KR20190095429A - 글루타티온 환원 효소 - Google Patents

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KR20190095429A
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덴 베르흐 마르코 알렉산더 반
엘라헤 야말자데
사무엘 아드리아누스 마리아 루이나르드
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디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
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Abstract

본 발명은, a) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 b) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드 서열에 대해 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 글루타티온 환원 효소 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다.

Description

글루타티온 환원 효소
본 발명은 글루타티온 환원 효소 활성을 갖는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 글루타티온 환원 효소를 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 상기 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드의 생산 방법 및 시스틴의 환원을 위한 상기 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 시스틴을 효소에 의해 환원시키는 방법에 관한 것이다.
글루타티온 환원 효소(GR로 축약됨)(EC 1.8.1.7)는 글루타티온 다이설파이드(GSSG)를 산화 스트레스에 저항하고 환원성 환경을 유지하는 데 유용한 분자인 설프히드릴 형태의 글루타티온(GSH)으로 환원시킴에 있어서 촉매작용한다. 산화 스트레스에 저항하고 환원성 환경을 제공하는 것은 식품 적용례에서, 예를 들어 식품의 보존을 위해 유익하다.
GSH의 환원성 환경으로부터 이익을 얻을 수 있는 하나의 적용례는 시스틴 또는 L-시스틴을 시스테인 또는 L-시스테인으로 환원시키는 것이다. 시스테인은 식품, 제약 및 개인 관리 산업에서 전구체이다. 보다 큰 식품 적용례 중 하나는 향미의 생산이다. 예를 들어, 메일라드(Maillard) 반응에 의한 시스테인과 당의 반응은 고기 향미를 산출한다. 또한, 시스테인은 베이킹용 가공 보조제로서 사용되고 천연 과일 주스 제품에 산화 방지제로서 첨가된다. 식품 첨가제로서 사용될 때, 시스테인은 E 번호 E920을 갖는다.
변이체 글루타티온 환원 효소가 동일한 전환에 촉매작용하지만, 이는 이들이 동일한 적용례에 적합한 것임을 의미하지 않는다. 다양한 적용례는 효소가 작동해야 하는 조건에 대한 다양한 요구를 제기할 것이다. 효소에 의한 전환 비에 영향을 미칠 수 있는 물리적 파라미터 및 화학적 파라미터는 온도(반응 속도에 대해 긍정적인 영향을 미치나, 효소 안정성에 대해서는 부정적인 영향을 미칠 수 있음), 습기 함량, pH, 염 농도, 식품 매트릭스의 구조적 무결성, 효소의 활성제 또는 억제제의 존재, 기질 및 생성물의 농도 등이다.
따라서, 예를 들어 열안정성이 유리할 수 있는 고온 적용례에서 여러 적용례를 위해 개선된 특성을 갖는 개선된 글루타티온 환원 효소에 대한 지속적인 필요성이 존재한다.
식품에서의 적용례를 위해, GSH가 미생물 오염을 미함유하는 것이 중요하다. 미생물 오염을 피하는 하나의 해결책은 고온에서, 예컨대 40℃ 이상에서 GSH를 생산하는 것이다.
본 발명은 글루타티온 환원 효소 활성을 갖는 폴리펩티드의 식별을 기반으로 한다. 폴리펩티드는 예를 들어 카에토미움(Chaetomium) 속, 예컨대 카에토미움 써모필룸(Chaetomium thermophilum) 종의 미생물로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 호열성, 예를 들어 열안정성(즉, 효소 활성에 대해 열 처리를 견디는 능력) 및/또는 열활성(즉, 단지 고온에서 완전한 효소 활성을 발달시킴)을 갖는다. 본 발명의 폴리펩티드는 대안적으로 또는 부가적으로 넓은 pH 범위에 걸쳐 및/또는 비교적 높거나 낮은 pH에서 활성인 것일 수 있다.
개선된 호열성을 갖는 글루타티온 환원 효소를 제공하는 것은 이의 적용례를 넓히는 중요한 방법이다. 열활성 및 열안정성 글루타티온 환원 효소는 다른 글루타티온 환원 효소보다 상당한 유리점을 갖는다. 예를 들어, GSSG의 환원은 열활성 또는 열안정성 글루타티온 환원 효소를 사용하여 비교적 고온에서 수행될 수 있고, 이는 고온이 역할을 하는 공정과의 양립성을 야기한다. 또한, 고온에서 GSSG의 환원은 보다 빠른 반응 속도에서 수행될 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드가 크게 다른 pH 범위를 갖는 다양한 공정에서 본 발명의 폴리펩티드를 사용하는 것이 가능할 수 있기 때문에 넓은 pH 범위에서 활성인 글루타티온 환원 효소가 유리하다. 또한, pH 범위가 크게 변하는 공정에서 이러한 폴리펩티드를 사용하는 것이 가능하다. 또한, 6 내지 10의 pH 값이 존재하는 공정이 또한 가능하다.
글루타티온 환원 효소 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드는 특히 식품 성분의 제조에서, 바람직하게는 40℃ 초과의 온도에서 시스틴을 시스테인으로 환원시키는 것에 사용될 수 있다. 이는 식품 성분의 미생물 오염의 위험을 감소시키기 때문에 유익하다.
따라서, 본 발명은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 글루타티온 환원 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공한다:
a) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;
b) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드 서열에 대해 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
c) 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열의 대응 가닥에 중간 엄격도 조건(stringency condition) 하에 혼성화하는 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및
d) 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
또한, 본 발명은 하기를 제공한다:
- 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 제1항 또는 제2항의 글루타티온 환원 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
- 숙주 세포에서 글루타티온 환원 효소의 발현을 지시하는 하나 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결되는, 제3항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
- 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 핵산 또는 본 발명의의 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
- 폴리펩티드의 생산을 허용하는 조건 하에 적합한 발효 배지에서 본 발명에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 임의적으로, 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 폴리펩티드의 생산 방법.
- 산화된 티올의 환원을 위한 본 발명의 폴리펩티드의 용도.
- 시스틴을, 본 발명의 폴리펩티드, 보조인자 및 매개자(mediator)를 포함하는 환원 용액에 접촉시키는 단계; 및 임의적으로, 상기 시스테인을 회수하는 단계를 포함하는, 시스틴을 시스테인으로 효소에 의해 환원시키는 방법.
- 시스테인 및 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
도 1은 실시예 1에 사용된 발현 벡터를 제시한다.
도 2는 상이한 온도에서 카에토미움 써모필룸으로부터의 균류 글루타티온 환원 효소 폴리펩티드 및 효모 글루타티온 환원 효소의 온도 활성을 제시한다.
도 3은 상이한 pH에서 카에토미움 써모필룸으로부터의 글루타티온 환원 효소 폴리펩티드 및 효모 글루타티온 환원 효소의 상대적 활성을 제시한다.
도 4는 30분 후에 상이한 온도에서 카에토미움 써모필룸으로부터의 균류 글루타티온 환원 효소 폴리펩티드 및 효모 글루타티온 환원 효소의 잔여 활성을 제시한다.
도 5는 카에토미움 써모필룸으로부터의 글루타티온 환원 효소 폴리펩티드 및 효모 글루타티온 환원 효소를 사용하는 시스테인의 형성을 제시한다.
서열목록 설명
서열번호 1은 카에토미움 써모필룸으로부터의 글루타티온 환원 효소 폴리펩티드의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 2는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)에서의 발현을 위해 코돈 쌍 최적화된 카에토미움 써모필룸으로부터의 글루타티온 환원 효소 폴리펩티드의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제시한다.
상세한 설명
용어 "대응 가닥"은 용어 "보체"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 핵산의 대응 가닥은 암호화 가닥의 보체 또는 비-암호화 가닥의 보체일 수 있다. 이중-가닥 핵산을 언급할 때, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 보체는 아미노산 서열을 암호화하는 가닥의 대응 가닥 또는 이를 함유하는 임의의 핵산 분자를 지칭한다. 전형적으로, 역 대응 가닥이 의도된다.
용어 "발현"은 비제한적으로 전사, 전사 후 변형, 번역, 번역 후 변형 및 분비를 포함하는 폴리펩티드의 생산에 수반되는 임의의 단계를 포함한다.
