CN114164194B

CN114164194B - 施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶及其应用

Info

Publication number: CN114164194B
Application number: CN202111319543.6A
Authority: CN
Inventors: 冯雁; 黄飞
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2021-11-09
Filing date: 2021-11-09
Publication date: 2024-04-02
Anticipated expiration: 2041-11-09
Also published as: CN114164194A

Abstract

本发明涉及施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI‑RE核酸酶及其应用，属于生物技术领域。本发明以PIWI‑RE家族为对象，首次公开施氏假单胞杆菌(Pseudomonasstutzeri DSM 4166)来源的PIWI‑RE(PsPIWI‑RE)的核酸酶催化特性和作用机制。本发明公开的蛋白、核酸、多酶体系、试剂盒和方法能够对细胞内和细胞外的遗传物质进行位点特异性修饰，为开发基于原核生物来源PIWI‑RE介导的基因编辑、修饰及分子检测技术提供了一种新工具，可应用于核酸检测、基因编辑和基因修饰等生物技术领域。该研究首次阐明PIWI‑RE蛋白工作模式，对于拓展对PIWI超家族的认识，挖掘PIWI家族的新型基因编辑酶具有重要的意义。

Description

施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶及其应用。

背景技术

Argonaute(Ago)蛋白具有短链siRNA/DNA引导的单链DNA/RNA剪切特性，在特定位点切割与siRNA/DNA互补配对的DNA/RNA底物，研究表明其在生物体细胞免疫防御及代谢调控中发挥重要作用。真核生物中作为knockdown目标基因的RNAi技术就是依赖Ago蛋白对靶标RNA的剪切功能，并已成功用于药物开发和疾病治疗。近年来，原核生物Ago同源蛋白(pAgo)，尤其是来源于高温细菌和古菌的，表现了在单链、短DNA或RNA指导的DNA剪切功能，显示了在遗传调控方面的潜力。与目前通用的CRISPR相关酶(Cas)相比，其以碱基配对为基础的精准核酸剪切特性是一致的，然而一方面pAgo对靶标序列无特定motif(PAM/protospacer adjacent motif)的要求，显示了更广泛的基因编辑潜力；另一方面pAgo仅对单链DNA(ssDNA)具有剪切作用，而Cas系统酶则对双链DNA(dsDNA)具有催化作用，这限制了pAgo酶对基因组的编辑，因此以Ago为工具实现体内基因编辑还鲜有报道。理解Ago蛋白的作用机制、探索其对双链DNA的作用规律，并开发广谱基因编辑工具的潜力亟需深入研究。因此挖掘Ago家族新成员，开发更加高效、特异的新Ago蛋白显得尤为重要。

研究报道，常温微生物来源的Ago蛋白能在体外使用一对指导链剪切质粒DNA，例如来自嗜中温原核生物Clostridium butyricum和Limnothrix rosea的CbAgo以及LrAgo等蛋白能够在常温(37℃)条件下利用siDNA guide特异性剪切单链DNA(ssDNA)，也能利用一对siDNA guide剪切双链质粒DNA。但是，它们剪切双链DNA的能力很大程度上取决于双链DNA的GC含量，即其活性依赖于双链DNA的局部解旋。当剪切部位的GC含量高于31％时，双链DNA解旋有限，因此无法实现剪切。利用Ago蛋白在常温下剪切任意GC含量的质粒DNA或线性双链DNA底物，尚未见报道。

因此，寻找能与解旋作用相协同的Ago内切酶，将有利于提高对双链DNA的作用，为基因编辑提供新工具酶。

Eric等人报道了Thermus thermophilus来源的UvrD解旋酶同源蛋白在高温条件下促进TtAgo剪切线性双链DNA。对不同来源的中温解旋酶研究较多，然而其协助中温Ago实现双链DNA剪切尚无报道。本申请的发明人前期也探索了E.coli来源的RecA同源重组酶等蛋白质与NgAgo、CbAgo等蛋白的多酶组合对双链DNA的剪切作用，尚未发现明显的剪切效果。自然界是否已进化能协助Ago蛋白进行基因组编辑的解旋酶尚不可知。

