ES2257853T3

ES2257853T3 - Construcciones para la expresion controlada de genes recombinantes en celulas procariotas.

Info

Publication number: ES2257853T3
Application number: ES99913408T
Authority: ES
Inventors: Laurent Chevalet; Alain Robert; Jean-Yves Bonnefoy; Thien Ngoc Nguyen
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 1998-04-14
Filing date: 1999-04-14
Publication date: 2006-08-01
Anticipated expiration: 2019-04-14
Also published as: FR2777292A1; CN1303439A; DE69929590D1; AU3154099A; EP1071798B9; US6844169B1; JP2002511273A; CA2325601A1; EP1071798A1; EP1071798B1; CN1261581C; PT1071798E; DE69929590T2; BR9909643A; ATE316579T1; WO1999053080A1; DK1071798T3; AU768595B2; FR2777292B1

Abstract

Procedimiento de producción de una proteína recombinante de interés cuyo gen se pone bajo el control del promotor Ptrp del operón triptófano, caracterizado porque comprende las etapas siguientes: a) transformar una célula procariota mediante un vector que contiene una secuencia de ácidos nucleicos que, cuando dicha secuencia de ácidos nucleicos se introduce en dicha célula huésped, modifica el gen que codifica la TnaA triptofanasa de la célula huésped, de tal manera que esta modificación provoca la pérdida de la actividad de triptofanasa de dicha célula huésped, siendo el producto de expresión de dicho gen modificado incapaz de degradar el triptófano en indol, y a la integración de dicha secuencia en el ADN de dicha célula huésped; y, previa, posterior o simultáneamente, introducir en dicha célula procariota todo o parte de la secuencia de un promotor seguido en 3¿ de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de naturaleza ribonucleotídica o proteica, y que actúa negativamente sobre el promotor de Ptrp o su producto de transcripción, siendo dicha molécula de naturaleza ribonucleotídica, y que actúa negativamente en el promotor de Ptrp seleccionada entre las secuencias siguientes: siendo dicha molécula de naturaleza proteica, y que actúa negativamente sobre el promotor de Ptrp, elegida de la secuencia que codifica el aporrepresor TrpR del operón triptófano de dicha célula huésped o uno de sus fragmentos biológicamente activos que ha conservado su actividad represora; b) transformar dicha célula procariota mediante un vector que contiene un gen que codifica dicha proteína recombinante de interés; c) cultivar dicha célula transformada en un medio de cultivo que permite la expresión de la proteína recombinante; y d) recuperar la proteína recombinante a partir del medio de cultivo o de dicha célula transformada.

Description

Construcciones para la expresión controlada de genes recombinantes en células procariotas.

La presente invención se refiere a una nueva construcción para la expresión de un gen que codifica una proteína recombinante de interés puesta bajo el control del promotor Ptrp del operón triptófano en una célula huésped procariota, caracterizada porque la construcción comprende una secuencia de ácidos nucleicos capaz de desactivar el gen que codifica una TnaA triptofanasa cuando dicha secuencia de ácidos nucleicos se introduce en dicha célula huésped, y una secuencia de un promotor seguida en dirección 3' de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de naturaleza ribonucleotídica o proteica que actúa negativamente sobre el promotor Ptrp o su resultante de transcripción; a vectores que contienen dicha construcción; y a células huésped transformadas mediante dichos vectores. La invención tiene igualmente por objeto los procedimientos de producción de dichas proteínas recombinantes utilizando estas nuevas construcciones.

De manera general, la presente invención se utiliza para la producción de proteínas o polipéptidos recombinantes mediante métodos denominados de ADN recombinante. Más particularmente, la presente invención se refiere a la producción de proteínas o polipéptidos recombinantes mediante células transformadas de tipo bacteriana, y cuya expre-
sión está dirigida o está bajo el control del promotor/operador Prtp del operón triptófano (Nichols y Yanofsky, 1983).

Escherichia coli (E coli) es el organismo más comúnmente utilizado y el mejor caracterizado con el objetivo de producir proteínas recombinantes. Se usan distintos sistemas de expresión en E. coli y, entre ellos, se considera el promotor Ptrp del operón triptófano como uno de los más fuertes (Yansura y Bass, 1997).

Sin embargo, todos los genes recombinantes no se expresan con la misma eficacia mediante E. coli. Se ha descrito y observado que la acumulación de una proteína recombinante producida durante el cultivo de células huésped transformadas podía presentar rápidamente a una instabilidad plasmídica, a una disminución e incluso a una parada del crecimiento celular, y a una disminución del rendimiento global de producto recombinante. En este caso, es importante disponer de un sistema de expresión controlada y regulada que permita dividir el procedimiento de producción en dos fases: una primera fase denominada de crecimiento celular, en la que la actividad del promotor es mínima, seguida de una fase denominada de inducción o de desrepresión que favorece la expresión y la acumulación de la proteína recombinante.

El promotor Ptrp del operón triptófano de E. coli es adecuado para la producción de proteínas recombinantes debido a su carácter inducible. La represión a nivel del operador de Ptrp está asegurada mediante el producto del gen regulador de trpR cuando este producto, denominado igualmente aporrepresor trp, se une al triptófano (correpresor). La ausencia de triptófano da como resultado que la proteína TrpR sea incapaz de unirse al operador, provocando así una desrepresión del operón triptófano. Diversos ejemplos de expresión de genes heterólogos bajo el control de Ptrp muestran que la pérdida de expresión es demasiado importante para permitir la producción, en condiciones satisfactorias, de proteínas recombinantes, especialmente las que son tóxicas para la célula (Yansura y Henner, 1990).

La proteína reguladora TrpR se somete a un mecanismo de autorregulación (Kelley y Yanofsky, 1982), y su concentración tiende hacia un valor medio de 120 moléculas por célula K-12 de E. coli en presencia de un exceso de triptófano exógeno (Gunsalus, Gunsalus Miguel y Gunsalus, 1986). Esta concentración, aunque suficiente para regular correctamente la actividad del único promotor cromosómico Ptrp, puede resultar limitante frente a varias decenas de vectores que contienen el mismo promotor. En cuanto al triptófano, éste puede igualmente ser un factor limitante incluso si se proporciona en exceso en el medio de cultivo. En efecto, existe en E. coli una actividad de triptofanasa que está codificada por el gen tnaA, y que es capaz de degradar el triptófano en indol, desviándolo así de su función de regulador (Snell, 1975). Además, la triptofanasa es inducible mediante el triptófano, lo que hace vana cualquier tentativa de compensar este fenómeno de degradación con un aumento de la aportación de triptófano.

Se han previsto y descrito distintos enfoques que tienen el objetivo de controlar lo mejor posible la pérdida de expre-
sión. Sin embargo, algunos tienen el inconveniente de ser solamente aplicables a nivel de laboratorio (Hasan y Szybals-
ki, 1995; Suter-Crazzolara y Unsicker, 1995), o de disminuir el rendimiento de producto recombinante (Stark, 1987).

En consecuencia, existe en la actualidad una necesidad importante de desarrollar un sistema de expresión controlada de proteínas recombinantes de interés que se pueda usar a gran escala y que permita en particular controlar la pérdida de expresión. Esto es justamente el objeto de la presente invención.

La invención se refiere a nuevas construcciones basadas en el sistema de expresión de Ptrp que, cuando se introducen en una célula huésped procariota, preferentemente de tipo bacteriano, permiten reducir la expresión residual de genes recombinantes al principio del cultivo, aportando estas nuevas construcciones un control mejorado de la síntesis de proteínas recombinantes.

La presente invención tiene por objeto una construcción para la expresión de un gen que codifica una proteína recombinante de interés puesto bajo el control del promotor Ptrp del operón triptófano en una célula huésped procariota, caracterizada porque la construcción comprende una secuencia de ácidos nucleicos capaz de modificar el gen que codifica una TnaA triptofanasa cuando dicha secuencia de ácidos nucleicos se introduce en dicha célula huésped, siendo el producto de expresión de dicho gen incapaz de degradar el triptófano en indol, y una secuencia de un promotor seguida en 3' de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de naturaleza ribonucleotídica o proteica que actúa negativamente sobre el promotor de Ptrp o su producto de transcripción, siendo dicha molécula de naturaleza ribonucleotídica que actúa negativamente sobre el promotor de Ptrp elegida entre las secuencias ribonucleotídicas preferidas tales como se definen a continuación, y siendo dicha molécula de naturaleza proteica que actúa negativamente sobre el promotor de Ptrp elegida entre la secuencia que codifica el aporrepresor TrpR del operón triptófano de dicha célula huésped, no habiendo conservado ninguno de estos fragmentos activos su actividad represora.