"발현 벡터"는 시험관내 또는 폴리뉴클레오티드의 숙주 세포내 발현 및/또는 번역을 위한 적절한 제어 서열(예컨대 프로모터, 및 전사 및 번역 중단 신호)에 작동가능하게 연결된 폴리펩티드 암호화를 위한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
발현 벡터는, 재조합 DNA 절차를 편리하게 수행할 수 있고 폴리뉴클레오티드의 발현을 야기할 수 있는 임의의 벡터(예를 들어 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있다. 벡터의 선택은 전형적으로 벡터가 도입될 세포와 벡터의 양립성에 좌우될 수 있다. 벡터는 선형 또는 폐환상 플라스미드일 수 있다. 벡터는 자체적으로 복제하는 벡터, 즉, 염색체 외 독립체로서 존재하는 벡터(이의 복제는 염색체 복제에 독립적임), 예를 들어 플라스미드, 염색체 외 요소, 미니-염색체 또는 인공 염색체일 수 있다. 대안적으로, 벡터는, 숙주 세포에 도입될 때, 게놈 내로 통합되고 염색체와 함께 복제되어 염색체 내에서 통합된 것일 수 있다. 통합성 클로닝 벡터는 무작위로 또는 숙주 세포의 염색체의 미리 결정된 표적 유전자자리에서 통합할 수 있다. 벡터 시스템은 단일 벡터 또는 플라스미드, 또는 2개 이상의 벡터 또는 플라스미드(이는 숙주 세포의 게놈 또는 트랜스포존 내로 도입될 총 DNA를 함께 함유함)일 수 있다.
본원에 정의된 "숙주 세포"는 유전자 조작에 적합한 유기체이고, 표적 생성물, 예컨대 본 발명에 따른 폴리펩티드의 산업적 생산에 유용한 세포 밀도로 배양될 수 있는 것이다. 숙주 세포는 자연에서 발견되는 숙주 세포, 유전자 조작 또는 전형적인 돌연변이 생성 후에 모 숙주 세포로부터 유래되는 숙주세포일 수 있다. 유리하게는, 숙주 세포는 재조합 숙주 세포이다.
용어 "혼성화"는 올리고머성 화합물, 예컨대 핵산 화합물의 실질적 대응 가닥의 페어링을 의미한다.
혼성화는 낮거나 중간이거나 높은 엄격도 조건 하에 수행될 수 있다. 낮은 엄격도 혼성화 조건은 6X 염화 나트륨/시트르산 나트륨(SSC)에서 약 45℃에서 혼성화한 후에 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 50℃ 이상의 온도에서 2회 세척을 포함한다(세척 온도는 낮은 엄격도 조건의 경우 55℃로 증가할 수 있다). 중간 엄격도 혼성화 조건은 6X SSC에서 약 45℃에서 혼성화한 후에 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 60℃에서 1회 이상의 세척을 포함하고, 높은 엄격도 혼성화 조건은 6X SSC에서 약 45℃에서 혼성화한 후에 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 65℃에서 1회 이상 세척을 포함한다.
핵산 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에서 5개 이상의 뉴클레오티드 또는 핵산 유닛을 포함하는 뉴클레오티드 중합체로서 정의된다. 뉴클레오티드 또는 핵산은 RNA 및 DNA를 지칭한다. 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드 서열"은 상호교환적으로 본원에서 사용된다.
용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기를 포함하고 5개 초과의 아미노산 잔기를 함유하는 분자를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "단백질"은 용어 "폴리펩티드"와 동의어이고, 또한 2개 이상의 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 따라서, 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 폴리펩티드는 임의적으로 변형되어(예를 들어 글리코실화, 포스포릴화, 아실화, 파르네실화, 프레닐화, 설폰화 등) 작용기를 추가할 수 있다. 특정 조건 하에 특이적 기질의 존재 하에 활성을 나타내는 폴리펩티드는 효소로서 지칭될 수 있다. 유전 암호의 동의성의 결과로서, 제시된 폴리펩티드를 암호화하는 많은 뉴클레오티드 서열이 생산될 수 있음이 이해될 것이다.
"단리된 핵산 단편"은 단편으로서 자연적으로 발생하지 않고 자연 상태에서 발견되지 않는 핵산 단편이다.
본원에 사용된 용어 "단리된 폴리펩티드"는 자연적으로 결합되어 있는 하나 이상의 성분, 예를 들어 다른 폴리펩티드 물질로부터 제거된 폴리펩티드를 의미한다. 단리된 폴리펩티드는 임의의 다른 불순물을 미함유할 수 있다. 단리된 폴리펩티드는 SDS-PAGE 또는 이러한 목적을 위해 적함하고 당업자에게 공지된 임의의 다른 분석 방법에 의해 결정시 50% 이상 순수, 예를 들어 적어도 60% 순수, 적어도 70% 순수, 적어도 75% 순수, 적어도 80% 순수, 적어도 85% 순수, 적어도 80% 순수, 적어도 90% 순수, 또는 적어도 95% 순수, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 순수할 수 있다. 단리된 폴리펩티드는 재조합 숙주 세포에 의해 생산될 수 있다.
바람직하게는, 본 폴리펩티드 또는 본 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 글루타티온 환원 효소 활성 외에 다른 효소 활성을 갖지 않는다. 보다 바람직하게는, 본 폴리펩티드 또는 본 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 펩티다제 활성, 프로테아제 활성 및/또는 포스파타제 활성을 갖지 않는다.
"성숙 폴리펩티드"는 최종 형태의 폴리펩티드로서 본원에서 정의되고 mRNA를 폴리펩티드로 번역하고, 상기 폴리펩티드를 번역 후 변형한 후에 수득된다. 번역 후 변형은 N-말단 처리, C-말단 절단, 글리코실화, 포스포릴화, 및 절단에 의한 리더 서열, 예컨대 신호 펩티드, 프로펩티드 및/또는 프리프로펩티드의 제거를 포함한다.
"성숙 폴리펩티드 암호화 서열"은 (이의 아미노산 서열에 관해) 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
용어 "핵산 구축물"은 본원에서 자연적으로 발생하는 유전자로부터 단리되거나, 자연에 존재하지 않는 방식으로 결합되고 나란히 놓인 핵산 분절을 함유하도록 변형된 단일- 또는 이중-가닥인 핵산 분자로서 지칭된다. 용어 핵산 구축물은, 핵산 구축물이 암호화 서열의 발현에 필요한 모든 제어 서열을 함유하는 경우(여기서 상기 제어 서열은 상기 암호화 서열에 작동가능하게 연결된다), 용어 "발현 카세트"와 동의어이다.
용어 "프로모터"는, RNA 폴리머라제에 의해 결합되고, 전사를 개시하는 핵산 서열의 정확한 다운스트림 전자 시작 부위를 안내하는 DNA 서열로서 본원에서 정의된다. 또한, 프로모터는 조절자에 대한 결합 부위를 포함할 수 있다.
용어 "재조합"은, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터에 관해 사용될 때, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입, 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형됨을 나타내거나, 세포가 상기와 같이 변형된 세포로부터 유래됨을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 천연(비-재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 비정상적으로 발현되거나 적게 발현되거나 전혀 발현되지 않는 천연 유전자를 발현한다. 용어 "재조합"은 "유전자 변형된" 및 "유전자 이식된"과 동의어이다.
용어 "서열 동일성" 또는 "서열 상동성"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적을 위해, 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 서열 상동성 또는 서열 동일성의 백분율을 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬되는 것으로 정의된다. 2개의 서열 사이의 정렬을 최적화하기 위해, 갭이 비교되는 2개의 서열 중 임의의 것에 도입될 수 있다. 이러한 정렬은 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 수행될 수 있다. 대안적으로, 정렬은 보다 짧은 길이에 걸쳐, 예를 들어 약 20개, 약 50개, 약 100개 이상의 뉴클레오티드/염기 또는 아미노산에 걸쳐 수행될 수 있다. 서열 동일성은 보고된 정렬된 영역에 걸친 2개의 서열 사이의 동일한 일치의 백분율이다.
2개의 서열 사이의 서열의 비교 및 서열 동일성의 백분율의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 2개의 서열을 정렬시키고 2개의 서열 사이의 동일성을 결정하는 여러 다양한 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다는 사실을 알 것이다(문헌[Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley]). 2개의 아미노산 서열 사이 또는 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 서열 동일성은 2개의 서열의 정렬을 위한 니들만(Needleman) 및 분슈(Wunsch) 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다(문헌[Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453]). 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열 둘 다는 알고리즘에 의해 정렬될 수 있다. 니들만-분슈 알고리즘은 컴퓨터 프로그램 NEEDLE로 실현되었다. 본 발명의 목적을 위해, 엠보스 패키지(EMBOSS package)의 NEEDLE 프로그램을 사용하였다(버전 2.8.0 또는 보다 상위 버전, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice,P. Longden,I. and Bleasby,A. Trends in Genetics 16, (6) pp276-277, http://emboss.bioinformatics.nl/). 단백질 서열의 경우, EBLOSUM62를 치환 행렬에 대해 사용하였다. 뉴클레오티드 서열의 경우, EDNAFULL을 사용하였다. 사용된 임의적 파라미터는 10의 갭-오픈 패널티(gap-open penalty) 및 0.5의 갭 연장 패널티(gap extension penalty)이다. 숙련가는 모든 이들 상이한 파라미터가 약간 상이한 결과를 산출할 것이나 2개의 서열의 전체 퍼센트 동일성은 상이한 알고리즘을 사용했을 때 유의미하게 변경되지 않음을 이해할 것이다.
상기에 기재된 프로그램 NEEDLE에 의한 정렬 후에, 쿼리(query) 서열과 본 발명의 서열 사이의 서열 동일성의 백분율을 하기와 같이 계산하였다: 둘 다의 서열에서 동일한 아미노산 또는 동일한 뉴클레오티드를 나타내는 정렬에서 상응하는 위치의 수를 정렬에서 갭의 총수를 감한 후에 정렬의 총 길이로 나눈다. 본원에 정의된 동일성은 NOBRIEF 옵션을 사용하여 NEEDLE로부터 수득될 수 있고 "최장-동일성"으로서 프로그램의 출력에서 표시된다.
본 발명의 핵산 및 단백질 서열은 예를 들어 관련된 서열의 다른 패밀리 구성원을 확인하는 공용 데이터에 대한 조사를 수행하는 "쿼리 서열"로서 추가로 사용될 수 있다. 이러한 조사는 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 조사는 NBLAST 프로그램(스코어 = 100, 워드길이 = 12)을 사용하여 수행되어 본 발명의 핵산 분자에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 조사는 XBLAST 프로그램(스코어 = 50, 워드길이 = 3)을 사용하여 수행되어 본 발명의 단백질 분자에 상응하는 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교의 목적을 위한 갭핑된 정렬을 수득하기 위해, Gapped BLAST를 문헌[Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402]에 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다(예를 들어 XBLAST 및 NBLAST). 미국 국립생물공학정보센터 홈페이지[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/]를 참조한다.
"합성 분자", 예컨대 합성 핵산 또는 합성 폴리펩티드는 시험관내 화학적 또는 효소적 합성에 의해 생산될 수 있다. 이는 비제한적으로 선택된 숙주 유기체에 대한 최적 코돈 사용에 의해 생산된 변이체 핵산을 포함한다.
합성 핵산은 바람직하게는 본원에 참고로 포함된 WO 2006/077258 및/또는 WO 2008/000632에 기재된 방법에 따라 코돈 사용을 위해 최적화될 수 있다. WO 2008/000632는 코돈 쌍 최적화를 다룬다. 코돈 쌍 최적화는 코돈 사용에 대해 변형되었던 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 특히 사용되는 코돈 쌍이 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 개선된 발현 및/또는 암호화된 폴리펩티드의 개선된 생산을 수득하도록 최적화되는 방법이다. 코돈 쌍은 암호화 서열의 2개의 후속 트리플릿의 세트(코돈)로서 정의된다. 당업자는 코돈 사용이 숙주 종에 따라 조정될 필요가 있고, 이는 아마 서열번호 2로부터 유의미한 상동성 편차를 가지나 본 발명에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 변이체를 야기한다는 것을 알 것이다.
본 발명은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 글루타티온 환원 효소 활성 (EC 1.8.1.7)을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다:
a) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖거나 서열번호 1의 폴리펩티드 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;
b) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드 서열에 대해 50% 이상의 서열 동일성을 갖거나 서열번호 1의 폴리펩티드 서열에 대해 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
c) 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열 또는 서열번호 2의 폴리펩티드 암호화 서열의 대응 가닥에 중간 엄격도 조건 하에 혼성화하는 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및
d) 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열 또는 서열번호 2의 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
본 폴리펩티드의 유리점은 열안정성을 갖고 고온에서 이의 활성을 유지한다는 것이다. 이는 폴리펩티드의 활성을 불활성화시키지 않으면서 오염을 줄이기 위한 열처리를 포함하는 식품 공정에서 본 폴리펩티드의 사용을 가능하게 한다.
또한, 본 발명은 하기와 같은 본 발명의 폴리펩티드를 제공한다:
i. 서열번호 1의 (성숙) 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성의 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
ii. 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열(또는 상응하는 야생형 서열, 또는 이종 유기체, 예컨대 효모, 예를 들어 사카로미세스 세레비시아에서 발현을 위해 최적화된 서열 코돈 또는 최적화된 코돈 쌍)의 대응 가닥에 높은 엄격도 조건 하에 혼성화하는 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 또는
iii. 서열번호 2의 (성숙) 폴리펩티드 암호화 서열(또는 상응하는 야생형 서열, 또는 이종 유기체, 예컨대 효모, 예를 들어 사카로미세스 세레비시아에서 발현을 위해 최적화된 서열 코돈 또는 최적화된 코돈 쌍)에 대해 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
또한, 본 발명은 이러한 폴리펩티드의 단리된 폴리펩티드, 실질적으로 순수한 폴리펩티드, 순수한 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드 또는 변이체 폴리펩티드인 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩티드는 카에토미움 속의 유기체로부터, 예컨대 카에토미움 써모필룸으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 기원에 관한 용어 "유래된" 또는 "유래가능한"은 본 발명에 따른 폴리펩티드에 의한 BLAST 조사 수행시, 본 발명에 따른 폴리펩티드가 천연 공급원, 예컨대 미생물 세포로부터 유래가능할 수 있고, 이의 내인성 폴리펩티드는 본원에 개시된 폴리펩티드에 대해 최고 퍼센트 상동성 또는 동일성을 나타낸다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 1의 (성숙) 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85, 86%, 87%, 88%, 89% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 전형적으로 폴리뉴클레오티드 서열은 특정 숙주 세포에서 본원에 개시된 폴리펩티드의 발현을 위해 코돈 최적화되거나 코돈 쌍 최적화된 서열이다. 본 발명의 폴리펩티드는 예를 들어 분비를 위한 적절한 제어 서열 및/또는 신호 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 중간 엄격도 하에, 바람직하게는 높은 엄격도 조건 하에 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열(또는 상응하는 야생형 서열, 또는 이종 유기체, 예컨대 바실러스(Bacillus), 예를 들어 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서 발현을 위해 최적화된 서열 코돈 또는 최적화된 코돈 쌍)의 대응 가닥에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 2의 (성숙) 폴리펩티드 암호화 서열(또는 상응하는 야생형 서열, 또는 이종 유기체, 예컨대 효모, 예를 들어 사카로미세스 세레비시아에서 발현을 위해 최적화된 서열 코돈 또는 최적화된 코돈 쌍)에 대해 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화될 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 성숙 폴리펩티드 서열번호 1의 하나 이상의 위치에서 치환, 결손 및/또는 삽입을 포함하는 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드의 변이체일 수 있다. 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드의 변이체는 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드의 아미노산으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 또는 12개 초과의 아미노산이 상이한 아미노산 서열일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 폴리펩티드의 생물학적 활성 단편을 특징으로 한다.
본 발명의 폴리펩티드는 자연적으로 발생한 폴리펩티드 또는 유전자 조작되거나 재조합된 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 정제될 수 있다. 단백질의 정제는 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 열안정성 및/또는 열활성을 가질 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 넓은 pH 범위에서 활성일 수 있고/있거나 비교적 높거나 낮은 pH에서 활성일 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 열안정성일 수 있다. 본원에서 "열안정성"은 본 발명의 폴리펩티드가 50℃에서 30분의 항온처리 후에 60% 이상의 잔여 글루타티온 환원 효소 활성을 가질 수 있음을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드는 55℃, 60℃, 65℃ 또는 70℃에서 30분의 항온처리 후에 50% 이상의 잔여 글루타티온 환원 효소 활성을 가질 수 있다.
본원에서 "잔여 활성"은 동일한 반응 조건(pH, 기질 등) 하에 이의 최적 온도 범위에서 원래 고유/용적 활성과 비교하여 특정 온도에서 특정 항온처리 기간 후에 효소가 갖는 임의의 고유/용적 효소적 활성을 의미한다. 효소의 고유/용적 활성은 효소 양(예를 들어 mg 또는 ml 단위) 당 단위 시간(예를 들어 분 단위) 당 전환된 기질의 특정 양(예를 들어 μmol 단위)을 의미한다. 효소의 잔여 활성은 백분율(%)로 표현되는 원래 고유/용적 활성으로 나눈 전술된 항온처리 기간 후에 효소의 고유/용적 활성에 기인한다. 이러한 경우, 효소의 고유 활성은 U/mg 단위로 표시될 수 있고, 효소의 용적 활성은 U/ml로 표시될 수 있다. 대안적으로, 효소의 고유/용적 활성은 또한 설명의 의미에서 katal/mg 또는 katal/ml로 표시될 수 있다.
용어 "효소적 활성"(때때로 "촉매적 활성" 또는 "촉매적 효율"로도 지칭됨)은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있고, 효소의 전환비를 지칭하고, 보통 비 kkat/KM으로 표현된다(여기서, kkat는 촉매 상수(턴오버(turnover) 수로도 지칭됨)이고, KM 값은 반응 속도가 이의 최고 값의 절반 위치에 있는 기질 농도에 해당한다). 대안적으로, 효소의 효소적 활성은 또한 고유 활성(전환된 기질의 μmol x mg-1 x 분-1; 상기 참조) 또는 용적 활성(전환된 기질의 μmol x ml-1 x 분-1; 상기 참조)에 의해 명시될 수 있다.
효소적 활성에 대해 문헌, 예컨대 문헌[Structure and Mechanism in Protein Science: A guide to enzyme catalysis and protein folding, Alan Fersht, W.H.Freeman, 1999]; [Fundamentals of Enzyme Kinetics, Athel Cornish-Bowden, Wiley-Blackwell 2012 and Voet et al., "Biochemie" [Biochemistry], 1992, VCH-Verlag, Chapter 13, pages 331-332]을 참조할 수 있다.
따라서, 본 발명의 열안정성 폴리펩티드는 50℃의 온도에서 30분 후에 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상의 잔여 활성을 가질 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 50℃의 온도에서 30분 후에 75 내지 100%, 예컨대 75 내지 90% 범위의 잔여 활성을 갖는다.
글루타티온 환원 효소 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 열활성을 갖는다. 본원에서 "열활성"은 이러한 폴리펩티드의 온도 최적값이 약 50℃ 이상, 약 55℃ 이상 또는 약 60℃ 이상임을 의미한다.
열활성은 실시예 2에 제시된 바와 같이 결정될 수 있다.
용어 "온도 최적값"은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있고, 효소가 이의 최대 효소적 활성을 나타내는 온도 범위에 관한 것이다. 이에 관하여 문헌, 예컨대 문헌[Enzyme Assays: A Practical Approach, Robert Eisenthal,Michael J. Danson, Oxford University Press 2002; Voet et al., "Biochemie", 1992, VCH-Verlag, Chapter 13, page 331]; [I. H. Segel, Enzyme Kinetics: Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State Enzyme Systems, Wiley Interscience, 1993]; 및 [A. G. Marangoni, Enzyme Kinetics: A Modern Approach, Wiley Interscience, 2002]을 참조할 수 있다.
본원에서, 온도 최적값은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드가 달리 일정한 반응 조건 하에 최대 효소적 활성의 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상을 갖는 온도 범위로 이해된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 온도 최적값은 바람직하게는 50℃ 내지 70℃ 범위, 예컨대 55℃ 내지 65℃ 범위이다.
따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 열안정성(즉, 이의 효소적 활성에 관해 열 처리를 견딜 수 있음) 및/또는 열활성(즉, 고온에서 이의 완전한 효소적 활성을 발달시킴)을 갖는다.
본 발명의 폴리펩티드는 비교적 높은 pH, 예컨대 6 이상, 7 이상, 8 이상 또는 9 이상의 pH에서 활성일 수 있다.
용어 "pH 최적값"은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있고, 효소가 이의 최대 효소적 활성을 갖는 pH 범위에 관한 것이다. 이에 관해 관련 있는 문헌, 예컨대 문헌[Enzyme Assays: A Practical Approach, Robert Eisenthal,Michael J. Danson, Oxford University Press 2002 and Voet et al., "Biochemie", 1992, VCH-Verlag, Chapter 13, page 331]을 참조한다. 본원에서, 용어 pH 최적값은 전형적으로 본 발명에 따라 사용된 글루타티온 환원 효소가 달리 일정한 반응 조건 하에 최대 효소적 활성의 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상을 갖는 pH 범위를 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명의 폴리펩티드는 매우 넓은 pH 범위에 걸쳐 활성일 수 있다. pH 6 내지 pH 10 범위에서, 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 최대 활성의 10% 이상의 활성을 가질 수 있다. 이의 결과로서, 크게 다른 pH 범위를 갖는 다양한 공정에서 본 발명의 폴리펩티드를 사용하는 것이 가능할 수 있다. 또한, 이를 pH 값이 공정에서 유의미한 변동을 겪는 공정에서 사용하는 것이 가능하다. 또한, 6 내지 10의 pH가 존재하는 공정이 가능하다.
pH 6.0 내지 pH 10의 전체 pH 범위에 걸쳐, 본 발명의 폴리펩티드는 최대 활성, 즉, 달리 동일한 조건 하에 최적 pH 값을 갖는 최대 활성, 바람직하게는 최적 온도 및 농도에서 최대 활성과 비교하여 10% 이상, 보다 바람직하게는 15% 이상, 추가로 바람직하게는 20% 이상, 가장 바람직하게는 25% 이상, 특히 30% 이상의 활성을 갖는다.
본 발명은 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 글루타티온 환원 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 제공한다.
본 발명의 핵산은 서열번호 2 또는 이의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 2를 포함할 수 있거나 이의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산은 서열번호 2의 핵산의 단리된 핵산, 실질적으로 순수한 핵산, 순수한 핵산, 재조합 핵산, 합성 핵산 또는 변이체 핵산일 수 있다. 변이체 핵산 서열은 예를 들어 서열번호 2에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 핵산 구축물을 제공한다. 본 발명의 핵산을 포함하는 발현 벡터 또는 본 발명의 핵산은 숙주 세포에서 폴리펩티드의 발현을 유도하는 하나 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결된다.
핵산을 핵산 구축물 또는 발현 벡터 내로 삽입하는 여러 방법이 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001]을 참조한다. 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 제어 서열, 예컨대 프로모터 및 종결자 서열에 의해 조작하는 것이 바람직할 수 있다.
프로모터는 돌연변이, 절단 및 혼성 프로모터를 포함하는, 전사 활성을 나타내는, 진핵 또는 원핵 숙주 세포에 적합한 임의의 적절한 프로모터 서열일 수 있고, 세포에 대해 내인성(천연) 또는 이종(외래)인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로부터 수득될 수 있다. 프로모터는 구성적 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터는 예를 들어 전분 유도성 프로모터일 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에 개시된 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포 또는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 적합한 숙주 세포는 포유동물, 곤충, 식물, 균류 또는 조류 세포 또는 박테리아 세포일 수 있다.
바람직하게는, 숙주 세포 또는 재조합 숙주 세포는 진핵 생물, 보다 바람직하게는 효모일 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 숙주 세포는 사카로미세스 세레비시아 또는 재조합 사카로미세스 세레비시아이다.
보다 바람직하게는, 본 숙주 세포는 열불안정성 숙주 세포, 중온성 숙주 세포 또는 35℃ 미만의 활성 피크를 갖는 숙주 세포이다. 열불안정성 숙주 세포의 유리점은 원치않는 효소적 부활성이 예를 들어 40℃ 내지 75℃에서 열 처리에 의해 용이하게 감소할 수 있다는 것이다.
바람직하게는, 본 재조합 숙주 세포(바람직하게는 사카로미세스 세레비시아)는 탈수소 효소, 바람직하게는 열안정성 및/또는 열활성 탈수소 효소를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 핵산은 바실러스로부터, 바람직하게는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 또는 바실러스 서브틸리스로부터 유래된 글루코스 탈수소 효소를 암호화한다. 바실러스 서브틸리스로부터 유래된 효소의 예는 US 5,126,256 및 US 5,114,853에 공지되어 있다. 보다 바람직하게는, 유전자 구축물은 탈수소 효소, 예컨대 글루코스 탈수소 효소의 과발현을 가능하게 한다. 탈수소 효소를 암호화하는 핵산과 본원에 개시된 핵산 또는 발현 벡터를 조합하는 것의 유리점은 재조합 숙주 세포가 둘 다의 효소를 제공한다는 것이다. (글루코스) 탈수소 효소는 유리하게 보조인자의 재생을 위해 사용될 수 있다.
본 발명자는 사카로미세스 세레비시아를 숙주로서 사용함으로써, 원치않는 부활성, 예컨대 펩티다제, 프로테아제 및 포스파타제가 감소됨을 밝혀냈다.
또한, 본 발명은 숙주 세포를 적합한 발효 배지에서 폴리펩티드의 생산에 도움이 되는 조건 하에 배양하는 단계 및 폴리펩티드를 생산하는 단계를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 생산 방법에 관한 것이다. 숙련가는 사용된 숙주 세포에 따라, 예컨대 발효 배지의 pH, 온도 및 조성에 따른 본원에 개시된 폴리펩티드의 생산 방법의 실행 방법을 이해한다. 숙주 세포는 0.5 또는 1 L 이상 내지 10 내지 100 m3 이상의 부피를 갖는 진탕 플라스크에서 또는 발효조에서 배양된다. 배양은 숙주 세포의 필요요건에 따라 호기성으로 또는 혐기성으로 수행될 수 있다.
유리하게, 본원에 개시된 폴리펩티드는 발효 배지로부터 회수되거나 단리된다.
대안적으로, 본원에 개시된 폴리펩티드는 단리된 발효 배지로부터 회수되지 않는다. 발효 배지, 또는 본 재조합 숙주 세포 또는 사카로미세스 세레비시아는 발효 배지로부터 회수됨 없이 산화된 티올의 환원을 위한 효소적 환원을 위해 즉시 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 산화된 티올의 환원을 위한 본 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 산화된 글루타티온의 환원 또는 환원된 글루타티온의 생산을 위한 본 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 보다 바람직하게는, 본 발명은 매개자, 바람직하게는 글루타티온에 의한 산화된 티올의 환원을 위한 본 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 보다 바람직하게는, 본 발명은 시스틴의 환원을 위한 본 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 보다 바람직하게는, 본 발명은 25℃ 내지 75℃ 범위의 온도에서, 바람직하게는 30℃ 내지 65℃ 또는 35℃ 내지 60℃ 범위의 온도에서, 보다 바람직하게는 40℃ 내지 75℃ 범위의 온도에서, 가장 바람직하게는 45℃ 내지 75℃ 또는 심지어 50℃ 또는 60℃ 내지 75℃ 범위의 온도에서 산화된 티올의 환원을 위한 본 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 시스틴을 시스테인으로 효소에 의해 환원시키는 방법에 관한 것이다:
시스틴을, 본 발명의 폴리펩티드, 보조인자 및 매개자를 포함하는 환원 용액에 접촉시키는 단계; 및
임의적으로, 시스테인을 회수하는 단계.
본 발명자는 본 발명의 폴리펩티드가 시스틴을 효소에 의해 환원시키는 데에 효율적으로 사용될 수 있음을 밝혀냈다. 본 폴리펩티드는 특히 고온에서 시스틴을 효소에 의해 환원시킴을 가능하게 하고, 이는 시스테인의 미생물 오염의 위험을 감소시키는 데 유익하다. 이는 시스테인의 식품 적용례에서 유리하다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 시스틴을 환원 용액에 접촉시키는 본 단계는 25℃ 내지 75℃ 범위의 온도에서, 바람직하게는 30℃ 내지 65℃ 또는 35℃ 내지 60℃ 범위의 온도에서, 보다 바람직하게는 40℃ 내지 75℃ 범위의 온도, 가장 바람직하게는 45℃ 내지 75℃ 또는 심지어 50℃ 또는 60℃ 내지 75℃ 범위의 온도에서 수행된다.
본원에 사용된 보조인자는 본 발명의 폴리펩티드를 보조하는 헬퍼 분자를 의미한다. 바람직하게는, 보조인자는 조효소이다. 바람직하게는, 보조인자는 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트(NADPH), 바람직하게는 산화된 형태의 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트(NADP+), 또는 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드(NADH), 바람직하게는 산화된 형태의 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드(NAD+)이다.
본원에 사용된 매개자는 전자 수송 공정을 가능하게 하는 화합물, 즉, 전자를 시스틴으로 수송시키는 것을 촉진하여 환원된 시스테인을 야기하는 분자를 의미한다. 바람직하게는, 본 매개자는 글루타티온이다. 글루타티온은 산화된 형태(GSSG로 축약됨) 또는 환원된 형태(GSH로 축약됨)일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 환원 용액은 6 이상의 pH를 갖는다. 보다 바람직하게는, 본 환원 용액은 6.5 이상, 7 이상, 7.5 이상, 8.5 이상 또는 9.0 이상의 pH를 갖는다. 보다 바람직하게는, 환원 용액의 pH는 7 이하, 8 이하, 9 이하, 10 이하, 11 이하 또는 12 이하이다.
바람직한 실시양태에서, 본 환원 용액은 보조인자 재생 시스템을 추가로 포함한다. 보조인자 재생 시스템의 사용은, 환원 과정 동안 보조 인자의 첨가를 위한 추가적 단계가 필요하지 않기 때문에, 효소에 의해 시스틴을 환원시키는 개선된 방법을 제공한다. 또한, 보조인자를 재생하는 것은 비용 효율적인데, 보다 적은 양의 보조인자가 시스틴을 시스테인으로 환원시키는 데 필요하기 때문이다. 바람직하게는, 보조인자 재생 시스템은 효소 및 상응하는 기질을 포함한다. 바람직하게는, 보조인자 재생 시스템은 글루코스 탈수소 효소 및 글루코스 및/또는 포메이트 탈수소 효소 및 포메이트를 포함한다. 바람직하게는, 글루코스 탈수소 효소 및 글루코스 및/또는 포메이트 탈수소 효소는 열안정성 및/또는 열활성 효소이다. 보다 바람직하게는, 글루코스 탈수소 효소는 바실러스로부터, 보다 바람직하게는 바실러스 메가테리움 또는 바실러스 서브틸리스로부터 유래된다. 열안정성 탈수소 효소는 예를 들어 US 5,126,256 및 US 5,114,853에서 공지되어 있고 바실러스 메가테리움으로부터 유래된 탈수소 효소를 기재한다. 포메이트 탈수소 효소는 NADH의 재생에 특히 적합한 것으로 밝혀진 반면에, 글루코스 탈수소 효소는 NADPH 및 NADH 재생 둘 다에 적합하다. 본 보조인자 재생 시스템에서 대안적 효소는 알코올 탈수소 효소, NADP-의존적 포메이트 탈수소 효소, 글루코스 6-포스페이트 탈수소 효소, H2-촉진된 NAD(P)+-환원성 수소화 효소 또는 포스파이트 탈수소 효소이다. 알코올 탈수소 효소 및 알코올, 보다 바람직하게는 알코올 탈수소 효소와 이소프로판올, 또는 알코올 탈수소 효소와 에탄올을 포함하는 보조인자 재생 시스템이 특히 바람직하다. 알코올 탈수소 효소와 알코올을 기재로서 사용하는 것의 유리점은 알코올 탈수소 효소에 의해 형성된 생성물(예컨대 에탄올을 사용한 후에 이소프로판올 및 아세트알데하이드를 사용한 후에 아세톤)이 휘발성이어서 본 환원 용액 및/또는 시스테인 포함 용액으로부터 용이하게 제거될 수 있다는 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 산업적 규모에서 수행된다. 본 발명의 설명에 걸쳐, 산업적 규모 방법 또는 산업적 공정은 10 L 이상, 바람직하게는 100 L 이상, 보다 바람직하게는 1 m3 이상, 5 m3 이상, 보다 더 바람직하게는 10 m3 이상, 가장 바람직하게는 25 m3 이상, 바람직하게는 250 m3 미만의 부피 규모를 갖는 환원 용액을 사용하는 방법을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 환원 용액은 시스테인을 시스틴으로 재산화시키는 것에 촉매작용하는 화합물을 적게, 즉, 5%(중량) 미만 또는 1%(중량) 미만으로 함유하거나 함유하지 않는다. 전자를 '흡착하는' 경향을 갖는 이러한 화합물의 예는 제2철, 니트레이트, 구리 이온이다. 유리점은 본 환원 용액에서 증가된 양의 시스테인이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 환원 용액은 수용액이다. 바람직하게는, 환원 용액 또는 수용액은 완충제를 포함한다. 바람직하게는, 완충제는 나트륨 포스페이트 완충제이다. 대안적으로, 완충제는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 완충제(또는 트리스 HCl 완충제) 또는 2-(N-모폴리노)에탄설폰산 완충제(MES 완충제로 축약됨)이다.
본 발명의 효소에 의한 환원에 의해 생산된 시스테인이 미생물 오염을 미함유하여, 식품 적용례에서의 안전한 사용을 가능하게 한다는 유리점을 고려했을 때, 본 발명은 시스테인 및 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 조성물은 식품 조성물이다. 식품 조성물은 안전한 것으로 간주되고/되거나 식품의 제조에서 사용하기에 적합한 조성물이다. 보다 바람직하게는, 본 조성물은 글루콘산, 폼산, 글루코스, 포메이트, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드, 글루타티온(GSH 또는 GSSG), 아세톤 및 아세트알데하이드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 것을 추가로 포함한다.
또는, 본 발명으로부터 기인한 시스테인은 유리하게 식품, 식품 매트릭스 향미 제조 공정에서 유리하게 사용될 수 있다.
본 발명은 비제한적인 실시예에서 추가로 설명된다.
실시예
실시예 1: 사카로미세스 세레비시아에서 카에토미움 써모필룸의 글루타티온 환원 효소의 발현
고온에서 기능하는 글루타티온 환원 효소(GR) 활성을 갖는 폴리펩티드를 카에토미움 써모필룸 변이체 써모필룸 균주 DSM 1495로부터 기원한 카에토미움 써모필룸으로부터 수득하였다.
서열번호 1의 아미노산 서열을 WO 2008/000632에 기재된 바와 같이 사카로미세스 세레비시아 특이적 코돈 쌍 최적화를 위한 템플레이트로서 사용하였다. 클로을 위해, BsaI 인식 부위를 함유하는 DNA 서열을 균류 GR을 암호화하는 유전자의 5'- 및 3'-단부에 도입하였다. 골든 게이트 클로닝(golden gate cloning)을 사용함으로써 균류 GR 유전자를 사카로미세스 세레비시아 TDH3 프로모터와 TAL1 종결자 사이에 위치시킨 후에, 증식을 위해 에스케리키아 콜라이(Eschericia coli)에 형질전환시켰다. 형질전환체를 네오마이신(Neomycin)에 대한 저항성을 부여하는 카나마이신(kanamycin) 저항 유전자를 사용하여 선택하였다. THD3 프로모터-균류 GR 서열번호 2-TAL1 종결자(POT) 발현 카세트를 함유하는 플라스미드를 단리하고, POT의 증폭을 위한 PCR 반응에서 템플레이트로서 사용하였고, 도 1에 나타낸 바와 같이 선형화된 사카로미세스 세레비시아 2-마이크론 발현 벡터 pRS30g의 5'- 및 3'-단부에 상응하는 50 염기 쌍 DNA 서열을 동시 첨가하였다. 균류 GR POT 발현 카세트 및 선형화된 pRS30g를 PEG 리튬 아세테이트(LIAC) 방법을 통해 내인성 글루타티온 환원 효소 활성이 없는(ΔGLR1) 공개적으로 입수가능한 사카로미세스 세레비시아 CEN.PK113-7D에 공동-형질감염시켰다. 벡터 주쇄 및 균류 GR POT를 기능성 발현 벡터로 상동 재조합을 통해 생체내 재결합시켰다. 형질전환체의 선택을 G418 저항성을 부여하는 pRS30g 상에 존재하는 KanMx 마커를 사용하여 수행하였다. 적절한 형질전환체를 효모 추출물, 파이톤(phytone), D 글루코스 배지(YEPh-D 배지) + G418(200 μg/ml)에서 배양하였다. 예비 배양물을 사용하여 Verduyn 배지(문헌[Verduyn C, Postma E, Scheffers WA, van Dijken JP. 1992a. Effect of Benzoic Acid on Metabolic Fluxes in Yeasts: A Continuous-Culture Study on the Regulation of Respiration and Alcoholic Fermentation. Yeast 8:501-517]) + G418(400 ml, 2 L 진탕 플라스크에서, 200 RPM, 30℃)에서 발효물을 접종하여 0.1의 OD600을 개시하였다. 24시간의 항온처리 후에, 세포를 원심분리하고 밀리-큐 물(milli-Q water; mQ)로 세척하고 200 mM Tris-HCL 완충제(pH 7.5)에 펠릿 습중량을 기준으로 10%(w/w)로 현탁시켰다. 현탁액을 500 mg 유리 비드(0.45 내지 0.50 mm)를 함유하는 2 ml 튜브에 1 ml 분획으로 옮겼다. 사이에 얼음 상에서 2분의 냉각과 함께 3회 5000 RPM에서 40초 동안 Precellys 24 균질기 상에서 튜브를 완전히 진탕시켜 세포를 기계적으로 용해시켰다. 불용성 세포 잔해를 4℃에서 15분 동안 12.000 RPM에서 원심분리하여 제거하여 상청액을 모으고 60분 동안 3000 RPM에서 원심분리하였다. 이러한 무세포 추출물을 글루타티온 환원 효소의 공급원으로서 사용하였다.
실시예 2: 열안정성 글루타티온 환원 효소의 생화학적 특성규명
2.1 열안정성 균류 글루타티온 환원 효소 및 효모 글루타티온 환원 효소의 열 의존성 활성
상이한 온도에서 실시예 1에 따른 효소 및 상업적으로 입수가능한 사카로미세스 세레비시아의 효모 글루타티온 환원 효소(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), G3664)의 활성을, 효소를 10 mM GSSG 및 0.5 mM NADPH와 함께 분석 완충제 0.1 M Tris(pH 8.0)에서 15분 동안 항온처리하고 직후 340 nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량화하였다. 반응 생성물을 목적하는 온도로 설정된 수욕(20℃ 내지 80℃에서 약 10℃마다)에서 유리 시험 튜브에서 그 온도에서 15분 이내에 NADPH의 허용가능한 전환을 산출할 것으로 예상되는 희석물에서 항온처리하였다. 15분 후에, 반응 생성물을 녹는 얼음 상에서 신속한 냉각에 의해 켄칭하고, 판독을 2분 이내에 수행하였다. 하나의 튜브를 블랭크로서 첨가하고(효소 대신에 완충제가 첨가됨), 추가적 블랭크를 수욕에서 항온처리하지 않았으나 반응 동안 얼음 상에서 저장하였다(아이스 블랭크). 아이스 블랭크를 2회, 즉, 시작시 1회 및 종결시 1회 측정하였다. 측정된 흡광도를 상응하는 블랭크(동일한 온도에서 항온처리됨)에 대해 보정하고, 상이한 희석 인자 및 활성을 효소에 대해 관찰된 최고 활성에 대해 표현하였다. 반응의 개시시 반응 혼합물의 조성은 하기와 같다: 250 μl 분석 완충제 pH 8.0 + 250 μL 40 mM GSSG + 250 μL 2 mM NADPH + 250 μL 반응 개시용 효소 희석물.
GR의 상대적 활성을 도 2에 도시하였다. 균류 열안정성 글루타티온 환원 효소는 60℃에서 최대 촉매 활성을 나타냈다.
2.2 균류 열안정성 글루타티온 환원 효소의 pH 의존적 활성
모든 GR 효소의 pH 곡선을 pH 6 내지 10의 모든 pH 유닛에서 0.1 M 포스페이트 완충제 내에서 실온에서 활성을 분석함으로써 수득하였다. GR 효소가 부재하는 블랭크를 모든 pH에 포함시켰다. pH 6 내지 9를 위한 완충제는 0.1 M Na2HPO4 용액 및 0.1 M NaH2PO4 용액을 상이한 비로 혼합함으로써 제조하여 목적하는 pH를 수득하였다. 수산화 나트륨의 첨가가 완충제 pH 10 도달을 위해 필요하였다. NADPH 스톡(50 mM)을 밀리큐 물에서 pH 8까지 수산화 나트륨을 첨가하여 제조하고, 여기서 NADPH는 가용성이었고 안정하였다. GSSG 용액을 각각의 pH에 대해 별개로 제조하였다(15 mL 그라이너(Greiner) 튜브에서, 20 mM = 61.3 mg/5 mL 완충제). 효소를 먼저 물에 20x 희석한 후에 상이한 pH 세트 포인트에서 완충제에 100x 희석하였다. NADPH 스톡 용액을 효소의 첨가 전에 NADPH의 백그라운드 전환을 최소화하는 분석의 개시 전에 간략히 목적하는 완충제에서 25x 희석하였다. 분석을 하기와 같이 수행하였다: 100 μl GSSG 용액 pH X + 50 μl NADPH 용액 pH X + 50 μl 희석된 효소 pH X, 340 nm에서 목적하는 pH에서 후속 동역학 판독을 수행하였다. 반응의 경사(Δ340 nm/분)를 동일한 pH에서의 블랭크 반응(효소 대신에 완충제가 첨가됨) 경사에 대해 보정하고, 활성을 측정된 효소의 최고 활성에 상대적으로 표현하였다. 제1 측정 시리즈는 균류 GR(열 충격 받지 않음)에 대한 것이고, 제2 시리즈는 효모 GR에 대한 것이다.
상대적 활성을 도 3에 나타냈다. 균류 GR은 8 내지 10의 pH에서 최대 촉매 활성을 나타냈다.
2.3 균류 글루타티온 환원 효소의 열안정성(30분)
실시예 1에서 생산된 균류 GR에 열 충격 주어 가능한 프로테아제 활성을 불활성화시켰다. 샘플을 완충제에 100-배 희석하여 샘플 용액에서 글리세롤의 임의의 안정화 효과를 방지하고, 샘플을 수욕에서 65℃에 60분 동안 두었다. 샘플을 15 mL 플라스틱 그라이터 튜브에서 미리-평형화된 완충제(0.1 M Tris pH 8.0)에 희석하였다. 이어서, 튜브를 폐쇄하고 수욕에 즉시 다시 위치시켰다. 60분 후에, 튜브를 효율적인 냉각을 위해 녹는 얼음 위에 두었다. 샘플을 냉장고에 저장하였다. 열 충격 받은 균류 GR(이미 100x 희석됨) 및 상업적 효모 GR(시그마-알드리치 G3664)을 분석 완충제(0.1 M Tris pH 8.0)에 각각 20x 및 2500x 희석하였다. 용액을 2개의 PCR 플레이트의 웰에 옮기고(웰 당 100 μL, 효소 샘플 당 8개의 웰의 3줄); 나머지 희석물을 녹는 얼음 상에 유지하였다. PCR 기기를 줄 방향으로 플레이트를 가로지르는 온도 구배를 적용하도록 프로그래밍하였다. 하나의 PCR 플레이트를 64℃ 내지 40℃ 범위의 온도에서(A→H = 64/62.5/59.4/54.6/49.2/44.6/41.5/40℃) 항온처리하였고, 나머지 하나는 56℃ 내지 80℃ 범위의 온도에서 항온처리하였다(A→H = 80/78.5/75.4/70.6/65.2/60.6/57.5/56℃). 온도 구배를 30분 동안 유지한 후에, PCR 플레이트를 분석 전까지(이 경우 약 20분 동안) 4℃의 일정한 온도로 다시 신속히 냉각하였다. 둘 다의 플레이트를 PCR 기기에서 동일한 시간에서 (동일한 유형의) 상이한 기기에서 항온처리하였다.
GR 효소 둘 다에 대한 온도 안정성 프로필을 도 4에 나타냈다. 균류 GR은 40℃ 내지 65℃ 범위의 온도에서 안정한 반면에, 효모 GR은 55℃에서 30분 동안 항온처리한 후에 이의 활성의 80% 초과를 잃었다.
2.4 적용례에서 균류 글루타티온 환원 효소의 열안정성(16시간)
열 충격 받은 균류 GR(이미 100x 희석됨) 및 상업적 효모 GR(시그마-알드리치 G3664)을 완충제(0.1 M Tris pH 8)에 20x 및 2500x 희석하였다. 샘플을 2개의 PCR 플레이트의 웰에 옮겼다(웰 당 100 μL); 나머지 희석물을 밤새 냉장 보관하였다. 하나의 플레이트를 30℃에서 항온처리하고, 나머지 하나를 50℃에서 PCR 기기에서 16시간 동안 항온처리하였다(리드 온도 105℃). 16시간 후에, PCR 프로그램은 활성 분석 전까지 온도를 다시 4℃로 만들었다. 활성 분석을 위해, 50 μl를 PCR 플레이트의 웰에서 GR 활성 분석 MTP에 옮겼다. 블랭크(효소 대신에 완충제)를 NADPH의 백그라운드 전환에 의한 경사 정정을 위해 포함시켰다(Δ340 nm/분). 상이한 웰(온도 당 효소 당 8개)의 결과를 평균 내고 냉장고에 밤새 저장된 샘플의 활성(=100%, 효소가 이들 조건 하에 안정한 것으로 가정함)에 대해 표현하였다. 열 충격 받은 균류 GR 및 상업적으로 입수가능한 효모 GR의 16시간 항온처리로 하기 결과를 수득하였다(표 1):
(약간) 고온에서 GR 효소의 밤샘 항온 처리 결과의 개요
효소 30℃에서 16시간 후에 잔여 활성 50℃에서 16시간 후에 잔여 활성
효모 GR (시그마) 0% 0%
균류 GR 107% 107%
실시예 3: 글루타티온의 존재 하에 시스틴을 시스테인으로 환원시키는 글루타티온 환원 효소의 용도
매개자로서 산화된 글루타티온 및 보조인자로서 NADPH의 존재 하에 균류 GR 및 효모 GR(시그마)을 사용하여 시스틴을 시스테인으로 환원시켰다. 반응식은 하기와 같다:
CYS-CYS+2GSH→2CYS+GSSG
GSSG+NADPH→2GSH+NADP+H
반응을 온도 및 pH 제어된 200 ml 재킷화된 용기에서 수행하였다. 총 작업 부피는 100 ml였다. 반응을 2개의 용기에서 수행하였다. 용기 1은 기준 효모 GR(시그마)을 함유하였고, 용기 2는 열안정성 균류 GR을 함유하였다. 반응을 55℃에서 수행하였고, pH를 NaOH(1 M)에 의해 8로 조절하였다. 반응물 및 효소의 농도를 하기 표 2에 나타냈다.
GR 효소를 사용하는 시스틴의 환원에서 적용된 성분의 농도(100 mL)
화합물 용기 1 용기 2
효소 효모 GR (시그마) 균류 GR
효소 용량 (유닛/ml)* 2.0 2.0
GSSG (g) 0.1 0.1
시스틴 (g) 1.0 1.0
NADPH (g) 4.775 4.775
*유닛: μmol / ml / 분
샘플을 t=0(효소 첨가 직전), 0.25, 1, 2, 3, 4 및 5시간에 채취하였다. 200 μl 샘플을 1분 동안 13.000 RPM에서 원심분리하고, 100 μl의 상청액을 900 μl 0.111 N HCL에 옮기고(최종 농도: 0.1 N HCL) 혼합하고 -20℃에서 저장하였다. 모든 샘플을 LCMS-MS 방법에 의해 분석하여 L-시스틴, L-시스테인, GSH, GSSG 및 이들 성분의 조합을 측정하였다. 또한, 반응의 완결을 투명한 샘플 용액에 의해 시각적으로 확인하였고, 이는 낮은 가용성의 L-시스틴이 고도로 가용성인 L-시스테인으로 환원됨을 나타낸다. 시간에 따른 시스테인 형성을 도 5에 나타내다. 균류 GR을 사용하여 5시간의 항온처리 이내에 약 10 g/l의 L-시스틴을 L-시스테인으로 완전히 환원시켰다. 효모 GR(시그마)의 존재 하에 시스테인 수준은 시간에 따라 증가하지 않았고, 이는 효소가 적용된 조건 하에 활성이 아니었음을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> DSM IP Assets B.V. <120> GLUTATHIONE REDUCTASE <130> 32280-WO-PCT <140> PCT/EP2017/082784 <141> 2017-12-14 <150> EP 16206155.0 <151> 2016-12-22 <160> 2 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 469 <212> PRT <213> Chaetomium thermophilum <400> 1 Met Ala Pro Ile Ser Lys Glu Thr Asp Phe Leu Val Ile Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Leu Gly Ala Ala Arg Ala Ala Ser Gly Arg Tyr Gly Ala 20 25 30 Arg Ala Met Ile Ile Glu Gly Lys Arg Leu Gly Gly Thr Cys Val Asn 35 40 45 Val Gly Cys Val Pro Lys Lys Val Thr Phe Asn Ala Ala Ala Ile Ala 50 55 60 Glu Thr Ile His His Ser Lys Ala Tyr Gly Phe Asn Val Gln Glu Thr 65 70 75 80 Ala Pro Phe Asp Trp Ala Thr Phe Lys Ala Lys Arg Asp Ala Tyr Val 85 90 95 Lys Arg Leu Asn Gly Ile Tyr Glu Arg Asn Leu Ala Asn Asp Lys Val 100 105 110 Glu Tyr Val His Gly Trp Ala Lys Leu Ile Ser Pro Asn Gln Val Glu 115 120 125 Val Thr Leu Glu Asp Gly Ser Lys Thr Val Val Ser Ala Lys Lys Ile 130 135 140 Leu Ile Ala Val Gly Gly Tyr Pro Ser Pro Pro Pro Ala Ile Pro Gly 145 150 155 160 Ala Glu Tyr Gly Thr Asn Ser Asp Gly Phe Phe Asp Ile Asp Lys Leu 165 170 175 Pro Lys Lys Val Ala Leu Val Gly Ala Gly Tyr Ile Ala Val Glu Phe 180 185 190 Ala Gly Met Phe Asn Ala Leu Gly Val Glu Thr His Leu Phe Ile Arg 195 200 205 His Asp His Phe Leu Arg Ala Phe Asp Pro Met Ile Gln Glu Gly Val 210 215 220 Thr Lys Glu Tyr Glu Arg Leu Gly Val Lys Leu His Lys Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Thr Arg Val Asp Lys Asp Ala Thr Thr Gly Gln Leu Thr Ile His 245 250 255 Tyr Lys Glu Gly Asp Gly Glu Gly Val Ile Gly Asp Val Asp His Leu 260 265 270 Ile Trp Ala Ile Gly Arg Lys Pro Ala Thr Gln Gly Leu Gly Leu Glu 275 280 285 Ala Ala Gly Val Lys Thr Asp Glu Lys Gly Tyr Ile Val Val Asp Glu 290 295 300 Tyr Gln Asn Thr Ser Val Glu Asn Ile Tyr Ala Leu Gly Asp Val Thr 305 310 315 320 Gly Arg Val Glu Leu Thr Pro Val Ala Ile Ala Ala Gly Arg Lys Leu 325 330 335 Ala Ala Arg Leu Tyr Gly Pro Glu Gln Phe Arg Thr Ala Lys Leu Asp 340 345 350 Tyr Glu Asn Val Pro Ser Val Val Phe Ala His Pro Glu Val Gly Ala 355 360 365 Ile Gly Leu Thr Glu Pro Gln Ala Ile Glu Lys Tyr Gly Lys Glu Asn 370 375 380 Val Lys Val Tyr Lys Ser Asn Phe Ile Ala Met Tyr Tyr Ala Met Met 385 390 395 400 Glu Pro Glu Gln Lys Ala Pro Thr Ser Tyr Lys Leu Val Cys Val Gly 405 410 415 Pro Glu Glu Arg Val Val Gly Leu His Ile Met Gly Leu Gly Ser Ala 420 425 430 Glu Ile Leu Gln Gly Phe Gly Val Ala Ile Lys Met Gly Ala Thr Lys 435 440 445 Ala Asp Phe Asp Asn Cys Val Ala Ile His Pro Thr Ser Ala Glu Glu 450 455 460 Leu Val Thr Met Arg 465 <210> 2 <211> 1410 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon Pair Optimized DNA Sequence <400> 2 atggctccaa tctccaagga aactgacttc ttggtcattg gtggtggttc tggtggtttg 60 ggtgccgcta gagctgcttc cggtcgttat ggtgccagag ctatgatcat tgaaggtaag 120 agattgggtg gtacttgtgt caacgttggt tgtgttccaa agaaggtcac tttcaacgct 180 gctgccattg ctgaaaccat tcaccactcc aaggcttacg gtttcaacgt tcaagaaacc 240 gctccattcg actgggctac tttcaaggcc aagagagatg cttacgtcaa gagattgaat 300 ggtatctacg aaagaaactt ggctaacgac aaggttgaat acgtccacgg ttgggctaaa 360 ttgatctctc caaaccaagt tgaagtcact ttagaagatg gttccaagac cgttgtttct 420 gccaagaaga tcttgattgc tgtcggtggt tacccatctc caccaccagc cattccaggt 480 gctgaatacg gtactaactc cgatggtttc ttcgacattg acaaattgcc taagaaggtt 540 gctttggtcg gtgctggtta catcgccgtt gaatttgctg gtatgttcaa cgccttgggt 600 gtcgaaaccc acttgttcat cagacacgac catttcttga gagctttcga cccaatgatc 660 caagaaggtg tcaccaagga atacgaaaga ttaggtgtca aattgcacaa gagatctgct 720 ttgactagag ttgacaagga tgctaccacc ggtcaattaa ctattcacta caaggaaggt 780 gatggtgaag gtgttatcgg tgacgttgac catttgatct gggctattgg tagaaagcca 840 gctactcaag gtttaggttt ggaagctgct ggtgtcaaga ccgatgaaaa gggttacatt 900 gttgttgacg aataccaaaa cacttctgtt gaaaacatct acgctttggg tgatgtcacc 960 ggtcgtgtcg aattgacccc agttgccatt gccgctggta gaaaattggc tgctcgtcta 1020 tacggtccag aacaattcag aaccgctaag ttggactacg aaaacgttcc atccgttgtc 1080 tttgctcacc cagaagttgg tgctatcggt ttgactgaac ctcaagctat cgaaaagtac 1140 ggtaaggaaa acgtcaaggt ctacaaatct aacttcatcg ccatgtacta cgctatgatg 1200 gaaccagaac aaaaggctcc aacttcttac aaattggttt gtgttggtcc agaagaaaga 1260 gttgttggtt tgcacatcat gggtttgggt tctgctgaaa tcttgcaagg tttcggtgtc 1320 gccatcaaga tgggtgctac taaggctgat ttcgacaact gtgttgccat tcacccaacc 1380 tctgctgaag aattagtcac catgcgataa 1410

Claims (15)

  1. a) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;
    b) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드 서열에 대해 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    c) 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열의 대응 가닥에 중간 엄격도 조건 하에 혼성화하는 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및
    d) 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 글루타티온 환원 효소 활성을 갖는 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서,
    카에토미움 써모필룸으로부터 유래되는 폴리펩티드.
  3. 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 제1항 또는 제2항의 글루타티온 환원 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
  4. 숙주 세포에서 글루타티온 환원 효소의 발현을 지시하는 하나 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결되는, 제3항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  5. 제1항 또는 제2항의 폴리펩티드, 제3항의 핵산 또는 제4항의 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  6. 제5항에 있어서,
    재조합 효모 세포, 바람직하게는 재조합 사카로미세스 세레비시아 세포인 재조합 숙주 세포.
  7. 폴리펩티드 생산을 허용하는 조건 하에 적합한 발효 배지에서 제5항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    임의적으로, 폴리펩티드를 회수하는 단계
    를 포함하는 제1항 또는 제2항의 폴리펩티드의 생산 방법.
  8. 산화된 티올을 환원시키기 위한 제1항 또는 제2항의 폴리펩티드의 용도.
  9. 시스틴을, 제1항 또는 제2항의 폴리펩티드, 보조인자 및 매개자를 포함하는 환원 용액에 접촉시키는 단계; 및
    임의적으로, 시스테인을 회수하는 단계
    를 포함하는, 시스틴을 시스테인으로 효소에 의해 환원시키는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    시스틴을 환원 용액에 접촉시키는 단계가 25℃ 내지 75℃ 범위의 온도에서 수행되는, 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    매개자가 글루타티온인, 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    보조인자가 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트(NADPH), 바람직하게는 산화된 형태의 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트(NADP+), 또는 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드(NADH), 바람직하게는 산화된 형태의 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드(NAD+)인, 방법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    환원 용액이 6 이상의 pH를 갖는, 방법.
  14. 시스테인 및 제1항 또는 제2항의 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    글루콘산, 폼산, 글루코스, 포메이트, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드, 글루타티온, 아세톤 및 아세트알데하이드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 것을 추가로 포함하는 조성물.

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