CN101052713A - 通过信使rna干扰酶促进活细胞内的单蛋白生成 - Google Patents

Abstract

本发明描述了活大肠杆菌细胞中的单蛋白生成(SPP)系统，其利用了mRNA干扰酶例如MazF的独特性能，MazF是一种细菌毒素，它是一种单链RNA和ACA特异性的核糖核酸内切酶，它在体内有效地和选择性地降解所有的细胞mRNA，造成了总蛋白合成的显著下降。MazF和被遗传工程改造成编码无ACA的mRNA的靶基因的伴随表达造成了持续的和高水平的(高达90％)目标表达，并基本上缺乏背景的细胞蛋白合成。值得注意的是，目标合成持续了至少4天，说明细胞尽管生长停滞但仍保留了转录和翻译的能力。SPP技术非常适用于酵母和人类蛋白，甚至是细菌的整合膜蛋白。这个新系统使得能够获得空前高的信噪比，这将显著地简化先前棘手的但生物学重要的蛋白的结构和功能研究。

Description

通过信使RNA干扰酶促进活细胞内的单蛋白生成

与相关申请的交叉引用

本申请要求Inouye等在2004年11月4日提交的题为“通过mRNA干扰酶促进活细胞内的单蛋白生成”的美国临时申请No.60/624,976的优先权。在此通过引用将其全部内容并入本申请。

技术领域

本发明涉及用于通过mRNA干扰酶(interferase)促进活细胞内单蛋白生成的系统，所述mRNA干扰酶是单链RNA以及序列特异性的核糖核酸内切酶。

背景技术

大多数细菌都含有自杀基因，所述基因在暴露于细胞应激之后的表达造成了生长停滞以及最终的死亡(综述见Elenberg-Kulka和Gerdes，Ann.Rev.Microbiol.53：43-70(1999)；Engelberg-Kulkaet al.，Trends Microbiol.12：66-71(2004))。这些毒素基因通常与同一操纵子中的它们的同源抗毒素基因共表达(称作成瘾(addiction)模块或抗毒素-毒素系统)。大肠杆菌具有5个成瘾模块(Christensen et al.，J.Mol.Biol.332：809-19(2003))，其中MazE/MazF模块已经被最广泛地研究。MazE/MazF复合物的x线结构是已知的(Kamada et al.，Mol.Cell 11：875-84(2003))，并且最近已经表征了MazF的酶活性(Zhang et al，J.Biol.Chem.278：32300-306(2003))。

MazF是一种序列特异性的核糖核酸内切酶，其特异性地在ACA序列处切割单链RNA(ssRNA)。核糖核酸内切酶是一大组在核酸链内的位置处切割核酸的酶中之一。核糖核酸内切酶或核糖核酸酶对RNA是特异性的。MazF被称作mRNA干扰酶，因为它在体内的主要靶标是信使RNA(mRNA)。转移RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)似乎受到保护不被切割，分别是因为它们的二级结构或者它们与核糖体蛋白相结合。因此，MazF表达引起了mRNA的几乎完全降解，导致了蛋白合成的重度减少，最终导致细胞死亡(Zhang et al，Mol.Cell 12：913-23(2003))。在选择的细菌中可以找到MazF，最近大肠杆菌蛋白PemK(由质粒R100编码)也显示出是序列特异性的核糖核酸内切酶(Zhanget al.，J.Biol.Chem.279：20678-20684(2004))。PemK在特定核酸序列处高度特异性地切割RNA，所述序列即UAX，其中X是C、A或U。见PCT/US2004/018571，在此通过引用将其并入本申请。这些序列特异性的核糖核酸内切酶是保守的，这突出了它们在生理学和进化中的重要作用。我们将该序列特异性的核糖核酸内切酶毒素家族称作“mRNA干扰酶”(Zhang et al.，J.Biol.Chem.279：20678-20684(2004))。

在本研究中，我们已经利用MazF的独特的切割性能设计出了活大肠杆菌细胞内的单蛋白生成(SPP)系统。在表达经遗传工程改造成表达无ACA的mRNA而不改变其氨基酸序列的基因之后，高水平的单个的靶蛋白合成持续了至少96个小时，而背景的细胞蛋白合成几乎不存在。因此，MazF的毒性作用仅针对于mRNA，其对细胞生理学只有最小的副作用。事实上，尽管它们的生长停滞状态，这些细胞保持了用于能量代谢(ATP生成)、氨基酸和核苷酸生物合成和转录及翻译的基本的代谢和生物合成活性。除了证实SPP系统对人类和酵母蛋白的效力，该技术对于过量表达整合内膜蛋白也是有效的，所述蛋白的天然表达水平是相对低的。SPP系统生成了史无前例的信噪比，对于需要回收分离状态的蛋白的试验，该系统不需要任何蛋白纯化步骤，更重要的是该系统使得能在完整的活细胞内进行蛋白的结构和功能研究。

附图说明

图1：人嗜酸细胞活化趋化因子的表达，使用pColdI(SP-1)和pColdI(SP-2)，有和没有MazF共表达。

图2：ACA序列对嗜酸细胞活化趋化因子表达的作用。

图3：去除MazF ORF中的所有ACA序列对嗜酸细胞活化趋化因子表达的作用。

图4：酵母蛋白在SPP系统中的表达。

图5：在利用pColdIV(SP-2)的SPP系统中表达LspA(一种内膜蛋白)。

发明概述

本发明描述了活大肠杆菌细胞中的单蛋白生成(SPP)系统，其利用了mRNA干扰酶的独特的性能，例如MazF，这是一种细菌毒素，其是单链RNA-和ACA-特异性的核糖核酸内切酶，它在体内有效地和选择性地降解所有的细胞mRNA，造成了总蛋白合成的明显下降。在本发明的一个实施方式中，用于在可转化的活细胞中表达单个靶蛋白同时减少非目标细胞蛋白合成的系统包括：(a)包括具有至少一个第一mRNA干扰酶识别序列的细胞mRNA的分离的可转化的活细胞；(b)包括编码mRNA干扰酶多肽的分离的核酸序列的第一表达载体，其中通过用备选的(alternate)三联密码子序列替换至少一个第二mRNA干扰酶识别序列突变了编码mRNA干扰酶多肽的分离的核酸序列，以生成编码突变的mRNA干扰酶多肽的突变的核酸序列；和(c)任选地，包括编码靶蛋白的分离的核酸序列的第二表达载体，其中通过用备选的三联密码子序列替换至少一个第三mRNA干扰酶识别序列突变了编码靶蛋白的分离的核酸序列，以生成编码突变的靶蛋白的突变的核酸序列；其中用第一表达载体和第二表达载体转化分离的细胞；和其中将分离的细胞维持在容许在所述细胞内表达突变靶蛋白的条件下。

在另一个实施方式中，本发明提供了增加靶蛋白在分离的活细胞内的表达的方法，包括步骤：(a)突变编码mRNA干扰酶多肽的分离的核酸序列，以用备选的三联密码子序列替换至少一个第一mRNA干扰酶识别序列，以生成编码突变的mRNA干扰酶多肽的突变的核酸序列；(b)突变编码靶蛋白的分离的核酸序列，以用备选的三联密码子序列替换至少一个第二mRNA干扰酶识别序列，以生成编码突变的靶蛋白的突变的核酸序列；(c)提供包括步骤(a)的突变的核酸序列的第一表达载体和包括步骤(b)的突变的核酸序列的第二表达载体；(d)提供具有包括至少一个第三mRNA干扰酶识别序列的细胞信使RNA序列的分离的活的可转化的细胞；(e)向所述分离的活的可转化的细胞内引入第一表达载体和第二表达载体；(f)表达突变的mRNA干扰酶多肽；和(g)将分离的细胞维持在容许在所述细胞内表达突变靶蛋白的条件下。

