JP2008518623A - メッセンジャーrna干渉酵素が促進する生細胞における単一タンパク質産生 - Google Patents
メッセンジャーrna干渉酵素が促進する生細胞における単一タンパク質産生 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本願は、2004年11月4日に出願された、Inouyeらによる「mRNA干渉酵素によって促進される生細胞における単一タンパク質」と題された米国仮出願第60/624976号への優先権を主張する。この出願の全開示は、参照によって本明細書中に組み込まれる。
略語「ACA」は、アデニン−シトシン−アデニン配列をいう。
本明細書中で使用される場合、ある特定の核酸に関して、用語「コードする」、「コードしている」または「コードされる」は、特定のタンパク質に翻訳されるために核酸中に保存された情報をいう。タンパク質をコードする核酸は、核酸の翻訳領域内に非翻訳配列(例えばイントロン)を含んでもよく、またはかかる介在非翻訳配列を欠失していてもよい(例えば、cDNAでのように)。タンパク質をコードする情報は、コドンの使用によって特定される。典型的にはアミノ酸配列は、核酸により「ユニバーサル」遺伝子コードを用いてコードされる。
以下の実施例は、本発明をどのようにして行い、使用するかの完全な開示および説明を当業者に提供するよう提出され、本発明者らがその発明と見なすものの範囲を限定することを意図せず、また、下記の実験が行われた全てまたは唯一の実験であることを表すことを意図しない。使用した数(例えば、量、温度等)に関しては正確を期したが、いくつかの実験誤差および偏りが計上されるべきである。他に示されなければ、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧または大気圧近くである。
下記の実験において、大腸菌BL21(DE3)細胞を用いた。mazF遺伝子を、pACYCDuet(Novagen)のNdeI−XhoI部位にクローニングして、プラスミドpACYCmazFを作製した。pACYCmazFを鋳型として用いた部位特異的変異誘発によって、pACYCmazF(−9ACA)を構築した。最適な大腸菌コドン使用頻度(図2A参照)に基づいてエオタキシン遺伝子を合成し、pColdI(SP−1)のNdeI−HindIII部位にクローニングして、プラスミドpColdI(SP−1)エオタキシンを作製した。pColdI(エオタキシン)を鋳型として用いた部位特異的変異誘発によって、テキストに記載されるように、pColdI(SP−1)エオタキシンを構築した。QuickChange部位特異的変異誘発キット(Stratagene)のための使用説明書に従って、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて変異誘発を行った。pColdI(SP−1)エオタキシンを鋳型として用いた部位特異的変異誘発によって、pColdI(SP−2)エオタキシンもまた構築した。pColdI(SP−1)エオタキシンを鋳型として用いた部位特異的変異誘発によって、pColdI(SP−1)エオタキシン(+ACA)を構築した。野生型Hsp10遺伝子を、酵母染色体を鋳型として用いたPCRによって増幅し、pColdI(SP−2)のNdeI−BamHI部位にクローニングして、プラスミドpColdI(SP−2)Hsp10を作製した。酵母染色体を鋳型として用いた二段階PCRによって無ACAHsp10遺伝子を増幅し、pColdI(SP−2)のNdeI−BamHI部位にクローニングしてプラスミドpColdI(SP−2)Hsp10(−ACA)を作製した。鋳型として野生型Rpb12プラスミド、および変化した配列を含有する5’および3’オリゴヌクレオチドを用いたPCRによって野生型および無ACARpb12遺伝子を増幅しpColdI(SP−2)のNdeI−BamHI部位にクローニングして、プラスミドpColdI(SP−2)Rpb12およびpColdI(SP−2)Rpb12(−ACA)をそれぞれ作製した。二段階PCRによって無ACALspA遺伝子を増幅し、pColdI(SP−2)のNdeI−BamHI部位にクローニングしてプラスミドpColdIV(SP−2)lspA(−ACA)を作製した。
