CN1088107C - 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子制备方法及其表达载体和工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的分泌表达载体，用该分泌型表达载体转化的宿主细胞，以及用上述表达载体的大肠杆菌发酵表达GM-CSF方法。本发明的方法制得的GM-CSF产率高，而且后续的纯化工艺简便有效。

Description

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子制备方法及其表达载体和工程菌

本发明涉及利用重组DNA技术生产蛋白质或多肽药物的领域，更具体地，本发明涉及重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)分泌型制备方法，在该方法中所用的分泌型表达载体、宿主细胞及产品。

集落刺激因子(Colony stimulating factor，CSF)是一类能刺激骨髓多能造血干细胞向各系祖细胞集落分化，并使其发育成为成熟的粒细胞、巨噬细胞等的造血因子。CSF包括多能集落刺激因子(multipotent CSF；IL-3)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)等。其中，GM-CSF是一种在体外具有促进粒单系祖细胞增殖、抑制中性粒细胞运动、增强中性粒细胞趋化、吞噬和增强单核-巨噬细胞抗肿瘤和抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)的糖蛋白(Gasson JC et al.Blood，1991；77：1131-1145)。

体内给予GM-CSF后短时间内，机体常出现外周血白细胞短暂下降，4-6小时内恢复正常，随后可观察到持续性的白细胞增多。白细胞的增多，主要是中性粒细胞，嗜酸性粒细胞和单核细胞的增多，而淋巴细胞仅偶尔有轻度增多。临床上重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rHuGM-CSF)广泛用于癌症放疗化疗(Silver GM et al.Surgery，1989；106：452-455)、骨髓异常增生综合症(Vadhan-Raj Set al.Blood，1989；74：1491-1498)、AIDS(Baldwin GC et al.Blood，1989；74：1673-1667)、骨髓移植(Nemunaitis J et al.Blood，1988；72：834-836)等疾病的治疗或辅助治疗。此外，GM-CSF对慢性和遗传性中性粒细胞缺乏症、寄生虫感染、再生障碍性贫血等亦具有较为显著的疗效。因此，GM-CSF具有广泛的用途。

1985年，直接从人白血病细胞系MO或人T淋巴细胞系T7的cDNA文库中筛选得到了人GM-CSF的DNA序列(Wong GG et al.Science，1985；228：810.Burgess AW et al.J Biol Chem，1977；252：1991-2033)。GM-CSF成为第一个被克隆的刺激造血的细胞因子，也是第一个利用重组DNA技术生产的造血因子(VlichTR et al.Blood，1990；75：846)。

目前已知的制备GM-CSF的方法主要有二种：

(1)利用真核细胞来表达。例如用酵母细胞(中华人民共和国专利公开号CN1097218A)、用COS-1动物细胞来表达(Wong GG et al.Science，1985；228：810)、用CHO细胞(Moonen P et al.Proc Natl Acad Sci USA，1987；84：4428-4431)、或用昆虫细胞(Chiou CJ et al.FEBS Lett，1990；259：249-253.中华人民共和国专利公开号CN1096541A)进行表达。

利用真核细胞表达蛋白的最大优点是表达的蛋白可以部分或完全糖基化，因而更接近天然蛋白构型。但其缺点是表达量普遍较低，而生产成本很高、生产工艺复杂。尽管天然的GM-CSF是糖蛋白，但已经证明非糖基化GM-CSF的生物学活性比糖基化的GM-CSF高4-8倍(Moonen P et al.Proc Natl Acad Sci USA，1987；84：4428-4431.Kaushansky K et al.Biochem，1987；26：4861-4867)。另外用真核细胞表达时，产生的GM-CSF虽可糖基化，但所表达的成分往往不均一，这给下游的纯化工作带来极大不便。

(2)利用大肠杆菌制备GM-CSF。既然糖基化对GM-CSF的生物学活性并无意义，那么用大肠杆菌(E.coli)表达GM-CSF就十分合适。目前大部分重组GM-CSF均是来源于E.coli。