2013年，A Maxwell Burroughs等人通过对基因组序列分析，报道了两类新型PIWI家族蛋白，其中来源于原核生物的新型PIWI蛋白含有两个保守的氨基酸残基：精氨酸(R)和谷氨酸(E)，因此被称为PIWI-RE家族。结构预测表明，PIWI-RE家族蛋白C端含有相对保守的PIWI domain和MID domain，而N端大的未知结构域(N端结构域)取代了典型Argonaute蛋白的N端结构域和PAZ结构域。进一步分析表明，具有核酸酶催化残基(DEDX)motif的Ago仅存在于少部分PIWI-RE家族成员中，推测它们具有内切酶活性。值得注意的是，部分PIWI-RE蛋白基因在原核生物基因组中不是单独存在，而是与预测的DinG解旋酶在同一基因簇。DinG解旋酶属于SF-II解旋酶家族，具有依赖于ATP的DNA解旋酶活性，一般认为其参与DNA损伤修复途径。Oleg等人报道DinG解旋酶在跨活性转录单位的复制过程中特别参与了R-loops的解开。由于PIWI-RE与DinG解旋酶基因簇所代表的可能是一类新的Argonaute蛋白：PIWI-RE具有推测的单链DNA/RNA指导的DNA剪切活性，并可能通过与DinG解旋酶“合作”实现双链DNA的剪切。该类蛋白的催化机制和生理功能尚未见报道。对PIWI-RE及DinG解旋酶酶学特性及体内作用机制的分析，将有利于揭示PIWI-RE蛋白机器的生物学功能，发展新型基因编辑技术系统。

发明内容

基于现有技术的现状，本发明提供一种施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶及其应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明首先提供一种施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶具体来源于施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri)DSM4166菌株。

本发明还提供一种编码所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶的多核苷酸。

在本发明的一个实施方式中，编码所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶的多核苷酸的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶的应用，所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶作为基因编辑或基因修饰工具的应用。

进一步地，所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶作为RNA指导的DNA剪切工具的应用。

在本发明的一个实施方式中，所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶作为RNA指导的DNA剪切工具时，引导PsPIWI-RE发挥剪切活性的guide长度范围为10-30nt。

进一步地，5’OH-RNA,5’P-RNA引导所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶对配对ssDNA的特异性剪切。

在本发明的一个实施方式中，21nt 5’P-RNA的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，21nt5’OH-RNA的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

进一步地，所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶作为DNA指导的RNA剪切工具的应用。

5’OH-DNA,5’P-DNA引导所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶对配对ssRNA的特异性剪切。

在本发明的一个实施方式中，21nt 5’P-DNA的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，21nt 5’OH-DNA的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一个实施方式中，所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶作为DNA指导的RNA剪切工具时，引导PsPIWI-RE发挥剪切活性的guide长度范围为10-30nt。

在本发明的一个实施方式中，所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶作为基因编辑或基因修饰工具的应用条件为20-65℃范围内，优选为55℃。

在本发明的一个实施方式中，所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶作为基因编辑或基因修饰工具的应用条件为：在含有Mg²⁺和Mn²⁺的条件下使用。

本发明还提供一种包含编码所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶的多核苷酸的表达载体。

本发明还提供一种包含所述表达载体的病毒载体。

本发明还提供一种多酶体系，包括所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶，同时还包括DinG解旋酶，所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶通过与DinG解旋酶“合作”实现双链DNA的剪切。

本发明还提供一种多酶体系，包括所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶，同时还包括短核酸链guide；

所述短核酸链guide选择为5’OH-RNA或5’P-RNA时，所述短核酸链guide引导所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶对配对ssDNA的特异性剪切；

所述短核酸链guide选择为5’OH-DNA或5’P-DNA时，所述短核酸链guide所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶对配对ssRNA的特异性剪切。

在本发明的一个实施方式中，所述短核酸链guide长度范围为10-30nt。

在本发明的一个实施方式中，21nt 5’P-RNA的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，21nt5’OH-RNA的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。21nt 5’P-DNA的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，21nt 5’OH-DNA的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供一种试剂盒，包括所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶，同时还包括DinG解旋酶，所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶通过与DinG解旋酶“合作”实现双链DNA的剪切。

本发明还提供一种试剂盒，包括所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶，同时还包括短核酸链guide；

