CN107384880A

CN107384880A - 一种黄素单加氧酶突变体及其制备方法

Info

Publication number: CN107384880A
Application number: CN201610992431.XA
Authority: CN
Inventors: 路福平; 刘逸寒; 贾雷博
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2016-11-09
Filing date: 2016-11-09
Publication date: 2017-11-24

Abstract

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种黄素单加氧酶突变体及其制备方法。本发明使用易错PCR技术，对野生型黄素单加氧酶进行随机突变，得到黄素单加氧酶突变体，比酶活较野生型黄素单加氧酶的比酶活提高了35％；同时采用酵母表达系统，当黄素单加氧酶展示于酵母表面时，酵母细胞既作为酶的生产者，又可以充当固定化酶中的载体，免去了酶的纯化和固定等操作，简化了生产环节，降低了生产成本。

Description

一种黄素单加氧酶突变体及其制备方法

技术领域：

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种黄素单加氧酶突变体及其制备方法。

技术背景：

蒜氨酸(Alliin，S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜，S-allyl cysteine sulphoxide，SACS)是一种无味无臭的半水合物。蒜氨酸主要存在于大蒜鳞茎的细胞中，是大蒜中含量最多的含硫化合物，占大蒜中所有含硫化合物的85％以上，其含量高达0.5％-1.4％，最高达到3.2％(以干基计算)。

近些年来，西方医药生物研究人员对蒜氨酸的药理作用做了大量研究。经研究发现，蒜氨酸主要有以下几方面作用:广谱抗菌作用。蒜氨酸对金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、白色葡萄球菌、福氏痢疾杆菌、宋氏痢疾杆菌、伤寒杆菌及大肠杆菌等病源微生物均有不同程度的抑制和杀灭作用。在预防和治疗人、畜及水产动物等肠道疾病方面效果显著。能够降低血液中的胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白。抑制血小板聚集，预防和治疗高血脂症和血栓形成及抗动脉粥样硬化。具有抑制肿瘤的作用。蒜氨酸能在胃里增强巨噬细胞的功能，抑制硝酸盐还原菌的生长繁殖，从而使胃肠道内亚硝酸盐的含量减少，防止胃癌及直肠癌的发生。具有抗氧化作用。蒜氨酸还可以抑制脂质过氧化，具有抗氧化和清除自由基的活性，因此在减缓人体衰老等与自由基生成有关的方面发挥重要的作用。还可作为天然防腐剂。其对各种真菌的杀灭作用强度与化学防腐剂苯甲酸、山梨酸相近似。其它作用。还可用于治疗镰刀细胞贫血症；提高并维持肝脏整体的功能；用于治疗各种心血管疾病，如降血压、降低眼压等。此外蒜氨酸在抗衰老、降血脂、提高人体免疫力等方面也有很好效果。而随着研究的深入，新发现的药理作用更加复杂。目前蒜氨酸类保健产品在国外主要用于预防心肌梗死、脑梗死和降血脂等用途。

蒜氨酸既有如此重要的作用，然而，蒜氨酸的生产方法目前主要有化学合成法和组织培养法。化学合成法因为有化学污染、成本较高，因此难以在食品、医药生产中推广应用。组织培养法是1986年佐野孝之辅用大蒜组织培养，得到蒜氨酸等有机硫化物，此法制备的蒜氨酸仅仅处于研究阶段，且大蒜中存在蒜氨酸酶，使得蒜氨酸在分离提取中成本和难度都较高。而酶法催化，通过大蒜来源的黄素单加氧酶将脱氧蒜氨酸(S-烯丙基-L-半胱氨酸，S-Allyl-L-(+)-Cysteine,SAC)中硫元素氧化形成蒜氨酸(Alliin，S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜，S-allyl cysteine sulphoxide，SACS)的方法，具有酶催化效率高，反应条件温和，特异性好等优点。且酶法催化反应用于工业生产时，可以简化工艺流程、降低能耗、节省资源，减少污染。具有很好的利用价值及应用前景。

