KR101064783B1

KR101064783B1 - ｍＲＮＡ 인터퍼라제를 이용하여 살아 있는 세포에서 단일 단백질 생산을 촉진하는 방법

Info

Publication number: KR101064783B1
Application number: KR1020077012576A
Authority: KR
Inventors: 이노우예 마사요리; 준지에 창; 모투 스즈키
Original assignee: 유니버시티 오브 메디신 앤드 덴티스트리 오브 뉴 저지
Priority date: 2004-11-04
Filing date: 2005-11-04
Publication date: 2011-09-14
Also published as: KR20080088350A; EP1812582A2; CN101052713B; JP2008518623A; WO2006055292A3; EP1812582A4; CN101052713A; WO2006055292A2; JP5013375B2; CA2577180A1

Abstract

본 발명은 mRNA 인터퍼라제의 독특한 성질을 이용한 살아 있는 대장균(E. coli) 세포에서의 SPP 시스템을 개시하며, 상기 mRNA 인터퍼라제로는 박테리아 독소로서 단일 가닥 RNA- 및 ACA-특이적 엔도리보뉴클레아제인 MazF를 일예로 들 수 있으며, 상기 MazF는 생체 조건(in vivo)에서 효율적으로 그리고 선택적으로 모든 세포 mRNA들을 분해하며, 그 결과 총 단백질 합성을 급격히 감소시킨다. ACA-결핍 mRNA를 엔코딩하도록 유전자조작된 목표 유전자와 MazF의 동시-발현(concomitant expression)은 백그라운드 세포 단백질 합성이 사실상 부재한 상태에서 표적 단백질 발현을 지속적으로 유지시켜 높은 수준으로(90% 까지) 표적 단백질 합성을 유발한다. 놀랍게도, 표적 단백질의 합성은 적어도 4일간 지속되며, 이는 세포가 이들의 성장 지체에도 불구하고 전사 및 번역 능력을 보유하고 있음을 시사하는 것이다. SPP 기술은 효모와 인간 단백질에 매우 적합하며, 심지어 박테리아의 내재성 막 단백질에도 유용하다. 상기 신규 시스템은 견줄데 없는 신호 대비 잡음 비율로 인하여 이전부터 생물학적으로 중요하게 여겨졌으나 다루기 어려웠던 단백질들의 구조적 기능적 연구를 매우 간편하게 할 수 있도록 할 수 있다.

mRNA 인터퍼라제, SPP 시스템, MazF

Description

ｍＲＮＡ 인터퍼라제를 이용하여 살아 있는 세포에서 단일 단백질 생산을 촉진하는 방법{SINGLE PROTEIN PRODUCTION IN LIVING CELLS FACILITATED BY A MESSENGER RNA INTERFERASE}

본 출원과 관련된 크로스-레퍼런스

본원은 이노우에(Inouye)와 그의 동료 저자들에 의해 "mRNA 인터퍼라제에 의해 살아 있는 세포에서 이용이 용이해진 단일 단백질(Single Protein in Living Cells Facilitated by an mRNA Interferase)"로 발명의 명칭이 부여되어, 2004년 12월 4일자로 출원된, 미국 가출원(U.S. Provisional Application) 제 60/624,976호의 우선권 주장 출원이다. 상기 출원에 개시된 모든 사항은 본원의 레퍼런스로써 통합되어 있다.

발명이 속하는 기술 분야

본 발명은 단일-가닥 RNA- 및 서열-특이적 엔도리보뉴클레아제(sequence-specific endoribonuclease)인 mRNA 인터퍼라제를 이용하여 살아 있는 세포에서 단일-단백질(single-proteins) 생산을 촉진하는 시스템에 관한 것이다.

대부분의 박테리아는 세포 스트레스에 노출시 발현되어 성장 저해와 최종적인 세포사멸을 유도시키는 자살 유전자(suicidal genes)를 포함하고 있다(Ann. Rev. Microbiol. 53: 43-70 (1999) 에서 Elenberg-Kulka 및 Gerdes; Trends Microbiol. 12: 66-71 (2004)에서 Engelberg-Kulka 와 그 동료저자들에 의해 검토됨). 이러한 독소(toxin) 유전자들은 일반적으로 동일 오페론(애딕션 모듈(addiction module) 또는 항독소-독소 시스템(antitoxin-toxin system)으로 지칭됨)내의 이들의 동족 항독소 유전자들(cognate antitoxin genes)과 함께 동시-발현(co-expression)된다. 대장균은 5개의 애딕션 모듈을 가지고 있으며(Christensen et al., J. Mol. Biol. 332: 809-19 (2003)), 상기 모듈 중 MazE/MazF 모듈이 가장 폭넓게 연구되어 왔다. MazE/MazF 복합체의 x-레이 구조(Kamada et al., Mol. Cell 11: 875-84 (2003)는 이미 공지되어 있으며, 또한 최근에 MazF의 효소 활성이 밝혀진 바 있다(Zhang et al, J. Biol. Chem. 278: 32300-306 (2003)).

MazF는 특이적으로 ACA 서열에서 단일-가닥 RNA들로 절단되는 서열-특이적 엔도리보뉴클레아제이다. 엔도뉴클레아제는 핵산 사슬내 여러 위치에서 핵산을 절단시키는 거대한 효소 그룹 중 하나이다. 엔도리보뉴클레아제 또는 리보뉴클레아제는 RNA에 특이적이다. MazF는 생체내에서(in vivo) 이의 일차 표적(target)이 전령 RNA(mRNA)이므로, mRNA 인터퍼라제에 속한다. 운반 RNA(tRNAs) 및 리보좀 RNA(rRNAs)는 각각 이의 이차 구조 또는 라이보좀 단백질과의 결합 중 어느 한 요인으로 인하여 절단으로부터 보호되는 것으로 보여진다. 그러므로, MazF 발현은 거의 완전한 mRNA 분해를 일으키며, 단백질 합성의 극심한 감소 및 최종적으로 세포 사멸을 유도한다(Zhang et al, Mol. Cell 12: 913-23 (2003)). MazF는 선별된 박테리아에서 발견되었으며, 최근에 대장균 단백질 PemK(플라스미드 RlOO에 의해 엔코딩된)가 또한 서열-특이적 엔도리보뉴클레아제인 것으로 밝혀진 바 있다(Zhang et al., J. Biol. Chem. 279: 20678-20684 (2004)). 상기 PemK는 특정 핵산 서열 즉, UAX(여기서 X는 C, A 또는 U임)에 높은 특이성을 가지고 RNA를 절단한다. 본 발명의 레퍼런스로 통합된 PCT/US2004/018571를 참조하기 바란다. 상기 서열-특이적 엔도리보뉴클레아제는 보존되어 있으나, 생리학 및 진화에 있어서 이들의 본질적인 역할에 대해서는 저평가되어 있다. 본 발명자들은 상기 서열 특이적 엔도리보뉴클레아제 독소의 패밀리를 "mRNA 인터퍼라제"로 정의한다(Zhang et al., J. Biol. Chem. 279: 20678-20684 (2004)).

본 연구에서, 본 발명자들은 살아 있는 대장균 세포에서 SPP 시스템(single-protein production system)을 고안하기 위해 MazF의 특이한 절단 특성에 대해 탐구하여 왔다. 아미노산 서열의 변형 없이 ACA-결핍 mRNA(ACA-less mRNA)를 발현하도록 조작된 유전자의 발현시, 백그라운드 세포 단백질(background cellular protein) 합성은 사실상 결여된 반면, 개개의 표적 단백질 합성은 적어도 96시간 동안 높은 수준으로 지속되었다. 따라서, MazF의 독성 효과는 세포 생리에 있어 최소한의 부작용을 갖는 mRNA와 관련되어 있다. 사실상, 세포의 성장 지체 상태에도 불구하고, 이러한 세포들은 에너지 대사(ATP 생산), 아미노산 및 뉴클레오티드 생합성 그리고 전사 및 번역을 위한 필수적인 대사 및 생합성 활성을 유지한다. 본 발명은 인간 및 효모 단백질 발현을 위한 SPP 시스템의 효율에 대한 입증뿐만 아니라, 천연상태에서는 그 발현 수준이 비교적 낮은 내재성 내막 단백질(integral inner membrane protein)의 과발현에도 효과적이었음을 개시한다. 상기 SPP 시스템은 실험과정에서 단백질 동정시 단백질 회수를 위해 요구되는 임의의 단백질 정제 단계의 배제와 보다 중요하게는, 비손상된 살아 있는 세포에서 단백질의 구조적 기능적 연구를 모두 가능하게 하는 전례가 없는 신호 대 잡음 비율(signal to noise ratios)을 나타낸다.

도. 1은 MazF 동시-발현 유무와 pColdI(SP-1) 및 pColdI(SP-2) 사용에 따른 인간 이오탁신(eotaxin) 발현양상을 보여주는 도면이다.

도. 2는 이오탁신 발현에 있어서 ACA 서열의 영향을 보여주는 도면이다.

도. 3은 이오탁신 발현에 있어서, MazF ORF의 모든 ACA 서열이 제거된 경우 그에 따른 영향을 보여주는 도면이다.

도. 4는 SPP 시스템에서 효모 단백질의 발현을 보여주는 도면이다.

도. 5는 발현벡터 pColdIV(SP-2)를 이용한 SPP 시스템에서 내막 단백질, LspA의 발현양상을 보여주는 도면이다.

발명의 개요

본 발명은 mRNA 인터퍼라제의 독특한 성질을 이용한 살아 있는 대장균(E. coli) 세포에서의 SPP 시스템을 개시하며, 상기 mRNA 인터퍼라제로는 박테리아 독소로서 단일 가닥 RNA- 및 ACA-특이적 엔도리보뉴클레아제인 MazF를 일예로 들 수 있으며, 상기 MazF는 생체내에서 효율적으로 그리고 선택적으로 모든 세포 mRNA들을 분해하며, 그 결과 총 단백질 합성을 급격히 감소시킨다.

