNA的多拷贝质粒实现了截短的PTH(主要是PTH(3-84)和PTH(8-84))的表达，但其几乎不含PTH生物活性。另外一种策略是采用融合蛋白的方法，但目前公开的大多是制备PTH(1-34)融合蛋白，且制备过程中涉及包涵体的提取、复性以及酶切等步骤，相对繁琐。此外，Forsberg采用IgG结合蛋白作为融合伴侣，在大肠杆菌中表达PTH(1-84)，最终得率可以达到5～8mg/L。上述重组表达的方法制备得到的PTH产品均需采用冻干的形式保存。

目前市场上存在的PTH定标品及质控品多采用冻干的方式才能长期保存，而冻干生产工艺复杂，使用需要复融，复融后也需要快速使用，不可长期放置，容易导致实验结果不准确。针对上述问题，目前还没有很好的解决方案。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种PTH融合蛋白、其制备方法、含有其的检测试剂、试剂盒及应用，以提供一种活性更优的PTH全长融合蛋白，从而提高PTH抗原临床检测的准确性。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种PTH融合蛋白，该PTH融合蛋白包括：标签序列；以及PTH 1-84位全长氨基酸序列，其中，标签序列位于PTH 1-84位全长氨基酸序列的C-末端或N-末端。

进一步地，标签序列选自如下任意一种：MBP、NusA、TF、MysB、GST、T7、6*His+T7、TrxA、DsbC、DsbA、IF2、Sumo、3*fLag、Avi、KSI、CKS、SKP、BFR、GrPE、btuF及Ecotin。

根据本发明的第二个方面，提供了一种DNA分子，该DNA分子包括编码上述任一种PTH融合蛋白的DNA序列。

进一步地，上述DNA分子还包括分别位于PTH融合蛋白的DNA序列5’端的连接序列和3’端的连接序列，5′端的连接序列为5′端酶切位点，3′端的连接序列为依次连接的终止密码子和3′端酶切位点；优选地，5′端酶切位点为BamHI酶切位点，3′端酶切位点为XhoI酶切位点，终止密码子为TAA。

根据本发明的第三个方面，提供了一种重组质粒，该重组质粒有效连接有编码上述任一种DNA分子。

根据本发明的第四个方面，提供了一种工程菌，该工程菌含有上述任一种重组质粒。

根据本发明的第五个方面，提供了一种PTH融合蛋白的制备方法，该制备方法包括：人工合成SEQ ID NO:2所示的DNA序列；将DNA序列连接到带有标签序列的表达载体上，构建重组质粒；筛选阳性重组质粒，将阳性重组质粒转化宿主细胞，得到转化细胞；以及诱导转化细胞表达，得到PTH融合蛋白。

进一步地，带有标签序列的表达载体选自如下任意一种：pET-SKP、pET-28a、pET-MBP、pET-NusA、pET-TF、pET-MysB、pET-GST、pET-21a、pET-TrXA、pET-DsbC、pET-DsbA、pET-IF2、pET-Sumo、pET-3*fLag、pET-Avi、pET-KSI、pET-CKS、pET-BFR、pET-GrPE、pET-btuF及pET-Ecotin。

根据本发明的第六个方面，提供了一种PTH检测试剂，该检测试剂包含上述任一种PTH融合蛋白。

进一步地，检测试剂为定标品或质控品。

进一步地，检测试剂还包括稳定融合蛋白的稳定液，优选稳定液包括：基础组分，基础组分包括pH7.2～7.5的磷酸缓冲液；以及稳定组分，稳定组分包括动物血清、糖类、渗透剂及洗涤剂中的至少一种；优选地，动物血清选自山羊血清、牛血清及马血清中的至少一种，糖类选自蔗糖、海藻糖、低聚果糖及葡聚糖中的至少一种，渗透剂选自甘氨酸、精氨酸及脯氨酸中的至少一种，洗涤剂为胆酸、脱氧胆酸、十二烷基硫酸钠、吐温20以及吐温80中的至少一种；更优选地，基础组分包括：20～100mM的磷酸缓冲液、50～100mM NaCl、0.01～1％的螯合剂以及0.01～1％的防腐剂，其中，螯合剂为EDTA或EGTA，防腐剂为NaN₃或300；更优选地，稳定组分包括1～20wt％的胎牛血清、0.1～2M的甘氨酸、0.01～0.2wt％的吐温以及0.5～8wt％的蔗糖或海藻糖；进一步优选，稳定组分包括2～10wt％的胎牛血清、0.2～1M的甘氨酸、0.01～0.1wt％的吐温以及1～5wt％的蔗糖或海藻糖。