发明详述

下面的定义设定了本发明的参数。

缩写“ACA”表示序列腺嘌呤-胞嘧啶-腺嘌呤。

对于指定的核酸，术语“编码”在此使用时表示用于翻译成指定的蛋白的储存于核酸内的信息。编码蛋白的核酸可以在核酸的翻译区内包括有非翻译序列(例如内含子)，或者可以缺乏这些间插的非翻译序列(例如在cDNA中)。通过使用密码子说明了编码蛋白的信息。核酸通常利用“通用的”遗传密码编码氨基酸序列。

术语“密码子”在此使用时表示核苷酸三联体，它们一起规定了多肽链中的氨基酸残基。大多数有机体都使用20或21个氨基酸来制备它们的多肽，所述多肽是蛋白或蛋白前体。因为DNA中有着四种可能的核苷酸，即腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、和胸腺嘧啶(T)，所以存在64种可能的三联体识别仅20种氨基酸加上终止信号。因为这种冗余性，大多数氨基酸由超过一种的三联体编码。规定单个氨基酸的密码子并不都是以均等频率使用的。不同的有机体常常表现出对编码相同的给定氨基酸的若干密码子中的一种的特别“偏爱(preferences)”。如果编码区含有高水平的罕见密码子或罕见密码子簇，通过重新合成基因或者通过诱变去除罕见密码子可以增加表达。见J.Sambrook和D.W.Russell，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第3版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)，15.12；通过引用将其并入本申请。因此可以进行“密码子选择”以优化在选定宿主中的表达。最优选的密码子是那些在高表达基因中经常能找到的密码子。对于大肠杆菌中的“密码子偏爱”，见Konigsberg，et al.，Proc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A.80：687-91(1983)，在此通过引用并入本申请。

本领域技术人员将认识到改变、添加或删除编码序列内的单个氨基酸或一小部分氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白序列的个别替换、删除或添加是“保守修饰变体”，其中改变造成了氨基酸被化学相似氨基酸替换。术语“保守修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，保守修饰变体表示那些编码相同的氨基酸序列或氨基酸序列的保守修饰变体的核酸。因为遗传密码的简并性，大量的功能相同的核酸编码任何给定的蛋白。例如，密码子UUA、UUG、CUU、CUC、CUA、和CUG都编码氨基酸亮氨酸。因此，在密码子规定为亮氨酸的每一个位置，密码子可以被改变成任何所述的相应的密码子，而不改变所编码的多肽。这些核酸变异是“沉默变异”，它们代表一类保守修饰变异。根据遗传密码，在此编码多肽的每一种核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。本领域的一般技术人员将认识到核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子；和UGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)都可以被修饰而产生功能相同的分子。因此，编码本发明的多肽的核酸的每种沉默变异都是在本发明的范围之内。

术语“嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)”在此使用时表示由74个氨基酸残基构成的趋化因子，其属于C-C(或β)趋化因子家族，并参与了动物和人体的嗜酸性粒细胞炎性状态。

本发明包括mRNA干扰酶多肽的活性部分、片段、衍生物、突变体、和功能变体，其程度为这些活性部分、片段、衍生物、和功能变体能保留mRNA干扰酶的任何生物性能。mRNA干扰酶多肽的“活性部分”表示比全长多肽短的肽，但是其保留了可测定的生物活性。mRNA干扰酶的“片段”表示一连串至少5到7个连续氨基酸的氨基酸残基片段，常常为至少约7到9个连续氨基酸，通常至少约9到13个连续氨基酸，以及最优选地至少约20到30或更多个连续氨基酸。mRNA干扰酶或其片段的“衍生物”表示通过改变蛋白的氨基酸序列所修饰的多肽，例如通过操纵编码蛋白的核酸或通过改变蛋白本身。这些天然氨基酸序列的衍生物可以包括一个或多个氨基酸的插入、添加、删除或替换，以及可以改变或可以不改变原始mRNA干扰酶的基本活性。

术语“基因”表示位于编码特定功能产物(即蛋白或RNA分子)的DNA区段的特定位置上的有序的核苷酸序列。它可以包括编码DNA之前和之后的区域以及外显子之间的内含子。

术语“诱导”或“可诱导的”表示通过将细胞暴露于诱导物或条件例如热增加其转录或合成的基因或基因产物。

术语“诱导物”或“诱导剂”表示低分子量的化合物或物理因子，其与阻遏蛋白相结合生成不再能与操纵基因相结合的复合物。

术语“诱导”表示引起一些特殊效应的行为或方法，例如特定基因或操纵子的转录、或在有机体暴露于特殊刺激之后的蛋白生成。

在向细胞内插入核酸的上下文中的术语“引入”、“转染”、“转化”、“转导”包括表示将核酸掺入到原核细胞或真核细胞内，其中核酸可以被整合到细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，被转化成自主复制子，或者被短暂表达(例如转染mRNA)。

术语“分离的”表示物质例如核酸或蛋白基本上不含在其天然存在的环境中所能发现的通常伴随于它的或与它相互作用的组分。分离的物质任选地包括在物质的天然环境中未发现伴随其的物质，或者如果物质是处于其天然的环境中，那么该物质已经被有意的人为干涉所合成地(非天然地)改变。例如“分离的核酸”可以包括被插入到载体(例如质粒或病毒载体)内的DNA分子，或者被整合到原核或真核细胞或宿主有机体的基因组DNA内的DNA分子。当应用于RNA时，术语“分离的核酸”主要表示如上定义的分离的DNA分子所编码的RNA分子。或者，该术语可以表示已经被充分地与其天然状态(即细胞或组织内)中通常与其相伴的其它核酸分离开的RNA分子。分离的核酸(DNA或RNA)还可以表示用生物学或合成工具直接生成的并且与其生产过程中存在的其它组分分离开的分子。

缩写“IPTG”表示异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，它是β-半乳糖苷酶的合成诱导物，β-半乳糖苷酶是一种通过结合并抑制lac阻抑物而促进乳糖利用的酶。例如，在利用含有lacZ基因的质粒载体的克隆策略中，联合使用IPTG和合成显色底物Xgal可以将重组体和非重组体细菌克隆区分开来。

术语“MazF”在此使用时表示核糖核酸内切酶的总类，表示具有该特定名称的特定酶，以及它们的具有与本发明的MazF多肽的作用相一致的与其的结构和序列同源性的活性片段及衍生物。

缩写“lspA”表示大肠杆菌中负责信号肽酶II活性的基因。

缩写“LspA”表示大肠杆菌中负责脂蛋白信号肽酶活性的基因。

本发明所包括的酶家族被称作“mRNA干扰酶”。预期本发明扩展到具有与本发明的该酶家族的作用相一致的与其的结构及功能相似性的分子。

术语“核酸”或“核酸分子”在此使用时包括任何DNA或RNA分子，单链或双链，以及如果是单链，包括它的线型或环型的互补序列分子。在讨论核酸分子时，在此可以根据按5’到3’方向提供序列的正常约定描述特定核酸分子的序列或结构。除非有其它的限定，该术语包括已知的类似物。