본 발명의 일태양(embodiment)으로, 본 발명은 비-표적 세포 단백질(non-target cellular proteins) 합성은 감소되는 반면, 형질전환가능한 살아 있는 세포(transformable living cell)에서 단일 표적 단백질(single target proteins)은 발현시키는 시스템을 제공하며, 상기 시스템은 하기를 포함한다: (a) 하나 이상의 제 1 mRNA 인터퍼라제 인식 서열을 갖는 세포 mRNA를 포함하는 분리된 형질전환가능한 살아 있는 세포; (b) mRNA 인터퍼라제 폴리펩티드를 엔코딩하는 분리된 핵산 서열을 포함하는 제 1 발현 벡터, 여기서 상기 mRNA 인터퍼라제 폴리펩티드를 엔코딩하는 분리된 핵산 서열은 돌연변이된 mRNA 인터퍼라제 폴리펩티드를 엔코딩하는 돌연변이된 핵산 서열을 생산하기 위해 하나 이상의 제 2 mRNA 인터퍼라제 인식 서열을 별개의 트리플렛 코돈 서열(alternate triplet codon sequence)로 대체함으로써 돌연변이된 것을 특징으로 하며; 및 (c) 선택적으로, 표적 단백질을 엔코딩하는 분리된 핵산 서열을 포함하는 제 2 발현 벡터, 여기서 표적 단백질을 엔코딩하는 분리된 핵산 서열은 돌연변이된 표적 단백질을 엔코딩하는 돌연변이된 핵산 서열을 생산하기 위해 하나 이상의 제 3 mRNA 인터퍼라제 인식 서열을 별개의 트리플렛 코돈 서열로 대체함으로써 돌연변이된 것을 특징으로 하며; 여기서 상기 분리된 세포는 상기 제 1 발현 벡터 및 제 2 발현 벡터로 형질전환되며; 여기서 상기 분리된 세포는 세포내에서 상기 돌연변이 표적 단백질의 발현이 허용되는 조건하에서 유지되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 분리된 살아 있는 세포에서 표적 단백질의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다: (a) 돌연변이된 mRNA 인터퍼라제 폴리펩티드를 엔코딩하는 돌연변이된 핵산 서열을 생산하도록 하나 이상의 제 1 mRNA 인터퍼라제 인식 서열을 별개의 트리플렛 코돈 서열로 대체하여 mRNA 인터퍼라제 폴리펩티드를 엔코딩하는 분리된 핵산 서열을 돌연변이시키는 단계; (b) 돌연변이된 표적 단백질을 엔코딩하는 돌연변이된 핵산 서열을 생산하도록 하나 이상의 제 2 mRNA 인터퍼라제 인식 서열을 별개의 트리플렛 코돈 서열로 대체하여 표적 단백질을 엔코딩하는 분리된 핵산 서열을 돌연변이시키는 단계; (c) 단계 (a)의 돌연변이된 핵산 서열을 포함하는 제 1 발현벡터 및 단계 (b)의 돌연변이된 핵산 서열을 포함하는 제 2 발현 벡터를 준비하는 단계; (d) 제 3 mRNA 인터퍼라제 인식 서열 중 적어도 하나를 포함하는 세포 mRNA 서열을 갖는 동정된 형질전환가능한 살아 있는 세포를 준비하는 단계; (f) 돌연변이된 mRNA 인터퍼라제 폴리펩티드를 발현시키는 단계; 및 (g) 상기 분리된 세포를 상기 세포내에서 돌연변이 표적 단백질의 발현이 허용되는 조건하에서 유지하는 단계.

발명의 상세한 설명

본 발명의 파라미터들은 다음과 같이 정의된다.

축약어 "ACA"는 아데닌(Adenine)-시토신(Cytosine)-아데닌(Adenine) 서열로 정의된다.

여기서 사용된, "엔코드(encode)", "엔코딩(encoding)" 또는 "엔코딩된(encoded)"이라는 용어는, 특정 핵산과 관련하여, 특정 단백질로 변역되는 상기 핵산에 저장된 정보로 정의된다. 단백질을 엔코딩하는 핵산은 상기 핵산의 번역되는 지역 내에 비-번역 서열(예를 들면, 인트론)을 포함하거나 또는 중간에 끼어들어 있는 비-번역 서열이 결여되어 있을 수도 있다(예를 들면, cDNA에서 처럼). 단백질로 엔코딩된 정보는 코돈의 사용으로 특화된다. 전형적으로, 아미노산 서열은 "범용(universal)" 유전 코드를 사용하는 핵산에 의해 엔코딩된다.

여기서 사용된 "코돈(codon)"이라는 용어는 폴리펩티드 사슬내에 존재하는 아미노산 잔기들을 특정하는 트리플렛 뉴클레오티드로 정의된다. 대부분의 개체들은 이들의 폴리펩티드를 만드는 20개 또는 21개의 아미노산을 사용하며, 상기 폴리펩티드들은 단백질 또는 단백질 전구체가 된다. DNA에는 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C) 및 티민 (T)의 네 개의 선택가능한 뉴클레오티드가 존재하기 때문에, 종결 신호를 포함하여 20개의 아미노산 만을 인식하는 64개의 가능한 트리플렛이 존재한다. 이러한 잉여성(redundancy)로 인해, 대부분의 아미노산은 하나 이상의 트리플렛에 의해 코드된다. 하나의 아미노산을 코딩하는 코돈은 동일한 빈도로 사용되지 않는다. 종종 다른 개체들은 동일한 해당 아미노산을 엔코딩하는 몇몇 코돈 중 어느 하나를 특히 "선호(preferences)"함을 보여준다. 만일 코딩 지역이 희귀한 코돈을 높은 수준 또는 일단의 집단(cluster)으로 포함하고 있다면, 유전자의 재합성 또는 돌연변이유발을 통해 상기 희귀 코돈을 제거함으로써 이의 발현을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 레퍼런스로 제시된 J. 샘브룩 및 D.W 러셀의 분자 클로닝을 참조하라(J. Sambrook and D.W. Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001), at 15.12). 따라서, 선택된 숙주에서 발현을 최적화하기 위해 "코돈 선택(codon selection)"이 행해질 것이다. 가장 선호되는 코돈은 높은 수준으로 발현되는 유전자에서 잦은 빈도로 발견되는 코돈이다. 대장균에서의 "코돈 선호"에 대해서는, 본 발명의 레퍼런스로 제시된 코인스버그와 그의 동료 저자들의 논문을 참고하라(Konigsberg, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 80:687-91 (1983)).

통상의 기술자는 엔코딩된 서열내의 하나의 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산을 변형, 부가 또는 결실시키는, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에서의 개개의 치환, 결실 또는 부가가 결국 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환되는 결과를 초래하는 "보존적으로 변형된 변종(conservatively modified variant)"인지 여부를 파악할 수 있을 것이다. 상기 "보존적으로 변형된 변종"이라는 용어는 아미노산 및 핵산 서열 둘 모두에 적용된다. 특히 핵산 서열의 경우, 보존적으로 변형된 변종은 동일하거나 보존적으로 변형된 변종 아미노산 서열을 엔코딩하는 그러한 핵산을 의미하는 것이다. 유전 코드의 축퇴성(degeneracy) 때문에, 대다수의 기능적으로 동일한 핵산은 임의의 주어진 단백질을 엔코딩한다. 예를 들어, UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, 및 CUG 코돈은 모두 아미노산 루신을 엔코딩한다. 따라서, 상기한 코돈 중 하나에 의해 루신으로 정해진 모든 위치에서, 상기 코돈은 엔코딩된 폴리펩티드의 변형없이 상기한 코돈들 중 어느 하나로 변형될 수 있다. 이러한 핵산 변형은 "침묵 변형(silent variations)"이며, 일종의 보존적으로 변형된 변이에 해당한다. 폴리펩티드를 엔코딩하는 여기의 모든 핵산 서열은 유전 코드를 참조함으로써, 상기 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 설명한다. 통상의 기술자는 기능적으로 동일한 분자를 생산하기 위해 임의의 핵산내의 각 코돈(보통 메티오닌의 유일한 코돈인 AUG; 및 트립토판의 유일한 코돈인 UGG를 제외)을 변형시킬 수 있음을 인식하고 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산에 대한 각각의 침묵 변이는 본 발명의 권리범위 이내이다.

여기서 사용된 "이오탁신"이라는 용어는 C-C(또는 베타) 케모카인 패밀리에 속하며 동물 및 인간의 호산구성 염증 상태(eosinophilic inflammatory states)에 관여하는 74개 아미노산 잔기로 구성된 주화성 단백질(chemotactic factor)로 정의된다.

본 발명은 mRNA 인터퍼라제 폴리펩티드의 활성부위, 단편, 유도체, 돌연변이체 및 기능적 변이체를 포함하며, 상기 활성부위, 단편, 유도체 및 기능적 변이체는 상기 mRNA 인터퍼라제의 생물학적 특성을 보유하는 것을 특징으로 한다. mRNA 인터퍼라제 폴리펩티드의 "활성 부위(active portions)"는 전장 길이 폴리펩티드보다 짧지만, 측정가능한 생물학적 활성을 보유한 펩티드로 정의된다. mRNA 인터퍼라제의 "단편(fragments)"은 적어도 5 내지 7개의 연속된 아미노산, 종종 적어도 약 7 내지 9개의 연속된 아미노산, 전형적으로 적어도 약 9 내지 13개의 연속된 아미노산, 가장 바람직하게는 적어도 약 20 내지 30개의 연속된 아미노산 길이의 아미노산 잔기로 정의된다. mRNA 인터퍼라제 또는 이의 단편의 "유도체(derivatives)"는 단백질 아미노산 서열의 변형, 예를 들어, 상기 단백질을 엔코딩하는 핵산의 조작 또는 단백질 자체의 변형에 의해 변형된 폴리펩티드로 정의된다. 천연 아미노산 서열의 이러한 유도체는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 삽입, 부가, 결실, 또는 치환을 포함할 수 있으며, 오리지날 mRNA 인터퍼라제의 본질적인 활성이 달라지거나 그렇지 않을 수 있다.

"유전자"라는 용어는 특별한 기능을 가진 산물(즉, 단백질 또는 RNA 분자)을 엔코딩하는 DNA 세그먼트상의 특별한 지점에 위치한 정렬된 뉴클레오티드 서열로 정의된다. 상기 서열은 엑손사이의 인트론 뿐만 아니라 코딩 DNA 상류 및 하류 지역을 포함할 수 있다.

"유도하다(Induce)" 또는 "유도되는(inducible)"이라는 용어는, 예를 들어, 열과 같은 유발자 또는 조건에 세포가 노출됨으로써 유전자 또는 이의 산물의 전사 또는 합성이 증가되는 것을 의미한다.

"유도물질(Inducer)" 또는 "유도제(inducing agent)"라는 용어는 억제 단백질과 결합하여 오퍼레이터에 더 이상 결합할 수 없는 복합체를 형성하도록 하는 저분자량 화합물 또는 물리적 물질을 의미한다.

