CN1273599C - 中国青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中国青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶基因及其编码的蛋白，以及该蛋白在制备抗肿瘤和抗衰老的药物中的作用。本发明用RT-PCR的方法，从中国青岛文昌鱼卵巢总RNA中分离得到的硫氧还蛋白过氧化物酶基因TPx，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。该基因编码的蛋白(重组硫氧还蛋白过氧化物酶Bbt-TPx)，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。本发明的重组硫氧还蛋白过氧化物酶具有抗氧化作用，可用于制备抗肿瘤和抗衰老的药物。

Description

中国青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种中国青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶基因及其编码的蛋白，以及该蛋白在制备抗肿瘤和抗衰老的药物中的应用。

背景技术

文昌鱼，鱼肉红色，晶莹、半透明状。身体细长象一把外科手术刀，所以西欧人叫它两尖鱼或海茅。文昌鱼共有29个种。分布在热带、亚热带的8～16米的浅水海域中，特别在北纬48°至南纬40°之间的环形地区。虽然文昌鱼不属于脊椎动物，但它胚胎发生出现的脊索、神经管及咽鳃裂表现了脊椎动物胚胎发生的共性，因而在动物进化树上占据着及其重要的地位。因此，时至今日，当代胚胎学仍把文昌鱼的胚胎发生作为脊椎动物胚胎发生的基本模式。

过氧化物还原酶(Peroxiredoxins Prx)是生物体内一类抗氧化蛋白酶。自从1988年K·Kim在酿酒酵母里发现过氧化物还原酶至今的十余年中，过氧化物还原酶越来越受到人们的广泛关注。过氧化物还原酶在体内主要是通过还原过氧化氢和一些过氧化氢物( )来实现自己的抗氧化作用。过氧化物还原酶属于过氧化物酶家族。过氧化物酶的氢供体(hydrogen donor)目前发现的主要有谷胱甘肽、硫氧还蛋白、NADH、NADPH。过氧化物还原酶与其他过氧化物酶比较最明显的特征就是绝大部分的过氧化物还原酶在体内是以硫氧还蛋白作为唯一的氢供体。正因为如此，过氧化物还原酶也被称为硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxin Peroxidase，TPx)。但是并不是所有的过氧化物还原酶都是以硫氧还蛋白作为唯一氢供体。

过氧化物还原酶普遍存在于多数生物体内。研究已经证明酵母、植物、动物、原生动物、寄生虫甚至真细菌和古细菌体内都含有该酶，说明过氧化物还原酶是一个非常重要的基因。过氧化物还原酶主要位于细胞溶质中，在线粒体、叶绿体、过氧化物酶体和细胞核内也均有少量分布。实验证明过氧化物还原酶在生物体内大量表达。许多生物体含有不止一种过氧化物还原酶的同型异构体。在哺乳动物细胞里至少已有六种过氧化物还原酶已经被发现。

过氧化物还原酶在生物体内的主要功能包括两个方面：一是细胞脱毒能力和抵抗氧化压力；二是调节由过氧化氢介导的信号转导和免疫反应。根据过氧化物还原酶所具有的活性半胱氨酸残基的数目可以把其分为两大类：1-Cys和2-Cys过氧化物还原酶。从结构和反应机制的进一步研究得出的结果我们还可以把2-Cys过氧化物还原酶分为两类：典型和非典型的2-Cys过氧化物还原酶。典型的2-Cys过氧化物还原酶，由于这一类酶在体内只依靠硫氧还蛋白作为它的唯一的氢供体，所以我们又将它称作硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx)。

研究表明，寄生虫的过氧化物还原酶在寄生虫抵抗宿主的免疫反应和氧化压力起着重要的作用；而在哺乳动物特别是人，该蛋白与疾病，信号传导和免疫反应有着紧密联系。随着对过氧化物还原酶研究的不断深入，人们越来越认识到它在生物体内的重要性。在寄生虫的防治和抗肿瘤抗衰老药物的研究中，该蛋白有着良好的前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的中国青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶基因及其编码的蛋白Bbt-TPx。