Mediante la expresión "proteína recombinante de interés", se pretende designar todas las proteínas, polipéptidos o péptidos obtenidos mediante recombinación genética, y susceptibles de ser utilizados en campos tales como el campo de la salud humana o animal, de la cosmetología, de la nutrición humana o animal, de la agroindustria o de la industria química. Entre estas proteínas de interés, se pueden citar particularmente pero sin limitarse a ellas:

- una citoquina, y especialmente una interleuquina, un interferón, un factor de necrosis de tejido y un factor de crecimiento, y especialmente un factor de crecimiento hematopoyético (G-CSF, GM-CSF), una hormona tal como la hormona de crecimiento humana o la insulina, un neuropéptido,

- un factor o cofactor implicado en la coagulación, y especialmente el factor VIII, el factor de von Willebrand, la antitrombina III, la proteína C, la trombina y la hirudina,

- una enzima y especialmente la tripsina, una ribonucleasa, y la \beta-galactosidasa,

- un inhibidor de enzima tal como la \alpha1-anti-tripsina, y los inhibidores de proteasas víricas,

- una proteína capaz de inhibir el inicio o el progreso de cánceres, tales como los productos de expresión de genes supresores de tumores, por ejemplo el gen P53,

- una proteína capaz de estimular una respuesta inmunitaria o un anticuerpo, tal como por ejemplo las proteínas, o sus fragmentos activos, de la membrana externa de la bacteria Gram negativa, en particular las proteínas OmpA de Klebsiella o la proteína G del virus respiratorio sincitial humano,

- una proteína capaz de inhibir una infección vírica o su desarrollo, por ejemplo los epítopos antigénicos del virus en cuestión, o variantes modificadas de proteínas víricas susceptibles de entrar en competición con las proteínas víricas nativas,

- una proteína susceptible de ser contenida en una composición cosmética tal como la sustancia P, o una superóxido dismutasa,

- una proteína alimentaria,

- una enzima capaz de dirigir la síntesis de compuestos químicos o biológicos, o capaz de degradar algunos compuestos químicos tóxicos, o también

- cualquier proteína que tenga una toxicidad frente al microorganismo que la produce, en particular si este microorganismo es la bacteria E. coli, como por ejemplo, pero sin limitarse a ella, la proteasa del virus del VIH-1, la proteína ECP (proteína catiónica eosinofílica), o las proteínas 2B y 3B del poliovirus.

Mediante la expresión "secuencia de ácidos nucleicos capaz de desactivar el gen que codifica una TnaA triptofanasa cuando dicha secuencia de ácidos nucleicos se introduce en dicha célula huésped", se pretende designar una secuencia de ácidos nucleicos capaz de modificar dicho gen de tal manera que esta modificación conlleva a la pérdida de la actividad de triptofanasa de dicha célula huésped, siendo el producto de expresión de dicho gen modificado incapaz de degradar el triptófano en indol, desviándolo así de su función reguladora. Entre dichas secuencias de ácidos nucleicos capaces de desactivar el gen que codifica una TnaA triptofanasa cuando una de dichas secuencias de ácidos nucleicos se introduce en dicha célula huésped, se prefiere una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una TnaA triptofanasa desactivada obtenida mediante mutación, tal como mediante sustitución, inserción y/o supresión de al menos un nucleótido de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una TnaA triptofanasa activa.

La invención comprende una construcción según la invención, caracterizada porque la célula huésped procariota es una bacteria Gram negativa, que pertenece preferentemente a la especie de E. coli.

La invención comprende también una construcción según la invención, caracterizada porque comprende además, en dirección 5' de dicha secuencia de ácidos nucleicos capaz de desactivar el gen que codifica una TnaA triptofanasa cuando dicha secuencia de ácidos nucleicos se introduce en dicha célula huésped, todo o parte de la secuencia de ácidos nucleicos del promotor Ptna del operón triptofanasa.

Preferentemente, la invención se refiere a una construcción según la invención, caracterizada porque dicha secuencia de ácidos nucleicos capaz de desactivar el gen que codifica una TnaA triptofanasa cuando dicha secuencia de ácidos nucleicos se introduce en dicha célula huésped comprende un fragmento mutado de la secuencia que codifica dicha TnaA triptofanasa.

Preferentemente, la invención se refiere a una construcción según la invención, caracterizada porque dicho fragmento mutado se obtiene mediante inserción de un codón de terminación en una posición tal que la secuencia del fragmento mutado así obtenido codifica un fragmento proteico desprovisto de actividad de triptofanasa.

De manera igualmente preferida, la invención se refiere a una construcción según la invención, caracterizada porque dicho fragmento mutado es un fragmento mutado de la secuencia que codifica la TnaA triptofanasa de dicha célula huésped.

En cuanto a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la TnaA triptofanasa de E. coli, y a su promotor Ptna, se hará referencia en la presente descripción a la secuencia publicada por Deeley y Yanofsky (1981).

En cuanto a las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el promotor/operador Ptrp del operón triptófano, se hará referencia a la secuencia publicada por Yanofsky et al (1981).

La invención se refiere asimismo a una construcción según la invención en la que dicho promotor seguido en 3' de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de naturaleza ribonucleotídica o proteica, y que actúa negativamente sobre el promotor de Ptrp, es todo o parte del promotor Ptna del operón triptofanasa de E. coli.

De manera igualmente preferida, la invención comprende una construcción según la invención, caracterizada porque dicha secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de naturaleza ribonucleotídica o proteica, y que actúa negativamente sobre el promotor de Ptrp, es la secuencia que codifica el aporrepresor TrpR del operón triptófano de E. coli o uno de sus fragmentos biológicamente activos tal como se describe por Gunsalus y Yanofsky (1980).

Mediante la expresión "secuencia de ácidos nucleicos que comprende todo o parte de la secuencia de un promotor", se pretende designar una secuencia de ácidos nucleicos que comprende toda la secuencia de un promotor, o uno de sus fragmentos biológicamente activos, capaz de dirigir o controlar la expresión de un gen que está unido de manera funcional al mismo.

Mediante la expresión "fragmento biológicamente activo de un promotor", se pretende designar en la presente descripción cualquier secuencia de un fragmento de dicho promotor, el cual es capaz de dirigir o controlar la expresión del gen situado en dirección 3' de dicho fragmento, estando dicho gen unido de manera funcional a dicho fragmento.

Mediante la expresión "fragmento biológicamente activo del aporrepresor TrpR del operón triptófano", se pretende designar en la presente descripción cualquier fragmento de dicho aporrepresor que conservó su actividad represora.

Mediante la expresión "secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de naturaleza ribonucleotídica, y que actúa negativamente sobre el promotor de Ptrp", se entiende que se prefiere los ribonucleótidos elegidos entre las secuencias siguientes:

1

2

Otro aspecto de la invención se refiere a un vector que contiene una construcción según la invención.

Preferentemente, el vector según la invención se caracteriza porque se trata del vector pMAK705[tnaAt] o del vector pMAK705[Ptna::trpR::3'tna].

La invención se refiere asimismo a una célula huésped procariota, preferentemente una bacteria de la especie de E. coli, transformada mediante un vector según la invención.

La invención describe un procedimiento de producción de proteína recombinante en una célula huésped utilizando una construcción según la invención.

En otro aspecto, la invención tiene por objeto un procedimiento de producción de proteínas recombinantes de interés, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a): transformar una célula procariota mediante un vector según la invención, e integrar dicha construcción en el ADN de dicha célula huésped;

b): transformar dicha célula procariota mediante un vector que contiene un gen que codifica dicha proteína recombinante de interés;

c): cultivar dicha célula transformada en un medio de cultivo que permite la expresión de la proteína recombinante; y

d): recuperar la proteína recombinante a partir del medio de cultivo o de dicha célula transformada.