术语“寡核苷酸”表示由经磷酸二酯键连接的两个或多个(优选地超过3个)核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸组成的核酸分子。

术语“操纵基因”表示位于基因上游(5’)的并且一种或多种调节蛋白(阻抑物或激活物)与其结合以控制基因表达的DNA区域。

术语“操纵子”在此使用时表示用于控制基因表达的功能整合的遗传单位。它是由一个或多个编码一种或多种多肽的基因以及通过调节结构基因的转录而控制其表达的邻近部位(启动子和操纵基因)组成。术语“表达操纵子”表示可以具有转录和翻译控制序列的核酸片段，所述序列例如启动子、增强子、翻译起始信号、多腺苷酸化信号、终止子等，其促进了多肽编码序列在宿主细胞或有机体内的表达。

短语“可操纵地连接”包括表示启动子和第二序列之间的功能连接，其中启动子序列启动并介导对应于第二序列的DNA序列的转录。一般而言，可操纵地连接意思是所连接的核酸序列是连续的，对于必须连接两个蛋白编码区的情况，所连接的核酸序列是连续的并位于相同的阅读框内。

缩写“ORP”代表“开放阅读框”，其是基因序列的一部分，它含有不被内在终止序列中断的碱基序列，并且它具有编码肽或蛋白的潜能。开放阅读框开始于起始密码子并终止于终止密码子。终止或末端密码子决定了多肽的末端。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在此可互换使用，其表示氨基酸残基的多聚物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸多聚物，以及适用于天然存在的氨基酸的多聚物。

缩写“PCR”表示聚合酶链式反应，其是扩增DNA的量的技术，因此使得DNA更容易被分离、克隆和测序。见例如美国专利No.5,656,493、5,33,675、5,234,824、和5,187,083，在此通过引用将每个专利的内容都并入本申请。

术语“启动子”在此使用时包括表示转录起点上游(5′)的DNA区域，其参与RNA聚合酶和其它蛋白的识别和结合，以便启动转录。术语“诱导型启动子”表示应答于特定化合物(即诱导物或诱导剂)的存在或应答于限定的外部条件(例如温度升高)而激活的启动子。

短语“定点诱变”表示一种体外技术，其利用重组DNA方法将碱基变化例如突变引入到一段DNA的特定位点。

术语“非翻译区”或UTR在此使用时表示其碱基不参与蛋白合成的DNA部分。

术语特定序列核酸的“变体”、“突变体”和“衍生物”表示与特定序列紧密相关的核酸序列，但是它们可以天然地或通过设计具有序列或结构上的变化。“紧密相关”意思是在限定长度的核酸序列上，序列的至少约60％，但是常常超过85％的核苷酸是匹配的。紧密相关的核酸序列之间的核苷酸序列的变化或差异可以代表在正常复制或该特定核酸序列性状被重复过程中生成的序列中的核苷酸变化。对于特殊的目的，可以特异地设计出其它的变化，并将其引入到序列内。利用各种诱变技术可以在体外生成这些特定的变化。这些特异生成的序列变体可以被称作原始序列的“突变体”或“衍生物”。

本领域技术人员可以生成具有单个或多个氨基酸置换、缺失、添加或替换的蛋白变体。这些变体尤其可以包括：(a)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸替换的变体；(b)其中添加了一个或多个氨基酸的变体；(c)其中至少一个氨基酸包括取代基的变体；(d)其中在保守或非保守位点上来自一个物种的氨基酸残基被替换为另一个物种的相应残基的变体；和(d)其中靶蛋白与另一种肽或多肽例如融合伴侣、蛋白标记或其它可赋予靶蛋白有用的性能的化学部分例如抗体的表位融合的变体。本领域技术人员已知用于获得这些变体的技术，包括遗传学的(抑制、删除、突变等)、化学的和酶的技术。

术语“载体“和”表达载体“在此使用时表示复制子，即作用为另一种遗传序列或元件(DNA或RNA)可以与之相连接以造成所连序列或元件的复制并因此可将该序列或元件运送到宿主细胞中的载体或转运物的任何物质，如噬菌体、质粒、粘粒、杆粒、噬菌体或病毒。在此所述的大肠杆菌SPP系统利用了pColdI载体，其在低温下诱导蛋白生成。

必须注意到，单数形式“一/该”在此和所附的权利要求书中使用时包括复数指示，除非在上下文中有清楚的其它说明。所有的技术和科学术语在此使用时都具有相同的含义。

除非有不同的说明，所有的技术和科学术语在此使用时都具有如本发明所属领域的一般技术人员通常所理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中也可以使用与在此所述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料，现在描述优选的方法和材料。在此通过引用将在此所提及的所有出版物都并入本申请，用于公开和描述与所引用文献相关的方法和/或材料。

实施例

给出下面的实施例，以便为本领域一般技术人员提供关于如何制备和如何利用本发明的完整阐述和说明，这并不打算限制本发明人所视为本发明的范围，也不打算表示下面的试验是所能实施的全部或唯一的试验。已经努力保证所用数字(例如量、温度等)的准确性，但是一些试验误差和偏差应该考虑到。除非有其它不同的说明，比例份都是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，以及压力是大气压或接近大气压。

菌株和质粒

下面描述的试验中使用大肠杆菌BL21(DE3)细胞。将mazF基因克隆到pACYCDuet(Novagen)的Ndel-Xhol位点内，生成了质粒pACYCmazF。利用pACYCmazF作为模板，通过定点诱变构建出了pACYCmazF(-9ACA)。根据最佳的大肠杆菌密码子选择合成了嗜酸细胞活化趋化因子基因(见图2A)，并将其克隆到了pColdI(SP-1)的Ndel-HindIII位点内，生成了质粒pColdI(SP-1)嗜酸细胞活化趋化因子。如在文中所述的，利用pColdI(嗜酸细胞活化趋化因子)作为模板，通过定点诱变构建出了pColdI(SP-1)嗜酸细胞活化趋化因子。根据QuickChange定点诱变试剂盒(Stratagene)的说明书，用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)实施了诱变。还利用pColdI(SP-1)嗜酸细胞活化趋化因子作为模板通过定点诱变构建出了pColdI(SP-2)嗜酸细胞活化趋化因子。利用pColdI(SP-1)嗜酸细胞活化趋化因子作为模板，通过定点诱变构建出了pColdI(SP-1)嗜酸细胞活化趋化因子(+ACA)。用酵母染色体作为模板，通过PCR扩增出野生型Hsp10基因，并将其克隆到了pColdI(SP-2)的NdeI-BamHI位点内，生成了质粒pColdI(SP-2)Hsp10。利用酵母染色体作为模板，通过两步PCR扩增出了无ACA的Hsp10基因，并将其克隆到了pColdI(SP-2)的NdeI-BamHI位点内，生成了质粒pColdI(SP-2)Hsp10(-ACA)。利用野生型Rpb12质粒作为模板，通过PCR扩增出野生型和无ACA的Rpb12基因，并将含有改变序列的5’和3’寡核苷酸克隆到了pColdI(SP-2)的NdeI-BamHI位点内，分别生成了质粒pColdI(SP-2)Rpb12和pColdI(SP-2)Rpb12(-ACA)。通过两步PCR扩增无ACA的LspA基因，并将其克隆到pColdIV(SP-2)的NdeI-BamHI位点内，生成了质粒pColdIV(SP-2)lspA(-ACA)。

