JP6455430B2 - キサンチンオキシダーゼ遺伝子とそれをコードするアミノ酸配列 - Google Patents
キサンチンオキシダーゼ遺伝子とそれをコードするアミノ酸配列 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6455430B2 JP6455430B2 JP2015527253A JP2015527253A JP6455430B2 JP 6455430 B2 JP6455430 B2 JP 6455430B2 JP 2015527253 A JP2015527253 A JP 2015527253A JP 2015527253 A JP2015527253 A JP 2015527253A JP 6455430 B2 JP6455430 B2 JP 6455430B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- xanthine oxidase
- amino acid
- dna
- base sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y117/00—Oxidoreductases acting on CH or CH2 groups (1.17)
- C12Y117/03—Oxidoreductases acting on CH or CH2 groups (1.17) with oxygen as acceptor (1.17.3)
- C12Y117/03002—Xanthine oxidase (1.17.3.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0093—Oxidoreductases (1.) acting on CH or CH2 groups (1.17)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
反応式:ヒポキサンチン+O2→キサンチン+H2O2
キサンチン+O2→尿素+H2O2
そこで本発明者は、これまで行われていなかったアースロバクター属由来のキサンチンオキシダーゼをコードする遺伝子のクローニングを行ってその全配列を明らかにするとともに、該遺伝子を用いた遺伝子組み換えにより、プロテアーゼの生産が少ない宿主によるキサンチンオキシダーゼの生産方法を提供することでこの問題点を解決した。
項1
下記の(a)〜(c)のいずれかのポリペプチドからなるキサンチンオキシダーゼ。
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるサブユニットと、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるサブユニットとから構成されるポリペプチドの組合せ
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、0、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位したアミノ酸配列からなるサブユニットと、配列番号2に示されるアミノ酸配列において、0、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位したアミノ酸配列からなるサブユニットとから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せ(ただし、上記(a)の組合せを除く)
(c)配列番号1に示されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列からなるサブユニットと、配列番号2に示されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列からなるサブユニットとから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せ(ただし、上記(a)の組合せを除く)
項2
下記の(d)〜(f)のいずれかのポリペプチドからなる蛋白質。
(d)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(e)配列番号3に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位したアミノ酸配列からなるポリペプチド
(f)配列番号3に示されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチド
項3
以下の(A)〜(F)のいずれかのDNA。
(A)配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードするDNAと、配列番号2に示されるアミノ酸配列をコードするDNAの組合せ
(B)配列番号4に示される塩基配列からなるDNAと、配列番号5に示される塩基配列からなるDNAの組合せ
(C)配列番号4に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなるDNAと、配列番号5に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなるDNAとから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せをコードするDNAの組合せ(ただし、上記(B)の組合せを除く)
(D)配列番号4に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAと、配列番号5に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAとから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せをコードするDNAの組合せ(ただし、上記(B)の組合せを除く)
(E)配列番号4に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び/又は逆位されている塩基配列と、配列番号5に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び/又は逆位されている塩基配列とから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せをコードするDNAの組合せ(ただし、上記(B)の組合せを除く)