"유도(Induction)"라는 용어는 특별한 어떤 효과를 유발하는 활동 또는 과정으로 정의되며, 예를 들면, 개체가 특정 자극에 노출된 다음 특정 유전자 또는 오페론이 전사되거나, 상기 개체에 의해서 단백질 생산이 일어나는 것을 그 예로 들 수 있다.

핵산이 세포로 삽입되는 상황에서 "도입된(introduced)", "형질감염(transfection)", "형질전환(transformation)", "형질도입(transduction)" 이라는 용어는 상기 핵산이 원핵 세포 또는 진핵 세포에 통합된다는 의미로 정의되며, 상기 핵산이 상기 세포의 게놈(예를 들면, 염색체, 플라스미드, 플라스티드 또는 미토콘드리아 DNA)에 통합되거나, 자율복제기점(autonomous replicon)으로 전환되거나, 일시적으로 발현될 수 있음을 포함한다(예를 들면, 형질도입된 mRNA).

"동정된(Isolated)"이라는 용어는 핵산 또는 단백질과 같은 물질이 천연적으로 조성된 환경에서 발견되는 경우처럼, 상기 물질이 보통 수반되거나 상호작용하는 성분들과 실질적으로 분리되었다는 것으로 정의된다. 상기 동정된 물질은 선택적으로 천연 상태에서 존재하는 물질과 함께 발견되지 않는 물질; 또는 만일 상기 물질이 이의 천연 상태에 존재한다면, 통상의 기술자에 의해 합성적으로(비-천연적으로) 변형되어진 물질을 포함할 수 있다. 예를 들면, "동정된 핵산"은 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터에 삽입되거나, 원핵 또는 진핵 세포 또는 숙주 개체의 게노믹 DNA에 삽입된 DNA 분자를 포함할 수 있다. RNA에 적용되는 경우, 상기 "동정된 핵산"이라는 용어는 상기에서 정의한 바와 같이 동정된 DNA 분자에 의해 엔코딩되는 RNA 분자를 주로 의미한다. 다른 한편으로, 상기 용어는 천연 상태에서(즉, 세포 또는 조직내에서) 일반적으로 관련이 있는 다른 핵산으로부터 충분히 분리된 RNA 분자로 정의될 수 있다. 동정된 핵산(DNA 또는 RNA 중 어느 하나)는 추가로 생물적 또는 합성적 수단에 의해 직접적으로 생산되며 이의 생산 동안 존재하는 다른 성분과 분리된 분자로 정의될 수 있다.

축약어 "IPTG"는 락 오페론 억제자(lac repressor)에 결합하여 이를 억제함으로써 락토오스 이용을 촉진시키는 효소인 베타-갈락토시다제의 합성 유도물질인 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)로 정의된다. 예를 들면, IPTG는 합성된 발색 기질(synthetic chromogenic substrate)인 Xgal과 함께 사용되어 lacZ 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터를 사용하는 클로닝 기법에서 비-재조합성 박테리아 콜로니로부터 재조합체가 구별되도록 한다.

특별한 이름을 가진 특별한 효소와 관련하여, 여기서 사용된 "MazF"라는 용어는 일반적인 부류의 엔도리보뉴클레아제 및 본 발명이 제시한 MazF 폴리펩티드의 역할과 일치하는 구조와 서열 상동성(homology)을 갖는 이의 활성 단편 및 유도체로 정의된다.

축약어 "1spA"는 대장균에서 시그날 펩티다제(signal peptidase) Ⅱ 활성과 관련된 유전자로 정의된다.

축약어 "LspA"는 대장균에서 리포단백질 시그날 펩티다제 활성에 관여하는 유전자로 정의된다.

본 발명에 포함되는 효소 패밀리는 "mRNA 인터퍼라제"로 정의된다. 이는 본 발명의 권리범위를 본 발명이 개시한 상기 효소 패밀리의 역할과 일치하는 구조적 기능적 유사성을 갖는 분자로 확장하려는 의도이다.

여기서 사용된, "핵산" 또는 "핵산 분자"라는 용어는 단일 또는 이중 가닥 중 어느 하나인 DNA 또는 RNA 분자를 포함하며, 단일 가닥인 경우, 선형 또는 원형 중 어느 하나의 형태인 상기 분자의 상보적인 서열 분자를 포함한다. 핵산 분자를 논의할 때, 여기에 기술된 특정 핵산 분자의 서열 또는 구조는 5' 에서 3' 방향으로 서열이 제공되는 통상의 규칙에 따라 제시될 것이다. 특별한 언급이 없는한, 상기 용어는 공지된 유사개념을 포함한다.

"올리고뉴클레오티드(Oligonucleotide)"라는 용어는 포스포디에스터 결합에 의해 연결된 둘 이상의, 바람직하게는 셋 이상의 리보- 또는 디옥시리보뉴클레오티드로 구성된 핵산분자로 정의된다.

"오퍼레이터(Operator)"라는 용어는 하나 또는 그 이상의 조절 단백질(억제자 또는 활성자)이 유전자 발현을 조절하기 위해 결합하는 유전자의 상류(5')에 존재하는 DNA 지역으로 정의된다.

여기에서 사용된, "오페론(operon)"이라는 용어는 유전자 발현 조절을 위해 기능적으로 통합된 유전적 단위로 정의된다. 상기 오페론은 구조 유전자의 전사를 조절함으로써 이들의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 및 인접 부위(프로모터 및 오퍼레이터)를 엔코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자로 구성된다. "발현 오페론(Expression operon)"이라는 용어는 프로모터, 인핸서, 전사 개시 신호, 폴리아데닐레이션 신호, 터미네이터 등과 같은 전사 및 번역 조절 서열을 포함하는 핵산 세그먼트로 정의되며, 상기 오페론은 숙주 세포 또는 개체내의 폴리펩티드 코딩 서열의 발현에 이용될 수 있다.

"작동가능하게 연결된(Operably linked)"이라는 어구는 프로모터와 두번째 서열 사이의 기능적 연관관계에 관한 정의를 포함하며, 상기 프로모터 서열은 두번째 서열에 부합하는 DNA 서열의 전사를 개시 및 매개한다. 일반적으로, 상기 어구는 연관된 핵산 서열이 연속되어 있으며, 두개의 단백질 코딩 지역을 결합시킬 필요가 있는 곳에서 연속되어 있으며, 또한 동일 해독틀(reading frame)에 존재하고 있다는 것을 의미한다.

축약어 "ORP"는 펩티드 또는 단백질을 엔코딩하는 능력을 갖고 있으며, 내부 종결 서열에 의해 방해되지 않는 염기 서열을 포함하는 유전자 서열 부분인 "개방 해독틀(open reading frame)"을 지칭한다. 상기 개방 해독틀은 개시코돈으로 시작하여 종결코돈으로 끝난다. 종결 코돈은 폴리펩티드의 말단을 결정한다.

"폴리펩티드(Polypeptide)", "펩티드(peptide)" 및 "단백질(protein)"은 아미노산 잔기의 폴리머로 정의되며, 여기서 호환되어 사용된다. 상기 용어들은 천연적으로 존재하는 아미노산 폴리머뿐만 아니라, 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 천연적으로 존재하는 아미노산의 인공적 화학 유사체인 아미노산 폴리머에 적용된다.

축약어 "PCR"은 DNA의 양을 증폭하여 상기 DNA의 분리, 클론 및 시퀀스를 보다 용이하게 하는 기술인 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)으로 정의된다. 본 발명의 참고문헌으로 통합된 미국 특허 제 5,656,493호, 제 5,33,675호, 제 5,234,824호, 및 제 5,187,083호를 각각 참고하기 바란다.

여기서 사용된 "프로모터(promoter)"라는 용어는 전사를 개시하기 위해 필요한 RNA 폴리머라제와 다른 단백질의 인식 및 결합에 관여하며, 전사 개시부위의 상류(5')에 존재하는 DNA 지역으로 정의된다. "유도성 프로모터(Inducible promoter)"라는 용어는 특정 화합물 즉, 유도물질 또는 유도제의 존재 또는 예를 들어, 온도 상승과 같은 특정된 외부 조건 중 어느 하나에 반응하여 프로모터가 활성화된다는 것을 의미한다.

"위치-지정 돌연변이유발(Site-directed mutagenesis)"이라는 어구는 염기 변형, 즉 돌연변이가 재조합 DNA 방법을 이용하여 DNA의 특정 위치에 도입되는 시험관내 기법(in vitro technique)으로 정의된다.

여기서 사용된 "비번역 지역(untranslated region)" 또는 UTR이라는 용어는 단백질 합성에 관여하지 않는 DNA의 염기 부분으로 정의된다.

특정 핵산 서열의 "변종(variants)", "돌연변이체(mutants)" 및 "유도체(derivatives)"라는 용어는 특정 서열과 밀접하게 관련되어 있으나, 서열 또는 구조 내에 천연적인 변형 또는 인공적인 변형 중 어느 하나를 포함하는 핵산 서열로 정의된다. "밀접하게 관련된(Closely related)"이라는 어구는 뉴클레오티드 서열의 약 60%, 그러나 더 잦은 빈도로서, 85% 이상이 정의된 길이의 핵산 서열과 일치한다는 것을 의미한다. 밀접하게 관련된 핵산 서열들 간의 뉴클레오티드의 변형 또는 차이는 특정 핵산 서열의 특성상 정상적인 복제과정동안 발생하는 뉴클레오티드 서열내의 변화로 나타난다. 특정 목적을 위해 다른 변형이 특별히 고안되어 서열내로 도입될 수 있다. 상기한 변형은 다양한 돌연변이유발 기법을 이용하여 시험관내에서 행해질 수 있다. 특별하게 생성된 이러한 변종 서열은 본래 서열의 "돌연변이체" 또는 "유도체"로 정의될 수 있다.

통상의 기술자는 하나 또는 다수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 대체된 변종 단백질을 생산할 수 있다. 상기 변종 단백질은 하기 변종을 포함하며, 이러한 변종을 획득하기 위한 유전적(억제, 결실, 돌연변이 등), 화학적, 그리고 효소적 기술을 포함하는 기술은 통상의 기술자에게 알려져 있다: (a) 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 보존 또는 비-보존된 아미노산으로 대체된 변종; (b) 하나 또는 그 이상의 아미노산이 부가된 변종; (c) 하나 이상의 아미노산이 치환기를 포함하는 변종; (d) 보존 또는 비-보존된 어느 하나의 위치에 존재하는, 어느 한 종(species)에서 유래한 아미노산 잔기가 대응되는 다른 종의 잔기로 대체된 변종; 및 (d) 표적 단백질이 예를 들어, 항체의 항원결정기(epitope)와 같은 표적 단백질에 유용한 특성을 부여할 수 있는, 융합 파트너(fusion partner), 단백질 태그 또는 다른 화학 성분과 같은 또 다른 펩티드 또는 폴리펩티드와 융합된 변종.