黄素单加氧酶(Flavin-containing monooxygenase,FMO)，是一组依赖黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavin Adenine Dinucleotide,FAD)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和分子氧的微粒体酶，是重要的肝内药物和化学异物代谢酶，可催化含氮、硫、磷、硒和其他亲核杂原子的化合物和药物的氧化。黄素单加氧酶能够特异性催化半胱氨酸轭合物脱氧蒜氨酸(S-Allyl-L-(+)-Cysteine,SAC)中硫元素的氧化。因此，选择以大蒜来源的黄素单加氧酶来催化SAC合成SACS具有很高的利用价值。

酶分子体外定向进化属于蛋白质的非理性设计，是蛋白质工程的新策略。利用分子生物学手段在分子水平创造出分子的多样性，结合灵敏的筛选技术，迅速得到理想的突变体。它不需事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，而是人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外改造酶基因，获得具有某些预期特征的结构酶。其中，易错PCR是指在扩增目的基因的同时，利用Taq酶不具备3’→5’校对功能，同时改变反应体系中Mn2+、Mg2+和各种dNTP的浓度，以一定的频率向目的基因随机引入碱基错配，导致目的基因发生随机突变。然而，经一次突变的基因一般很难获得满意的结果，由此又发展出连续易错PCR(Sequential Error-prone PCR)策略。即将一次PCR扩增得到的产物作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行易错，使每一次获得的小突变不断进行积累而产生重要的有益突变。因此，具有独有的优势。

毕赤酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速。毕赤酵母表达系统用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。毕赤酵母表达系统具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达系统表达的蛋白质更加稳定，毕赤酵母表达系统具有两种表达形式，包括毕赤酵母游离表达系统和毕赤酵母细胞表面展示系统。毕赤酵母游离表达系统表达的外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达系统表达的蛋白质更加稳定，某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，易于纯化，而毕赤酵母细胞表面展示系统除具有外源基因的翻译后加工能力和蛋白的折叠加工及适度糖基化的优点外，经该系统得到的全细胞催化剂还可以重复利用从而降低生产成本。毕赤酵母表达系统已成为现代分子生物学研究最重要的工具和模型，是表达外源基因比较理想的工具。

在本发明中，新型黄素单加氧酶基因在毕赤酵母表达系统中进行了表达，得到新型的毕赤酵母黄素单加氧酶重组菌株(包括毕赤酵母黄素单加氧酶游离表达重组菌株和毕赤酵母细胞表面展示黄素单加氧酶重组菌株)。重组菌株发酵后，经过相应的处理可得新型黄素单加氧酶催化剂。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种黄素单加氧酶突变体及利用其制备蒜氨酸的方法。

本发明实现上述目的的技术路线如下：取新鲜大蒜鳞茎于液氮中研碎，按照Trizol试剂说明书进行总RNA的提取并进行RT-PCR。以合成的cDNA第一链为模板，设计引物，扩增野生型黄素单加氧酶基因序列(如SEQ IDNO：3所示)。将其与pET28a载体连接后通过易错PCR进行随机突变，获得黄素单加氧酶突变体基因(如SEQ ID NO：5所示)。构建重组载体并在毕赤酵母GS115中成功表达，得到产黄素单加氧酶突变体的重组菌株，进一步通过发酵提取工艺获得新型黄素单加氧酶。

所述突变体氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：6所示；黄素单加氧酶突变体的比酶活较野生型黄素单加氧酶的比酶活提高了35％。

在本发明中采用如下定义：

1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

2、黄素单加氧酶突变体的标识

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示新型黄素单加氧酶突变体中突变的氨基酸。如Leu17Ala，表示位置17的氨基酸由大蒜鳞茎的野生型黄素单加氧酶的Leu替换成Ala，位置的编号对应于SEQ ID NO：4中野生型黄素单加氧酶的氨基酸序列编号；如C49，表示第49位的碱基为C，位置的编号对应于SEQ ID NO：3中野生型黄素单加氧酶的核苷酸序列编号。

