CN111394357B - 一种猪rspo1基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪RSPO1基因及其应用。本发明首次克隆得到了一种猪RSPO1基因，利用该基因构建得到一种重组载体PET‑32α‑Rspondin 1，进而表达得到了一种重组蛋白质rpRSPO1；该重组蛋白质rpRSPO1具有生物活性，能够显著提高细胞活力、促进细胞增殖；还能够有效缓解呕吐毒素诱导的动物平均日增重下降、平均日采食量下降、单位长度空肠重量降低和肠道跨膜电阻值降低，显著提高动物生长性能、增强肠道屏障防御功能；因此，所述猪RSPO1基因、所述蛋白质rpRSPO1或所述重组载体在制备细胞和哺乳动物生长促进剂、以及制备缓解呕吐毒素诱导的动物肠道损伤的制剂中具有广泛的应用前景。

Description

一种猪RSPO1基因及其应用
技术领域
本发明属于生物技术技术领域。更具体地，涉及一种猪RSPO1基因及其应用。
背景技术
Wnt/β-catenin信号通路在机体生长发育过程中发挥着重要的作用，其中，R-spondin 1(RSPO1)作为Wnt/β-catenin信号通路增强剂，通过有效结合膜受体E3泛素连接酶ZNRF3、RNF43以及Lgr4/5/6，抑制ZNRF3、RNF43对Wnt受体卷曲家族成员Frizzleds泛素化降解，以提高Frizzleds受体结合Wnt配体的敏感性，促进Wnt/β-catenin信号通路的激活，维持生命的正常代谢。
呕吐毒素是最常见的一种污染饲料和食品的霉菌毒素，无论在发展中国家还是发达国家，呕吐毒素污染问题均受到了广泛关注。呕吐毒素是世界上谷物污染面积较广的一种毒素，其作用的首要靶器官是动物肠道，能抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，损伤肠道屏障和吸收功能，最终导致动物生长发育受阻，给畜牧业带来巨大经济损失。例如，有研究表明呕吐毒素抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性，降低肠道干细胞活性。另外，食品中的呕吐毒素也会导致人的肠道损伤、腹泻和呕吐，严重危害人类健康。
目前，去除或降低饲料和食品的呕吐毒素含量的方法包括物理法、化学法和生物脱毒法，以上方法均能够降低呕吐毒素的含量，但同时也使得营养物质的大量流失，适口性差，造成生物安全性和规模化生产等问题。因此，亟需提供一种无毒副作用、能够大规模推广应用的用于缓解呕吐毒素诱导的肠道损伤的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有用于促进细胞增殖和动物生长，及其缓解呕吐毒素诱导的肠道损伤的方法的缺陷和不足，提供一种猪RSPO1基因及其应用。
本发明的目的是提供一种猪RSPO1基因。
本发明另一目的是提供所述猪RSPO1基因编码的蛋白质rpRSPO1。
本发明又一目的是提供一种重组载体。
本发明又一目的是提供所述猪RSPO1基因、所述蛋白质rpRSPO1或所述重组载体在制备细胞生长促进剂中的应用。
本发明再一目的是提供所述猪RSPO1基因、所述蛋白质rpRSPO1或所述重组载体在制备动物促生长饲料添加剂中的应用。
本发明再一目的是提供所述猪RSPO1基因、所述蛋白质rpRSPO1或所述重组载体在制备缓解呕吐毒素诱导的动物肠道损伤的制剂中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明首先提供了一种猪RSPO1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了所述猪RSPO1基因编码的蛋白质rpRSPO1，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明还提供了一种重组载体，含有所述猪RSPO1基因。
本发明经过创造性的探索研究，发现体外重组表达的蛋白质rpRSPO1能够显著提高肠道上皮细胞活力(P<0.05)，显著提高细胞增殖标志PCNA以及Wnt/β-catenin信号通路相关靶蛋白质(β-catenin、TCF4、CyclinD1)的表达量(P<0.05)。因此，所述猪RSPO1基因、所述蛋白质rpRSPO1或所述重组载体在制备细胞生长促进剂中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述应用为在增加细胞活力、促进细胞增殖中的应用。
优选地，所述细胞为肠上皮细胞。
另外，所述猪RSPO1基因、所述蛋白质rpRSPO1或所述重组载体在制备动物促生长饲料添加剂中的应用，以及在制备缓解呕吐毒素诱导的动物肠道损伤的制剂中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述应用为缓解呕吐毒素诱导的动物平均日增重下降、平均日采食量下降、单位长度空肠重量降低和肠道跨膜电阻值降低，提高动物平均日增重、平均日采食量、单位长度空肠重量和肠道跨膜电阻值。