여기서 사용된, "벡터" 및 "발현벡터"라는 용어는 레플리콘(replicon), 즉 파지, 플라스미드, 코스미드, 박미드, 파지 또는 바이러스와 같은 전달체 또는 운반체로 역할 수 있는 임의의 매개체(agent)로 정의되며, 상기 벡터에는 복제하고자 하는 또 다른 유전적 서열 또는 엘리먼트(DNA 또는 RNA 둘 중 하나)가 결합되며, 상기 서열 또는 엘리먼트는 상기 벡터에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다. 본 발며이 개시한 대장균(E. coli) SPP 시스템은 저온에서 단백질 생산이 유도되는, pColdⅠ 벡터를 사용하는 것이 바람직하다.

본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된, 단수형 "부정관사(a)", "접속사(and)", 및 "정관사(the)"는 특별히 달리 언급하지 않는한, 복수의 지칭 대상을 포함하는 것임을 아울러 강조한다. 본원에서 사용된 모든 기술 용어와 과학 용어들은 동일한 의미를 갖는다.

특별히 달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어와 과학 용어들은 본 발명의 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 이해하고 있는 의미와 동일한 의미를 갖는 것으로 정의한다. 비록 여기서 기술된 것과 동일 또는 유사한 임의의 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있을지라도, 이하 본 발명의 바람직한 방법 및 물질을 실시예로 제시한다. 여기에 제시된 모든 공개문헌들은 상기 공개문헌에 인용된 것과 연관성이 있는 방법 및/또는 물질을 개시 및 기술하기 위한 참고문헌으로 통합되어 있다.

하기의 실시예는 통상의 기술자가 본 발명을 실시 및 이용하기 위해 요구되는 완전한 개시사항 및 설명을 제공하기 위한 것이며, 본 발명자들이 본원발명의 권리범위로 간주하고 있는 발명의 범주를 하기의 모든 실시예 또는 단지 수행된 실험에 의해 개시된 범위만으로 한정하고자 하는 의도는 아니다. 사용된 수치(예를 들면, 양, 온도 등)와 관련하여 이의 정확도를 명확히 하기 위한 노력을 하였으나, 몇 가지 실험적 실수 및 오차가 있을 수 있으므로 이를 감안하여야 한다. 특별히 달리 언급하지 않는 한, 부(part)는 중량부, 분자량은 평균 분자량, 온도는 섭씨(degrees Centigrade) 및 압력은 대기압 또는 이와 근사한 압력이다.

균종(Strains) 및 플라스미드

하기 실험에 대장균 BL21(DE3) 세포를 사용하였다. 플라스미드 pACYCmazF를 제조하기 위해 mazF 유전자를 pACYCDuet(Novagen)의 Ndel-Xhol 부위에 클로닝하였다. 상기 pACYCmazF(-9ACA)는 pACYCmazF를 주형으로 사용하여 위치-지정 돌연변이유발을 통해 제작하였다. 이오탁신 유전자는 대장균의 최적 코돈 사용빈도(usage)에 근거하여 합성하였으며(도 2A; 서열번호 1 참조), 상기 유전자를 pColdⅠ(SP-1)의 Ndel-HindⅢ 부위에 클로닝하여 플라스미드 pColdⅠ(SP-1)이오탁신을 제조하였다. 주형으로 pColdⅠ(이오탁신)을 사용한 상기 pColdⅠ(SP-1)이오탁신은 위치-지정 돌연변이유발 기법이 기술된 문헌에 개시된 것과 동일한 방법으로 제작하였다. 퀵체인지 위치-지정 돌연변이유발 키트(QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit, Stratagene)의 사용지침을 준수하여 상기 스타타진(Stratagene) 사(社)에서 제공하는 Pfu DNA 중합효소를 사용하여 돌연변이를 유발하였다. 또한 pColdⅠ(SP-1)이오탁신을 주형으로 사용하여 위치-지정 돌연변이유발 기법에 의해 pColdI(SP-2)이오탁신을 제작하였다. pColdⅠ(SP-1)이오탁신을 주형으로 사용하여 위치-지정 돌연변이유발 기법에 의해 pColdⅠ(SP-1)이오탁신(+ACA)를 제작하였다. 효모 염색체(Yeast chromosome)를 주형으로 하여 PCR로 야생형 Hsp10 유전자를 증폭하였으며, NdeⅠ-BamHⅠ 부위에 상기 증폭된 유전자를 클로닝하여 플라스미드 pColdⅠ(SP-2)Hsp10을 제작하였다. 효모 염색체를 주형으로 사용하여 2-단계 PCR로 ACA-결핍 Hsp10 유전자를 증폭하였으며, 상기 증폭된 유전자를 pColdⅠ(SP-2)의 Ndel-BamHI 부위에 클로닝하여 플라스미드 pColdⅠ(SP-2)Hsp10(-ACA)를 제작하였다. 야생형 Rpb12 플라스미드를 주형으로 사용하여 PCR에 의해 야생형 및 ACA-결핍 Rpb12 유전자를 증폭하였으며, 변형된 서열을 포함하는 5' 및 3' 올리고뉴클레오티드를 pColdⅠ(SP-2)의 NdeⅠ-BamHⅠ 부위에 클로닝하여 플라스미드 pColdⅠ(SP-2)Rpb12 및 pColdⅠ(SP-2)Rpb12(-ACA)를 각각 제작하였다. 2-단계 PCR로 ACA-결핍 LspA 유전자를 증폭하고 pColdⅣ(SP-2)의 NdeⅠ-BamHⅠ 부위에 클로닝하여 플라스미드 pColdⅣ(SP-2)lspA(-ACA)를 제작하였다.

생체내 조건에서 단백질 합성 검정

플라스미드들을 포함한 대장균 BL21(DE3)을 M9-글루코스 배지에서 배양하였다. 배지의 OD₆₀₀ 값이 0.5에 도달했을 때, 상기 배지에 IPTG 1mM을 첨가하고 배양온도를 15℃로 전환하여 45분간 교반하였다. 정해진 시간 간격으로, 10 mCi [³⁵S]-메티오닌을 포함하는 시험관에 배지 1㎖를 첨가하였다. 15분(펄스) 간 인큐베이션한 후, 40 mg/㎖의 메티오닌 0.2㎖를 첨가하고 5분(체이스) 간 인큐베이션하였다. M9-글루코스 배지로 표지된 세포를 세척하고, SDS-PAGE 로딩 버퍼 100㎕에 현탁시켰다. 각 샘플 10㎕를 SDS-PAGE 후, 방사선자동사진법으로 분석하였다.

막 파쇄물 제조

원심분리(10,000xg, 5분간)를 통해 배지 1㎖로부터 수확한 세포를 10mM Tris-HCl(pH 7.5)에 현탁시키고 초음파분쇄(sonication)시켰다. 비파쇄된 세포를 제거한 후, 원심분리(100,000xg, 60 분간)하여 총 막 파쇄물을 획득하였다.

실시예 1. 세포 단백질 합성에 대한 MazF 유도 효과

pACYCmazF를 내포한 대장균 BL21(DE3)를 pColdⅠ(SP-1)이오탁신(A 및 B의 좌측 판넬) 또는 pColdⅠ(SP-2)이오탁신(B 및 C의 우측 판넬) 중 어느 하나로 형질전환시켰다. 세포를 37℃, M9 배지에서 배양하였다. 배지의 OD₆₀₀ 값이 0.5일 때, 상기 배지의 배양온도를 15℃로 전환하고, 15℃에서 45분간 배양하여 세포가 저온에 순응하도록 한 다음, IPTG(1mM)를 첨가하여 이오탁신 및 MazF 둘 모두의 발현(0 시)을 유도하였다. 각 겔 상단에 표기된 시점에 15분간 S-메티오닌으로 세포를 펄스-라벨(pulse-label)하였으며, 총 세포 단백질을 SDS-PAGE(polyacrylaminde gel electrophoresis) 실시 후 방사선자동사진법으로 분석하였다.

mazF 유전자를, IPTG 유도성 파지 T7 프로모터를 포함하는 저 복제수 플라스미드인, pACYC에 클로닝하여 pACYCmazF를 제조하였다. 상기 클로닝 기법은 제이. 샘브룩(J. Sambrook) 및 디.더블유. 레셀(D.W. Russell)이 저술한 분자 클로닝(Molecular Cloning)에 소개된 일반적인 기법이며(A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001) 참조), 상기 논문은 본 발명의 참고문헌으로서 본원에 통합된다. pACYCmazF로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)은, IPTG를 포함하는 아가 플레이트에서 콜로니 형성을 나타내지 아니하였으므로(데이타 미제시), 락 오페론 유도물질인 상기 IPTG에 민감한 것으로 생각된다.

도 1은 MazF 동시-발현 유무에 따른 pColdⅠ(SP-1) 및 pColdⅠ(SP-2)에서의 인간 이오탁신 발현양상을 보여주는 SDS-PAGE 분석사진이다. 도 1B는 pColdI(SP-1)이오탁신으로 형질전환된 세포에서의 결과(왼쪽 판넬); 및 pColdI(SP-2)이오탁신으로 형질전환된 세포에서의 결과(오른쪽 판넬)을 보여준다. 도 1C 는 pACYCmazF 및 pColdI(SP-2)이오탁신으로 형질전환시킨 세포를 LB 배지(왼쪽 판넬) 또는 M9 배지(오른쪽 판넬)에서 배양한 결과를 보여준다. 도 1A 및 도 1B의 세포들은 모두 동일한 방식으로 다루어졌으며, 표시된 시점에, SDS-PAGE를 실시한 다음 쿠마시 블루 염색을 통해 총 세포 단백질을 분석하였다. 동일 부피의 배지를 채취하여 분석을 하였음에 주목하라. 겔의 좌측 방향에 분자량 마커가 존재하며, 이오탁신 위치는 화살표로 지시되어 있다. MazF가 ACA 서열 위치하여 mRNA를 효과적으로 분해함에 따라, MazF 유도를 수반한 37℃에서(Zhang et al., Mol. Cell 12: 913-23 (2003)) 또는 도 1A에 도시된 바와 같이 15℃에서 세포 단백질 합성은 급격히 저해되었다. 이러한 저온-충격 실험(cold-shock experiments)의 첫 단계로 저온-충격 순응을 위해 필요한 저온-충격 단백질을 유도하기 위해 pACYCmazF를 운반하는 세포들을 15℃에서 45분간 배양하였다(Thieringer et al., Bioassays 20(1): 49-57 (1998) 참조). 그런 다음 IPTG를 배지에 첨가하여 MazF 발현을 유도하였다(도 1A 왼쪽 판넬, 0 시). 겔 상단에 표기된 시점에 15분 동안 [³⁵S] 메티오닌으로 세포를 펄스-라벨하였다. 판넬 A의 좌측 판넬은 오직 pACYC이오탁신으로만 형질전환시킨 세포에서의 결과를 보여주며; 판넬 A의 중간 판넬은 pCold(SP-1)이오탁신으로만 형질전환시킨 세포에서의 결과를 보여주며; 및 판넬 A의 우측 판넬은 상기 두 가지 플라스미드 모두로 형질전환시킨 세포에서의 결과를 보여준다.