在本发明的一个实施方式中，所述试剂盒中还包括有含有Mg²⁺或Mn²⁺的盐。

与现有技术相比，本发明以PIWI-RE家族为对象，首次公开施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri DSM 4166)来源的PIWI-RE(PsPIWI-RE)的核酸酶催化特性和作用机制。该研究首次阐明PIWI-RE蛋白工作模式，对于拓展对PIWI超家族的认识，挖掘PIWI家族的新型基因编辑酶具有重要的意义。

本发明公开的蛋白、核酸、多酶体系、试剂盒和方法能够对细胞内和细胞外的遗传物质进行位点特异性修饰，为开发基于原核生物来源PIWI-RE介导的基因编辑、修饰及分子检测技术提供了一种新工具，可应用于核酸检测、基因编辑和基因修饰等生物技术领域。

附图说明

图1：PIWI-RE与常见Argonaute进化树分析结果。

图2：PsPIWI-RE蛋白分子筛纯化A280吸收峰图。

图3：PsPIWI-RE蛋白SDS-PAGE检测结果，黑色箭头所指为PsPIWI-RE蛋白条带。

图4：PsPIWI-RE结合核酸酶切结果，Dnase1为DNA水解酶，Rnase H为RNA水解酶。

图5：EMSA试验检测PsPIWI-RE对5’P-DNA、5’P-RNA、5’OH-DNA、5’OH-RNA四种不同guide的结合情况。

图6：PsPIWI-RE对单链DNA底物的特异性剪切活性，5’P-DNA、5’P-RNA、5’OH-DNA、5’OH-RNA四种不同guide分别与PsPIWI-RE蛋白孵育后，加入78nt单链DNA底物(Target)，变性PAGE凝胶电泳检测剪切结果。

图7：PsPIWI-RE对单链RNA底物的特异性剪切活性，5’P-DNA、5’P-RNA、5’OH-DNA、5’OH-RNA四种不同guide分别与PsPIWI-RE蛋白孵育后，加入45nt单链RNA底物(Target)，变性PAGE凝胶电泳检测剪切结果。

图8：温度对PsPIWI-RE活性的影响。以5’OH-RNA为guide,78nt单链DNA为target，在不同温度下进行target剪切试验，检测温度对PsPIWI-RE活性的影响。

图9：Guide长度对PsPIWI-RE活性的影响，分别以不同长度的5’OH-RNA为guide进行target剪切试验。

图10：金属离子对PsPIWI-RE活性的影响，不同金属离子作为辅基添加到PsPIWI-RE介导的DNA剪切体系。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

PIWI-RE是PIWI超家族家族远缘蛋白的验证

将典型的PIWI-RE蛋白与常见的Argonaute蛋白进行进化树分析，结果如图1所示，结果显示，PIWI-RE属于PIWI超家族远缘蛋白家族，与常见Argonaute蛋白亲缘关系较远，独立为独特的一个亚家族。

本申请以下实施例中选取来源于施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri)DSM4166菌株的PIWI-RE蛋白(PsPIWI-RE)为对象，描述了该蛋白及其同基因簇DinG解旋酶(PsDinG2)的相互关系。

来源于施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri)DSM4166菌株的PIWI-RE蛋白(PsPIWI-RE)，命名为PsPIWI-RE，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

来源于施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri)DSM4166菌株的PIWI-RE蛋白(PsPIWI-RE)的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2

重组蛋白表达与纯化

来自施氏假单胞杆菌DSM4166菌株的PIWI-RE蛋白(PsPIWI-RE,Accessionnumber:WP_014597637.1)编码基因经过密码子优化后，克隆到表达载体pET28a(pET28a-PsPIWI-RE)。用该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆菌落接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，摇瓶培养过夜，按照1:100转接到1L LB液体培养基继续培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，转为20℃，200rpm培养16h。离心收集菌体，以LysisBuffer(20mM Tris–HCl pH 7.5,1M NaCl,10mM咪唑)重悬菌体，高压破碎。12000rpm离心30min，收集上清。以Ni-NTA亲和层析柱纯化。纯化时，以含有20mM imidazole的lysisbuffer洗涤20个柱体积，以含有200mM咪唑的lysis buffer洗脱5-10ml。洗脱蛋白经过分子筛(GE HealthCare,Superdex 200Increase 10/300GL)纯化后，浓缩到浓度为1mg/mL，蛋白冻存于-80℃冰箱。SDS-PAGE检测蛋白质纯度。