优选地，所述动物为哺乳动物。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次提供了一种猪RSPO1基因，该基因的编码区片段大小为789bp，利用该基因构建得到了一种重组载体PET-32α-Rspondin 1，并表达得到了一种重组蛋白质rpRSPO1；研究表明重组蛋白质rpRSPO1具有生物活性，能够显著提高细胞活力，显著提高细胞增殖标志PCNA以及Wnt/β-catenin信号通路相关靶蛋白质(β-catenin、TCF4、CyclinD1)的表达量，以促进细胞增殖；还能够有效缓解呕吐毒素诱导的动物平均日增重下降、平均日采食量下降、单位长度空肠重量降低和肠道跨膜电阻值降低，提高动物平均日增重、平均日采食量、单位长度空肠重量和肠道跨膜电阻值，进而显著提高动物生长性能、增强肠道屏障防御功能；因此，所述猪RSPO1基因、所述蛋白质rpRSPO1或所述重组载体在制备细胞和哺乳动物的生长促进剂、以及制备缓解呕吐毒素诱导的动物肠道损伤的制剂中具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是猪RSPO1目的片段的电泳结果图；其中，M：DNA 2000Marker；1：猪RSPO1目的片段。
图2是限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ分别单、双酶切验证重组载体的结果图；其中，M：DNA 10000Marker；1：KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切验证重组载体；2：KpnⅠ单酶切验证重组载体；2：EcoRⅠ单酶切验证重组载体。
图3是重组载体转入感受态细胞后形成的单菌落的转化子阳性鉴定结果图；其中，M：DNA 2000Marker；1、2、3和4分别为挑取的4个单克隆。
图4是重组载体在不同感受态细胞中表达重组蛋白质rpRSPO1的结果图；其中，1：对照工程菌；2：工程菌BL 21；3：工程菌Rosetta。
图5是利用His标签抗体和人源化R-spondin 1抗体Western blotting鉴定重组蛋白质rpRSPO1的属性结果图；其中，1：诱导前对照工程菌；2：诱导前工程菌Rosetta；3：诱导后对照工程菌；4：诱导后工程菌Rosetta。
图6是重组蛋白质rpRSPO1对猪小肠上皮细胞活力的影响结果图。
图7是重组蛋白质rpRSPO1对猪小肠上皮细胞增殖的影响结果图；其中，(A)图是Western blotting结果图；(B)图是Western blotting结果统计图。
图8是重组蛋白质rpRSPO1对小鼠结肠癌细胞活力的影响结果图。
图9是重组蛋白质rpRSPO1对小鼠生长性能的影响结果图；其中，(A)图是重组蛋白质rpRSPO1对小鼠平均日增重的影响结果图；(B)图是重组蛋白质rpRSPO1对小鼠平均日采食量的影响结果图。
图10是重组蛋白质rpRSPO1对呕吐毒素诱导小鼠单位长度空肠重量的影响结果图。
图11是重组蛋白质rpRSPO1对小鼠肠道跨膜电阻值的影响结果图。
图12是重组蛋白质rpRSPO1对小鼠肠绒毛高度的影响结果图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1猪RSPO1的克隆、蛋白表达和纯化
1、猪RSPO1编码区目的片段的获得
(1)实验方法
分离7日龄仔猪小肠，采用Trizol法抽提其空肠RNA，使用随机引物N6(5’-NNNNNN-3’)反转录为cDNA，RNA反转录为cDNA的反应体系如表1所示。
RNA反转录为cDNA的反应条件为：37℃保温60min，80℃灭活5min，12℃10min。
表1 RNA反转录为cDNA的反应体系
反转录酶buffer 5μL
RNase inhibitor 0.25μL
反转录酶 1μL
随机引物N6 2μL
dNTP 2.5μL
DEPC水 1.25μL
然后，设计猪RSPO1的克隆引物F1/R1(引物F1:5’-ATGCGGCT TGGGCTGTGTGTGTG-3’；引物R1:5’-CTAGGTGGGTCCCGCAGAGGTG-3’)，以cDNA为模板，按照表2所示的猪RSPO1的克隆PCR体系进行PCR反应，得到猪RSPO1目的片段。
猪RSPO1的克隆PCR反应条件为：94℃2min，98℃10s，58℃30s，68℃1min，68℃5min，35个循环。
表2猪RSPO1的克隆PCR体系
Figure BDA0002398053560000041
Figure BDA0002398053560000051
(2)实验结果
猪RSPO1目的片段的电泳结果图如图1所示，可以看出，猪RSPO1目的片段的大小为789bp，猪RSPO1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2、重组载体PET-32α-Rspondin 1的获得
(1)实验方法
使用限制性内切酶Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ分别双酶切猪RSPO1目的片段和载体PET-32α，使用T4连接酶将双酶切过后的猪RSPO1目的片段和载体PET-32α连接(连接体系如表3所示)，16℃连接16h，获得重组载体PET-32α-Rspondin 1。
表3猪RSPO1目的片段和载体PET-32α连接体系
猪RSPO1目的片段 0.5μL
PET-32α 0.6μL
T4 DNA ligase buffer 2μL