0시에, IPTG 부재하의 세포에서 관찰된 단백질 패턴(C로 표시된 대조군)과 매우 유사한 단백질 패턴이 관찰되었으며 한편, IPTG의 첨가후 1시간 경과한 시점의 단백질 합성은 급격히 저해되었다. 6시간 후에, 거의 모든 세포 단백질의 합성은 거의 완전히 억제되었다.

실시예 2. MazF-유도 세포에서 ACA-결핍 mRNA의 발현

본 발명자들은 ACA 서열을 포함하지 않도록 유전자 조작시킨 mRNA를 MazF-유도 세포(MazF-induced cells)에서 발현시킬 경우, 상기 mRNA는 상기 세포에서 안정적으로 유지되어, 다른 세포 단백질 생산없이 상기 mRNA에 의해 엔코딩되는 단백질이 생산될 것으로 가정하였다. 상기 가정을 검증하기 위해, 본 발명자들은 아미노산 서열의 변형없이 유전자의 모든 ACA 서열이 제거된 인간 이오탁신 유전자를 합성하였다. 도 2A는 인간 이오탁신의 아미노산 서열 및 이의 유전자 뉴클레오티드 서열을 보여준다. 상기 뉴클레오티드 서열은 대장균에서 선호되는 코돈을 이용하여 디자인되었으며 밑줄그어진 트리플렛은 하기 실험에서 ACA로 변형되었다. 상기 ACA 서열은 64개의 가능한 트리플렛 서열 중 하나로서, 해독틀내에서 상기 ACA 서열의 위치에 관계없이 단백질의 아미노산의 서열에 대한 변형을 일으키지 아니하면서 다른 MazF-비절단 서열(MazF-uncleavable sequences)로 전환될 수 있다.

도 2A(서열번호 1)에 도시된 이오탁신 유전자는 주 저온-충격 단백질인, CspA(Qing et al, Nat. Biotechnol. 22: 877-882 (2004))를 엔코딩하는 cspA 유전자의 번역 강화 인자(translation enhancing element)로부터 획득한 서열, 6개 히스티딘(His) 잔기, 인자 Xa 절단 부위(factor Xa cleavage site) 및 유전자 삽입을 위한 NdeⅠ 부위로부터 유래한 His-Met 서열로 이루어진 17개-잔기 길이의 서열에 융합되었다. 융합 단백질의 전체 코딩 지역은 저온 충격시 단백질을 고발현시키는 저온-충격 벡터인 pColdⅠ(SP-1) 및 pColdⅠ(SP-2) 벡터[Qing et al, Nat. Biotechnol. 22: 877-882 (2004)]에 삽입되었다. pCold(SP-1)의 2개 ACA 서열과 관련하여, 샤인-달가노 서열(Shine-Dalgarno sequence)과 개시 코돈 사이에 위치하는 하나와 번역 강화 인자내에 존재하는 나머지 다른 하나는 AUA로 변형되었다. pColdⅠ(SP-1)내의 상기 2개의 ACA 서열 이외에 pColdⅠ(SP-2)에서, 5'-비번역 지역(5'-UTR)내의 3개의 다른 ACA 서열도 또한 염기 치환에 의해 MazF-비절단 서열로 변형되었다(5'에서 3' 방향으로 각각의 ACA는 GCA, AUA 및 GCA로 변형되었음). 그 결과 획득된 각각의 컨스트럭트, 즉 pColdⅠ(SP-1)이오탁신 및 pColdI(SP-2)이오탁신을 사용하여 대장균 BL21(DE3) 세포를 형질전환시켰다.

pColdⅠ(SP-1)이오탁신으로 형질전환된 세포를 15℃에서 저온-충격을 가하고, 1시간 동안 저온 순응시킨 후, IPTG를 첨가하여 이오탁신 생산을 유도하였다. 그런 다음에 세포를 15분 동안 [³⁵S]메티오닌으로 펄스-라벨하였다(0시); 도 1A, 중간 판넬). 상기 0 시를 기점으로 배양 72시간 동안 다른 세포 단백질과 함께 상기 이오탁신은 거의 일정한 수준으로 생산되었다. 12시간 경과 시점에서 상기 이오탁신의 생산량은 표지된 [³⁵S]메티오닌으로 판단컨대, 총 세포 단백질 합성의 대략 11%를 차지하는 것으로 분석되었다.

pACYCmazF와 pColdⅠ(SP-1)이오탁신 둘 모두가 내포된 대장균 BL21(DE3)를 사용하여 이오탁신 및 mazF 유전자 둘 모두를 동시-발현시켰을 때, 유도후 3 시간 경과시, 백그라운드 세포 단백질(background cellular protein) 합성은 급격히 감소된 반면, 이오탁신 생산은 72시간 동안 거의 일정한 수준으로 유지되었다(도 1A, 우측 판넬). 흥미롭게도 상기 실험에서, MazF 유도 부재시의 생산량(도 1A, 중간 판넬; 12시간 경과 시점에 47%)보다 이오탁신 생산 수준은 더 높아졌다(도 1A, 우측 판넬; 12시간 경과 시점에서 총 단백질 생산량의 11%). 대략 5배에 달하는 생산량 차이는 MazF에 의해 세포 mRNA가 분해됨에 따라 더 많은 리보좀이 이오탁신 mRNA 번역에 이용될 수 있게 되었기 때문인 것으로 생각된다. 특히 12시간 경과 시점이후에 특별한 단백질 밴드가 관찰되지 않았다는 점에 주목할만 하다.

동일한 실험을 pACYCmazF 와 pColdⅠ(SP-2)이오탁신 둘 모두를 포함하는 세포를 대상으로 수행하였을 때, 거의 전적으로 이오탁신이 생산되었다(도 1B, 우측 판넬). 특히 상기 경우의 이오탁신 생산은 pColdI(SP-1)이오탁신의 경우보다 상당히 높았다는 점에 주목할만 하다(도 1B, 좌측 판넬). 상기한 이오탁신의 높은 생산은 pColdⅠ(SP-1)에서 5'-UTR 내의 ACA 서열이 추가로 제거됨으로써 이오탁신 mRNA의 안정화에서 기인하는 것으로 생각된다. MazF 유도 후 12시간 경과시점에 [³⁵S]메티오닌의 대략 90%가 이오탁신에 통합되었으며, 주목할만한 특이한 세포 단백질 밴드가 식별되지 않았다는 사실(도 1B, 우측 판넬)은 본 발명이 개시한 SPP 시스템에서 이오탁신의 신호 대비 잡음 비율(signal-to-noise ratio)이 상당히 개선되었음을 시사한다. 높은 수준의 이오탁신 생산이 유도후 심지어 96 시간이 경과한 시점에서도 유지된다는 점은 주목할만 하다. 더 나아가, 백그라운드 세포 단백질 합성은 pColdI(SP-1)이오탁신 의 경우(6시간 경과시점)에 비해 더 이른 시점에 감소되었다(3시간 경과시점) (도 1B의 좌측 판넬과 우측 판넬 비교).

두 벡터 모두의 경우(도 1A와 도 1B), OD₆₀₀과 세포 단백질에 통합된 [³⁵S]메티오닌으로 판단할 때, MazF 유도직후 세포 성장은 완전히 억제되었음을 알 수 있었다. 상기 결과는 MazF 유도로 인해 성장-지체된 세포가 생리적으로 죽은 것이 아니며, 만일 상기 세포 mRNA가 ACA 서열을 갖지 않게 된다면 단백질 합성을 완전하게 할 수 있을 것임을 시사한다. 상기 결과는 연이어 대장균 BL21(DE3) 세포의 세포 통합이 장기간 손상되지 않은 상태로 유지되면 상기 성장-지체된 세포에서 에너지 대사뿐만 아니라 뉴클레오티드와 아미노산의 생합성 기능도 완전히 활성화될 것임을 시사한다. 더 나아가, RNA 중합효소, 리보좀, tRNA 및 단백질 합성을 위해 필요한 다른 모든 인자를 포함한 전사 및 번역 기구들 또한 잘 보존된다.

pColdI(SP-2)이오탁신을 이용하여 생산된 이오탁신은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 후 쿠마시 블루 염색에 의해 주 밴드로 확인된다(도 1C). 0시간 경과 시점에서, 상기 이오탁신 밴드는 거의 식별이 불가능하였으나, 12시간 경과시점에는 주 밴드로 나타났으며 24시간 경과 이후에는 밴드의 밀도가 증가하였다. 그러나, 배양시간을 증가시키더라도 이오탁신의 생산 수준이 실질적으로 향상되지 아니하였으므로, 이는 MazF-유도 세포에서 이오탁신 생산 수준의 역가(threshold)에 대해 시사한다. 통합된 [³⁵S]메티오닌이 96시간 동안 일정하게 유지되었기 때문에(도 1B), SPP 시스템에서 이오탁신 생산 및 분해는 24시간 후에 동적평형을 이루는 것으로 생각된다. MazF 유도직후 완전한 생장 억제로 인하여 예상되는 바대로 세포 단백질 밴드의 밀도가 일정하게 유지되었다는 사실에 주목할 필요가 있다. 본 발명자들은 이오탁신 생산이 LB 배지와 같은 리치 미디어(rich media)에 의해 영향받는지 여부를 시험하였으며, pColdⅠ(SP-2)를 사용한 경우 M9 제한 배지에서 얻어진 이오탁신 생산 수준과 비교하여 LB 배지의 사용으로 인하여 상기 이오탁신 생산이 조금도 향상되지 않음을 확인하였다.