PsPIWI-RE蛋白分子筛纯化A280吸收峰图如图2所示，PsPIWI-RE蛋白SDS-PAGE检测结果如图3所示，黑色箭头所指为PsPIWI-RE蛋白条带。原核表达的PsPIWI-RE蛋白浓度为1mg/ml，SDS-PAGE检测显示蛋白纯度较高，无明显杂质蛋白，说明制备的PsPIWI-RE蛋白可用于活性检测。

实施例3

PIWI-RE蛋白共结合核酸提取

携带PsPIWI-RE表达质粒(pET28a-PsPIWI-RE)的大肠杆菌BL21(DE3)菌株，经过IPTG诱导后，离心收菌，以Lysis Buffer(20mM Tris–HCl pH 7.5,250mM NaCl,10mMimidazole)重悬菌体，高压破碎。12000rpm离心30min，收集上清。以Ni-NTA亲和层析柱纯化。以含有20mM imidazole的Lysis buffer洗涤20个柱体积，以含有200mM咪唑的lysisbuffer洗脱5-10ml。取纯化的蛋白1mL加入蛋白酶K处理1小时，加入等体积苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，上清中的核酸经过乙醇沉淀后，加入30-50μL水溶解，核酸被分成三份，一份加入DNase处理，一份加入RNase处理，一份为无核酸酶处理对照。样品用8％天然PAGE凝胶电泳检测。

为探究PsPIWI-RE蛋白的底物类型，本实施例中，PsPIWI-RE被克隆并表达于大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。提取与PsPIWI-RE共纯化的核酸并分析其成分。PsPIWI-RE结合核酸酶切结果如图4所示，Dnase1为DNA水解酶，Rnase H为RNA水解酶。结果显示，与PsPIWI-RE共纯化的核酸主要能够被DnaseⅠ水解，而不能够被Rnase H水解，表明在大肠杆菌内，PsPIWI-RE主要结合的核酸是DNA。

实施例4

EMSA试验

为说明PsPIWI-RE蛋白对短链核苷酸的能力，选取四种不同guide 5’P-DNA、5’OH-DNA、5’P-RNA、5’OH-RNA，每条guide 3’端修饰6-FAM荧光基团，序列为5’-TGAGGTAGTAGGTTGTATAGT-3’(其中RNA guide序列T为U)进行EMSA试验。

具体而言，21nt 5’P-DNA的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

21nt 5’OH-DNA的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

21nt 5’P-RNA的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

21nt5’OH-RNA的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

1μM上述guide链与不同浓度的PsPIWI-RE蛋白在室温孵育20min，以8％Native-PAGE电泳检测PsPIWI-RE与guide结合情况。

为了进一步探究PsPIWI-RE的指导链类型，本实施例中，EMSA试验被设置用于分析PsPIWI-RE与四种不类型的21nt短核酸链(gDNA/gRNA)：5’P-DNA、5’P-RNA、5’OH-DNA、5’OH-RNA之间的结合情况。

EMSA试验检测PsPIWI-RE对5’P-DNA、5’P-RNA、5’OH-DNA、5’OH-RNA四种不同guide的结合情况如图5所示。

结果显示，PsPIWI-RE对四种不同的短核酸链都具有结合能力。

实施例5

PsPIWI-RE的核酸酶活性试验

将终浓度为1μM不同类型的guide和5μM PsPIWI-RE蛋白分别孵育于发反应缓冲液(20mM Tris–HCl pH 7.5,250mM NaCl,2mM DTT，10mM MgCl₂)，室温放置15min,加入0.2μM78nt target DNA链(5’-TCGTAAATAATTTAATTACTATACAACCTACTACCTCGTATAAATTTTTAAATAAATATTGCATTCAAGCTTTTAAT-6-FAM-3’，Sequence ID NO.15),37℃反应2h，加入等体积2×loading buffer(生工生物工程(上海)股份有限公司，B548642)，16％Urea-PAGE电泳检测剪切结果。

本实施例设计单链DNA剪切试验用于确定PsPIWI-RE是否具有RNA/DNA指导的DNA剪切活性。PsPIWI-RE分别与4种不同的21nt短链核酸(5’OH-RNA,5’P-RNA,5’OH-DNA,5’P-DNA)孵育后检测不同指导链条件下PsPIWI-RE对ssDNA或ssRNA的剪切活性。