本发明中黄素单加氧酶突变前后的碱基及氨基酸对照如下表：

一种黄素单加氧酶突变体的制备方法，包括如下步骤：

⑴通过易错PCR随机突变大蒜鳞茎的野生型黄素单加氧酶基因，获得SEQ ID NO：5所示黄素单加氧酶突变体基因；

⑵将所述的黄素单加氧酶突变体编码基因酶切、连接到表达或展示载体，得到携带黄素单加氧酶突变体编码基因的重组载体；

⑶将重组载体转化至宿主细胞，得到重组菌株；

⑷表达所述的重组菌株，纯化获得如SEQ ID NO：6所示的黄素单加氧酶突变体；

进一步地，所述的表达载体为pPIC9K、所述的宿主细胞为毕赤酵母GS115；

进一步地，所述的展示载体为pPIC9K-Flo、所述的宿主细胞为毕赤酵母GS115。

有益效果：

1、本发明中黄素单加氧酶突变体基因在毕赤酵母表达系统中进行了表达，得到毕赤酵母黄素单加氧酶突变体重组菌株(包括毕赤酵母黄素单加氧酶突变体游离表达重组菌株和毕赤酵母细胞表面展示黄素单加氧酶突变体重组菌株)，重组菌株发酵后，经过相应的处理可得新型黄素单加氧酶催化剂。

2、本发明使用易错PCR技术，对野生型黄素单加氧酶进行随机突变，得到黄素单加氧酶突变体(Leu17Ala)，比酶活较野生型黄素单加氧酶的比酶活提高了23％；

3、本发明采用酵母表面展示系统，将黄素单加氧酶展示于酵母表面，酵母细胞既作为酶的生产者，又可以充当固定化酶中的载体，免去了酶的纯化和固定等操作，简化了生产环节，降低了生产成本。

附图说明：

图1为野生型黄素单加氧酶成熟肽基因的PCR扩增电泳图；

其中：M为DNA Marker，1为黄素单加氧酶成熟肽基因fmo；

图2为本发明重组质粒pPIC9K-fmom酶切验证图；

其中：M为DNA Marker，1为pPIC9K-fmom经EcoRI和NotI双酶切；

图3为本发明重组质粒pPIC9K-Flo-fmom酶切验证图；

其中：M为DNAMarker，1为pPIC9K-Flo-fmom经SnaBI和EcoRI双酶切；

图4为黄素单加氧酶突变体酶活性检测结果图。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施：

实施例1野生型黄素单加氧酶成熟肽基因的获得

1、取新鲜大蒜鳞茎于液氮中研碎，按照Trizol试剂说明书进行总RNA的提取并进行RT-PCR；

2、以合成的cDNA第一链为模板，根据Genbank序列号AB924383.1登录的黄素单加氧酶序列，在其ORF框上下游设计一对引物，分别引入限制性酶切位点BamH I、HindⅢ，设计本发明的黄素单加氧酶基因的扩增引物如下：

上游引物P1(SEQ ID NO.1)：

5’-CGCGGATCCATGGTTTCCTCATCTTGCTCGTC-3’

下游引物P2(SEQ ID NO.2)：

5’-CCCAAGCTTTGAAAGAAATTTGCTGAAAGTTTCTCTTG-3’

以P1和P2作为上、下游引物，以大蒜鳞茎野生型黄素单加氧酶基因组为模板进行扩增；

其扩增的反应条件为：

扩增条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸1min30s反应30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，得到1389bp的条带(图1)，用小量D N A回收试剂盒回收P C R产物，得到本发明的野生型黄素单加氧酶的基因fmo，测序后见序列3，将扩增获得的fmo与载体pET28a载体连接，得到重组质粒pET28a-fmo，并化转入DH5α中。

实施例2黄素单加氧酶突变体基因的获得

1、基于易错PCR技术进行随机突变，构建新型黄素单加氧酶，设计引物如下：上游引物P1(SEQ ID NO.1)：

5’-CGCGGATCCATGGTTTCCTCATCTTGCTCGTC-3’

下游引物P2(SEQ ID NO.2)：

5’-CCCAAGCTTTGAAAGAAATTTGCTGAAAGTTTCTCTTG-3’

在易错PCR反应体系中，以P1和P2作为上下游引物，以野生型黄素单加氧酶成熟肽基因为模板，进行易错PCR。

其扩增的反应条件为：

扩增条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸1min30s反应30个循环；72℃延伸10min。