실시예 3. ACA 서열이 단백질 생산에 미치는 부정적 효과

도 1에서 관찰된 MazF-유도 세포에서의 이오탁신의 독점적 생산이 이오탁신 생산을 위해 제조된 ACA-결핍 mRNA 때문임을 확인하기 위해, 도 2A(서열번호 1)에 도시한 바와 같이 아미노산 서열의 변형없이, 5개의 천연 ACA 서열을 이오탁신 유전자에 부가하였다. pColdⅠ(SP-2)를 이용하여 상기 이오탁신 유전자들을 발현시켰으며, 도 1에 기술된 것과 동일한 방법으로 세포를 처치하고 [³⁵S]-메티오닌으로 표지하였다. 좌측 판넬은 ACA-결핍 이오탁신 유전자에서의 결과를 보여주며(도 1B의 좌측 판넬과 동일함) 우측 판넬은 5개 ACA 서열을 보유한 이오탁신 유전자에서의 결과를 보여준다.

도 1에 기술된 것과 동일한 조건하에서 pACYCmazF와 같이 pColdl(SP-1)를 사용하여 상기 유전자를 발현시켰을 때, 첫 번째 2시간 동안 이오탁신 생산 수준은 낮게 나타났으며, 이후 시점에 상기 생산은 ACA-결핍 mRNA와 관련한 발현(도 2B, 좌측 판넬)과 비교하여 백그라운드 수준(도 2B, 우측 판넬)까지 더 감소되는 것으로 나타났다.

흥미롭게도, mazF 유전자는 ACA 함량이 특별히 높은 mRNA(111개 잔기를 가진 단백질에 9개 ACA 서열 존재)-MazE(82개 아미노산 잔기에 ACA 서열은 단 2개임)와는 크게 대조적임-를 엔코딩하며, 이는 세포에서 mazF 발현이 네거티브하게 조절됨을 시사한다. 따라서, 본 발명자들은 ACA를 갖지 않는 mazF 유전자[pACYCmazF(-9ACA)]를 제작하였고 mazF 코딩 지역에서 이들 ACA 서열의 제거가 기초 세포 단백질 생산을 효과적으로 감소시키는지 여부를 시험하였다.

도 3은 mazF ORF에서 모든 ACA 서열의 제거가 이오탁신 발현에 비치는 영향을 보여주는 도면이다. 판넬 A는 MazF의 아미노산 서열과 상기 아미노산의 ORF에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 보여준다. 밑줄그어진 트리플렛 서열(총 9개)은 야생형 mazF 유전자에서 원래 ACA이나, MazF-비절단 서열로 변형되었다. 판넬 B는 야생형 mazF 유전자(왼쪽 판넬) 및 ACA-결핍 mazF 유전자(우측 판넬)가 도입된 pColdI(SP-2)이오탁신의 이오탁신 발현양상을 보여준다. 실험은 도 1에 기술된 동일한 방법으로 수행되었다.

도 3A(서열번호 2)에 도시된 바와 같이, 염기 치환 중 어느 것도 MazF 아미노산 서열을 변형시키지 않는다. pYCACmazF(-9ACA)를 포함한 세포가 M9 배지에서 pYCACmazF를 포함한 세포보다 조금 느린 성장을 보이기는 하지만, 이오탁신 생산에는 중대한 영향없이 백그라운드 세포 단백질 합성은 그보다 더 감소되었다(도 3B). 이는 mRNA의 ACA 서열이 MazF로 유도된 세포에서 단백질 생산에 중요한 역할을 담당한다는 것을 명백히 보여주는 결과이다.

실시예 4. 효모 단백질에 SPP 시스템의 적용

본 발명자들은 두 가지 효모 단백질(열-충격 인자, Hsp10 및 RNA 중합효소 소단위체, Rpb12)에 대해 본 발명의 SPP 시스템을 적용해 보았다. Hsp10 및 Rpb12의 ORF는 각각 3개와 1개의 ACA를 포함하고 있으며, 상기 ORF들은 이의 아미노산 서열 변형없이 MazF-비절단 서열로 전환되었다(도 4A). 야생형 서열과 같이, 상기 서열은 이후 pColdⅠ(SP-2)에 삽입되었다. 최종적으로 얻어진 플라스미드는 각각 야생형 Hsp10가 삽입된 경우 pColdI(SP-2)Hsp10, 돌연변이체 Hsp10이 삽입된 경우 pColdI(SP-2)Hsp10(-lACA), 야생형 Rpb12가 삽입된 경우 pColdI(SP-2)Rpb12 및 pColdI(SP-2)Rpb12(-3ACA)로 명명되었다. pACYCmazF가 도입된 대장균 BL21(DE3)는 상기 각각의 플라스미드로 형질전환되었다. 이후 15℃에서 48시간동안 대장균의 단백질 발현 패턴을 검사하였다.

SPP 시스템에서 효모 단백질의 발현양상은 도 4에 도시되어 있다. pColdI(SP-2)를 사용하였을 때, 효모 Hsp10 및 Rpb12는 이들 유전자내에 ACA 서열이 존재 및 부존재하는 경우 모두, 상기 SPP 시스템에서 발현되었다. 실험은 도 1의 경우에 적용된 것으로 기술된 것과 동일한 과정으로 수행되었다. 도 4A는 야생형 및 ACA-결핍 Hsp10 유전자를 사용하였을 경우의 Hsp10 발현양상을 보여준다. 106개의 코돈으로 이루어진 Hsp10 ORF는 3 ACA 서열을 포함하며(A25-Q26를 코딩하는 GCA-CAA, T29를 코딩하는 ACA 및 P76-Q77를 코딩하는 CCA-CAG), 상기 ACA 서열들은 각각 GCC-CAA, ACC 및 CCC-CAG로 변형되었다(변형된 염기는 굵게 표시됨). 상기 염기 치환은 Hsp10의 아미노산 서열은 변형시키지 않는다. 도 4B는 야생형 및 ACA-결핍 유전자를 이용한 Rpb12의 발현양상을 보여준다. 70개 코돈으로 구성된 Rpb12 ORF는 T10에 한개의 ACA를 포함하며, 상기 ACA는 트레오닌을 코딩하는 ACC로 전환되었다.

도 4A는 Hsp10이 합리적으로 보아 높은 수준으로 이의 본래 3개의 ACA 서열(WT 판넬)과 함께 발현됨을 보여주고 있다. 그러나 모든 ACA 서열이 제거되었을 때, Hsp10 합성은 몇 곱절로 상당히 증가하였다. ACA-결핍 Hsp10의 경우 또한 기초 단백질 합성은 상당히 감소되었으며, 이는 Hsp10의 생산에 더 많은 리보좀이 참여했기 때문인 것으로 생각된다. 도 4B는 Rpb12가 하나의 ACA만을 포함하지만, 상기 ACA 서열이 SPP 시스템에서 단백질 생산에 대단히 악영향을 미침을 보여주며, 이는 WT 판넬에서는 ³⁵S-메티오닌의 통합이 거의 관찰되지 않는 반면, ACA-결핍 Rpb12에서는 상당한 통합이 일어났다는 사실로부터 알 수 있다. 상기 결과들은 MazF에 대한 mRNA 민감도가 mRNA내의 ACA 서열 개수 뿐만 아니라, MazF에 대한 ACA 서열의 유효 민감도에 의해서도 영향을 받을 수 있음을 제시한다. ACA 서열 민감도는 mRNA의 단일-가닥 지역내의 ACA 서열의 위치뿐만 아니라, MazF에 의한 분해로부터 리보좀이 mRNA를 보호하는 것으로 생각되므로, 리보좀에 의한 mRNA의 유효한 번역에 의해서도 결정되는 것으로 볼 수 있다.

실시예 5. SPP 시스템의 내막 단백질에의 적용

본 발명자들은 중요성이 덜한 내재성 막 단백질에 본 발명의 SPP 시스템을 적용해 보고자 시도하였다. 본 발명자들은 리포단백질의 시그날 펩티드의 분해에 특별히 요구되는 대장균의 시그날 펩티다제 Ⅱ를 코딩하는 lspA 유전자를 선택하였다(Tokuda and Matsuyama, Biochem. Biophys. Acta 1693: 5-13 (2004)). 대장균은 성숙 리포단백질의 두 번째 아미노산 잔기(산성 또는 중성)의 특성에 따라 내막 또는 외막 중 어느 하나에서 조립되는 것으로 알려진 총 96개의 리포단백질을 포함하고 있다(Yamaguchi and hiouye, Cell 53: 423-432 (1988); Tokuda and Matsuyama, Biochem. Biophys. Acta 1693: 5-13 (2004)). 다른 모든 분비 단백질의 시그날 펩티드는 대장균에서 세포당 500개의 분자 수준으로만 존재하는 것으로 평가된 시그날 펩티다제 Ⅰ(선도서열 펩티드분해효소, leader peptidase)에 의해 분해된다(Wolfe et al, J. Biol. Chem. 257: 7898-7902 (1982)).

리포단백질 시그날 펩티다제(LspA)는 또한 내막에서 대단히 미량 존재하는 단백질인 것으로 알려져 있다. 상기 단백질은 164개의 아미노산 잔기를 포함하며, LspA가 내재성 막 단백질임을 시사하는, 막관통 도메인으로 추정되는 4개의 도메인을 포함한다. lspA ORF에서 세개의 ACA 서열은 이의 아미노산 서열의 변형없이 비-MazF-절단 서열로 전환되었으며, ACA-결핍 LspA는 mazF(-9ACA)가 도입된 SPP 시스템에서 pColdI(SP-2)에 의해 발현되었다.

pColdL(SP-2)를 이용한 SPP 시스템에서 내막 단백질인 LspA의 발현양상은 도 5에 도시되어 있다. LspA, 시그날 펩티다제 Ⅱ 또는 리포단백질 시그날 펩티다제는 도 1에 기술된 방법을 그대로 적용하여 SPP 시스템에서 발현되었다. 판넬 A는 총 세포 단백질; 판넬 B는 막 파쇄물을 보여준다: LspA의 위치는 화살표로 제시되어 있다.

도 5A에 도시된 바와 같이, ³⁵S-메티오닌의 통합이 IPTG 유도직후 단지 1시간만 지속되었기 때문에, SPP 시스템에서 LspA의 발현은 세포에 명백히 해롭다. 그럼에도 불구하고, 도 5B에 도시된 바와 같이, 0시 및 1시간 경과 시점에 다른 세포 단백질 밴드와 비교하여 LspA 밴드 밀도가 가장 높았으므로 ³⁵S-메티오닌의 LspA로의 통합이 이루어졌음을 논리적으로 추론할 수 있다(도 5A의 레인 C와 비교할 것). 0시 및 1시간 경과 시점에 관찰된 합성된 백그라운드 세포 단백질은 초원심분리에 의해 용이하게 제거되었으며, 막파쇄물에서 ³⁵S-메티오닌 통합은 매우 높게 나타났다.