La invención tiene igualmente por objeto un procedimiento de producción de una proteína recombinante de interés según la invención, en el que dicha construcción se introduce en el ADN de la célula huésped procariota.

La invención describe un procedimiento de producción de proteínas recombinantes según la invención, en el que dicha construcción se introduce en el ADN de la célula huésped procariota mediante un vector según la invención, preferentemente según el método de integración cromosómica descrita en el ejemplo 1 ó 2.

La invención describe igualmente un procedimiento de producción de proteínas recombinantes según la invención, en el que dicha construcción se introduce sin otro elemento de ADN que permitiría asociar una ventaja selectiva.

La invención comprende también un procedimiento de producción de una proteína recombinante de interés según la invención, en el que dicha construcción se introduce en el locus del operón de triptofanasa.

La invención tiene además por objeto un procedimiento de producción de proteínas recombinantes de interés según la invención, caracterizado porque dicho procedimiento comprende además entre la etapa a) y b) del procedimiento anterior, una etapa de resolución y de selección por cribado.

La invención describe además un procedimiento de producción de proteínas recombinantes de interés según la invención, en el que el control de la expresión de las proteínas recombinantes, antes de la inducción del promotor de Ptrp, se obtiene mediante la inducción de dicho promotor seguido en 3' de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de naturaleza ribonucleotídica o proteica, y que actúa negativamente sobre el promotor de Ptrp según la invención.

Finalmente, la invención se refiere igualmente a un procedimiento de producción según la invención, en el que la inducción de dicho promotor seguido en 3' de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de naturaleza ribonucleotídica o proteica, y que actúa negativamente sobre el promotor de Ptrp según la invención, se obtiene mediante cualquier medio que permita ejercer un efecto inhibidor o activador sobre dicho promotor.

Preferentemente, la invención comprende un procedimiento de producción según la invención, en el que la inducción de dicho promotor seguido en 3' de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de naturaleza ribonucleotídica o proteica, y que actúa negativamente sobre el promotor de Ptrp según la invención, se obtiene:

a): eligiendo una fuente de carbono apropiada en el medio de cultivo; o bien

b): añadiendo triptófano al medio de cultivo; o mediante una combinación de a) y b).

Los sistemas de construcciones y de vectores, las células huésped procariotas transformadas mediante dichos vectores, así como los procedimientos de la invención descritos anteriormente y que se ejemplificarán en los ejemplos siguientes, entran en el contexto del control de la producción de proteínas recombinantes en células procariotas. Se adaptan para la expresión de genes homólogos o heterólogos puestos en dirección 3' del promotor/operador de Ptrp. Más particularmente, se describen a continuación dos mutantes para ilustrar la invención. Tienen los nombres ICONE 100 e ICONE 200 (ICONE por Células Mejoradas para Sobreexpresión y Expresión sin Pérdidas). Las modificaciones introducidas en la línea ICONE presentan las características siguientes:

1): están integradas en el cromosoma del huésped,

2): siendo generadas mediante una técnica de mutagénesis dirigida, se destinan exclusivamente a un único sitio del ADN bacteriano, perfectamente conocido puesto que se trata del operón de tna situado a 83 min en el mapa físico del genoma de E. coli K-12. A este respecto, las consecuencias en el plano fisiológico para el huésped están perfectamente identificadas. En particular, se aparta la posibilidad que funciones crípticas sean reactivadas tras la integración cromosómica (tal como se sospecha en el caso de la mutagénesis aleatoria),

3): la tecnología usada en estos ejemplos para la integración cromosómica (Hamilton et al., (1989)) excluye la posibilidad de que se inserten otras secuencias en el ADN bacteriano. Especialmente, los mutantes no presentan genes de resistencia a un antibiótico. En el caso en el que se utilizaran a nivel industrial, estos ofrecen al productor y al legislador la garantía que no tendrán ventaja selectiva en caso de diseminación accidental en el medioambiente.

Según un aspecto de la invención, se describe un primer tipo de mutante o célula transformada denominado ICONE 100, que presenta una mutación en el gen de tnaA que conlleva a una pérdida de la actividad de triptofanasa. El fenotipo asociado con esta mutación es la ausencia de degradación del triptófano. Resulta que este tipo de mutante, después de la transformación mediante un vector informador, y después de cultivar en un medio que favorece habitualmente la actividad de triptofanasa, es superior al aislado del cual procede, en término de control de la represión por el triptófano.

Según otro aspecto de la invención, se describe un segundo tipo de mutante denominado ICONE 200, que presenta un casete de expresión del gen de trpR bajo el control del promotor de la Ptna triptofanasa, integrado en el locus del gen de tnaA. El uso del locus de tna como diana para la integración conlleva, en la bacteria huésped, una pérdida de la actividad de triptofanasa que se traduce, como se describe anteriormente, en una incapacidad para convertir el triptófano en indol. Por otra parte, la presencia del casete de Ptna::trpR en el cromosoma confiere a este nuevo gen de trpR las características de Ptna, es decir una sensibilidad a la represión catabólica (Isaacs, Chao, Yanofsky y Saier, 1994; Botsford y Demos, 1971), y la inductibilidad por el triptófano (Stewart y Yanofsky, 1985). Esta última propiedad constituye una innovación en la que el promotor de Ptrp plasmídico está controlado, a nivel de la transcripción, por un promotor cromosómico, ptna, que es en sí antagonista. De manera sorprendente, después de la transformación mediante un vector de expresión, y después de cultivar en un fermentador, resulta que ICONE 200 es superior al aislado del cual procede, en términos de control de la represión por el triptófano.

Las bacterias que presentan una de las características mencionadas anteriormente son útiles para la producción controlada de moléculas recombinantes. Por lo tanto, la presente invención tiene igualmente por objeto el uso de dichas bacterias transformadas en un procedimiento de producción de proteínas recombinantes.

En los ejemplos siguientes, la ventaja proporcionada por los dos mutantes se demuestra claramente utilizando como proteína recombinante la \beta-galactosidasa de Echerichia coli.

Otro aspecto de la invención describe las características de las mutaciones introducidas. Éstas están perfectamente definidas, controladas en el plano genético y bioquímico, están destinadas al locus de tna de E. coli, y están libres de un marcador de selección.

Los microorganismos mutantes o transformados de la invención se construyen a partir de procariotas, más precisamente bacterias Gram-negativas que pertenecen a la especie de Escherichia coli. Se usaron las propiedades del promotor del operón triptofanasa de E. coli (inducible por el triptófano, sensible a la represión catabólica) para dirigir la síntesis transitoria de un mediador que actúa negativamente sobre la expresión dirigida por Ptrp. Sin embargo, se sabe que otras especies bacterianas, en particular las que colonizan el tubo digestivo de los animales, son capaces de sintetizar una triptofanasa inducible por el triptófano (Snell, 1975). En consecuencia, otras cepas distintas de E. coli son adecuadas para practicar los métodos descritos y producir en ellas proteínas recombinantes.

Los ejemplos y las figuras a continuación se destinan a ilustrar la invención sin limitarla bajo ningún concepto.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Cinéticas de crecimiento de las cepas RV308, ICONE 100 e ICONE 200 x pVA-\betagal. La DO de 580 nm corresponde a la medida de la densidad óptica mediante espectrofotometría.

Figura 2: Cinéticas de actividad de \beta-gal de las cepas RV308, ICONE 100 e ICONE 200 x pVA-\betagal.

Las bacterias transformadas mediante un vector que contiene el gen de la \beta-galactosidasa bajo el control del promotor de Ptrp se cultivan en un fermentador. La actividad de \beta- galactosidasa se mide mediante incubación de un extracto celular en presencia de ONPG (sustrato específico de la \beta-galactosidasa).

Figura 3: Comparación de las cinéticas de crecimiento de las cepas de E. coli RV308 e ICONE 200 transformadas mediante el vector pVA-polio2B.

Figuras 4A y 4B: inmunotransferencia sobre los extractos intracelulares de los cultivos de RV308 e ICONE 200 transformados mediante el vector pVA-polio2B.

Figura 4A: RV308 x pVA-polio2B

Figura 4B: ICONE 200 x pVA-polio2B

Figura 5: Análisis mediante SDS-PAGE de la proteína polio-2B purificada mediante cromatografía de afinidad sobre níquel.