(F)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位したアミノ酸配列からなるサブユニットと、配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位したアミノ酸配列からなるサブユニットとから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せをコードするDNAの組合せ
項4
以下の(G)〜(L)のいずれかのDNA。
(G)配列番号3に示されるアミノ酸配列をコードするDNA
(H)配列番号6に示される塩基配列からなるDNA
(I)配列番号6に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなるDNA
(J)配列番号6に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
(K)配列番号6に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び/又は逆位されている塩基配列からなるDNA
(L)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
項5
項3に記載のDNAを組み込んだベクター。
項6
さらに項4に記載のDNAを組み込んだ、項3に記載のベクター
項7
項5または項6に記載のベクターを含む形質転換体。
項8
項7に記載の形質転換体を培養すること、及び、得られた培養物からキサンチンオキシダーゼを採取することを含む、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。
項9
項8に記載の方法で製造された、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチド
項10
項1または項9に記載のキサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをヒポキサンチンおよび/またはキサンチンに作用させる工程を含む、生体成分の測定方法。
項11
項1または項9に記載のキサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドを含む、生体成分測定試薬。
(1−1)キサンチンオキシダーゼ
本発明のキサンチンオキシダーゼの一態様は、(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるサブユニットと、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるサブユニットとから構成されるポリペプチドの組合せである。配列番号1で示されるポリペプチド配列は、成熟型キサンチンオキシダーゼのαサブユニット配列であり、配列番号2で示されるポリペプチド配列は、βサブユニット配列である。
(b)または(c)のキサンチンオキシダーゼには、キサンチンオキシダーゼを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じるバリアント(例えば、一塩基多型)も含まれる。
アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線(インターネット)を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本書では、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)の同一性アルゴリズムBLAST(Basic local alignment search tool)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/においてデフォルト(初期設定)のパラメータを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。
本発明のキサンチンオキシダーゼをコードするDNAの一態様は、(A)配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードするDNAと、配列番号2に示されるアミノ酸配列をコードするDNAの組合せである。本書において「タンパク質をコードするDNA」とは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られるDNA、即ち、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するDNAのことをいう。従ってコドンの縮重によって相違するDNAも含まれる。
塩基配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線(インターネット)を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本書では、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)の同一性アルゴリズムAdvanced BLAST 2.1において、プログラムにblastnを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の同一性の値(%)を算出する。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、一般には、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって、例えば、Molecular Cloning(Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)に記載されている。
ハイブリダイゼーション液として50%ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1%SDS、10%デキストラン硫酸、10μg/mLの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5))を用いる。
好適な一実施形態において、本発明のDNAは、単離された状態で存在するDNAである。ここで「単離されたDNA」とは、天然状態において共存するその他の核酸やタンパク質等の成分から分離された状態であることをいう。但し、単離されたDNAは、天然状態において隣接する核酸配列(例えばプロモーター領域の配列やターミネーター配列など)など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えば染色体DNAの場合の「単離された」状態とは、好ましくは、天然状態において共存する他のDNA成分を実質的に含まない。一方、cDNA分子など遺伝子工学的手法によって調製されるDNAの場合の「単離された」状態では、好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない。同様に、化学合成によって調製されるDNAの場合の「単離された」状態では、好ましくは、dNTPなどの前駆体(原材料)や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「DNA」と記載した場合には単離された状態のDNAを意味する。本発明のDNAには、本明細書中で説明したDNAと相補的なDNA(cDNA)も含まれる。