根据本发明的第七个方面，提供了一种PTH检测试剂盒，试剂盒包括上述任一种PTH检测试剂。

根据本发明的第八个方面，提供了上述任一种PTH融合蛋白、上述任一种PTH检测试剂或上述任一种试剂盒在PTH抗原临床检测中的应用。

进一步地，该应用包括：将PTH检测融合蛋白作为定标品或质控品，通过半自动免疫分析仪或全自动免疫分析仪对PTH抗原进行临床检测。

应用本发明的技术方案，通过采用具有标签序列的全长PTH融合蛋白，在与抗体结合时能提供更全面的结合区域，进而提高检测准确性。在此基础上，在本申请优选的实施例中，通过选择特定种类的稳定液，并通过优化各组分之间的含量比例，筛选得到上述全长PTH融合蛋白的稳定液。上述PTH融合蛋白在该稳定液中不仅可以在常温下以液态形式存在，而且能够长期稳定存在，不仅提高了临床检测检测的准确性，而且提高了检测的便利性。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了本申请的实施例5中在稳定液A、B、C、D、E、F中NusA-PTH(1-84)融合蛋白的降解率随时间变化的曲线；

图2示出了本申请的实施例6中在稳定液G、H、I、J、K、L中DsbA-PTH(1-84)融合蛋白的降解率随时间变化的曲线；

图3示出了本申请的实施例7中在稳定液M中TF-PTH(1-84)融合蛋白的降解率随时间变化的曲线。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

如背景技术所提到的，正常人体中PTH由甲状旁腺释放入血液后，随即会裂解为多种片段。血清中的片段形式主要为PTH(35-84)和PTH(7-84)。目前的检测样本通常是手臂静脉血，检测方法通常为双抗夹心法。由于存在多种形式的PTH片段，检测PTH时所用的单抗结合区域可能会涉及一个或多个片段。而现有技术中PTH 1-34的融合蛋白无法满足作为定标品或质控品的要求，因为其在检测PTH时能够与单抗结合的区域有限，进而势必对临床检测的准确性有一定的影响。

为了改善现有技术中的上述缺陷，在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种PTH融合蛋白，该PTH融合蛋白包括：标签序列；PTH 1-84位全长氨基酸，其中，标签序列位于PTH1-84位全长氨基酸的C-末端或N-末端。

本申请所提供的上述PTH融合蛋白，一方面保留了PTH蛋白的全长序列，在与抗体结合时能提供更全面的结合区域，进而提高检测准确性；另一方面根据实际需要选择合适的标签序列，既有利于融合蛋白的纯化，又能够使融合蛋白的表达量和活性相对更高。

上述PTH融合蛋白中，标签序列可以从现有的蛋白标签中进行合理选择。在本申请一优选的实施例中，上述标签序列选自如下任意一种：MBP、NusA、TF、MysB、GST、T7、6*His+T7、TrXA、DsbC、DsbA、IF2、Sumo、3*fLag、Avi、KSI、CKS、SKP、BFR、GrPE、btuF及Ecotin。

更优选地，上述标签序列选自NusA、TF、TrXA、DSbC、DsbA、CKS以及SKP相比其它标签序列，上述标签序列具有如下三个方面的优势：(1)标签肽段本身稳定性好；(2)标签肽段能促进目的蛋白结构的正确折叠，比如以分子伴侣或二硫键的形式；(3)标签肽段有易表达、强助溶的效果，利于提高目的蛋白表达效率。采用这些标签序列的融合蛋白在表达纯化后的得率更高。

在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种DNA分子，该DNA分子包括编码上述任一种PTH融合蛋白的DNA序列。

根据上述融合蛋白具体表达所用质粒的需要，可以在编码PTH 1-84位全长氨基酸的DNA序列的5′端和3′端进行合理改造以便能够在该质粒中正确表达。改造包括在5′端和3′端增加酶切位点，以便在需要时能够将PTH 1-84位全长氨基酸序列切割下来进行利用。具体融合蛋白与质粒连接的方式可根据具体情况而定，包括但不限于酶切连接的方式，比如PCR连接的方式。

在一种优选的实施例中，上述DNA分子还包括分别位于PTH融合蛋白的DNA序列的5′端的连接序列和3′端的连接序列，即(该DNA分子从5’端至3’端依次为：5’端连接序列-标签序列-DNA序列-3’端连接序列；或者为5’端连接序列-DNA序列-标签序列-3’端连接序列)其中，5′端的连接序列为5′端酶切位点，3′端的连接序列为依次连接的终止密码子和3′端酶切位点；优选地，5′端酶切位点为BamHI酶切位点，3′端酶切位点为XhoI酶切位点，终止密码子为TAA。上述连接序列的存在，便于在实际使用中根据需要将PTH(1-84)从融合蛋白上切割下来利用。

在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种重组质粒，该重组质粒有效连接有编码上述任一种DNA分子。

在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种工程菌，该工程菌含有上述任一种重组质粒。

本申请的上述DNA分子、重组质粒以及工程菌，均可表达得到本申请的上述全长PTH融合蛋白，在用作PTH定标品之用时，具有提高检测准确性、稳定性的优势，而在作为质控品时，能够准确检测所使用仪器或者试剂的稳定性。