加水至 20μL
(2)实验结果
限制性内切酶Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ分别单、双酶切验证重组载体的结果图如图2所示，可以看出，酶切结果均符合预期。
3、重组蛋白质的表达
(1)实验方法
将重组载体PET-32α-Rspondin 1转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆，并鉴定其是否为阳性转化子，其转化步骤为：
a.取10μL连接产物与50μL DH5α感受态细胞在冰上混匀，静置30min；
b.42℃水浴80s，冰上静置3min；
c.加入5倍体积的LB液体培养基，37℃，200r/min摇1h；
d.3000r/min，离心2min，弃上清余60μL左右吹打均匀后涂板；
e.平板倒放于37℃培养箱内培养，挑取单克隆测序，保种，并提取其载体，将提取的载体分别重新转化到工程菌Rosetta、工程菌BL 21和对照工程菌内，吸取表达菌1mL到100mL LB液体培养基，37℃、200r/min培养至OD＝0.6～0.8，加入IPTG至终浓度1mmol/L，37℃，200r/min继续培养四个小时，经IPTG诱导后，获得带有His标签的重组蛋白质rpRSPO1。离心，弃上清，用Lysis buffer溶液重悬上清，超声波破碎30min，将上清液置于镍柱中，于4℃冰箱中结合60min，除去下端封闭盖，流出悬液，使用不同浓度的咪唑洗涤镍柱，最后使用500mmol/L的咪唑进行洗脱，将洗脱下的溶液冰上透析，对收集到的溶液进行SDS-PAGE电泳分析重组蛋白质rpRSPO1的表达情况。
(2)实验结果
重组载体转入感受态细胞后形成的单菌落的转化子阳性鉴定结果图如图3所示，可以看出，4个单克隆均扩增出单一明亮的条带，说明转化子均已成功的转化至目的位置。
重组载体在不同感受态细胞中表达重组蛋白质rpRSPO1的结果图如图4所示，可以看出，与工程菌BL 21相比，重组载体在工程菌Rosetta中的表达量更优。
利用His标签抗体和人源化RSPO1抗体Western blotting鉴定重组蛋白质rpRSPO1的属性结果图如图5所示，可以看出，重组蛋白质rpRSPO1已经成功表达。
实施例2重组蛋白质rpRSPO1对猪小肠上皮细胞增殖及其细胞活力的影响
1、实验方法
将IPEC-J2细胞以每孔3×103个细胞接种到96孔细胞培养板中，对照组用完全培养基培养，试验组用含1μg/mL rpRSPO1蛋白质溶液的完全培养基培养，分别在接种后的第24h、48h、72h和96h检测细胞活力。
将猪小肠上皮细胞(IPEC-J2细胞)以每孔1×104个细胞接种到6孔细胞培养板中，对照组用完全培养基培养，试验组用含1μg/mL rpRSPO1蛋白质溶液的完全培养基培养，分别在接种后的第24h、48h、96h和120h，根据密度换算出细胞数目。
2、实验结果
重组蛋白质rpRSPO1对猪小肠上皮细胞活力的影响结果图如图6所示，可以看出，与对照组相比，重组蛋白质rpRSPO1处理IPEC-J2细胞72h后，能够显著提高IPEC-J2细胞活力(P<0.05)。
重组蛋白质rpRSPO1对猪小肠上皮细胞增殖的影响结果图如图7所示，其中，(A)图是Western blotting结果图；(B)图是Western blotting结果统计图；可以看出，与对照组相比，重组蛋白质rpRSPO1处理IPEC-J2细胞后，能够显著提高细胞增殖标志PCNA以及Wnt/β-catenin信号通路相关靶蛋白质(β-catenin、TCF4、CyclinD1)的表达量(P<0.05)。
实施例3重组蛋白质rpRSPO1对小鼠结肠癌细胞活力的影响
1、实验方法
将小鼠结肠癌细胞(CMT-93细胞)以每孔3×103个细胞接种到96孔细胞培养板中，对照组用完全培养基培养，试验组用含1μg/mL rpRSPO1蛋白质溶液的完全培养基培养，分别在接种后的第24h、48h、72h和96h检测细胞活力。
2、实验结果
重组蛋白质rpRSPO1对小鼠结肠癌细胞活力的影响结果图如图8所示，可以看出，与对照组相比，重组蛋白质rpRSPO1处理CMT-93细胞72h后，能够显著提高CMT-93细胞活力(P<0.05)。
实施例4重组蛋白质rpRSPO1对小鼠生长和肠道屏障功能的影响
1、实验动物及分组
选取体重相近的4周龄C57BL/6雄性健康小鼠32只，随机分为4个组：对照组、调控剂组(rpRSPO1组)、呕吐毒素组(DON组)、缓解组(D+rpRSPO1组)，实验分组及处理方法如表4所示，每个组8个重复，每个重复1只小鼠。
表4实验分组及处理方法
组别 灌胃方案
对照组 磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)
调控剂组 5.5mg/kg body weight(BW)rpRSPO1
呕吐毒素组 3.0mg/kg BW呕吐毒素+PBS
缓解组 3.0mg/kg BW呕吐毒素+5.5mg/kg BW rpRSPO1
2、实验过程
攻毒前：共3天，每天早上8:00，给小鼠灌胃0.15mLPBS或5.5mg/kg rpRSPO1蛋白质(BW代表小鼠体重)；其中，对照组和呕吐毒素组灌胃PBS，调控剂组和缓解组灌胃5.5mg/kgrpRSPO1蛋白质(每只小鼠灌胃前均用PBS润洗灌胃针)；
