CN115232799A - 一种苯乙烯单加氧酶突变体及其应用 - Google Patents

一种苯乙烯单加氧酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及耐热性提高的苯乙烯单加氧酶突变体及其用途。本发明将来源于Streptomyces exfoliatus sp.A1013Y的苯乙烯单加氧酶SeStyA进行分子改良，获得了一系列热稳定性显著提高的突变体，与野生型相比，突变体的催化活力高，反应速度更快，能缩短反应周期，获得更高的时空产率。催化性能提升的突变子将显著增强SeStyA的应用潜力。

Description

一种苯乙烯单加氧酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体内容涉及耐热性提高的苯乙烯单加氧酶突变体及其用途。
背景技术
环氧化合物的(R)-和(S)-对映体都是有机合成中活性药物、天然产物、精细化学品和高级聚合材料必不可少的重要中间体。因此，研究者花费了大量的精力致力于开发出有效的不对称环氧化方法。对于内部烯烃或带有官能团的烯烃，一般都是通过化学催化的环氧化来生成对映体纯的目标产物，但是化学法对末端烯烃的对映体选择性不足。生物催化介导的环氧化可以有效地从末端烯烃制备高度光学纯的环氧化产物。目前已报道了苯乙烯单加氧酶、细胞色素P450酶、氯过氧化物酶和烯烃单加氧酶均能以中等至优异的对映选择性催化末端烯烃的环氧化。其中苯乙烯单氧化酶(SMO)作为苯乙烯分解代谢途径中的第一个酶，可以说它是催化环氧化反应中最出色的生物催化剂，目前已经发现了大量的苯乙烯单加氧酶，可用于催化苯乙烯及其衍生物的环氧化并生成相应的(S)-环氧化物且ee值大于99％。最近，我们又发现了多种具有(R)-对映选择性的SMO，进一步拓宽了SMO的工具箱(Catalysis Science&Technology,2021,11(6):2195-2201)。但是SMO的应用仍受到诸如低催化活性，低立体选择性以及稳定性不足等因素的限制。在探索酶的工业化应用进程中，稳定性往往是最关键的特性之一，因此提高蛋白的稳定性是很有必要的。
蛋白质稳定化(Protein stabilization)是一个常见的蛋白质工程目标。稳定性高的蛋白质通常具有以下几点优势：1)能够在高温、有机助溶剂或高浓度底物或产物等压力环境中更好的行使催化功能；2)蛋白质在常温下的使用寿命延长，其储存稳定性增加；3)在细菌中过度表达时能够避免形成包涵体，更容易生产制造；4)更适合作为酶定向进化的母本，是蛋白质工程更好的起点。目前主要是通过蛋白质工程来提高蛋白质的稳定性，而蛋白质工程的策略多种多样，包括了定向进化，基于蛋白质结构的理性设计以及基于序列信息的半理性设计。
发明内容
本发明采用序列一致性方法对来源于Streptomyces exfoliatus sp.A1013Y的苯乙烯单加氧酶SeStyA进行分子改良，以SEQ ID NO.2所示的序列为出发序列，将多个氨基酸进行替换后获得了热稳定性提高的突变体。苯乙烯单加氧酶SeStyA的核苷酸序列为SEQ IDNO.1。
根据本领域公共知识，编码相同氨基酸的核苷酸密码子替换，构建的相关突变体的载体、基因工程菌等也属于本发明的保护范围。
为了达到以上目的，本发明利用在线软件Consensus Finder(http://kazlab.umn.edu/)获得了SeStyA潜在的稳定替换位点，从中选取一致性大于70％的12个氨基酸，构建获得了12个单突变子E274D，I18V，R376A，P58V，V162R，A312G，F180L，A52G，A101G，Y254H，D338E，D96P和1个双突变子SeM2。测定其残余活力后发现，突变子A52G、D96P、A101G、V162R以及SeM2的热稳定性有所提高，以定点突变技术将SeM2拆分后获得了单点突变子W86C和D338E。将这6个突变子以不同的方式进行整合后得到SeM4、SeM5-1、SeM5-2、SeM6，通过活性测定最终获得了热稳定性最高的组合突变子SeM6。
(1)首轮筛选获得的热稳定性提高的突变子的特征如下：