在本申请第五种典型的实施方式中，提供了一种PTH融合蛋白的制备方法，该制备方法包括：人工合成SEQ ID NO:2所示的DNA序列；将DNA序列连接到带有标签序列的表达载体上，构建重组质粒；筛选阳性重组质粒，将阳性重组质粒转化宿主细胞，得到转化细胞；以及诱导转化细胞表达，得到PTH融合蛋白。

上述SEQ ID NO:2所示序列为编码PTH 1-84位全长氨基酸序列以及连接序列的DNA序列，将其与一系列带有不同标签序列的表达载体连接，即可得到一系列的重组质粒。后续通过常规的筛选阳性重组质粒以及诱导表达的步骤，即可获得一系列带有不同标签序列的PTH融合蛋白。

上述制备方法与现有方法类似，在人工合成上述SEQ ID NO:2所示序列之前，还需要根据所欲表达的宿主细胞的种类及其对密码子的偏好性，对编码PTH 1-84位全长氨基酸序列的DNA序列进行密码子优化。

上述制备方法中，带有标签序列的载体可以根据需要从现有的带有标签序列的载体中合理选择得到。在本申请一种优选的实施例中，上述带有标签序列的表达载体选自如下任意一种：pET-SKP、pET-28a、pET-MBP、pET-NusA、pET-TF、pET-MysB、pET-GST、pET-21a、pET-TrXA、pET-DsbC、pET-DsbA、pET-IF2、pET-Sumo、pET-3*fLag、pET-Avi、pET-KSI、pET-CKS、pET-BFR、pET-GrPE、pET-btuF及pET-Ecotin。带有上述标签序列的表达载体有助于提高所表达的融合蛋白的表达量和/或活性。

更优选地，上述带有标签序列的表达载体选自pET-NusA、pET-TF、pET-TrxA、pET-DSbC、pET-DsbA、pET-CKS以及pET-SKP中的任意一种。相比其它标签序列，上述标签序列具有如下三个方面的优势：(1)标签肽段本身稳定性好；(2)标签肽段能促进目的蛋白结构的正确折叠，比如以分子伴侣或二硫键的形式；(3)标签肽段有易表达、强助溶的效果，利于提高目的蛋白表达效率。

在本申请第六种典型的实施方式中，提供了一种PTH检测试剂，检测试剂包含上述任一种PTH融合蛋白。包含上述PTH融合蛋白的检测试剂，由于融合蛋白具有PTH蛋白的全长序列，在与抗体结合时能提供更全面的结合区域，因而能够提高检测准确性。

上述PTH检测试剂，根据实际应用需要，可以作为定标品或者质控品。在本申请一种优选的实施例中，该检测试剂为定标品或质控品。需要说明的是，在作为定标品或质控品等具体使用的检测试剂时，上述PTH融合蛋白通常存在于能够维持其活性或者便于检测其活性的蛋白缓冲液中，比如磷酸缓冲液(PBS缓冲液)中。在一种具体的使用状态下，该PTH融合蛋白存在于50mM的PBS缓冲液(具体配方为：100mM NaCl，0.1％EDTA-2K，0.09％NaN₃，50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4)中，在该缓冲液中存在的PTH融合蛋白能够实现即时的检测。

为了进一步提高上述PTH检测试剂在储存状态下的稳定性，进而提高使用的便利性。在本申请一种优选的实施例中，上述检测试剂还包括稳定融合蛋白的稳定液。在现有的能够实现PTH融合蛋白检测的缓冲液的基础上，任何能够增强其稳定性的成分均可以作为本申请的检测试剂的稳定液的成分。

在本申请另一种优选的实施例中，该稳定液包括：基础组分，基础组分包括pH7.2～7.5的磷酸缓冲液；以及稳定组分，其中稳定组分包括动物血清、渗透剂、糖类、洗涤剂中的至少一种。本申请通过大量的实验验证，在现有的蛋白缓冲液，如磷酸缓冲液的基础上通过添加至少一种上述成分能够提高全长PTH融合蛋白的存储稳定性。

优选地，上述动物血清选自山羊血清、牛血清及马血清中的至少一种，上述糖类选自蔗糖、海藻糖、低聚果糖及葡聚糖中的至少一种，上述渗透剂选自甘氨酸、精氨酸及脯氨酸中的至少一种，上述洗涤剂为胆酸、脱氧胆酸、十二烷基硫酸钠、吐温20以及吐温80中的至少一种。其中，优选聚合度为3～4，分子量为504～667的低聚果糖及葡聚糖。

在本申请一种更优选的实施例中，上述基础组分包括：20～100mM的磷酸缓冲液、50～100mM NaCl、0.01～1％的EDTA(以EDTA-2K，乙二胺四乙酸二钾，或EDTA-2Na，乙二胺四乙酸二钠形式存在)以及0.01～0.01％的NaN₃或300。在本申请一种更优选的实施例中，稳定组分包括1～20％的胎牛血清、0.1～2M的甘氨酸、0.01～0.2％的吐温以及0.5～8％的蔗糖或海藻糖；进一步优选，稳定组分包括2～10％的胎牛血清、0.2～1M的甘氨酸、0.01～0.1％的吐温以及1～5％的蔗糖或海藻糖。上述吐温优选为吐温20和吐温80。