PsPIWI-RE对单链DNA底物的特异性剪切活性，5’P-DNA、5’P-RNA、5’OH-DNA、5’OH-RNA四种不同guide分别与PsPIWI-RE蛋白孵育后，加入78nt单链DNA底物(Target)，变性PAGE凝胶电泳检测剪切结果如图6所示。

78nt单链DNATarget序列如SEQ ID NO.15所示。

PsPIWI-RE对单链RNA底物的特异性剪切活性，5’P-DNA、5’P-RNA、5’OH-DNA、5’OH-RNA四种不同guide分别与PsPIWI-RE蛋白孵育后，加入45nt单链RNA底物(Target)，变性PAGE凝胶电泳检测剪切结果如图7所示。

45nt单链RNA底物(Target)序列如SEQ ID NO.16所示。

结果显示，5’OH-RNA,5’P-RNA可以引导PsPIWI-RE对配对ssDNA的特异性剪切，5’OH-DNA,5’P-DNA可以引导PsPIWI-RE对配对ssRNA的特异性剪切。以上数据表明，PsPIWI-RE虽然不具有典型的N端domian和PAZ domain，但保留了常见Ago蛋白的活性，在常温下RNA指导的DNA剪切，或者DNA指导的RNA剪切活性。相较于已经公开的其他Argonaute蛋白的DNA指导的DNA剪切活性，PsPIWI-RE的剪切活性具有独特性和特异性，在基于Ago蛋白的基因编辑、基因检测等应用方面具有重要意义。

PsPIWI-RE反应条件的优化：

温度对PsPIWI-RE活性的影响：

对于温度梯度试验，将上述反应体系置于不同温度下反应，在不同温度条件下PsPIWI-RE活性进行检测。选择21nt 5’OH-RNA为guide链，78nt ssDNA为target，设置温度梯度为：20、30、37、45、55、65、75、85℃。37℃反应2h，加入等体积2×loading buffer(生工生物工程(上海)股份有限公司，B548642)，16％Urea-PAGE电泳检测剪切结果。

21nt5’OH-RNA的序列如SEQ ID NO.6所示。

在不同温度下进行target剪切试验，检测温度对PsPIWI-RE活性的影响，结果如图8所示，结果显示PsPIWI-RE在20-65℃范围内均有活性，在55℃活性最高。

Guide长度对PsPIWI-RE活性的影响：

对于guide长度试验，将上述反应体系中的guide长度换成8、10、12、14、16、18、21、25、30nt的5’OH-RNA。37℃反应2h,加入等体积2×loading buffer(生工生物工程(上海)股份有限公司，B548642)，16％Urea-PAGE电泳检测剪切结果。

具体而言，8nt 5’OH-RNA的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

10nt 5’OH-RNA的序列如SEQ ID NO.8所示。

12nt 5’OH-RNA的序列如SEQ ID NO.9所示。

14nt 5’OH-RNA的序列如SEQ ID NO.10所示。

16nt 5’OH-RNA的序列如SEQ ID NO.11所示。

18nt 5’OH-RNA的序列如SEQ ID NO.12所示。

21nt5’OH-RNA的序列如SEQ ID NO.6所示。

25nt 5’OH-RNA的序列如SEQ ID NO.13所示。

31nt 5’OH-RNA的序列如SEQ ID NO.14所示。

Guide长度对PsPIWI-RE活性的影响结果如图9所示，结果显示，引导PsPIWI-RE发挥剪切活性的guide长度范围为10-30nt。

盐离子浓度的和金属离子对PsPIWI-RE活力的影响：

使用不同的金属离子作为辅基分析PsPIWI-RE的DNA剪切活性，PsPIWI-RE使用Mg² ⁺、Mn²⁺、Co²⁺为辅基。

对于不同金属离子试验，将上述反应中的10mM MgCl₂，替换成10mM FeCl₂、CoCl₂、CuCl₂、NiCl₂、MgCl₂、MnCl₂、ZnCl₂、CaCl₂溶液。

金属离子对PsPIWI-RE活性的影响结果如图10所示，结果表明，在含有Mg²⁺和Mn²⁺的条件下活性较高。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 783

<212> PRT

<213> 施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri)