本发明的另一目的在于提供上述基因的蛋白在制备抗肿瘤和抗衰老的药物中的应用。

本发明用RT-PCR的方法，从中国青岛文昌鱼卵巢总RNA中分离得到的硫氧还蛋白过氧化物酶基因TPx，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。

上述本发明基因编码的蛋白(重组文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶Bbt-TPx)，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示；该蛋白等电点为7.30，分子量为22150道尔顿。

该蛋白Bbt-TPx是通过表达载体pET-32a(+)M-TPx在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达的。

所述表达载体pET-32a(+)M-TPx是在质粒pET-32a(+)M(购自Nobogen公司)的多克隆位点中间插入His的亲和标记位点和TPX基因序列的高效表达载体，该系统使TPx基因在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达，表达量可达600mg/L。

本发明所选择的文昌鱼属于中国青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)，采自中国山东省青岛市沙子口水域。

中国青岛文昌鱼卵巢cDNA文库的构建：首先分离文昌鱼卵巢，提取总RNA。取总RNA进行逆转录合成cDNA第一链产物。再取cDNA用于连接反应，转化液分别涂板，其余用于摇总库菌落。从平板中挑取单克隆保种

本发明通过对以上重组克隆大规模序列测定，从中得到了1个新的编码中国青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶的克隆，命名为TPx(其DNA序列如序列表中<400>1序列所示)。新基因编码198个氨基酸的成熟肽(其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示)，等电点为7.30，分子量为22,150道尔顿，具有典型的硫氧还蛋白过氧化物酶一级结构的特征，分子内具有两个活性半胱氨酸功能域。

本发明通过设计了一对引物，将编码中国青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶的新基因TPx用PCR方法从T载体上扩增出来，克隆到原核融合表达载体pET-32a(+)M上，构建成表达质粒pET-32a(+)M-TPx，并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)/pLysS。此表达载体(pET-32a(+)M-TPx)以T7为启动子，以可溶的形式表达，其N端具有6×His结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。通过对培养时间，诱导时间，温度等条件的摸索和优化，重组Bbt-TPx蛋白的表达量可达到600mg/L，并且基本上处于可溶状态。

本发明还摸索和优化了重组Bbt-TPx蛋白的纯化条件，表达产物的超声裂解液经Ni²⁺Chelating Sepharose亲和色谱层析，得到纯度较高的目的蛋白，目的蛋白经进一步的SP-Sepharose阳离子交换层析，可得到纯度在95％以上的重组Bbt-TPx蛋白。

试验证明，本发明获得的重组文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶具有生物活性。该重组文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶具有抗氧化作用。重组文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶具有还原H₂O₂的活性。当超螺旋DNA或对硫醇基敏感的蛋白遭到外界的氧化作用破坏时，重组的Bbt-TPx蛋白对其具有明显的保护作用。因此，本发明的重组硫氧还蛋白过氧化物酶可用于制备抗肿瘤和抗衰老的药物。

由本发明的含有文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶编码序列的表达质粒pET-32a(+)M-TPx经BaM HI/Xho I双酶切，可得到610bp的片段，即为文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶TPx编码序列。

本发明的表达质粒的复制方法：参照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，按CaCl₂法在E.Coli.DH5α或BL21(DE3)/pLysS菌株中转化质粒，用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基转化细菌，碱法提取质粒。

附图说明

图1为本发明的文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶和其他物种的该蛋白的比较结果，其中加粗和阴影表示相同；加边框表示为该蛋白的功能域。

图2为青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶基因TPx的PCR产物电泳结果。1：TPx基因PCR产物；2：没加模板的空白对照；M：1Kb的DNA分子量标准。

