JP2003517837A - バクテリオファージファイ６〜ファイ１４由来のｒｎａポリメラーゼ類およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ｄｓＲＮＡウィルス由来のポリメラーゼタンパク質は、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、またはｄｓＤＮＡテンプレート類を用いてＲＮＡ合成を触媒する。このようなポリメラーゼはｄｓＲＮＡウィルスから精製でき、このようなポリメラーゼのアミノ酸配列を有するタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＮＡ合成のための方法およびキットに有用である。本発明のポリメラーゼは操作性が高く、非常に高いＲＮＡ重合化率を有し、ＲＮＡ合成開始のためにプライマーを必要としないが、プライマーの存在下で、ＲＮＡ合成を開始することもできる。プライマー非依存の合成は、サンプル中のＲＮＡ種の定量、および直接的配列決定によるそれらの同定のためにＲＮＡを増幅するのに特に有用である。この方法論は、病原性寄生物類および疾病に関連する遺伝子発現レベルの相違を検出するのに特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、種々のＲＮＡテンプレートおよびＤＮＡテンプレート存在下でＲＮ
Ａ合成が可能な新規なポリメラーゼタンパク質に関する。本発明はまた、そのポ
リメラーゼタンパク質を、適切な条件下で種々のＲＮＡテンプレートおよびＤＮ
Ａテンプレートに接触させることによるＲＮＡ合成の方法とキットに関する。本
発明はまた、核酸を安定化し、配列決定する方法に関する。

【０００２】 （発明の背景） ２本鎖ＲＮＡウィルス類は、原核生物から高等真核生物までの種々の宿主に感
染することが知られている。これらウィルスの幾つかは、ヒトや経済的に重要な
動物および植物に対して重篤な感染症を生じさせる（ＦｉｅｌｄｓおよびＫｎｉ
ｐｅ、１９９０年）。構造や宿主特異性が顕著に異るにもかかわらず、全てのｄ
ｓＲＮＡウィルスは実際、共通の複製方法を有している。殆どの場合、ウイルス
粒子は侵入時、ゲノム性ｄｓＲＮＡをテンプレートとして用いてポジティブセン
ス１本鎖ＲＮＡをつくるトランスクリプターゼ機能を持つコア粒子に変る。ウィ
ルス・コア内で形成されたｓｓＲＮＡは細胞質内へ押し出され、蛋白合成を支配
するメッセンジャーとして働く。同じｓｓＲＮＡはまた、相補的マイナス鎖合成
（複製）のためのテンプレートとしての活性も十分にある。この過程は、新たに
組立てられたコア粒子内で起こり、ウィルス・ポリメラーゼによって行われる。
複製後、マイナス鎖ＲＮＡ複製物は、プラス鎖テンプレートとの関連を保ったま
まゲノムｄｓＲＮＡを再構成する。ｄｓＲＮＡを含むコア粒子は、さらなる転写
工程を支援することもできるし、またはさらに成熟して感染性の子孫粒子を形成
することもできる。したがって、ｄｓＲＮＡウィルスの複製および転写の双方は
、ウィルスがコードするポリメラーゼ活性に依存し、大型のタンパク質複合体の
内部で起こる。どのｄｓＲＮＡウィルスもポリメラーゼ複合体を構築するいくつ
かのタンパク質のうちただ１種のポリペプチド種が、ＲＮＡポリメラーゼに共通
して保存されているいくつかの特徴的な配列モチーフを含むことが理論的に予測
されている（Ｋｏｏｎｉｎら、１９８９年；Ｂｒｕｅｎｎ、１９９１年；Ｂｒｕ
ｅｎｎ、１９９３年）。しかし、このようなタンパク質のポリメラーゼ活性につ
いての直接の生化学的な証拠は、今までのところ得られていない。

【０００３】 今までに幾つかの実験系が、ｄｓＲＮＡウィルスのポリメラーゼ複合体内でＲ
ＮＡ代謝を律する分子的原理を解明するために開発されている。これらの系の中
で最初のものは、精製された完全ウィルス、またはウィルス標品から得られたコ
ア粒子を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写であり、したがって既にｄｓＲＮＡテ
ンプレートが含まれていた。このような系は、レオウィルス（Ｊｏｋｌｉｋ、１
９７４年）、バクテリオファージφ６（Ｖａｎ Ｅｔｔｅｎら、１９７３年；Ｐ
ａｒｔｒｉｄｇｅら、１９７９年）、感染性膵臓壊死ウィルス（Ｃｏｈｅｎ、１
９７５年）、酵母ウィルス様粒子（ＨｅｒｒｉｎｇおよびＢｅｖａｎ、１９７７
年）および他の多くのものに関して報告されている。これらの方法により、ｓｓ
ＲＮＡ合成の機構および制御に関して詳細な情報が得られている。しかしながら
、粒子ベースの転写では、複製に関する問題に取り組むことはできなかった。

