CN104109196A - 一种泥蚶抗氧化蛋白Peroxiredoxin-6 - Google Patents

一种泥蚶抗氧化蛋白Peroxiredoxin-6 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供种泥蚶抗氧化蛋白Peroxiredoxin-6(Prx6)，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明通过对泥蚶抗氧化蛋白Prx6基因的筛选和克隆，获得Prx6基因的全长序列，并对其进行生物信息学分析，进而探究Prx6基因表达机理和调控机制，丰富泥蚶免疫学和分子遗传学的研究内容。为后续开展功能基因和分子育种的研究，发掘与生长、繁殖、营养代谢、抗病等主要经济性状相关的候选基因提供理论依据。

Description

一种泥蚶抗氧化蛋白Peroxiredoxin-6
技术领域
本发明属于功能基因筛选技术领域，具体涉及一种泥蚶抗氧化蛋白Peroxiredoxin-6。
背景技术
抗氧化蛋白Peroxiredoxin是抗氧化物酶系，属抗氧化蛋白超家族，它的蛋白序列和催化活性与其它的抗氧化剂不同。Peroxiredoxin家族有六个成员分别为：Prx I、Prx II、Prx III、Prx IV、Prx V和Prx VI。Prx能够保护基因组免受活性氧的破坏和通过抑制细胞衰老使基因组保持完整从而预防肿瘤的发生。因此Peroxiredoxin为肿瘤的治疗提供了新的方法。植物中对抗氧化蛋白的研究主要集中在植物的生长发育和环境适应中的作用，它既作为抗氧化剂还原多种有害的过氧化物，又参与信号转导调节着细胞氧化还原状态以及抗氧化剂代谢的平衡。在无脊椎动物的研究中用Peroxiredoxin免疫动物后，可以产生相关的保护性，这将有望应用于寄生虫感染的血清学诊断。除此之外，抗氧化蛋白还作用于宿主与寄生虫之间的相互影响中，因此抗氧化蛋白可以作为候选疫苗分子，这将为寄生虫高效疫苗的研究提供新的线索。
近年来由于我国沿海地区人为活动的开展，环境的改变和恶化导致其抗病性状退化，发病死亡率升高，致使泥蚶种群数量急遽下降，产量锐减，经济效益受到严重影响。因此，进一步研究泥蚶免疫机制的机理，对丰富泥蚶基因的研究内容具有理论指导意义，为今后泥蚶的健康养殖提供依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种泥蚶抗氧化蛋白Peroxiredoxin-6(Prx6)及其应用，从而弥补现有技术的不足。
本发明所筛选获得的抗氧化蛋白Peroxiredoxin-6，其包含有：
1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白；
2)在1)中的氨基酸中取代、缺少或添加一个或一个氨基酸，具有与1)中功能的蛋白。
本发明还提供用于编码上述抗氧化蛋白Peroxiredoxin-6的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
本发明的抗氧化蛋白Peroxiredoxin-6可用于制备抗氧化剂；其一种应用是作为饲料添加剂。
通过对泥蚶抗氧化蛋白Prx6基因的筛选和克隆，获得Prx6基因的全长序列，并对其进行生物信息学分析，进而探究Prx6基因表达机理和调控机制，丰富泥蚶免疫学和分子遗传学的研究内容。为后续开展功能基因和分子育种的研究，发掘与生长、繁殖、营养代谢、抗病等主要经济性状相关的候选基因提供理论依据。
附图说明
图1：泥蚶Peroxiredoxin-6 cDNA序列及翻译的氨基酸序列图；其中：方框标注字母为对应起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)和多聚尾信号(AATAAA)；
图2：泥蚶Peroxiredoxin-6氨基酸序列对比结果，其中：泥蚶(Tegr)，沙蠋(Arma)，鲑疮痂鱼虱(Lesa)，大西洋鲑(Sasa)，斑点叉尾鱼(Icpu)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
一、泥蚶抗氧化蛋白Peroxiredoxin-6(Prx6)的分离
1、本实验所用的泥蚶均购自宁波市场。
2、实验所用引物
本实验所用引物详见表1：
表1：泥蚶Prx6的cDNA克隆及相关实验所用到的引物
3、实验所用试剂