2、将黄素单加氧酶突变体基因克隆入表达载体pET28a中，转化大肠杆菌BL21(DE3)，接种于每孔含200μL LB液体培养基(含30μg/mL的Kan)的96孔细胞培养板中，于37℃条件下200r/min摇床培养，当OD600达到0.6，向每个孔中加入IPTG(终浓度1mmol/L)，在16℃下诱导16h，4℃下4000r/min离心15min后收集菌体，重悬于15mL预冷的pH为7.4的PBS缓冲液中，用低温超高压连续流动细胞破碎仪破碎细胞，破碎结束后，在4℃下12000r/min离心45min，收集上清液获得粗酶液，随后进行酶活力检测。

3、酶活力检测

反应的总体系为0.5mL，取100uL酶液加入NADPH(终浓度为2mmol/L)，37℃预孵育5min(水浴)，随后加入底物SAC(终浓度为10mmol/L)；继续以37℃孵育20min，最终加入0.5mL预冷的无水乙醇终止反应。将反应混合物4℃离心20min，除去蛋白沉淀。上清液过膜用于LC-MS分析。空白对照分别为：未加蛋白和未加底物。

LC-MS分析采用Agilent 20RBAX SB-C8 3.5um 2.1*150mm色谱柱，流速为0.1mL/min，检测信号为紫外214nm，以10％的甲醇(含0.1％三氟乙酸)为流动相的条件下进行检测。对黄素单加氧酶突变体酶活性检测结果如图4所示，底物SAC与酶液反应后，样品的质谱响应峰在2.544min的位置检测到了产物Alliin(Alliin理论分子量为177，在正离子模式检165测条件下m/z约为178，如图4)。通过检测蒜氨酸的生成率，野生型黄素单加氧酶催化蒜氨酸生成率为23％，新型黄素单加氧酶催化蒜氨酸生成率为31％，结果表明，新型黄素单加氧酶的酶活比野生型黄素单加氧酶的酶活提高了35％。

4、序列测定

将黄素单加氧酶突变体基因序列进行测序(北京华大生物工程公司)，结果表明，此时扩增得到的黄素单加氧酶突变体基因fmom，见序列5。

实施例3毕赤酵母黄素单加氧酶突变体游离表达重组菌的构建

1、黄素单加氧酶突变体表达载体pPIC9K-fmom的构建

将经易错PCR构建获得的黄素单加氧酶突变体基因经EcoRI和NotI双酶切后与同样双酶切的毕赤酵母表达载体pPIC9K用连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109(DH5α)感受态细胞中，经Amp抗性筛选，挑选阳性转化子；提取阳性转化子质粒，经37℃摇管培养后抽提质粒，并进行单、双酶切初步验证，并将酶切验证正确的重组质粒命名为pPIC9K-fmom；将酶切验证正确的阳性克隆送至北京华大基因科技股份有限公司测序，以进一步确保目的基因的正确性，最终确定构建获得正确的重组菌株JM109/pPIC9K-fmom。

2、黄素单加氧酶突变体重组菌株的构建及黄素单加氧酶突变体高表达菌株的筛选

(1)线性化重组表达质粒pPIC9K-fmom的制备。

重组质粒在电转化毕赤酵母GS115前，要先将构建好的重组表达质粒pPIC9K-fmom进行线性化以提高重组质粒在毕赤酵母染色体上的整合效率。每次转化需要线性化质粒DNA 10μg，且质粒越纯，转化效率越高。用SalⅠ这种限制性内切酶将重组质粒进行线性化酶切。酶切完之后，用小量DNA回收试剂盒回收线性化酶切产物。

(2)线性化质粒pPIC9K-fmom电转化毕赤酵母GS115、阳性转化子的鉴定及黄素单加氧酶突变体高产菌株的筛选

①将80μL感受态细胞和10μg经线性化的DNA加入到1.5mL预冷的离心管中，混匀，将反应液转移到预先冰浴的转化杯中；

②将装有转化液的转化杯冰浴5min后，在电转电压1500V，电转时间5ms条件下，进行毕赤酵母电转化；

③脉冲后，立即向转化杯中加入1mL预冷的1mol/L的山梨醇溶液，把转化液转移到一个新的1.5mL离心管中；

④30℃静置培养1-2h，吸取毕赤酵母GS115电转液200μL涂布在MD培养基上；⑤30℃培养直至转化子出现；

⑥挑取转化子单菌落溶解在10μL去离子水中，取2μL菌液，加入Lyticase破壁酶，30℃反应l0min，反应液立即放入-80℃冰箱中冷冻l0min，使酵母细胞壁裂解，释放的基因组作为模板进行PCR。以转入空质粒pPIC9K的毕赤酵母GS115/pPIC9K作为对照，确定阳性转化子。