A:: Experimento nº 2: inducción mediante 5 \mug/ml de IAA cuando la densidad óptica es igual a 32,5;

B:: Experimento nº 1: inducción mediante 25 \mug/ml de IAA cuando la densidad óptica es igual a 32,5;

C:: Experimento nº 4: inducción mediante 5 \mug/ml de IAA cuando la densidad óptica es igual a 63,5;

D:: Experimento nº 3: inducción mediante 25 \mug/ml de IAA cuando la densidad óptica es igual a 62,5;

PM:: Marcador de peso molecular (kDa).

Figura 6: Cinéticas de crecimiento de ICONE 200 x pVA-polio2B: influencia del tiempo de inducción y de la concentración del inductor.

\blacksquare: Experimento nº 1: inducción mediante 25 \mug/ml de IAA cuando la densidad óptica es igual a 32,5.

\Box: Experimento nº 2: inducción mediante 5 \mug/ml de IAA cuando la densidad óptica es igual a 32,5.

\bullet: Experimento nº 3: inducción mediante 25 \mug/ml de IAA cuando la densidad óptica es igual a 62,5.

\circ: Experimento nº 4: inducción mediante 5 \mug/ml de IAA cuando la densidad óptica es igual a 63,5.

Las flechas indican el momento de la inducción.

La invención se basa en la introducción estable de mutaciones en el genoma de la cepa huésped. Todas las modificaciones presentadas en los ejemplos siguientes se introducen en el locus de tna de E. coli, que consiste esquemáticamente en la siguiente serie:

A) promotor de Ptna,

B) secuencia que codifica el gen de tnaA (triptofanasa),

C) región intergénica,

D) secuencia que codifica el gen de tnaB (triptófano-permeasa),

E) terminador de la transcripción.

Más precisamente, las modificaciones se refieren al elemento (B). Éste se sustituye en beneficio de un elemento (b), cuyas características en las diversas construcciones son las siguientes:

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TABLA 1 Naturaleza de las mutaciones portadas por ICONE 100 e ICONE 200

Nombre del mutante	Naturaleza del elemento (b)
ICONE 100	\begin{minipage}[t]{70mm} Secuencia que codifica tnA interrumpida en posición +221 por un codón de terminación y por un sitio de restricción de Xbal \end{minipage}
ICONE 200	\begin{minipage}[t]{70mm} Secuencia que codifica el gen trpR que codifica el aporrepresor de Ptrp \end{minipage}

Ejemplo 1 Construcción del mutante ICONE 100

Se amplifica mediante PCR un fragmento de ADN marcado con tnaAT. Se extiende desde la posición -275 hasta la posición +1054 con relación al primer nucleótido de la secuencia que codifica tnaA. Este fragmento, que se solapa con promotor de Ptna y con tnaA, se amplifica mediante reacción de PCR en dos partes. La parte I se extiende desde la posición -275 hasta la posición +220. Se amplifica con la ayuda de los oligonucleótidos Trp5 (sentido) y Trp2 (antisentido) cuyas secuencias son:

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3

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La parte II se sitúa en la secuencia que codifica tnaA, inmediatamente en 3' de la parte I. Se extiende desde la posición +221 hasta la posición +1054. Se amplifica con la ayuda de los oligonucleótidos Trp3 y Trp4:

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4

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Las reacciones de PCR se efectúan utilizando, como matriz, colonias de E. coli K-12 lisadas en el tampón de la Taq polimerasa (AmpliTaq Gold CETUS, USA).

Los productos de la amplificación se precipitan con etanol, y después se digieren con enzimas de restricción apropiadas (BamHI - XbaI para la parte I, Xbal - HindIII para la parte II). Un análisis sobre gel de agarosa coloreado con BET permite verificar que los fragmentos tienen el tamaño esperado (Deeley y Yanofsky, 1981). El fragmento de tnaAT se genera ligando los dos fragmentos I y II en el sitio de Xbal. Difiere de la secuencia natural por la presencia de un codón de terminación en la posición +221, seguido de un sitio de restricción de Xbal. Este fragmento de tnaAT se clona, en los sitios de BamHI/HindIII, en el vector de pRIT28 (Hultman, Stahl, Hornes y Uhlen, 1989), y se secuenció. El fragmento de tnaAT se subclonó en el vector pMAK705 (Hamilton, Aldea, Washburn, Babitzke y Kushner, 1989), dando pMAK705[tnaAT].

El método usado para generar una reorganización genética en E. coli es el descrito por Hamilton et al. (1989). Se basa en el uso del vector suicida pMAK705, que presenta un origen de replicación termosensible, funcional a 30ºC pero inactivo más allá de 42ºC, así como el gen de resistencia a cloranfenicol (CMP). Se transforma E. coli RV308 (Maurer, Meyer y Ptashne, 1980) mediante 4 \mug del vector pMAK705[tnaAT], y la mezcla de transformación se coloca en placas de medio LB + CMP 20 \mug/ml. Después de incubar una noche a 30ºC, se subcultivan tres clones en medio líquido LB + CMP 20 \mug/ml, y se incuban a 30ºC con agitación hasta alcanzar una DO a 580 nm cercana a 1. Después, las suspensiones se colocan en placas sobre un medio LB + CMP 20 \mug/ml, y se incuban a 44ºC y a 30ºC. Las colonias que se desarrollan a 44ºC (= cointegrantes) son portadores de una integración cromosómica del vector, estando esta integración favorecida por la existencia de homologías de secuencia entre el cromosoma y el inserto portado por el vector.

La fase denominada de resolución consiste en favorecer la escisión del vector mediante un mecanismo de recombinación entre secuencias repetidas presentes en el cromosoma. Algunos clones aislados a 44ºC se cultivan en medio líquido LB + CMP 20 \mug/ml a 30ºC durante tres días, renovando regularmente el medio. Después, las suspensiones se diluyen, se colocan en placas sobre un medio de agar-agar LB + CMP 20 \mug/ml, y se incuban a 30ºC hasta que aparecen colonias individuales. Se subcultivan por duplicado varias decenas de colonias sobre medio de agar-agar LB + CMP 20 \mug/ml a 30ºC y 44ºC. Las colonias que no se desarrollan a 44ºC se seleccionan y se criban mediante una reacción de PCR que indica si la resolución del vector conservó el codón de terminación y el sitio Xbal en el locus de tna. Los oligonucleótidos utilizados son Trp6 (sentido) y Trp7 (antisentido), respectivamente homólogos a la mutación deseada y a una parte del terminador de tnaA:

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De dieciocho clones cribados, nueve dan un fragmento de amplificación del tamaño esperado, indicando la presencia del codón de terminación seguido del sitio Xbal en el gen de tnaA. Los otros nueve clones no dan ningún producto de amplificación, probablemente porque la etapa de resolución restauró sobre el cromosoma el gen de tnaA no mutado. Entre los nueve clones positivos, se recogen cuatro y se someten a una limpieza del plásmido mediante subcultivo sucesivo en ausencia de presión de selección. Tras algunos días de cultivo, se obtienen clones otra vez sensibles al cloranfenicol.

La presencia de la mutación que no activa el gen de tnaA se confirma de dos maneras distintas: primero, una amplificación mediante PCR con la ayuda de los oligonucleótidos Trp5 y Trp4, seguido de una digestión mediante Xbal, muestra que el sitio de restricción, ausente en E. coli RV308, está presente en el gen de tnaA de los mutantes; después, mediante un cultivo de los mutantes en un medio rico en triptófano, seguido del ensayo con indol (añadiendo el reactivo de Kovacs al medio de cultivo), se muestra que los mutantes no han generado ningún indol, mientras que la cepa RV308 de origen produce indol en las mismas condiciones. Se deduce que la mutación introducida conlleva a una pérdida de la actividad de triptofanasa.

Se selecciona un clon con vistas a una conservación en forma congelada. Se denomina ICONE 100.

Ejemplo 2 Construcción del mutante ICONE 200

Se construye un fragmento de ADN in vitro mediante amplificación de PCR de tres subunidades.