体内蛋白合成的检测

将携带质粒的大肠杆菌BL21(DE3)生长于M9葡萄糖培养基中。当培养物的OD₆₀₀达到0.5时，将培养物转移到15℃下45分钟，并往培养物中加入1mM IPTG。以所示的时间间隔，将1ml培养物加入到含有10mCi[³⁵S]-甲硫氨酸的试管内。在孵育15分钟(脉冲)之后，加入0.2ml 40mg/ml甲硫氨酸，并再孵育5分钟(追加)。用M9葡萄糖培养基洗涤标记的细胞，并将其重悬于100μl SDS-PAGE加样缓冲液中。用SDS-PAGE后接放射自显影法分析10μl每个样品。

膜部分的制备

将经离心(10,000xg，5分钟)从1ml培养物中收集到的细胞悬浮于10mM Tris-HCl(pH值7.5)中，并用超声破碎细胞。在去除未破碎细胞之后，通过离心(100,000xg，60分钟)获得了总的膜部分。

实施例1：MazF诱导细胞蛋白合成的作用

用pColdI(SP-1)嗜酸细胞活化趋化因子(A和B的左图)或pColdI(SP-2)嗜酸细胞活化趋化因子(B的右图和C)转化携带有pACYCmazF的大肠杆菌BL21(DE3)。细胞生长于37℃的M9葡萄糖培养基中。当OD₆₀₀达到0.5时，将培养物转移到15℃，在15℃下孵育45分钟使得细胞适应低温后，加入IPTG(1mM)诱导嗜酸细胞活化趋化因子和MazF表达(0时间)。在每个凝胶上方所示的时间点，用³⁵S-甲硫氨酸脉冲标记细胞15分钟，并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)之后接放射自显影法分析总的细胞蛋白。

将mazF基因克隆到pACYC(低拷贝数的含有IPTG诱导型噬菌体T7启动子的质粒)内，生成了pACYCmazF。通常可以在J.Sambrook和D.W.Russell的Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)找到克隆技术，在此通过引用将其并入本申请。经pACYCmazF转化的大肠杆菌BL21(DE3)对IPTG(lac诱导物)是敏感的，因为在含有IPTG的琼脂平板上没有形成克隆(没有显示)。

图1通过SDS-PAGE显示了应用pColdI(SP-1)和pColdI(SP-2)以及有或没有MazF共表达时的人嗜酸细胞活化趋化因子的表达。图1B显示了经pColdI(SP-1)嗜酸细胞活化趋化因子转化的细胞的结果(左图)；以及经pColdI(SP-2)嗜酸细胞活化趋化因子转化的细胞的结果(右图)。图1C显示了在LB(左图)或M9培养基(右图)中孵育的经pACYCmazF和pColdI(SP-2)嗜酸细胞活化趋化因子转化的细胞的结果。如图1A和图1B所示的相同方式处理细胞，并在所示的时间点，通过SDS-PAGE后接考马斯蓝染色分析总的细胞蛋白。注意到取相同体积的培养物进行分析。在凝胶的左侧显示了分子量标记的位置，以及用箭头指示了嗜酸细胞活化趋化因子的位置。因为MazF在ACA序列处有效地切割了mRNA，在37℃下MazF诱导之后(Zhang et al.，MoI.Cell 12：913-23(2003))或者如图1A所示在15℃，细胞蛋白合成受到显著抑制。在这个冷激试验中，首先将携带有pACYCmazF的细胞在15℃孵育45分钟，以诱导冷激适应所需的冷激蛋白(见Thieringeret al.，Bioassays 20(1)：49-57(1998))。然后向培养物中加入IPTG诱导MazF(图1A的0时间，左图)。在凝胶上方所示的时间点，用[³⁵S]甲硫氨酸脉冲标记细胞15分钟。图A左图显示了仅仅经pACYC嗜酸细胞活化趋化因子转化的细胞的结果；图A中图显示了仅仅经pCold(SP-1)嗜酸细胞活化趋化因子转化的细胞的结果；以及图A右图显示了经两种质粒转化的细胞的结果。

在0时间点，观察到了非常相似的蛋白模式，如同没有IPTC的细胞(对照，表示为C)，但是在加入IPTG后1个小时显著地抑制了细胞蛋白合成。在6小时后，几乎完全阻断了几乎所有细胞蛋白的合成。

实施例2：无ACA mRNA在MazF诱导细胞内的表达

我们推测如果被遗传工程改造成不含有ACA序列的mRNA在MazF诱导细胞内表达，则该mRNA可能稳定地保持于细胞内，使得可生成该mRNA编码的蛋白，而不生成任何其它的细胞蛋白。为了检验这种可能性，我们合成了人嗜酸细胞活化趋化因子的基因，消除了该基因内的所有ACA序列，而不改变氨基酸序列。图2A显示了人嗜酸细胞活化趋化因子的氨基酸序列以及其基因的核苷酸序列。在下面的试验中，用优选的大肠杆菌密码子设计出核苷酸序列，标下划线的那些三联体被改变为ACA。在64种可能的三联体序列中，ACA序列是独特的，因为它可以被改变成其它的MazF不可切割的序列，而不改变蛋白的氨基酸序列，无论ACA序列在阅读框内的位置如何。

将图2A中所示的嗜酸细胞活化趋化因子基因与由来自主要冷激蛋白CspA(Qing et al，Nat.Biotechnol.22：877-882(2004))的cspA基因的翻译增强元件的序列、6个His残基、Xa因子切割位点以及源自Ndel位点的用于基因插入的His-Met序列组成的17个残基的序列融合。将融合蛋白的整个编码区插入到pColdI(SP-1)和pColdI(SP-2)载体内，冷激载体容许在冷激之后高水平的蛋白表达(Qing et al，Nat.Biotechnol.22：877-882(2004))。在pCold(SP-1)中，两个ACA序列(一个位于Shine-Dalgarno序列和起始密码子之间以及另一个位于翻译增强元件内)被转化成了AUA。在pColdI(SP-2)中，除了pColdI(SP-1)中的两个ACA序列外，5’非翻译区(5’-UTR)中的三个其它的ACA序列也都经碱基替换转化成了MazF不可切割的序列(从5’ACA到3’ACA分别被转化成了GCA、AUA和GCA)。所形成的构建体，分别为pColdI(SP-1)嗜酸细胞活化趋化因子和pColdI(SP-2)嗜酸细胞活化趋化因子，被转化到了大肠杆菌BL21(DE3)细胞内。

在15℃下将经pColdI(SP-1)嗜酸细胞活化趋化因子转化的细胞冷激并适应低温1个小时之后，加入IPTG诱导嗜酸细胞活化趋化因子的生成。然后用[³⁵S]-甲硫氨酸脉冲标记细胞15分钟(0时间，图1A，中图)。从0时间开始在72个小时的孵育期间内，嗜酸细胞活化趋化因子几乎以恒定水平与其它的细胞蛋白一起生成。从[³⁵S]-甲硫氨酸掺入判断，12小时时间点的嗜酸细胞活化趋化因子生成占总的细胞蛋白合成的约11％。