⑦在确定阳性转化子的基础上，先用含不同浓度遗传霉素的抗性平板筛选高遗传霉素抗性的转化子，然后分别测定这些高遗传霉素抗性的转化子的新型黄素单加氧酶的酶活，以得到新型黄素单加氧酶的高产菌株GS115/pPIC9K-fmom。

实施例4毕赤酵母细胞表面展示黄素单加氧酶突变体重组菌的构建

1、重组质粒pPIC9K-Flo-fmom的构建

将易错PCR纯化产物与载体pPIC9K-Flo经SnaBI和EcoRI双酶切后，将黄素单加氧酶突变体基因连接至载体pPIC9K-Flo中，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，在含有Amp的LB固体培养基中筛选培养，挑取阳性转化子，培养后提质粒，双酶切鉴定并测序，命名为pPIC9K-Flo-fmom。

2、毕赤酵母重组菌的构建

将测序正确的重组质粒经SalI线性化后，用电转化法转化毕赤酵母GS115，MD平板筛选重组子，获得毕赤酵母细胞表面展示黄素单加氧酶突变体重组菌GS115/pPIC9K-Flo-fmom。

实施例5黄素单加氧酶突变体在毕赤酵母游离表达重组菌中的表达及制备

将培养于YPD固体平板上的实施例3所得高产菌株接种至YPD液体培养基中，30℃、250r/min培养24h；以1％的接种量转接到新鲜BMGY培养基中，30℃培养24h，然后6000r/min离心5min得到菌体，转入BMMY培养基中，30℃、250r/min，每隔24h补甲醇，使其终浓度保持在0.5％V/V，培养120h后可得到黄素单加氧酶突变体的粗酶液，检测其酶活为5U/mL。然后采用分级盐析法沉淀新型黄素单加氧酶，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得新型黄素单加氧酶纯酶酶粉。

实施例6毕赤酵母细胞表面展示黄素单加氧酶突变体全细胞催化剂的制备

将培养于YPD固体平板上的实施例4所得的高产菌株接种至YPD液体培养基中，30℃、250r/min培养24h，以1％的接种量转接到新鲜BMGY培养基中，30℃培养24h，然后6000r/min离心5min得到菌体，转入BMMY培养基中，30℃、250r/min培养120h，每隔24h补甲醇，使其终浓度保持在0.5％V/V，然后离心收集取菌体，用双蒸水洗1-2次，加入保护剂，通过真空冷冻干燥制得毕赤酵母细胞表面展示新型黄素单加氧酶全细胞催化剂，检测其酶活为12U/g。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

<120> 一种黄素单加氧酶突变体及其制备方法

<130> 1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgcggatcca tggtttcctc atcttgctcg tc 32

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cccaagcttt gaaagaaatt tgctgaaagt ttctcttg 38

