CN1861790A - 重组人甲状旁腺激素1－84的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用基因工程技术制备重组人甲状旁腺激素1－84的方法。采用大肠杆菌偏爱密码子，本发明设计合成了rhPTH 1－84的编码序列并构建了载体和工程菌。本发明以可溶形式在大肠杆菌胞质中高效表达含hPTH 1－84完整序列的融合蛋白，融合蛋白经金属螯合层析纯化后，以肠激酶酶切，再经离子交换、凝胶层析等进一步纯化，获得了纯度98％以上的rhPTH 1－84，得率可达300mg/l。

Description

重组人甲状旁腺激素1-84的制备方法

技术领域

本发明涉及甲状旁腺激素1-84的活性蛋白的制备，具体涉及利用基因工程技术制备重组人甲状旁腺激素1-84。

背景技术

人甲状旁腺激素(human parathyroid hormone，hPTH)是由人甲状旁腺主细胞分泌的一种直链肽类激素，成熟肽全长84个氨基酸，是体内重要的调节钙平衡和骨重建的激素，可以作为一种安全有效的治疗骨质疏松药物研究开发。目前治疗骨质疏松症的药物主要破骨细胞抑制剂，只作用于破骨细胞，可减慢或抑制破骨细胞活性，抑制骨的吸收，而对骨的形成作用很差，不能刺激成骨细胞产生强壮的新骨，也不能使已遭受破坏的骨进行骨重建，只能延缓骨吸收速度。因此，这些药物只能预防和稳定而不能治愈骨质疏松症。与之不同，hPTH小剂量间歇给药，可以同时作用于破骨细胞和成骨细胞，刺激净新骨生成，改善骨质量，促进骨重建，hPTH不仅阻止骨的损失，还可以逆转骨丢失，以全新的机制有效治疗骨质疏松。利用多肽合成技术化学全合成hPTH 1-84成本太高，所以采用基因工程技术生产hPTH 1-84是解决问题的有效手段。

先前的研究表明大肠杆菌分泌表达hPTH 1-84产量低，并无实际生产意义。另外，大肠杆菌表达外源蛋白，往往会在氨基端引入甲硫氨酸；hPTH基因5’端含有一个内源核糖体结合位点(iRBS)，可能会被作为翻译的起始位点，导致表达产物含有hPTH 8-84；另外，hPTH的mRNA和蛋白产物对大肠杆菌内源酶敏感，容易降解，所以在非分泌表达hPTH 1-84的研究中，大肠杆菌直接表达hPTH 1-84基因也遇到了产物不均一、产量不高的问题。最有效的直接表达体系是，Oshika，Y等利采用T7启动子，在大肠杆菌系统表达了设计合成的hPTH 1-84基因，表达水平可达100mg/l，纯化后得率为27mg/l。非分泌表达的另一个策略是融合表达，这种策略可以减少mRNA和蛋白降解，也可以排除iRBS对翻译起始的影响。Paulsen，J.等采用lambda噬菌体pR启动子表达beta-半乳糖苷酶-hPTH融合蛋白，经包涵体收集、甲酸裂解、中和复性、反相层析等步骤得到[Pro¹]-hPTH1-84(hPTH 1-84类似物，氨基端引入脯氨酸)，最终得率260mg/l。Forsberg，G.采用IgG结合蛋白作为融合伴侣，在大肠杆菌包内表达可溶的hPTH融合蛋白，经亲和层析、牛凝血酶/枯草芽孢杆菌蛋白酶H64A酶切、阳离子交换层析、凝胶层析和反相层析等得到hPTH 1-84，最终得率为5～8mg/l。现有的rhPTH 1-84制备方法存在的问题是：产量低，大部分为包涵体表达需要复性步骤，纯化步骤中普遍包括反相层析，不易放大生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单、易放大、产量高的利用基因工程技术制备重组人甲状旁腺激素(rhPTH 1-84)的方法，以克服现有技术的不足。