インビボでのタンパク質合成のアッセイ
1mlの培養物から遠心分離(10,000×gで5分間)によって採取した細胞を、10mM Tris−HCl(pH7.5)に懸濁し、超音波によって破砕した。破壊されなかった細胞を除去した後、全膜画分を、遠心分離(100,000×gで60分間)によって得た。
pACYCmazFを担持している大腸菌BL21(DE3)細胞を、pColdI(SP−1)エオタキシン(1Aおよび1Bの左パネル)またはpColdI(SP−2)エオタキシン(1Bの右パネルおよび1C)のいずれかで形質転換した。細胞をM9培地中、37℃で増殖させた。OD600が0.5で、培養物を15℃に移し、15℃で45分間インキュベートして細胞を低温に順化させた後、IPTG(1mM)を添加して、エオタキシンおよびMazF発現の両方を誘導した(時間0)。各ゲルの上部に示される時点で、細胞を35S−メチオニンで15分間パルスラベルし、全細胞タンパク質をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE)と、それに続くオートラジオグラフィによって解析した。
本発明者らは、ACA配列を含まないよう操作されたmRNAをMazF誘発細胞中で発現させた場合にmRNAが細胞中で安定して維持されて、他のいかなる細胞タンパク質も産生することなく、mRNAによってコードされるタンパク質が産生され得ると推測した。この可能性を試験するために、本発明者らは、アミノ酸配列を変化させることなく遺伝子中の全てのACA配列を排除して、ヒトエオタキシンの遺伝子を合成した。図2Aは、ヒトエオタキシンのアミノ酸配列およびその遺伝子のヌクレオチド配列を示す。ヌクレオチド配列は、好ましい大腸菌コドンを用いて設計し、下線を引いたトリプレットを、下記の実験においてACAに変化させた。ACA配列は、リーディングフレーム中のACA配列の位置にかかわらず、タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく他のMazF切断不可能配列に変えることができる。これは64種の可能性のあるトリプレット配列の中で類がないものである。
図1で観察されるMazF誘発細胞における排他的エオタキシン産生が、ACAを持たないエオタキシンmRNAによることを確認するために、図2Aに示されるように、エオタキシン遺伝子に、そのアミノ酸配列を変化させることなく、5つの本来のACA配列を付加した。pColdI(SP−2)の使用によってエオタキシン遺伝子を発現させ、図1に記載されているのと同様にして細胞を処理し、[35S]−メチオニンで標識した。左パネルは、無ACAエオタキシン遺伝子の結果を示し(図1Bの左パネルと同じである)、右パネルは5つのACA配列を有するエオタキシン遺伝子の結果を示す。
本発明者らは、SPPシステムを2つの酵母タンパク質、熱ショック因子Hsp10およびRNAポリメラーゼサブユニットRpb12に適用した。Hsp10およびRpb12のORFは、それぞれ3つおよび1つのACAを含み、それらのアミノ酸配列を変化させることなく、これをMazF切断不可能配列に転換した(図4A)。これらおよび野生型配列をそれぞれpColdI(SP−2)に挿入した。得られたプラスミドを、それぞれ、野生型Hsp10に対してpColdI(SP−2)Hsp10、変異Hsp10に対してpColdI(SP−2)Hsp10(−1ACA)、野生型Rpb12に対してpColdI(SP−2)Rpb12、およびpColdI(SP−2)Rpb12(−3ACA)と名づけた。これらのプラスミドで、pACYCmazFを含む大腸菌BL21(DE3)を個々に形質転換した。次いでタンパク質発現パターンを、15℃で48時間調べた。