【０００４】 この問題は、パッケージｓｓＲＮＡを含んでいる単離されたウィルス中間体（
例えば、Ｆｕｊｉｍｕｒａら、１９８６年参照）や、空のポリメラーゼ粒子を用
いて取組まれた。ファージφ６の場合、空の組換えポリメラーゼ複合体粒子（Ｐ
Ｃ）が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＮＡパッケージング、複製および転写活性があ
ることが判った（Ｇｏｔｔｌｉｅｂら、１９９０年；Ｏｌｋｋｏｎｅｎら、１９
９０年；Ｖａｎ Ｄｉｊｋら、１９９５年）。他の２つの系、すなわち酵母ウィ
ルス様粒子（ＶＬＰ）およびロタウイルスのオープンコア粒子は、ウィルス特異
的外来性ｓｓＲＮＡテンプレートの複製を支えることが示された（Ｆｕｊｉｍｕ
ｒａおよびＷｉｃｋｎｅｒ、１９８８年；Ｃｈｅｎら、１９９４年）。

【０００５】 バクテリオファージφは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅの複合
ｄｓＲＮＡウィルスである（Ｖｉｄａｖｅｒら、１９７３年）。φ６ゲノムは、
３種のｄｓＲＮＡセグメント、すなわち大型（Ｌ）、中型（Ｍ）および小型（Ｓ
）から成る（Ｓｅｍａｎｃｉｋら、１９７３年；Ｖａｎ Ｅｔｔｅｎら、１９７
４年）。本発明の目的のため、φ６ＲＮＡセグメントのプラスセンス鎖をｌ^＋、
ｍ^＋、ｓ^＋と呼び、それに対応してマイナスセンス鎖を１⁻、ｍ⁻、ｓ⁻と呼ぶ
。φ６ファージの全ポリメラーゼ複合体は、４種の蛋白種Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４およ
びＰ７から成り、全てＬセグメントにコードされる（Ｍｉｎｄｉｃｈら、１９８
８年）。Ｐ１は、十二面体殻に組み上げられる主要構造タンパク質であり、残り
のタンパク質サブユニットは恐らく５回対称位置に在る（Ｂｕｔｃｈｅｒら、１
９９７年；ｄｅ Ｈａａｓら、１９９９年）。個々の組換えタンパク質および遺
伝子操作された不完全ＰＣ粒子の研究により、Ｐ４およびＰ７の機能性を理解す
ることが可能となった。Ｐ４は、プラス鎖ＲＮＡのパッケージングを生じさせる
ヘキサマーＮＴＰａｓｅであり（Ｇｏｔｔｌｉｅｂら、１９９２年；Ｐａａｔｅ
ｒｏら、１９９５年；ＦｒｉｌａｎｄｅｒおよびＢａｍｆｏｒｄ、１９９５年；
Ｊｕｕｔｉら、１９９８年；Ｐａａｔｅｒｏら、１９９８年）、一方Ｐ７は、効
率的なパッケージ反応に必要な蛋白コファクターとして働く（Ｊｕｕｔｉおよび
Ｂａｍｆｏｒｄ、１９９５年、１９９７年）。Ｐ２は今までのところ最も研究が
少ないＰＣタンパク質であるが、タンパク質配列のコンピュータ解析を用いてポ
リメラーゼ・サブユニットと推定されている（Ｋｏｏｎｉｎら、１９８９年；Ｂ
ｒｕｅｎｎ、１９９１年）。この結論は、さらに種々の蛋白欠損ＰＣ粒子に関す
る生化学的研究により支持された（Ｇｏｔｔｌｉｅｂら、１９９０年；Ｃａｓｉ
ｎｉら、１９９４年；ＪｕｕｔｉおよびＢａｍｆｏｒｄ、１９９５年）。

【０００６】 ｄｓＲＮＡウィルスの推定ポリメラーゼは単独で、テンプレート依存ＲＮＡ合
成を単独で触媒できるのか、あるいはその合成活性は粒子に結合したポリメラー
ゼタンパク質と緊密に関連しているのか。最近まで、この疑問は解かれずにいた
。φ６ファージのタンパク質Ｐ２も他のｄｓＲＮＡウィルスの類似の推定ポリメ
ラーゼ（ロタウィルス・ポリメラーゼを除き）とも、今まで単離体では得られな
かった。これは、推定ポリメラーゼがポリメラーゼ複合体の微量成分にあたるの
で、この複合体から直接タンパク質を精製しようとしてもうまくゆかないという
事実によるものであったと思われる。さらに、個々の可溶性ポリメラーゼタンパ
ク質をつくれるような遺伝子発現系が知られていなかった。２種の推定ポリメラ
ーゼ、ブルータング・ウィルスおよび感染性滑液嚢疾患ウィルスのポリメラーゼ
に関して、対応する組換えタンパク質をつくる細胞の粗製抽出液といくらかのポ
リメラーゼ活性が関連することが報告されている（Ｕｒａｋａｗａら、１９８９
年；ＭａｃｒｅａｄｉｅおよびＡｚａｄ、１９９３年）。しかしながら、これら
の報告は、問題のタンパク質と観察されたポリメラーゼ活性とが直接関連する如
何なる証拠も提供していない。一方、ロタウィルスの推定ポリメラーゼＶＰ１は
、関連する部分的活性をいくらか有することが示された。該酵素は、ヌクレオチ
ド類似体（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、１９９１年）およびウィルスｓｓＲＮＡ（
Ｐａｔｔｏｎ、１９９６年）と結合することが判明した。しかしながら、単離タ
ンパク質は、少なくとも１種の追加のタンパク質ＶＰ２（主要構造タンパク質）
がないとＲＮＡ基質を複製できなかった（Ｚｅｎｇら、１９９６年；Ｐａｔｔｏ
ｎら、１９９７年）。