(2−1)アクセサリー蛋白質
本発明の別の一態様は、下記の(d)〜(f)のいずれかのポリペプチドからなる蛋白質である。
(d)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(e)配列番号3に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位したアミノ酸配列からなるポリペプチド
(f)配列番号3に示されるアミノ酸配列との同一性が80%以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチド
本発明の別の一態様は、以下の(G)〜(L)のいずれかのDNAである。
(G)配列番号3に示されるアミノ酸配列をコードするDNA
(H)配列番号6に示される塩基配列からなるDNA
(I)配列番号6に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなるDNA
(J)配列番号6に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
(K)配列番号6に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び/又は逆位されている塩基配列からなるDNA
(L)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(3−1)キサンチンオキシダーゼをコードするDNAを組み込んで得られるベクター
本発明によれば、上記のキサンチンオキシダーゼをコードするDNAを組み込んで得られるベクター、及びこのベクターを微生物に導入して得られることを特徴とする形質転換体も提供される。
ベクターには、さらに上記で説明するアクセサリータンパク質をコードするDNAが組み込まれていてもよい。アクセサリータンパク質を共発現させることにより補因子合成や補因子の酵素タンパク質への配位を活性化し、活性酵素としての生産量の向上が見込める。
本発明は、宿主細胞に本発明のDNAが導入された形質転換体に関する。本発明のDNAの宿主への導入手段は特に制限されないが、例えば、上記で説明するベクターに組み込まれた状態で宿主に導入される。宿主細胞は、本発明のDNAを発現してキサンチンオキシダーゼを生産することが可能である限り、特に制限されない。具体的には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、植物培養細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。好ましくは、原核生物に分類される微生物であり、例えば、放線菌属、大腸菌属の微生物が適する。
本発明によれば、上記の形質転換体を培養し、得られた培養物よりキサンチンオキシダーゼ酵素活性を持つタンパク質を採取する工程を含むキサンチンオキシダーゼの製造方法も提供される。
上記の本発明の方法により製造される本発明のキサンチンオキシダーゼは、以下の(i)〜(iv)の性質を備えるものであり、従来のものより高品質のキサンチンオキシダーゼである。
(i)作用:メディエーター、過酸化水素存在下でキサンチンオキシダーゼ酵素活性を示す。
(ii)分子量:SDS 105kDaと31kDaのヘテロダイマー
(iii)安定pH範囲:pH6.0〜9.0である。
(iv)熱安定性:50℃10分間の熱処理後に90%以上の残存活性を有する。
本発明において、キサンチンオキシダーゼの活性測定は以下の条件で行う。
〔活性測定法I〕
<反応試薬>
下記のTris−HCl緩衝液8.0ml、キサンチン溶液1.0ml、オキソン酸カリウム溶液1.0mlを混合して反応試薬とする。
・ 100mM Tris−HCl緩衝液pH7.5
・ 10mM キサンチン溶液
・ 1mM オキソン酸カリウム溶液
<測定条件>
反応試薬3mlを37℃で5分間予備加温する。XTO溶液0.1mlを添加し、ゆるやかに混和後、水を対照にして37℃に制御された分光光度計で、293nmの吸光度変化を5分間記録し、直線部分から1分間あたりの吸光度変化(ΔOD TEST)を測定する。盲検はXTO溶液の代わりにXTOを溶解する溶媒を反応試薬に加えて同様に1分間あたりの吸光度変化(ΔOD BLANK)を測定する。これらの値から以下の式(I)に従ってXTO活性を求める。ここでXTO活性における1単位(U)とは、濃度0.48mMのキサンチン存在下で1分間に1マイクロモルの尿酸を生成する酵素量として定義される。
・反応式
2キサンチン+O2→→→→→→2尿酸+H2O2
Xanthine oxidase
・活性値算出式
XTOの活性(U/ml)={(ΔOD TEST−ΔOD BLANK)×3.1×希釈倍率}/{12.5×0.1×1.0}
<反応試薬>
下記のTris−HCl緩衝液33.27ml、キサンチン溶液2.0ml、オキソン酸カリウム溶液2.0ml、ホースラディッシュペルオキシダーゼ溶液0.5ml、4−アミノアンチピリン溶液1.26ml、ADPS溶液0.97mlを混合して反応試薬とする。
・ 100mM Tris−HCl緩衝液pH7.5
・ 10mM キサンチン溶液
・ 1mM オキソン酸カリウム溶液
・ 500U/ml ホースラディッシュペルオキシダーゼ溶液
・ 24.6mM 4−アミノアンチピリン溶液
・ 31.9mM ADPS溶液
<測定条件>
反応試薬3mlを37℃で5分間予備加温する。XTO溶液0.1mlを添加し、ゆるやかに混和後、水を対照にして37℃に制御された分光光度計で、546nmの吸光度変化を5分間記録し、直線部分から1分間あたりの吸光度変化(ΔOD TEST)を測定する。盲検はXTO溶液の代わりにXTOを溶解する溶媒を反応試薬に加えて同様に1分間あたりの吸光度変化(ΔOD BLANK)を測定する。これらの値から以下の式(I)に従ってXTO活性を求める。ここでXTO活性における1単位(U)とは、濃度0.48mMのキサンチン存在下で1分間に1マイクロモルの尿酸を生成する酵素量として定義される。
・反応式
2キサンチン+O2→→→→→→2尿酸+H2O2
Xanthine oxidase