本发明的第一方面，提供了一种编码人甲状旁腺激素1-84蛋白的人工DNA序列(序列表序列1)：

TCTGTGAGTGAAATTCAGCTGATGCATAACCTGGGGAAACATCTGAAC

TCGATGGAGCGTGTAGAATGGCTGCGTAAGAAGCTGCAGGATGTGCA

CAATTTTGTTGCCCTGGGTGCCCCGCTGGCTCCGCGCGATGCTGGTTC

CCAGCGTCCGCGTAAAAAGGAAGACAATGTCTTGGTTGAGAGCCATG

AAAAAAGCCTGGGCGAGGCAGACAAAGCCGATGTGAATGTATTAACT

AAAGCTAAATCCCAG

该编码序列包括252个核苷酸。本序列与hPTH 1-84的cDNA(Hendy，G.N.等，1981)相比，8.3％的碱基和21.4％的密码子发生了改变。设计本序列时，在不改变所编码氨基酸序列前提下，采用大肠杆菌偏爱密码子，适合在大肠杆菌中表达。本发明提供的编码人甲状旁腺激素1-84的DNA序列与目前任何已报道的表达hPTH 1-84的基因均不相同。本序列编码hPTH1-84的氨基酸序列序列如下：

NH₂-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-

Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-

Val-Ala-Leu-Gly-Ala-Pro-Leu-Ala-Pro-Arg-Asp-Ala-Gly-Ser-Gln-Arg-Pro-

Arg-Lys-Lys-Glu-Asp-Asn-Val-Leu-Val-Glu-Ser-His-Glu-Lys-Ser-Leu-Gly-

Glu-Ala-Asp-Lys-Ala-Asp-Val-Leu-Thr-Lys-Ser-Gln-COOH

本发明的第二方面，提供了一种含有hPTH 1-84编码序列、肠激酶识别序列(DDDDK)的编码序列、限制酶识别位点的人工DNA序列(序列表序列2)：

CTGGGTACCGATGACGATGACAAGTCTGTGAGTGAAATTCAGCTGATG

CATAACCTGGGGAAACATCTGAACTCGATGGAGCGTGTAGAATGGCT

GCGTAAGAAGCTGCAGGATGTGCACAATTTTGTTGCCCTGGGTGCCCC

GCTGGCTCCGCGCGATGCTGGTTCCCAGCGTCCGCGTAAAAAGGAAG

ACAATGTCTTGGTTGAGAGCCATGAAAAAAGCCTGGGCGAGGCAGAC

AAAGCCGATGTGAATGTATTAACTAAAGCTAAATCCCAG TGATAAGCT

TGCG

序列2在序列1的5’-端插入CTGGGTACCGATGACGATGACAAG共24个核苷酸的片断，其中GGTACC是限制酶Kpn I识别位点，GATGACGATGACAAG是肠激酶识别位点(DDDDK)的编码序列；3’-端插入TGATAAGCTTGCG共13个核苷酸的片断，该片断包含限制酶Hind III识别位点AAGCTT，同时其中的TGATAA位于阅读框构成终止密码。

本发明的第三方面，提供了一种含有序列2所示的核苷酸序列的表达质粒，序列2所示的核苷酸序列与表达质粒可操作地连接。

在一个优选的方案中，表达质粒选用pET32a(+)，序列2所示的核苷酸序列插入到pET32a(+)的Kpn I和Hind III位点之间，得到pET32a(+)-PTH84质粒。

本发明的第四方面，提供了一种带有pET32a(+)-PTH84质粒的大肠杆菌菌株。

在一个优选的方案中，大肠杆菌菌株选用大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的第五方面，提供了一种表达人甲状旁腺激素1-84活性蛋白的方法，包括如下步骤：

序列2所示的DNA片断和质粒pET32a(+)通过Kpn I和Hind III双酶切连接，转化大肠杆菌受体菌，获得pET32a(+)-PTH84质粒；

将pET32a(+)-PTH84质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达转化子；

培养表达转化子，得到重组甲状旁腺激素1-84融合蛋白。

本发明的第六方面，提供了一种纯化重组人甲状旁腺激素1-84活性蛋白的方法，包括以下步骤：

培养pET32a(+)-PTH84质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)，收集菌体，

破碎；

菌体裂解液进行镍离子螯合层析，收集洗脱液；

上步得到的洗脱液中加入肠激酶进行酶切反应；

酶切反应产物，依次进行阴离子交换层析、阳离子交换层析、凝胶层析，获得人甲状旁腺激素1-84纯品。

本发明设计合成了采用大肠杆菌偏爱密码子，适合在大肠杆菌中表达的rhPTH 1-84编码基因，并在其上游插入了肠激酶识别位点(DDDDK)的编码序列，使得rhPTH 1-84可以在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达，经肠激酶切割后可得到N端正确的rhPTH 1-84活性蛋白，效果优良。