本発明者らは、SPPシステムを微量内在性膜タンパク質へ適用しようと試みた。本発明者らは、リポタンパク質のシグナルペプチドの切断に特異的に必要とされる、大腸菌中のシグナルペプチダーゼIIの遺伝子lspAを選択した(TokudaおよびMatsuyama、Biochem.Biophys.Acta 1693:5〜13頁(2004年))。大腸菌は、合計96種のリポタンパク質を含み、これらは、成熟したリポタンパク質の第2のアミノ酸残基の性質(酸性であるか中性であるか)により、内膜または外膜のいずれかで集合することが知られている(YamaguchiおよびInouye、Cell 53:423〜432頁(1988年)、TokudaおよびMatsuyama、Biochem.Biophys.Acta 1693:5〜13頁(2004年))。他の全ての分泌タンパク質のシグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼI(リーダーペプチダーゼ)によって切断されるが、これは大腸菌中に1細胞あたり500分子のレベルでしか存在しないと推定される(Wolfeら、J.Biol.Chem.257:7898〜7902頁(1982年))。
本研究は、mRNA干渉酵素による細胞タンパク質合成の完全な阻害が、細胞生理機能劣化効果がないことを示す。MazFによりほとんど全ての細胞mRNAがACA配列で切断される結果として、細胞タンパク質合成は完全にブロックされ、これは言い換えると、完全な細胞増殖停止につながる。しかし驚いたことに、MazF誘発によって増殖停止された細胞は、mRNAがACA配列を有さないように改変されていれば、タンパク質合成を高レベルで長時間にわたって(15℃で少なくとも96時間)行う能力があることがわかった。このようにして、本発明者らは、インビボでの単一タンパク質産生(SPP)を確立することに初めて成功した。
Claims (68)
- 形質転換可能生細胞において非標的細胞タンパク質合成を減少させながら単一標的タンパク質を発現するためのシステムであって、
(a)第1のmRNA干渉酵素認識配列を少なくとも1つ有する細胞mRNAを含む単離された形質転換可能生細胞;
(b)mRNA干渉酵素ポリペプチドをコードする単離された核酸配列を含む第1の発現ベクター、ここでmRNA干渉酵素ポリペプチドをコードする単離された核酸配列は、少なくとも1つの第2のmRNA干渉酵素認識配列を代替のトリプレットコドン配列で置換することによって変異されて変異mRNA干渉酵素ポリペプチドをコードする変異核酸配列となる;
(c)任意に、標的タンパク質をコードする単離された核酸配列を含む第2の発現ベクター、ここで標的タンパク質をコードする単離された核酸配列は、少なくとも1つの第3のmRNA干渉酵素認識配列が代替のトリプレットコドン配列で置換されて変異されて、変異標的タンパク質をコードする変異核酸配列を生じる;
を含んでなり、単離された細胞が第1の発現ベクターおよび第2の発現ベクターで形質転換されており、単離された細胞が、細胞における変異標的タンパク質の発現を可能にする条件下で維持されることを特徴とするシステム。 - 第1および第2の発現ベクターが、それぞれ少なくとも1つの調節配列をさらに含む、請求項1に記載のシステム。
- 少なくとも1つの調節配列が、少なくとも1つの誘導性プロモーターである、請求項2に記載のシステム。
- 第1の発現ベクターにおける少なくとも1つの誘導性プロモーターが、変異mRNA干渉酵素ポリペプチドをコードする変異核酸配列に動作可能に連結されている、請求項3に記載のシステム。
- 第2の発現ベクターにおける少なくとも1つの誘導性プロモーターが、変異標的タンパク質をコードする変異核酸配列に動作可能に連結されている、請求項3に記載のシステム。
- (b)における変異核酸配列が、非変異mRNA干渉酵素ポリペプチドのアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を有する変異mRNA干渉酵素ポリペプチドをコードする、請求項1に記載のシステム。
- (c)における変異核酸配列が、非変異標的タンパク質のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を有する変異標的タンパク質をコードする、請求項1に記載のシステム。