H2O2+ADPS+4AA→→→→→→dye+H2O
Peroxidase
・活性値算出式
XTOの活性(U/ml)=[{(ΔOD TEST−ΔOD BLANK)×3.1×希釈倍率}/{30.2×0.1×1.0}]×2
本発明の別の一態様は、上記の本発明のキサンチンオキシダーゼをヒポキサンチンおよび/またはキサンチンに作用させる工程を含む、生体成分の測定方法である。
あるいは、本発明の別の一態様は、上記の本発明のキサンチンオキシダーゼを含む、生体成分を測定するための試薬である。
好ましくは、試薬を2つに分包した液状試薬(以下、2試薬系の液状試薬とも記載する。)を用いて自動分析機で分析する方法である。この方法では、試料にまず1種類目の試薬(以下、第一試薬またはR1とも記載する。)を添加して一定時間反応させ、次いで2種類目の試薬(以下、第一試薬またはR1とも記載する。)をさらに添加して反応させ、この間の吸光度の変化を測定することにより目的成分を定量することが出来る。
キサンチンオキシダーゼの生産菌である、アースロバクター・ルテウスから目的のキサンチンオキシダーゼ遺伝子を取得するため、精製されたキサンチンオキシダーゼ(東洋紡社製XTO211)からN末端アミノ酸解析を行った。精製キサンチンオキシダーゼを1mg/mlの濃度にイオン交換水で溶解し、SDS−PAGEに供し、分子量によってタンパク質を分画した。結果を図1に示す。SDS−PAGEの結果、約105kDa、約90kDa、約68kDaと約31kDaの場所にバンドが検出された。68kDaに存在するバンドは、タンパク質の保護剤として用いられている牛血清アルブミン(BSA)であることが予測されることから、SDS−PAGEゲルからナイロンメンブレン膜にタンパク質を転写し、約105kDa、約90kDa、約31kDaのバンドを切り出し、N末端アミノ酸解析に供した。
N末端アミノ酸解析の結果、検出されたアミノ酸は以下の配列であった。
105kDa:SGPVPPVTIA
90kDa:ADHGSTLA
31kDa:MDLGTVTDLVPTADPV
これらの配列をもとに、キサンチンオキシダーゼ遺伝子のクローニングを試みることにした。
キサンチンオキシダーゼの生産菌である、アースロバクター・ルテウスから目的のキサンチンオキシダーゼ遺伝子を取得するため、アースロバクター・ルテウスのゲノム解析を行った。まず、アースロバクター・ルテウスをLB培地で培養し、菌体を回収した後、ゲノムDNAの精製を行った。ゲノムDNAの精製には、東洋紡社製MagExtractor Plant Genomeを用いて行い、精製法はキット付属の説明書に従った。精製されたゲノムDNAはオペロン・バイオテクノロジー社にてGS−FLXによるゲノム解析を行っていただいた。
ゲノム解析の結果を図2に示す。ゲノム解析の結果、アースロバクター・ルテウスは約4.7MbのゲノムDNAを有していることが判明した。さらに、実施例1で解析されたN末端アミノ酸解析結果から、ブラスト解析を行い、キサンチンオキシダーゼ遺伝子を探索したところ、配列表7に示す配列を見出した。
配列表7に示す配列は、3つの遺伝子が重複した配列となっており、第一の遺伝子の終止コドン(TGA)と第二の遺伝子の開始コドン(ATG)は、TGATGという配列で結合しており、第二の遺伝子の終止コドン(TGA)と第三の遺伝子の開始コドン(ATG)はATGAという配列で結合している。このうち第一の遺伝子は、キサンチンオキシダーゼのアクセサリータンパク質である、XdhCをコードしていると推測され、他の微生物に由来するXdhCと高い同一性を示した。第二及び第三の遺伝子は、それぞれのキサンチンオキシダーゼのαサブユニット(XdhA)βサブユニット(XdhB)をコードしていると推測され、遺伝子産物のN末端配列は解析された105kDaタンパク質と、31kDaタンパク質のN末端アミノ酸とそれぞれ高い同一性を示した。また、90kDaタンパク質にN末端アミノ酸配列は、βサブユニット(XdhB)の内部に高い同一性をもつ配列が見出されたことから、90kDaタンパク質は、105kDaのβサブユニットタンパク質が部分分解された産物であると考えられた。
取得されたDNA配列がキサンチンオキシダーゼをコードすることを確認するため、以下のプライマーセットを用いてキサンチンオキシダーゼ遺伝子をクローニングし、大腸菌発現ベクターpBSKNにNdeIとEcoRIサイトで導入した。
XdhA_F(NdeI) aaaacatATGGACCTGGGCACCGTCACCGA
XdhB_R(EcoRI) aaaagaatTCAGCGGGTgGGGGTGGCGGCC
作製されたキサンチンオキシダーゼ発現ベクターpBSKN−XTOを大腸菌JM109に形質転換し、形質転換体をTB+IM培地(TB培地+1mM IPTG,+0.01mM モリブデン産アンモニウム)で培養し、培養菌体内のキサンチンオキシダーゼ活性を測定した。キサンチンオキシダーゼ活性の検出は、活性測定法Iに示す方法で行った。その結果、大腸菌体内に35U/Lのキサンチンオキシダーゼ活性が検出された。また、対照として発現ベクターであるpBSKNを導入した大腸菌JM109株についても同様に培養を行い、キサンチンオキシダーゼ活性を測定したが、活性は検出されなかった。
キサンチンオキシダーゼの効率的は発現には、アクセサリータンパク質である、XdhCを共発現することが効果的であると考えられ、XdhC遺伝子の共発現を試みた。がXdhC、XdhA, XdhBの3つの遺伝子を共発現させるため、以下のプライマーセットを用いて3つの遺伝子を含む領域をクローニングし、大腸菌発現ベクターpBSKNにNdeIとEcoRIサイトで導入した。
XdhC_F(NdeI) aaaacatATGCTCCACATCGTCGACCGGCT
XdhB_R(EcoRI) aaaagaatTCAGCGGGTgGGGGTGGCGGCC
作製されたキサンチンオキシダーゼ発現ベクターpBSKN−XTOを大腸菌JM109に形質転換し、形質転換体をTB+IM培地(TB培地+1mM IPTG,+0.01mM モリブデン酸アンモニウム)で培養し、培養菌体内のキサンチンオキシダーゼ活性を測定した。キサンチンオキシダーゼ活性の検出は、活性測定法Iに示す方法で行った。その結果、大腸菌体内に68U/Lのキサンチンオキシダーゼ活性が検出された。
発現したキサンチンオキシダーゼが野生株アースロバクター・ルテウスから取得されたものと同等であることを確認するため、大腸菌形質転換体からキサンチンオキシダーゼの精製を試みた。酵素の精製は、菌体の破砕、陰イオンクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーにより行った。取得した酵素液を用いて、酵素特性を評価した。
(1)過酸化水素精製比率の比較