异丙醇、乙醇、Trizol、RNase-Frees水、氯仿、TAE缓冲液、氨苄青霉素、柠檬酸钠、X-gal、IPTG、葡萄糖、SOB、琼脂粉等普通试剂采购自上海生工；普通DNA产物回收试剂盒和琼脂糖凝胶试剂盒采购自天根技术有限公司；Advantage 2 Polymerase试剂盒、SMARTTM RNA cDNA扩增试剂盒采购自Clontech公司；大肠杆菌DH5α、rTag聚合酶、PMD-18载体采购自Takara公司；反转录试剂盒试剂盒采购自Promega公司；SYBR Gree Realtime Master Mix采购自美国Bio-rad生物技术有限公司。
4、泥蚶RNA的提取
Triol法总RNA提取方法如下：
前期准备：超净工作台紫外光杀菌。打开冷冻离心机，泡沫盒取冰块，戴上一次性手套，手套上喷洒75％酒精。
(1)取新鲜泥蚶血液、外套膜、足等组织，将组织剪碎，放到10mL离心管中，加入1mLTrizol裂解液。
(2)用匀浆机进行破碎处理，1min左右，然后冰上静置5min。
(3)向做好标记灭菌eppendorf(EP)管中加入600μl的Trizol裂解液。冰上静置5min，2℃，12000rpm离心5min。
(4)在新的灭菌EP管中分别加入200μl氯仿和800μl裂解的组织液，剧烈震荡，充分混合后置冰上反应10min，并适时摇匀，防止分层。然后2℃，12000rpm离心15min。
(5)取新的灭菌EP管，管中加入500μl的冰异戊醇，轻轻吸取450μl上清液转移入管中。-20℃冰箱内放置30min，使RNA充分沉淀。之后2℃，12000rpm离心10min，RNA沉淀于管底，弃上清液。
(6)向沉淀中加入1mL70％冰乙醇洗涤两次。
(7)2℃，12000rpm离心5min，使沉淀再次贴于管壁，弃上清，放置2min，晾干沉淀。
(8)沉淀中加入25μl的RNase-free水，轻弹管壁，使RNA充分溶解。提取完成，-80℃或液氮短期保存。
5、抗氧化蛋白Peroxiredoxin-6基因的扩增
5.1、cDNA的第一链扩增
(1)将提取后的RNA分别进行5’和3’的扩增
(2)混匀后PCR反应程序：72℃3min，结束后立即冰浴2min；
(3)5’端反应液加0.5μl SMARTerⅡ A oligo；
(4)两管分别加入以下试剂：
(5)PCR反应程序：42℃90min之后70℃，10min；
(6)将PCR之后的产物进行稀释：加Tricine-EDTA50μl；
(7)-20℃保存备用。
5.2cDNA扩增
分别用表1中的引物对泥蚶总RNA反转录，然后对cDNA进行PCR扩增，PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳。
PCR反应体系：
扩增片段所用PCR反应程序：94℃变性1min，1个循环；94℃变性30s，60℃退火1min，68℃延伸3min，35个循环；4℃保温。得到的DNA产物进行凝胶电泳，条带清晰则割胶回收。
5.4PCR产物的回收纯化
将得到的DNA割胶回收(回收过程中离心均为室温，12000rpm)
(1)打开恒温水浴锅，设定温度为50℃；
(2)取割胶回收试剂盒中的吸附柱，检查吸附柱的吸附膜是否完好。将吸附柱放入收集管后向吸附柱中加入500μl平衡液BL，离心1min后拔出吸附柱，倒掉废液。吸附柱放回收集管后加入500μl蒸馏水，重复以上步骤，放置备用；
(3)取一个灭菌的离心管，称取质量，在紫外灯下将单一的目的条带从琼脂糖凝胶切下放入其中，再称取质量。得到胶的质量，换算成体积。如果凝胶中为0.1g，则体积视为100μl；
(4)向胶块中加入适量体积的溶胶液PN(3倍)，以浸没胶块为宜。50℃水浴10min，期间适时的翻转离心管，促进胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补充一些溶胶液，继续水浴几分钟，直到胶块溶胶完全溶解。室温放置，待溶液冷却到室温；
(5)将得到的溶液全部加入到吸附柱中，室温放置2min，离心1min，倒掉收集管中的废液；
(6)向吸附柱中加入600μl漂洗液PW，静置2-5min，离心1min，倒掉收集管中的废液；
(7)空管离心2min，尽量除尽漂洗液，丢弃收集管，换上灭菌的离心管，空管离心2min。换个离心管，离心2min。换掉离心管，室温放置5min，彻底晾干；
(8)向吸附柱中悬空加入30-40μl的洗脱液EB，室温放置3min，离心2min，将管中的溶液加入戏附中，再次离心2min，丢弃吸附柱，离心管中的溶液即为回收的DNA溶液。-40℃保存备用；
(9)用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA，条带长度与PCR产物条带长度相同。
5.5大肠杆菌培养及转导转化