La primera subunidad situada en el promotor de Ptna se extiende desde la posición -511 hasta la posición +3 con respecto al primer nucleótido de la secuencia que codifica el gen de tnaA. Se amplifica a partir de los oligonucleótidos TrpR1 (biotinilado en 5') y TrpR2:

6

La segunda subunidad corresponde a la secuencia que codifica el gen de trpR de E. coli. Se amplifica a partir de los oligonucleótidos TrpR3 y TrpR4 (biotinilado en 5'):

7

8

La tercera subunidad corresponde a la secuencia situada inmediatamente en 3' de la secuencia que codifica el gen de tnaA. Ésta contiene la región intergénica del operón de tna, y una parte del gen de tnaB que codifica la triptófano-permeasa. Se amplifica a partir de los oligonucleótidos TrpR5 y TrpR6:

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Los fragmentos amplificados se purifican según el método de GeneClean (Bio101, La Jolla, CA, USA).

Las subunidades I y II se fusionan de la siguiente manera. En dos tubos separados, cada subunidad se incuba con 30 \mul de perlas marcadas con estreptavidina (Dynabeads, DYNAL, Noruega). Después de 20 min. a 37ºC, y 5 min. a temperatura ambiente, el ADN fijado se desnaturaliza mediante 50 \mul de NaOH 0,15 M. Los ADN monocatenarios recuperados en cada sobrenadante se mezclan en partes iguales, y se someten a una reacción de hibridación y de extensión en presencia de la Taq polimerasa (AmpliTaq Gold, CETUS, USA) siguiendo cinco ciclos de PCR. El producto de reacción se amplifica en una reacción de PCR con la ayuda de los oligonucleótidos TrpR1 y TrpR4.

El producto de amplificación purificado mediante el GeneClean se digiere mediante BamHI y PstI. El fragmento así aislado se clona en el vector pRIT28 para dar pRIT28[Ptna::trpR], y después se secuencia.

La subunidad III se digiere mediante las enzimas PstI y HindIII, y después se clona en pRIT28 para dar pRIT28[3'tna], y después la secuencia se verifica mediante secuenciación de ADN (ABI 373A, Perkin Elmer, USA).

El vector pRIT28[Ptna::trpR] se digiere con las enzimas PstI y HindIII, y después se liga en presencia de la subunidad III, ella misma aislada a partir de pRIT28[3'tna] mediante una doble digestión con PstI/HindIII. El vector resultante se denomina pRIT28[Ptna::trpR::3'tna]. El inserto se transfiere en pMAK705 tras una doble digestión mediante las enzimas BamHI y HindIII. El plásmido resultante se denomina pMAK705[Ptna::trpR::3'tna].

La integración de la fusión Ptna::trpR::3'tna en el locus de tna de E. coli RV308 se realiza en condiciones análogas a las descritas en el Ejemplo 1. Brevemente, la cepa se transforma mediante el vector pMAK705[Ptna::trpR::3'tna], y después se somete a las etapas de integración y de resolución.

El cribado de las colonias al final de la resolución recurre a condiciones ligeramente distintas de las del Ejemplo 1. El locus de tna se amplifica mediante PCR a partir de los oligonucleótidos TrpR11 y TrpR7:

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El oligonucleótido TrpR11 se híbrida con la secuencia de Ptna en dirección 5' de TrpR1, y el oligonucleótido TrpR7 se híbrida con la secuencia de tnaB en dirección 3' de TrpR6. El producto de la amplificación tiene un tamaño distinto según que el gen situado en dirección 3' de Ptna sea tnaA (situación encontrada en RV308) o trpR (situación buscada en los mutantes). Se conserva una colonia que posee trpR en el locus de tna, y se denomina ICONE 200. Un análisis de su secuencia cromosómica muestra que ésta posee el gen de trpR inmediatamente en dirección 3' del promotor de Ptna. Un cultivo en presencia de triptófano demuestra la ausencia de formación de indol, lo que es una consecuencia lógica de la perdida del gen de tnaA.

Ejemplo 3 Pérdida de expresión en presencia de succinato + triptófano

Este ejemplo describe las capacidades relativas de E. coli RV308, ICONE 100 e ICONE 200 para controlar la expresión de una proteína recombinante bajo el control del promotor de Ptrp. Para ello, se ha construido un vector de expresión denominado pVA-\betagal en el que la secuencia que codifica la \beta-galactosidasa de E. coli se coloca en dirección 3' del promotor de Ptrp. El vector de origen utilizado para esta construcción es pVAABP308 (Murby, Samuelsson, Nguyen et al., 1995).

Cada una de las tres cepas se transforma mediante el vector pVA-\betagal. Los transformantes obtenidos se cultivan individualmente en un medio completo (Caldo de soja tríptico (DIFCO) 30 g/l, extracto de levadura (DIFCO) 5 g/l) durante una noche a 37ºC. Se transfiere una alícuota de estos precultivos a 60 ml de medio M9.YE.SUCC (1x disolución de sales M9 (DIFCO), extracto de levadura (DIFCO) 5 g/l, succinato de sodio 20 g/l). Después de un tiempo de incubación a 37ºC que permite alcanzar la fase exponencial del crecimiento, se retira una muestra de cada cultivo. El crecimiento se estima mediante la densidad óptica a 580 nm de la suspensión bacteriana. El nivel de actividad de la \beta-galactosidasa se mide en cada pelete celular. Para eso, se centrifuga 1 ml de cultivo durante 3 minutos a 12.000 g. El pelete celular se recoge en 900 \mul de tampón (Tris-HCl 50 mM pH 7,5 - EDTA 1 mM - NaCl 100 mM - Lisozima 400 \mug/ml), y se incuba durante 15 minutos a 37ºC. Se añaden 100 \mul de SDS (1% en Tris-HCl 50 mM pH 7,5), y la muestra se coloca durante 5 minutos a temperatura ambiente. El ensayo se efectúa mezclando 30 \mul de la muestra, 204 \mul de tampón (Tris-HCl 50 mM pH 7,5 - MgCl_{2} 1 mM) y 66 \mul de ONPG (4 mg/ml en Tris-HCl 50 mM pH 7,5). La mezcla de reacción se incuba a 37ºC. La reacción se termina mediante la adición de 500 \mul de Na_{2}CO_{3} 1 M. La DO a 420 nm, relacionada con el tiempo de incubación, es proporcional a la actividad de \beta-galactosidasa presente en la muestra. Sabiendo que E. coli RV308 tiene una supresión completa del operón lac (Maurer, Meyer y Ptashne, 1980), la actividad de \beta-galactosidasa medida se debe únicamente a la expresión del gen portado por el vector
pVA-\betagal.

En la tabla 2 se resumen los resultados obtenidos con cada una de las cepas RV308, ICONE 100 e ICONE 200.

TABLA 2 Crecimiento de las cepas RV308, ICONE 100 e ICONE 200, y pérdida de expresión (media y desviación típica sobre tres experimentos)

	DO 580 nm	\beta-GAL (U/ml)
RV308	2,47 \pm 0,01	0,93 \pm 0,09
ICONE 100	3,69 \pm 0,24	0,21 \pm 0,03
ICONE 200	2,43 \pm 0,03	0,02 \pm 0,00

Los resultados de la tabla 2 muestran que los mutantes de la línea ICONE se desarrollan por lo menos tan bien como la cepa RV308 de la cual proceden. Por lo tanto, las mutaciones introducidas no tienen efectos negativos sobre el crecimiento. Por otra parte, la actividad de \beta-galactosidasa medida es distinta en las tres cepas. ICONE 100 posee una actividad intracelular de aproximadamente 4,5 veces menor que la de RV308. En condiciones - succinato como fuente de carbono - en las que la actividad del promotor de Ptna es máxima (Botsford y DeMoss, 1971), la supresión del gen de la triptofanasa presenta por lo tanto a una disminución de la pérdida de expresión, probablemente limitando la degradación del triptófano intracelular (correpresor). En estas mismas condiciones, el nivel de pérdida de expresión en ICONE 200 disminuye todavía más, en un factor de 10, con relación a ICONE 100. Por lo tanto, la actividad del promotor de Ptrp plasmídico es mínima en ICONE 200. Por una parte, la pérdida de la actividad de triptofanasa da a la bacteria la posibilidad de controlar mejor el Ptrp, tal como se demuestra para ICONE 100. Pero ICONE 200 posee una segunda característica que la distingue de ICONE 100 en el plano genético, y le da, a nivel experimental, una ventaja suplementaria en términos de control de la expresión. Así, en condiciones en las que el Ptna es activo, ICONE 200 tiene la posibilidad de dirigir la sobreexpresión del aporrepresor de TprR, y por consecuencia la pérdida de expresión medida a nivel del promotor de Ptrp plasmídico se reduce en un factor próximo a 50 con relación a la cepa de origen RV308.