上述稳定液中，％代表质量百分含量，M代表该组分在稳定液中的终浓度，即mol/L。需要注意，全文中％均代表质量百分含量。而且，下文中稳定液M指的是第M种稳定液，其它处M均代表该组分在稳定液中的终浓度，即mol/L。

上述优选的实施例中，通过选择特定种类的稳定液，并通过优化各组分之间的含量比例，使得上述PTH融合蛋白在该稳定液中不仅可以在常温下以液态形式存在，而且能够长期稳定存在。这在临床检测中不仅提高了检测的准确性，而且提高了检测的便利性。

在上述优选的实施例中，根据上述PTH融合蛋白所带标签的不同，其所适用的稳定液也略有不同。在一种更优选的实施例中，对NusA-PTH(1-84)融合蛋白而言，其稳定液(pH7.4)中的基础组分为：50mM的磷酸缓冲液、100mM NaCl、0.1％的EDTA-2K以及0.09％的NaN₃；稳定组分为1～20％的胎牛血清、0.1～2M的甘氨酸、0.05％的吐温20以及5％的蔗糖或海藻糖。进一步优选地，对于NusA-PTH(1-84)融合蛋白而言，其稳定液中的基础组分为：50mM的磷酸缓冲液、100mM NaCl、0.1％的EDTA-2K以及0.09％的NaN₃；稳定组分为2％或10％的胎牛血清、0.2M或1M的甘氨酸、0.05％的吐温20以及5％的蔗糖或海藻糖。

在另一种优选的实施例中，对DsbA-PTH(1-84)融合蛋白而言，其稳定液(pH7.4)中的基础组分为：50mM的磷酸缓冲液、100mM NaCl、0.1％的EDTA-2K以及300；稳定组分为5％的胎牛血清、0.5M的甘氨酸、0.01～0.2％的吐温20以及0.5～8％的蔗糖或海藻糖。进一步优选地，对DsbA-PTH(1-84)融合蛋白而言，其稳定液(pH7.4)中的基础组分为：50mM的磷酸缓冲液、100mM NaCl、0.1％的EDTA-2K以及300；稳定组分为5％的胎牛血清、0.5M的甘氨酸、0.05％或0.1％的吐温20以及1％或5％的蔗糖或海藻糖。

在一种优选的实施例中，TF-PTH(1-84)融合蛋白的最适稳定液中基础组分为：50mM的磷酸缓冲液、100mM NaCl、0.1％的EDTA-2K以及0.09％的NaN₃；稳定组分为10％的胎牛血清、1M的甘氨酸、0.05％的吐温20以及5％的蔗糖或海藻糖。

在一种优选的实施例中，TrxA-PTH(1-84)融合蛋白的最适稳定液中基础组分为：50mM的磷酸缓冲液、100mM NaCl、0.1％的EDTA-2K以及0.09％的NaN₃；稳定组分为8％的胎牛血清、0.5M的甘氨酸、0.05％的吐温20以及3％的蔗糖或海藻糖。

在本申请第七种典型的实施方式中，提供了一种PTH检测试剂盒，试剂盒包括上述任一种PTH检测试剂。含有上述PTH检测试剂的试剂盒，具有检测方便、快速且准确性高的优势。

在本申请第八种典型的实施方式中，提供了上述任一种PTH融合蛋白、任一种PTH检测试剂或任一种试剂盒在PTH抗原临床检测中的应用。在本申请一种优选的实施例中，应用包括：将PTH检测融合蛋白作为定标品或质控品，通过半自动免疫分析仪或全自动免疫分析仪对PTH抗原进行临床检测。定标品由一系列已知浓度的参考品组成，用来为待测试剂提供标准曲线，不同的参考品所制备的标准曲线的灵敏度和稳定性不同。本申请上述PTH融合蛋白作为定标品的应用具有使检测灵敏度高和准确性高的优势。而质控品是专门用于质量控制目的的已知浓度的参考品。本申请上述PTH融合蛋白作为质控品的应用，能够使监测定标的准确性及稳定性更高。

下面将结合具体的实施例详细说明本申请的有益效果。

(一)原材料来源及融合蛋白的检测方法

1实验材料

PTH基因序列由南京金斯瑞公司合成。

2菌株载体

大肠杆菌(E.coLi)DH5α感受态细胞、带有标签的原核系列表达载体(pET-28a、pET-MBP、pET-NusA、pET-TF、pET-MysB、pET-GST、pET-21a、pET-TrXA、pET-DSbC、pET-DSbA、pET-IF2、pET-Sumo、pET-3*flag、pET-Avi、pET-KSI、pET-CKS、pET-BFR、pET-BFR、pET-GrPE、pET-btuF、pET-Ecotin)、原核表达宿主菌BL21(DE3)感受态细胞，由Snibe保存提供。