【０００７】 本発明におけるポリメラーゼは、他の如何なるタンパク質の助けが無くてもｉ
ｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡ合成が可能であることを示している。以下の記載からあ
きらかになるように、本発明のポリメラーゼは、ＲＮＡ重合に使用するテンプレ
ートに対し比較的特異性がない。これに反して、先行技術のＲＮＡ依存ポリメラ
ーゼのテンプレート特異性は一般にかなり厳密である。例えば、バクテリオファ
ージＱβのＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ−プライマーが標的ＲＮＡにアニール
していない限り、極めて限定されたテンプレート・セットだけを効果的に複製す
る（米国特許第５６３１１２９号およびその中の引用文献）。特定の３’−末端
ｔＲＮＡ様構造は、チャヒキ・モザイク・ウィルスＲＮＡポリメラーゼによるＲ
ＮＡ複製に必須である（ＤｒｅｈｅｒおよびＨａｌｌ、１９８８年）。同様に、
ウィルス特異的エレメントがインフルエンザ・ウィルスのポリメラーゼにより触
媒されるＲＮＡ合成に必要である（米国特許第５８５４０３７号）。最後に、ロ
タウィルスのオープンコア粒子は、相同なｓｓＲＮＡのみを複製することが示さ
れている（Ｃｈｅｎら、１９９４年；および米国特許第５６１４４０３号）。

【０００８】 （発明の概要） 本開示は、種々のＲＮＡテンプレートおよびＤＮＡテンプレート存在下、プラ
イマー非依存ＲＮＡ合成のできる新規な、非特異的ポリメラーゼタンパク質に関
する。本発明者らは本報告が、広い範囲のウィルス特異的テンプレートおよび非
相同的ｓｓＲＮＡテンプレート双方を効果的にｉｎ ｖｉｔｒｏでプライマー非
依存的に複製して対応するｄｓＲＮＡ生成物を生成することができるＲＮＡポリ
メラーゼを単離した、最初の報告であると考える。好ましい実施形態において、
該ポリメラーゼは、２本鎖ＲＮＡウィルスあるいは２本鎖ＲＮＡウィルスのポリ
メラーゼをコードする核酸を含む細胞に由来する。本発明のポリメラーゼの特徴
は、これを（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＮＡの増幅、（２）合成生成物中に容
易に検出可能なヌクレオチド類縁体の取り込み、（３）非常に長いｄｓＲＮＡ類
を生成するＲＮＡ合成、（４）１本鎖核酸の安定化、および（５）ポリヌクレオ
チド類の配列決定に特に適したものとする。

【０００９】 本発明のポリメラーゼタンパク質は、好ましくはＣｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅウ
ィルス、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅウィルス、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅウィルスま
たはＴｏｔｉｖｉｒｉｄａｅウィルスから由来し、具体的にはφ６、φ７、φ８
、φ９、φ１０、φ１１、φ１２、φ１３、またはφ１４からなどのＣｙｓｔｏ
ｖｉｒｉｄａｅ科のφ６−関連バクテリオファージ類に由来する（Ｍｉｎｄｉｃ
ｈら、１９９９年）。

【００１０】 本技術の最も好ましい実施形態は、２本鎖ＲＮＡバクテリオファージφ６のＰ
２ポリメラーゼを扱う。より具体的には、Ｐ２ポリメラーゼは、そのタンパク質
をコードするＤＮＡを含む細菌株から単離された。単離されたＰ２ポリメラーゼ
の標品は、テンプレート依存ＲＮＡポリメラーゼとして作用することがｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ酵素アッセイにおいて証明された。Ｐ２ポリメラーゼは鋳型特異性が低
く、ｓｓＲＮＡ基質、ｄｓＲＮＡ基質、ｓｓＤＮＡ基質およびｄｓＤＮＡ基質存
在下、好ましくは線状形態でＲＮＡ合成を触媒できることが見出されている。該
Ｐ２ポリメラーゼは発展的(processive)であり、極めて高いＲＮＡ重合率を有し
、ＲＮＡ合成開始のためのプライマーを必要としないが、しかしプライマー存在
下でもまたＲＮＡ合成を開始できる。本発明はまた、Ｐ２ポリメラーゼの遺伝子
的に修飾された形態、または遺伝子コードが自然に変化したため変化した変化形
体に関する。

【００１１】 発明者らの知る限り、これが広範囲のウィルス特異的テンプレートおよび非相
同的ｓｓＲＮＡテンプレート双方をｉｎ ｖｉｔｒｏで効果的にプライマー非依
存性複製し対応するｄｓＲＮＡ生成物を生成することができるＲＮＡポリメラー
ゼを単離した最初の報告である。他の知られたＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ類
のテンプレート特異性は、本明細書に前記のとおり一般にかなり厳密である。本
発明のポリメラーゼは、実質的に任意に与えられたｓｓＲＮＡテンプレートから
ｄｓＲＮＡを生成するための一般的な道具として分子生物学的に使用できる新型
酵素である。最近、ｄｓＲＮＡは、種々の生物において幾つかの極めて重要なプ
ロセスを誘発することが示されたため大きな関心課題となっている（総説として
Ｓｈａｒｐ、１９９９年参照）。