图3为pET32a(+)M-TPx重组表达载体的酶切和PCR鉴定。M：1Kb的DNA分子量标准；1：PET32a(+)M-TPx重组表达载体的Bam H I和Xho I双酶切；2：PET32a(+)M-TPx重组表达载体的PCR鉴定。

图4为重组Bbt-TPx蛋白诱导表达、亲和层析电泳图。M：蛋白分子量标准；1：重组Bbt-TPx蛋白在总菌中蛋白表达量；2：重组Bbt-TPx蛋白在上清中蛋白表达量；3：重组Bbt-TPx蛋白的50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，500mmol/L NaCl洗脱峰；4：重组Bbt-TPx蛋白的50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，500mmol/L NaCl，100mmol/L咪唑洗脱峰；5：重组Bbt-TPx蛋白的50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，500mmol/L NaCl，150mmol/L咪唑洗脱峰；6：重组Bbt-TPx蛋白的50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，500mmol/L NaCl，300mmol/L咪唑洗脱峰。

图5为重组Bbt-TPx蛋白的SP-Sepharose阳离子交换层析的SDS-PAGE分析。M：蛋白分子量标准；1：重组Bbt-TPx蛋白的Ni²⁺螯和层析的300mmol/L咪唑洗脱峰更换缓冲液50mM PB(pH6.3)；2：重组Bbt-TPx蛋白的50mM PB(pH6.3)，500mM NaCl洗脱峰。

图6为pET32a(+)M-TPx重组表达载体的构建示意图。

图7为重组Bbt-TPx蛋白还原H₂O₂活性的测定图。系列1：重组Bbt-TPx蛋白浓度为0ug/ml；系列2：重组Bbt-TPx蛋白浓度为100ug/ml；系列3：重组Bbt-TPx蛋白浓度为50ug/ml；系列4：重组Bbt-TPx蛋白浓度为20ug/ml。图8为重组Bbt-TPx蛋白保护超螺旋DNA实验的琼脂糖电泳结果图。1：空白对照的supercoil DNA；2：只加DTT；3：只加Fe³⁺；4：只加DTT和Fe³⁺；5～9：DTT+Fe³⁺+500、200、100、50、25ug/ml TPx。SF：Supercoiled FormofPlasmid；NF：Nicked Form ofPlasmid.。质粒为pGAPZαA。

图9为重组Bbt-TPx蛋白保护GS蛋白活性图。系列1：反应体系无DTT、Fe³⁺和TPx；系列2：反应体系含100ug/ml TPx；系列3：反应体系含20ug/ml TPx；系列4：反应体系含DTT和Fe³⁺，无TPx。

具体实施方式

以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例一：中国青岛文昌鱼卵巢cDNA文库的构建及EST分析

总RNA的提取和cDNA合成：分离中国青岛文昌鱼卵巢，采用异硫氰酸胍法提取卵巢总RNA，酚/氯仿抽提去除蛋白质.获得100μg卵巢总RNA。取1ug总RNA以SMARTIII olignuclotide(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3′)和CDSIII/3′PCR引物(5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)₃₀N_-1N-3′)进行逆转录合成第一链，得到10μlcDNA第一链产物。

文昌鱼卵巢cDNA文库的构建和鉴定：取cDNA 1μl用于连接反应，反应体系5μl，转化其中1μl，取1/200、1/100和2/100体积转化液分别涂板，其余用于摇总库菌落。从平板中挑取单克隆保种并随机挑取一定数目的单克隆进行测序和生物信息学分析。