当用具有pACYCmazF和pColdI(SP-1)嗜酸细胞活化趋化因子的大肠杆菌BL21(DE3)共表达嗜酸细胞活化趋化因子和mazF基因时，在3个小时诱导之后显著地降低了背景细胞蛋白合成，而几乎恒定水平的嗜酸细胞活化趋化因子生成持续了72个小时(图1A，右图)。有趣的是，这个试验中嗜酸细胞活化趋化因子的生成水平高(图1A，右图，12小时时占总蛋白生成的11％)于没有MazF诱导时(图1A，中间图，12小时时为47％)。这种约5倍的富集可能是因为更多的核糖体变成可用于嗜酸细胞活化趋化因子mRNA翻译的事实，因为MazF降解了细胞mRNA。值得注意的是，在12小时时间点之后没有观察到特定的蛋白条带。

当用具有pACYCmazF和pColdI(SP-2)嗜酸细胞活化趋化因子的细胞实施同一试验时，几乎唯一地生成了嗜酸细胞活化趋化因子(图1B，右图)。值得注意的是，嗜酸细胞活化趋化因子的生成显著高于使用pColdI(SP-1)嗜酸细胞活化趋化因子时(图1B，左图)。这种更高的嗜酸细胞活化趋化因子生成可能是因为通过进一步去除pColdI(SP-1)的5’-UTR中的ACA序列稳定了嗜酸细胞活化趋化因子mRNA。在MazF诱导之后12个小时，近90％的[³⁵S]-甲硫氨酸掺入到嗜酸细胞活化趋化因子中，以及特别是不能辨别出明显的细胞蛋白条带(图1B，右图)，说明本发明SPP系统显著地提高了嗜酸细胞活化趋化因子的信噪比。有趣地注意到甚至在诱导之后96个小时时，高水平的嗜酸细胞活化趋化因子生成还没有减弱。此外，背景的细胞蛋白合成减弱早(3个小时时)于用pColdI(SP-1)嗜酸细胞活化趋化因子时(6个小时时)(比较图1B中的左图和右图)。

对于两种载体(图1A和B)，通过OD₆₀₀以及通过[³⁵S]-甲硫氨酸向细胞蛋白内的掺入都可以判断出在MazF诱导之后完全地阻断了细胞生长。这些结果说明MazF诱导造成的生长停滞的细胞并非生理学死亡的细胞，相反地它们完全能合成蛋白，只要其mRNA不含有ACA序列。这又说明大肠杆菌BL21(DE3)细胞的细胞完整性可以长时间地保持完整，使得生长停滞细胞内不仅能量代谢而且氨基酸和核苷酸的生物合成功能都是完全有活性的。此外，也很好地保留了转录和翻译机制，包括RNA聚合酶、核糖体、tRNA、以及蛋白合成所需的所有其它的因子。

通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳之后的考马斯兰染色，用pColdI(SP-2)嗜酸细胞活化趋化因子生成的嗜酸细胞活化趋化因子表现为主要条带(图1C)。在0小时时间点时，嗜酸细胞活化趋化因子条带几乎不能看到，而在12小时时，其已经成为主要条带，其密度甚至在24小时之后仍有所增加。但是，更长时间的孵育不能显著地增加其生成水平，说明在MazF诱导细胞内存在着嗜酸细胞活化趋化因子生成的阈值水平。由于[³⁵S]-甲硫氨酸掺入恒定地保持了96个小时(图1B)，因此似乎SPP系统内的嗜酸细胞活化趋化因子生成和降解在24小时后可能平衡。重要的是注意到如从MazF诱导后的完全的生长抑制所预期到的，细胞蛋白的条带密度保持恒定。我们检验了嗜酸细胞活化趋化因子生成是否受丰富培养基例如LB培养基的影响，发现如果使用pColdI(SP-2)，LB培养基的应用不会增强嗜酸细胞活化趋化因子生成超过用限定的M9培养基所得到的水平。

实施例3：ACA序列对蛋白生成的负性作用

为了验证在图1中所观察到的MazF诱导细胞内的唯一的嗜酸细胞活化趋化因子生成是因为嗜酸细胞活化趋化因子的无ACA的mRNA，往嗜酸细胞活化趋化因子基因中加入了5个天然的ACA序列，且不改变如图2A所示的其氨基酸序列。利用pColdI(SP-2)表达嗜酸细胞活化趋化因子基因，并按与图1所述的相同的方式处理并用[³⁵S]-甲硫氨酸标记细胞。左图显示了无ACA的嗜酸细胞活化趋化因子基因的结果(与图1B的左图相同)以及右图显示了具有5个ACA序列的嗜酸细胞活化趋化因子基因的结果。

当在与图1所述的相同条件下，利用pColdI(SP-1)和pACYCmazF一起表达该基因时，与无ACA的mRNA表达(图2B，左图)相比较，仅仅在头2个小时观察到了低水平的嗜酸细胞活化趋化因子生成，在此之后生成水平进一步降低到了背景水平(图2B，右图)。

有意思的是，MazF基因编码具有异常高ACA含量的mRNA(111个残基的蛋白中有9个ACA序列)，这与MazE(82个氨基酸残基中仅有2个ACA序列)明显不同，说明细胞内mazF表达受负向调节。因此，我们构建了没有ACA的mazF基因[pACYCmazF(-9ACA)]，并检验了从mazF编码区去除这些ACA序列是否可以引起背景细胞蛋白生成的更有效的减少。

图3显示了mazF ORF中的所有ACA序列的去除对嗜酸细胞活化趋化因子表达的作用。图A显示了MazF的氨基酸序列及其ORF的核苷酸序列。标下划线的三联体序列(总共9个)最初在野生型mazF基因中是ACA，其被改变为MazF不可切割的序列。图B显示了利用野生型mazF基因(左图)和无ACA的mazF基因(右图)，用pColdI(SP-2)嗜酸细胞活化趋化因子表达嗜酸细胞活化趋化因子。如图1中所述实施试验。

如图3A所示，没有一种碱基替换改变了MazF的氨基酸序列。尽管具有pYCACmazF(-9ACA)的细胞在M9培养基中比具有pYCACmazF的细胞生长得稍慢，但是背景蛋白合成被进一步地减少，并且对嗜酸细胞活化趋化因子生成没有显著的影响(图3B)。这些结果清楚地证实mRNA中的ACA序列在MazF诱导细胞中的蛋白生成方面发挥着关键作用。

实施例4：SPP系统在酵母蛋白中的应用

我们将SPP系统应用于两种酵母蛋白：Hsp10(一种热激因子)和Rpb12(一种RNA聚合酶亚基)。Hsp10和Rpb12的ORF分别含有3个和1个ACA，将其转化成了MazF不可切割的序列，且不改变它们的氨基酸序列(图4A)。然后，将它们和野生型序列一起插入到了pColdI(SP-2)内。所形成质粒分别被称作pColdI(SP-2)Hsp10(野生型Hsp10)、pColdI(SP-2)Hsp10(-1ACA)(突变体Hsp10)、pColdI(SP-2)Rpb12(野生型Rpb12)和pColdI(SP-2)Rpb12(-3ACA)。这些质粒各自都被转化到了具有pACYCmazF的大肠杆菌BL21(DE3)内。然后检查在15℃下48个小时的蛋白表达模式。