【００１２】 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＮＡ合成に種々のｄｓＲＮＡテンプレートを利用でき
る本発明のポリメラーゼの能力はまた、研究されたポリメラーゼ類のいずれにお
いても知られていなかった新規な特徴である。酵母ウィルス様粒子がｄｓＲＮＡ
依存ＲＮＡ合成を触媒することが以前に報告されているが、この系でＲＮＡ転写
に用いられたテンプレートは、ウィルス特異的ｄｓＲＮＡだけであった（Ｆｕｊ
ｉｍｕｒａおよびＷｉｃｋｎｅｒ、１９８９年）。本発明において、用語「ＲＮ
Ａ転写」とは、ｄｓＲＮＡテンプレート上のＲＮＡ合成を言う。Ｐ２ポリメラー
ゼにより触媒されるＲＮＡ転写において、新たに合成されたＲＮＡは、ｄｓＲＮ
Ａテンプレートのテンプレート鎖と２本鎖を形成し、古い非テンプレート鎖と置
き換わる。したがって、このタイプの反応を利用して、ポリメラーゼとのインキ
ュベーションでできるｄｓＲＮＡ産物に放射活性または化学的に修飾されたヌク
レオチド類を取り込ませることによりｄｓＲＮＡ基質を標識することができる。
あるいは、該反応を基質ｄｓＲＮＡから放出されたｓｓＲＮＡを回収するために
使用できる。

【００１３】 ｓｓＲＮＡをｄｓＲＮＡに変換し、鎖置換機構によりｄｓＲＮＡを転写する本
発明のポリメラーゼタンパク質の能力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを増幅する
ために本酵素を使用することを示唆する。従来のポリメラーゼ類と違って、Ｐ２
タンパク質は１本鎖ＲＮＡテンプレートの相補的生成物を合成するためにプライ
マーを必要としない。したがって、該Ｐ２ポリメラーゼは、ＲＮＡ基質を増幅す
るために比類なく適している。これらの特性により、本発明のポリメラーゼは感
染検出において特に有用となる。これに関する診断法は、ＲＮＡサンプルを増幅
すること、場合によっては、容易に検出可能なヌクレオチド類縁体を増幅生成物
に取込ませること、ならびに直接的配列決定によりＲＮＡ種を同定することを含
む。

【００１４】 本発明のポリメラーゼがＤＮＡ基質存在下、ＲＮＡ合成できることもまた非常
に有利である。この特徴により、生物学的および物理化学的研究の双方に好適な
所望のＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ２本鎖の生成が可能となる。また、放射活性標識ま
たは化学的に修飾されたヌクレオチド類の存在下、ＤＮＡテンプレート類からＲ
ＮＡ合成を可能にして、放射活性標識化ＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ２本鎖または化学
的に修飾されたヌクレオチド類を含有するＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ２本鎖をそれぞ
れ得ることができる。

【００１５】 本発明は、本発明のポリメラーゼを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏのＲＮＡ合成法
を意図している。この方法は、（ａ）下記の詳細な説明において具体的に述べる
ように、ｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡまたはｓｓＤＮＡ、またはｄｓＤＮＡのど
れかに属する核酸基質を用意すること；（ｂ）その基質を、ＲＮＡ合成に十分な
条件下でポリメラーゼタンパク質と接触させること；および（ｃ）新たに形成さ
れた核酸を、反応混合物から回収することを含む。ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイ
ゼーションに依る方法とは対照的に、ｄｓＲＮＡを調製する本発明方法は都合が
よいことに、少なくとも１３，５００ｂｐまでの非常に長い２本鎖ＲＮＡ類を生
成するのに使用できる。例えば、米国特許第５７９５７１５号に記載されている
現行の方法は、一般に１０００ｂｐ未満の長さのｄｓＲＮＡ類を生成する。

【００１６】 本発明のポリメラーゼタンパク質を核酸類を安定化する方法に用いることがで
きる。１本鎖核酸類はヌクレアーゼにより容易に分解されることが知られている
。１本鎖核酸を２本鎖核酸に変換し、この反応混合物を１種または複数のヌクレ
アーゼを含む調製物と接触させることにより、１本鎖核酸に比べて安定性の増し
た２本鎖核酸類を回収することが可能である。

【００１７】 本発明はまた、後で述べるｉｎ ｖｉｔｒｏでのテンプレート依存ＲＮＡ合成
用のキットを提供する。

【００１８】 本発明はまた、ｄｓＤＮＡからｄｓＲＮＡを生成する方法に関する。この方法
は、 （ａ）ＤＮＡテンプレートをＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼにより転写するこ
とによりｓｓＲＮＡを用意すること；および （ｂ）本発明のタンパク質によりｓｓＲＮＡ基質をｄｓＲＮＡに変換すること
を含み、ステップ（ａ）および（ｂ）は同一反応容器内で同時に、または連続し
て実施されるのが好ましい。