<400> 1

Met Lys Ala Leu Glu Leu Arg Thr Ser Leu Phe Lys Phe Asp Ala Thr

1 5 10 15

Gln Leu Gly Gln Ala Tyr Arg Val Val Ile Gly Pro Gln Tyr Leu Asp

20 25 30

Ala Trp Gln Ala Leu Gln Gly Leu Val Lys Lys Pro His Pro Gly Leu

35 40 45

Pro Thr Thr Gly Leu Glu Glu Met Leu Ala Val Leu Ser Arg Gly Pro

50 55 60

Val Lys Val Asp Leu Phe Pro Gln Lys Lys Gly Gly Val Ser Ala Ile

65 70 75 80

Leu Met Leu Tyr Pro Leu Ser Val Asp Thr Ile Asn Glu Val Leu His

85 90 95

Leu Trp Ser Met Asp Val Leu Arg Ile Trp Asn Glu Gln Leu Val Gly

100 105 110

Ile Glu Gly Lys Leu Ile Val Thr Asp Val Val Pro Leu Asp Thr Ser

115 120 125

Arg Leu Val Thr Pro Gly Asp Ile Ser Ser Leu Ala Tyr Thr Val Ile

130 135 140

Pro Trp Leu Val Gly Gln Ala Leu Ile Gln Thr Pro Met Gln Ala Ala

145 150 155 160

Arg Pro Ile Lys Leu Tyr Gln Ala Ala Asp Ser Ser Leu Leu Ala Trp

165 170 175

Asp Asp Pro Ile Val Ser Glu Asn Asp Val Arg Tyr Ala Ser Ala Leu

180 185 190

His Ala Ile Glu Pro Thr Leu Val Leu Leu His Gly Arg Pro Gln Pro

195 200 205

Tyr Ile Gln Leu Arg Val Lys Leu Thr Gln Val Met Pro Asn Leu Val

210 215 220

Gly Lys Lys Lys His Ala Trp Val Lys Thr Gly Asp Leu Ile Val Lys

225 230 235 240

Ala Lys Leu Lys Thr Lys Lys Thr Asp Glu Gly Trp Glu Thr Thr Tyr

245 250 255

Glu His Pro Val Glu Lys Leu Leu Thr Phe Met Gly Val Gln Ser Phe

260 265 270

Pro Pro Met Val Asp Gly Asp Ile Pro Val Asp Ser Asp Val Arg Pro

275 280 285

Ile Tyr Ala Ile Pro Pro Ser Asn Pro Met Ile Ala Ser Gly Pro Gly

290 295 300

Pro Leu Phe Leu Asp Gln Ala Gly Phe His Leu Leu Ala Ser Leu Pro

305 310 315 320

Gly Thr Ala Pro Leu Leu Val Lys Lys Ala Val Ala Ser Leu Arg Glu

325 330 335

Glu Lys Val Val Asn Thr Gly Glu Ala Ala Asn Leu Asn Ala Met Val

340 345 350

Leu Ala Ala His Ala Asp Val Met Leu Arg Leu His Ala Ala Ser Thr

355 360 365

Thr Leu Ala Gln Asp Ser Lys Phe Phe Asp Lys Val Met Pro Pro Leu

370 375 380

Val Ala Leu Thr Arg Leu Asp Val Pro Asp Ala Gln Arg Met Leu Glu

385 390 395 400