实施例二：重组文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶基因序列的测定和分析

青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶基因的质粒和序列来自实施例一中国青岛文昌鱼卵巢cDNA文库中编号为bbelo2001的基因簇。对其进行生物信息学分析，结果显示其cDNA序列长度为1108bp。利用工具软件DNAtools 6.0对其碱基序列进行分析，并获得其最大读码框，长度597bp，编码198个氨基酸残基的蛋白。通过BLASTX发现它与人类(Homo sapiens)的过氧化物还原酶1(hPRx1)(登录号为gi|4505591|ref|NP_002565.1|)具有明显的同源性(Identities＝155/198(78％)，Positives＝176/198(88％))。进一步分析显示，青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶基因编码198个氨基酸的成熟蛋白，蛋白的分子量为22.15KD，等电点为7.30。该基因不含有信号肽，不含有跨膜区，也不含有糖基化位点。该蛋白亚细胞定位分析表明它是一个细胞溶质蛋白。Blast同源检索分析表明，青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶与具有两个活性半胱氨酸功能域的过氧化物还原酶的同源性相当高。它与第一类和第二类过氧化物还原酶都具有80％以上的同源性(图1)。

实施例三：重组文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶表达质粒的构建

依据TPx基因的两端序列合成一对引物，上游引物含BamH I切割位点，下游引物含Xho I切割位点。

上游引物：5’-CGC  GGA TCC TCT GCT GGA AAT GCC AAG-3’

                   BaM HI

下游引物：5’CCG  CTC GAG TCA TTA CTG CTT GGA GAA ATA TTC TTT G-3’；

                   Xho I Stop codon

用PCR的方法，从实施例二中的青岛文昌鱼文库扩增得到硫氧还蛋白过氧化物酶TPx基因片断(含酶切位点)，长度为610bp左右，与预期大小一致(图2)。将回收纯化的TPx基因PCR产物，用Bam HI和Xho I酶切后，插入到同样用Bam HI和Xho I切开的载体pETTRX的窗口，构成含TPx基因片段的表达载体pET-32a(+)M-TPx，其构建过程如图6。用Bam HI和Xho I酶切重组质粒，可切出与PCR产物大小一致的片段，以及与线性载体pET-32a(+)M(5.9kb)大小一致的片段。用TPx上下游特异引物扩增重组质粒，也能获得一条与TPx预期大小一致的特征片段(图3)。这都表明TPx基因已插入质粒载体pET-32a(+)M中。纯化后的pET-32a(+)M-TPx重组质粒，以T7terminator(上海博亚生物工程公司合成)为测序引物进行反向测序，其序列与青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶TPx基因的测序结果完全一致，说明合成的引物与PCR扩增无误，读码框正确。

实施例四：重组文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶的表达

将pET-32a(+)M-TPx转化大肠杆菌BL21(DE3)/pLysS。基因工程菌超声裂解上清液经SDS-PAGE电泳分析表明，菌体经诱导后有明显的特异表达产物带，分子量与用软件DNATOOL5.1预测的理论值24.46kD相符(图4)。

经过对培养时间，诱导浓度，温度等条件的摸索：菌体扩大培养不同时间后诱导表达比较，基因工程菌的培养条件为：接单菌落于50ml氨卞抗性LB培养基中，37℃，250rpm/min培养过夜，取过夜培养物20ml接种于2L的氨卞抗性LB培养基中，37℃，250rpm/min培养至OD600＝0.6(扩大培养约2h)，加入100mM IPTG和20％葡萄糖至终浓度分别为0.1mM和0.2％，25℃，250rpm/min诱导培养10h后离心收获菌体。经SDS-PAGE电泳分析表明，在此条件下重组的Bbt-TPx蛋白的表达量占菌体总蛋白的20％以上，基本上处于可溶状态(图4)。

实施例五：重组文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶的纯化

将诱导表达后的培养菌液在4℃，6,000rpm/min离心5分钟，菌体先用TE缓冲液(pH8.0)重悬，离心，再用预冷的50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，500mmol/L NaCl溶液洗涤菌体，超声处理后，裂解上清液经Ni²⁺Chelating Sepharose亲和色谱层析一步纯化，经SDS-PAGE分析和薄层扫描分析表明融合蛋白的纯度达到80％(图4)。以1L基因工程菌培养物为材料，最终获得约600mg纯化的重组蛋白。