Ejemplo 4 Pérdida de expresión en presencia de glicerol + triptófano

Este ejemplo demuestra la ventaja aportada por el mutante ICONE 200 en un medio de cultivo y en condiciones de fermentación próximas a las que se podría utilizar industrialmente para producir proteínas recombinantes con el sistema de Ptrp.

Cada una de las tres cepas RV308, ICONE 100 e ICONE 200 se transforma mediante el vector pVA-\betagal. Los transformantes obtenidos se cultivan individualmente en 200 ml de medio completo (Caldo de soja tríptico (DIFCO) 30 g/l, extracto de levadura (DIFCO) 5 g/l) durante una noche a 37ºC.

La suspensión celular obtenida se transfiere estérilmente a un fermentador (modelo CF3000 de Chemap, capacidad 3,5 l) que contiene 1,8 litros del siguiente medio (concentraciones para 2 litros de cultivo final): glicerol 90 g/l, (NH_{4})_{2}
SO_{4} 5 g/l, KH_{2}PO_{4} 6 g/l, K_{2}HPO_{4} 4 g/l, citrato sódico.2H_{2}O 9 g/l, MgSO_{4}.7H_{2}O 2 g/l, extracto de levadura 1 g/l, CaCl_{2}.2H_{2}O 30 mg/l, ZnSO_{4}.7H_{2}O 8 mg/l, CoCl_{2}.6H_{2}O 7 mg/l, Na_{2}MoO_{4}.2H_{2}O 7 mg/l, MnSO_{4}.1H_{2}O 10 mg/l, H_{3}BO_{3} 2 mg/l, CuSO_{4}.5H_{2}O 8 mg/l, FeCl_{3}.6H_{2}O 54 mg/l, agente antiespumante 0,06%, tetracilcina 8 mg/l, triptófano 200 mg/l. El pH se ajusta a 7,0 mediante adición de amoniaco. El porcentaje de oxígeno disuelto se mantiene a 30% de la saturación regulando automáticamente la velocidad de agitación, y después mediante el caudal de aeración a la medida del O_{2} disuelto. Cuando la densidad óptica del cultivo alcanza un valor comprendido entre 40 y 45, se procede a la inducción por adición de 25 mg/l de ácido indol-acrílico (SIGMA).

Se efectúa un análisis mediante cinética de la densidad óptica del cultivo (DO a 580 nm de la suspensión), y de la actividad de \beta-galactosidasa intracelular (véase el Ejemplo 3). Las figuras 1 y 2 ilustran respectivamente las cinéticas de crecimiento y de actividad de la \beta-galactosidasa en tres cultivos.

Los datos presentados en la figura 1 confirman la observación del Ejemplo 3: las tres cepas tienen cinéticas de crecimiento parecidas. Los mutantes de la línea ICONE han conservado, desde este punto de vista, el potencial de crecimiento de E. coli RV308, y por lo tanto siguen siendo candidatos potenciales para un uso industrial.

Los datos de la Figura 2 muestran el impacto de las mutaciones portadas por las cepas ICONE sobre la expresión de la \beta-galactosidasa en un fermentador. Claramente, en un medio a base de glicerol, la presencia o ausencia de la actividad de triptofanasa no tiene ningún efecto sobre el control de la expresión, tal como lo demuestra la primera parte de las curvas de RV308 e ICONE 100, incluso si se constata que el triptófano exógeno desaparece más rápidamente en el cultivo de RV308 que en el de ICONE 100 (datos no mostrados). Sin embargo, el mutante ICONE 200 presenta mejores capacidades para controlar la expresión al comienzo del cultivo: la actividad de \beta-galactosidasa sigue siendo baja durante las 18 primeras horas de cultivo, y después empieza a aumentar a partir de t = 20 h, momento en el que la concentración de triptófano extracelular se hace nula (datos no mostrados). La segunda parte de la curva que se refiere a ICONE 200 muestra que la actividad de \beta-galactosidasa aumenta uniformemente para alcanzar un nivel, al final del cultivo, próximo al obtenido con RV308. Para ello, se demuestra que el sistema de regulación presente en ICONE 200 aporta un control transitorio del promotor de Ptrp plasmídico. Este control, ejercido por el triptófano y/o la fuente de carbono, se queda inoperante en la segunda parte del cultivo, y no actúa contra una expresión máxima de la proteína recombinante.

Ejemplo 5 Control de la expresión de una proteína tóxica

Este ejemplo describe el comportamiento de las cepas RV308 e ICONE 200 en cultivo cuando se transforman mediante un vector que presenta, en dirección 3' del promotor de triptófano, el gen de una proteína tóxica. A título de ejemplo y para ilustrar la invención, el gen de interés es el que codifica la proteína 2B del poliovirus. Se ha descrito que la sobreexpresión de esta proteína modifica la permeabilidad de las membranas en las bacterias (Lama et al., 1992), así como en las células eucariotas (Aldabe et al., 1996), lo que le hace un modelo de elección para estudiar las consecuencias de la pérdida de expresión en E. coli.

El gen que codifica la proteína 2B se amplifica a partir del vector pET3.2B (Lama et al., 1992) mediante una reacción de PCR con la ayuda de los oligonucleótidos siguientes:

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Después, el producto de la amplificación se digiere con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII, y después se clona en un vector de expresión que deriva de pBR322 y que presenta el promotor de triptófano Ptrp. El vector resultante, denominado pVA-polio2B, presenta una secuencia que codifica la proteína 2B fusionada, en su extremo C-terminal, a una cola poli(His), bajo el control del promotor de Ptrp.

El vector pVA-polio2B se introduce en las bacterias de E. coli RV308 e ICONE 200 mediante transformación. Después, se cultiva un clon recombinante de cada construcción en condiciones similares a las descritas en el Ejemplo 4.

Las cinéticas de crecimiento de las bacterias RV308 e ICONE 200 medidas mediante la densidad óptica a 580 nm se presentan en la figura 3. Aparece claramente que RV308 presenta un retraso de crecimiento importante: el tiempo de generación medio en el fermentador durante las primeras 14 horas de cultivo es de 1h45 min., frente a sólo 1h17 min. para ICONE 200. Después de 24 horas de cultivo, la densidad óptica para la cepa RV308 solamente es igual a 13. De manera sorprendente, la cepa ICONE 200 alcanza ella misma una densidad óptica igual a 37 tras 17h30 min. de cultivo, tiempo en el que se efectúa una inducción mediante adición de ácido indol acrílico (IAA) a 25 \mug/ml. El efecto de la inducción es inmediato: la velocidad de consumo de oxígeno cae bruscamente (datos no mostrados), y se detiene el crecimiento.

Se tomaron muestras a distintos tiempos de cultivo, y se analizaron para determinar su contenido de proteína recombinante. Las muestras de biomasa centrifugadas a 8.000 g se recogen mediante un tampón P1 (Tris 25 mM, EDTA 1,1 mM, lisozima 1 mg/ml, pH 8), a razón de 5 ml por 1 g de biomasa. La biomasa se resuspende, se incuba durante 15 min. a temperatura ambiente, y después se somete a una sonicación durante 2 min. El lisado se centrífuga nuevamente (10.000 g, 15 min., 4ºC) para dar una fracción soluble (sobrenadante) y una fracción insoluble (pelete recogido en 200 \mul de tampón P2: Tris 25 mM, EDTA 1 mM, pH 8). Estas muestras se depositan sobre gel de poliacrilamida, y se someten a una electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). Después, el gel se transfiere sobre membrana según la técnica de la transferencia Western, para revelar la presencia de la proteína recombinante. El anticuerpo utilizado es un monoclonal anti- poli(His) acoplado con peroxidasa (Sigma). El revelado se efectúa mediante quimioluminiscencia con el kit ECL+ (Amersham). Las figuras 4A y 4B presentan el resultado de las inmunotransferencias sobre las fracciones insolubles que proceden respectivamente de los cultivos de RV308 e ICONE 200. La figura 4A muestra que la proteína recombinante está presente en todas las muestras, es decir, desde el comienzo del cultivo hasta el tiempo de fermentación t = 24h, incluso aunque no se haya efectuado ninguna inducción mediante IAA. Sin embargo, con ICONE 200, no se detectó ninguna proteína recombinante antes de la inducción (figura 4B). Es solamente después de la inducción mediante IAA que la proteína 2B es detectable (en la fracción insoluble), y que se observa la manifestación de su carácter tóxico. Así, estos resultados demuestran que el ICONE 200 mutante tiene una ventaja evidente con relación a la cepa RV308 de la cual procede, y permite realizar un control eficaz de la expresión en un fermentador.

