CN109370993B - 一种酶活提高的苯乙烯单加氧酶突变体及其应用 - Google Patents

一种酶活提高的苯乙烯单加氧酶突变体及其应用 Download PDF

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杨套伟
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Abstract

本发明公开了一种酶活提高的苯乙烯单加氧酶突变体及其应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。此突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的苯乙烯单加氧酶的第305位氨基酸由天冬氨酸突变为甘氨酸得到的；此突变体的酶活可达99.12±1.5U/mL、Kcat/Km可达268.2±19.5mM‑1·min‑1，分别较野生型提高了1.7倍、3.4倍；此突变体的温度稳定性以及pH稳定性较野生型有了明显的提高，将此突变体在60℃下保持24h依旧可残留59％的酶活，在pH5.0的状态下保持12h依然可残留71％的酶活。

Description

一种酶活提高的苯乙烯单加氧酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及一种酶活提高的苯乙烯单加氧酶突变体及其应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。
背景技术
环氧化合物是一类具有三元环醚结构的化合物，由于其可与多种试剂发生开环反应，因此，可作为合成许多光学活性药物、农药以及一些精细化学品的重要前体物，在有机合成、制药工业、香料工业等领域均具有重要的应用。
传统的手性环氧化合物生产多采用化学催化法，但是，由于化学催化法需先制备具有MFI结构的结晶性钛硅酸盐催化剂，然后才能在液相中，同时以贵金属催化剂和具有MFI结构的结晶性钛硅酸盐催化剂作为双催化剂使烯烃、氧和氢进行反应以制备手性环氧化合物，化学催化法具有反应条件苛刻、选择性低、副产物多、分离纯化困难的缺陷，并且，化学催化法使用的重金属催化剂还会造成严重的环境污染。
因此，急需找到新的合成手性环氧化合物的方法替代传统的化学催化法，以解决传统化学催化法具有的缺陷。
苯乙烯单加氧酶(Styrene monooxygenase，SMO，1.14.14.11)是一种重要的黄素依赖型单加氧酶，可以参与许多不同种类的氧化反应，尤其能够催化苯乙烯环氧化作用生成氧化苯乙烯，并且，苯乙烯单加氧酶具有优异的立体选择性，可以催化苯乙烯类化合物得到光学纯(S)环氧化合物，ee值高于99％。
因此，若可用苯乙烯单加氧酶催化苯乙烯类化合物以生产手性环氧化合物，无疑可很大程度上的解决传统化学催化法的缺陷。
但是，由于苯乙烯单加氧酶的生产依赖NADH，Pseudomonas putida、Pseudomonasputida、Pseudomonas sp、Pseudomonas fluorescens等苯乙烯单加氧酶生产菌株均很难大量的产出苯乙烯单加氧酶，使得苯乙烯单加氧酶具有产量低的缺陷，此缺陷大大限制了生物催化法合成手性环氧化合物的工业化进程。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种酶活提高的苯乙烯单加氧酶突变体及其应用。此突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的苯乙烯单加氧酶的第305位氨基酸由天冬氨酸突变为甘氨酸得到的；此突变体的酶活可达99.12±1.5U/mL、Kcat/Km可达268.2±19.5mM-1·min-1，分别较野生型提高了1.7倍、3.4倍；此突变体的温度稳定性以及pH稳定性较野生型有了明显的提高，将此突变体在60℃下保持24h依旧可残留59％的酶活，在pH5.0的状态下保持12h依然可残留71％的酶活；以苯乙烯为底物，利用以编码此突变体的基因为目的基因、以pETdute-1为表达载体、以大肠杆菌为表达宿主构建得到的重组大肠杆菌进行全细胞催化氧化苯乙烯，可使环氧化合物催化效率达到190U/g CDW、转化率达到95％。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种苯乙烯单加氧酶突变体，所述苯乙烯单加氧酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的苯乙烯单加氧酶的第305位氨基酸进行突变得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ IDNO.1的苯乙烯单加氧酶的第305位氨基酸由天冬氨酸突变为甘氨酸得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述苯乙烯单加氧酶的来源为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。
在本发明的一种实施方式中，所述苯乙烯单加氧酶突变体的氨基酸序列为SEQ IDNO.2。
本发明提供了编码上述苯乙烯单加氧酶突变体的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
本发明提供了携带上述基因的重组质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的构建方法为先根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，再根据设计的突变引物，以编码苯乙烯单加氧酶基因的核苷酸序列为模板进行定点突变，得到重组基因；将得到的重组基因连接到表达载体上，得到重组质粒。
