CN1185342C

CN1185342C - 编码人甲状旁腺激素的寡核苷酸及其高效表达方法

Info

Publication number: CN1185342C
Application number: CNB011414499A
Authority: CN
Inventors: 方宏清; 马清钧
Original assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2001-09-25
Filing date: 2001-09-25
Publication date: 2005-01-19
Anticipated expiration: 2021-09-25
Also published as: CN1408865A

Abstract

本发明公开了一种编码人甲状旁腺激素的寡核苷酸及其高效表达方法，目的是提供一种可以在大肠杆菌中高效表达，生成人甲状旁腺激素的寡核苷酸序列及其高效表达方法。本发明能够在大肠杆菌中高效表达，生成人甲状旁腺激素的寡核苷酸序列是序列1的DNA。该序列由252个碱基组成，编码序列2中由84个氨基酸残基组成的氨基酸。序列1的高效表达方法，包括以下步骤：1)合成序列3的核苷酸序列；2)目的基因与质粒pUC19连接，转化到DH5α受体菌，获得序列完全正确的克隆pUC19-PTH；3)构建表达载体pBV220-PTH或表达载体pET22-PTH；4)将表达载体pBV220-PTH或表达载体pET22-PTH转化到受体菌中，获得表达转化子；5)培养转化子，得到重组的人甲状旁腺激素。

Description

编码人甲状旁腺激素的寡核苷酸及其高效表达方法

技术领域

本发明涉及一种人工合成的编码人体激素的寡核苷酸序列及其高效表达方法，特别是涉及一种编码人甲状旁腺激素的寡核苷酸及其高效表达方法。

背景技术

人甲状旁腺激素(human parathyroid hormone，hPTH)由甲状旁腺主细胞合成，成熟肽由84个氨基酸残基组成(Hendy等，Proc Natl Acad Sci USA，78，7365-7369，1981)。PTH是维持机体血钙平衡的重要激素之一。临床上PTH可用于多种骨相关疾病，如甲状旁腺功能低下、骨质疏松症等的治疗和诊断。特别是近年来，大量动物实验研究和人体临床研究表明，间断性给予适量的PTH有促进成骨作用，可快速刺激骨形成，而不伴有骨吸收增加。作为骨形成刺激剂，PTH及其类似物已引起人们的重视，临床上正在进行治疗骨质疏松症的研究。然而PTH天然来源非常有限，利用多肽合成技术进行全合成的成本太高。因此采用基因工程技术生产PTH是解决问题的有效手段。

1983年有两个研究小组用化学合成方法成功获得PTH(1-84)，但得率很低(Biochem Biophys Res Commun，114，493-499，1983；Biochemistry，27，2691-2697，1983)。由于哺乳动物的信号肽序列不能有效地被大肠杆菌或酵母识别加工，直接将hprepro-PTH基因插入到大肠杆菌或酵母的表达载体上，并不能有效表达成熟的甲状旁腺激素(Born等，1987)。1990年挪威学者Hogset等(J Biol Chem，265，7338-7344，1990)将hPTH基因融合到金黄色葡萄球菌蛋白A信号肽的下游，并由蛋白A启动子控制表达。表达产物能正确加工，并分泌到细胞周质和培养基中，但产量仅1mg/L，远不能满足研究和应用需求。直接胞内表达PTH天然基因，产量仅0.2mg/L(3^rd Congr Eur Biotech 111，363-369，1984)。PTH难以表达的原因推测是由于其结构松散，易被蛋白酶降解。1988年加拿大的一研究小组(J Biol Chem，263，1307-1313，1988)开始进行细胞内非分泌表达PTH研究，在lac启动子的控制下表达人工合成PTH基因，产物不均一，HPLC纯化后经鉴定分别为PTH(1-84)，fMet-PTH(1-84)和PTH(8-84)。体外活性测定结果表明，fMet-PTH(1-84)的活性仅为PTH(1-84)的10％，而PTH(8-84)则无生物活性。随后该研究小组依据密码子的简并性对目的基因序列进行改造(J Biol Chem 266，2831-2835，1991)，使PTH(1-84)的表达水平达到20mg/L，占细菌总蛋白的2.5％。为防止降解，提高表达水平，也有人采用融合技术表达β-半乳糖苷酶-PTH融合蛋白(Wingender等，J Biol Chem246，4367-4373，1989)，尽管表达水平较高，但体外切割技术难度很大。

在酿酒酵母中表达PTH的研究工作也有很多(Protein Expr Purif 13，396，1998；Appl Microbiol Biotechnol 50，187，1998)。PTH的天然信号肽序列在酵母体内加工效率不高，利用酵母自身的α因子信号肽可提高PTH的表达水平。但酵母表达的PTH易降解为PTH(27-84)，而且还有O型糖基化产物。利用基因突变技术将26位Lys变为Gln，可消除在26-27位之间的降解，但不能防止C端缺失产生PTH(1-80)。在蛋白酶缺陷株表达可获得完整型PTH(1-84)。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以在大肠杆菌中高效表达，生成人甲状旁腺激素的寡核苷酸序列。