<210> 3

<211> 1371

<212> DNA

<213> 大蒜

<400> 3

atggtttcct catcttgctc gtccattccc aagatgcccg tcacccccct gtcactcgtc 60

acccgccatg tagcaattat tggcgcgggc gcagctggtc tcgtcaccgc ccgtgagctc 120

cgccgcgaag gccatacaac cactattttc gaacgcggat cttcaatcgg tggaacatgg 180

atctacacgc ctgatacaga acccgacccg atgagccaag attcgtcccg acctatagta 240

cactccagcc tgtacaagtc gttgcgaacg aacttaccgc gcgaagtgat gggctttctc 300

gattatcctt ttgtggagaa aacgaacggc ggagatcgga ggaggtttcc aggacacgaa 360

gaggtgttag attatttgga gaggttcggg agggaatttg gggtatccag agaagtgggt 420

atggaaaaag aggtggttag ggttgatatg gagcagggcg ggaaatggac ggtcaaatgg 480

aagggaaaag atggaggcgg cggcgaggag ggttttgatg cggtggttgt ttgcaatggg 540

cattatactg agcctaggtt tgcggagatt cctggaattg atgtatggcc tgggaagcaa 600

atgcatagcc ataactatcg tatccccgaa ccgtttcatg accaagttgt ggttatcatt 660

gggagttccg ctagtgccgt tgatatctca agagatgttg ccagatttgc caaagaagtt 720

cacattgcaa ataggtcaat aactgagggc acgccagcaa agcaacctgg gtatgataat 780

atgtggcttc attcaatgat aaaaatcact cataatgatg gctctgtggt attccatgat 840

ggatgttccg ttcatgttga tgtcatcatg cactgcaccg ggtatgttta taacttccca 900

ttccttaata cgaatggaat cgtcactgtg gacgacaacc gagtggggcc actgtataaa 960

catgtgttcc ctccattact agctccatct ctctctttcg ttggaatacc atggaagatt 1020

gttcccttcc ccttatgcga actacaaagc aagtggatag ctgcagtttt atctggtcga 1080

atttcactcc caacgaaaaa ggagatgatg gaagatgtgg aagcatacta caaacaaatg 1140

gaagctgctg gaattccaaa aagatacaca cataatatcg ggcataacca gtttgactac 1200

gatgactggc ttgctaatga atgtggatat agttgcattg aagagtggag aaggctgatg 1260

tacaaggagg tgagcaaaaa caggaaagag cggcctgaaa gctatcgcga tgaatgggac 1320

gatgatcact tggttgcaca agcaagagaa actttcagca aatttctttc a 1371

<210> 4

<211> 457

<212> PRT

<213> 大蒜

<400> 4

Met Val Ser Ser Ser Cys Ser Ser Ile Pro Lys Met Pro Val Thr Pro

1 5 10 15

Leu Ser Leu Val Thr Arg His Val Ala Ile Ile Gly Ala Gly Ala Ala

20 25 30

Gly Leu Val Thr Ala Arg Glu Leu Arg Arg Glu Gly His Thr Thr Thr

35 40 45

Ile Phe Glu Arg Gly Ser Ser Ile Gly Gly Thr Trp Ile Tyr Thr Pro

50 55 60

Asp Thr Glu Pro Asp Pro Met Ser Gln Asp Ser Ser Arg Pro Ile Val

65 70 75 80

His Ser Ser Leu Tyr Lys Ser Leu Arg Thr Asn Leu Pro Arg Glu Val

85 90 95

Met Gly Phe Leu Asp Tyr Pro Phe Val Glu Lys Thr Asn Gly Gly Asp

100 105 110

Arg Arg Arg Phe Pro Gly His Glu Glu Val Leu Asp Tyr Leu Glu Arg

115 120 125

Phe Gly Arg Glu Phe Gly Val Ser Arg Glu Val Gly Met Glu Lys Glu

130 135 140

Val Val Arg Val Asp Met Glu Gln Gly Gly Lys Trp Thr Val Lys Trp

145 150 155 160

Lys Gly Lys Asp Gly Gly Gly Gly Glu Glu Gly Phe Asp Ala Val Val

165 170 175

Val Cys Asn Gly His Tyr Thr Glu Pro Arg Phe Ala Glu Ile Pro Gly

180 185 190

Ile Asp Val Trp Pro Gly Lys Gln Met His Ser His Asn Tyr Arg Ile

195 200 205

Pro Glu Pro Phe His Asp Gln Val Val Val Ile Ile Gly Ser Ser Ala

210 215 220

Ser Ala Val Asp Ile Ser Arg Asp Val Ala Arg Phe Ala Lys Glu Val

225 230 235 240