得られた酵素液とアースロバクター・ルテウス野生株が生産するキサンチンオキシダーゼ酵素液、さらに対照として、ミルク由来キサンチンオキシダーゼ酵素液を用いて、活性測定法1及び活性測定法IIで酵素活性測定を行った。結果を表1に示す。
上記3種のXTO酵素液を用いて、活性測定法1の基質をキサンチンからヒポキサンチンに代え、同様に酵素活性測定を行った。キサンチンを基質にしたときの酵素活性を100%とし、ヒポキサンチン基質としたときの酵素活性を求めた。結果を表2に示す。
以上の結果から、本実施例により得られた組換えキサンチンオキシダーゼは、野生型キサンチンオキシダーゼとほぼ同等の特性を有していることが判明した。
Claims (6)
- 下記の(d)または(e)のポリペプチドからなる、共発現させることにより補因子合成および補因子のキサンチンオキシダーゼへの配位を活性化するアクセサリー蛋白質の機能を有する蛋白質。
(d)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(e)配列番号3に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位したアミノ酸配列からなるポリペプチド - 以下の(G)〜(J)のいずれかのDNA。
(G)配列番号3に示されるアミノ酸配列をコードするDNA
(H)配列番号6に示される塩基配列からなるDNA
(I)配列番号6に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、共発現させることにより補因子合成および補因子のキサンチンオキシダーゼへの配位を活性化するアクセサリー蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするDNA
(J)配列番号6に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び/又は逆位されている塩基配列からなる、共発現させることにより補因子合成および補因子のキサンチンオキシダーゼへの配位を活性化するアクセサリー蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするDNA - 以下の(A)〜(F)のいずれかのDNA、および、請求項2に記載のDNAを組み込んだベクター。
(A)配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードするDNAと、配列番号2に示されるアミノ酸配列をコードするDNAの組合せ
(B)配列番号4に示される塩基配列からなるDNAと、配列番号5に示される塩基配列からなるDNAの組合せ
(C)配列番号4に示される塩基配列との同一性が90%以上である塩基配列からなるDNAと、配列番号5に示される塩基配列との同一性が90%以上である塩基配列からなるDNAとから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せをコードするDNAの組合せ(ただし、上記(B)の組合せを除く)
(D)配列番号4に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAと、配列番号5に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAとから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せをコードするDNAの組合せ(ただし、上記(B)の組合せを除く)
(E)配列番号4に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び/又は逆位されている塩基配列と、配列番号5に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び/又は逆位されている塩基配列とから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せをコードするDNAの組合せ(ただし、上記(B)の組合せを除く)
(F)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位したアミノ酸配列からなるサブユニットと、配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位したアミノ酸配列からなるサブユニットとから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せをコードするDNAの組合せ - 請求項3に記載のベクターを含み、かつ、宿主細胞がエシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、ブレビバチルス(Brevibacillus)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、サッカロミセス(Saccharomyces)属、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属、キャンデイダ(Candida)属、ピキア(Pichia)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、トリコデルマ(Trichoderma)属およびコレトトリカム(Colletotrichum)属の微生物よりなる群から選択されるいずれかの微生物である形質転換体。
- 宿主細胞がエシェリヒア(Escherichia)属の微生物である請求項4に記載の形質転換体。
- 請求項4または5に記載の形質転換体を培養すること、及び、得られた培養物からキサンチンオキシダーゼを採取することを含むキサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013147484 | 2013-07-16 | ||
JP2013147484 | 2013-07-16 | ||
PCT/JP2014/067892 WO2015008637A1 (ja) | 2013-07-16 | 2014-07-04 | キサンチンオキシダーゼ遺伝子とそれをコードするアミノ酸配列 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2015008637A1 JPWO2015008637A1 (ja) | 2017-03-02 |
JP6455430B2 true JP6455430B2 (ja) | 2019-01-23 |
Family
ID=52346106