攻毒期：共5天，对照组灌胃0.3mL PBS，呕吐毒素组分别灌胃0.15mL DON+0.15mLPBS，调控剂组灌胃5.5mg/kg rpRSPO1蛋白质，缓解组分别灌胃0.15mL DON+5.5mg/kgrpRSPO1蛋白质；
攻毒后：灌胃情况与攻毒前相同，并于攻毒结束后72h(即正式期第11d)采样。
3、测定指标及方法
统计小鼠采食量、饮水量及体重，计算小鼠的平均日增重和平均日采食量，称量小鼠单位长度空肠重量，利用Ussing Chamber检测小鼠肠道跨膜电阻值(Transepithelialelectrical resistance，TEER)。
4、实验结果
重组蛋白质rpRSPO1对小鼠生长性能的影响结果图如图9所示，其中，(A)图为重组蛋白质rpRSPO1对小鼠平均日增重的影响结果图，可以看出，与对照组相比，重组蛋白质rpRSPO1能够增加小鼠平均日增重；与呕吐毒素组相比，缓解组能够有效缓解呕吐毒素诱导的小鼠平均日增重下降(P<0.05)；(B)图为重组蛋白质rpRSPO1对小鼠平均日采食量的影响结果图，可以看出，与对照组相比，重组蛋白质rpRSPO1能够显著增加小鼠平均日采食量(P<0.05)；与呕吐毒素组相比，缓解组能够有效缓解呕吐毒素诱导的小鼠平均日采食量下降；说明重组蛋白质rpRSPO1能够显著提高小鼠的生长性能。
重组蛋白质rpRSPO1对呕吐毒素诱导小鼠单位长度空肠重量的影响结果图如图10所示，可以看出，与对照组相比，重组蛋白质rpRSPO1能够增加小鼠单位长度空肠重量；与呕吐毒素组相比，缓解组能够有效缓解呕吐毒素诱导的小鼠单位长度空肠重量降低，显著增加小鼠单位长度空肠重量(P<0.05)。
重组蛋白质rpRSPO1对小鼠肠道跨膜电阻值的影响结果图如图11所示，可以看出，与对照组相比，重组蛋白质rpRSPO1能够显著增加小鼠肠道跨膜电阻值(P<0.05)，增强肠道屏障功能；与呕吐毒素组相比，缓解组能够有效缓解呕吐毒素诱导的小鼠肠道跨膜电阻值降低，显著增大小鼠肠道跨膜电阻值(P<0.05)，增强肠道屏障防御功能。
重组蛋白质rpRSPO1对小鼠肠绒毛高度的影响结果图如图12所示，可以看出，与对照组相比，重组蛋白质rpRSPO1能够提高小鼠空肠绒毛高度；与呕吐毒素组相比，缓解组能够有效缓解呕吐毒素诱导的小鼠肠绒毛降低，提高肠道吸收功能。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种猪RSPO1基因及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 789
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcggcttg ggctgtgtgt ggtggccctg gttctgagct ggatgcatct cgccgccggc 60
agccggggga tcaaggggaa gaggcagagg cggatcagcg ccgaggggag ccaggcctgt 120
gccaaaggct gtgagctctg ttcggaggtc aacggctgcc ttaagtgctc gcccaagctg 180
ttcatcctgc tggagaggaa tgacatccgc caggtgggcg tttgcttgcc atcctgcccc 240
cctggatact tcgatgcccg caaccccgac atgaacaaat gcatcaaatg caagatcgag 300
cactgcgagg cctgcttcag ccataatttc tgcaccaagt gtaaggagag cttgtatctg 360
cacaagggcc gctgctatcc cgcctgtccc gagggctctg cggctgccaa cggcaccatg 420
gagtgcagca gccctgcaca atgtgaaatg agcgagtggt ctctgtgggg gccgtgctcc 480
aagaagaaga agctctgtgg cttccggagg ggcttggagg agcgaacacg gagggtgctc 540
caggcccctg ggggggacca cgccatctgc tccgacacca aggaaacccg gaggtgcact 600
gtgcggagga cgccctgccc cgagggccag aagaggagga agggtggcca gggccggcgg 660
gagaacgcca acaggaaccc cagccggaag gagggcaagg aagcgggcgc cggtgctcgg 720
agacgcaagg gccagcagca gcagcaccag gggacagtgg ggccgatcac ctctgcggga 780
cccacctag 789
<210> 2
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Arg Leu Gly Leu Cys Val Val Ala Leu Val Leu Ser Trp Met His
1 5 10 15