本发明能够在大肠杆菌中高效表达，生成人甲状旁腺激素的寡核苷酸序列是序列1的DNA。该序列由252个碱基组成，编码序列2中由84个氨基酸残基组成的氨基酸。

本发明的另一个目的是提供一种序列1的核苷酸序列在大肠杆菌中的高效表达方法。

为实现这一目的，本发明采取以下技术方案：序列1的高效表达方法，包括以下步骤：

1)目的基因的合成

合成序列3的核苷酸序列；

2)目的基因与质粒pUC19连接，转化到DH5α受体菌，获得序列完全正确的克隆pUC19-PTH；

3)构建表达载体pBV220-PTH或表达载体pET22-PTH；

4)将表达载体pBV220-PTH或表达载体pET22-PTH转化到受体菌中，获得表达转化子；

5)培养转化子，得到重组的人甲状旁腺激素。

为了便于操作，所述目的基因的合成过程中，采取分段合成的办法，然后将每段的5’端磷酸化，并连接到一起。

所述表达质粒pET22-PTH转化的受体菌优选BL21(DE3)或JM109(DE3)。

含有序列1的质粒pBV220-PTH、带有质粒pBV220-PTH的重组大肠杆菌、含有序列1的质粒pET22-PTH、带有质粒pET22-PTH的重组大肠杆菌在本发明序列1的高效表达过程中，起到重要的作用。

本发明利用分子生物学软件优化基因序列，在不改变氨基酸序列的基础上，获得了一个全新的基因表达序列，并在大肠杆菌内获得高表达(达到1000mg/L)，经纯化每升可获得100mg产品，使人甲状旁腺激素批量化生产成为了可能，完全可以满足实验及医疗的需求，而且成本低，周期短，具有非常高的实际应用价值及重要的经济意义。

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为在16％SDS-PAGE上进行全菌蛋白电泳的结果。

图2为本发明重组人PTH纯品的SDS-PAGE

图3为重组人PTH的RP-HPLC分析

图4为本发明PTH生物活性测定

具体实施方式

实施例1、本发明的寡核苷酸序列在大肠杆菌中的高效表达

一、目的基因的合成

1、采用大肠杆菌偏爱密码子，并在序列1的5’端加入EcoRI、BamHI两个酶切位点和ATG起始密码子，3’端引入TAA、TGA两个终止密码子和BamHI酶切位点，全序列长278个碱基，它的双链DNA展示于序列3。为了方便，分成10个片段进行合成，其序列如下：

No1.

ggaattcata tgtcagtatc agagattcag t 31

No2.

taatgcataa ccttggcaaa catttgaact ccatggagcg tgtagaatgg ctgcgtaaga 60

No3.

agctgcagga cgttcacaat ttcgttgcgc tgggcgctcc gctggcaccg cgtgacgctg 60

No4.

gttctcaacg cccgcgtaag aaagaagata acgttctggt tgaatcccat gagaaatctc 60

No5.

tgggcgaagc agacaaagcg gatgtgaacg ttctgaccaa agctaaatcc cagtaatgag 60

No6.

agttcaaatg tttgccaagg ttatgcatta actgaatctc ggatacagac atatg 55

No7.

gcgcaacgaa attgtgaacg tcctgcagct tcttacgcag ccattctaca cgctccatgg 60

No8.

tatcttcttt cttacgcggg cgttgagaac cagcgtcacg cggtgccagc ggagcgccca 60

No9.

cgttcacatc cgctttgtct gcttcgccca gagatttctc atgggattca accagaacgt 60

No10.

cgggatcctc attactggga tttagctttg gtcagaa 37

2、5’端磷酸化：将合成的10个片段用水溶解各取50pmol，40微升反应体积，用T4多核苷酸激酶将ATP的γ-磷酸基转移到各片段的5’末端，具体反应条件为37℃，60min。然后70℃，5min灭活。

3、退火连接：上述反应产物，95℃，5min，于保温杯中缓慢降温(过夜)。次日加T4 DNA连接酶，12℃过夜(12h以上)。

4、PCR扩增：以连接产物为模板，No1和No10为引物，63℃退火，72℃延伸40s，30个循环。

二、获得克隆pUC19-PTH

电泳回收278bp左右的PCR产物，用EcoRI和BamHI双酶切后与同样双酶切的质粒pUC19连接，转化到DH5α受体菌，蓝白斑筛选获得阳性转化子，挑单个转化子培养抽提质粒，经酶切正确后再进行测序，最后获得序列完全正确的克隆pUC19-PTH。

三、表达载体pET22-PTH的构建

从重组质粒pUC19-PTH上用NdeI和BamHI双酶切获得PTH基因片段，回收后连接到同样双酶切的pET22b表达载体上，转化DH5α后用PCR和酶切良种方法筛选正确克隆，即pET22-PTH。

将表达质粒pET22-PTH转化到受体菌BL21(DE3)或JM109(DE3)中，获得表达转化子，即重组菌株。将该菌株接到两倍LB培养基中，37℃，250 rpm振荡培养到菌密度(OD₆₀₀)达到0.3至0.5时，在培养液中加入终浓度为1mM IPTG，继续培养4小时。在16％的SDS-PAGE中进行全菌蛋白电泳，可见一条明显表达带，分子量约9500道尔顿。