为了提高重组蛋白的得率和浓度，简化实验步骤，缩短对重组蛋白的处理时间，在用Ni2+亲和色谱层析纯化重组蛋白时，我们采用一步法进行纯化。根据载体质粒pET-32a(+)M所表达的外源蛋白与Ni2+亲和柱的结合能力较强的特点，我们选用了较简化的洗脱条件：50mMTris，500mMNaCl，pH8.0(A液)；100mM咪唑，50mMTris，500mMNaCl，pH8.0(B液)；150mM咪唑，50mMTris，500mMNaCl，pH8.0(C液)；300mM咪唑，50mMTris，500mMNaCl，pH6.0(D液)。重组TPx蛋白在D液被洗脱下来(图4)。从SDS-PAGE结果来判断分离效果最好的部分。

利用SP-Sepharose阳离子交换层析进一步纯化重组蛋白(洗脱液为PBS)，便得到纯度在95％以上的重组文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶Bbt-TPx蛋白(图5)。

实施例六：重组Bbt-TPx蛋白还原H₂O₂活性实验

该活性实验参照Lim·YS et al(Biochem Biophys Res Commun，1994，199(1)：199-206.)的方法。反应体系为1ml，包括5mmol/L DTT，50mmol/L HEPES-HCl(pH7.0)缓冲液和重组Bbt-TPx蛋白(0，20ug/ml，50ug/ml，100ug/ml)。室温放置10分钟后，加入H₂O₂(200ummol/L)。分别室温放置反应0，2.5分钟，5分钟，7.5分钟，10分钟后加入100ul 100％(w/v)TCA，混匀后立即加入200ul 10mmol/L Fe(NH₄)₂SO₄和100ul 2.5mol/L KSCN，测定O.D.₄₇₅。另做一不加H₂O₂的体系作为空白对照(图7)。从图7可以看到，在加有重组Bbt-TPx蛋白的系列中，随着反应时间的延长，O.D.₄₇₅吸收值逐步降低，说明H₂O₂被重组Bbt-TPx蛋白还原了。而且随着重组Bbt-TPx蛋白浓度的升高，O.D.₄₇₅吸收值下降的越快，说明被还原的H₂O₂量越多。而没有加入Bbt-TPx的系列1，吸收值基本没有变化。该实验证明了重组的Bbt-TPx蛋白具有还原H₂O₂的能力，且还原能力与重组Bbt-TPx蛋白浓度成正比。

实施例七：重组Bbt-TPx蛋白保护超螺旋DNA实验

该活性实验参照Lim·YS et al的方法。反应体系为50ul，包括10mmol/L DTT，3ummol/LFeCl₃，50mmol/L HEPES-HCl(pH7.0)缓冲液，1ug由PEG法提取的超螺旋DNA(pGAPZαA)和重组Bbt-TPx蛋白(500ug/ml，200ug/ml，100ug/ml，50ug/ml，25ug/ml)37℃温育2小时。另做一体系不加DTT和重组蛋白；一体系不加FeCl₃和重组蛋白；一体系不加重组蛋白作为对照.反应完后分别取10ul跑琼脂糖电泳检测(胶浓度为0.8％)，并通过紫外分光成像系统分析结果(图8)。结果显示，作为对照的质粒DNA只以超螺旋(supercoil form)一种构象存在(lane 1)，而当同时加入了DTT和Fe³⁺时，质粒的超螺旋构象几乎被破坏，形成另一种构象(nick form)(lane 4)。往反应体系中加入重组Bbt-TPx蛋白后，可以看到随着重组Bbt-TPx蛋白浓度的不同，质粒的超螺旋构象受到了不同程度的保护(lane 5-9)，而且质粒的超螺旋构象受到的保护程度与重组Bbt-TPx蛋白的浓度成正比。该实验证明了在一些自由基对DNA造成伤害时，重组的Bbt-TPx蛋白对超螺旋DNA具有一定的保护作用。