大肠杆菌制备GM-CSF的优点是低成本和高表达。目前使用大肠杆菌制备GM-CSF时，均采用胞浆表达法，所表达的GM-CSF在大肠杆菌胞浆中以不溶性的包含体(inclusion bodies)形式存在(张智清等.病毒学报，1993；9：136-142)。这种表达体系的缺点主要表现在以下两个方面：

(a)在纯化过程中必须使用变性剂或去污剂，需要变性和复性的过程，这给下游的纯化工作带来困难，同时也降低了产品的最终得率；

(b)这种表达体系更大的缺点是使表达的GM-CSF的N端比天然GM-CSF多了一个甲硫氨酸残基(Met)。因此在体内应用时可能会刺激机体产生抗体，从而影响疗效并加大了副作用。

为了克服这一缺点，有人使用融合蛋白的方法表达GM-CSF(中华人民共和国专利公开号CN1108303)，但是这种方法要加入外源的蛋白水解酶，因此必然增加了纯化的难度。

此外，Libby等人研究了人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)在大肠杆菌中的分泌型表达(Libby RT et al.DNA，1987；6：221-229)。他们将GM-CSF序列与外膜信号肽(opmA)融合，置于串联的脂蛋白启动子和乳糖启动子操纵子的控制下。表达的GM-CSF结合于胞膜上，纯化比较困难，表达量也很低，每升发酵液仅能得到几毫克的GM-CSF。

因此，本领域中需要一种方便高效地生产GM-CSF的方法。本发明的目的就是提供这样一种制备GM-CSF的方法，它通过将GM-CSF分泌到细胞外，而简化了后续的纯化步骤，并提高了产率。

为此，本发明提供了一种表达重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的分泌表达载体，该载体含有：重组的人GM-CSF序列、与GM-CSF的编码序列相连接的大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽(ST II)序列、和大肠杆菌碱性磷酸酶(phoA)启动子。

在一个较佳例子中，该载体含有ST II基因的核糖体结合位点序列以及该GM-CSF编码序列来自中国人外周血单个核细胞的PCR扩增产物。

本发明还提供了一种大肠杆菌宿主细胞，它被上述的表达重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的分泌表达载体所转化。

另一方面，本发明还提供了一种制备重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的方法，该方法包括：

在培养条件下，培养被分泌表达载体所转化的大肠杆菌宿主细胞，该分泌表达载体含有：重组的人GM-CSF序列、与GM-CSF的编码序列相连接的大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽(ST II)序列、和大肠杆菌碱性磷酸酶(phoA)启动子，该载体在大肠杆菌中表达时，将GM-CSF分泌至大肠杆菌的胞周质；

分离纯化所表达的该集落刺激因子，得到产物。

图1.是化学法合成ST IISD序列及信号肽序列的示意图。

图2.显示了融合基因pho-ST II-GM-CSF全序列。

图3.显示了融合基因的克隆过程。

图4.是插入了融合基因的pBR322载体的酶切图。其中泳道1为λDNA/HindIII；泳道2为pHuGM CSF/PvuII；泳道3为pHuGM CSF/BamHI；泳道4为pHuGM CSF/SpeI；泳道5为pHuGM CSF/SpeI+BamHI；泳道6为pHuGMCSF/HindIII；泳道7为pHuGM CSF/SalI；泳道8为pHuGM CSF/EcoRI；和泳道1为λDNA/HindIII(分子量标记物)。

图5.是在本发明的一种转化的大肠杆菌宿主细胞W3110/pHuGM CSF在发酵后，细菌胞质中的GM-CSF电泳分析图。图中从右至左依次为泳道1-8，其中泳道1为发酵20小时；泳道2为发酵22小时；泳道3为发酵24小时；泳道4为发酵26小时；泳道5为发酵28小时；泳道6为发酵30小时；泳道7为发酵32小时；泳道8为发酵34小时；泳道9为发酵18小时。