在本发明的一种实施方式中，编码所述苯乙烯单加氧酶基因的核苷酸序列为SEQID NO.4。
在本发明的一种实施方式中，所述突变引物中，正向引物的核苷酸序列为SEQ IDNO.5，反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的表达载体为pETdute-1载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组基因与表达载体是通过双酶切进行连接的；所述酶切位点为BamH I以及Hind III。
本发明提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
本发明提供了上述苯乙烯单加氧酶突变体或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞在制备环氧化合物方面的应用。
有益效果：
(1)本发明的突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的苯乙烯单加氧酶的第305位氨基酸由天冬氨酸突变为甘氨酸得到的，其酶活可达99.12±1.5U/mL、Kcat/Km可达268.2±19.5mM-1·min-1，分别较野生型提高了1.7倍、3.4倍；
(2)本发明突变体的温度稳定性以及pH稳定性较野生型有了明显的提高，将其60℃下保持24h依旧可残留59％的酶活，在pH5.0的状态下保持12h依然可残留71％的酶活；
(3)以苯乙烯为底物，利用以编码本发明突变体的基因为目的基因、以pETdute-1为表达载体、以大肠杆菌为表达宿主构建得到的重组大肠杆菌进行全细胞催化氧化苯乙烯，可使环氧化合物催化效率达到190U/g CDW、转化率达到95％。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的E.coli BL21感受态细胞、大肠杆菌JM109感受态细胞以及pETDute-1载体购自上海生工生物工程股份有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
发酵培养基：胰蛋白胨12g/L、酵母提取物8g/L、K3HPO4 4g/L、一水合柠檬酸2.1g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、甘油10g/L、硫酸铵2.5g/L、MgSO4 0.24g/L、NaCl 3g/L，pH 6.8～7.0。
LB固体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L的酵母膏、10g/L的NaCl、0.2g/L的琼脂粉。
LB液体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L的酵母膏、10g/L的NaCl。
下述实施例中涉及的试剂如下：
CaCl2溶液(0.1M)：将11.099g氯化钙用去离子水溶解后定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存。
50％甘油：将50mL甘油用50mL去离子水溶解，高压灭菌后4℃保存。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
苯乙烯单加氧酶酶活测定方法：
以苯乙烯为底物，通过HPLC法测定催化反应中生成的氧化苯乙烯的量；
其中，酶活测定体系：0.1M磷酸钾缓冲液(pH 8.0)、40％十六烷烃、0.2M甲酸铵、0.3mM NADH、1mM NAD+、0.05mM FAD、25mM StyB(NADH-FAD氧化还原酶)、20mM FDH(甲酸脱氢酶)、10mM StyA(FAD依赖型羟化酶)、20mM苯乙烯，30℃，220rpm振荡反应4h，反应完成后，取有机相以HPLC检测底物转化情况；
HPLC方法：高效液相色谱仪为Agilent 1260series，色谱柱为ZORBAX SB-C18柱(4.6×150mm 5-Micron，Agilent)，HPLC条件为:流动相为甲醇/水＝75：25，柱温35℃，流速0.8mL·min-1，检测波长为220nm；
酶活定义：每分钟能催化生成1μmol环氧化物的酶量为一个酶活单位。
催化效率测定方法：
根据酶活测定条件从Lineweaver-Burk双倒数图确定kcat和Km的值；
催化效率的计算公式为：催化效率＝kcat/Km；
其中，酶活测定参见上述苯乙烯单加氧酶酶活测定方法。
转化率测定方法：
转化率的计算公式为：转化率＝(生成产物的量/原来的底物的量)×100％；
其中，生成产物的量参见上述苯乙烯单加氧酶酶活测定方法。
实施例1：含苯乙烯单加氧酶突变体的重组载体的构建
具体步骤如下：
(1)D305G突变体的获得：以SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为模板，Fprimer(序列如SEQ ID NO.5所示)、Rprimer(序列如SEQ ID NO.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQ IDNO.3所示的重组基因A；
(2)D305L突变体的获得：以SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为模板，Fprimer(序列如SEQ ID NO.7所示)、Rprimer(序列如SEQ ID NO.8所示)为引物，进行PCR即得到重组基因B；
(3)D305T突变体的获得：以SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为模板，Fprimer(序列如SEQ ID NO.9所示)、Rprimer(序列如SEQ ID NO.10所示)为引物，进行PCR即得到重组基因C；
(4)将重组基因A-C与pETDute-1分别用BamH I、Hind III双酶切，纯化后用T4DNA连接酶16℃过夜连接，连接产物化学法转化JM109感受态细胞，转化液涂布含氨苄青霉素(200mg/mL)LB平板(由LB固体培养基制成)，提取质粒，通过双酶切及测序验证构建的重组质粒，分别命名为pETDute-1-D305G、pETDute-1-D305L以及pETDute-1-D305T；其中，测序由上海生工完成。
实施例2：产苯乙烯单加氧酶突变体的大肠杆菌工程菌的构建
将实施例1得到的重组质粒pETDute-1-D305G、pETDute-1-D305L以及pETDute-1-D305T分别转化入E.coli BL21感受态细胞，具体步骤如下：
(1)将大肠杆菌在LB平板(由LB固体培养基制成)活化后挑取单菌落接种于10mL新鲜LB液体培养液中，于37℃培养12h，得到种子液；
(2)按照1％接种量将种子液接种到50mL新鲜培养基中，于37℃，180rpm下振荡培养1.5h～2h，至OD600达到0.5左右，得到菌液；
(3)将CaCl2溶液(灭菌)放在冰上预冷15min；
(4)将100mL菌液分装于4个50mL离心管并于冰上冷却20min后，将离心管中的菌液于4℃、8000r/min下离心5min；
(5)弃去50mL离心管中的上清，向50mL离心管中加入5mL预冷的CaCl2溶液，缓慢吹打均匀后于冰上静置15min，再次离心，弃去上清，重复此操作两次；
(6)在50mL离心管中加入3.2mLCaCl2溶液和1.6mL 50％甘油后，将50mL离心管中的液体分装于1.5mL的离心管中，每支离心管分装120μL，得到感受态菌液；
(7)在含有120μL感受态菌液的1.5mL离心管中分别加入重组质粒4μL pETDute-1-D305G、pETDute-1-D305L以及pETDute-1-D305T，混匀后冰上放置半小时，然后42℃准确热击90s，冰上冷置4分钟；
(8)在1.5mL离心管中加入LB液体培养液800μL，于37℃、180rpm/min培养90min后离心，弃去部分上清，剩余菌液重悬后涂布在氨苄抗性平板上，于37℃培养12h，挑取阳性转化子验证，得到重组菌E.coli/pETDute-1-D305G、E.coli/pETDute-1-D305L以及E.coli/pETDute-1-D305T。
实施例3：苯乙烯单加氧酶突变体酶活的测定
具体步骤如下：
将实施例2构建的重组菌E.coli/pETDute-1-D305G、E.coli/pETDute-1-D305L以及E.coli/pETDute-1-D305T与表达未突变的酶的对照菌株E.coli/pETDute-1-SMO分别接种于10mL含氨苄的LB培养基中，37℃振荡培养12h，得到种子液；将种子液按4％的接种量转接于大肠杆菌发酵培养基中诱导表达，37℃培养4h，得到发酵液；取发酵液于4℃、10000r/min离心20min，细胞破碎上清液为胞内粗酶液，然后采用柱纯化得到纯酶液，用于酶活力的测定。
检测结果如下：突变体D305G的酶活为99.12±1.5U/mL，较野生型SMO提高了1.7倍；突变体D305L无酶活；突变体D305T的酶活为58.3±0.85U/mL，与野生型SMO相比无较大改变。
实施例4：苯乙烯单加氧酶突变体酶学性质的测定
具体步骤如下：
将实施例3得到的粗酶液纯化后得到的SMOD305G和野生型SMO在pH5.0的缓冲液中放置12h后测定残余的酶活；
将实施例3得到的粗酶液纯化后得到的SMOD305G和野生型SMO在60℃的条件下保持12h后测定残余的酶活；
将实施例3得到的粗酶液纯化后得到的SMOD305G和野生型SMO进行催化效率的测定。
检测结果如下：SMOD305G在pH5.0的缓冲液中放置12h后残余的酶活为71％，比未突变的SMO提高了28％；SMOD305G在60℃的条件下保持12h后的残余酶活为80％，比未突变的SMO18％；SMOD305G的Kcat/Km为268.2±19.5mM-1·min-1，相比未突变的SMO(76.5±9.2mM-1·min-1)提高了3.4倍。
实施例5：苯乙烯单加氧酶突变体的应用
将SMOD305G在以下不同一相和两相催化体系中进行了全细胞催化，具体步骤如下：
以实施例2构建的重组菌E.coli/pETDute-1-D305G为出发菌株，以苯乙烯为底物，分别以10％DMSO/缓冲液、10％乙醇/缓冲液、15％异戊醇/缓冲液、环己烷/缓冲液(1:1)、邻苯二甲酸二酯/缓冲液(1:1)、十六烷烃/缓冲液(1:1)作为缓冲体系反应4h后，检测催化效率和转化率。
检测结果如下：在10％DMSO/缓冲液的条件下全细胞催化效率为125±8.3U/gCDW；在10％乙醇/缓冲液的条件下全细胞催化效率为115±11.3U/g CDW；在15％异戊醇/缓冲液的条件下全细胞催化效率为105±10.2U/g CDW；在环己烷/缓冲液(1:1)的条件下全细胞催化效率为147±12.4U/g CDW；在苯二甲酸二酯/缓冲液(1:1)的条件下全细胞催化效率为160±15.2U/g CDW；在十六烷烃/缓冲液(1:1)的条件下全细胞催化效率最高，可以达到190U/g CDW，此时，转化率也最高，约为95％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种酶活提高的苯乙烯单加氧酶突变体及其应用
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Lys Lys Arg Ile Gly Ile Val Gly Ala Gly Thr Ala Gly Leu His
1 5 10 15
Leu Gly Leu Phe Leu Arg Gln His Asp Val Asp Val Thr Val Tyr Thr
20 25 30
Asp Arg Lys Pro Asp Glu Tyr Ser Gly Gln Arg Leu Leu Asn Thr Val
35 40 45
Ala His Asn Ala Val Thr Val Gln Arg Glu Val Ala Leu Asp Val Asn
50 55 60
Glu Trp Pro Ser Glu Glu Phe Gly Tyr Phe Gly His Tyr Tyr Tyr Val
65 70 75 80
Gly Gly Pro Gln Pro Met Arg Phe Tyr Gly Asp Leu Lys Ala Pro Ser
85 90 95
Arg Ala Val Asp Tyr Arg Leu Tyr Leu Pro Met Leu Met Arg Ala Leu
100 105 110
Glu Ala Arg Gly Gly Lys Phe Cys Tyr Asp Ala Val Ser Ala Glu Asp
115 120 125
Leu Gly Gly Leu Ser Glu Gln Tyr Asp Leu Leu Val Val Cys Thr Gly
130 135 140
Lys Tyr Ala Leu Gly Lys Val Phe Val Lys Gln Ser Glu Asn Ser Pro
145 150 155 160
Phe Glu Lys Pro Gln Arg Ala Leu Cys Val Gly Leu Phe Lys Gly Ile
165 170 175
Lys Glu Ala Pro Ile Arg Ala Val Thr Met Ser Phe Ser Pro Gly His
180 185 190
Gly Glu Leu Ile Glu Ile Pro Thr Leu Ser Phe Asn Gly Met Ser Thr
195 200 205
Ala Leu Val Leu Glu Asn His Ile Gly Ser Asp Leu Glu Val Leu Ala
210 215 220
His Thr Lys Tyr Asp Asp Asp Pro Arg Ala Phe Leu Asp Leu Met Leu
225 230 235 240
Glu Lys Leu Arg Lys His His Pro Ser Val Ala Glu Arg Ile Asp Pro
245 250 255
Ala Glu Phe Asp Leu Ala Asn Ser Ser Leu Asp Ile Leu Gln Gly Gly
260 265 270
Val Val Pro Val Phe Arg Asp Gly His Ala Thr Leu Asn Asn Gly Lys
275 280 285
Thr Ile Ile Gly Leu Gly Asp Ile Gln Ala Thr Val Asp Pro Val Leu
290 295 300
Asp Gln Gly Ala Asn Met Ala Ser Tyr Ala Ala Trp Ile Leu Gly Glu
305 310 315 320
Glu Ile Leu Ala His Ser Val Tyr Asp Leu Arg Phe Ser Glu His Leu
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<210> 2
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
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Leu Gly Leu Phe Leu Arg Gln His Asp Val Asp Val Thr Val Tyr Thr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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290 295 300
Gly Gln Gly Ala Asn Met Ala Ser Tyr Ala Ala Trp Ile Leu Gly Glu
305 310 315 320
Glu Ile Leu Ala His Ser Val Tyr Asp Leu Arg Phe Ser Glu His Leu
325 330 335
Glu Arg Arg Arg Gln Asp Arg Val Leu Cys Ala Thr Arg Trp Thr Asn
340 345 350
Phe Thr Leu Ser Ala Phe Thr Glu Leu Pro Pro Glu Phe Leu Thr Phe
355 360 365
Leu Gln Ile Leu Ser Gln Ser Arg Glu Met Ala Asp Glu Phe Thr Asp
370 375 380
Asn Phe Asn Tyr Pro Glu Arg Gln Trp Asp Arg Phe Ser Ser Pro Glu
385 390 395 400
Arg Ile Gly Gln Trp Cys Ser Gln Tyr Ala Pro Thr Ile Ala Ala
405 410 415
<210> 3
<211> 1248
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgaaaaaac gtatcggtat cgttggtgct ggtaccgctg gtctgcacct gggtctgttc 60
ctgcgtcagc acgacgttga cgttaccgtt tacaccgacc gtaaaccgga cgaatactct 120
ggtcagcgtc tgctgaacac cgttgctcac aacgctgtta ccgttcagcg tgaagttgct 180
ctggacgtta acgaatggcc gtctgaagaa ttcggttact tcggtcacta ctactacgtt 240
ggtggtccgc agccgatgcg tttctacggt gacctgaaag ctccgtctcg tgctgttgac 300
taccgtctgt acctgccgat gctgatgcgt gctctggaag ctcgtggtgg taaattctgc 360
tacgacgctg tttctgctga agacctgggt ggtctgtctg aacagtacga cctgctggtt 420
gtttgcaccg gtaaatacgc tctgggtaaa gttttcgtta aacagtctga aaactctccg 480
ttcgaaaaac cgcagcgtgc tctgtgcgtt ggtctgttca aaggtatcaa agaagctccg 540
atccgtgctg ttaccatgtc tttctctccg ggtcacggtg aactgatcga aatcccgacc 600
ctgtctttca acggtatgtc taccgctctg gttctggaaa accacatcgg ttctgacctg 660
gaagttctgg ctcacaccaa atacgacgac gacccgcgtg ctttcctgga cctgatgctg 720
gaaaaactgc gtaaacacca cccgtctgtt gctgaacgta tcgacccggc tgaattcgac 780
ctggctaact cttctctgga catcctgcag ggtggtgttg ttccggtttt ccgtgacggt 840
cacgctaccc tgaacaacgg taaaaccatc atcggtctgg gtgacatcca ggctaccgtt 900
gacccggttc tggaccaggg tgctaacatg gcttcttacg ctgcttggat cctgggtgaa 960
gaaatcctgg ctcactctgt ttacgacctg cgtttctctg aacacctgga acgtcgtcgt 1020
caggaccgtg ttctgtgcgc tacccgttgg accaacttca ccctgtctgc tttcaccgaa 1080
ctgccgccgg aattcctgac cttcctgcag atcctgtctc agtctcgtga aatggctgac 1140
gaattcaccg acaacttcaa ctacccggaa cgtcagtggg accgtttctc ttctccggaa 1200
cgtatcggtc agtggtgctc tcagtacgct ccgaccatcg ctgcttaa 1248
<210> 4
<211> 1248
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgaaaaaac gtatcggtat cgttggtgct ggtaccgctg gtctgcacct gggtctgttc 60
ctgcgtcagc acgacgttga cgttaccgtt tacaccgacc gtaaaccgga cgaatactct 120
ggtcagcgtc tgctgaacac cgttgctcac aacgctgtta ccgttcagcg tgaagttgct 180
ctggacgtta acgaatggcc gtctgaagaa ttcggttact tcggtcacta ctactacgtt 240
ggtggtccgc agccgatgcg tttctacggt gacctgaaag ctccgtctcg tgctgttgac 300
taccgtctgt acctgccgat gctgatgcgt gctctggaag ctcgtggtgg taaattctgc 360
tacgacgctg tttctgctga agacctgggt ggtctgtctg aacagtacga cctgctggtt 420
gtttgcaccg gtaaatacgc tctgggtaaa gttttcgtta aacagtctga aaactctccg 480
ttcgaaaaac cgcagcgtgc tctgtgcgtt ggtctgttca aaggtatcaa agaagctccg 540
atccgtgctg ttaccatgtc tttctctccg ggtcacggtg aactgatcga aatcccgacc 600
ctgtctttca acggtatgtc taccgctctg gttctggaaa accacatcgg ttctgacctg 660
gaagttctgg ctcacaccaa atacgacgac gacccgcgtg ctttcctgga cctgatgctg 720
gaaaaactgc gtaaacacca cccgtctgtt gctgaacgta tcgacccggc tgaattcgac 780