His Ile Ala Asn Arg Ser Ile Thr Glu Gly Thr Pro Ala Lys Gln Pro

245 250 255

Gly Tyr Asp Asn Met Trp Leu His Ser Met Ile Lys Ile Thr His Asn

260 265 270

Asp Gly Ser Val Val Phe His Asp Gly Cys Ser Val His Val Asp Val

275 280 285

Ile Met His Cys Thr Gly Tyr Val Tyr Asn Phe Pro Phe Leu Asn Thr

290 295 300

Asn Gly Ile Val Thr Val Asp Asp Asn Arg Val Gly Pro Leu Tyr Lys

305 310 315 320

His Val Phe Pro Pro Leu Leu Ala Pro Ser Leu Ser Phe Val Gly Ile

325 330 335

Pro Trp Lys Ile Val Pro Phe Pro Leu Cys Glu Leu Gln Ser Lys Trp

340 345 350

Ile Ala Ala Val Leu Ser Gly Arg Ile Ser Leu Pro Thr Lys Lys Glu

355 360 365

Met Met Glu Asp Val Glu Ala Tyr Tyr Lys Gln Met Glu Ala Ala Gly

370 375 380

Ile Pro Lys Arg Tyr Thr His Asn Ile Gly His Asn Gln Phe Asp Tyr

385 390 395 400

Asp Asp Trp Leu Ala Asn Glu Cys Gly Tyr Ser Cys Ile Glu Glu Trp

405 410 415

Arg Arg Leu Met Tyr Lys Glu Val Ser Lys Asn Arg Lys Glu Arg Pro

420 425 430

Glu Ser Tyr Arg Asp Glu Trp Asp Asp Asp His Leu Val Ala Gln Ala

435 440 445

Arg Glu Thr Phe Ser Lys Phe Leu Ser

450 455

<210> 5

<211> 1371

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggtttcct catcttgctc gtccattccc aagatgcccg tcacccccgc gtcactcgtc 60

acccgccatg tagcaattat tggcgcgggc gcagctggtc tcgtcaccgc ccgtgagctc 120

cgccgcgaag gccatacaac cactattttc gaacgcggat cttcaatcgg tggaacatgg 180

atctacacgc ctgatacaga acccgacccg atgagccaag attcgtcccg acctatagta 240

cactccagcc tgtacaagtc gttgcgaacg aacttaccgc gcgaagtgat gggctttctc 300

gattatcctt ttgtggagaa aacgaacggc ggagatcgga ggaggtttcc aggacacgaa 360

gaggtgttag attatttgga gaggttcggg agggaatttg gggtatccag agaagtgggt 420

atggaaaaag aggtggttag ggttgatatg gagcagggcg ggaaatggac ggtcaaatgg 480

aagggaaaag atggaggcgg cggcgaggag ggttttgatg cggtggttgt ttgcaatggg 540

cattatactg agcctaggtt tgcggagatt cctggaattg atgtatggcc tgggaagcaa 600

atgcatagcc ataactatcg tatccccgaa ccgtttcatg accaagttgt ggttatcatt 660

gggagttccg ctagtgccgt tgatatctca agagatgttg ccagatttgc caaagaagtt 720

cacattgcaa ataggtcaat aactgagggc acgccagcaa agcaacctgg gtatgataat 780

atgtggcttc attcaatgat aaaaatcact cataatgatg gctctgtggt attccatgat 840

ggatgttccg ttcatgttga tgtcatcatg cactgcaccg ggtatgttta taacttccca 900

ttccttaata cgaatggaat cgtcactgtg gacgacaacc gagtggggcc actgtataaa 960

catgtgttcc ctccattact agctccatct ctctctttcg ttggaatacc atggaagatt 1020

gttcccttcc ccttatgcga actacaaagc aagtggatag ctgcagtttt atctggtcga 1080

atttcactcc caacgaaaaa ggagatgatg gaagatgtgg aagcatacta caaacaaatg 1140

gaagctgctg gaattccaaa aagatacaca cataatatcg ggcataacca gtttgactac 1200

gatgactggc ttgctaatga atgtggatat agttgcattg aagagtggag aaggctgatg 1260

tacaaggagg tgagcaaaaa caggaaagag cggcctgaaa gctatcgcga tgaatgggac 1320

gatgatcact tggttgcaca agcaagagaa actttcagca aatttctttc a 1371

<210> 6

<211> 457

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Val Ser Ser Ser Cys Ser Ser Ile Pro Lys Met Pro Val Thr Pro