图4显示了酵母蛋白在SPP系统中的表达。利用pColdI(SP-2)，在其基因内存在或不存在ACA序列时，在SPP系统内表达酵母Hsp10和Rpb12。如上面为图1所述的进行试验。图4A显示了利用野生型和无ACA的Hsp10基因表达Hsp10。由106个密码子构成的hsp10 ORF含有3个ACA序列：GCA-CAA(A25-Q26)、ACA(T29)、和CCA-CAG(P76-Q77)，它们分别被转化成了GCC-CAA、ACC和CCC-CAG(改变的碱基用黑体表示)。这些碱基替换不改变Hsp10的氨基酸序列。图4B显示了利用野生型和无ACA的基因表达Rpb12。由70个密码子构成的rpb12 ORF含有一个ACA(T10)，其被转化成了苏氨酸的ACC。

图4A显示可以以相当高的水平表达具有其天然的3个ACA序列(WT)的Hsp10。但是，当去除了所有的ACA序列时，Hsp10合成显著地增加了数倍。值得注意的是，对于无ACA的Hsp10，背景也显著地降低了，可能是因为更多的核糖体被用于生成Hsp10。图4B显示尽管Rpb12只含有1个ACA，但是它对其在SPP系统中的生成产生毁灭性的影响，在WT组中只观察到了很少的³⁵S-甲硫氨酸掺入，而在无ACA的Rpb12中看到了合理的掺入。这些结果说明不仅可以通过mRNA中的ACA序列的数目还可以通过ACA序列对MazF的有效的易感性，来操控mRNA对MazF的敏感性。可能通过ACA序列在mRNA的单链区域中的位置以及核糖体对mRNA的有效翻译来决定ACA序列的易感性，因为假定核糖体保护mRNA免于MazF切割。

实施例5：SPP系统在整合膜蛋白中的应用

我们尝试将SPP系统应用于较少的(minor)整合膜蛋白。我们选择了大肠杆菌中的信号肽酶II的基因1spA，它对于脂蛋白的信号肽的切割是特异性需要的(Tokuda和Matsuyama，Biochem.Biophys.Acta1693：5-13(2004))。大肠杆菌总共含有96种脂蛋白，已知它们在内膜或外膜上组装，这取决于成熟脂蛋白的第二个氨基酸残基的性质(酸性或中性)(Yamaguchi和Inouye，Cell 53：423-432(1988)；Tokuda和Matsuyama，Biochem.Biophys.Acta 1693：5-13(2004))。信号肽酶I(前导肽酶)切割所有其它分泌蛋白的信号肽，估计其在大肠杆菌中的存在水平仅为每个细胞500个分子(Wolfe et al，J.Biol.Chem.257：7898-7902(1982))。

脂蛋白信号肽酶(LspA)也被认为是内膜中的非常低丰度的蛋白。它由164个氨基酸残基组成，以及含有4个推测的跨膜域，说明LspA是一种整合内膜蛋白。将LspA ORF中的三个ACA序列改变成了非MazF可切割的序列，而不改变其氨基酸序列，在利用mazF(-9ACA)的SPP系统中用pColdI(SP-2)表达无ACA的LspA。

图5显示了内膜蛋白LspA在利用pColdL(SP-2)的SPP系统中的表达。在如图1所述的SPP系统中表达LspA(信号肽酶II或脂蛋白信号肽酶)。A图显示了总的细胞蛋白；以及B图显示了膜部分：用箭头显示出LspA的位置。

如图5A所示，LspA在SPP系统中的表达对于细胞显然是有毒性的，因为³⁵S-甲硫氨酸掺入在IPTG诱导后仅持续了1个小时。然而，如图5B所示，似乎获得了相当的³⁵S-甲硫氨酸掺入LspA，0和1小时时间点时的LspA条带的密度与其它的细胞蛋白条带比较是最高的(与图5A中的C泳道相比较)。通过超速离心容易地去除在0和1小时观察到的背景细胞蛋白合成，并且³⁵S-甲硫氨酸掺入高度地富集于膜部分中。

讨论

本研究证实了mRNA干扰酶对细胞蛋白合成的完全抑制不会对细胞生理造成恶化影响。作为MazF在ACA序列处对几乎所有细胞mRNA的断裂的结果，细胞蛋白合成被完全阻断，其进而导致了完全的细胞生长停滞。但是，令人惊讶的是，发现经MazF诱导被正常停滞的细胞完全能长时间地高水平地合成蛋白(在15℃下至少96个小时)，只要它们的mRNA被遗传工程改造成不含有ACA序列。通过这种方式我们首次实现建立了体内的单蛋白生成(SPP)。

我们的结果证实MazF诱导的细胞不是死细胞。MazF诱导不会妨碍到保持产生各种细胞功能(包括RNA和蛋白合成)所需的足够ATP的能量代谢的细胞完整性。另外，氨基酸和核苷酸的生物合成也保持完整。相当惊讶地发现，在完全缺乏新的细胞蛋白合成时，这些细胞功能(例如蛋白合成所需的蛋白因子)以及细胞代谢所需的所有蛋白因子都能在15℃下稳定地保持至少96个小时。仍需要确定这些细胞功能可以保持多长时间而不影响SPP的能力。尽管粗略一看它们似乎处于休眠状态，但是它们完全能合成RNA和蛋白，并且与剥夺营养造成的停滞期所引起的休眠有着明显的不同。我们建议将MazF诱导所形成的生理状态称作“准休眠”状态。仍然需要确定这种准休眠细胞是否是死的或未死的。通过在各种处理之后的细胞的菌落形成能力常常可以确定出细菌的生存力。已经按这种方式检查了MazF诱导之后的大肠杆菌细胞的生存力，并且显示出如果诱导MazE则在MazF诱导之后有限时间的孵育期内可重新获得生存力(Pedersen et al.，Mol.Microbiol.45：501-10(2002)；Amitai et al，J.Bacteriol.186：8295-8300(2004))。因此，MazF的作用在一定程度上是可逆的，但是对是否存在“不可恢复点”是有争议的，从此点开始细胞注定会死亡(Amitai et al.，J.Bacteriol.186：8295-8300(2004))。重要的是，两组所用的MazE基因在其ORF中含有两个ACA序列。本结果清楚地说明为了在MazF诱导细胞内表达任何基因，必须将这些基因中的ACA序列转化成MazF不可切割的序列。因此，表达MazF的准休眠细胞不能表达MazE是非常可能的，除非从其ORF中清除了所有的ACA序列。

在活细胞或未死细胞内只生成感兴趣的单蛋白的能力为研究先前难到达的蛋白在活细胞内的各个方面提供了新的方法。因为通过使用SPP系统，可以在活细胞内用同位素(¹⁵N和¹³C)唯一地标记相关蛋白，甚至检查蛋白在活细胞内的NMR结构也是可能的。最近我们已经显示通过用高表达冷激载体pCold表达相关蛋白，用细胞裂解物而不用蛋白纯化就能实现对蛋白的NMR结构的测定(Qing et al.，Nat.Biotechnol.22：877-882(2004))。我们现在证实MazF与pCold载体的一起应用显著地降低了信噪比，因为通过MazF诱导几乎可以完全阻断背景细胞蛋白合成。在这些试验中，我们显示从pColdI载体本身中去除ACA序列也是非常重要的，观察到由此嗜酸细胞活化趋化因子生成提高了5倍。当联合MazF时，通过³⁵S-甲硫氨酸掺入判断出嗜酸细胞活化趋化因子合成率为总细胞蛋白合成的90％的水平。剩下的10％是由没有掺入任何特定蛋白条带的一般背景组成。这进而使得可以实施对非常低丰度蛋白的结构研究，所述蛋白的生成因其大量表达时的毒性而是受限的。我们在本研究中的确证实LspA(一种非常低丰度的内膜蛋白)可以被唯一地表达于膜部分中。一些蛋白仅仅在活细胞内可以被折叠，只有通过使用SPP系统才可以实现对它们的结构研究。