고찰

본 발명은 mRNA 인터퍼라제에 의한 세포 단백질 합성의 완전한 저해가 세포 생리상 해로운 영향을 미치지 아니함을 개시하고 있다. ACA 서열에서 MazF에 의한 거의 모든 세포 mRNA의 절편화(fragmentation)로 인해, 세포 단백질 합성은 완전히 억제되며, 결국 이는 연이어 세포 성장의 완전한 지체를 조장하게 된다. 그러나, 놀랍게도 MazF 유도로 인해 성장이 지체된 세포는 만일 상기 세포의 mRNA가 ACA 서열을 갖지 않도록 유전자 조작되면, 장시간(15℃에서 적어도 96 시간) 동안 높은 수준으로 완벽하게 단백질을 합성할 수 있다는 것이 확인되었다. 이에 근거하여 본 발명자들은 최초로 생체내에서 단일-단백질 생산(single-protein production, SPP) 시스템을 구축하는데 성공하였다.

본 발명자들이 개시한 결과는 MazF로 유도된 세포가 죽지 않음을 보여준다. MazF 유도는 RNA 및 단백질 합성을 포함하는 다양한 세포 기능에 요구되는 충분한 양의 ATP 생산에 관여하는 에너지 물질대사를 유지하는 세포 본연의 특성에 유해한 영향을 미치지 않는다. 게다가 아미노산 및 뉴클레오티드의 생합성은 또한 손상되지 않은체 유지된다. 새로운 세포 단백질의 합성은 전혀 이루어지지 않는 상태에서, 이들 세포의 기능을 위해 필요한 모든 단백질 인자(예를 들어, 단백질 합성을 위해 필요한 단백질 인자들)와 세포의 물질대사가 15℃에서 적어도 96시간 동안 안정적으로 유지된다는 것은 상당히 놀라운 발견이다. SPP 시스템에 영향을 주지 아니하면서 상기 세포 기능이 얼마나 오랫동안 지속될 수 있는지는 결정되어 하는 문제로 남아 있다. 비록 일견하기에는 상기 세포들이 휴지 상태(dormant state)로 존재할 것으로 예상되나, 상기 세포들은 RNA와 단백질 합성을 완벽하게 할 수 있으며, 영양 결핍으로 인한 지체기에 의해 유발된 휴면(dormancy)과는 엄격히 다른 상태에 처해 있다. 본 발명자들은 MazF 유도에 의해 조장된 생리적 상태를 "유사-휴면(quasi-dormant)" 상태로 지칭할 것을 제안하는 바이다. 상기 유사-휴면 상태의 세포가 죽은 것인지 아니면 죽지 않은 것인지 여부는 결정되어야 할 문제로 남아있다. 박테리아 생존력은 종종 다양한 처치후에 세포가 콜로니를 형성하는 능력으로 결정된다. 이러한 맥락에서 MazF 유도후 대장균 세포의 생존능력이 평가되었으며, MazE로 유도되는 경우, MazF 유도직후 제한된 시간동안 배양시 생존력이 회복되는 것으로 나타났다(Pedersen et al., Mol. Microbiol. 45: 501-10 (2002); Amitai et al, J. Bacteriol. 186: 8295-8300 (2004)). 모든 세포가 사멸될 운명에 처해지는 임의의 시점으로부터, '돌이킬 수 없는 시점(a point of no return)'이 존재하는 것으로 주장되기는 하였으나(Amitai et al., J. Bacteriol. 186: 8295-8300 (2004)), MazF의 영향은 어느 정도 가역적이다. 매우 중요한 사항으로, 두 그룹 모두에 의해 사용된 상기 MazE 유전자는 이의 ORF에 2개의 ACA 서열을 포함하고 있다. 상기 결과는 어떤 유전자들이 MazF로 유도된 세포에서 발현되기 위해서는, 이들 유전자 내에 존재하는 ACA 서열이 MazF-비절단 서열로 전환되어야 함을 명백히 보여준다. 따라서 MazF를 발현하는 유사-휴면 상태의 상기 세포는 모든 ACA 서열이 이의 ORF에서 제거되지 아니하면, 상기 MazE를 발현하지 못할 가능성이 매우 높다.

살아 있는 세포 또는 죽지 않은 세포에서 관심 있는 단일 단백질만을 생산하도록 하는 능력은 이전의 살아 있는 세포로는 달성하기 어려운 단백질의 다양한 양상을 연구하기 위한 새로운 접근책을 제공한다.

SPP 시스템을 이용함으로써, 관심대상 단백질은 활성세포에서 전적으로 동위원소(¹⁵N 및 ¹³C) 로 표지될 수 있기 때문에, 살아 있는 세포에서 단백질의 NMR 구조 또한 확인할 수 있다. 최근에 본 발명자들은 고 발현 저온-충격 벡터인, pCold로 관심있는 대상 단백질을 발현시킴으로써 단백질의 정제 없이 세포 파쇄물로도 단백질의 NMR 구조 결정이 가능함을 알게 되었다(Qing et al., Nat. Biotechnol. 22: 877-882 (2004)). 이제 본 발명자들은 MazF 유도로 인하여 백그라운드 세포 단백질 합성이 거의 완벽하게 억제될 수 있기 때문에, pCold 벡터와 함께 사용된 MazF가 신호 대비 잡음 비율을 급격하게 감소시킨다는 사실을 밝히는 바이다. 이러한 실험에서 본 발명자들은 이오탁신 생산이 5배나 개선됨을 관찰하였으므로, pColdⅠ 벡터에서 ACA 서열의 제거 또한 매우 중요하다는 사실을 인지하게 되었다. MazF와 조합된 경우, 이오탁신 합성은 총 세포 단백질 합성의 90% 수준인 것으로 나타났으며, 이는 단백질에 통합된 ³⁵S-메티오닌에 의해 판단한 결과이다. 잔존하는 10%는 임의의 특별한 단백질 밴드로 통합되지 않는 일반적인 백그라운드로 파악되었다. 나아가 이는 연구자로 하여금 대량 발현시 이의 독성 때문에 생산이 제한되는 매우 미량으로 존재하는 단백질의 구조 연구를 가능하게 한다. 실제로 본 발명자들은 매우 미량으로 존재하는 내막 단백질인 LspA가 막 파쇄물내에서 독점적으로 발현된다는 사실을 확인하였다. 일부 단백질은 살아 있는 세포내에서만 바람직한 구조로 폴딩될 가능성이 있으므로, 이러한 단백질들의 구조 연구는 SPP 시스템을 이용하여야만 가능할 수 있다.

SPP 시스템의 또 다른 특별한 장점은 MazF 유도직후 세포 성장이 완전히 억제되기 때문에 관심있는 대상 단백질이 높은 농도의 배지에서 동위원소로 표지되거나 표지된 상태로 생산될 수 있다. SPP 시스템은 단백질뿐만 아니라, 다른 비-단백질 화합물의 생산에도 적용이 가능하다. 더 나아가 SPP 시스템은 단지 박테리아에만 국한되지 아니하며, MazF와 다른 mRNA 인터퍼라제는 효모 및 포유동물 세포의 SPP 시스템을 생성하기 위해 진핵세포에도 적용될 수 있다.

여기서 기술된 수치 범위와 관련하여, 별도의 명시적인 언급이 없는 한 가장 낮은 하한의 1/10 단위로, 상기 범위의 상한 및 하한 사이의 각각의 사이값과 임의로 정의된 다른 범위 또는 상기 정의된 다른 범위 이내의 사이값은 본 발명의 범위내에 속한다. 정의된 범위내에서 명시적으로 배제되지 아니한 경우, 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있는 상기 더 작은 범위의 상한 및 하한 또한 본 발명의 범위에 속하는 것이다. 정의된 수치 범위가 상한과 하한 중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 상기한 상한과 하한 중 어느 하나를 배제한 범위 또한 본 발명의 권리범위에 포함된다.

본 명세서에서 언급된 공개문헌들은 단순히 본원의 출원일 이전에 종래 기술분야에 개시된 사항으로써만 제시된 것이다. 상기 문헌들 중 어떠한 것도 상기 문헌에 공개된 사항에 비추어 본원발명이 선행 발명으로서 자격을 갖추지 못하였음을 자인하는 자료로 해석되어서는 안된다. 더 나아가, 제공된 문헌들의 공개일은 실제 공개일과는 상이할 수 있으며, 따라서 별도의 확인을 거쳐야 할 수 있음을 밝혀둔다.

본 발명자들이 본 발명의 바람직한 구현예로 기술한 실시예들은 참조용으로 제시된 것이며, 통상의 기술자는 본 발명의 본질적 개념 및 이의 영역을 벗어나지 않는 한도에서 본 발명과 균등한 것으로 대체함으로써 다양한 변형을 시도할 수 있다. 게다가, 본 발명의 목적, 정신 및 범위에 근거하여 특정 상황, 물질, 물건의 구성, 공정, 공정 단계 또는 복수의 공정 단계에 적합하도록 수많은 변형이 행해질 수 있다. 상기한 그러한 모든 변형은 본 명세서에 첨부된 특허청구범위에 포함된다.