3实验试液、药品与主要设备

PCR Mix、DNA Marker购自北京全式金生物；T₄DNA连接酶、内切酶BamHI和XhoI、载体通用上下游引物T7和T7ter均购自thermo；DNA操作中所用的DNA提取试液盒、胶回收试液盒、质粒提取试液盒购自Omega公司；氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、IPTG、琼脂糖和琼脂粉购自上海生工。

PTH 1-84(WHO国际标准品)，NIBSC代码：95/646，购自世卫组织生物标准国际实验室。

4融合表达的PTH(1-84)检测方法

检测仪器：深圳市新产业生物医学工程股份有限公司Maglumi 4000P

检测方法：利用化学发光免疫夹心法检测PTH浓度，采用针对PTH的一株单克隆抗体标记ABEI，另一株标记FITC，样本、标准液与ABEI标记的单克隆抗体，FITC标记的单克隆抗体，混匀置37℃孵育15分钟，形成“夹心三明治”，加入包被羊抗FITC抗体的磁性微球，37℃孵育5分钟，外加磁场沉淀，去掉上清液，用洗液清洗沉淀复合物2次，直接进入样品测量室，仪器自动泵入发光底物1(NaOH)和2(H₂O₂)，自动监测3秒钟内发出的相对光强度(RLU)。PTH浓度与RLU成一定的比例关系，仪器自动拟合计算PTH浓度。

检测试液：下列各实施例或对比例中所提供的血清甲状旁腺激素试液盒(化学发光法)。

该试液盒检测PTH(1-84)的线性范围为0～5000pg/mL。

(二)实施例和对比例

实施例1

(一)重组克隆质粒构建

表达PTH(1-84)的DNA序列的设计和人工合成：根据PTH(1-84)氨基酸序列(见SEQID NO:1)，人工合成的编码人甲状旁腺激素1-84蛋白的cDNA序列如SEQ ID NO:2所示，依据大肠杆菌密码子偏爱性，人工合成优化的适合大肠杆菌表达的DNA序列如SEQ ID NO:3所示。合成PTH(1-84)基因时，在该基因的5′端引入BamHI酶切位点，在3′端引入终止密码TAA和XhoI酶切位点。

为便于以后的亚克隆，将合成基因克隆到pUC57-simple质粒上，用于保存该合成的DNA序列。质粒pUC57-simple含有BamHI和XhoI酶切位点。

(二)重组表达质粒和重组工程菌的构建：

1.准备目的基因片段

用DNA抽提试液盒提取含有PTH(1-84)编码序列的pUC57-PTH质粒，用BamHI/XhoI双酶切，在1％的琼脂糖凝胶电泳分离小片段，切下含有11KD左右片段的凝胶，用凝胶DNA回收试液盒回收11KD左右片段，电泳验证后备用。

2.准备表达载体片段

用DNA抽提试液盒提取pET28a(+)质粒DNA，用BamHI/XhoI，1％的琼脂糖凝胶电泳分离大片段，切下含有大片段的凝胶，用凝胶DNA回收试液盒回收大片段，电泳验证后备用。

其余表达质粒pET-28a(+)、pET-MBP、pET-NusA、pET-TF、pET-MysB、pET-GST、pET-21a、pET-TrXA、pET-DsbC、pET-DsbA、pET-IF2、pET-Sumo、pET-3*fLag、pET-Avi、pET-KSI、pET-CKS、pET-BFR、pET-GrPE、pET-btuF、pET-Ecotin，按上述同样的方法回收。

3.构建重组表达质粒pET-PTH(1-84)

将上述步骤1和2准备好的目的基因片段与表达载体片段的DNA片段按不同的摩尔比(2/8、3/7、4/6、5/5)混合均匀，用T4 DNA连接酶在16℃连接30min，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并将转化后的感受态细胞涂布于含有各自抗性的琼脂糖平板上(1％蛋白胨，0.5％酵母膏，1％NaCl及2％琼脂)，37℃培养过夜。

4.阳性重组子筛选

从上述转化平板上，用无菌牙签随机挑取抗性单菌落(即白斑)，进行PCR鉴定。将PCR验证阳性的单菌落接种于5mL LB/抗生素培养液中，提取质粒，进行酶切鉴定，然后进行1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定重组子。

选取PCR和双酶切均为阳性克隆的质粒进行测序，测序工作委托Thermo公司完成。将测序结果进行BLAST分析，以确定DNA片段已经连接到相应的载体上，正确的重组质粒命名为pET-PTH(1-84)。用重组质粒pET-PTH(1-84)DNA转化大肠杆菌BL21(DE3)，所得到的即为用于表达rPTH(1-84)融合蛋白的重组工程菌。