Gly Lys His Asp Ser Asn Ser Leu Asn Asp Trp Leu Met Asn His Val

405 410 415

Val Pro Ala Ser Lys Gln Ala Ser Glu Asn Gly Ala Lys Val Met Ile

420 425 430

Val Glu Thr Ser Thr Ser Ala Ala Ser Gln Glu Ala Gly Leu Asp Pro

435 440 445

Lys His Val Ile Arg Arg Val Leu Ala Lys His Gly Ile Ala Thr Gln

450 455 460

Phe Ile Met His Ile Asp Pro Asp Ala Gln Ala Lys Arg Arg Lys Thr

465 470 475 480

Lys Ala Asp Asp Arg Asp Phe Lys Ala Thr Asn Ser Ile Ile Glu Ala

485 490 495

Ile Arg Leu Ser Gly His Leu Pro Val Pro Thr Pro Lys Val Lys Ser

500 505 510

Met Pro Ala Ser Thr Thr Val Leu Ser Ile Leu Leu Asp Arg Ile Gln

515 520 525

Asp Lys Gly Pro Ala Ile Tyr Leu Pro Val Ile Thr Arg Thr Val Leu

530 535 540

Gly Gly Asn Lys Pro Glu Val Phe Trp Phe Glu Ser Cys Leu Asp Ser

545 550 555 560

Asn Gly Lys Trp Phe Ser Tyr Gly Glu Gly Leu Ala Ala Ile His Gly

565 570 575

Thr Asp Thr Leu Leu Lys Pro Asp Gln Leu Lys Thr Leu Val Thr Gln

580 585 590

Ser Leu Leu Asp Cys Lys Ile Asn Ser Asn Asp Ser Leu Ile Val Cys

595 600 605

Leu Asp Ala Asn Leu Arg Thr Phe Tyr Gly Ala Leu Lys Asp Gly Pro

610 615 620

Gly Glu Gly Leu Pro Pro Val Pro Ser Asp Ala Ala Val Val Arg Ile

625 630 635 640

Arg Ala Asp His Gln Val Ala Gln Ile Ser Gly Asn His Thr Leu Ser

645 650 655

Pro Asn Ser Ala His Tyr Ile Gly Thr Lys Val Gly Ala Phe Gln Ser

660 665 670

Cys Glu Ser Ala Ser Val Phe Tyr Phe Val Ser Pro Ser Lys Gln Tyr

675 680 685

Gly Ser Val Arg Ser Gln Arg Glu Asn Thr Arg Tyr Asp Val Ser Glu

690 695 700

Arg Asp Leu Arg Asp Pro Trp Gln Gln Leu Gly Val Thr Glu Ile Thr

705 710 715 720

Ile Ile Thr Pro Gly Ala Phe Ser Thr Ala Thr Val Ile Ala Glu Gln

725 730 735

Val Ala Leu Leu Cys Arg Asn Pro Ser Leu Trp Asp Gly Tyr Leu Arg

740 745 750

Leu Pro Gly Pro Met His Leu Gly Lys Gln Val Ala Ala Asp His Pro

755 760 765

Ile Leu Glu Met Arg Arg Lys Ser Glu Ala Asn Arg Tyr Gly Asn

770 775 780

<210> 2

<211> 2352

<212> DNA

<213> 施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri)