<110> University of Medicine and Dentistry of New Jersey <120> SINGLE PROTEIN PRODUCTION IN LIVING CELLS FACILITATED BY A MESSENGER RNA INTERFERASE <130> pc-24865 <150> 60/624,976 <151> 2004-11-04 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 276 <212> RNA <213> mammalian <400> 1 augaaucaua aagugcauca ucaucaucau cauaucgaag guaggcauau ggguccagca 60 ucuguuccga cuaccuguug cuuuaaccug gcgaaccgca aaauuccgcu gcagcgccug 120 gaaagcuauc gccguauuac cucuggcaaa ugcccgcaga aagcggugau cuuuaaaacc 180 aaacuggcga aagauauuug cgcggauccg aaaaaaaaau gggugcagga uucuaugaaa 240 uaucuggauc agaaaucucc gaccccgaaa ccguaa 276 <210> 2 <211> 336 <212> RNA <213> mammalian <400> 2 augguaagcc gauacguacc cgauaugggc gaucugauuu ggguugauuu ugacccgacc 60 aaagguagcg agcaagcugg ccaucgucca gcuguugucc ugaguccuuu cauguauaau 120 aauaaaaccg guaugugucu guguguuccu uguaccacgc aaucaaaagg auauccguuc 180 gaaguuguuu uauccgguca ggaacgugau ggcguagcgu uagcugauca gguaaaaagu 240 aucgccuggc gggcaagagg agcaacgaag aaaggaaccg uugccccaga ggaacugcaa 300 cucauuaaag ccaaaauuaa cguacugauu ggguag 336

Claims

MazF 폴리펩티드를 엔코딩하는 분리된(isolated) 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로서, 여기서 상기 MazF 폴리펩티드를 엔코딩하는 분리된 핵산 서열이, 하나 이상의 MazF 인식 서열을 다른(alternative) 트리플렛 코돈 서열로 대체함으로써 돌연변이되어 비돌연변이된 MazF 폴리펩티드의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 MazF 폴리펩티드를 엔코딩하는 돌연변이된 핵산 서열을 생산하는, 발현 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 발현 벡터가 각각 하나 이상의 조절 서열(regulatory sequence)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 발현 벡터.
제 2항에 있어서, 상기 하나 이상의 조절 서열이 하나 이상의 유도성 프로모터인 것을 특징으로 하는, 발현 벡터.
제 3항에 있어서, 상기 하나 이상의 유도 프로모터가 돌연변이된 MazF 폴리펩티드를 엔코딩하는 돌연변이된 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는, 발현 벡터.
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제 1항에 있어서, 상기 돌연변이된 MazF 폴리펩티드를 엔코딩하는 돌연변이된 핵산 서열이, 비선호 코돈(rare codons)을 선호 코돈(preferred codons)으로 대체함으로써 추가로 돌연변이되어, 2회-돌연변이된 핵산 서열을 생산하며,

여기서 상기 2회 돌연변이된 핵산 서열은 비돌연변이된 MazF 폴리펩티드의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 MazF 폴리펩티드를 엔코딩하는 것을 특징으로 하는, 발현 벡터.
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(a) 비돌연변이된 MazF 폴리펩티드의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 MazF 폴리펩티드를 엔코딩하는 돌연변이된 핵산 서열이 생산되도록, 하나 이상의 제 1 MazF 인식 서열을 다른 트리플렛 코돈으로 대체하여 MazF 폴리펩티드를 엔코딩하는 분리된 핵산 서열을 돌연변이시키는 단계;

(b) 돌연변이된 표적 단백질을 엔코딩하는 돌연변이된 핵산 서열이 생산되도록, 하나 이상의 제 2 MazF 인식 서열을 다른 트리플렛 코돈으로 대체함으로써, 표적 단백질을 엔코딩하는 분리된 핵산 서열을 돌연변이시키는 단계;

(c) 단계 (a)의 돌연변이된 핵산 서열을 포함하는 제 1 발현 벡터 및 단계 (b)의 돌연변이된 핵산 서열을 포함하는 제 2 발현 벡터를 제공하는 단계;

(d) 제 3 MazF 인식 서열 중 1개 이상을 포함하는 세포 mRNA 서열을 지니는 분리된 형질전환가능한 살아 있는 세포를 제공하는 단계,

(e) 상기 분리된 형질전환가능한 살아 있는 세포에 상기 제 1 발현 벡터 및 제 2 발현 벡터를 도입하는 단계;

(f) 돌연변이된 MazF 폴리펩티드를 발현시키는 단계; 및

(g) 상기 분리된 살아 있는 세포를 세포내에서 돌연변이 표적 단백질의 발현이 용인되는 조건하에서 유지하는 단계를 포함하는, 분리된(isolated) 살아 있는 세포에서 표적 단백질의 발현을 증가시키는 방법.
제 33항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 발현 벡터 각각이 하나 이상의 조절 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 34항에 있어서, 상기 하나 이상의 조절 서열이 하나 이상의 유도성 프로모터인 방법.
제 35항에 있어서, 상기 제 1 발현 벡터의 유도성 프로모터가 돌연변이된 MazF 폴리펩티드를 엔코딩하는 돌연변이된 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 유도 물질로 MazF 폴리펩티드를 엔코딩하는 돌연변이된 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 상기 유도성 프로모터를 유도시켜 MazF 폴리펩티드를 발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 37항에 있어서, 상기 MazF 폴리펩티드가 세포 mRNA를 선택적으로 분해하여, 그로 인해 비-표적 단백질 합성이 감소되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 35항에 있어서, 상기 제 2 발현 벡터의 유도성 프로모터는 돌연변이된 표적 단백질을 엔코딩하는 돌연변이된 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 39항에 있어서, 유도물질로 상기 돌연변이된 표적 단백질을 엔코딩하는 돌연변이된 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 유도성 프로모터를 유도시켜 상기 돌연변이된 표적 단백질을 발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 33항에 있어서, 제 1 발현 벡터의 유도성 프로모터가 MazF 폴리펩티드를 엔코딩하는 돌연변이된 핵산 서열에 작동가능하게 연결되어 있으며, 상기 제 2 발현 벡터의 유도성 프로모터가 돌연변이된 표적 단백질을 엔코딩하는 돌연변이된 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어 있으며,

하기 단계들을 추가로 포함하는, 방법:

첫 번째 유도물질로 상기 MazF 폴리펩티드를 엔코딩하는 돌연변이된 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 유도성 프로모터를 유도시켜 상기 MazF 폴리펩티드를 발현시키는 단계; 및

두 번째 유도물질로 상기 돌연변이된 표적 단백질을 엔코딩하는 돌연변이된 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 유도성 프로모터를 유도시켜 상기 돌연변이된 표적 단백질을 발현시키는 단계.
제 33항에 있어서, 상기 세포가 제 1 발현 벡터 및 제 2 발현 벡터가 동시-감염(co-transfection)되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 33항에 있어서, 단계 (a)가, 비돌연변이된 MazF 폴리펩티드의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 MazF 폴리펩티드를 엔코딩하는 2회-돌연변이된 핵산 서열을 생산하기 위해, 비선호 코돈(rare codons)을 선호 코돈(preferred codons)으로 대체하여 MazF 폴리펩티드를 엔코딩하는 돌연변이된 핵산 서열을 추가로 돌연변이시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 33항에 있어서, 단계 (b)가 비돌연변이된 표적 단백질의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 2회-돌연변이된 표적 단백질을 엔코딩하는 2회-돌연변이된 핵산 서열을 생산하기 위해, 비선호 코돈(rare codons)을 선호 코돈(preferred codons)으로 대체하여 돌연변이된 표적 단백질을 엔코딩하는 돌연변이된 핵산 서열을 추가로 돌연변이시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 33항에 있어서, 단계 (a)가 비돌연변이된 MazF 폴리펩티드의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 MazF 폴리펩티드를 엔코딩하는 2회-돌연변이된 유도성 핵산 서열을 생산하기 위해, 비선호 코돈(rare codons)을 선호 코돈(preferred codons)으로 대체하여 상기 MazF 폴리펩티드를 엔코딩하는 돌연변이된 유도성 핵산 서열을 추가로 돌연변이시키는 단계를 추가로 포함하며;

단계 (b)가 비돌연변이된 표적 단백질의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 2회-돌연변이된 표적 단백질을 엔코딩하는 2회-돌연변이된 핵산 서열을 생산하기 위해, 비선호 코돈(rare codons)을 선호 코돈(preferred codons)으로 대체하여 상기 돌연변이된 표적 단백질을 엔코딩하는 돌연변이된 핵산 서열을 추가로 돌연변이시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제 45항에 있어서, 상기 제 1 발현 벡터의 MazF 폴리펩티드를 엔코딩하는 2회-돌연변이된 핵산 서열이 상기 MazF 폴리펩티드를 엔코딩하는 2회-돌연변이된 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 제 1 유도성 프로모터를 포함하며;

상기 제 2 발현 벡터의 2회-돌연변이된 표적 단백질을 엔코딩하는 2회-돌연변이된 핵산 서열은 상기 2회-돌연변이된 표적 단백질을 엔코딩하는 2회-돌연변이된 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 제 2 유도성 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 46항에 있어서, 첫 번째 유도제로 MazF 폴리펩티드를 엔코딩하는 2회-돌연변이된 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 제 1 유도성 프로모터를 유도시켜 상기 MazF 폴리펩티드를 발현시키는 단계; 및

두 번째 유도물질로 상기 2회-돌연변이된 표적 단백질을 엔코딩하는 2회-돌연변이된 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 제 2 유도성 프로모터를 유도시켜 상기 2회-돌연변이된 표적 단백질을 발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 33항에 있어서, 단계 (a)의 상기 하나 이상의 제 1 MazF 인식 서열, 단계 (b)의 상기 하나 이상의 제 2 MazF 인식 서열, 및 단계 (d)의 상기 하나 이상의 제 3 MazF 인식 서열이 동일한 mRNA 인터퍼라제 인식 서열인 방법.
제 48항에 있어서, 단계 (a), (b) 및 (d)의 MazF 인식 서열이 아데닌-시토신-아데닌인, 방법.
제 33항에 있어서, 단계 (g)에서, 상기 돌연변이된 표적 단백질을 엔코딩하는 mRNA가 세포내에서 안정적으로 유지됨을 특징으로 하는, 방법.
제 45항에 있어서, 단계 (g)에서, 상기 2회-돌연변이된 표적 단백질을 엔코딩하는 mRNA가 세포내에서 안정적으로 유지됨을 특징으로 하는, 방법.
제 33항에 있어서, 상기 세포가 진핵세포인, 방법.
제 52항에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포인, 방법.
제 33항에 있어서, 상기 세포가 원핵세포인, 방법.
제 54항에 있어서, 상기 세포가 대장균 세포인, 방법.
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제 33항에 있어서, 상기 표적 단백질이 포유동물 단백질인, 방법.
제 62항에 있어서, 상기 표적 단백질이 인간 단백질인, 방법.
제 33항에 있어서, 상기 표적 단백질이 효모 단백질인, 방법.
제 33항에 있어서, 상기 표적 단백질이 미량 존재 박테리아 단백질(minor bacterial protein)인, 방법.
제 65항에 있어서, 상기 표적 단백질이 유독성 미량 존재 단백질(toxic low abundant protein)인, 방법.
제 33항에 있어서, 단계 (g)의 진행중, 하나 이상의 방사능으로 표지된 동위원소를 포함하는 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제 33항에 있어서, 단계 (b)에서 상기 표적 단백질을 엔코딩하는 분리된 핵산 서열을 중합효소 연쇄 반응에 의해 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.