图6是对GM-CSF的纯化各步骤的SDS-PAGE电泳分析图。图中从左至右依次为泳道1-4，最右侧为分子量标记物(低分子量蛋白)。其中泳道1为GM-CSF粗提后；泳道2为Sepharose DEAE FF纯化后；泳道3为Phenyl-sepharose HP纯化后；泳道4为Sephacryl S-200纯化后。

图7是.纯化后GM-CSF HPLC图谱

图8是纯化后GM-CSF的SDS-PAGE电泳图。图中从左至右依次为泳道1-3，最右侧为分子量标记物(低分子量蛋白)。泳道1-3为不同批次纯化的GM-CSF。

本发明的发明者是根据GM-CSF的理化性质及结构特点，通过多年研究，完成了本发明。该发明的基本过程如下：通过反转录PCR(RT-PCR)从中国人外周血单个核细胞中克隆到人的GM-CSF cDNA，与ST II信号肽序列融合并置于phoA启动子下游，然后将此表达单元克隆到载体pBR322中，构建出表达重组人GM-CSF的分泌型载体，转化大肠杆菌，筛选出所需的转化细胞。制备分泌型GM-CSF时，用高密度发酵方法发酵转化的大肠杆菌，然后采用粗提、DEAE阴离子层析、苯基琼脂糖凝胶(Phenyl Sepharose)HP疏水层析、凝集过滤等分离步骤提纯GM-CSF。

近年来，人们对大肠杆菌分泌型表达重组蛋白分子的生物技术越来越重视，并已成功地表达了几种活性的免疫分子。大肠杆菌分泌型表达的原理是：将目的蛋白的编码序列融合到信号肽编码序列之后，表达产物在通过大肠杆菌细胞内膜分泌至胞周质(periplasmic space)时，信号肽可被信号肽酶正确识别并切除。分泌后的外源蛋白不含N端甲硫氨酸，并已经空间折叠(包括形成二硫键)成具有天然构象的活性蛋白，无需后续的复性过程，从而简化了生产工艺。另外，蓄积在胞周质的外源蛋白避免了细胞内一些蛋白酶的降解，因而更加稳定。

本发明的发明人经过多年研究，通过筛选，发现了可用于分泌表达GM-CSF的最佳启动子和信号肽，即大肠杆菌的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，phoA)启动子和大肠杆菌耐热型肠毒素II(heat-stable enterotoxin II，STII)信号肽。

大肠杆菌的碱性磷酸酶(phoA)启动子是化学诱导性强启动子(Chang C et al.Gene，1986；44：121-125)，目前已经在分泌型表达外源蛋白中被选用。phoA位于细菌胞周质，参与细菌磷酸代谢，在外界磷酸盐供应充足时，phoA的合成受抑制；而在外界磷酸盐供应不足，达到一定的程度，就启动phoA系统来合成phoA。合成的phoA被跨膜运输到胞周质，因此phoA启动子十分易于调控。利用phoA的分泌型表达及其启动子的化学诱导性，将外源cDNA置于phoA启动子及其信号肽下游，可构建成分泌型原核表达载体。目前应用该类分泌型载体已成功表达了人生长激素(Gray GL et al.Gene，1985；39：247-254)、人表皮生长因子(Oka T et al.Proc Natl Acad Sci USA，1985；7212-7216)和α干扰素(Miyake T et al.J Biochem，a985；97：1429-1436)，所表达的蛋白具有正确的氨基酸序列及生物学活性，但是此表达体系的不足之处是表达水平较低，往往不适合于大规模生产。但还没有人将其用于表达GM-CSF。

大肠杆菌耐热型肠毒素II(heat-stable enterotoxin II，STII)是产毒素性大肠杆菌产生的一种分泌型蛋白，其信号肽含23个氨基酸残基，成熟蛋白由48个氨基酸残基组成(Picken R et al.Infect Immunol，1983；42：269-275)，含有4个半胱氨酸(Cys)，可形成两对二硫键。研究表明只有形成正确的二硫键，STII蛋白分子才被分泌到胞周质，这样就保证了蛋白分子构型的准确性。此外，以ST II作信号肽时表达率较高而且形成的蛋白分子绝大部分被分泌到胞周质，因此尽管STII的表达调控机理还不十分明确，已有实验室将其作为信号肽来构建分泌型表达载体，以表达人源化的基因工程抗体(Cater P et al.Bio/technology，1992；10：163-167.Zhu Z et al.Biotechnoplogy，1996；14：192-196)。