实施例八：重组Bbt-TPx蛋白保护GS蛋白活性实验

该活性实验参照Kim·K et al的方法。反应体系为50ul，包括10ug/ml GS，10mmol/LDTT，3umol/L FeCl₃，50mmol/L咪唑-HCl(PH7.0)和不同浓度的重组Bbt-TPx蛋白(20ug/ml和100ug/ml)。该体系包括两部分，一部分为30ul，含有GS，咪唑和Bbt-TPx；另一部分20ul，含有DTT和FeCl₃。将两部分混和后30℃温育不同时间(0，2min，8min，15min，25min)，然后加入2mlγ-Glutamyltransferase Assay Mixture，30℃温育5min后加入1ml Stop Mixture，测定O.D.₅₄₀。另做一体系不加重组Bbt-TPx蛋白、DTT和FeCl₃；一体系不加重组Bbt-TPx蛋白作为对照。根据反应剩余的GS蛋白转移谷酰氨和铁离子形成的γ-Glutamyl-hydroxamate-Fe³⁺化合物的O.D.₅₄₀吸收值来判断重组Bbt-TPx蛋白保护GS蛋白活性的能力。以反应时间为横坐标，O.D.₅₄₀吸收值为纵坐标作曲线，观察重组Bbt-TPx蛋白保护GS蛋白的活性(图9)。从图9可以看到，在反应体系含DTT和Fe³⁺、无重组Bbt-TPx蛋白的时候，GS蛋白的活性随着反应时间的延长而迅速降低，当反应体系中加入了不同浓度的重组Bbt-TPx蛋白的时候，GS蛋白的活性得到了不同程度的保护。当重组Bbt-TPx蛋白的浓度为100ug/ml的时候，GS蛋白的活性几乎没有下降。该实验证明了重组Bbt-TPx蛋白对生物体内一些对ROS非常敏感的蛋白如GS等具有保护作用。

                             序列表

<110>中山大学

<120>中国青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶基因及其应用

<160>2

<210>1

<211>597

<212>DNA

<213>中国青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)

<220>

<221>mat peptide

<222>(1)…(597)

<400>1

atg tct gct gga aat gcc aag ctc caa cac ccc gct cca aac ttc gag  48

Met Ser Ala Gly Asn Ala Lys Leu Gln His Pro Ala Pro Asn Phe Glu

1               5                   10                  15

agc acg gct gta cta ccc tct ggg gag ttc aag acc ata aaa ctc tcg  96

Ser Thr Aln Val Leu Pro Ser Gly Glu Phe Lys Thr Ile Lys Leu Ser

            20                  25                  30

gac tat aaa gga aag tac ttg gtc atc ttc ttc tac cct ctg gat ttc    144

Asp Tyr Lys Gly Lys Tyr Leu Val Ile Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe

        35                  40                  45

aca ttt gtg tgc ccg aca gaa atc atc gcc ttc agc gat cgc gtg gag    192

Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Ile Ala Phe Ser Asp Arg Val Glu