Ejemplo 6 Producción de una proteína tóxica

Este ejemplo tiene por objetivo demostrar que una proteína tóxica se puede expresar en un cultivo de E. coli ICONE 200 con elevada densidad celular y en condiciones de cultivo adecuadas para una extrapolación industrial. Para ello, se evalúa la cepa de E. coli ICONE 200 transformada mediante el vector pVA-polio2B. Los resultados obtenidos en el Ejemplo 5 indican que las condiciones de inducción se deben de optimizar si se quiere evitar que la expresión se traduzca instantáneamente en una parada del crecimiento, y después en una lisis bacteriana. Por lo tanto, este ejemplo describe distintos ensayos destinados a optimizar el rendimiento de proteína recombinante por unidad de volumen fermentado, ajustando la concentración de inductor y la densidad celular en la inducción. Las condiciones de cultivo utilizadas son las descritas en el Ejemplo 4.

Las combinaciones experimentales ensayadas son las siguientes:

\blacksquare: Experimento nº 1: inducción mediante 25 \mug/ml de IAA cuando la densidad óptica está comprendida entre 30 y 35;

\blacksquare: Experimento nº 2: inducción mediante 5 \mug/ml de IAA cuando la densidad óptica está comprendida entre 30 y 35;

\blacksquare: Experimento nº 3: inducción mediante 25 \mug/ml de IAA cuando la densidad óptica está comprendida entre 60 y 65;

\blacksquare: Experimento nº 4: inducción mediante 5 \mug/ml de IAA cuando la densidad óptica está comprendida entre 60 y 65.

Para cada experimento, se toman muestras de biomasa a distintos tiempos tras la inducción, y se analizan según el siguiente protocolo. Se recogen aproximadamente 20 gramos de biomasa en 100 ml de 1x de tampón de comienzo (preparado a partir de 8x concentrado: 1,42 g Na_{2}HPO_{4}.2H_{2}O, 1,11 g NaH_{2}PO_{4}.H_{2}O, 23,38 g NaCl, c.s. 100 ml, pH 7,4). La suspensión se trata mediante sonicación durante 3 x 5 min., y después se centrífuga durante 30 min. a 20.000 g y 4ºC. El pelete se recoge en 15 ml de tampón de comienzo + guanidina-HCl 6 M + 0,1% SB3-14 (1-propanosulfonato de N-tetradecil-N,N-dimetil-3-amonio, Sigma), y después se incuba en hielo durante 1 hora. La suspensión se centrífuga durante 1 hora a 30.000 g y 4ºC. El sobrenadante se filtra sobre 0,45 \mu a fin de purificarlo mediante cromatografía de afinidad de metal quelatado. Se cargó una columna que contiene 1 ml de gel (HiTrap Chelating, Amersham Pharmacia Biotech) con 1 ml de NiSO_{4} 0,1 M, se lavó con 5 ml de agua, y después se equilibró con 30 ml de tampón de comienzo + guanidina-HCl 6 M + 0,1% SB3-14. Después, la muestra se cargó sobre la columna. Un aclarado con 60 ml de tampón de lavado (tampón de comienzo + guanidina-HCl 6 M + 0,1% SB3-14 + imidazol 20 mM) permite eliminar la mayoría de las proteínas fijadas mediante interacciones no específicas. La proteína recombinante polio-2B se eluye con 10 x 1 ml de tampón de elución (tampón de comienzo + guanidina-HCl 6 M + 0,1% SB3-14 + imidazol 300 mM). Las fracciones más concentradas en proteínas se agrupan y después se desalifican sobre gel de Sephadex G-25 (columnas PD10, Amersham Pharmacia Biotech). La calidad y la cantidad de proteína polio-2B así obtenida se estiman respectivamente mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) y mediante una evaluación de las proteínas totales (método con BCA, Pierce).

La figura 5 presenta un gel SDS coloreado con azul de Coomassie de las proteínas polio-2B extraídas y purificadas tras los experimentos 1 a 4 descritos anteriormente. El tamaño de la proteína recombinante corresponde al tamaño teórico (11 kDa) predicho a partir de su secuencia codificante. Además, corresponde al tamaño de la proteína mayoritaria observada en la transferencia Western después de la inducción, en el lisado de E. coli ICONE 200 x pVApolio-213 (figura 4B). Por lo tanto, es a priori posible que las proteínas visibles en la figura 5 correspondan a la proteína 2B del poliovirus fusionada a una cola de polihistidina. Por otra parte, la calidad de las proteínas obtenidas es idéntica en todas las condiciones de inducción ensayadas.

La tabla 3 siguiente resume los resultados obtenidos combinando distintos factores tales como la densidad óptica en la inducción, la concentración de inductor, y el tiempo de cultivo después de la inducción.

TABLA 3 Influencia de la densidad óptica en la inducción, de la concentración de inductor y del tiempo después de la inducción, sobre el rendimiento de expresión de una proteína tóxica (ejemplo de polio-2B)

Nº de	Densidad óptica (580 nm)	Concentración	Tiempo después	Cantidad de proteína
experimento	del cultivo en el	de inductor	de la inducción	extraída y purificada
	momento de la inducción	(IAA, mg/l)	(HH:MM)	(mg por litro de medio)
1	32,5	25	00:45	3
			01:45	2
2	32,5	5	00:45	6
			01:45	6
3	62,5	25	00:45	5,5
			02:45	7,5
4	63,5	5	00:45	6
			02:50	9

Comparando los grupos de los experimentos (1-2) y (3-4), se observa que cuanto más tarde se realiza la inducción, mayor es el rendimiento de la expresión. Esto confirma la ventaja de hacer crecer la biomasa lo más posible antes de poner en marcha la inducción. En el caso de los experimentos (3-4), se consume aproximadamente 70% de sustrato carbonado en el momento en el que la expresión de la proteína de polio-2B se pone en marcha. Con una cepa tal como ICONE 200, la fase de crecimiento celular y la fase de expresión están totalmente separadas, lo que permite optimizar el rendimiento de proteína recombinante, incluso cuando esta proteína es tóxica.

Paralelamente con el tiempo de inducción, la concentración de inductor es igualmente un parámetro que influye. El mejor resultado de expresión obtenido en este ejemplo corresponde al experimento nº 4, en el que la concentración de inductor con relación al número de células es la más baja (5 mg/l dIAA para un cultivo cuya densidad óptica es igual a 63,5). Es igualmente en este experimento que el efecto tóxico de la expresión de polio-2B es el menos marcado, puesto que el cultivo continúa desarrollándose después de la inducción, mientras que el crecimiento se detiene completamente en todos los demás experimentos (véase figura 6). Por lo tanto, es particularmente importante ajustar las condiciones de inducción de una proteína tóxica, a fin de encontrar el óptimo entre una concentración de inductor demasiado baja para dar lugar a una expresión significativa, y una concentración demasiado elevada que provoca la detención inmediata del metabolismo bacteriano. Comparando los resultados de los experimentos nº 4 y nº 1, se observa que una inducción más tardía (DO = 63,5 frente a 32,5) y menos fuerte (concentración de IAA igual a 5 mg/l frente a 25 mg/l) permite multiplicar por un factor de 3 a 4 la cantidad de proteína recombinante obtenida por unidad de volumen fermentado.