通过合并phoA启动子、ST II信号肽以及GM-CSF编码序列，本发明人获得了一种hGM-CSF分泌型表达载体。这种载体充分发挥了phoA启动子和ST II信号肽的优点并消除了各自的缺点，从而可分泌表达hGM-CSF。利用该载体制备GM-CSF的方法具有产量高，下游纯化工作简便等突出优点。

为了获得构建分泌型表达载体的几个构件，首先根据已知的phoA启动子的序列，合成用PCR引物，用PCR的方法从大肠杆菌XL-1 Blue菌株的基因组DNA中克隆phoA启动子。根据ST II的序列，采用化学合成的方法分6个片断合成ST II全序列。采用中国人外周血单个核细胞作为人GM-CSF基因的来源，用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法获得编码GM-CSF的cDNA，经核酸测序证明序列正确后，将上述三个构件连接成一个融合基因，插入pBR322载体中，完成了GM-CSF分泌型表达载体pHuGMCSF的构建。

可用于本发明的宿主细胞宜为原核细胞，更佳地为大肠杆菌，最佳地为大肠杆菌K12的W3110菌株。

表达载体的转化可采用常规的方法，用载体pHuGMCSF转化W3110细菌，经过反复筛选和表达分析，获得高表达GM-CSF的生产菌株W3110/pHuGMCSF。

可用多种方法使转化表达载体的菌株W3110/pHuGMCSF表达GM-CSF。在下面的实施例4给出了一个优选方案。其中对培养基中的磷酸盐控制极为重要，合适的磷酸盐浓度既可使细菌生长至较高的浓度，同时也可使GM-CSF表达率也较高。当培养发酵时间一般为20-40小时，更佳地为24-36小时；PH可在5.8-7.8之间，更佳地为6.0-7.6之间时，GM-CSF均有较好的表达。最佳的发酵时间为28-32小时，PH值为6.5-7.2，此时可得到数倍于包含体表达法的产量。

随后的纯化工艺设计可以充分利用分泌型表达的优点。在从大肠杆菌中提取GM-CSF时，采用了冻融低渗法，这样可在十分温和的方法下使GM-CSF释放出来。既有利于保持GM-CSF的活性，又有利于纯化，因为细菌结构蛋白并受到破坏。

后续的纯化方法可以采用温和的纯化手段在温和的条件下完成。选用本领域中常规的纯化方法。在本发明的一个实施例中，纯化方案中使用了DEAE阴离子层析、苯基琼脂糖凝胶HP疏水层析、凝集过滤等液相色谱方法，经过合理组合，使整个纯化容易快速，最终得到的GM-CSF纯度大于98％。这一结果在进一步的鉴定中得到了证实。

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而并非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 phoA启动子-STII信号肽-GM-CSF融合基因的构建

(一)、细菌碱性磷酸酶启动子(phoA)的克隆

用PCR方法从XL-1 Blue菌株的细菌基因组DNA中克隆phoA启动子。采用溶菌酶处理、SDS裂解、酚抽提和透析方法，从XL-1 Blue细菌制备细菌基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增。所用的上游引物为：5′GT GAA TTC AAC TTC TCC ATA CTT TGG ATA AGG AAA3′(含EcoRI位点)，

下游引物为：5′GT ACT AGT TAC AAA TAC ATT AAA AAA TAA AAA3′(含SpeI位点)。

PCR产物经EcoRI/SpeI双酶切后，低融点胶回收备用。

(二)、ST IISD序列及信号肽的化学合成

1.化学合成ST IISD序列及信号肽的设计

如图1，设计末端碱基互补的6个小片段，每个片段32-36个bp，在片段划分时，正负链间有6个碱基互补，利于片段的正确连接，连成的完整片段包括：翻译增强子、SD序列和STII的23个氨基酸残基组成的完整信号肽编码序列。5’末端和3’末端分别设计SpeI和NsiI位点。信号肽的氨基酸序列为

Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser Ile Ala ThrAsn Ala Tyr Ala。

2.寡核苷酸的合成与纯化：用固相亚磷酰胺法合成，经PAGE纯化。

3.连接：取寡核苷酸片段(除5’端的2个片段)各0.2OD，于含T4多核苷酸激酶和ATP的20μl反应体系中，37℃温育1小时进行5′末端磷酸化；将磷酸化的小片段与未磷酸化的5′端两片段等摩尔混合，90℃退火，自然冷却至室温，然后加入pGEM-5Zf(Promega)的SpeI/NsiI大片段、T4 DNA连接酶及其缓冲液，于12℃连接过夜，转化XL-1 Blue细菌，筛选阳性转化子。

(三)、人GM-CSF cDNA的克隆

从活化的中国健康成人外周血单个核细胞RT-PCR克隆人GM-CSF cDNA。

1.富含GM-CSF mRNA细胞的诱生

经Ficoll-Paque梯度离心从正常成人外周血分离出单个核细胞，用Hanks缓冲液洗三遍后，置于含10μg/mlPHA(Sigma)，10％小牛血清的RPMI1640完全培养基中(细胞浓度为1×10⁶/ml)，在37℃，5％CO₂中培养3天，然后在1000U/mlIL-2中连续培养14天，每3天换液一次，最后再用10μg/ml的PHA继续培养3天后，收获细胞。

2.细胞mRNA的制备：采用异硫氰酸胍一步法抽提细胞总RNA，经OligodT12柱纯化mRNA。

3.反转录引物设计：所用的引物可克隆到包括完整3’非编码区序列的GM-CSF cDNA。为了便于后续克隆，设计5’端含SalI、EcoRI位点的Oligo dT引物5’GT GAA TTC TCG AGC TCG TAC GAC CTT TTT TTT TTT TT3’用于反转录。PCR扩增的上游引物为5’CT GCA GCA CCC GCC CGC TCG CCC AG3’(含与NsiI匹配的PstI位点)，下游引物用反转录引物，扩增出的片段长约720bp。

GM-CSF PCR产物经PstI酶切后，5’端的第二个GCA与STII信号肽的最后一个氨基酸的编码DNA相连，从而编码人GM-CSF成熟蛋白的第一个氨基酸(Ala)，因此信号肽切除后分泌的GM-CSF氨基末端不含Met，而与天然GM-CSF相一致。

(四)、融合基因的连接

phoA PCR产物的EcoRI/SpeI片段、STII的SpeI/NsiI片段和人GM-CSF的PstI/EcoRI三个片段以等摩尔混合，与去磷酸化的pUC18载体EcoRI大片段连接，克隆到pUC18载体，构建成重组载体pUC18-pho-STGM，其中含融合基因pho-ST-GMCSF。同时构建了pUC18-ST-hGM亚克隆，用于核酸测序。经全自动测序分析，融合基因的序列正确(参见图2)。

实施例2、分泌型GM-CSF表达载体的构建

选择pBR322多拷贝载体，按图3所示的克隆过程，将融合基因插入其EcoRI位点。如图4所示，经HindIII酶切鉴定出正确的重组载体。正向插入的重组载体可切出1.2kb左右的小片段。

实施例3.工程菌的建立

选用大肠杆菌W3110菌株(ATCC27325)为宿主菌，其基因型为F-mcrA mcrBIN(rrnD-rrnE)。用CaCl₂制备成感受态细菌，将pHuGMCSF重组表达载体转入大肠杆菌W3110，建立人GM-CSF分泌型表达的工程菌W3110/pHuGMCSF。原始菌种用含15％甘油的LB培养基保存于-70℃，每支1.0ml。工程菌在LB软琼脂平板上生长呈典型的大肠杆菌菌落特征。为检查工程菌的稳定性，每传20代作一次酶切图谱分析，结果与原始菌种一致，证明本发明中的工程菌是很稳定的。该大肠杆菌(Escherichia coli)菌株W3110/pHuGM CSF于1997年10月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，中国，武汉市，保藏号为CCTCCNo.：M97024。