【００１９】 本発明はまた、本発明のポリメラーゼタンパク質を用いる核酸分子のヌクレオ
チド塩基配列決定法に向けられる。これは、プライマー無しの直接核酸配列決定
への可能性を開いている。核酸分子を配列決定するための具体的なキットも開示
する。

【００２０】 本発明の他の特徴、態様および利点は、以下の記載および添付の請求項から明
らかとなろう。

【００２１】 本発明の以下の詳細な説明ならびに前記の本文は、添付の図面と組み合わせて
解釈すればより良く理解されるであろう。

【００２２】 （発明の詳細な説明） 本発明のポリメラーゼタンパク質は、ｄｓＲＮＡウィルスに由来するか、また
はこのようなウィルス・ポリメラーゼのアミノ酸配列を有するものである。本発
明のポリメラーゼは、ｓｓＲＮＡテンプレート、ｄｓＲＮＡテンプレート、ｓｓ
ＤＮＡテンプレート、またはｄｓＤＮＡテンプレートを用いてＲＮＡ合成を触媒
する。本発明の重要な態様は、ｄｓＲＮＡウィルスからポリメラーゼを精製する
方法である。本発明の好ましいポリメラーゼであるＰ２ポリメラーゼはprocessi
veであり、非常に高いＲＮＡ重合率を有し、ＲＮＡ合成開始のためにプライマー
を必要としないが、しかしプライマー存在下でＲＮＡ合成を開始することもでき
る。上記のように、プライマー非依存の合成は、サンプル中のＲＮＡ種定量のた
めのＲＮＡ増幅および直接的配列決定によるそれらの同定に特に有用である。こ
の方法論は、病原性寄生物および疾病に関連する遺伝子発現レベルの相違を検出
するのに特に有用である。

【００２３】 本発明のポリメラーゼ 新型テンプレート依存ＲＮＡポリメラーゼ類は、極めて低いテンプレート特異
性を有し、種々の核酸基質存在下でＲＮＡ合成を触媒できる。ＲＮＡポリメラー
ゼは、「ｄｓＲＮＡウィルスのポリメラーゼ」、「ｄｓＲＮＡウィルス・ポリメ
ラーゼ」、「ポリメラーゼタンパク質」または「ポリメラーゼ」と様々に呼ばれ
る。本発明は、好適な条件下でｓｓＲＮＡ基質、ｄｓＲＮＡ基質、ｓｓＤＮＡ基
質またはｄｓＤＮＡ基質と接触させると、ｄｓＲＮＡウィルス由来の単離ポリメ
ラーゼが単独でｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ合成できるという最初の直接的証拠を
提供する。

【００２４】 好ましくは、本発明のＲＮＡポリメラーゼは、任意のｄｓＲＮＡウィルス（例
えば、Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉ
ｄａｅまたはＴｏｔｉｖｉｒｉｄａｅ）に由来するものである。Ｃｙｓｔｏｖｉ
ｒｉｄａｅ科（例えば、φ６、φ７、φ８、φ９、φ１０、φ１１、φ１２、φ
１３またはφ１４）のφ６関連バクテリオファージ類は、本発明のポリメラーゼ
の最も好ましい起源であることが期待される。

【００２５】 同一または実質的に同じポリメラーゼは、同一または実質的に同じタンパク質
をコードする配列を有する核酸を単離することにより調製でき、選択された宿主
中好適な制御領域のもとでそのタンパク質を発現させてそのタンパク質を単離す
る。このようなタンパク質をコードする配列を有する核酸は、ｄｓＲＮＡウィル
スから単離するのが好ましく、そうでない場合は合成または部分的に合成しても
よい。

【００２６】 本発明の好ましい実施形態において、ＲＮＡ合成のｉｎ ｖｉｔｒｏ系は、ｄ
ｓＲＮＡバクテリオファージφ６の精製された組換えタンパク質Ｐ２に基づく。
ｄｓＲＮＡバクテリオファージφ６のＰ２タンパク質はまた、本明細書では「Ｒ
ＮＡポリメラーゼＰ２」、「Ｐ２ ＲＮＡポリメラーゼ」、「Ｐ２ポリメラーゼ
」、「Ｐ２タンパク質」または「Ｐ２」と様々に言われる。

【００２７】 さらに本発明は、 （ａ）少なくとも配列番号１の部分的核酸配列を有する核酸配列； （ｂ）少なくとも配列番号８の部分的アミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードする核酸配列； （ｃ）遺伝子コードの縮退により（ａ）または（ｂ）の核酸配列とは異なる核
酸配列； （ｄ）（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の核酸配列にハイブリダイズする
核酸配列；および （ｅ）（ｂ）の配列に対して少なくとも２０％同一性、好ましくは少なくとも
５０％同一性を示すアミノ酸配列をコードする核酸配列 を含む群から選択される核酸配列によりコードされるタンパク質に関する。

【００２８】 「部分的核酸配列」とは、配列番号１の１端または他端から少なくとも１個の
ヌクレオチドを欠く連続ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を意味し、該部分配列は依然と
して、タンパク質Ｐ２と同様の生物学的活性を有するタンパク質の発現を制御で
きる。