实施例2重组工程菌的诱导表达

选取8个单菌落，挑取阳性单克隆无菌条件下转接到含有10mL LB液体培养基(含抗性)的50mL离心管中，在37℃、220rpm的摇床中过夜(约15个小时)。以1/100的体积转接于350mL LB培养基(含抗性)的1L锥形瓶中，37℃，250rpm恒温振荡器中扩大培养；OD₆₀₀达到0.6时，加入IPTG到终浓度0.3Mm，20℃，180rpm进行诱导表达进行诱导表达，诱导培养20h后离心收集细菌，4℃下10000rpm离心10分钟。收集菌体沉淀，-40℃冰箱保存备用。

实施例3

按实施例1和2，将具有NusA、TF、TrxA、DsbA、DsbC、CKS、SKP等蛋白标签的表达载体分别与目的蛋白PTH(1-84)一起融合表达，分别得到NusA-PTH(1-84)、TF-PTH(1-84)、TrxA-PTH(1-84)、DsbA-PTH(1-84)、DsbC-PTH(1-84)、CKS-PTH(1-84)和SKP-PTH(1-84)等融合蛋白，然后分别用PBS缓冲液(配方：100mM NaCl，0.1％EDTA-2K，0.09％NaN₃，50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4)将制备的含有PTH(1-84)的融合蛋白稀释1000倍，作为储备液。而后将制得的各PTH(1-84)储备液与稀释液分别按1:1、1:3、1:7、1:15、1:31体积比稀释，测定其浓度，并与PTH(1-84)WHO国际标准品比较，最后根据稀释比例计算得到各融合表达PTH(1-84)的原始浓度，即得率。检测结果如下表1所示。

表1.PTH(1-84)融合蛋白得率

注：血清甲状旁腺激素检测试液盒(化学发光法)线性范围为0～5000pg/mL，当检测样品浓度大于5000pg/mL时，结果显示为“＞5000pg/mL”。

表1结果显示：制备的PTH(1-84)融合蛋白的得率为45～65mg/mL，其中得率较高的为NusA-PTH(1-84)和DsbA-PTH(1-84)。

实施例4

相同条件下做PTH(1-84)WHO国际标准品和本发明制备的PTH(1-84)融合蛋白的回收实验。具体操作如下：

将已知浓度的PTH(1-84)WHO国际标准品和本发明制备的PTH(1-84)融合蛋白用PBS缓冲液(配方：100mM NaCl，0.1％EDTA-2K，0.09％NaN₃，50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4)稀释为5000pg/mL，定义为J点浓度，将J点浓度的PTH(1-84)WHO国际标准品以及J点浓度的PTH(1-84)融合蛋白与PBS缓冲液体积比为1:1稀释为I点浓度，按照同样的稀释比例得到H点浓度、G点浓度、F点浓度、E点浓度、D点浓度、C点浓度和B点浓度，A点浓度为PBS缓冲液中PTH浓度，即PTH浓度为0。相同条件下检测各点浓度。检测结果如下表2所示。

表2.

表2结果显示：融合表达的PTH(1-84)与PTH(1-84)WHO标准品按一定比例稀释后，所测得的浓度与目标浓度基本一致，此结果进一步说明本发明制备融合蛋白含有PTH(1-84)。

实施例5

按表3配方分别配制PTH标准品稳定液A、B、C、D、E及F，按照本申请的原核表达PTH的方法制备PTH融合蛋白，用PTH标准品稳定液A、B、C、D、E及F分别将NusA-PTH(1-84)融合蛋白稀释为1500pg/mL，稀释后的标准品溶液平均分为9份，40℃避光放置，每3～4天取1份按上述方法检测PTH浓度，并绘制PTH降解率随时间变化的曲线。

检测结果如图1所示，PTH的降解率随时间的变化曲线反映了PTH标准品的稳定性，从图1中可以看出，稳定液对融合表达的PTH(1-84)标准品有良好的保护效果。其中，标准品稳定液中胎牛血清浓度为2％～10％、甘氨酸浓度为0.2M～1M时(即稳定液B和E)，稳定液的对融合蛋白的稳定效果更好。

表3.PTH稳定液A、B、C、D、E、F组分

实施例6

按表4配方分别配制稳定液G、H、I、J、K、L，按照本申请的原核表达PTH的方法制备PTH融合蛋白。用PTH标准品的稳定液G、H、I、J、K、L分别将DsbA-PTH(1-84)融合蛋白稀释为1500pg/mL，稀释后的标准品溶液平均分为9份，40℃避光放置，每3～4天取1份，检测PTH浓度，并绘制PTH降解率随时间的变化曲线。

检测结果如图2所示，PTH的降解率随时间的变化曲线反映了PTH标准品的稳定性，可见，本申请的上述稳定液对融合表达的PTH(1-84)标准品有良好的保护作用。其中标准品稳定液中糖类浓度为1％～5％，洗涤液浓度0.02％～0.1％时(即稳定液H和J)，PTH降解速率更低。