SPP系统的另一个独特的优点是可以在高度浓缩的培养物中生成相关的蛋白或用同位素标记相关的蛋白，因为在MazF诱导之后完全阻断了细胞生长。SPP系统不仅可以被应用于生成蛋白也可以被用于生成其它的非蛋白化合物，这是有可能的。此外，SPP系统可以不仅仅限于细菌，MazF和其它的mRNA干扰酶也可以应用于真核细胞，以便形成酵母和哺乳动物细胞中的SPP系统。

对于在此所给出的数值范围，要明白到下限单位的1/10(除非上下文中有不同的说明)、该范围的上限和下限之间的每个间插数值以及任何其它在该指定范围内的指定的或间插的数值都包含在本发明的范围内。可能被独立地包含于更小范围内的这些较小范围的上限和下限也包括在本发明中，指定的范围中可有任何特别排除的极限。指定的范围包含极限值之一或两者时，排除了那些所包括的极限值之一或两者的范围也包括于本发明内。

在此所讨论的出版物仅仅提供其在本申请提交日期之前的公开内容。本文不被理解为承认本发明无权因在先发明而先于这些出版物。此外，在此所提供的出版物的日期可能不同于实际的出版日期，这可能需要独立地验证。

虽然已经参照特定的实施方式描述了本发明，本领域技术人员应当明白可以进行各种变化以及可以替换等同方案，而不脱离于本发明的真实的精神和范围。另外，可以进行多种修饰以便使得特定的情形、材料、物质的组成、方法、方法步骤适应于本发明的目标、精神和范围。所有这些修饰旨在属于所附的权利要求书的范围之内。

Claims (68)

1.用于在可转化的活细胞内表达单个靶蛋白同时减少非目标细胞蛋白合成的系统，包括：

(a)包括具有至少一个第一mRNA干扰酶识别序列的细胞mRNA的分离的可转化的活细胞；

(b)包括编码mRNA干扰酶多肽的分离的核酸序列的第一表达载体，其中通过用备选的三联密码子序列替换至少一个第二mRNA干扰酶识别序列突变了编码mRNA干扰酶多肽的分离的核酸序列，以生成编码突变的mRNA干扰酶多肽的突变的核酸序列；

(c)任选地，包括编码靶蛋白的分离的核酸序列的第二表达载体，其中通过用备选的三联密码子序列替换至少一个第三mRNA干扰酶识别序列突变了编码靶蛋白的分离的核酸序列，以生成编码突变的靶蛋白的突变的核酸序列；

其中用第一表达载体和第二表达载体转化分离的细胞；以及

其中将分离的细胞维持在容许在所述细胞内表达突变体靶蛋白的条件下。

2.权利要求1的系统，其中第一和第二表达载体各自还包括至少一个调节序列。

3.权利要求2的系统，其中所述至少一个调节序列是至少一个诱导型启动子。

4.权利要求3的系统，其中第一表达载体中的所述至少一个诱导型启动子与编码突变的mRNA干扰酶多肽的突变的核酸序列可操纵地连接。

5.权利要求3的系统，其中第二表达载体中的所述至少一个诱导型启动子与编码突变的靶蛋白的突变的核酸序列可操纵地连接。

6.权利要求1的系统，其中(b)中的突变的核酸序列编码具有与非突变的mRNA干扰酶多肽的氨基酸序列相同的氨基酸序列的突变的mRNA干扰酶多肽。

7.权利要求1的系统，其中(c)中的突变的核酸序列编码具有与非突变的靶蛋白的氨基酸序列相同的氨基酸序列的突变的靶蛋白。

8.权利要求1的系统，其中当在细胞内表达时突变体mRNA干扰酶多肽识别细胞信使RNA中的所述至少一个第一mRNA干扰酶识别序列。

9.权利要求1的系统，其中突变体mRNA干扰酶多肽选择性地切割细胞信使RNA，由此减少非目标细胞蛋白合成。

10.权利要求1的系统，其中第一mRNA干扰酶识别序列、第二mRNA干扰酶识别序列、和第三mRNA干扰酶识别序列是相同的mRNA干扰酶识别序列。

11.权利要求10的系统，其中mRNA干扰酶识别序列是腺嘌呤-胞嘧啶-腺嘌呤。

12.权利要求1的系统，其中表达的编码突变的靶蛋白的信使RNA被稳定地保持于细胞中。

13.权利要求1的系统，其中编码突变的靶蛋白的突变的核酸序列还被突变成用偏爱密码子替换罕见密码子，以生成二次突变的核酸序列，其中所述二次突变的核酸序列编码具有与非突变的靶蛋白的氨基酸序列相同的氨基酸序列的二次突变的靶蛋白。

14.权利要求13的系统，其中编码二次突变的靶蛋白的二次突变的核酸序列包括与编码二次突变的靶蛋白的二次突变的核酸序列可操纵地连接的诱导型启动子。

15.权利要求13的系统，其中表达的编码二次突变的靶蛋白的信使RNA被稳定地保持于细胞中。

16.权利要求1的系统，其中编码突变的mRNA干扰酶多肽的突变的核酸序列还被突变成用偏爱密码子替换罕见密码子，以生成二次突变的核酸序列，其中所述二次突变的核酸序列编码具有与非突变的mRNA干扰酶多肽的氨基酸序列相同的氨基酸序列的二次突变的mRNA干扰酶多肽。

17.权利要求16的系统，其中编码二次突变的靶蛋白的二次突变的核酸序列包括与编码二次突变的mRNA干扰酶多肽的二次突变的核酸序列可操纵地连接的诱导型启动子。

18.权利要求1的系统，其中细胞是哺乳动物细胞。

19.权利要求1的系统，其中细胞是真核细胞。

20.权利要求1的系统，其中细胞是原核细胞。

21.权利要求20的系统，其中细胞是大肠杆菌细胞。

22.权利要求1的系统，其中突变的mRNA干扰酶多肽是MazF。

23.权利要求1的系统，其中突变的mRNA干扰酶多肽是MazF的功能片段。

24.权利要求1的系统，其中突变的mRNA干扰酶多肽是MazF的功能变体。

25.权利要求1的系统，其中靶蛋白是哺乳动物蛋白。

26.权利要求25的系统，其中哺乳动物蛋白是人类蛋白。

27.权利要求1的系统，其中靶蛋白是酵母蛋白。

28.权利要求1的系统，其中靶蛋白是较少的细菌蛋白。

29.权利要求28的系统，其中靶蛋白是毒性低丰度蛋白。

30.权利要求1的系统，其中细胞被保持于包括至少一种放射性标记的同位素的培养基中。

31.权利要求30的系统，其中当表达时，突变体蛋白是被放射性标记的。

32.权利要求1的系统，其中通过聚合酶链式反应扩增编码靶蛋白的分离的核酸序列。

33.增加靶蛋白在分离的活细胞内的表达的方法，该方法包括步骤：

(a)突变编码mRNA干扰酶多肽的分离的核酸序列以用备选的三联密码子序列替换至少一个第一mRNA干扰酶识别序列，以生成编码突变的mRNA干扰酶多肽的突变的核酸序列；