实施例4.发酵

种子培养：

保存的菌种，接种入含5μg/ml四环素的LB培养基中，250ml的培养基放入1L的培养瓶中，摇床中培养，培养温度30℃，转速为200rpm，培养时间为15小时，培养后OD600光吸收在2.5左右。

发酵罐培养：

发酵培养基

酪蛋白水解氨基酸             10.0g/L

酵母提取物                   2.0g/L

葡萄糖                       2.5g/L

(NH₄)₂SO₄                5.0g/L

NaH₂PO₄·2H₂O            1.3g/L

K₂HPO₄·3H₂O             2.6g/L

一水合柠檬酸三钠                    1.0g/L

MgSO₄·7H₂O                      2.42g/L

四环素                              5mg/l

微量元素添加物

FeCl₃·6H₂O                      16.90g

ZnSO₄·7H₂O                      2.88g

MnSO·H₂O                         1.69g

CuSO₄·5H₂O                      2.50g

CoCl₂·6H₂O                      2.38g

H₃BO₃                            0.62g

NaMoO·2H₂O                       2.42g

上述物质溶于500ml 0.1N的HCl中，过滤除菌。

发酵过程补料

葡萄糖                             100-200g/L

上述培养基中蛋白胨、酵母提取物和(NH₄)₂SO₄、NaH₂PO₄、K₂HPO₄、柠檬酸钠、MgSO₄等盐类混合后，发酵罐中高压灭菌。用前无菌加入四环素终浓度为5mg/l，微量元素1ml/l，葡萄糖2.5g/l。

发酵参数为：培养温度30℃；PH值使用NH₃H₂O控制在6.9；罐压3.45×10⁴Pa(5 PSI)，通气量每升发酵培养基1l/min；溶解氧控制在20％以上，可通过提高搅拌速率或通入纯氧来控制；搅拌速率起始为400rpm，以后与溶解氧参数级联控制。

发酵时以2％的比例在发酵罐中无菌加入种子培养基，发酵3小时左右葡萄糖基本耗尽时，加入葡萄糖，加入速率根据细菌生长速率来调整。发酵过程中加入消泡剂Antifoam 204(Sigma)消泡。

发酵过程中不断监测细菌的生长状况，发酵30小时左右当细菌生长至OD₆₀₀光吸收为130左右光密度不再增加时，使用Hitachi连续流离心机离心收集细菌，每升最终发酵培养物可得到约85-130g湿菌，冻存于-70℃保存备用。

此外，在发酵过程中的不同时间取样，进行SDS-PAGE电泳分析，检测GM-CSF的表达量，发现在发酵30小时左右时的GM-CSF表达量最高(图5)。

实施例5.纯化

GM-CSF的粗提

粗提缓冲液为2mM EDTA，20mM PB PH7.4。粗提方法：从-70℃取出菌体，按每克湿菌加入10ml上述缓冲液，悬浮细菌，放在4℃振荡1h，悬液经4℃，12000g，20min离心后收集上清，上清经5μm滤膜正压过滤后，即为GM-CSF提取液。

离子交换层析

层析介质为Pharmacia公司的DEAE FF阴离子交换填料，柱体积为7.5cm×6cm。柱子经缓冲液A(20mM PB PH7.4)充分平衡后，将GM-CSF粗提液以10ml/min流速上样，改用20ml/min流速，以20％缓冲液B(1M NaCl，20mM PBPH7.4)洗柱至280nm紫外吸收到基线，再以30％缓冲液B洗柱，收集洗脱蛋白峰。