【００２９】 「部分的アミノ酸配列」とは、タンパク質Ｐ２と同様の生物学的活性を有した
ままの配列番号８の１端または他端から少なくとも１個のアミノ酸を欠く連続ア
ミノ酸配列を意味する。好ましい実施形態において、部分的アミノ酸配列は、ポ
リペプチドのＮ末端および／またはＣ末端から１０個、３０個または５０個のア
ミノ酸を欠く。

【００３０】 本発明はまた、遺伝子コードの縮退により配列番号１とは異なる核酸配列に関
する。

【００３１】 本発明はさらに、従来のハイブリダイゼーション条件下で、好ましくはＳａｍ
ｂｒｏｏｋら、１９８９年により記載されたようなストリンジェントな（緊縮）
条件下で、配列番号１にハイブリダイズする核酸配列に関する。高緊縮ハイブリ
ダイゼーションは、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液および１
００μｇの非特異的担体ＤＮＡ中で約６５℃から７０℃の間が考えられる。好ま
しいプローブは、配列番号１に記載されたポリヌクレオチド配列の連続した塩基
から選択された１００個の塩基である。過剰なプローブは約０．２×から０．１
×ＳＳＣ未満の等価イオン強度を有する溶液中で洗浄することにより除去する。
典型的な高緊縮洗浄は、５５℃で３０分間を２回、および６０℃で１５分間を３
回である。

【００３２】 本発明の核酸配列にハイブリダイズするこれらの核酸配列は、原則としてこの
ような核酸配列を有する任意の生物由来であり得るが、ｄｓＲＮＡウィルス由来
であることが好ましい。本発明の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列は、例
えば種々の生物の遺伝子ライブラリーから単離することができる。

【００３３】 このような核酸配列は、例えば標準的技法によるハイブリダイゼーション（Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年参照）により、本発明の核酸配列、またはこれら
の配列の断片、またはこれら分子の逆の相補分子を用いて同定し、単離すること
ができる。

【００３４】 ハイブリダイゼーション・プローブとしては、配列番号１と全く同一の、また
は実質的に同一のヌクレオチド配列を有する核酸分子またはその配列の断片が使
用できる。好ましくは配列番号１の全ヌクレオチド配列が使用される。ハイブリ
ダイゼーション・プローブとして使用される断片はまた、従来の合成技法により
得られた合成断片であって、その配列が本発明の核酸配列と実質的に同一である
ものであってもよい。本発明の核酸配列にハイブリダイズする遺伝子が同定され
単離されたらばその配列を決定し、その配列によりコードされるタンパク質の特
性を分析する必要がある。

【００３５】 用語の「核酸配列にハイブリダイズする」は、同一または実質的に同じタンパ
ク質またはその生物学的に活性な断片をコードしている、配列番号１の断片、誘
導体および対立変異体を包含する。断片は、記載されたタンパク質（または実質
的に同様のタンパク質）またはその生物学的に活性な断片をコードするのに十分
の長さを有する核酸配列の部分として理解される。本文での用語「誘導体」とは
、上記の核酸分子の配列とは１箇所または複数の箇所の位置で異なっており、し
かもその配列に対する相同性の高いこれら分子のヌクレオチド配列を意味する。

【００３６】 本明細書での「％同一性」とは、２個のアミノ酸配列が対応する位置で同一の
ヌクレオチドまたはアミノ酸の最大量を与えるように整列している場合、対応す
る位置に存在している同一アミノ酸のパーセンテージを意味する。本発明は、そ
のアミノ酸配列が配列番号８の特定のアミノ酸配列に対して、アミノ酸レベルで
少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８
０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９
０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質に関する。

【００３７】 改善された特性を有する修飾ポリメラーゼを構築するために、タンパク質工学
が使用できる。このような修飾には、例えばＰ２ポリメラーゼまたは実質的に同
様の特性を有するタンパク質のアミノ酸配列を現在利用できる酵素よりも：１）
よりテンプレート特異性を低くする；２）より操作性を高める；３）２本鎖核酸
テンプレート上でのＲＮＡ合成の触媒作用においてより効率的にするように突然
変異させることを含み得る。このような修飾はまた、プライマーの伸長、配列決
定または核酸の増幅に関して該酵素を最適化することも含むことができる。

【００３８】 本発明のポリメラーゼタンパク質の製造 本発明は、本発明のタンパク質、好ましくはｄｓＲＮＡウィルス・ポリメラー
ゼタンパク質の発現方法および精製方法を提供する。この方法は（ａ）本発明の
ポリメラーゼタンパク質をコードする配列を有する核酸を有しその核酸から前記
タンパク質を発現できる細胞をインキュベーションし；（ｂ）そのタンパク質を
宿主から、または培地から回収し；（ｃ）そのタンパク質を精製することを含む
。本発明の核酸配列は、発現ベクター内の調節エレメントに操作可能に結合させ
ることができる。その結合体は配列制御下でタンパク質を産生するために選択さ
れた宿主細胞内に導入される。具体的な実施形態として、バクテリファージφ６
のＰ２ ＲＮＡポリメラーゼの発現と精製が実施例１において扱われている。

【００３９】 本技術のポリメラーゼ発現は、任意の好適な宿主細胞において達成し得る（例
えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞または細菌細胞）。本発明の現時点で好ま
しい実施形態では、発現宿主は、細菌の大腸菌である。