Leu Ala Ala Gly Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile
20 25 30
Ser Ala Glu Gly Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser
35 40 45
Glu Val Asn Gly Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu
50 55 60
Glu Arg Asn Asp Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro
65 70 75 80
Pro Gly Tyr Phe Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys
85 90 95
Cys Lys Ile Glu His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr
100 105 110
Lys Cys Lys Glu Ser Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala
115 120 125
Cys Pro Glu Gly Ser Ala Ala Ala Asn Gly Thr Met Glu Cys Ser Ser
130 135 140
Pro Ala Gln Cys Glu Met Ser Glu Trp Ser Leu Trp Gly Pro Cys Ser
145 150 155 160
Lys Lys Lys Lys Leu Cys Gly Phe Arg Arg Gly Leu Glu Glu Arg Thr
165 170 175
Arg Arg Val Leu Gln Ala Pro Gly Gly Asp His Ala Ile Cys Ser Asp
180 185 190
Thr Lys Glu Thr Arg Arg Cys Thr Val Arg Arg Thr Pro Cys Pro Glu
195 200 205
Gly Gln Lys Arg Arg Lys Gly Gly Gln Gly Arg Arg Glu Asn Ala Asn
210 215 220
Arg Asn Pro Ser Arg Lys Glu Gly Lys Glu Ala Gly Ala Gly Ala Arg
225 230 235 240
Arg Arg Lys Gly Gln Gln Gln Gln His Gln Gly Thr Val Gly Pro Ile
245 250 255
Thr Ser Ala Gly Pro Thr
260

Claims (3)

1.核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的猪RSPO1基因、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质rpRSPO1在制备缓解呕吐毒素诱导的动物肠道损伤的制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为缓解呕吐毒素诱导的动物平均日增重下降、平均日采食量下降、单位长度空肠重量降低和肠道跨膜电阻值降低，提高动物平均日增重、平均日采食量、单位长度空肠重量和肠道跨膜电阻值。
3.根据权利要求1～2所述的应用，其特征在于，所述动物为哺乳动物。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007013666A3 (en) * 2005-07-26 2007-06-21 Kirin Brewery Anti-tumor agents comprising r-spondins
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2007013666A3 (en) * 2005-07-26 2007-06-21 Kirin Brewery Anti-tumor agents comprising r-spondins
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NCBI Reference Sequence: XM_021095970.1.PREDICTED: Sus scrofa R-spondin 1 (RSPO1), mRNA.《NCBI》.2017, *
PREDICTED: Sus scrofa R-spondin 1 (RSPO1), mRNA;NCBI Reference Sequence: XM_021095970.1;《NCBI》;20170513;"ORIGIN"部分，"FEATURES"部分 *
呕吐毒素抑制猪肠上皮细胞增殖和干细胞扩增的机制研究;黎相广;《万方智搜》;20191003;正文第11页第8-9行，第13页第7-8行，第88页倒数第2-3行，第88页最后一段，第90页第3段，第28-29页第2.4.2-2.4.3节，第34页第2段 *

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