- 変異mRNA干渉酵素ポリペプチドが細胞において発現された場合に細胞メッセンジャーRNA中の少なくとも1つの第1のmRNA干渉酵素認識配列を認識する、請求項1に記載のシステム。
- 細胞メッセンジャーRNAが変異mRNA干渉酵素ポリペプチドによって選択的に切断され、それによって非標的細胞タンパク質合成が減少する、請求項1に記載のシステム。
- 第1のmRNA干渉酵素認識配列、第2のmRNA干渉酵素認識配列および第3のmRNA干渉酵素認識配列が同じmRNA干渉酵素認識配列である、請求項1に記載のシステム。
- mRNA干渉酵素認識配列がアデニン−シトシン−アデニンである、請求項10に記載のシステム。
- 変異標的タンパク質をコードする、発現されたメッセンジャーRNAが、細胞中で安定して維持される、請求項1に記載のシステム。
- 変異標的タンパク質をコードする変異核酸配列がさらに変異されてレアコドンを好ましいコドンに置換して二重変異核酸配列を生じ、二重変異核酸配列が、非変異標的タンパク質のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を有する二重変異標的タンパク質をコードする、請求項1に記載のシステム。
- 二重変異標的タンパク質をコードする二重変異核酸配列が、二重変異標的タンパク質をコードする二重変異核酸配列に動作可能に連結されている誘導性プロモーターを含む、請求項13に記載のシステム。
- 二重変異標的タンパク質をコードする、発現されたメッセンジャーRNAが、細胞中で安定して維持される、請求項13に記載のシステム。
- 変異mRNA干渉酵素ポリペプチドをコードする変異核酸配列がさらに変異されてレアコドンを好ましいコドンに置換して二重変異核酸配列を生じ、二重変異核酸配列が、非変異mRNA干渉酵素ポリペプチドのアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を有する二重変異mRNA干渉酵素ポリペプチドをコードする、請求項1に記載のシステム。
- 二重変異標的タンパク質をコードする二重変異核酸配列が、二重変異mRNA干渉酵素ポリペプチドをコードする二重変異核酸配列に動作可能に連結されている誘導性プロモーターを含む、請求項16に記載のシステム。
- 細胞が哺乳動物細胞である、請求項1に記載のシステム。
- 細胞が真核細胞である、請求項1に記載のシステム。
- 細胞が原核細胞である、請求項1に記載のシステム。
- 細胞が大腸菌細胞である、請求項20に記載のシステム。
- 変異mRNA干渉酵素ポリペプチドがMazFである、請求項1に記載のシステム。
- 変異mRNA干渉酵素ポリペプチドがMazFの機能的断片である、請求項1に記載のシステム。
- 変異mRNA干渉酵素ポリペプチドがMazFの機能的バリアントである、請求項1に記載のシステム。
- 標的タンパク質が哺乳動物タンパク質である、請求項1に記載のシステム。
- 哺乳動物タンパク質がヒトタンパク質である、請求項25に記載のシステム。
- 標的タンパク質が酵母タンパク質である、請求項1に記載のシステム。
- 標的タンパク質が微量細菌タンパク質である、請求項1に記載のシステム。
- 標的タンパク質が、毒性の少量タンパク質である、請求項28に記載のシステム。
- 細胞が、少なくとも1つの放射性標識同位元素を含む培地中で維持される、請求項1に記載のシステム。
- 変異タンパク質が、発現された場合に放射性同位元素標識される、請求項30に記載のシステム。
- 標的タンパク質をコードする単離された核酸配列がポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される、請求項1に記載のシステム。
- (a)mRNA干渉酵素ポリペプチドをコードする単離された核酸配列を変異させて少なくとも1つの第1のmRNA干渉酵素認識配列を代替のトリプレットコドン配列で置換して、変異mRNA干渉酵素ポリペプチドをコードする変異核酸配列を生じる工程、