【００４０】 該タンパク質は： （ａ）細胞溶解物を得るために緩衝液中で宿主細胞を破壊すること； （ｂ）前記溶解物を遠心分離により清澄化すること； （ｃ）少なくとも１回、より好ましくは２回のアフィニティー・クロマトグラ
フィを用いてタンパク質を精製すること； （ｄ）さらに、本質的にヌクレアーゼおよびプロテアーゼ活性の無いフラクシ
ョンを得るために少なくとも１回のイオン交換クロマトグラフィを用いてタンパ
ク質を精製すること を含むステップにより単離し、精製することが好ましい。

【００４１】 該精製法は、 （ｉ）ブルーアガロース(Blue Agarose)上でそのタンパク質を精製すること； （ｉｉ）ヘパリン・アガロース(Heparin Agarose)上で該タンパク質をさらに
精製すること；および （ｉｉｉ）リソースＱ(Resource Q)上で該タンパク質をさらに精製し、本質的
にヌクレアーゼやプロテアーゼを含まず、少なくとも９０％、より好ましくは少
なくとも９５％のポリメラーゼタンパク質を含有するタンパク質フラクションを
得ることを、含むことが好ましい。

【００４２】 本明細書で「本質的にヌクレアーゼやプロテアーゼを含まない」とは、精製さ
れたタンパク質調製物が検出可能な量のヌクレアーゼおよび／またはプロアーゼ
を含有しないという意味である。

【００４３】 ＲＮＡ基質上でのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ合成 本発明は： （ａ）ｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ基質を用意するステップ； （ｂ）前記ｓｓＲＮＡ基質またはｄｓＲＮＡ基質を、ＲＮＡ合成に十分な条件
下で本発明のタンパク質と接触させるステップ；および （ｃ）この反応混合液から新たに生成されたｄｓＲＮＡ種を回収するステップ
を含むｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを製造する方法に関する。

【００４４】 本技術の具体的実施形態によれば、ポリメラーゼＰ２は、あらたに開始し、さ
らにｓｓＲＮＡ基質上での完全長相補鎖合成を触媒し、適切なサイズのｄｓＲＮ
Ａ生成物を与えることが示された（図２、図３および図５）。したがって、精製
Ｐ２による反応は、φ６に関して確立された、最初の真正な複製のｉｎ ｖｉｔ
ｒｏモデルであると考えることができる。というのは、以前に報告されたφ６プ
ロカプシドに基づく系（Ｏｌｋｋｏｎｅｎら、１９９０年；Ｇｏｔｔｌｉｅｂら
、１９９０年）は、ＲＮＡパッケージ化が完了しない限り、複製を支援すること
ができない（Ｆｒｉｌａｎｄｅｒら、１９９２年）からである。

【００４５】 本技術の具体的実施形態において（図２）、Ｐ２複製混合物はＰ２タンパク質
の他に１本鎖ｍ^＋ＲＮＡ基質（φ６ファージのポジティブセンスｍセグメント）
、［α^３２Ｐ］ＵＴＰを含む４種のヌクレオチド三リン酸類（ＮＴＰ類）および
組換えプロカプシド系におけるＲＮＡ合成に関して記載されているのと同じ緩衝
液（Ｖａｎ Ｄｉｊｋら、１９９５年）を含んでいた。該反応生成物を分析する
と、Ｐ２タンパク質の存在は，ｍ^＋ＲＮＡ基質の２本鎖形（Ｍ）として移動し、
エチジウムブロミド（ＥｔＢｒ）染色ゲルとオートラジオグラムの双方（図２）
において見ることのできる新たなＲＮＡバンドの出現と対応することを示した。
このバンドの強度は、試験された範囲内で（レーン２〜４）加えられたＰ２の量
に比例していた。Ｐ２がＢＳＡと置換された場合、または該反応混合液がＲＮＡ
基質を欠いた場合（レーン２および１）、バンドは現れなかった。

【００４６】 図３（Ｃ）に示すように行われたＲＮａｓｅ保護アッセイでのＰ２複製生成物
の性質は、新たに生成されたＲＮＡが確かにｄｓＲＮＡの性質を有していること
を明白に証明している。また、鎖分離実験（図３（Ａ）および３（Ｂ））から、
プラスセンスＲＮＡセグメント（特にｍ^＋セグメント）の存在下、Ｐ２ポリメラ
ーゼは相補的マイナスセンスＲＮＡ鎖を合成することもまた明かである。