(b)突变编码靶蛋白的分离的核酸序列以用备选的三联密码子序列替换至少一个第二mRNA干扰酶识别序列，以生成编码突变的靶蛋白的突变的核酸序列；

(c)提供包括步骤(a)的突变的核酸序列的第一表达载体以及包括步骤(b)的突变的核酸序列的第二表达载体；

(d)提供具有包括至少一个第三mRNA干扰酶识别序列的细胞信使RNA序列的分离的活的可转化细胞；

(e)将所述第一表达载体和第二表达载体引入所述分离的活的可转化的细胞内；

(f)表达突变的mRNA干扰酶多肽；和

(g)将分离的细胞维持在容许在所述细胞内表达突变体靶蛋白的条件下。

34.权利要求33的方法，其中第一和第二表达载体各自还包括至少一个调节序列。

35.权利要求34的方法，其中所述至少一个调节序列是至少一个诱导型启动子。

36.权利要求35的方法，其中第一表达载体中的诱导型启动子与编码突变的mRNA干扰酶多肽的突变的核酸序列可操纵地连接。

37.权利要求36的方法，还包括用诱导剂诱导与编码突变的mRNA干扰酶多肽的突变的核酸序列可操纵地连接的诱导型启动子以表达突变的mRNA干扰酶多肽的步骤。

38.权利要求37的方法，其中突变的mRNA干扰酶多肽选择性地切割细胞信使RNA，由此减少非目标细胞蛋白合成。

39.权利要求35的方法，其中第二表达载体中的诱导型启动子与编码突变的靶蛋白的突变的核酸序列可操纵地连接。

40.权利要求39的方法，还包括用诱导剂诱导与编码突变的靶蛋白的突变的核酸序列可操纵地连接的诱导型启动子以表达突变的靶蛋白的步骤。

41.权利要求33的方法，其中第一表达载体中的诱导型启动子与编码突变的mRNA干扰酶多肽的突变的核酸序列可操纵地连接，以及第二表达载体中的诱导型启动子与编码突变的靶蛋白的突变的核苷酸序列可操纵地连接，该方法还包括步骤：

用第一诱导剂诱导与编码突变的mRNA干扰酶多肽的突变的核酸序列可操纵地连接的诱导型启动子以表达突变的mRNA干扰酶多肽；

用第二诱导剂诱导与编码突变的靶蛋白的突变的核酸序列可操纵地连接的诱导型启动子以表达突变的靶蛋白。

42.权利要求33的方法，其中用第一表达载体和第二表达载体共转染细胞。

43.权利要求33的方法，步骤(a)还包括以下步骤：

进一步突变编码突变的mRNA干扰酶多肽的突变的核酸序列以用偏爱密码子替换罕见密码子，以生成编码具有与非突变的mRNA干扰酶多肽的氨基酸序列相同的氨基酸序列的二次突变的mRNA干扰酶的二次突变的核酸序列。

44.权利要求33的方法，步骤(b)还包括以下步骤：

进一步突变编码突变的靶蛋白的突变的核酸序列以用偏爱密码子替换罕见密码子，以生成编码具有与非突变的靶蛋白的氨基酸序列相同的氨基酸序列的二次突变的靶蛋白的二次突变的核酸序列。

45.权利要求33的方法，步骤(a)还包括以下步骤：

进一步突变编码突变的mRNA干扰酶多肽的突变的诱导型核酸序列以用偏爱密码子替换罕见密码子，以生成编码具有与非突变的mRNA干扰酶多肽的氨基酸序列相同的氨基酸序列的二次突变的mRNA干扰酶的二次突变的诱导型核酸序列；以及

步骤(b)还包括以下步骤：

进一步突变编码突变的靶蛋白的突变的核酸序列以用偏爱密码子替换罕见密码子，以生成编码具有与非突变的靶蛋白的氨基酸序列相同的氨基酸序列的二次突变的靶蛋白的二次突变的核酸序列。

46.权利要求45的方法，其中第一表达载体中编码二次突变的mRNA干扰酶多肽的二次突变的核酸序列包括与编码二次突变的mRNA干扰酶多肽的二次突变的核酸序列可操纵地连接的第一诱导型启动子；以及第二表达载体中编码二次突变的靶蛋白的二次突变的核酸序列包括与编码二次突变的靶蛋白的二次突变的核酸序列可操纵地连接的第二诱导型启动子。

47.权利要求46的方法，还包括以下步骤：

用第一诱导剂诱导与编码二次突变的mRNA干扰酶多肽的二次突变的核酸序列可操纵地连接的第一诱导型启动子，以表达二次突变的mRNA干扰酶多肽；以及

用第二诱导剂诱导与编码二次突变的靶蛋白的二次突变的核酸序列可操纵地连接的第二诱导型启动子，以表达二次突变的靶蛋白。

48.权利要求33的方法，其中步骤(a)中所述至少一个第一mRNA干扰酶识别序列、步骤(b)中所述至少一个第二mRNA干扰酶识别序列、和步骤(d)中所述至少一个第三mRNA干扰酶识别序列是相同的mRNA干扰酶识别序列。

49.权利要求48的方法，其中步骤(a)、(b)、和(d)中所述mRNA干扰酶识别序列是腺嘌呤-胞嘧啶-腺嘌呤。

50.权利要求33的方法，其中在步骤(g)中，编码突变的靶蛋白的信使RNA被稳定地保持于细胞中。

51.权利要求45的方法，其中在步骤(g)中，编码二次突变的靶蛋白的信使RNA被稳定地保持于细胞中。

52.权利要求33的方法，其中细胞是真核细胞。

53.权利要求52的方法，其中细胞是哺乳动物细胞。

54.权利要求33的方法，其中细胞是原核细胞。

55.权利要求54的方法，其中细胞是大肠杆菌细胞。

56.权利要求33的方法，其中突变的mRNA干扰酶多肽是MazF。

57.权利要求33的方法，其中突变的mRNA干扰酶多肽是MazF的功能片段。

58.权利要求33的方法，其中突变的mRNA干扰酶多肽是MazF的功能变体。

59.权利要求45的方法，其中二次突变的mRNA干扰酶多肽是MazF。

60.权利要求45的方法，其中二次突变的mRNA干扰酶多肽是MazF的功能片段。

61.权利要求45的方法，其中二次突变的mRNA干扰酶多肽是MazF的功能变体。

62.权利要求33的方法，其中靶蛋白是哺乳动物蛋白。

63.权利要求62的方法，其中哺乳动物蛋白是人类蛋白。

64.权利要求33的方法，其中靶蛋白是酵母蛋白。

65.权利要求33的方法，其中靶蛋白是较少的细菌蛋白。

66.权利要求65的方法，其中靶蛋白是毒性低丰度蛋白。

67.权利要求33的方法，还包括在步骤(g)期间在包括至少一种放射性标记的同位素的培养基中孵育所述细胞的步骤。

68.权利要求33的方法，还包括通过聚合酶链式反应扩增步骤(b)中编码靶蛋白的分离的核酸序列的步骤。

Images