(1)配置试剂
1)X-gal：DMF＝0.025g：1mL，DMF为N-二甲基甲酰胺，溶解混匀后用离心管封装，外面包裹上锡箔纸、封口膜，-40℃保存(见光分解)。
2)IPTG：dH2O＝0.2g：1mL，用0.22mm的滤膜过滤除菌。-40℃保存。
3)葡糖糖(1M)：称取18g葡糖糖充分溶解于60mL的去离子水中，定容至100mL，用0.22mm的滤膜过滤除菌，-40℃保存。
4)Amp：dH2O＝0.1g：1mL，用0.22mm的滤膜过滤除菌，外面包裹上锡箔纸、封口膜，-40℃保存。
(2)做平板：
1)洗出4个500mL的容量瓶，备用。刷洗10个培养皿，拿一定数量的牙签一起120℃，高压灭菌30min后放入烘箱烘干。
2)配置100mL固体培养基(SOB)，200mL液体培养基(SOB)，200mL液体培养基(SOC)。
3)将培养基于120℃，高压灭菌30min，灭菌结束后，让其在高压灭菌锅中自然冷却至70℃取出，将液体培养基SOB和SOC做好标记，4℃保存，待使用时在加Amp。
4)超净工作台及使用的器具都用酒精棉擦拭，点好酒精灯，固体培养基继续在超净工作台中冷却，待不烫手(50℃左右)，加入Amp后倒平板。倒完平板，凝固，用保鲜膜包裹后倒置放在4℃保存。
(3)连接：取割胶回收到的DNA4μl加到灭过菌的小PCR管中，再加1μlpMD18-T Vctor，最后加入5μl的Solution1。插在浮子上16℃水浴过夜。第二天早上8:00拿出，放入4℃保存备用。
(4)转化：
1)取20μl IPTG，100μL：X-gal加入到每一个平板中，之后盖上上盖，用保鲜膜封好，放入恒温培养箱烘干、备用；
2)从-80℃取出买来的大肠杆菌感受态细胞，擦进冰里融化3min，从4℃中取出连接好的DNA，用预冷过的枪头全部加入到对应的感受态中，冰上摆动混匀后，冰浴30min；
3)拿至42℃水浴锅，水浴90s，然后立即取出，冰浴2min，之后每管加入900μlSOC，用封口膜封好管口，插在浮子上，放入37℃的恒温摇床1h，之后拿出5000rmp/min，离心30s，弃500μl上清，将剩下的菌液摇匀，培养皿盖子上做好相应标记，取50μl或100μl菌液涂于平板上，保鲜膜包好后置于37℃恒温培养箱中，先正向放置培养1h，然后倒置培养，放置过夜(12h左右)，视情况拿出置于4℃继续培养，剩余菌液4℃保存，白色的为转化成功的，蓝色的则是不成功的；
(5)菌液PCR：
1)在未加入Amp的液体培养基SOB中加入一定Amp，摇匀。取出一定数量的灭菌EP管，每管中加入1mL含Amp的SOB，拿出转化好的大肠杆菌，用牙签挑取单个大肠杆菌放入管中混匀。每个菌种做3个平行，菌在SOB中混匀后，丢弃牙签，盖上离心管，用封口膜封好后，恒温摇床中摇匀3h；
2)拿出菌液PCR引物M13，RV-M48，跑菌落PCR，退后温度为58℃，35个循环，普通PCR；
3)跑1％琼脂糖凝胶电泳，目的条带为原条带长上加200bp，成功后送测序公司测序。
将3′-RACE和5′-RACE所得的序列进行拼接，以获得泥蚶Peroxiredoxin-6基因的cDNA全长；将所测得序列利用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的BLAST工具进行数据库基因序列的相似性及同源性查找，并利用这些序列进行基因同源性的比较，用DNAMAN5.2.2软件进行cDNA全长ORF分析。根据所测得基因的cDNA序列推导其氨基酸序列，用MEGA3.1软件的Neighbor-joining的方法构建Peroxiredoxin-6的进化树。
用RACE法得到的泥蚶Peroxiredoxin-6的全长cDNA总共有1937碱基，开放阅读框为675个碱基，编码224个氨基酸，其中还包含了5′非编码区(5′-UTR)碱基67个，3′非编码区(3′-UTR)碱基1195个，终止密码子TAA和多聚尾信号AATAAA以及多聚A尾巴。泥蚶Peroxiredoxin-6的推导分子量为25.11KDa，理论等电点7.40，没有信号肽(图1)。
通过在NCBI上选取的Peroxiredoxin-6序列与泥蚶Peroxiredoxin-6的进行对比，从图2中可以发现，Tg-Prx6与与沙蠋的相似性仅为73.5％，与鲑疮痂鱼虱相似性为72.1％，与大西洋鲑的相似性为68.7％，与斑点叉尾鱼的相似性为70.9％，从而证明本发明所筛选的泥蚶Peroxiredoxin-6为一新型的基因。
表2：NCBI上选取的Peroxiredoxin-6的信息表
二、泥蚶抗氧化蛋白Peroxiredoxin-6(Prx6)的重组表达