ctggctaact cttctctgga catcctgcag ggtggtgttg ttccggtttt ccgtgacggt 840
cacgctaccc tgaacaacgg taaaaccatc atcggtctgg gtgacatcca ggctaccgtt 900
gacccggttc tgggtcaggg tgctaacatg gcttcttacg ctgcttggat cctgggtgaa 960
gaaatcctgg ctcactctgt ttacgacctg cgtttctctg aacacctgga acgtcgtcgt 1020
caggaccgtg ttctgtgcgc tacccgttgg accaacttca ccctgtctgc tttcaccgaa 1080
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gaattcaccg acaacttcaa ctacccggaa cgtcagtggg accgtttctc ttctccggaa 1200
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<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gttgacccgg ttctgggtca gggtgctaac atg 33
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gccttactgg ttagcagaat g 21
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgttgatccg gttctgctac aaggtgccaa tatgg 35
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gccttactgg ttagcagaat g 21
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cgttgatccg gttctgacac aaggtgccaa tatgg 35
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gccttactgg ttagcagaat g 21

Claims (9)

1.一种苯乙烯单加氧酶突变体，其特征在于，所述苯乙烯单加氧酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的苯乙烯单加氧酶的第305位氨基酸由天冬氨酸突变为甘氨酸得到的。
2.如权利要求1所述的一种苯乙烯单加氧酶突变体，其特征在于，所述苯乙烯单加氧酶的来源为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。
3.如权利要求1或2所述的一种苯乙烯单加氧酶突变体，其特征在于，所述苯乙烯单加氧酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
4.编码权利要求1-3任一所述苯乙烯单加氧酶突变体的基因。
5.携带权利要求4所述基因的重组质粒。
6.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的构建方法为先根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，再根据设计的突变引物，以编码苯乙烯单加氧酶基因的核苷酸序列为模板进行定点突变，得到重组基因；将得到的重组基因连接到表达载体上，得到重组质粒。
7.如权利要求5或6所述的重组质粒，其特征在于，所述突变引物中，正向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
8.携带权利要求4所述基因或权利要求5-7任一所述重组质粒的宿主细胞。
9.权利要求1-3任一所述苯乙烯单加氧酶突变体或权利要求4所述基因或权利要求5-7任一所述重组质粒或权利要求8所述宿主细胞在制备环氧化合物方面的应用。
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Mutations at the putative active cavity of styrene monooxygenase: Enhanced activity and reversed enantioselectivity;Hui Lin et al.;《Journal of Biotechnology》;20121231;第235-241页 *
Production of (S)-styrene oxide using styrene oxide isomerase negative mutant of Pseudomonas putida SN1;Ju Hee Hana et al.;《Enzyme and Microbial Technology》;20061231;第1264-1269 *
Rational design of styrene monooxygenase mutants with altered substrate preference;Abeer Ahmed Qaed et al.;《Biotechnol Lett》;20111231;第611-616页 *
StyA [Pseudomonas putida] GenBank: ABB03727.1;Park,S. et al.;《GenBank》;20060901;序列部分 *

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