<400> 2

atgaaggccc ttgagctacg caccagccta ttcaaatttg atgcgaccca attggggcaa 60

gcctaccgtg tggtaatcgg cccccagtat ctcgacgcgt ggcaagcgct tcaggggctg 120

gttaaaaagc cacatccggg cctgcctacg acaggattgg aggagatgct tgccgttctt 180

tcccggggcc ccgtaaaggt ggacctattc ccccaaaaaa agggcggtgt ctcggcaatt 240

ctcatgctct atccgctgtc ggtcgacact atcaacgagg tgctccacct atggtcgatg 300

gacgtcctta ggatttggaa cgagcaactg gtcggcattg aaggaaagtt gatcgtcacc 360

gacgtggtgc cgctggatac aagtcgtcta gtcacgcctg gagacatttc atcgctcgcg 420

tatacggtca ttccttggct ggtgggacaa gccctcatac aaacgcccat gcaggcagcg 480

aggcccatca agctgtacca ggcagctgat tccagcttgc ttgcatggga tgaccctatc 540

gtttccgaaa atgatgtccg atatgccagt gcactgcatg ctatcgaacc gactcttgtc 600

ttgctgcacg gtcggccgca gccctacatc cagctacgtg tgaaactgac ccaggtgatg 660

cccaaccttg taggcaagaa aaaacatgcc tgggtcaaaa ccggcgacct gatcgtcaaa 720

gcgaagctca aaaccaagaa gacggacgaa ggctgggaaa ctacgtacga gcaccctgtc 780

gagaagctgc tgaccttcat gggcgtacag tcgtttcctc caatggtcga cggcgacatc 840

cccgtcgaca gcgacgtgag acccatctac gccatcccac cgtcaaatcc aatgattgcg 900

tcaggccctg gcccgctgtt cctcgaccaa gccggctttc acctccttgc aagtctgcct 960

ggaacggctc cgcttctggt caagaaggcg gtggctagct tacgagagga gaaggttgtc 1020

aacacgggag aggccgccaa tctgaacgcg atggtactcg cagcacacgc tgacgtgatg 1080

ctgcggctac atgcagccag taccaccctg gcccaggaca gcaagttctt cgataaggtg 1140

atgcctcctc tcgtggcact gacacgcctg gatgtaccgg acgcgcagcg aatgcttgaa 1200

ggaaaacatg acagcaacag cctaaacgac tggctaatga accatgtggt gcccgctagc 1260

aagcaggctt ctgaaaatgg cgcaaaggta atgatcgttg agaccagtac gtccgctgcc 1320

tctcaggaag cagggctaga ccccaagcac gtcattcgaa gggtactggc aaagcacggc 1380

atcgcgaccc agttcatcat gcatatcgac cctgatgcac aagctaagag gcggaagacc 1440

aaagcggatg atcgtgattt caaagctacc aactcgatca tcgaagcgat tcgactaagc 1500

gggcacctcc ccgttccgac gcccaaagta aaatcgatgc cggcgagcac aacggtgctg 1560

tcgattttgc tggatagaat tcaggataaa ggcccggcca tctatctgcc ggttatcacc 1620

cggacggtgt tgggcgggaa taaaccagag gttttctggt tcgaatcttg cttggactcc 1680

aatggcaaat ggttcagcta cggcgagggc ttggccgcca tccacgggac ggacactctg 1740

ctcaagcctg accaattgaa gacattggtc acccaatcct tgctggactg caagatcaat 1800

tcgaacgact cgttgatcgt ctgcctcgat gccaatctaa gaaccttcta tggagcattg 1860

aaagatggcc ccggggaggg tcttcctccc gtcccatcag atgccgctgt cgtccgcatt 1920

cgagccgatc accaggtagc acagatcagc ggcaaccaca ccttgtctcc caactcggct 1980

cactacatcg ggacgaaggt gggagctttt caatcttgcg agagcgcctc ggtattttat 2040

ttcgtgtcac cgtctaagca gtacggcagc gttcgctcac agcgcgagaa cacaagatac 2100

gacgtatcag aacgagacct gcgagatcca tggcagcagt tgggcgtaac agaaatcacg 2160

atcataacgc ccggggcatt tagcactgcg acagtgatcg ctgaacaggt cgccttgctg 2220

tgcaggaacc cttcactgtg ggacggctac ctgcgtctgc ctgggcccat gcacttgggc 2280

aaacaagtag cggcagacca tccaattttg gaaatgcgac gcaagtctga agcgaaccgg 2340

tatggaaatt ag 2352

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgaggtagta ggttgtatag t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgaggtagta ggttgtatag t 21

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ugagguagua gguuguauag u 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ugagguagua gguuguauag u 21

<210> 7

<211> 8

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ugagguag 8

<210> 8

<211> 10

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ugagguagua 10

<210> 9

<211> 12

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ugagguagua gg 12

<210> 10

<211> 14

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ugagguagua gguu 14

<210> 11

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ugagguagua gguugu 16

<210> 12

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ugagguagua gguuguau 18

<210> 13

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ugagguagua gguuguauag uauau 25

<210> 14

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ugagguagua gguuguauag uauauuaaau u 31

<210> 15

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tcgtaaataa tttaatatac tatacaacct actacctcgt ataaattttt aaataaatat 60

tgcattcaag cttttaat 78

<210> 16

<211> 45

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

auauacuaua caaccuacua ccucguauaa auuuuuaaau aaaua 45

Claims

1.一种施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶的应用，其特征在于，

5’OH-RNA，5’P-RNA引导所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶对配对ssDNA的特异性剪切，5’P-RNA的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示， 5’OH-RNA的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示；或，

5’OH-DNA，5’P-DNA引导所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶对配对ssRNA的特异性剪切，5’P-DNA的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，5’OH-DNA的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示；

施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶作为基因编辑或基因修饰工具的应用条件为20-65℃；

所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶作为基因编辑或基因修饰工具的应用条件为：在含有Mg²⁺和Mn²⁺的条件下使用。

2.一种多酶试剂盒，其特征在于，包括施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶、短核酸链guide，以及含有Mg²⁺或Mn²⁺的盐，

所述短核酸链guide选择为5’OH-RNA或5’P-RNA时，5’P-RNA的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，5’OH-RNA的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述短核酸链guide引导所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶对配对ssDNA的特异性剪切；

所述短核酸链guide选择为5’OH-DNA或5’P-DNA 时，5’P-DNA的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，5’OH-DNA的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述短核酸链guide所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶对配对ssRNA的特异性剪切。