成功构建了pET28-Prx6原核表达载体，实现了重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)的表达，SDS-PAGE结果显示重组蛋白主要为上清表达，且分子量均与预期大小(～24kD)一致。重组表达后的蛋白经Ni-NTA螯合亲和层析后产量分别达到了7.59mg/g菌体和8.82mg/g菌体，纯度分别为90.5％和92.5％。Western Blotting结果显示纯化后的蛋白带有组氨酸标签，说明成功实现了泥蚶Prx6在大肠杆菌中的重组表达。
三、泥蚶抗氧化蛋白Peroxiredoxin-6(Prx6)抗氧化效果检测
1、泥蚶Prx6清除DPPH·自由基能力的测定
取上述体外表达纯化后的Prx6蛋白(约2.5μg)，及等量纯品番茄红素、叶黄素、玉米黄质作为对照组分别加入0.2mmol/L DPPH·无水乙醇溶液各1mL，混匀后在室温下避光反应30min，6000r/min离心10min，取上清液在517nm测定吸光度Ai，平行测3次，取其平均值。空白组以等体积无水乙醇代替DPPH·溶液，对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液，并以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液空白调零。实验结果见表3。
清除率按下式计算：清除率=[1-(Ai-Aj)]÷A0×100％
其中：A0为对照组吸光度，Ai为样品组吸光度，Aj为空白组吸光度。
表3：各种成分对DPPH·自由基清除率统计表
样品 DPPH·自由基清除率
Prx6蛋白 92％
番茄红素 46％
叶黄素 25％
玉米黄质 30％
从表3可以看出，本发明的重组Prx6蛋白能有效清除DPPH·自由基，清除率高达92％，与等量纯品番茄红素、叶黄素、玉米黄质相比具有更高的清除DPPH·自由基的能力。
2、硫氰酸铁法测Prx6蛋白催化H202的反应活性
重组Prx蛋白(Prx1或Prx2)的抗氧化活性鉴定主要参考文献(Liau等，2010)的检测方法，原理为：Prx蛋白可以催化过氧化氢转化为水和氧气，而剩余的过氧化氢可将Fe2+氧化成Fe3+，然后与硫氰酸根离子形成红色络合物，通过测定475nm处的吸光值即可测定微量过氧化氢的含量。此法较为灵敏，可以测出微量过氧化氢的含量变化。
将5μl重组Prx6蛋白(约1.5μg)加入85μl的反应缓冲液(1mMDTT/0.03×PBS/0.5％甘油，pH=7.4)中室温孵育2min，然后加入10μl不同浓度的H2O2使反应开始(0.1～2mM)，反应温度为37℃，待反应至所设定时间时加入40μl26％的三氯乙酸终止反应。向体系中加入40μl硫酸亚铁铵(Fe(NH4)2(SO4)2)和20μl硫氰酸钾(KSCN)，与剩余过氧化氢反应后形成红色络合物，测定A475nm后与H2O2标准曲线对比即可得到剩余过氧化氢的含量，进而计算出反应速度。
用灵敏的硫氰酸铁法来测定Prx6催化H2O2反应动力学。在37℃，pH=7.4的条件下，Prx6催化H2O2反应的最大反应速率Vmax≈0.78nM/min，Km≈2.16×10-4M。Prx6催化H2O2反应的Km值比过氧化氢酶催化H2O2反应的Km值(2.5×10-2M)分别小约120倍，表明它们与底物有较好的亲和力。
综上所述，本发明克隆的泥蚶Prx6基因能在体外重组表达，表达蛋白具有较强的抗氧化活性。
本文对泥蚶的抗氧化性质的研究为其可能在水产免疫增强剂、食品防氧化、化妆品工业、水产动物疾病分子诊断等领域的应用奠定了基础。

Claims (5)

1.一种抗氧化蛋白Peroxiredoxin-6，其特征在于，所述的抗氧化蛋白Peroxiredoxin-6包含有：
1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白；
2)在1)中的氨基酸中取代、缺少或添加一个或一个氨基酸，具有与1)中功能的蛋白。
2.一种基因，其特征在于，所述的基因用于编码权利要求1所述的抗氧化蛋白Peroxiredoxin-6。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQID NO:2。
4.权利要求1所述的抗氧化蛋白Peroxiredoxin-6在制备抗氧化剂中的应用。
5.权利要求1所述抗氧化蛋白Peroxiredoxin-6在制备饲料添加剂中的应用。
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