在该步骤中，也可以利用载体pBV220构建表达载体pBV220-PTH，然后转化受体菌得到表达产物。其具体方法是：从重组质粒pUC19-PTH上用EcoRI和BamHI双酶切获得PTH基因片段，回收后连接到同样双酶切的pBV220表达载体上，转化DH5α后用PCR和酶切两种方法筛选正确克隆，即pBV220-PTH。

将表达质粒pBV220-PTH转化到受体菌DH5α或JM109中，获得表达转化子，即重组菌株。将该菌株接到两倍LB培养基中，30℃，250rpm振荡培养到菌密度(OD₆₀₀)达到0.3至0.5时，升温到42℃后继续培养4小时。在16％的SDS-PAGE中进行全菌蛋白电泳，可见一条明显表达带，分子量约9500道尔顿。

四、重组菌株BL21(DE3)/pET22-PTH的发酵培养

挑单菌落接入150ml的两倍LB培养基中，37℃，250rpm振荡培养过夜，然后转接到3升发酵培养基中(德国Braun 5L发酵罐)，通气搅拌培养4小时后，加入3ml的1mol/L IPTG，继续培养4小时收菌。如图1所示，在16％SDS-PAGE上进行全菌蛋白电泳，可见分子量约9500道尔顿处有一条明显的表达带。用ELISA试剂盒测定PTH含量达到1g/L。

实施例2、重组人PTH的纯化

收集菌体，破菌释放菌体内蛋白。第一步用SP Sepharose Fast Flow柱捕获目的产物。洗脱峰经C18(5μm)柱精细纯化，可获得纯度达到99％的hPTH纯品，如图2、图3所示。其N端15个残基与天然序列完全一致，电喷雾质谱法测得的分子量为9423.75±0.11，与理论值9423.7基本一致，证明表达产物正确。

实施例3、重组人PTH的鉴定

根据PTH刺激鼠骨肉瘤细胞株ROS 17/2.8产生cAMP的特性(J Biol Chem，263，18369-18377，1988)，测得本发明所得到的rhPTH纯品的生物活性与Sigma公司的PTH(1-84)相一致(如图4所示)。

序列表

<160>3

<170>

<210>1

<211>252

<212>DNA

<213>artificial sequence

<214>人工序列

<400>1

tcagtatcag agattcagtt aatgcataac cttggcaaac atttgaactc catggagcgt 60

gtagaatggc tgcgtaagaa gctgcaggac gttcacaatt tcgttgcgct gggcgctccg 120

ctggcaccgc gtgacgctgg ttctcaacgc ccgcgtaaga aagaagataa cgttctggtt 180

gaatcccatg agaaatctct gggcgaagca gacaaagcgg atgtgaacgt tctgaccaaa 240

gctaaatccc ag 252

<210>2

<211>84

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<214>人属人种

<400>2

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu

5 10 15

Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp

35 40 45

Ala Gly Ser Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val

50 55 60

Glu Ser His Glu Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val

65 70 75

Asn Val Leu Thr Lys Ala Lys Ser Gln

80 84

<210>3

<211>278

<212>dsDNA

<213>artificial sequence

<214>人工序列

<400>3

ggaattcata tgtcagtatc agagattcag ttaatgcata accttggcaa acatttgaac 60

ccttaagtat acagtcatag tctctaagtc aattacgtat tggaaccgtt tgtaaacttg 60

tccatggagc gtgtagaatg gctgcgtaag aagctgcagg acgttcacaa tttcgttgcg 120

aggtacctcg cacatcttac cgacgcattc ttcgacgtcc tgcaagtgtt aaagcaacgc 120

ctgggcgctc cgctggcacc gcgtgacgct ggttctcaac gcccgcgtaa gaaagaagat 180

gacccgcgag gcgaccgtgg cgcactgcga ccaagagttg cgggcgcatt ctttcttcta 180

aacgttctgg ttgaatccca tgagaaatct ctgggcgaag cagacaaagc ggatgtgaac 240

ttgcaagacc aacttagggt actctttaga gacccgctta gtctgtttcg cctacacttg 240

gttctgacca aagctaaatc ccagtaatga ggatcccg 278

caagactggt ttcgatttag ggtcattact cctagggc 278

Claims

1、序列1的DNA序列。

2、根据权利要求1所述的序列，其特征在于：它编码的是序列2的蛋白质。

3、序列1的高效表达方法，包括以下步骤：

1)目的基因的合成

合成序列3的核苷酸序列；

3)构建表达载体pBV220-PTH或表达载体pET22-PTH；

5)培养转化子，得到重组的人甲状旁腺激素。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述表达质粒pET22-PTH转化的受体菌是BL21(DE3)或JM109(DE3)。

5、含有序列1的质粒pBV220-PTH。

6、带有质粒pBV220-PTH的重组大肠杆菌。

7、含有序列1的质粒pET22-PTH。

8、带有质粒pET22-PTH的重组大肠杆菌。