La cepa de E. coli ICONE 200, obtenida mediante modificación genética según la invención de una cepa de interés industrial, permite controlar estrictamente la expresión de cualquier gen colocado en un vector plasmídico en dirección 3' del promotor de triptófano Ptrp. Este control es transitorio porque esta mediado por el triptófano exógeno aportado en el cultivo. El potencial de inducción de Ptrp en ICONE 200 se conserva y sigue siendo modulable por la concentración de IAA. Gracias a estas características, ICONE 200 permite la expresión controlada de proteínas recombinantes en condiciones de cultivo extrapolables a grandes escalas.

Bibliografía

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Claims

1. Procedimiento de producción de una proteína recombinante de interés cuyo gen se pone bajo el control del promotor Ptrp del operón triptófano, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a): transformar una célula procariota mediante un vector que contiene una secuencia de ácidos nucleicos que, cuando dicha secuencia de ácidos nucleicos se introduce en dicha célula huésped, modifica el gen que codifica la TnaA triptofanasa de la célula huésped, de tal manera que esta modificación provoca la pérdida de la actividad de triptofanasa de dicha célula huésped, siendo el producto de expresión de dicho gen modificado incapaz de degradar el triptófano en indol, y a la integración de dicha secuencia en el ADN de dicha célula huésped; y, previa, posterior o simultáneamente, introducir en dicha célula procariota todo o parte de la secuencia de un promotor seguido en 3' de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de naturaleza ribonucleotídica o proteica, y que actúa negativamente sobre el promotor de Ptrp o su producto de transcripción, siendo dicha molécula de naturaleza ribonucleotídica, y que actúa negativamente en el promotor de Ptrp seleccionada entre las secuencias siguientes:

12

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: siendo dicha molécula de naturaleza proteica, y que actúa negativamente sobre el promotor de Ptrp, elegida de la secuencia que codifica el aporrepresor TrpR del operón triptófano de dicha célula huésped o uno de sus fragmentos biológicamente activos que ha conservado su actividad represora;

2. Procedimiento de producción de una proteína recombinante de interés según la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácidos nucleicos capaz de desactivar el gen que codifica una TnaA triptofanasa se introduce en el ADN de la célula huésped procariota.

3. Procedimiento de producción de una proteína recombinante de interés según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha secuencia de ácidos nucleicos en dicha célula huésped se introduce sin más elementos de ADN que permitiría asociarle una ventaja selectiva.

4. Procedimiento de producción de una proteína recombinante de interés según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha secuencia de ácidos nucleicos introducida en dicha célula huésped se introduce en el locus del operón de triptofanasa.

5. Procedimiento de producción de una proteína recombinante de interés según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicho procedimiento comprende además, entre la etapa a) y b), una etapa de resolución y de cribado.

6. Procedimiento de producción según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la inducción de dicho promotor seguido en 3' de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de naturaleza ribonucleotídica o proteica, y que actúa negativamente sobre el promotor de Ptrp o su producto de transcripción, se obtiene:

a): seleccionando una fuente de carbono adecuada en el medio de cultivo; o

b): añadiendo triptófano al medio de cultivo; o

c): mediante una combinación de a) y b);

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la célula huésped procariota es una bacteria Gram negativa.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la célula huésped procariota es E. coli.

9. Construcción para la expresión de un gen que codifica una proteína recombinante de interés puesto bajo el control del promotor de Ptrp del operón triptófano en una célula huésped procariota,

-: caracterizada porque la construcción comprende una secuencia de ácidos nucleicos que, cuando dicha secuencia de ácidos nucleicos se introduce en dicha célula huésped, modifica el gen que codifica la TnaA triptofanasa de la célula huésped, de tal manera que esta modificación conlleva la pérdida de la actividad triptofanasa de dicha célula huésped, siendo el producto de expresión de dicho gen modificado incapaz de degradar triptófano en indol, y

-: caracterizada porque dicha secuencia de ácidos nucleicos, capaz de desactivar el gen que codifica una TnaA triptofanasa cuando dicha secuencia de ácidos nucleicos se introduce en dicha célula huésped, es la secuencia de ácidos nucleicos que comprende todo o parte de la secuencia de un promotor seguido en 3' de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de naturaleza ribonucleotídica o proteica, y que actúa negativamente sobre el promotor de Ptrp o su producto de transcripción, siendo dicha molécula de naturaleza ribonucleotídica, y que actúa negativamente sobre el promotor de Ptrp elegida entre las secuencias siguientes:

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siendo dicha molécula de naturaleza proteica, y que actúa negativamente sobre el promotor de Ptrp, elegida de la secuencia que codifica el aporrepresor TrpR del operón triptófano de dicha célula huésped o de uno de sus fragmentos biológicamente activos que haya conservado su actividad represora.

10. Construcción según la reivindicación 9, caracterizada porque comprende además, corriente arriba de dicha secuencia de ácidos nucleicos capaz de desactivar el gen que codifica una TnaA triptofanasa cuando dicha secuencia de ácidos nucleicos se introduce en dicha célula huésped, todo o parte de la secuencia de ácidos nucleicos del promotor de Ptna del operón triptofanasa.

11. Construcción según la reivindicación 9 ó 10, caracterizada porque dicha secuencia de ácidos nucleicos capaz de desactivar el gen que codifica una TnaA triptofanasa cuando dicha secuencia de ácidos nucleicos se introduce en dicha célula huésped, comprende un fragmento mutado de la secuencia que codifica dicha TnaA triptofanasa.

12. Construcción según la reivindicación 11, caracterizada porque dicho fragmento mutado se obtiene mediante inserción de un codón de terminación en una posición tal que la secuencia del fragmento mutado así obtenido codifica un fragmento proteico desprovisto de actividad de triptofanasa.

13. Construcción según la reivindicación 11 ó 12, caracterizada porque dicho fragmento mutado es un fragmento mutado de la secuencia que codifica la TnaA triptofanasa de dicha célula huésped.

14. Construcción según la reivindicación 9, caracterizada porque dicho promotor seguido en 3' de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de naturaleza ribonucleotídica o proteica, que actúa negativamente sobre el promotor de Ptrp, es todo, o una parte que permite una actividad promotora, del promotor de Ptna del operón triptofanasa.

15. Construcción según la reivindicación 14, caracterizada porque dicha secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de naturaleza ribonucleotídica o proteica, y que actúa negativamente sobre el promotor de Ptrp, es la secuencia que codifica el aporrepresor TrpR del operón triptófano o de uno de sus fragmentos biológicamente activos.

16. Vector que contiene una construcción según una de las reivindicaciones 9 a 15.

17. Vector según la reivindicación 16, caracterizado porque se trata del vector pMAK705[tnaAt] o del vector pMAK705[Ptna:trpR:3'tna],

-: estando dicho vector pMAK705[tnaAt] constituido del vector pMAK705, cuya secuencia se identifica en GenBank con el número de acceso AF519766, comprendiendo este vector un fragmento de ADN del gen que codifica la TnaA triptofanasa, denominado tnaAT, que se extiende desde la posición -275 hasta la posición +1054 con relación al primer nucleótido de la secuencia que codifica la tnaA amplificado con la ayuda de los dos pares de cebadores Trp5 (sentido)/Trp2 y Trp3/Trp4; y

-: estando dicho vector pMAK705[Ptna:trpR:3'tna] constituido del vector pMAK705, comprendiendo este vector tres subunidades, la primera subunidad situada en el promotor Ptna que se extiende desde la posición -511 hasta la posición +3 con respecto al primer nucleótido de la secuencia que codifica la tnaA, y amplificada a partir del par de cebadores TrpR1/TrpR2, una segunda subunidad que corresponde a la secuencia que codifica el gen de trpR de E. coli, y amplificada a partir de los cebadores TrpR3/TrpR4, y una tercera subunidad que corresponde a la secuencia situada inmediatamente en 3' de la secuencia que codifica la tnaA, y amplificada a partir de los cebadores TrpR5/TrpR6,

teniendo estos pares de cebadores las secuencias:

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18. Célula huésped procariota transformada mediante un vector según una de las reivindicaciones 16 a 17.

19. Célula huésped procariota según la reivindicación 18, caracterizada porque se trata de E. coli.

20. Utilización de una bacteria transformada mediante un vector según una de las reivindicaciones 16 y 17, para la producción de proteínas recombinantes.