表4.实施例6-9的稳定液配方

实施例7

按上表4中的配方配制PTH稳定液M，配制方法如下：

20mL PTH标准品稳定液M配制方法如下：向烧杯中加入1mL 1M磷酸钠缓冲液和8mL纯化水，混合，将pH调至7.4±0.1。接着加入0.117g氯化钠、1g蔗糖、1.501g甘氨酸和0.02gEDTA并混合。然后加入0.1mL 10％吐温20溶液并混合。接着，加入2mL胎牛血清并混合、0.2mL 9％的叠氮钠，并再次调节溶液的pH为7.4±0.1。最后用纯化水定容至20mL。

按照本申请的原核表达PTH的方法制备融合表达的PTH融合蛋白，分别用普通PBS缓冲液(配方：100mM NaCl，0.1％EDTA-2K，0.09％NaN₃，50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4)和本申请的PTH标准品稳定液M将融合表达的TF-PTH(1-84)融合蛋白稀释为1500pg/mL，每组稀释后的标准品溶液平均分为9份，40℃避光放置，每3～4天取1份按上述方法检测PTH浓度，并绘制PTH降解率随时间的变化曲线。

检测结果如图3所示，PTH的降解率随时间的变化曲线反映了PTH标准品的稳定性，结果表明融合表达的PTH在稳定液M中的稳定性要明显优于在普通缓冲液中的稳定性。

实施例8

按表4配方配制PTH稳定液N，具体配制方法同实施例7。按照本申请的原核表达PTH的方法制备PTH融合蛋白，用PTH标准品稳定液N融合表达的TrxA-PTH(1-84)融合蛋白分别稀释为50pg/mL、1500pg/mL及2500pg/mL，稀释后的标准品溶液分为两组，每组9份，其中一组2-8℃避光放置，每1～4个月取1份检测PTH浓度。另外一组40℃避光放置，每3～7天取1份检测PTH浓度。检测结果如下表5和表6所示。

表5.2～8℃检测结果

表6.40℃检测结果

从表5和表6中可以看出，将融合表达的TrxA-PTH加入到本申请的液体稳定液中：

在40℃条件下，融合表达的PTH标准品可以至少稳定保存30天；

在2～8℃条件下，融合表达的PTH标准品可以至少稳定保存12个月。

此外，发明人对稳定液中的各种组分对NusA-PTH(1-84)融合蛋白的稳定性的影响分别进行了研究，具体方法同实施例5，各稳定液的具体配方见下表7。

表7：

按表7配方分别配制PTH标准品稳定液1至12，用PTH标准品稳定液1至12分别将NusA-PTH(1-84)融合蛋白稀释为1500pg/mL，同时以普通缓冲液作为对比，同样将NusA-PTH(1-84)融合蛋白稀释为1500pg/mL，稀释后的标准品溶液平均分为9份，40℃避光放置，每3～4天取1份按上述方法检测PTH浓度，并绘制PTH降解率随时间变化的曲线。

检测结果如表8所示，表8示出了NusA-PTH(1-84)融合蛋白的降解率随时间的变化，反映了不同成分的稳定液对维持PTH标准品稳定性的作用。从表8中可以看出，相对于仅由基础组分形成的普通缓冲液，本申请的稳定液1至12对融合表达的NusA-PTH(1-84)标准品有良好的保护效果，稳定效果更佳。

而且，从表8可以看出，标准品的稳定液6、7、8和9，在普通缓冲液的组分基础上，仅增加动物血清、渗透剂、糖类、洗涤剂中的一种，即可获得比普通缓冲液要好的稳定效果。而在增加任意两种的情况下，如稳定液5和10，其对融合蛋白的稳定性效果更好。而在增加三种时，稳定液对该融合蛋白的稳定效果较增加一种或两种好。而同时含有上述稳定组分的稳定液对该融合蛋白的稳定效果最好。其中，动物血清为胎牛血清、糖类为蔗糖/海藻糖、渗透剂为甘氨酸，而洗涤剂为吐温时的稳定液的效果又相对优于动物血清为山羊或马血清、糖类为低聚果糖/葡聚糖、渗透剂为精氨酸/脯氨酸，而洗涤剂为胆酸、脱氧胆酸、十二烷基硫酸钠时的稳定液的效果。

表8：

附：上表中的Ctr代表普通缓冲液。

从以上的描述中，可以看出，本申请上述的实施例通过采用具有标签序列的全长PTH融合蛋白，在与抗体结合时能提供更全面的结合区域，进而提高检测准确性。并且，通过选择特定种类的稳定液，并通过优化各组分之间的含量比例，筛选得到上述全长PTH融合蛋白的稳定液。上述PTH融合蛋白在该稳定液中不仅可以在常温下以液态形式存在，而且能够长期稳定存在，不仅提高了临床检测检测的准确性，而且提高了检测的便利性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司

<120> PTH融合蛋白、其制备方法、含有其的检测试剂、试剂盒及应用

<130> PN82165SZSW

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 84

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser

35 40 45

Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu

50 55 60

Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys

65 70 75 80

Ala Lys Ser Gln

<210> 2

<211> 252

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

tctgtgagtg aaatacagct tatgcataac ctgggaaaac atctgaactc gatggagaga 60

gtagaatggc tgcgtaagaa gctgcaggat gtgcacaatt ttgttgccct tggagctcct 120

ctagctccca gagatgctgg ttcccagagg ccccgaaaaa aggaagacaa tgtcttggtt 180

gagagccatg aaaaaagtct tggagaggca gacaaagctg atgtgaatgt attaactaaa 240

gctaaatccc ag 252

<210> 3

<211> 252

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

tctgtttctg aaatccagct gatgcacaac ctgggtaaac acctgaactc tatggaacgt 60

gttgaatggc tgcgtaaaaa actgcaggac gttcacaact tcgttgctct gggtgctccg 120

ctggctccgc gtgacgctgg ttctcagcgt ccgcgtaaaa aagaagacaa cgttctggtt 180

gaatctcacg aaaaatctct gggtgaagct gacaaagctg acgttaacgt tctgaccaaa 240

gctaaatctc ag 252

Claims

1.一种PTH融合蛋白，其特征在于，所述PTH融合蛋白包括：

标签序列；以及

PTH 1-84位全长氨基酸序列，

其中，所述标签序列位于所述PTH 1-84位全长氨基酸序列的C-末端或N-末端。

2.根据权利要求1所述的PTH融合蛋白，其特征在于，所述标签序列选自如下任意一种：MBP、NusA、TF、MysB、GST、T7、6*His+T7、TrxA、DsbC、DsbA、IF2、Sumo、3*fLag、Avi、KSI、CKS、SKP、BFR、GrPE、btuF及Ecotin。

3.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子包括编码权利要求1或2所述的PTH融合蛋白的DNA序列。

4.根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子还包括分别位于所述PTH融合蛋白的DNA序列5’端的连接序列和3’端的连接序列，所述5′端的连接序列为5′端酶切位点，所述3′端的连接序列为依次连接的终止密码子和3′端酶切位点；

优选地，所述5′端酶切位点为BamHI酶切位点，所述3′端酶切位点为XhoI酶切位点，所述终止密码子为TAA。

5.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒有效连接有编码权利要求3或4所述的DNA分子。

6.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌含有权利要求5所述的重组质粒。

7.一种PTH融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

人工合成SEQ ID NO:2所示的DNA序列；

将所述DNA序列连接到带有标签序列的表达载体上，构建重组质粒；

筛选阳性重组质粒，将所述阳性重组质粒转化宿主细胞，得到转化细胞；以及

诱导所述转化细胞表达，得到所述PTH融合蛋白。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述带有标签序列的表达载体选自如下任意一种：

pET-SKP、pET-28a、pET-MBP、pET-NusA、pET-TF、pET-MysB、pET-GST、pET-21a、pET-TrXA、pET-DsbC、pET-DsbA、pET-IF2、pET-Sumo、pET-3*fLag、pET-Avi、pET-KSI、pET-CKS、pET-BFR、pET-GrPE、pET-btuF及pET-Ecotin。

9.一种PTH检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包含权利要求1或2所述的PTH融合蛋白。

10.根据权利要求9所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂为定标品或质控品。

11.根据权利要求9所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂还包括稳定所述融合蛋白的稳定液，优选所述稳定液包括：

基础组分，所述基础组分包括pH7.2～7.5的磷酸缓冲液；以及

稳定组分，所述稳定组分包括动物血清、糖类、渗透剂及洗涤剂中的至少一种；优选地，所述动物血清选自山羊血清、牛血清及马血清中的至少一种，所述糖类选自蔗糖、海藻糖、低聚果糖及葡聚糖中的至少一种，所述渗透剂选自甘氨酸、精氨酸及脯氨酸中的至少一种，所述洗涤剂为胆酸、脱氧胆酸、十二烷基硫酸钠、吐温20以及吐温80中的至少一种；

更优选地，所述基础组分包括：20～100mM的磷酸缓冲液、50～100mM NaCl、0.01～1％的螯合剂以及0.01～1％的防腐剂，其中，所述螯合剂为EDTA或EGTA，所述防腐剂为NaN₃或 ₃₀₀；

更优选地，所述稳定组分包括1～20wt％的胎牛血清、0.1～2M的甘氨酸、0.01～0.2wt％的吐温以及0.5～8wt％的蔗糖或海藻糖；进一步优选，所述稳定组分包括2～10wt％的胎牛血清、0.2～1M的甘氨酸、0.01～0.1wt％的吐温以及1～5wt％的蔗糖或海藻糖。

12.一种PTH检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求9至11中任一项所述的PTH检测试剂。

13.权利要求1或2所述的PTH融合蛋白、权利要求9至11中任一项所述的PTH检测试剂或权利要求12所述的试剂盒在PTH抗原临床检测中的应用。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述PTH检测融合蛋白作为定标品或质控品，通过半自动免疫分析仪或全自动免疫分析仪对PTH抗原进行临床检测。