    50                  55                  60

gag ttt cgt aag atc aac tgc gag gtg gtg gcg tgt tca aca gac tcc    240

Glu Phe Arg Lys Ile Asn Cys Glu Val Val Ala Cys Ser Thr Asp Ser

65                  70                  75                  80

caa ttc tcc cac ttg gcc tgg acg aac acc ccc aga aag cag ggt gga    288

Gln Phe Ser His Leu Ala Trp Thr Asn Thr Pro Arg Lys Gln Gly Gly

                85                  90                  95

ctg ggc cag atg aag atc cca atc ctg gcc gac aaa gcg atg acc ata    336

Leu Gly Gln Met Lys Ile Pro Ile Leu Ala Asp Lys Ala Met Thr Ile

            100                 105                 110

tcc cgg gac tac ggc gtg ttg atg gag cct gag ggc atc gcg ttc cgt    384

Ser Arg Asp Tyr Gly Val Leu Met Glu Pro Glu Gly Ile Ala Phe Arg

        115                 120                 125

ggt ttg ttc atc att gac gac aag ggt acc ctg cgc caa atc acg atc    432

Gly Leu Phe Ile Ile Asp Asp Lys Gly Thr Leu Arg Gln Ile Thr Ile

    130                 135                 140

aac gac ctg cct gtc ggg cgt tcg gtc gac gag acg ctg cgt ctg gtt    480

Asn Asp Leu Pro Val Gly Arg Ser Val Asp Glu Thr Leu Arg Leu Val

145                 150                 155                 160

cag gcc ttc cag ttc aca gac aaa cac ggg gaa gtg tgt cct gct ggc    528

Gln Ala Phe Gln Phe Thr Asp Lys His Gly Glu Val Cys Pro Ala Gly

                165                 170                 175

tgg aag ccc ggt gca gac acc atc aaa ccc gac gtt aag aac agc aaa    576

Trp Lys Pro Gly Ala Asp Thr Ile Lys Pro Asp Val Lys Asn Ser Lys

            180                 185                 190

gaa tat ttc tcc aag cag                                            595

Glu Tyr Phe Ser Lys Gln

        195

<210>2

<211>198

<212>PRT

<213>中国青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)

<220>

<221>mat peptide

<222>(1)…(198)

<400>2

Met Ser Ala Gly Asn Ala Lys Leu Gln His Pro Ala Pro Asn Phe Glu

1               5                   10                  15

Ser Thr Aln Val Leu Pro Ser Gly Glu Phe Lys Thr Ile Lys Leu Ser

            20                  25                  30

Asp Tyr Lys Gly Lys Tyr Leu Val Ile Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe

        35                  40                  45

Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Ile Ala Phe Ser Asp Arg Val Glu

    50                  55                  60

Glu Phe Arg Lys Ile Asn Cys Glu Val Val Ala Cys Ser Thr Asp Ser

65                  70                  75                  80

Gln Phe Ser His Leu Ala Trp Thr Asn Thr Pro Arg Lys Gln Gly Gly

                85                  90                  95

LeL Gly Gln Met Lys Ile Pro Ile Leu Ala Asp Lys Ala Met Thr Ile

            100                 105                 110

Ser Arg Asp Tyr Gly Val Leu Met Glu Pro Glu Gly Ile Ala Phe Arg

        115                 120                 125

Gly Leu Phe Ile Ile Asp Asp Lys Gly Thr Leu Arg Gln Ile Thr Ile

    130                 135                 140

Asn Asp Leu Pro Val Gly Arg Ser Val Asp Glu Thr Leu Arg Leu Val

145                 150                 155                 160

Gln Ala Phe Gln Phe Thr Asp Lys His Gly Glu Val Cys Pro Ala Gly

                165                 170                 175

Trp Lys Pro Gly Ala Asp Thr Ile Lys Pro Asp Val Lys Asn Ser Lys

            180                 185                 190

Glu Tyr Phe Ser Lys Gln

        195

Claims (4)

1.用RT-PCR的方法，从中国青岛文昌鱼卵巢总RNA中分离得到的硫氧还蛋白过氧化物酶基因TPx，其DNA序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述基因编码的蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；该蛋白等电点为7.30，分子量为22150道尔顿。

3.如权利要求2所述的蛋白，其特征在于该蛋白是通过表达载体pET-32a(+)M-TPx在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达的。

4.如权利要求3所述的蛋白，其特征在于所述表达载体pET-32a(+)M-TPx是在质粒pET-32a(+)M的多克隆位点中间插入His的亲和标记位点和TPX基因序列的高效表达载体，该系统使TPx基因在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达，表达量可达600mg/L。

Images