疏水层析

填料为Pharmacia公司的Phenyl-Sepharose HP，柱体积为3.5×12cm。柱经平衡缓冲液A(1.5M(NH₄)₂SO₄，20mM PB PH7.4)充分平衡。离子交换层析得到的组分中加入固体(NH₄)₂SO₄，使其终浓度为1.5M，离心去沉淀后以5ml/min流速上样，改用10ml/min流速，以40％缓冲液B(20mM PB PH7.4)洗柱至280nm紫外吸收到基线，再作40-60％B线性梯度洗脱，收集GM-CSF活性蛋白峰。

超滤浓缩

把疏水层析得到的GM-CSF活性组份，在Minitan超滤器上用PTGC滤膜(MW10000)超滤浓缩至90-00ml。

凝胶过滤

填料为Pharmacia公司的Sephacryl S-200，柱体积为5cm×115cm。柱子先用缓冲液(100mM NaCl，20mM PB PH7.4)充分平衡后，将超滤浓缩样品上样层析，流速为60ml/h，收集GM-CSF活性蛋白峰。

上述各纯化步骤后的SDS-PAGE分析结果示于图6。从中可以看出，这些纯化步骤是相当有效的。

纯化后GM-CSF的鉴定

对用上述方法纯化后的GM-CSF，用常规方法进行HPLC纯度测定，结果测得其纯度大于98％，图谱见图7。

不同批次纯化后的GM-CSF常规SDS-PAGE电泳，银染后可见单一条带，见图8。

纯化后GM-CSF比活性测定：采用TF-1细胞、MTT测定细胞增殖的方法来测定GM-CSF的活性，标准参照品为Boehringer公司产品，所测的活性与GM-CSF的绝对量之比为比活性(单位为U/mg)，结果GM-CSF的比活性为1.0×10⁸U/mg。

在本发明中，在优选条件下发酵结束时GM-CSF 95％以上均分泌入大肠杆菌细胞周质，表达量占胞周质蛋白总量的40％，1L发酵液中GM-CSF的产量为350-500mg，这比迄今为至以包含体形式表达的GM-CSF产率高出近10倍。此外不必复性，所以工艺简便，而且获得的GM-CSF的活性很高。

Claims (10)

1.一种表达重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的分泌表达载体，其特征在于，该载体含有：重组的人GM-CSF序列、与GM-CSF的编码序列相连接的大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽(ST II)序列、和大肠杆菌碱性磷酸酶(phoA)启动子。

2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，该载体含有ST II基因的核糖体结合位点序列以及该GM-CSF编码序列来自中国人外周血单个核细胞的PCR扩增产物。

3.如权利要求2所述的载体，其特征在于，该载体包含于大肠杆菌(Escherichiacoli)W3110/pHuGM CSF，CCTCC No.：M 97024中。

4.一种大肠杆菌宿主细胞，其特征在于，它被权利要求1所述的载体所转化。

5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，它是大肠杆菌(Escherichia coli)W3110/pHuGM CSF.CCTCC No.：M 97024。

6.一种制备重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的方法，其特征在于，该方法包括：

在培养条件下，培养被分泌表达载体所转化的大肠杆菌宿主细胞，该分泌表达载体含有：重组的人GM-CSF序列、与GM-CSF的编码序列相连接的大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽(ST II)序列、和大肠杆菌碱性磷酸酶(phoA)启动子，该载体在大肠杆菌中表达时，将GM-CSF分泌至大肠杆菌的胞周质；

分离纯化所表达的该集落刺激因子，得到产物。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，该分离纯化后的产物不含有ST II信号肽氨基酸序列，其N端起始氨基酸为丙氨酸。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所用的分离纯化方法包括：粗提、DEAE阴离子层析、苯基琼脂糖凝胶HP疏水层析、凝集过滤。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，该载体含有ST II基因的核糖体结合位点序列以及该GM-CSF编码序列来自中国人外周血单个核细胞的PCR扩增产物。

10.如权利要求6-9中任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的大肠杆菌宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)W3110/pHuGM CSF，CCTCC No.：M97024。

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