本发明选择质粒pET32a(+)作为表达载体，大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌。由于pET32a(+)含有采用大肠杆菌自身的硫氧还蛋白作为融合伴侣，不仅提高了融合蛋白的可溶性，还使mRNA翻译效率提高，有效避免宿主菌内源酶对mRNA和蛋白本身的攻击。同时，由于BL21(DE3)宿主菌缺乏ompT和Lon蛋白酶，也减少了表达和纯化过程中对蛋白的降解作用。

总体而言，与现有技术相比，本发明的优点是目标蛋白rhPTH 1-84在大肠杆菌细胞内以可溶形式表达，省去复性步骤；纯化步骤中不含反相层析，尽量采用吸附作用层析，处理量，易放大；产量高，最终纯品得率可达300mg/l，具有生产意义，为rhPTH 1-84的工业化生产奠定了基础。

附图说明

图1显示了本发明制备rhPTH 1-84的工艺流程图；

图2显示了质粒pET32a(+)-PTH84构建过程；

图3显示了rhPTH 1-84纯化过程电泳图谱(其中泳道1为菌体裂解上清液；泳道2为亲和层析穿出峰；泳道3为亲和层析洗脱峰；泳道4为肠激酶酶切后混合液；泳道5为DEAE Sepharose FF穿出峰；泳道6为SPSepharose FF洗脱峰；泳道7为Superdex 75洗脱主峰)；

具体实施方式

本发明使用的缩写中，rhPTH 1-84指重组人甲状旁腺激素、Trx指硫氧还蛋白，His tag意为组氨酸纯化标签，pET32a(+)-PTH84指序列2所示的DNA片断和质粒pET32a(+)通过Kpn I和Hind III双酶切连接获得的表达质粒。

其他的技术术语包括：

融合表达

本发明采用pET32a(+)表达载体，把编码人甲状旁腺激素1-84蛋白的基因插入到大肠杆菌自身的蛋白-硫氧还蛋白(Trx)的下游，可以增加目标蛋白表达的溶解性和稳定性。

肠激酶切割

序列2在人甲状旁腺激素编码序列的5’-端插入肠激酶识别位点(DDDDK)的编码序列GATGACGATGACAAG，因此在表达出的融合蛋白中，硫氧还蛋白和rhPTH 1-84之间，带有肠激酶酶切位点DDDDK。融合蛋白经肠激酶切割，可以释放出N端正确加工的rhPTH 1-84蛋白。

金属螯合层析

本发明采用的pET32a(+)表达载体中，融合蛋白包含6个组氨酸组成的His tag，His tag用于金属螯合层析纯化提取融合蛋白，本发明采用Ni²⁺-Chelating Sepharose FF镍离子螯合柱。

本发明所说的“可操作地连接”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连接于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能翻译的位置时，那么它是可操作地连接于编码序列。本发明用于合成rhPTH 1-84基因的PCR引物由上海捷倍思基因技术有限公司合成，肠激酶按Vozza，L.A.等(Production of a recombinant bovineenterokinase catalytic subunit in the methylotrophic yeast Pichia pastoris，Biotechnology(NY)，1996 Jan；14(1)：77-81)公开的方法制备。表达质粒pET32a(+)、大肠杆菌BL21(DE3)以及DH5α均购于Novagen公司，限制性内切酶购于Takara公司，采用的层析介质包括Ni²⁺-Chelating Sepharose FF、DEAE Sepharose FF、SP Sepharose FF以及Superdex 75均购于AmershamBiosciences公司，玻璃层析柱购于华美生物工程公司。

下面结合实施例，对本发明做进一步地说明，其目的仅在于更好的理解本发明而绝非限制本发明的保护范围，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明的权利要求所定义的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：工程菌构建

目的基因合成：目的基因设计如序列2所示，全长289bp。采用交叠延伸聚合酶链反应法(gene splicing by over lap extension PCR，SOE PCR)获得，首先合成以下5个引物(Primer)片断：

Primer1(5’CTGGGTACCGATGACGATGACAAGTCTGTGAGTGAAATTCAGCTGATGCATAACCTGGGGAAACATCTGAACT3’)，

Primer2(5’AAAATTGTGCACATCCTGCAGCTTCTTACGCAGCCATTCTACACGCTCCATCGAGTTCAGATGTTTCCCCAGG3’)，

Primer3(5’TACGCGGACGCTGGGAACCAGCATCGCGCGGAGCCAGCGGGGCACCCAGGGCAACAAAATTGTGCACATCCTGCA3’)，

Primer4(5’TCTGCCTCGCCCAGGCTTTTTTCATGGCTCTCAACCAAGACATTGTCTTCCTTTTTACGCGGACGCTGGGAACCA3’)，

Primer5(5’CGCAAGCTTATCACTGGGATTTAGCTTTAGTTAATACATTCACATCGGCTTTGTCTGCCTCGCCCAGGCTTTT3’).

进行四轮PCR，合成设计序列。第一轮PCR中，primer 1和primer 2被分别用作正义和反义引物。primer 1共73个bp，与设计序列的1～73bp一致；同时primer 2的73bp与设计序列的54～126bp互补。这样，primer 1和primer 2的3’端有20bp是互补的，所以primer 1和primer 2可以互为引物和模板，合成的产物与设计序列的1～126完全一致。第一轮的产物与Primer3(互补于设计序列的107～181bp)的3’端也有20bp是互补的。所以在第二轮PCR中，第一轮的产物与Primer3互为引物和模板，并且将产物延伸到1～181bp。依此类推，用四轮SOE PCR合成了序列2所示的目的基因。

表达载体pET32a(+)-PTH84构建：上述PCR产物和pET32a(+)经过KpnI和Hind III双酶切连接构建成载体pET32a(+)-PTH84，转化至表达宿主E.coli DH5α，筛选阳性克隆，提取质粒经DNA测序确认无误。

工程菌建立：用常规CaCl₂法，将pET32a(+)-PTH84转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，从氨苄抗性菌落中分离获得转化子BL21(DE3)/pET32a(+)-PTH84。工程菌经发酵培养，IPTG诱导，SDS-PAGE检测，所得工程菌细胞质内表达一种分子量为27Kd的融合蛋白，表达量30％。

实施例2：工程菌BL21(DE3)/pET32a(+)-PTH84发酵

发酵在NLF-22发酵罐(BIOENGINEERING，Switzerland)进行，10L培养基接入500ml种子液，控制培养温度30℃，pH7.0，补料恒溶氧(30％)培养，OD600达到35，加入终浓度为0.2mmol的IPTG，诱导3小时终止发酵，收集菌体。

实施例3：rhPTH 1-84纯化

将实施例2得到的菌体悬浮于裂解液(50mM imidazole，pH7.0，20mMPhosphate Buffer(PB))，高压匀质机破壁，离心；上清液过以裂解液平衡的镍离子螯合柱Ni²⁺-Chelating Sepharose FF(Amersham Biosciences，Sweden)，洗脱液(200mM imidazole，pH7.0，20mM PB)洗脱，收集洗脱峰；测定蛋白浓度，稀释至5mg/ml，加入肠激酶至终浓度为0.5U/ml，37℃，24小时；酶解液过DEAE Sepharose FF(Amersham Biosciences)柱(pH7.8，20mM PB)，收集穿出液；调pH至6.5，过SP Sepharose FF(AmershamBiosciences)柱(以pH6.5，20mM PB平衡)，400mM NaCl，pH6.5，20mM PB洗脱，收集洗脱峰；过Superdex-75(Amersham Biosciences)柱(pH7.0，20mMPB)，收集主峰。SDS-PAGE检测为rhPTH 1-84。纯度大于98％，得率可达300mg/l。

实施例4：rhPTH 1-84冷冻干燥制成成品

在一百级的洁净空气环境下，将实施例3得到的rhPTH 1-84纯品，加入医用甘露醇，用pH7.0，20mM PB稀释，至甘露醇终浓度5％，rhPTH 1-84终浓度为0.1mg/ml，0.22μm无菌滤膜过滤，分装至3ml西林瓶，1ml/支，FreeZone 12 Freeze-dry System(Labconco，USA)冷冻干燥48小时。

实施例5：rhPTH 1-84的鉴定和检测

N端和C端氨基酸序列分析

委托中国科学院上海生物化学研究所进行，蛋白序列仪(PE，Inc.，model ABI-491A)。N端15个氨基酸和C端2个氨基酸的氨基酸序列分析结果分别为：NH₂-SVSEIQLMHNLGKHL和SQ-COOH，与理论序列完全一致。

质谱分析

委托中国科学院上海生物化学研究所进行，质谱仪(LCQ-ClassicMALDITOF mass spectrometer)。测得重组PTH 1-84的分子量为9424，与理论分子量9424.3相符。

                                    序列表

<110>华东理工大学

<120>重组人甲状旁腺激素1-84的制备方法

<130>SPI068104

<160>7

<170>Patent In version 3.1

<210>1

<211>252

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<223>编码人甲状旁腺激素1-84

<400>1

TCTGTGAGTG AAATTCAGCT GATGCATAAC CTGGGGAAAC     40

ATCTGAACTC GATGGAGCGT GTAGAATGGC TGCGTAAGAA     80

GCTGCAGGAT GTGCACAATT TTGTTGCCCT GGGTGCCCCG    120

CTGGCTCCGC GCGATGCTGG TTCCCAGCGT CCGCGTAAAA    160

AGGAAGACAA TGTCTTGGTT GAGAGCCATG AAAAAAGCCT    200

GGGCGAGGCA GACAAAGCCG ATGTGAATGT ATTAACTAAA    240

GCTAAATCCC AG                                  252

<210>2

<211>289

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<400>2

CTGGGTACCG ATGACGATGA CAAGTCTGTG AGTGAAATTC     40

AGCTGATGCA TAACCTGGGG AAACATCTGA ACTCGATGGA     80

GCGTGTAGAA TGGCTGCGTA AGAAGCTGCA GGATGTGCAC    120

AATTTTGTTG CCCTGGGTGC CCCGCTGGCT CCGCGCGATG    160

CTGGTTCCCA GCGTCCGCGT AAAAAGGAAG ACAATGTCTT    200

GGTTGAGAGC CATGAAAAAA GCCTGGGCGA GGCAGACAAA    240

GCCGATGTGA ATGTATTAAC TAAAGCTAAA TCCCAGTGAT    280

AAGCTTGCG                                      289

<210>3

<211>73

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<400>3

CTGGGTACCG ATGACGATGA CAAGTCTGTG AGTGAAATTC  40

AGCTGATGCA TAACCTGGGG AAACATCTGA ACT         73

<210>4

<211>73

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<400>4

AAAATTGTGC ACATCCTGCA GCTTCTTACG CAGCCATTCT  40

ACACGCTCCA TCGAGTTCAG ATGTTTCCCC AGG         73

<210>5

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<400>5

TACGCGGACG CTGGGAACCA GCATCGCGCG GAGCCAGCGG  40

GGCACCCAGG GCAACAAAAT TGTGCACATC CTGCA       75

<210>6

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<400>6

TCTGCCTCGC CCAGGCTTTT TTCATGGCTC TCAACCAAGA  40

CATTGTCTTC CTTTTTACGC GGACGCTGGG AACCA       75

<210>7

<211>73

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<400>7

CGCAAGCTTA TCACTGGGAT TTAGCTTTAG TTAATACATT  40

CACATCGGCT TTGTCTGCCT CGCCCAGGCT TTT         73

Claims (8)

1、一种编码人甲状旁腺激素1-84的核苷酸序列，如序列1所示。

2、一种含有人甲状旁腺激素1-84编码序列的核苷酸序列，如序列2所示。

3、一种表达质粒，其特征在于，含有序列2所示的核苷酸序列。

4、如权利要求3所述的表达质粒，其特征在于，序列2插入到pET32a(+)质粒的Kpn I和Hind III限制酶位点之间。

5、一种表达人甲状旁腺激素1-84的大肠杆菌菌株，其特征在于，带有质粒pET32a(+)-PTH84。

6、如权利要求5所述的大肠杆菌菌株，其特征在于，所说的大肠杆菌菌株是大肠杆菌BL21(DE3)。

7、一种表达人甲状旁腺激素1-84活性蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

序列2所示DNA片断和质粒pET32a(+)通过Kpn I和Hind III双酶切连接，转化大肠杆菌受体菌，获得pET32a(+)-PTH84质粒；

将pET32a(+)-PTH84质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达转化子；

培养表达转化子，得到重组甲状旁腺激素1-84融合蛋白。

8、一种纯化重组人甲状旁腺激素1-84活性蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

培养pET32a(+)-PTH84质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)，收集菌体，破碎；

菌体裂解液进行镍离子螯合层析，收集洗脱液；

上步得到的洗脱液中加入肠激酶进行酶切反应；

酶切反应产物，依次进行阴离子交换层析、阳离子交换层析、凝胶层析，获得人甲状旁腺激素1-84纯品。