(b)標的タンパク質をコードする単離された核酸配列を変異させて少なくとも1つの第2のmRNA干渉酵素認識配列を代替のトリプレットコドン配列で置換して、変異標的タンパク質をコードする変異核酸配列を生じる工程、
(c)工程(a)の変異核酸配列を含む第1の発現ベクターおよび工程(b)の変異核酸配列を含む第2の発現ベクターを提供する工程、
(d)少なくとも1つの第3のmRNA干渉酵素認識配列を含む細胞メッセンジャーRNA配列を有する、単離された、形質転換可能生細胞を提供する工程、
(e)第1の発現ベクターおよび第2の発現ベクターを、単離された、形質転換可能生細胞に導入する工程、
(f)変異mRNA干渉酵素ポリペプチドを発現させる工程、ならびに
(g)単離された細胞を、細胞における変異標的タンパク質の発現を可能にする条件下で維持する工程
を含む、単離された生細胞における標的タンパク質の発現を増大させる方法。 - 第1および第2の発現ベクターが、それぞれ少なくとも1つの調節配列をさらに含む、請求項33に記載の方法。
- 少なくとも1つの調節配列が少なくとも1つの誘導性プロモーターである、請求項34に記載の方法。
- 第1の発現ベクターにおける誘導性プロモーターが、変異mRNA干渉酵素ポリペプチドをコードする変異核酸配列に動作可能に連結されている、請求項35に記載の方法。
- 変異mRNA干渉酵素ポリペプチドをコードする変異核酸配列に動作可能に連結された誘導性プロモーターを誘導因子で誘導して変異mRNA干渉酵素ポリペプチドを発現させる工程をさらに含む、請求項36に記載の方法。
- 変異mRNA干渉酵素ポリペプチドが細胞メッセンジャーRNAを選択的に切断し、それによって非標的細胞タンパク質合成を減少させる、請求項37に記載の方法。
- 第2の発現ベクターにおける誘導性プロモーターが、変異標的タンパク質をコードする変異核酸配列に動作可能に連結されている、請求項35に記載の方法。
- 変異標的タンパク質をコードする変異核酸配列に動作可能に連結された誘導性プロモーターを誘導因子で誘導して変異標的タンパク質を発現させる工程をさらに含む、請求項39に記載の方法。
- 第1の発現ベクターにおける誘導性プロモーターが変異mRNA干渉酵素ポリペプチドをコードする変異核酸配列に動作可能に連結されており、第2の発現ベクターにおける誘導性プロモーターが変異標的タンパク質をコードする変異核酸配列に動作可能に連結されており、さらに以下の工程:
変異mRNA干渉酵素ポリペプチドをコードする変異核酸配列に動作可能に連結された誘導性プロモーターを第1の誘導因子で誘導して変異mRNA干渉酵素ポリペプチドを発現させる工程、および
変異標的タンパク質をコードする変異核酸配列に動作可能に連結された誘導性プロモーターを第2の誘導因子で誘導して変異標的タンパク質を発現させる工程
を含む、請求項33に記載の方法。 - 細胞が第1の発現ベクターおよび第2の発現ベクターでコトランスフェクションされる、請求項33に記載の方法。
- 工程(a)が、
変異mRNA干渉酵素ポリペプチドをコードする変異核酸配列をさらに変異させてレアコドンを好ましいコドンで置換して、非変異mRNA干渉酵素ポリペプチドのアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を有する二重変異mRNA干渉酵素をコードする二重変異核酸配列を生じる工程
をさらに含む、請求項33に記載の方法。 - 工程(b)が、
変異標的タンパク質をコードする変異核酸配列をさらに変異させてレアコドンを好ましいコドンで置換して、非変異標的タンパク質のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を有する二重変異標的タンパク質をコードする二重変異核酸配列を生じる工程
をさらに含む、請求項33に記載の方法。 - 工程(a)が、
変異mRNA干渉酵素ポリペプチドをコードする変異誘導性核酸配列をさらに変異させてレアコドンを好ましいコドンで置換して、非変異mRNA干渉酵素ポリペプチドのアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を有する二重変異mRNA干渉酵素をコードする二重変異誘導性核酸配列を生じる工程