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015527253A Active JP6455430B2 (ja) | 2013-07-16 | 2014-07-04 | キサンチンオキシダーゼ遺伝子とそれをコードするアミノ酸配列 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6455430B2 (ja) |
WO (1) | WO2015008637A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107119059B (zh) * | 2017-04-20 | 2020-03-20 | 武汉轻工大学 | 可用于临床检测的黄嘌呤氧化酶、其编码基因及其应用 |
KR101899426B1 (ko) | 2017-05-25 | 2018-09-17 | (주)큐브바이오 | 종양 진단을 위한 퓨린 대사체 하이포잔틴 및 잔틴 농도 분석용 효소 조성물 |
CN109735511B (zh) * | 2018-09-06 | 2022-03-29 | 西安文理学院 | 一种临床检测用黄嘌呤氧化酶的制备方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2917400B2 (ja) * | 1990-04-18 | 1999-07-12 | 東洋紡績株式会社 | 耐熱性キサンチンオキシダーゼおよびその製造法 |
JP2004105024A (ja) * | 2002-09-13 | 2004-04-08 | Toyobo Co Ltd | 溶液中のヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体の安定化方法及びその組成物 |
-
2014
- 2014-07-04 WO PCT/JP2014/067892 patent/WO2015008637A1/ja active Application Filing
- 2014-07-04 JP JP2015527253A patent/JP6455430B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPWO2015008637A1 (ja) | 2017-03-02 |
WO2015008637A1 (ja) | 2015-01-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6460152B2 (ja) | 新規なグルコース脱水素酵素 | |
JP4348563B2 (ja) | 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ | |
JP6212852B2 (ja) | 新規なグルコース脱水素酵素 | |
JP6079038B2 (ja) | 新規なグルコース脱水素酵素 | |
WO2010053161A1 (ja) | 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ | |
WO2014002973A1 (ja) | 新規なグルコース脱水素酵素 | |
JP6465156B2 (ja) | 新規なグルコース脱水素酵素 | |
JP6455430B2 (ja) | キサンチンオキシダーゼ遺伝子とそれをコードするアミノ酸配列 | |
JP2008206433A (ja) | グルコースデヒドロゲナーゼをコードするdna | |
WO2003091430A1 (en) | GLUCOSE DEHYDROGENASE β-SUBUNIT AND DNA ENCODING THE SAME | |
JP6414410B2 (ja) | キサンチンオキシダーゼの製造方法 | |
KR20190095429A (ko) | 글루타티온 환원 효소 | |
JP6186927B2 (ja) | 新規なグルコースオキシダーゼ及びそれをコードするポリペプチド配列 | |
JP4036667B2 (ja) | 新規グルコース脱水素酵素及びそれをコードする遺伝子 | |
JP2016158578A (ja) | フラビン結合型グルコース脱水素酵素 | |
US7037698B2 (en) | Pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase | |
JP7255865B2 (ja) | キヌレニンモノオキシゲナーゼ、及びそれを用いたキヌレニンの測定方法 | |
JP6476542B2 (ja) | 変異型グルコース−6−リン酸脱水素酵素 | |
JP2001275669A (ja) | 新規カタラーゼ遺伝子及び該遺伝子を用いた新規カタラーゼの製造方法 | |
EP1600503A1 (en) | Modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase | |
JP2004121234A (ja) | 新規なグリセロールキナーゼ、該遺伝子及び該遺伝子を用いたグリセロールキナーゼの製造法 | |
JPH119279A (ja) | グリセロールキナーゼをコードする遺伝子 | |
JP2014180223A (ja) | アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ及びその製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170616 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180522 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180622 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181009 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181031 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181113 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20181120 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20181203 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 6455430 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |