ES2944837T3 - Cepas de E. coli con citoplasma oxidativo - Google Patents
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Abstract
Esta descripción proporciona una cepa de E. coli, que carece de actividad de tiorredoxina reductasa codificada por trxB y actividad de tiorredoxina 1 codificada por trxA, y actividad de glutatión reductasa codificada por gor. Dicha cepa de E. coli expresa una proteína AhpC mutada que tiene actividad de glutatión reductasa y una disulfuro isomerasa procariótica citosólica. La cepa de E. coli tiene un citosol oxidativo y se puede usar para producir eficazmente proteínas que tienen enlaces disulfuro. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Cepas de E. coli con citoplasma oxidativo
Antecedentes de la invención
Las proteínas comercialmente valiosas, como las proteínas terapéuticas, frecuentemente poseen enlaces disulfuro. Estos enlaces disulfuro son importantes para la estabilidad y función de las proteínas. Los huéspedes bacterianos convencionales para la producción de proteínas tienen un citosol reductor y, por lo tanto, no pueden formar enlaces disulfuro en las proteínas expresadas en el citosol. Como resultado, actualmente muchas proteínas no pueden expresarse fácilmente en el citosol bacteriano y, en cambio, se expresan en sistemas de expresión eucariotas o periplásmicos. Aunque se han realizado intentos para promover la formación de enlaces disulfuro en el citosol bacteriano mediante la introducción de mutaciones en el genoma del huésped bacteriano para interrumpir las vías reductoras, estos esfuerzos han tenido un éxito limitado. Por lo tanto, la producción citosólica de proteínas con enlaces disulfuro en bacterias sigue siendo un desafío.
Resumen de la invención
La descripción proporciona una cepa de E. coli, que carece de actividad de tiorredoxina reductasa debido a la modificación genética de trxB y actividad de tiorredoxina 1 debido a la modificación genética de trxA, y actividad de glutatión reductasa debido a la modificación genética de gor. Dicha cepa de E. coli expresa una proteína AhpC mutada que tiene actividad de glutatión reductasa pero que carece de actividad de peroxirreductasa y de una disulfuro isomerasa procariota citosólica. En algunas modalidades, la proteína AhpC mutada es AhpC*. En algunas modalidades, la cepa de E. coli expresa tanto una proteína AhpC de tipo salvaje como una proteína AhpC mutada que tiene actividad de glutatión reductasa.
En algunas modalidades, la cepa comprende además un gen que codifica una proteína de interés. La proteína de interés puede ser una seleccionada del grupo que consiste en: un anticuerpo, un fragmento de este o una cadena ligera de anticuerpo+ de una IgG. En algunas modalidades, E. coli expresa además una prolil isomerasa recombinante.
En algunas modalidades, la disulfuro isomerasa citosólica expresada en E. coli es una DsbC.
En algunas modalidades, el gen que codifica la proteína de interés está ligado operativamente a un promotor inducible, por ejemplo, un promotor T7. En algunas modalidades, el promotor T7 puede ser inducido por arabinosa. En algunas modalidades, la expresión del gen ahpC* en E. coli se controla por un promotor Pc0. En algunas modalidades, la expresión de la disulfuro isomerasa procariota citosólica en E. coli se controla por un promotor MTL. En algunas modalidades, la E. coli es de una cepa K-12.
También se proporciona en la presente descripción un método para expresar proteínas recombinantes solubles de interés en cepas bacterianas de E. coli que comprende las etapas de: cultivar una cepa bacteriana de E. coli que comprende un citosol oxidante y un casete de expresión para expresar una proteína de interés en condiciones que permitan la expresión de la proteína de interés como una proteína soluble, en donde la cepa se modifica genéticamente de la siguiente manera: i) el gen trxB que codifica la tiorredoxina reductasa no es funcional; ii) la tiorredoxina 1 trxA no es funcional; iii) el gen gor de la glutatión reductasa no es funcional; iv) un gen ahpC que se ha mutado de manera que la enzima expresada carece de actividad de peroxirreductasa y tiene actividad de glutatión reductasa; y v) un gen que codifica una disulfuro isomerasa procariota citosólica se ha introducido de forma recombinante en la cepa bacteriana. En algunas modalidades, la cepa de E. coli comprende un gen ahpC funcional y un gen ahpC mutado. En algunas modalidades, el gen ahpC mutado es ahpC*. En algunas modalidades, el gen trxC no es funcional. En algunas modalidades, el gen trx B no es funcional.
En algunas modalidades, la disulfuro isomerasa citosólica es DsbC o disulfuro isomerasa de proteína de levadura (yPDI). En algunas modalidades, la cepa de E. coli expresa además una o más prolil isomerasas recombinantes. En algunas modalidades, la prolil isomerasa recombinante se selecciona del grupo que consiste en ciclofilina, FκΒP, parvulina, SlyD, Tig e yCpr6. En algunas modalidades, la cepa de E. coli expresa además una o más desagregasas. En algunas modalidades, la desagregasa se selecciona del grupo que consiste en Skp, GroEL, GroES, DnaK, DnaJ y GrpE.
En algunas modalidades, E. coli expresa una proteína de interés que se selecciona del grupo que consiste en: una IgG, una cadena ligera de una IgG o una cadena pesada de una IgG. En algunas modalidades, la cadena ligera del anticuerpo es una cadena ligera de un anticuerpo anti-HER2. En algunas modalidades, el gen que codifica la proteína de interés está ligado operativamente a un promotor inducible, por ejemplo, un promotor T7. En algunas modalidades, la cepa de E. coli expresa además una polimerasa T7. En algunas modalidades, la polimerasa T7 está bajo el control de un promotor inducible. En algunas modalidades, el promotor inducible es un ParaBAD, lac, phoA, tetA, xylAB, tac o promotor de ramnosa. En algunas modalidades, la polimerasa T7 puede reconocer el promotor T7, que controla la expresión de la proteína de interés.
En algunas modalidades, la cepa de E. coli expresa GshA codificada por el gen gshA. En algunas modalidades, el gshA es un gen recombinante que se inserta en el locus de TrxB.
También se proporciona en la presente descripción un kit que comprende E. coli de cualquiera de las modalidades anteriores y el kit comprende además un medio de crecimiento. El kit puede comprender además un plásmido que codifica una proteína de interés.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1A muestra los resultados del análisis por SDS PAGE de las fracciones solubles e insolubles de lisados celulares de siete cepas de E. coli modificadas que expresan la cadena ligera (LC) del anticuerpo de un anticuerpo anti-Muc1, Muc1 G09k LC. Las diversas mutaciones en estas cepas de E. coli se muestran en la tabla anterior a los resultados de SDS-PAGE.
La Figura 1B muestra los resultados del análisis por SDS-PAGE de la fracción soluble de los lisados celulares de tres cepas de E. coli modificadas que expresan la LC 7219, la cadena ligera de la IgG anti CD74. Los genotipos de estas cepas de E. coli se muestran en la tabla anterior a los resultados de SDS-PAGE.
La Figura 1C muestra los resultados del análisis por SDS-PAGE similares a los de la Figura 1A, excepto que la LC que se expresa es la cadena ligera de trastuzumab, una proteína que es relativamente fácil de expresar. La Figura 2 muestra los resultados de la expresión relativa de 4 LC distintas con una identidad de secuencia del 78-92 % en las cepas de E.coli Shuffle y Snuggle. La cepa Snuggle mostró entre 20-110 % de mejora en la producción de LC en comparación con la cepa Shuffle.
Descripción detallada de la invención
Introducción
Esta descripción proporciona una cepa de E. coli que se ha modificado genéticamente para que contenga un citoplasma oxidativo. Dicho citoplasma oxidativo es esencial para mantener la estructura tridimensional y la estabilidad de las proteínas que tienen enlaces disulfuro. La invención proporciona un sistema de producción basado en E. coli para producir una proteína tal como una cadena ligera (LC) de anticuerpo con rendimiento alto.
Previamente, se generó una cepa de E. coli mutante ("Shuffle"). Lobstein y otros, Microbial Cell Factories 2012, 11:56. Esta cepa mutante carece de actividad de la tiorredoxina reductasa (TRXB) y actividad de la glutatión reductasa (G0R). La Shuffle también sobreexpresa un DsbC sin su secuencia de señal y una variante del gen ahpC (ahpC*) que codifica una enzima que carece de actividad peroxirreductasa pero tiene actividad de glutatión reductasa. Se informó que Shuffle mostró capacidad para producir proteínas con enlaces disulfuro plegadas correctamente.
En comparación con Shuffle, la cepa de E. coli descrita en la presente descripción además se ha modificado genéticamente para que carezca de actividad de tiorredoxina 1 (TrxA). Por lo tanto, en algunas modalidades, la cepa de E. coli comprende mutaciones nulas en trxA, trxB, y gor. En consecuencia, la cepa carece de actividad de tiorredoxina reductasa (TrxB), actividad de tiorredoxina 1 (TrxA) y actividad de glutatión reductasa (G0R). La cepa de E. coli descrita en la presente descripción también sobreexpresa DsbC sin su secuencia señal y sobreexpresa una variante del gen de ahpC (ahpC*) que codifica una enzima que carece de actividad peroxirreductasa pero tiene actividad de glutatión reductasa.
Sorprendentemente, la cepa de E. coli descrita en la presente descripción puede producir un rendimiento mayor de algunas proteínas con enlaces disulfuro en comparación con Shuffle. Dado que trxB codifica la tiorredoxina reductasa citoplasmática que reduce reversiblemente una tiorredoxina oxidada codificada por trxA; de acuerdo con el pensamiento convencional, la inactivación de la tiorredoxina reductasa debería haber hecho innecesaria la inactivación del sustrato, la tiorredoxina 1, ya que la primera está aguas arriba de la última en la vía bioquímica redox. Por lo tanto, es una sorpresa que la cepa de E.coli que carece tanto de TrxA como de TrxB proporcione un rendimiento superior de algunas proteínas solubles biológicamente activas que contienen enlaces disulfuro.
Definición
El término "reductasa" se refiere a una tiorredoxina reductasa (TrxB), glutatión o glutatión reductasa (Gor) o cualquier otra enzima que pueda reducir los miembros de los sistemas tiorredoxina o glutarredoxina.
El término "tiorredoxina" incluye la tiorredoxina 1 (TrxA) y la tiorredoxina 2 (TrxC), como se describe en Rietsch y Beckwith (1998) Ann. Rev. Genet. 32: 163. Las tiorredoxinas son proteínas pequeñas caracterizadas por la presencia del motivo Cys-Xaa-Xaa-Cys (donde Xaa denota cualquier aminoácido) en su sitio activo. La tiorredoxina es re-reducida por la tiorredoxina reductasa (codificada por el gen trxB) y NADPH. En un mutante trxB, la tiorredoxina se acumula en su forma oxidada. TrxA está codificado por el gen trxA y TrxB está codificado por el gen trxB.
El término "gor" se refiere al gen de la glutatión oxidorreductasa y el término "G0R" se refiere a la glutatión oxidorreductasa.
"DsbC", es una proteína codificada por el gen dsbc, que cataliza la isomerización del enlace disulfuro. Los mutantes nulos de DsbC tienen un defecto en el plegamiento de proteínas con múltiples enlaces disulfuro.
El término "glutatión" se refiere a Y-L-glutamil-L-cisteinil-glicina (GSH), que es un tiol de bajo peso molecular altamente conservado que se encuentra en muchos organismos, que incluye las cianobacterias, las proteobacterias, algunas cepas de bacterias grampositivas y todos los eucariotas que tienen mitocondrias y cloroplastos. El glutatión se sintetiza por la acción de dos enzimas: glutamato-cisteína ligasa (gshA) y glutatión sintetasa (gshB). La glutamato-cisteína ligasa cataliza la reacción entre el ácido glutámico y la cisteína para formar Y-glutamilcisteína, que posteriormente se conjuga con glicina mediante la glutatión sintetasa para formar GSH.
Un ácido nucleico está “unido operativamente” a otro ácido nucleico cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador se une operativamente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas se une operativamente a una secuencia codificante si se coloca para facilitar la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. El enlazamiento se realiza por ligación en los sitios de restricción convenientes. Si esos sitios no existen, los adaptadores o enlazadores del oligonucleótido sintético se usan de acuerdo con la práctica convencional.
AhpC es una de las dos subunidades de la alquil peróxido de hidrógeno reductasa AhpCF. La otra subunidad de AhpCF es la flavoenzima AhpF. Tarataglia y otros, J. Biol. Chem., Volumen 265, 10535-10540, 1990; Smillie y otros, presentación de Genbank NCBL gi; 216542, 1993). Estas dos proteínas actúan juntas; AhpF usa NADH o Na DPH como donante de electrones para AhpC, que reduce los peróxidos de lípidos fisiológicos como el hidroperóxido de ácido linoleico y el hidroperóxido de timina y los hidroperóxidos de alquilo no fisiológicos a sus respectivas formas de alcohol no tóxico. Este complejo (o sistema) enzimático elimina el oxígeno y sus derivados. Se ha demostrado que AhpC actúa como una enzima específica de eliminación de hidroperóxido de alquilo para la protección contra el daño de los radicales de oxígeno, aunque también se ha demostrado que se produce la eliminación de los intermedios de nitrógeno reactivo. AhpF está relacionado con las tiorredoxina reductasas que poseen un fragmento N-terminal adicional extendido esencial para reducir específicamente AhpC.
El término "citosólico", cuando se usa para describir una proteína, se refiere a que la proteína está presente en el citosol de la célula.
Una "proteína o polipéptido heterólogo" se refiere a una proteína o polipéptido que normalmente no se produce en la célula huésped. Un polipéptido heterólogo puede ser de la misma especie y tipo que la célula huésped siempre que se exprese a partir de un ácido nucleico que se haya introducido en la célula huésped.
Un "polipéptido exógeno" se refiere a un polipéptido que normalmente no se produce en la célula.
Una "mutación nula" se refiere a una mutación en un gen que da como resultado un gen no funcional. La mutación nula puede provocar la carencia total de producción del producto génico asociado o un producto que no funciona correctamente.
El término "proteína disulfuro isomerasa", usado indistintamente con el término "disulfuro isomerasa" o "PDI", se refiere a una enzima que cataliza la formación de enlaces disulfuro y la isomerización. La PDI se ha implicado en la catálisis de la formación y reordenación de enlaces disulfuro a través de datos in vitro. (Creighton y otros (1980) J. Mol. Biol. 142:43; Feedman y otros (1989) Biochem. Soc. Symp. 5:167; y Bardwell y Beckwith (1993) Cell 74:899. Se ha demostrado que los mutantes de levadura en PDI tienen un defecto en la formación de enlaces disulfuro en la carboxipeptidasa Y (LaMantia y Lennarz (1993) Cell 74:899). El uso de PDI para la expresión de proteínas heterólogas en células huésped se describe con más detalle en la Solicitud PCT con núm. de publicación WO 93/25676; WO 94/08012; yEP 509,841.
El término "prolil isomerasa", usado indistintamente con "peptidilprolil isomerasa" o "PPlasa", se refiere a una enzima que se encuentra tanto en procariotas como en eucariotas que interconvierten los isómeros cis y trans de enlaces peptídicos con el aminoácido prolina. Las proteínas con actividad de prolil isomerasa incluyen, pero no se limitan a, ciclofilina (por ejemplo, núm. de acceso Q13427), FκΒP (por ejemplo, núm. de acceso Q02790), parvulina (por ejemplo, núm. de acceso Q9Y237), Tig (por ejemplo, núm. de acceso P0A850), SlyD (por ejemplo, núm. de acceso P0A9K9) e yCpr6 (por ejemplo, núm. de acceso S000004206).
El término "desagregasa" se refiere a una proteína chaperona que ayuda a desagregar y/o solubilizar proteínas de interés que se producen, por ejemplo, en un sistema de traducción libre bacteriano. Dichas chaperonas son particularmente útiles a concentraciones altas porque su mecanismo de acción es estequiométrico en lugar de catalítico y se cree que funciona tras estabilizar parches hidrofóbicos de la proteína recién sintetizada mientras la proteína se está plegando. Los ejemplos no limitantes de desagregasas incluyen Skp (por ejemplo, núm. de acceso
P0AEU7), GroEL (por ejemplo, núm. de acceso P0A6F5), GroES (por ejemplo, núm. de acceso P0A6F9), DnaK (por ejemplo, núm. de acceso P0A6Y8), DnaJ (por ejemplo, núm. de acceso P08622), GrpE (por ejemplo, núm. de acceso P09372), o.
Cuando se hace referencia a una proteína en "estado reducido", se refiere a que la proteína tiene más electrones que su forma oxidada.
El término "citoplasma oxidativo" se refiere al citosol de una célula en el que es más probable que un sustrato se oxide a que se reduzca.
El término "actividad de la tiorredoxina reductasa" se refiere a la capacidad de la tiorredoxina reductasa (TRXB) de mantener la tiorredoxina 1 en el estado reducido.
El término "actividad de la tiorredoxina 1" se refiere a la capacidad de la tiorredoxina 1 (TRXA) de mantener la ribonucleótido reductasa en estado reducido.
El término "actividad de peroxirreductasa" se refiere a la capacidad de AhpC para reducir el óxido de lípido fisiológico.
El término "actividad de glutatión reductasa" se refiere a la capacidad de catalizar la reducción de disulfuro de glutatión (GSSG) a glutatión en forma de sulfhidrilo (GSH). Por ejemplo, la glutatión reductasa (G0R) posee la actividad de glutatión reductasa.
El término "recombinante" o "de manera recombinante" se refiere a una biomolécula, por ejemplo, un gen o una proteína, que (1) se ha eliminado de su entorno natural, (2) no se asocia con la totalidad o una porción de un polinucleótido en el que el gen se encuentra en la naturaleza, (3) está unido operativamente a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza, o (4) no se encuentra en la naturaleza. El término "recombinante" puede usarse en referencia a aislados de ADN clonados, análogos de polinucleótidos sintetizados químicamente o análogos de polinucleótidos que son sintetizados biológicamente por sistemas heterólogos, así como también proteínas y/o ARNm codificados por dichos ácidos nucleicos.
Modificación de vías reductoras en E. coli.
La invención altera dos vías reductoras en E. coli para producir proteína citoplasmática plegada correctamente con enlaces disulfuro: la vía de la tiorredoxina y la vía de la glutarredoxina/glutatión.
En la vía de la tiorredoxina, la tiorredoxina reductasa (el producto del gen trxB) usa el potencial reductor de NADPH para mantener la tiorredoxina 1 (el producto del gen trxA) en un estado reducido, para que la tiorredoxina 1 a su vez puede reducir las proteínas sustrato tales como la ribonucleótido reductasa. Esta vía puede eliminarse siempre que haya una vía de glutatión o glutarredoxina presente en la célula. Esto se logró en la presente invención a través de la eliminación cromosómica de trxA y trxB.
En la vía del glutatión/glutarredoxina, la glutatión oxidorreductasa (el producto del gen gor) usa el potencial reductor de NADPH para reducir el glutatión (codificado por gshA y gshb). Después, el glutatión puede reducir tres glutarredoxinas (codificadas por grxA, grxB y grxC). Stewart y otros, EMB0 J. vol. 17 núm. 19 págs. 5543-5550 (1998). En la presente invención, esta vía se modificó para que el glutatión se reduzca a través de una peroxirreductasa mutada en lugar de G0R.
La cepa de E. coli descrita en la presente descripción se ha modificado genéticamente de manera que tiene vías reductoras diferentes en comparación con la E. coli de tipo salvaje. En algunas modalidades, la cepa de E. coli contiene un gen ahpC mutado que codifica una proteína AhpC mutada. En algunas modalidades, la proteína AphC mutada gana la actividad de una glutatión reductasa y, por lo tanto, puede restaurar el crecimiento de una cepa de E. coli mutante trxb gor. En modalidades preferidas, la proteína AphC mutada retiene el residuo de cisteína en la posición 165 en comparación con la proteína AphC de tipo salvaje. Estos mutantes pueden canalizar electrones hacia la vía del glutatión/glutarredoxina, en lugar de la vía de la tiorredoxina. En algunas modalidades, la proteína AphC mutada carece de la actividad de peroxirreductasa que posee la proteína AhpC de tipo salvaje. En algunas modalidades, la proteína AphC mutada retiene la actividad de peroxirreductasa que posee la proteína AhpC de tipo salvaje.
En algunas modalidades, la proteína AphC mutada contiene una o más mutaciones puntuales con relación a la AphC de tipo salvaje y la una o más mutaciones puntuales no implican el residuo de cisteína en la posición 165. En algunas modalidades, se seleccionan una o más mutaciones puntuales del grupo que consiste en S159P, P161S, A167T, P166S, C46Y, C46F, R119C y G141S. En algunas modalidades, estas proteínas AhpC mutantes retienen la actividad de peroxirreductasa que posee la AhpC de tipo salvaje. Algunos de estos mutantes se describen en Yamamoto y otros, Mol. Cell. 18 de enero; 29(1): 36-45 (2008).
En algunas modalidades, el gen aphC mutado es la SEQ ID NO: 4 (en adelante el "gen ahpC*"), que codifica la SEQ ID NO: 5 (en adelante, la "proteína AhpC*"). La proteína AhpC* pierde la actividad de peroxirreductasa que posee la proteína AhpC de tipo salvaje, pero gana la actividad de glutatión reductasa. La AhpC* contiene una inserción de una fenilalanina entre los residuos 36 y 37 de la proteína AhpC de tipo salvaje. En algunas modalidades, el gen ahpC se inserta en el sitio de cicatriz dejado por la recombinasa FLP a partir de la eliminación de ese gen. En un ejemplo, el ahpC se inserta en el sitio de la cicatriz en el locus de tnaA (triptofanasa) a partir de la eliminación de ese gen.
La cepa de E. coli además se ha modificado genéticamente de manera que carece de actividad de tiorredoxina reductasa. En una modalidad, E. coli contiene una mutación nula en el gen trxB, lo que hace que las bacterias carezcan de la actividad de la tiorredoxina reductasa.
La cepa de E. coli además se ha modificado genéticamente de manera que carece de la actividad de la tiorredoxina 1. En una modalidad, E. coli contiene una mutación nula en el gen trxA, lo que hace que las bacterias carezcan de la actividad de la tiorredoxina reductasa.
La cepa de E. coli además se ha modificado genéticamente de manera que el gen de la glutatión reductasa (gor), no es funcional. En una modalidad, E. coli contiene una mutación nula en el gen gor, lo que hace que las bacterias carezcan de actividad de glutatión reductasa.
En algunas modalidades, la cepa de E. coli expresa un gen gshA. GshA es responsable de la primera etapa de la biosíntesis de glutatión, y la expresión de una función de la proteína GshA puede garantizar que la célula aún posea una vía de síntesis de glutatión funcional y garantizar la supervivencia celular.
La cepa de E. coli también se ha modificado para expresar una disulfuro isomerasa procariota citosólica recombinante. La disulfuro isomerasa procariota citosólica recombinante puede facilitar el plegamiento de proteínas, lo que es especialmente importante para las LC más difíciles. En algunas modalidades, la chaperona se localiza en el citoplasma mediante la eliminación de la secuencia líder para la secreción fuera de la célula. En una modalidad, la disulfuro isomerasa es DsbC. En una modalidad, la disulfuro isomerasa es proteína de levadura disulfuro isomerasa (yPDI), por ejemplo, como se describe en Groff y otros, MAbs 6(3): 671-678 (2014), lo que demuestra que yPDI y DsbC eran indistintas funcionalmente para el plegamiento de proteínas de inmunoglobulina en sistemas procariotas. Por tanto, se espera que la proteína disulfuro isomerasa humana y otras proteínas estrechamente relacionadas también sean adecuadas para la sustitución funcional de DsbC en esta cepa. En algunas modalidades, la proteína isomerasa es una prolil isomerasa, y la prolil isomerasa adecuada puede incluir, pero no se limita a, ciclofilina, FκΒP, parvulina, desagregasa skP o slyD, groEL/groES, danK, dnaJ o grpE.
La secuencia señal que debe eliminarse para convertir una chaperona secretada en una chaperona citosólica puede identificarse de múltiples formas. Para organismos bien caracterizados como E. coli y humanos, se conocen las secuencias señal para la mayoría de las proteínas. Esto reduce la tarea de eliminar la secuencia de secreción a simplemente eliminar esta secuencia durante la clonación. Para organismos menos estudiados, que incluyen otras bacterias o animales, la secuencia señal aún puede inferirse a través de la homología con sus homólogos bacterianos o humanos. En los casos en los que no existen homólogos con secuencias señal conocidas, existen algoritmos de predicción de secuencias señal que son correctos aproximadamente el 70 % de las veces, Nielsen H, Engelbrecht J, BrunakS, yvon Heijne G. Protein Eng. enero de 1997; 10(1): 1-6.
Proteína de interés
Los métodos proporcionados en la presente descripción pueden usarse para cualquier proteína que tenga al menos un enlace disulfuro en su conformación biológicamente activa o que, en la forma madura, no contenga un enlace disulfuro, pero cuyo precursor contenga al menos un enlace disulfuro.
Los enlaces disulfuro se forman típicamente por la oxidación de grupos sulfhidrilo entre dos cadenas laterales de cisteína que dan como resultado un enlace covalente. Los enlaces disulfuro pueden estabilizar la estructura de la proteína terciaria tras bloquear las unidades de plegamiento en conformaciones estables tras unir residuos de manera covalente. Muchas de las proteínas con enlaces disulfuro se secretan o permanecen ancladas a la membrana plasmática, expuestas al medio ambiente. Estas características de las proteínas con enlaces disulfuro las convierten en excelentes agentes terapéuticos o dianas para la industria farmacéutica.
En las células procariotas, los enlaces disulfuro se forman cuando la proteína DsbA dona su enlace disulfuro a un polipéptido recién sintetizado que comprende un enlace disulfuro en su estructura nativa. La proteína de membrana integral DsbB genera enlaces disulfuro dentro de sí misma, que después se transfieren a DsbA. DsbC es una proteína que cataliza la isomerización de enlaces disulfuro. En la cepa de E. coli de tipo salvaje, DsbC se exporta al periplasma y, por lo tanto, no es adecuado para la producción de proteínas citoplasmáticas, que contienen disulfuro. Como se describe en la presente descripción, en algunas modalidades, la cepa de E. coli modificada expresa una disulfuro isomerasa procariota citosólica, por ejemplo, DsbC. Esta proteína DsbC citosólica se expresa sin su secuencia señal; como resultado, esta proteína DsbC permanece en el citoplasma para promover el ensamblaje de
disulfuro de proteínas de interés. En algunas células eucariotas, la vía principal de disulfuro está compuesta por la flavoproteína EroI asociada a la membrana y la proteína PDI soluble similar a la tiorredoxina. EroI, mediante el uso de un cofactor de flavina para mediar la reoxidación de su par de cisteínas por el oxígeno, genera enlaces disulfuro dentro de sí mismo y después transfiere los enlaces a PDI. A su vez, PDI transfiere los enlaces disulfuro directamente a los polipéptidos recién sintetizados que no han adoptado su estructura nativa.
Los enlaces disulfuro están presentes en numerosas proteínas, que incluye, pero no se limita a, proteínas secretadas, proteínas inmunitarias, proteínas de matriz extracelular, glicoproteínas, proteínas lisosómicas y proteínas de membrana. Pueden encontrarse descripciones detalladas de enlaces disulfuro y proteínas con enlaces disulfuro en, por ejemplo, Fass, D. Annu. Rev. Biophys., 2012, 41:63-79, Sevier, CS y Kaiser, C.A. Antioxidants & Redox Signaling, 2006, 8(5):797-811 y de Marco, A., Microbial Cell Factories, 2009, 8:26. Estas proteínas pueden producirse además mediante el uso del sistema descrito en la presente descripción.
La proteína de interés puede ser proteínas eucariotas, procariotas, proteínas víricas o proteínas vegetales. En algunas modalidades, la proteína de interés es de origen mamífero, que incluye origen murino, bovino, ovino, felino, porcino, canino, caprino, equino y de primate. En algunas modalidades, la proteína de interés es de origen humano. En algunas modalidades, la proteína de interés es un anticuerpo, tales como anticuerpos de cadena sencilla, un fragmento de un anticuerpo, así como también anticuerpos que consisten en múltiples cadenas polipeptídicas. En algunas modalidades, la proteína de interés es una cadena ligera o una cadena pesada de un anticuerpo. En algunas modalidades, la proteína de interés es un scFv. En algunas modalidades, la proteína de interés es un fragmento Fab. Los ejemplos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti-HER2. Una cadena ligera ilustrativa incluye, pero no se limita a, una cadena ligera de un anticuerpo anti-HER2, por ejemplo, una cadena ligera de trastuzumab.
Los ejemplos adicionales de proteínas de interés que pueden producirse incluyen las siguientes proteínas: polipéptidos de mamíferos que incluyen moléculas tales como, por ejemplo, renina, hormona del crecimiento, receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteínas CD tales como CD-3, CD4, CD8 y CD-19; interleucinas; interferones; receptores de células T; proteínas de membrana superficial; factor acelerador de la descomposición; antígeno viral tal como, por ejemplo, una porción de la envoltura del SIDA; proteínas de transporte; receptores específicos del tejido diana; adresinas; proteínas reguladoras; anticuerpos; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos enumerados anteriormente.
Una proteína producida por la invención puede usarse para uno o más de los siguientes propósitos o efectos: inhibir el crecimiento, infección o función de, o eliminar, agentes infecciosos, que incluye, pero no se limita a, bacterias, virus, hongos y otros parásitos; que afectan (suprimen o mejoran) las características corporales, que incluye, pero no se limita a, la altura, el peso, el color del cabello, el color de los ojos, la piel, la relación masa grasa/masa magra u otra pigmentación de los tejidos, o el tamaño o la forma de órganos o partes del cuerpo (como, por ejemplo, aumento o disminución de los senos, cambio en la forma de los huesos); afectar biorritmos o ciclos o ritmos circadianos; afectar la fertilidad de sujetos masculinos o femeninos; afectar el metabolismo, catabolismo, anabolismo, procesamiento, utilización, almacenamiento o eliminación de grasas, lípidos, proteínas, carbohidratos, vitaminas, minerales, cofactores u otros factores o componentes nutricionales de la dieta; afectar las características del comportamiento, que incluyen, pero no se limitan a, el apetito, la libido, el estrés, la cognición (que incluye los trastornos cognitivos), la depresión (que incluye los trastornos depresivos) y los comportamientos violentos; proporcionar efectos analgésicos u otros efectos para reducir el dolor; promover la diferenciación y el crecimiento de células madre embrionarias en linajes distintos de los linajes hematopoyéticos; actividad hormonal o endocrina; en el caso de las enzimas, corregir las deficiencias de la enzima y tratar las enfermedades relacionadas con la deficiencia; tratamiento de trastornos hiperproliferativos (tales como, por ejemplo, psoriasis); actividad de tipo inmunoglobulina (tal como la capacidad de unirse a antígenos o complemento); y la capacidad de actuar como un antígeno en la composición de la vacuna para generar una respuesta inmunitaria contra dicha proteína u otro material o entidad que presente reacción cruzada con dicha proteína.
Los polipéptidos y proteínas producidos por la invención pueden usarse para cualquier propósito conocido por un experto en la técnica. Los usos preferidos incluyen usos médicos, que incluyen usos de diagnóstico, usos profilácticos y terapéuticos. Por ejemplo, las proteínas pueden prepararse para administración tópica o de otro tipo. Otro uso médico preferido es para la preparación de vacunas. En consecuencia, las proteínas producidas por la invención se solubilizan o suspenden en soluciones aceptables farmacológicamente para formar composiciones farmacéuticas para la administración a un sujeto. Los tampones apropiados para fines médicos y los métodos de administración de las composiciones farmacéuticas se exponen más abajo. Un experto en la técnica entenderá que las composiciones médicas pueden administrarse además a sujetos distintos de los humanos, tal como para fines veterinarios.
Métodos Generales
A menos que se definan de cualquier otra manera, todos los términos científicos y técnicos usados en la presente descripción tienen el significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta
invención. Los profesionales se dirigen particularmente a Green, M.R. y Sambrook, J., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012)), y Ausubel, F.M., y otros, Current Protocols in Molecular Biology (Suplemento 99), John Wiley & Sons, Nueva York (2012) para definiciones y términos de la técnica. Los métodos estándar también aparecen en Bindereif, Schón y Westhof (2005) Handbook of RNA Biochemistry, Wiley-VCH, Weinheim, Alemania que describe métodos detallados para la manipulación y el análisis del ARN. Los ejemplos de técnicas moleculares apropiadas para generar ácidos nucleicos recombinantes e instrucciones suficientes para dirigirse a expertos a través de muchos ejercicios de clonaje se encuentran en Green, M.R. y Sambrook, J., (Id.); Ausubel, F.M., y otros, (Id.); Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology (Volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, California 1987); y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, San Diego, California 1990).
Los métodos para la purificación de proteínas, cromatografía, electroforesis, centrifugación y cristalización se describen en Coligan y otros (2000) Current Protocols in Protein Science, vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York. Los métodos para la síntesis libre de células se describen en Spirin & Swartz (2008) Cell-free Protein Synthesis, Wiley-VCH, Weinheim, Alemania. Los métodos para la incorporación de aminoácidos no nativos en proteínas mediante síntesis libre de células se describen en Shimizu y otros (2006) FEBS Journal, 273, 4133-4140.
Los métodos de amplificación por PCR se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en Innis y otros, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press Inc. San Diego, California, 1990. Una reacción de amplificación típicamente incluye el ADN que se va a amplificar, una polimerasa de ADN termoestable, dos cebadores de oligonucleótidos, trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTP), tampón de reacción y magnesio. Típicamente, un número deseable de ciclos térmicos está entre 1 y 25. Los métodos para el diseño de cebadores y la optimización de las condiciones de PCR se conocen bien en la técnica y pueden encontrarse en textos estándar de biología molecular tal como Ausubel y otros, Short Protocols in Molecular Biology, 5a edición, Wiley, 2002, e Innis y otros, PCR Protocols, Academic Press, 1990. Los programas de computadora son útiles en el diseño de cebadores con la especificidad requerida y propiedades de amplificación óptimas (por ejemplo, 0ligo Versión 5,0 (National Biosciences)). En algunas modalidades, los cebadores de PCR pueden contener adicionalmente sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción, para facilitar la inserción del fragmento de ADN amplificado en sitios de enzimas de restricción específicos en un vector. Si se van a añadir sitios de restricción al extremo 5' de los cebadores de PCR, es preferible incluir unas pocas (por ejemplo, dos o tres) bases 5' adicionales para permitir una escisión más eficaz por parte de la enzima. En algunas modalidades, los cebadores de PCR también pueden contener un sitio promotor de la ARN polimerasa, tal como T7 o SP6, para permitir la transcripción posterior in vitro. Los métodos para la transcripción in vitro se conocen bien por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Van Gelder y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1663-1667, 1990; Eberwine y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
89:3010-3014, 1992).
Cuando se hace referencia a las proteínas descritas en la presente descripción por su nombre, se entiende que esto incluye proteínas con funciones similares y secuencias de aminoácidos similares. Por lo tanto, las proteínas descritas en la presente descripción incluyen la proteína prototipo de tipo salvaje, así como también homólogos, variaciones polimórficas y muteínas creadas de forma recombinante. Por ejemplo, el nombre "proteína DsbC" incluye la proteína prototipo de tipo salvaje de E.coli (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), así como también homólogos de otras especies, variaciones polimórficas y muteínas creadas de forma recombinante. Se define que las proteínas tales como DsbC tienen funciones similares si tienen sustancialmente la misma actividad biológica o capacidad funcional que la proteína de tipo salvaje (por ejemplo, al menos el 80 % de cualquiera). Se define que las proteínas como DsbC y AhpC* tienen secuencias de aminoácidos similares si tienen al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la proteína prototipo. La identidad de secuencia de una proteína se determina mediante el uso del programa BLASTP con la longitud de palabra predeterminada de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BL0SUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992).
Una prueba fácilmente convencional para determinar si un homólogo de proteína, una variante polimórfica o una muteína recombinante incluye una proteína que tiene la función descrita en la presente descripción es mediante la unión específica a anticuerpos policlonales generados contra la proteína prototipo. Típicamente, una reacción específica o selectiva será al menos el doble de la señal o el ruido de fondo y, más típicamente, más de 10 a 100 veces el fondo. Por ejemplo, una proteína DsbC incluye proteínas que se unen a anticuerpos policlonales generados contra la proteína prototipo de la SEQ ID NO: 1.
Métodos de introducción de mutaciones en E. coli
En algunas modalidades, las modificaciones genéticas, por ejemplo, las inactivaciones de trxA y trxb, puede realizarse con una recombinación específica del sitio. La recombinación específica del sitio usa enzimas que poseen actividad de endonucleasa y actividad de ligasa y las enzimas reconocen una determinada parte de las secuencias de ADN y la reemplazan con cualquier otra secuencia de ADN correspondiente, véase Yang W. y Mizuuchi K., Structure, 1997, vol. 5, 1401-1406(9). Los sistemas de recombinación específicos de sitio se conocen bien en la técnica, por ejemplo, el sistema Int/att del bacteriófago A, el sistema Cre/LoxP del bacteriófago PI y el sistema FLP-FRT de levadura son sistemas de recombinación específicos de sitio bien desarrollados.
Los ejemplos no limitantes de métodos para introducir recombinación específica de sitio en diversas proteínas descritas en la presente descripción incluyen los sistemas de recombinación Cre/Lox y Flp/Frt. Ambos sistemas se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, se ha informado la integración específica del sitio en los cromosomas bacterianos (véase, por ejemplo, Saueryotros, Proc. Natl. Acad. Sci. 85. 5166-5170 (1988); Fukushige y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., 89. 7905-7907 (1992); Baubonis y otros, Nucleic Acids Research 21, 2025-2029 (1993); Hasan y otros, Gene, 150. 51-56 (1994); Golic y otros, Cell. 5_9, 499-509 (1989); Sauer, Mol. Cell. Biolo. 1_, 2087-2096 (1987); Sauer y otros, Methods: Companion to Methods in Enzymol. 4., 143-149 (1992); Sauer y otros, The New Biologist. 2., 441-449 (1990); Sauer y otros, Nucleic Acids Res. 17. 147-161 (1989); Qin y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. 91. 1706-1710 (1994); 0rbán y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 6861-6865 (1992)). Además, se han modificado genéticamente eliminaciones específicas de secuencias cromosómicas y reordenamientos, y actualmente es posible la escisión de ADN extraño como un plásmido a partir de vectores A (véase, por ejemplo, Barinaga, Science. 265, 27-28 (1994); Sauer, Methods in Enzymol. 225. 890-900 (1993); Sauer y otros, Gene, 70. 331-341 (1988); Brunelli y otros, Yeast, 1309-1318 (1993); Invitrogen (San Diego, Ca ) Catálogo 1995, 35; Clontech (Palo Alto, cA) Catálogo 1995/1996, 187-188). Se han generado esquemas de clonación para que la recombinación reconstituya o inactive una unidad de transcripción funcional mediante la eliminación o inversión de secuencias entre sitios de recombinación (véase, por ejemplo, 0dell y otros, Plant Phvsiol. 106. 447-458 (1994); Gu y otros, Cell. 73. 1155 1164 (1993); Lakso y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. 89. 6232-6236 (1992); Fiering y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. 90.
8469-8473 (1973)); 0'Gorman y otros, Science. 251, 1351-55 (1991); Jung y otros, Science, 259, 984-987 (1993)). Los genes que codifican las recombinasas Cre o Flp pueden proporcionarse en trans bajo el control de promotores constitutivos, inducibles o regulados por el desarrollo, o se ha introducido una recombinasa purificada (véase, por ejemplo, Baubonis y otros, supra; Dang y otros, Develop. Genet. 13, 367-375 (1992); Chou y otros, Genetics. 131.
643-653 (1992); Morris y otros, Nucleic Acids Res. 19. 5895-5900 (1991)).
En algunas modalidades, las manipulaciones genómicas descritas en la presente descripción se realizan con un protocolo de recombinación específico del sitio modificado de Kirill A. Datsenko y Barry L. Wanner Proc Natl Acad Sci USA. 6 de junio de 2000; 97(12): 6640-6645. En una modalidad, la inactivación de un gen, por ejemplo, trxA, puede realizarse de la siguiente manera. Se generó un amplicón de PCR que comprende un gen de resistencia a los antibióticos flanqueado por dos sitios FRT y extensiones de homología (H1 y H2), que son homólogas a los dos extremos del gen a inactivar. Después de transformar las células con este producto de PCR, el gen que se va a inactivar se reemplaza por el gen de resistencia a los antibióticos a través de la recombinación mediada por Red en estas regiones de homología flanqueantes. Después de la selección, el gen de resistencia puede eliminarse mediante el uso de un plásmido auxiliar que expresa la recombinasa FLP, que actúa en los sitios FRT (diana de reconocimiento de FLP) repetidos directamente que flanquean el gen de resistencia. El plásmido auxiliar Red y FLP pueden curarse simplemente mediante crecimiento a 37 °C porque son replicones sensibles a la temperatura. La activación de un gen, como dsbC, puede realizarse mediante técnicas de clonación molecular estándar que se conocen bien por los expertos en la técnica.
En algunas modalidades, la inactivación de un gen] se realiza mediante el uso del sistema CRISPR/Cas. El sistema CRISPR/Cas usa una proteína Cas y al menos uno o dos ácidos ribonucleicos que son capaces de dirigir la proteína Cas a una secuencia en un gen diana, por ejemplo, gor, para eliminar el gen. Los métodos de uso del sistema CRISPR/Cas para eliminar la expresión génica se conocen bien y se describen en, por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos núm. 2014/0170753.
Los métodos adicionales para inactivar un gen diana incluyen, pero no se limitan a, tecnología de recombinación homóloga, tecnología de activación de la transcripción de la nucleasa efectora (Nucleasa efectora similar a un activador de transcripción, TALEN), una nucleasa con dedos de zinc (Nucleasa con dedos de zinc, ZFN). Estos métodos también se conocen bien en la técnica.
Vectores y Promotores
Un ácido nucleico que codifica una proteína de interés, una chaperona (por ejemplo, DsbC) u otras proteínas (por ejemplo, AhpC*) puede insertarse en un vector replicable para la expresión en E. coli bajo el control de un promotor procariota adecuado. Muchos vectores están disponibles para este propósito y un experto en la técnica puede determinar fácilmente la selección del vector apropiado. Además del gen de interés, un vector típicamente comprende uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores y un promotor.
Los promotores que pueden usarse pueden ser cualquier secuencia promotora adecuada para una célula huésped eucariota o procariota, que muestre actividad transcripcional, que incluye promotores mutantes, truncados e híbridos, y pueden obtenerse a partir de polinucleótidos que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares, ya sean endógenos (nativos) o heterólogos (extraño) a la célula. El promotor puede ser un promotor constitutivo o inducible. En algunas modalidades, el promotor es un promotor constitutivo. Los promotores procariotas adecuados útiles para la práctica de esta invención incluyen, pero no se limitan a, los promotores de Pc0, PL59, MTL, ParaBAD, lac, T3, T7, lambda Pr'P1', trp, el promotor Pspc del operón de la proteína ribosómica spc, el promotor Pbla del plásmido
pBR322 del gen de la p-lactamasa, el promotor Pl del fago A, los promotores Parni y Parnii del plásmido pBR322 de control de la replicación, los promotores P1 y P2 del operón de ARN ribosomal rrnB, el promotor de tet, y el promotor pACYC. Los moduladores transcripcionales regulados por tetraciclina y los promotores de CMV se describen en el documento WO 96/01313, las patentes de Estados Unidos núms. 5,168,062 y 5,385,839.
En algunas modalidades, los promotores pueden tener una fortaleza diferente en cuanto a la cantidad de expresión que pueden producir. Los promotores pueden ser un promotor de fortaleza media, un promotor de fortaleza débil y un promotor fuerte. La fortaleza de un promotor puede medirse como la cantidad de transcripción de un producto génico iniciado en ese promotor, con relación a un control adecuado. Para los promotores constitutivos que dirigen la expresión de un producto génico en una construcción de expresión, un control adecuado podría usar la misma construcción de expresión, excepto que la versión de "tipo salvaje" del promotor, o un promotor de un gen "conservador", se usa en lugar del promotor a analizar.
En algunas modalidades, la fortaleza del promotor se determina tras medir la cantidad de transcritos del promotor en comparación con un promotor de control. Por ejemplo, las células huésped que contienen una construcción de expresión con el promotor que se va a analizar ("células huésped de prueba") y las células huésped de control que contienen una construcción de expresión de control, pueden cultivarse en réplicas. El ARN total de las células huésped y los controles puede extraerse y medirse por absorbancia a 260 nm. Después, puede sintetizarse ADNc a partir de la misma cantidad de ARN total de las células huésped de prueba y las células huésped de control. Puede realizarse RT-PCR para amplificar el ADNc correspondiente a la transcripción producida a partir del promotor. Un método ilustrativo se describe en De Mey y otros ("Promoter knock-in: a novel rational method forthe fine tuning of genes", BMC Biotechnol 201024 de marzo; 10:26).
En algunas modalidades, los diversos transgenes se expresan en E. coli bajo el control de promotores de diferente fortaleza para garantizar que las proteínas recombinantes, por ejemplo, la proteína AhpC* y la proteína DsbC, se expresen en niveles apropiados. Esto es útil para mantener un citoplasma oxidativo en las bacterias y establecer una vía de reducción alternativa para garantizar la supervivencia, el vigor (velocidad de crecimiento). En una modalidad, el gen ahpC* se controla por un promotor Pc0, un promotor de fortaleza media. Tanto el promotor PL59 (un promotor débil) como un promotor WT gshA (un promotor de fortaleza intermedia) pueden usarse para dirigir la expresión del gen gshA. En algunas modalidades, se usa un promotor fuerte T7 para impulsar la expresión de la proteína de interés para asegurar el máximo rendimiento. En algunas modalidades, la cepa de E coli expresa una polimerasa T7 recombinante bajo el control del promotor paraBAD, lo que permite una regulación y control estrictos de la proteína de interés, por ejemplo, mediante la adición o ausencia de arabinosa. Guzmán y otros, J. Bacteriol. Julio de 1995 177 (14): 4121-4130.
0pcionalmente, los clones de E. coli que portan las modificaciones deseadas como se describe en la presente descripción pueden seleccionarse mediante dilución limitada. 0pcionalmente, estos clones pueden secuenciarse para confirmar que las mutaciones deseadas están presentes en varios genes o transgenes deseados, por ejemplo, dsbc y ahpC*, se insertan en el genoma. En algunos casos, puede realizarse la secuenciación del genoma completo para determinar la ubicación de la inserción o la mutación en los cromosomas.
Células huésped
La cepa de E. coli en esta descripción puede ser cualquier cepa de E. coli conocida por un experto en la técnica. En algunas modalidades, la cepa de E. coli es una cepa A (K-12), B, C o D.
Medición de actividades enzimáticas
En algunas modalidades, una mutación introducida en uno o más de los genes, por ejemplo, trxA, no suprime la expresión de proteínas o la expresión de ARNm, pero da como resultado una muteína que carece de la actividad que posee la proteína de tipo salvaje correspondiente, por ejemplo, actividad de tiorredoxina de TrxA. Los expertos en la técnica entienden que, a veces, la inactivación de un gen no requiere la supresión completa de su actividad, por lo tanto, para los fines de esta descripción, la carencia de actividad significa que la muteína pierde del 85-100 % de la actividad de la proteína de control, por ejemplo, la proteína de tipo salvaje. Las diversas muteínas generadas pueden analizarse para confirmar que carecen de la actividad de la proteína de tipo salvaje. Por ejemplo, cada una de las secuencias codificantes de las muteínas puede expresarse por separado en una cepa huésped, y las muteínas se purifican y analizan en cuanto a sus actividades como se describe más abajo.
Confirmación de la pérdida de actividad de la tiorredoxina reductasa.
En una modalidad, la actividad de la tiorredoxina reductasa puede medirse por su actividad en la reducción del 5,5-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) en presencia de NADPH. La reacción típicamente comienza tras mezclar DTNB con tiorredoxina reductasa (TrxR), tiorredoxina (Trx) y NADPH, y monitorear el aumento de absorbancia a 412 nm con el tiempo. La actividad puede definirse como la velocidad de aumento de la absorbancia. Una modalidad para detectar la actividad de la tiorredoxina reductasa se describe en la patente de Estados Unidos núm. 8,592,468. Confirmación de la pérdida de actividad de la tiorredoxina
Los métodos para determinar la actividad de la tiorredoxina también se conocen bien. En una modalidad, el ensayo es un ensayo de precipitación de insulina, como se describió por Sung-Jong Jeon y otros, European Journal of Biochemistry, vol. 269, núm. 22. Se conoce que las tiorredoxinas poseen actividad como disulfuro reductasas de insulina; y puede medirse la reducción de los enlaces disulfuro de la insulina por el aumento de la turbidez debido a la precipitación de la cadena B de insulina libre. En un ejemplo ilustrativo, una mezcla de ensayo estándar contiene fosfato de potasio 0,1 M (pH 7,0), EDTA 1 mM e insulina bovina 0,13 mM en ausencia o en presencia de la proteína recombinante, y la reacción se inició tras la adición de ditiotreitol 1 mM. Se monitoreó un aumento de la absorbancia a 650 nm a 30 °C.
Confirmación de la pérdida de la actividad de la glutatión reductasa
También puede monitorearse la actividad de glutatión reductasa de AhpC* o la pérdida de la actividad de glutatión reductasa de la muteína G0R. En algunas modalidades, la actividad de glutatión reductasa se mide por su actividad en la reducción de cisteína. Por ejemplo, la cisteína se incubó con una solución de reducción que contiene la proteína candidata, por ejemplo, AhpC* o la muteína G0R, en presencia de cofactores. Preferentemente, el cofactor es una coenzima. Preferentemente, el cofactor es nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) o nicotinamida adenina dinucleótido (NADH). La reacción reduce la cistina a cisteína. La reacción esquemática es la siguiente:
La actividad puede medirse tras medirla producción de cisteína. En un ejemplo particular, la actividad de la glutatión reductasa en términos de reducción de cisteína se describe en el documento WO2018114576.
Confirmación de la pérdida de actividad de la peroxirreductasa de AhpC
La carencia de actividad de peroxirreductasa de AhpC* puede confirmarse tras incubar la proteína con hidroperóxidos orgánicos o peróxido de hidrógeno en presencia de NADH. Una peroxirreductasa funcional convertiría estos sustratos en agua por un mecanismo dependiente de NADH; la carencia de evidencia de tal conversión indica una carencia de actividad de peroxirreductasa.
Confirmación de que el citosol de la cepa de E. coli se encuentra en un estado oxidante
La cepa de E. coli descrita en la presente descripción contiene un citoplasma oxidativo. Esto puede confirmarse mediante la actividad biológica de una proteína que tiene un enlace disulfuro, por ejemplo, una LC que es difícil de expresar en una cepa de E. coli de tipo salvaje. En algunas modalidades, la confirmación de que E. coli tiene citoplasma oxidativo puede realizarse tras transformar las bacterias con un gen que codifica un polipéptido (un polipéptido de "prueba") que normalmente contiene al menos un enlace disulfuro. Los polipéptidos o proteínas de prueba preferidos son aquellos que normalmente se secretan por las células o que son proteínas de membrana. En algunos casos, estos polipéptidos se modifican por la eliminación o mutación de la secuencia señal, de manera que las proteínas no se exportan fuera del citoplasma de la célula.
Como un ejemplo ilustrativo, una secuencia codificante para la proteína LC, por ejemplo, una cadena ligera de anticuerpo anti-MUC1 (SEQ ID NO: 15), descrita anteriormente, puede modificarse genéticamente en un casete de expresión bajo un promotor adecuado y transformarse en la cepa de E. coli modificada. Se mide la fracción de proteína soluble que contiene la LC. Una cepa adecuada de E. coli podrá expresar en forma soluble al menos 1 mg/l00 ml de LC. Se conocen bien los métodos para preparar un lisado bacteriano y medir la cantidad de expresión de proteína (por ejemplo, la expresión de LC) en el lisado. En algunas modalidades, las células de E.coli pueden tratarse con un agente de lisis para producir un lisado. Las proteínas citoplasmáticas pueden liberarse tras tratar el lisado con enzimas, tales como benzonasa y lisozima de clara de huevo. La fracción de proteína insoluble puede separarse de la fracción soluble, por ejemplo, por centrifugación. La fracción de proteína soluble (que contiene la LC) puede recogerse y analizarse mediante SDS-PAGE. Después, la cantidad de proteína LC en la fracción de proteína soluble puede cuantificarse, por ejemplo, mediante densitometría. Un ejemplo específico de análisis de una expresión de LC se describe en el Ejemplo 2, que puede usarse para evaluar si el citosol está en un estado oxidante.
Expresión de confirmación
Pueden usarse varios métodos para determinar el nivel de expresión de proteínas de los diversos genes modificados en E. coli y/o confirmar si un gen se ha inactivado o insertado. Por ejemplo, la expresión de un gen puede determinarse mediante transferencia Northern convencional para cuantificar la transcripción de ARNm. Pueden emplearse varios marcadores, más comúnmente radioisótopos. Sin embargo, pueden emplearse además otras técnicas, como el uso de nucleótidos modificados con biotina para la introducción en un polinucleótido. Después, la
biotina sirve como sitio de unión a avidina o anticuerpos, que pueden marcarse con una amplia variedad de marcadores, tales como radionúclidos, agentes fluorescentes, enzimas o similares.
En algunas modalidades, la proteína expresada puede purificarse y cuantificarse mediante el uso de electroforesis en gel (por ejemplo, PAGE), análisis Western o electroforesis capilar (por ejemplo, Caliper LabChip). La síntesis de proteínas en las reacciones de traducción libres de células puede monitorearse mediante la incorporación de aminoácidos radiomarcados, típicamente, metionina marcada con S 35 o leucina marcada con C 14 Las proteínas marcadas radiactivamente pueden visualizarse en tamaño molecular y cuantificarse mediante autorradiografía después de la electroforesis o aislarse mediante inmunoprecipitación. La incorporación de etiquetas His recombinantes proporciona otro medio de purificación por cromatografía en columna de afinidad Ni2+. La producción de proteínas a partir de sistemas de expresión puede medirse como rendimiento de proteína soluble o mediante el uso de un ensayo de actividad enzimática o de unión.
En algunas modalidades, si la proteína a cuantificar posee actividad biológica definida, por ejemplo, actividad enzimática (como fosfatasa alcalina) o actividad de inhibición del crecimiento, la expresión de la proteína de interés puede confirmarse tras evaluar su actividad mediante incubación con sustratos adecuados.
Kits de la invención
Esta descripción proporciona además kits que comprenden una célula huésped de la invención y, opcionalmente, un medio de cultivo, un plásmido que codifica una proteína de interés, una sonda, un anticuerpo y/o instrucciones de uso. En algunas modalidades, el kit puede comprender además uno o más componentes necesarios para producir una proteína que contiene disulfuro biológicamente activa o adecuadamente plegada.
En algunas modalidades, el kit puede comprender uno o más reactivos necesarios para preparar una célula huésped de la invención. Dicho kit puede comprender uno o más reactivos necesarios para reducir la expresión de las reductasas o agentes necesarios para introducir mutaciones en una o más reductasas de una célula huésped. Un kit puede comprender los agentes necesarios para mejorar el crecimiento de las células huésped, por ejemplo, agentes reductores o un gen contenido opcionalmente en un plásmido, que codifica una proteína que mejora el crecimiento. Ejemplo 1. Métodos generales
Todas las manipulaciones genómicas, activaciones e inactivaciones, se realizaron con un protocolo de recombinación específico del sitio modificado de Kirill A. Datsenko y Barry L. Wanner Proc Natl Acad Sci USA. 6 de junio de 2000; 97(12): 6640-6645. Estos métodos permiten que ocurra el intercambio en un sitio específico, como en la integración de los genes de interés que se van a activar y la escisión de los genes que se van a inactivar a partir de este. La recombinación específica del sitio implica secuencias repetidas invertidas específicas, por ejemplo, los sistemas Cre-LoxP. Para las inserciones, el casete de integración estaba compuesto por el gen, por ejemplo, DsbC (NP 417369), para ser insertado adyacente a un marcador seleccionable que está flanqueado por sitios loxP. Después de que el casete completo se activó en el cromosoma, el gen marcador seleccionable se eliminó subsecuentemente mediante una exposición transitoria a la recombinasa Cre que se efectuó mediante electroporación por un plásmido que codifica la recombinasa Cre, lo que deja el gen de interés integrado en el genoma. Para las inactivaciones, el casete de eliminación estaba compuesto por un marcador seleccionable que está flanqueado por sitios loxP. Después de que el casete se activó en el cromosoma, el gen marcador seleccionable se eliminó subsecuentemente mediante una exposición transitoria a la recombinasa Cre que se efectuó mediante electroporación por un plásmido que codifica la recombinasa Cre.
Ejemplo 2. Producción de la cepa Snuggle
El fondo para todas las cepas con citoplasma oxidativo es S97. Esta cepa tiene todas las mutaciones presentes en la cepa Kg K10 (Knapp KG, Goerke Ar y Swartz J, Biotechnol Bioeng. 1 de julio de 2007;97(4):901-8) con RF1 sensible a ompT desarrollado para facilitar la incorporación de NNAA en sistemas de síntesis de proteínas libres de células, (Yin y otros, Sci Rep. 8 de junio de 2017;7(1):3026.). Además, esta cepa tiene una copia cromosómica de la polimerasa de ARN T7 que se ha integrado cromosómicamente bajo el control del promotor ParaBAD para una expresión estrictamente controlada de proteínas del promotor fuerte T7. La viabilidad de todas las cepas producidas como se describe más abajo se verificó mediante el uso de un ensayo en placa esencialmente como se describe en Ritz y otros, Science, 2001, con las siguientes modificaciones. Las células se sembraron directamente en placas con medios enriquecidos después de las modificaciones cromosómicas.
Se introdujeron cinco mutaciones adicionales en la cepa S97. Estas mutaciones fueron responsables de la producción de una vía reductora alternativa para moléculas pequeñas que se requiere para la viabilidad en ausencia de tiorredoxina reductasa o glutatión reductasa. Primero, una variante de ahpC se introdujo tras activar una variante mutante del gen ahpC, ahpC* en la cicatriz de la recombinasa Frt dejada en el locus tnaA de la eliminación de ese gen. Este gen se analizó bajo el control de un promotor débil PL57 o un promotor Pc0 de fortaleza media. Como se muestra en la Tabla 2, en comparación con el gen ahpC de tipo salvaje, que codifica una proteína de tipo salvaje que contiene dos fenilalaninas en los residuos 36 y 37, el ahpC* codifica una muteína que comprende tres
fenilalaninas en esta ubicación. La muteína ahpC* pierde la actividad de la peroxirreductasa (como muestra la proteína ahpC de tipo salvaje), pero gana la actividad de la glutatión reductasa. ahpCA, tiene solo una fenilalanina en esta ubicación y no codifica una peroxirreductasa funcional. Se ha informado que el mutante ahpCA restaura el crecimiento de las cepas B mutantes de E. coli que carecen de trxB y gor, ("cepa B").
En segundo lugar, un gen gshA, que se eliminó previamente de una cepa precursora de E. coli, se activó en el trxB de la cepa mutante generada anteriormente bajo el promotor débil PL59 o un promotor gshA WT de fortaleza intermedia. Se obtuvieron combinaciones viables con cualquiera de los promotores. Esto tuvo el efecto simultáneo de completar la nueva vía de reducción del glutatión AhpC* y eliminar la vía mediada por tiorredoxina. Anticipamos que los niveles de expresión de estas proteínas serían importantes para establecer una vía de reducción alternativa viable.
Se lograron combinaciones viables con activaciones de gshA con el promotor PL59 o WT gshA. Sin embargo, sólo las células que albergan ahpC* con el promotor Pc0 (como se describe en www.ncbi.nlm.nih.gov/μmc/articles/PMCl 134079) fueron viables, lo que indica que los niveles mayores de esta proteína son cruciales, mientras que un intervalo de concentración más amplio de GshA es suficiente para el crecimiento. Esta cepa producida anteriormente contenía tres mutaciones diferentes, ahpC* y activaciones de gshA e inactivaciones de trxB, lo que es suficiente para producir un citoplasma oxidativo capaz de formar disulfuro.
En tercer lugar, un gen DsbC sin líder se activó en el cromosoma con un promotor de MTL fuerte. La proteína DsbC sin líder carece de un péptido señal de secreción y funciona como una disulfuro isomerasa en el citoplasma, lo que promueve el ensamblaje disulfuro nativo de las proteínas citoplasmáticas. Por tanto, la cepa así producida, con estas tres mutaciones, es decir, inactivación de trxB, activación de DsbC y una mutación ahpC*, denominada "Shuffle", fue capaz de ensamblarse por plegamiento de LC.
Las mutaciones requeridas para producir E. coli Shuffle, aunque en otros informes se informó que produjeron títulos altos de proteínas de mamíferos unidas por disulfuro, aquí no condujeron a un nivel alto de producción de LC. Por lo tanto, se introdujo una cuarta mutación para resolver el problema, tras inactivar la tiorredoxina 1 (TrxA). Esta mutación dio como resultado la cepa de LC deseada capaz de expresar todas las LC a niveles altos. Las cepas que carecen de cualquiera de estas modificaciones no pudieron producir la mayor cantidad de LC. Esta nueva cepa ("419" como se muestra en la Tabla 2), que tiene las cinco mutaciones, denominada "Snuggle", produjo rendimientos mayores que las cepas "Shuffle" anteriores para la producción de proteínas unidas por disulfuro. Este resultado es particularmente sorprendente dado que la reductasa primaria para TrxA, TrxB, ya se eliminó, por lo que TrxA no debería haber sido funcional como reductasa citoplasmática.
La formación y reducción de enlaces disulfuro es un proceso dinámico influenciado tanto por proteínas prooxidativas como por moléculas pequeñas como DsbA y 02 y proteínas pro-reductoras y moléculas pequeñas tales como cisteína y tiorredoxina. Debido a esto, es difícil decir cuánta actividad de una proteína dada se requiere para producir un fenotipo dado. Dicho esto, se observó un potencial de producción de LC drásticamente más bajo para las LC que son difíciles de producir cuando TrxB, TrxA estaban presentes o cuando DsbC no estaba presente. Dichas diferencias sorprendentes indican que incluso una pequeña actividad de trxA o trxB probablemente sería suficiente para alterar el entorno redox del citosol y el plegamiento de LC hasta cierto punto. Se espera que para trxA o trxB, una expresión de proteína o un nivel de actividad > 25 % de los niveles endógenos provoque efectos nocivos. Para lDsbC, la concentración citoplasmática requerida para el plegamiento de LC es menos clara porque Snuggle y Shuffle usan diferentes promotores para la producción de DsbC citosólica. Debido a que esto funciona como chaperona y disulfuro isomerasa, es probable que todavía requiera una sobreexpresión de esta proteína, a niveles de al menos el 25 % de los presentes en Snuggle.
Se confirmó que siete cepas de E. coli, generadas como se describe en el Ejemplo 2, tenían los fenotipos enumerados en la Tabla 1, a más abajo:
Tabla 1. Fenoti os de las ce as
Cada cepa se transformó con el plásmido pJ411 de Atum (Newwark, California) que contenía un gen LC (Mud G09k LC, LC 7219 o Trastuzumab LC), con optimización de codón para la expresión de E. coli. Las células se cultivaron durante la noche a 37 °C en Caldo Terrific (TB) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) complementado con 40 mg/l de kanamicina. Al día siguiente, las células se diluyeron 1:100 en TB fresco con kanamicina y se cultivaron a 37 °C hasta una D0 de 2,0. En ese momento, las células se indujeron mediante la adición de arabinosa al 0,2 % y se movieron a 25 °C. Después de una inducción durante la noche, las células se recolectaron por la mañana. Las
células se resuspendieron en reactivo de lisis bacteriana BPER (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) con 1 |jl/ml de benzonasa nucleasa y 10 mg/ml de lisozima de clara de huevo de gallina para liberar proteína citoplasmática soluble. Se transfirieron 100 j l del lisado celular total a un tubo nuevo y se sedimentaron los restos celulares y la proteína insoluble mediante centrifugación a 20 000 x G durante 10 minutos. El sobrenadante que contenía las proteínas solubles se transfirió a un tubo nuevo. Después, el sedimento se resuspendió y se disolvió en 100 j l de tampón de muestra 1x LDS. Para el análisis de LC en cada fracción, se cargaron 10 j l de muestras de proteínas solubles e insolubles en un gel SDS PAGE Nu y se corrieron hasta que el frente del tinte estuvo en la parte inferior del gel. Los geles se tiñeron con colorante SimplyBlue Safe, se destiñeron con agua y después, se tomaron imágenes con un Biorad GelDoc EZ. La intensidad del gel y la cuantificación relativa de proteínas se determinaron mediante el uso de densitometría.
La Figura 1A muestra el perfil de expresión de una LC de comportamiento deficiente, la cadena ligera del anticuerpo anti-Muc1 Muc1 G09k lC. Muc1 G09k LC también se conoce como HT186-D11 y se describe en Thie y otros, PloS 0ne, 14 de enero de 2011; 6 (1): e15921. Para estas muestras, la cepa Shuffle disponible comercialmente proporciona una producción razonable de proteína soluble. No es sorprendente que todos los mutantes con citoplasma reductor, o aquellos que carecen de DsbC citosólica, no lograron producir LC en un título razonable. Sorprendentemente, el mutante de la cepa Sutro (S417) con un genotipo análogo a Shuffle que incluye DsbC citosólica y citoplasma oxidativo no logró expresar esta LC a títulos razonables. Sin embargo, S419, que contenía la mutación adicional de TrxA, permitió la producción de LC a niveles mayores que los de la cepa Shuffle, lo que indica que el conjunto de cambios realizados en esta cepa la convirtió en un huésped superior para la producción de LC.
La Figura 1B muestra otro ejemplo de una LC difícil, LC 7219 realizada en células Shuffle, una cepa precursora de Sutro con citoplasma reductor y Snuggle. LC 7219 es una IgG anti CD74, como se describió en el documento WO/2016/014434. Para estas muestras, solo se analizó la proteína soluble con el método anterior. Nuevamente, vemos muy poca expresión de LC en la cepa con citoplasma reductor, mientras que la cepa Snuggle produce títulos visiblemente mayores que la cepa Shuffle.
La Figura 1C muestra un ejemplo de una LC que es relativamente más fácil de producir en E. coli, la LC de trastuzumab. Para esta LC hubo una expresión soluble excelente independientemente del huésped. En este caso, la LC no necesita enlaces disulfuro para el plegamiento o la estabilidad. Hubo muy poca LC que termina en la fracción insoluble.
Ejemplo 3. Ahpc mutante que restauran el crecimiento en cepas 8gor/trxb
La proteína AhpC de tipo salvaje es una peroxirreductasa que contiene dos fenilalaninas en los residuos 36 y 37. Véase la última fila en la Tabla 2. La mutación que restablece el crecimiento en las cepas basadas en K12, AhpC*, se muestra en la tercera fila de la Tabla 2. La cepa mutante AhpC* contenía un residuo de fenilalanina adicional insertado entre las dos fenilalaninas en los residuos 36 y 37. El mutante ahpC que se informa que restaura el crecimiento de las cepas B, AhpC A, se muestra en el medio. La cepa mutante ahpC tiene solo una fenilalanina como se muestra en la Tabla 2; por conveniencia, el residuo 37 se muestra eliminado pero, en principio, la eliminación podría asignarse al residuo 36 o al 37. Durante la producción de la cepa Snuggle, cualquiera de los mutantes se introdujo en el cromosoma de células derivadas de E. coli K12 con eliminaciones en gor y trxB. Solo el mutante AhpC* restauró la viabilidad en estas células, lo que se cree que se debe a que esta cepa tiene un linaje K12.
Tabla 2
El mutante AhpC se analizó para determinar si tenía actividad de glutatión reductasa basado en su capacidad para convertir el glutatión oxidado (GSSG) en glutatión reducido (GSH). El método se describió en Yamamoto y otros, Mol. Cell. 18 de enero; 29(1): 36-45 (2008). Brevemente, la muteína AhpC purificada a 5 jM se incubó con una mezcla de reacción que contenía GSSG 1 mM, 0,5 jM de la subunidad F de la proteína alquil hidroperóxido reductasa (AhpF), 10 jM de la proteína glutarredoxina 1 (grxA) y NADH 0,8 mM. Los resultados muestran que el mutante AhpC* generó glutatión libre, GSH, lo que indica que el mutante posee actividad de glutatión reductasa. La proteína WT y el mutante ahpC delta que carecen de esta actividad no pudieron producir GSH a partir de GSSG.
Ejemplo 4. Expresión de le recombinante en cepas de e. coli Shuffle y Snuggle
Los plásmidos que codifican cuatro LC distintas (LC-1, LC-2, LC-3 y LC-4) se transformaron en la cepa E. coli Shuffle (C3026J, New England Biosciences) y la cepa E. coli Snuggle producidas como se describió en el Ejemplo 2. Estas cuatro LC comparten una identidad de secuencia del 78-92 % entre sí. Las células se cultivaron en t B a 37 °C hasta una D0 de 1,5 en un matraz de agitación y se indujeron con arabinosa al 0,1 % (Snuggle) o arabinosa al 1 % e IPTG 1 mM (Shuffle). La expresión de proteínas se llevó a cabo durante 16 horas a 25 °C. Las células se recolectaron mediante centrifugación de 1 ml del medio de fermentación a 21 000*g durante 10 min en una centrífuga de mesa. El sedimento resultante se resuspendió y se lisó en el reactivo de extracción de proteínas bacterianas B-PER (78248, Thermo Fisher) que contenía 50 mg/l de lisozima (L6876, Sigma Aldrich) y 25 U/ml de benzonasa (E1014, Sigma Aldrich) en una relación de 10 ml por g de peso celular húmedo. El material insoluble se eliminó por centrifugación a 21 000*g durante 10 min en una centrífuga de mesa. Se corrió un gel de SDS PAGE reductor con 4 uL del lisado resultante por pocillo y se determinó la expresión relativa de las bandas de LC teñidas con Coomassie mediante densitometría de gel.
Como se muestra en la Figura 2, la cepa Snuggle demostró una mejora del 20-110 % en la producción de LC en términos de rendimiento en comparación con la cepa Shuffle.
SECUENCIAS ILUSTRATIVAS
La SEQ ID NO: 1 Secuencia de ácido nucleico de dsbC
La SEQ ID NO: 2. Secuencia de ácido nucleico de ahpC
La SEQ ID NO: 3 Secuencia de proteína de ahpC
La SEQ ID NO: 4 Secuencia de ácido nucleico de ahpC* (con optimización de codón para la expresión en E. coli)
La SEQ ID NO: 5 Secuencia de proteína de AhpC*
La SEQ ID NO: 6 Secuencia de proteína de DsbC (lo subrayado es la secuencia señal)
La SEQ ID NO: 7 Secuencia de ácido nucleico de trxA
La SEQ ID NO: 8 Secuencia de proteína de trxA
La SEQ ID NO: 9 Secuencia de ácido nucleico de trxB
La SEQ ID NO: 10 Secuencia de proteína de trxB
La SEQ ID NO: 11 Secuencia de ácido nucleico de Gor
La SEQ ID NO: 12 Secuencia de proteína de Gor
La SEQ ID NO: 13 Secuencia de ácido nucleico de gshA
La SEQ ID NO: 14 Secuencia de proteína de gshA
La SEQ ID NO: 15 Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo anti-MUC (HT186-D11-LC)
Claims (15)
1. Una cepa de E. coli, en donde:
i) la cepa carece de la actividad de una tiorredoxina reductasa debido a la modificación genética de trxB; ii) la cepa carece de la actividad de una tiorredoxina 1 debido a la modificación genética de trxA;
iii) la cepa carece de la actividad de una glutatión reductasa debido a la modificación genética de gor; iv) la cepa expresa una proteína AhpC mutada, en donde la proteína AhpC mutada tiene actividad de glutatión reductasa pero carece de actividad de peroxirreductasa; y,
v) la cepa expresa una disulfuro isomerasa procariota citosólica.
2. La cepa de E. coli de la reivindicación 1, en donde
a) la cepa comprende además un gen que codifica una proteína de interés,
b) la disulfuro isomerasa citosólica es DsbC,
c) la E. coli expresa además una prolil isomerasa recombinante y/o una desagregasa,
d) la expresión de la proteína AhpC mutada se controla por un promotor Pc0,
e) la expresión de la disulfuro isomerasa procariota citosólica se controla por un promotor MTL, o f) la cepa de E. coli es una cepa K-12.
3. La cepa de E.coli de la reivindicación 2 a), en donde la proteína de interés se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo, un fragmento de este o una cadena ligera de anticuerpo de una IgG.
4. La cepa de E. coli de la reivindicación 2 a), en donde el gen que codifica la proteína de interés está ligado operativamente a un promotor inducible,
5. La cepa de E. coli de la reivindicación 4, en donde el promotor inducible es un promotor T7.
6. La cepa de E. coli de la reivindicación 2 c), en donde
la prolil isomerasa se selecciona del grupo que consiste en ciclofilina, FκΒP, parvulina, SlyD, Tig, yCpr6; y la desagregasa se selecciona del grupo que consiste en Skp, GroEL, GroES, DnaK, DnaJ y GrpE.
7. Un método para expresar proteínas recombinantes solubles de interés en cepas bacterianas de E. coli que comprenden la etapa de:
cultivar una cepa bacteriana de E. coli que comprende un citosol oxidante y un casete de expresión para expresar una proteína de interés en condiciones que permiten la expresión de la proteína de interés como una proteína soluble, en donde la cepa:
i) carece de la actividad de tiorredoxina reductasa debido a la modificación genética de trxB;
ii) carece de la actividad de tiorredoxina 1 debido a la modificación genética de trxA;
iii) carece de la actividad de una glutatión reductasa debido a la modificación genética de gor;
iv) expresa un gen ahpC que se ha mutado de manera que una enzima expresada a partir del gen ahpC tiene actividad de glutatión reductasa pero carece de actividad de peroxirreductasa; y
v) expresa un gen que codifica una disulfuro isomerasa procariota citosólica.
8. El método de la reivindicación 7, en donde
a) la cepa de E. coli contiene una mutación nula en trxC, trxB, o trxA,
b) la proteína de interés se selecciona del grupo que consiste en: una IgG, una cadena ligera de una IgG o una cadena pesada de una IgG,
c) la disulfuro isomerasa citosólica es DsbC o disulfuro isomerasa de proteína de levadura (yPDI), d) la cepa de E. coli expresa además una prolil isomerasa recombinante y/o una desagregasa recombinante,
e) el gen que codifica la proteína de interés está ligado operativamente a un promotor inducible, preferentemente un promotor T7,
f) la cepa de E. coli expresa una proteína GshA codificada por el gen gshA, o
g) la cepa de E. coli expresa además una polimerasa T7.
9. El método de la reivindicación 8 d), en donde
la prolil isomerasa recombinante se selecciona del grupo que consiste en ciclofilina, FκΒP, parvulina, SlyD, Tig e yCpr6; y
la desagregasa se selecciona del grupo que consiste en Skp, GroEL, GroES, DnaK, DnaJ y GrpE.
10. El método de la reivindicación 8 b), en donde la cadena ligera del anticuerpo es una cadena ligera de un anticuerpo anti-HER2.
11. El método de la reivindicación 8 f), en donde el gen gshA se inserta en el locus de TrxB.
12. El método de la reivindicación 8 g), en donde la polimerasa T7 está bajo el control de un promotor inducible.
13. El método de la reivindicación 11, en donde el promotor inducible es un ParaBAD, lac, lacUV5 phoA, tetA, xylAB, tac o promotor de ramnosa.
14. Un kit que comprende la E. coli de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el kit comprende además un medio de cultivo.
15. El kit de la reivindicación 14, en donde el kit comprende además un plásmido que codifica una proteína de interés.
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