A52G：第52位的丙氨酸突变为甘氨酸(DNA序列由GCG变为GGC)。
D96P：第96位的天门冬氨酸突变为脯氨酸(DNA序列由GAC变为CCG)。
A101G：第101位的丙氨酸突变为甘氨酸(DNA序列由GCG变为GGC)。
V162R：第162位的缬氨酸突变为精氨酸(DNA序列由GTG变为CGT)。
SeM2：第86位的色氨酸突变为半胱氨酸(DNA序列由TGG变为TGC),第338位的天门冬氨酸氨酸突变为谷氨酸(DNA序列由GAC变为GAA)。
(2)将双位点突变子SeM2拆分为单点突变子的特征如下：
W86C：第86位的色氨酸突变为半胱氨酸(DNA序列由TGG变为TGC)。
D338E：第338位的天门冬氨酸突变为谷氨酸(DNA序列由GAC变为GAA)。
(3)六个位点的整合突变子的特征如下：
SeM4：第52位的丙氨酸突变为甘氨酸(DNA序列由GCG变为GGC)，第96位的天门冬氨酸突变为脯氨酸(DNA序列由GAC变为CCG)，第101位的丙氨酸突变为甘氨酸(DNA序列由GCG变为GGC)，第162位的缬氨酸突变为精氨酸(DNA序列由GTG变为CGT)。
SeM5-1：第52位的丙氨酸突变为甘氨酸(DNA序列由GCG变为GGC)，第86位的色氨酸突变为半胱氨酸(DNA序列由TGG变为TGC)，第96位的天门冬氨酸突变为脯氨酸(DNA序列由GAC变为CCG)，第101位的丙氨酸突变为甘氨酸(DNA序列由GCG变为GGC)，第162位的缬氨酸突变为精氨酸(DNA序列由GTG变为CGT)。
SeM5-2：第52位的丙氨酸突变为甘氨酸(DNA序列由GCG变为GGC)，第96位的天门冬氨酸突变为脯氨酸(DNA序列由GAC变为CCG)，第101位的丙氨酸突变为甘氨酸(DNA序列由GCG变为GGC)，第162位的缬氨酸突变为精氨酸(DNA序列由GTG变为CGT)，第338位的天门冬氨酸突变为谷氨酸(DNA序列由GAC变为GAA)。
SeM6：第52位的丙氨酸突变为甘氨酸(DNA序列由GCG变为GGC)，第86位的色氨酸突变为半胱氨酸(DNA序列由TGG变为TGC)，第96位的天门冬氨酸突变为脯氨酸(DNA序列由GAC变为CCG)，第101位的丙氨酸突变为甘氨酸(DNA序列由GCG变为GGC)，第162位的缬氨酸突变为精氨酸(DNA序列由GTG变为CGT)，第338位的天门冬氨酸突变为谷氨酸(DNA序列由GAC变为GAA)。
这些组合突变子SeM4、SeM5-1、SeM5-2和SeM6的热稳定性较野生型均有所提高，其中SeM6提升幅度最大，为野生型的4.45倍，而相对活力也有所提高，为野生型的1.5倍。SeM6在50℃时的热失活半衰期是野生型的5倍，相对活力约为野生型的1.5倍，最适反应温度由45℃提高到50℃，而且产物光学纯度与野生型相当。SeM6的可溶性表达量较野生型有显著提高，每升培养基可获得约250mg纯酶。
以组合突变子SeM6为生物催化剂，在催化4-乙烯基-2,3-二氢苯并呋喃的环氧化反应时，野生型SeStyA在10mM底物浓度下，在40℃反应6小时，转化率为50％；而相同浓度的SeM6粗酶3小时即可完全转化10mM底物；而且当底物浓度为20mM时，SeM6粗酶3小时转化率可达到80％。
本发明与已有技术相比具有如下优势：
热稳定性提高的SeM6与野生型相比，其酶催化活力高，反应速度更快，能缩短反应周期，获得更高的时空产率。催化性能提升的突变子将显著增强SeStyA的应用潜力。
附图说明
图1部分突变子的蛋白表达情况；1:蛋白Marker；泳道2-12:野生型，V162R，R376A,I18V,A101G,Y254H,W86C/D338E,D338E,F180L,E274D,D96P蛋白上清液。
图2 SeStyA单点突变子和组合突变子残余活力和相对活力对比；
图3 SeStyA野生型和突变子SeM6最适温度；
图4 SeStyA野生型和突变子SeM6在50℃的热失活半衰期；
图5 SeStyA野生型和突变子SeM6催化10mM和20mM的4-乙烯基-2,3-二氢苯并呋喃的时间曲线。
具体实施方式
以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。