1 5 10 15

Ala Ser Leu Val Thr Arg His Val Ala Ile Ile Gly Ala Gly Ala Ala

20 25 30

Gly Leu Val Thr Ala Arg Glu Leu Arg Arg Glu Gly His Thr Thr Thr

35 40 45

Ile Phe Glu Arg Gly Ser Ser Ile Gly Gly Thr Trp Ile Tyr Thr Pro

50 55 60

Asp Thr Glu Pro Asp Pro Met Ser Gln Asp Ser Ser Arg Pro Ile Val

65 70 75 80

His Ser Ser Leu Tyr Lys Ser Leu Arg Thr Asn Leu Pro Arg Glu Val

85 90 95

Met Gly Phe Leu Asp Tyr Pro Phe Val Glu Lys Thr Asn Gly Gly Asp

100 105 110

Arg Arg Arg Phe Pro Gly His Glu Glu Val Leu Asp Tyr Leu Glu Arg

115 120 125

Phe Gly Arg Glu Phe Gly Val Ser Arg Glu Val Gly Met Glu Lys Glu

130 135 140

Val Val Arg Val Asp Met Glu Gln Gly Gly Lys Trp Thr Val Lys Trp

145 150 155 160

Lys Gly Lys Asp Gly Gly Gly Gly Glu Glu Gly Phe Asp Ala Val Val

165 170 175

Val Cys Asn Gly His Tyr Thr Glu Pro Arg Phe Ala Glu Ile Pro Gly

180 185 190

Ile Asp Val Trp Pro Gly Lys Gln Met His Ser His Asn Tyr Arg Ile

195 200 205

Pro Glu Pro Phe His Asp Gln Val Val Val Ile Ile Gly Ser Ser Ala

210 215 220

Ser Ala Val Asp Ile Ser Arg Asp Val Ala Arg Phe Ala Lys Glu Val

225 230 235 240

His Ile Ala Asn Arg Ser Ile Thr Glu Gly Thr Pro Ala Lys Gln Pro

245 250 255

Gly Tyr Asp Asn Met Trp Leu His Ser Met Ile Lys Ile Thr His Asn

260 265 270

Asp Gly Ser Val Val Phe His Asp Gly Cys Ser Val His Val Asp Val

275 280 285

Ile Met His Cys Thr Gly Tyr Val Tyr Asn Phe Pro Phe Leu Asn Thr

290 295 300

Asn Gly Ile Val Thr Val Asp Asp Asn Arg Val Gly Pro Leu Tyr Lys

305 310 315 320

His Val Phe Pro Pro Leu Leu Ala Pro Ser Leu Ser Phe Val Gly Ile

325 330 335

Pro Trp Lys Ile Val Pro Phe Pro Leu Cys Glu Leu Gln Ser Lys Trp

340 345 350

Ile Ala Ala Val Leu Ser Gly Arg Ile Ser Leu Pro Thr Lys Lys Glu

355 360 365

Met Met Glu Asp Val Glu Ala Tyr Tyr Lys Gln Met Glu Ala Ala Gly

370 375 380

Ile Pro Lys Arg Tyr Thr His Asn Ile Gly His Asn Gln Phe Asp Tyr

385 390 395 400

Asp Asp Trp Leu Ala Asn Glu Cys Gly Tyr Ser Cys Ile Glu Glu Trp

405 410 415

Arg Arg Leu Met Tyr Lys Glu Val Ser Lys Asn Arg Lys Glu Arg Pro

420 425 430

Glu Ser Tyr Arg Asp Glu Trp Asp Asp Asp His Leu Val Ala Gln Ala

435 440 445

Arg Glu Thr Phe Ser Lys Phe Leu Ser

450 455

Claims

1.一种黄素单加氧酶突变体，其特征在于，所述突变体其氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.6所示。

2.权利要求1所述黄素单加氧酶突变体的编码基因。

3.权利要求2所述黄素单加氧酶突变体的编码基因，其特征在于，如序列表SEQ IDNo.5所示。

4.权利要求1所述黄素单加氧酶突变体或权利要求2所述的基因的用途，其特征在于，用于蒜氨酸的制备。

5.一种包含权利要求2所述的基因的表达载体或宿主细胞。

6.如权利要求5所述的表达载体或宿主细胞，其特征在于，所述表达载体为pPIC 9K，宿主细胞为毕赤酵母GS115；或者，展示载体为pPIC9K-Flo，宿主细胞为毕赤酵母GS115。

7.权利要求1所述黄素单加氧酶突变体突变体的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将权利要求2所述的基因进行酶切，与表达载体连接得到了新的重组载体；

(2)将重组载体转化入宿主细胞中，得到重组菌株，之后将重组菌株发酵，得到高活力黄素单加氧酶突变体。