をさらに含み、
工程(b)が、
変異標的タンパク質をコードする変異核酸配列をさらに変異させてレアコドンを好ましいコドンで置換して、非変異標的タンパク質のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を有する二重変異標的タンパク質をコードする二重変異核酸配列を生じる工程
をさらに含む、
請求項33に記載の方法。 - 第1の発現ベクターの二重変異mRNA干渉酵素ポリペプチドをコードする二重変異核酸配列が、二重変異mRNA干渉酵素ポリペプチドをコードする二重変異核酸配列に動作可能に連結された第1の誘導性プロモーターを含み、第2の発現ベクターの二重変異標的タンパク質をコードする二重変異核酸配列が、二重変異標的タンパク質をコードする二重変異核酸配列に動作可能に連結された第2の誘導性プロモーターを含む、請求項45に記載の方法。
- 二重変異mRNA干渉酵素ポリペプチドをコードする二重変異核酸配列に動作可能に連結された第1の誘導性プロモーターを第1の誘導因子で誘導して二重変異mRNA干渉酵素ポリペプチドを発現させる工程、および
二重変異標的タンパク質をコードする二重変異核酸配列に動作可能に連結された第2の誘導性プロモーターを第2の誘導因子で誘導して二重変異標的タンパク質を発現させる工程
をさらに含む、請求項46に記載の方法。 - 工程(a)における少なくとも1つの第1のmRNA干渉酵素認識配列、工程(b)における少なくとも1つの第2のmRNA干渉酵素認識配列、および工程(d)における少なくとも1つの第3のmRNA干渉酵素認識配列が、同じmRNA干渉酵素認識配列である、請求項33に記載の方法。
- 工程(a)、(b)および(d)におけるmRNA干渉酵素認識配列がアデニン−シトシン−アデニンである、請求項48に記載の方法。
- 工程(g)において、変異標的タンパク質をコードするメッセンジャーRNAが細胞中で安定して維持される、請求項33に記載の方法。
- 工程(g)において、二重変異標的タンパク質をコードするメッセンジャーRNAが細胞中で安定して維持される、請求項45に記載の方法。
- 細胞が真核細胞である、請求項33に記載の方法。
- 細胞が哺乳動物細胞である、請求項52に記載の方法。
- 細胞が原核細胞である、請求項33に記載の方法。
- 細胞が大腸菌細胞である、請求項54に記載の方法。
- 変異mRNA干渉酵素ポリペプチドがMazFである、請求項33に記載の方法。
- 変異mRNA干渉酵素ポリペプチドがMazFの機能的断片である、請求項33に記載の方法。
- 変異mRNA干渉酵素ポリペプチドがMazFの機能的バリアントである、請求項33に記載の方法。
- 二重変異mRNA干渉酵素ポリペプチドがMazFである、請求項45に記載の方法。
- 二重変異mRNA干渉酵素ポリペプチドがMazFの機能的断片である、請求項45に記載の方法。
- 二重変異mRNA干渉酵素ポリペプチドがMazFの機能的バリアントである、請求項45に記載の方法。
- 標的タンパク質が哺乳動物タンパク質である、請求項33に記載の方法。
- 標的タンパク質がヒトタンパク質である、請求項62に記載の方法。
- 標的タンパク質が酵母タンパク質である、請求項33に記載の方法。
- 標的タンパク質が微量細菌タンパク質である、請求項33に記載の方法。
- 標的タンパク質が、毒性の少量タンパク質である、請求項65に記載の方法。
- 工程(g)の間に少なくとも1つの放射性標識同位元素を含む培地中で細胞をインキュベートする工程をさらに含む、請求項33に記載の方法。
- 工程(b)における標的タンパク質をコードする単離された核酸配列をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する工程をさらに含む、請求項33に記載の方法。
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