实施例1潜在热稳定性位点的预测及突变子构建
将SeStyA蛋白的氨基酸序列导入在线软件Consensus Finder进行热稳定性位点的预测。预测的最小一致性阈值设置>50％，其它参数保持默认值，获得了48个可能使SeStyA蛋白更稳定的潜在替换位点，从中选择了一致性>70％的12个共识替换，并构建了相应的单点突变体。另外在构建D338E的过程中，意外获得了一个双位点突变子，除了338位天冬氨酸Asp突变成谷氨酸Glu外，其86位氨基酸位点的色氨酸突变成了半胱氨酸Cys，将其命名为SeM2。
具体做法如下：
pET-SeStyAB是我们以前的工作中构建的质粒(Catalysis Science&Technology,2021,11(6):2195-2201),包含SeStyA、linker和PsStyB的DNA片段。利用在线软件PrimerX设计突变引物(表1)，参考
Figure BDA0003455932030000042
site-directed mutagenesis定点突变说明书进行PCR，50μL PCR体系：10×pfu Buffer 5μL，dNTP mix(2.5mM)4μL，引物F/R(10mM)各2.5μL，模板DNA 10ng，Phusion DNA polymerase(2U/μL)1μL，加超纯水至50μL；扩增条件：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸7.5min，共16个循环。PCR产物通过Dpn I在37℃处理1h，以去除甲基化的质粒模板。取10μL PCR产物按化学法转入E.coli DH5α感受态细胞，提取质粒后送上海生工生物工程有限公司测序验证。单点突变子的构建以pET-SeStyAB重组质粒为模板，组合突变子的构建以SeM6为模板。
表1定点突变引物
Figure BDA0003455932030000041
Figure BDA0003455932030000051
实施例2突变子的酶活力测定
采用化学法将实施例1中的突变子转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单克隆至2mL LB液体培养基中(50μg/mL卡那霉素)，37℃，180rpm过夜培养。将培养的种子液转接(1％v/v)至200mL TB液体培养基中，37℃，180rpm培养3h，待OD600约为0.8，加入0.05mM IPTG，20℃，180rpm继续诱导18h。
离心收集菌体，采用生理盐水洗涤菌体两次，再用0.1M磷酸钾缓冲液(pH＝7.0)重悬菌体，超声破碎菌体(破碎3s，停止3s，功率200W，99个循环)，4℃，13000rpm离心收集上清，所有粗酶液均以100μg的上样量进行SDS-PAGE检测蛋白表达情况。采用粗酶催化体系检测突变子对苯乙烯的催化活性，1mL粗酶催化体系包含30mg/mL(总蛋白浓度)野生型SeStyAB及突变子粗酶，5mg/mL ChkRED20粗酶，50μM FAD+，1mM NAD+,260mM异丙醇，5mM苯乙烯，0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)。在30℃，150rpm水浴摇床反应1h后，等体积乙酸乙酯终止反应，GC检测转化率。以野生型在相同条件下反应的转化率为对照，二者比值即为相对活力。
羰基还原酶ChKRED20(NCBI登录号：KC342020)按照文献报道方法对该酶进行异源表达(J.Mol.Catal.B:Enzym.2014,105:82-88)。
残余活力的测定：将野生型及突变子的粗酶液在45℃热处理15min后，立即放置冰上冷却10min，随后采用上述粗酶催化体系在30℃，150rpm水浴摇床中反应1h后，等体积乙酸乙酯终止反应，GC检测转化率(CHIRASIL-DEX CB柱，安捷伦，美国)。对应的，以未进行热处理的粗酶转化率作为对照，二者的比值即为残余活力。采用HPLC检测产物ee值(Chiralpak IC-H,n-hexane:2-propanol 98:2,0.5mL/min)。
对这13个突变子进行诱导表达，SDS-PAGE结果显示(图1)，D338E、F180L和SeM2的可溶性表达量要明显高于野生型，初步说明稳定性的提高也增加了目的蛋白的可溶性表达。检测了13个突变子连同野生型的相对活力，以及在45℃热处理15min后的残余活力，结果显示(表2)，所有突变子均保持了对苯乙烯的催化活性，SeM2，D338E，F180L，A101G和D96P活性较野生型均有所提高，其中SeM2最为明显，相对活力为野生型的1.4倍。其余大部分突变子的相对活力都在70％～98％之间，而A312G和R376A的活力较野生型下降较为明显，相对活力只有48％和59％。在残余活力方面，A52G，D96P，A101G，V162R和SeM2的残余活力要明显高于野生型。其中A52G的残余活力为野生型的1.6倍；SeM2的热稳定性也较好，其残余活力为野生型的1.3倍。因此，我们共获得了热稳定性提高的4个单突变子A52G、D96P、A101G、V162R以及双位点突变子SeM2。
表2 SeStyA野生型和突变子残余活力和相对活力
Figure BDA0003455932030000061
实施例3突变位点的整合和拆分
为了获得热稳定性更好的突变体，我们尝试将筛选到的有益突变子进行整合，由于有益突变子整合后可能存在的正协同或负协同效应，为此我们选择了四种不同的组合方式进行了整合。首先整合了A52G，D96P，A101G和V162R这四个残余活力提高较明显的突变子，命名为SeM4；鉴于SeM2的残余活力提高较为明显，而D338E的残余活力较野生型则无明显变化，因此我们又构建了W86C的单点突变子；随后在SeM4突变子上整合W86C或D338E，分别命名为SeM5-1，SeM5-2；最后将W86C和D338E同时整合至SeM4上，命名为SeM6，突变子的蛋白表达和粗酶液的制备方法见实施例2。随后检测了单点突变子A52G，D96P，A101G，V162R和W86C以及整合后的突变子的相对活力，以及粗酶液在50℃热处理15min后的残余活力。
以上突变子的活力检测结果如图2，W86C单点突变子的相对活力并无提高，且其残余活力较野生型相当，说明SeM2的相对活力的提高是W86C和D338E的共同作用；而与之前的有益突变子相比，这四个整合突变子的残余活性均有进一步的提高，其中SeM6的残余活力最好，为野生型的4.45倍。并且，SeM6也保留了SeM2的高催化活性，其相对活力为野生型的1.5倍。
实施例4野生型和突变子的热稳定性
SeStyA和SeM6的最适温度采用实施例2中的反应体系和检测方法，在不同温度(20℃～60℃)下反应30min。
热失活半衰期t1/2:将野生型和突变子的粗酶液在50℃热处理不同的时间，其中SeStyAB分别处理5～25min；SeM6分别处理10～50min，立即置于冰上冷却10min，随后采用1mL粗酶催化体系在30℃，150rpm，反应1h后，等体积乙酸乙酯终止反应，GC检测转化率即为残余活力Et。同时以未经过热处理的粗酶液作为对照，同样条件反应后检测转化率E0，Et/E0比值即为残余活力百分比，随后以其自然对数为Y轴，处理时间为X轴，用Prism作散点图，添加趋势线，得到热处理时间与相对活力的线性方程ln(Et/E0)＝-kt。热失活半衰期可通过公式t1/2＝ln2/k求得。
最适温度检测结果如图3，野生型的最适温度为45℃，而SeM6的最适温度为50℃，较野生型提高了5℃。热失活半衰期t1/2的检测结果如图4，在50℃处理不同的时间后检测了野生型和突变子的残余活力，拟合后的曲线得出野生型的半衰期为7.26min，而SeM6的半衰期为36.5min，较野生型提高了5倍。
实施例5突变子的酶动力学参数测定
野生型和突变子蛋白的纯化：突变子的粗酶液制备同实施例2，将上述粗酶液通过Ni2+-NTA柱(Qiagen，Valencia，CA)纯化，纯化方法为常规方法，参见产品使用手册。洗脱液为Tris-HCl缓冲液(10mM，pH 7.5)、300mM NaCl和250mM咪唑，收集目的蛋白并透析。透析液组分为：Tris-HCl缓冲液(25mM，pH 7.5)、50mM NaCl、2mM DTT和1mM EDTA。用Nano-drop2000分光光度计(Nano Drop Technologies，USA)测定蛋白浓度。
采用纯酶催化体系检测其对苯乙烯的动力学参数，反应体系为1mL，包括0.1M磷酸钾缓冲液(pH＝7.0)，20μM SeStyA，10μM PsStyB，8μM ChKRED20，1mM NAD+，50μM FAD+，添加不同浓度的苯乙烯(1～25mM)后,将反应置于30℃或40℃，150rpm反应10min，测定不同底物浓度下的转化率，再通过GraphPad Prism软件的Michaelis-Menten拟合分析得到SeStyA和SeM6的酶动力学参数。酶活的测定采用同样的催化体系，底物为5mM苯乙烯，单位酶活的定义是：30℃或40℃时，每分钟催化生成1μM产物所需的酶量为1个单位(U)。
该反应体系中黄素氧化还原酶PsStyB的获得方法为：含有黄素氧化还原酶StyB基因(GenBank登录号ADE62391.1)的质粒pETB为先前构建，其蛋白表达纯化方法为文献报道的方法(J.Mol.Catal.B:Enzym.2010,67:236-241)。羰基还原酶ChKRED20(NCBI登录号：KC342020)按照文献报道方法对该酶进行异源表达(J.Mol.Catal.B:Enzym.2014,105:82-88)。
对SeM6蛋白进行表达纯化，每升培养基可以获得约250mg的纯酶，较野生型的约200mg/L有所提高，这进一步说明该组合突变提高了SeStyA蛋白的可溶性表达。随后采用纯酶催化体系检测了SeM6的动力学参数，结果如表3，在30℃时突变体SeM6的米氏常数Km要大于野生型，其转换数kcat小于野生型；而在40℃时突变体的Km值要小于野生型，其转换数kcat增加到18.5min-1，高出野生型20％。当温度升高时，野生型的比活力明显下降，而突变体SeM6的比活力则有所提高，进一步说明了SeM6的高热稳定性。
表3 SeStyA野生型和突变子SeM6在30和40℃的酶动力学参数
Figure BDA0003455932030000081
实施例6突变子在生物催化中的应用
对SeM6全细胞和粗酶催化体系比较后，确定采用粗酶催化体系进行反应，根据SeM6的酶学性质，将生物催化的反应温度设定为40℃，4-乙烯基-2,3-苯并呋喃的浓度为10mM和20mM，检测了野生型和SeM6的催化效率。
结果显示(图5)，SeM6在3h左右即可完全转化10mM的4-乙烯基-2,3-苯并呋喃，而野生型在5h时转化率只有50％。当底物浓度为20mM时，SeM6在3h的转化率为80％，野生型只有15％，并且随着反应的推进，酶慢慢失去活性。以上结果说明SeM6相较野生型，在催化反应时可以提高转化效率，缩短反应时间，为后期StyA的工业化应用奠定了基础。
序列表
<110> 中国科学院成都生物研究所
<120> 一种苯乙烯单加氧酶突变体及其应用
<141> 2021-12-01
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1284
<212> DNA
<213> Streptomyces exfoliatus sp. A1013Y
<400> 1
atgaccgaca ccggcaccgg caccggcaac accgagaccg acatcggcat catcggttcc 60
ggtatctccg ggctgcaact ggccttacgc ctccagcagc tcggcgtacc agtgacgctg 120
tactccgcgc agaccgccga agagctcggc tcggcgcggc cgcggaactt ccccgcccgg 180
ttcgccccga cgcaagcgcg cgaggactcg ctcggcgtgc acgcctggca gttcgacgac 240
gcccgggtgc acagctgggc gatcaccatc cacggcgagg gcgccgacct ggagttcgcc 300
gcggcgctcg caccgccgtc gagcgtggtg gacttccgcc tctacctgcc gcacctgctc 360
accgagttcg cccggcgcgg cgggaacgta cggatcggcc cggtcgtggt ggacgaggtc 420
gcccgtcggc acgacctggt ggtggtcgcc aacggcgacc ggtccatgcg ggagctgttc 480
cccgtggacc ccgagcggtc gccccacacg acaccccagc ggatcctgtg cagcggcttc 540
taccacggca tccgggagga cgtcccgcac gagctggaca tccacttcct gcccgggatc 600
ggggagatcc tgcggatacc gttcctgtcc cgcctcggtc cggcccacgt gctggccttc 660
gaggcggtgc cgggcggccc gctggaggcg cccgcccacc tggacgccgc cgccgatccg 720
gccggcttcc accgcgaggt gctgcgtctg ctggccgcgt acgcgccgag tctgcgcgaa 780
cgcgtcgaca ccgcgcggtt cggcctcgtc gcaccgggcg aactggcgca gggcggcgtc 840
acgccgaccg tccgccgggg atgggcgcgc ctcgccgacg gcacgtgcgc cctggccatc 900
ggtgacgcct ggatcaccaa cgatccgctc accgcccagg gcgccaacct cggctcgcac 960
acggcgttcg cgctggccga tctcatcgcc tccgccaccg gtccgctcga cgacgcgttc 1020
tgccgcgacg cgtcggcccg gctgtgggac cacgcacgcc atgtcgtcga gtggagcaac 1080
gccttcctgg cgccgccccc gccgcacgtc atggagctgt tcggccgggc ggccggcgac 1140
aagcagatcg cggacgcgtt cgtcggccgg ttccacgacc cggtggcgat gtgggccgtg 1200
ctgtccagcc cggaaggggt ggattccttt gtcaggagct gcaccgaagg cggtcggcac 1260
gtcacggacg tggcgcatgg atga 1284
<210> 2
<211> 427
<212> PRT
<213> Streptomyces exfoliatus sp. A1013Y
<400> 2
Met Thr Asp Thr Gly Thr Gly Thr Gly Asn Thr Glu Thr Asp Ile Gly
1 5 10 15
Ile Ile Gly Ser Gly Ile Ser Gly Leu Gln Leu Ala Leu Arg Leu Gln
20 25 30
Gln Leu Gly Val Pro Val Thr Leu Tyr Ser Ala Gln Thr Ala Glu Glu
35 40 45
Leu Gly Ser Ala Arg Pro Arg Asn Phe Pro Ala Arg Phe Ala Pro Thr
50 55 60
Gln Ala Arg Glu Asp Ser Leu Gly Val His Ala Trp Gln Phe Asp Asp
65 70 75 80
Ala Arg Val His Ser Trp Ala Ile Thr Ile His Gly Glu Gly Ala Asp
85 90 95
Leu Glu Phe Ala Ala Ala Leu Ala Pro Pro Ser Ser Val Val Asp Phe
100 105 110
Arg Leu Tyr Leu Pro His Leu Leu Thr Glu Phe Ala Arg Arg Gly Gly
115 120 125
Asn Val Arg Ile Gly Pro Val Val Val Asp Glu Val Ala Arg Arg His
130 135 140
Asp Leu Val Val Val Ala Asn Gly Asp Arg Ser Met Arg Glu Leu Phe
145 150 155 160
Pro Val Asp Pro Glu Arg Ser Pro His Thr Thr Pro Gln Arg Ile Leu
165 170 175
Cys Ser Gly Phe Tyr His Gly Ile Arg Glu Asp Val Pro His Glu Leu
180 185 190
Asp Ile His Phe Leu Pro Gly Ile Gly Glu Ile Leu Arg Ile Pro Phe
195 200 205
Leu Ser Arg Leu Gly Pro Ala His Val Leu Ala Phe Glu Ala Val Pro
210 215 220
Gly Gly Pro Leu Glu Ala Pro Ala His Leu Asp Ala Ala Ala Asp Pro
225 230 235 240
Ala Gly Phe His Arg Glu Val Leu Arg Leu Leu Ala Ala Tyr Ala Pro
245 250 255
Ser Leu Arg Glu Arg Val Asp Thr Ala Arg Phe Gly Leu Val Ala Pro
260 265 270
Gly Glu Leu Ala Gln Gly Gly Val Thr Pro Thr Val Arg Arg Gly Trp
275 280 285
Ala Arg Leu Ala Asp Gly Thr Cys Ala Leu Ala Ile Gly Asp Ala Trp
290 295 300
Ile Thr Asn Asp Pro Leu Thr Ala Gln Gly Ala Asn Leu Gly Ser His
305 310 315 320
Thr Ala Phe Ala Leu Ala Asp Leu Ile Ala Ser Ala Thr Gly Pro Leu
325 330 335
Asp Asp Ala Phe Cys Arg Asp Ala Ser Ala Arg Leu Trp Asp His Ala
340 345 350
Arg His Val Val Glu Trp Ser Asn Ala Phe Leu Ala Pro Pro Pro Pro
355 360 365
His Val Met Glu Leu Phe Gly Arg Ala Ala Gly Asp Lys Gln Ile Ala
370 375 380
Asp Ala Phe Val Gly Arg Phe His Asp Pro Val Ala Met Trp Ala Val
385 390 395 400
Leu Ser Ser Pro Glu Gly Val Asp Ser Phe Val Arg Ser Cys Thr Glu
405 410 415
Gly Gly Arg His Val Thr Asp Val Ala His Gly
420 425

Claims (5)

1.一种苯乙烯单加氧酶突变体，其特征在于：以SEQ ID NO.2所示的序列为出发序列，第52位的丙氨酸突变为甘氨酸，第96位的天门冬氨酸突变为脯氨酸，第101位的丙氨酸突变为甘氨酸，第162位的缬氨酸突变为精氨酸。
2.一种苯乙烯单加氧酶突变体，其特征在于：将权利要求1所述的突变体的第86位的色氨酸突变为半胱氨酸。
3.一种苯乙烯单加氧酶突变体，其特征在于：将权利要求1所述的突变体的第338位的天门冬氨酸突变为谷氨酸。
4.一种苯乙烯单加氧酶突变体，其特征在于：将权利要求2所述的突变体的第338位的天门冬氨酸突变为谷氨酸。
5.权利要求1～4所述的苯乙烯单加氧酶突变体在生物催化中的应用。
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