【００４７】 本発明の具体的実施形態により、ＲＮＡ合成の混合液は、０．０１から０．１
ｍｇ／ｍｌの精製Ｐ２（図１のレーン６）、４０μｇ／ｍｌから３００μｇ／ｍ
ｌのＲＮＡ基質、５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．９、８０ｍＭの酢酸アンモ
ニウム（ＮＨ_４ＯＡｃ）、各１ｍＭのＡＴＰおよびＧＴＰ、各０．２ｍＭのＣＴ
ＰおよびＵＴＰ、６％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭ
のＭｎＣｌ_２、２ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２ｍｇ／ｍｌのＢ
ＳＡ、および８００ｕ／ｍｌのＲＮａｓｉｎを含有していた。該反応混合物は２
８℃で１時間インキュベートした。条件をいくらか変更しても、検出できるレベ
ルのＲＮＡ合成を行えることが示された。具体的には、ｍ^＋ＲＮＡテンプレート
が用いられる場合、これらの変更条件は以下の群から選択された１つまたは幾つ
かの変更を含み得る： （１）該反応混合液中Ｐ２タンパク質の最終濃度を変える（好ましくは、０．
００５から０．４ｍｇ／ｍｌ）； （２）該反応混合液中に精製度の低いＰ２タンパク質標品を使用する（図２、
レーン３）； （３）異なるｐＨ値の緩衝液（好ましくはｐＨ７．３〜９．３）； （４）ヌクレオシド三リン酸の濃度を変える（好ましくは各ＮＴＰの０．２〜
３ｍＭ）； （５）ＰＥＧ４０００の濃度を変える（好ましくは０〜９％）； （６）ＭｇＣｌ_２の濃度を変える（好ましくは０〜１０ｍＭ、より好ましくは
５〜１０ｍＭ）； （７）ＭｎＣｌ_２の濃度を変える（好ましくは０〜３ｍＭ）； （８）ＢＳＡの濃度を変える（好ましくは０〜１ｍｇ／ｍｌ）； （９）インキュベートの温度を変える（好ましくは２０〜４２℃）。

【００４８】 しかし、最適なＲＮＡ合成のためには、ＡＴＰおよびＧＴＰ双方の最終濃度を
少なくとも１ｍＭまで上げることが最も有利である（例えば、図２のレーン４と
レーン６を比較）。また反応混合液にＭｎ^２＋イオンを含むことも非常に有利で
ある。なぜならばＭｎ^２＋の添加によりＲＮＡ合成が著しく促進されることが判
明したからである（例えば、図２のレーン４とレーン５を比較）。さらに、非イ
オン性界面活性剤、好ましくはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１０００またはＴｗｅｅｎ
２０を、好ましくは０．０１から０．５％の最終濃度まで加えることもまた、該
反応の効率にとって有利であることを本発明者らは見出した。ＲＮＡ依存ＲＮＡ
合成に及ぼすプリンヌクレオチド三リン酸やマンガンの促進効果はφ６ポリメラ
ーゼ複合体（Ｖａｎ Ｄｉｊｋら、１９９５年）および他の幾つかのウィルス・
ポリメラーゼ類（Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ、１９８０年およびその中の引用文献）
の双方に関して報告されている。

【００４９】 本発明の他の実施形態において、Ｐ２ポリメラーゼは、φ６ファージに関連し
ているものと非相同体の両方の幾つかの異なったｓｓＲＮＡ基質を複製すること
が示された。第１に、一連の種々のφ６特異的ｓｓＲＮＡをＰ２ポリメラーゼ・
アッセイにおいて試験した（図５、レーン１〜８）。φ６ファージの大型（ｌ^＋ ）ｓｓＲＮＡセグメントと小型（ｓ^＋）ｓｓＲＮＡセグメントのコピーのどちら
もが、ゲル中をＬおよびＳ各々の位置において移動する標識化ｄｓＲＮＡ生成物
を生じさせた。これら２種の基質の複製効率は、前に述べた実施形態においてや
はり基質として用いられたｍ^＋ＲＮＡの複製効率（図５、レーン１〜３）と非常
に近かった。同等の複製効率が、φ６ヌクレオカプシド転写混合物から単離され
た天然の１本鎖セグメントに関して見出された（レーン８）。もう１つの試験さ
れた基質は、融合したｓ^＋セグメント、ｍ^＋セグメントおよびｌ^＋セグメントか
ら成る１３．５ｋｂ長の転写体（Ｑｉａｏら、１９９７年）であった。この場合
の２本鎖生成物は、Ｌセグメントより著しく移動が遅く、完全なまたは殆ど完全
な複製を示していた。３種のセグメントは全て７０〜８０塩基長の３’末端部分
が保存されており、伸長的な二次的構造を形成していると考えられていることは
注目すべきことである（Ｍｉｎｄｉｃｈら、１９９４年）。上記のＲＮＡ基質全
てがこの特徴を有しており、複製可能であった。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
でのＲＮＡ複製の可能性に及ぼす３’−近位配列の効果可能性を調べることは興
味深いことであった。３’末端において１５８個のヌクレオチドを欠く切断ｓ^＋ セグメントが合成され、複製反応における基質として用いられた（レーン４）。
驚くべきことに、生成物の効率における低下は見られなかった。それどころか、
この複製効率は、非修飾ｓ^＋の複製効率よりもいくらか高かった。プラスミドポ
リリンカー由来の１３個の余分のヌクレオチドをつけたｓ^＋ＲＮＡでは、さらに
高い複製効率が検出された（レーン５）。しかしながら、ｓ^＋セグメントに３１
個のポリリンカーヌクレオチドを加えると、ｄｓＲＮＡ生成物の収率を著しく低
下させた（レーン６）。したがって、我々は以下のように結論した：１）ＲＮＡ
基質の３’末端における保存された二次的構造とφ６特異的配列のどちらも、Ｐ
２によるｉｎ ｖｉｔｒｏの複製にとって重要ではない。しかしながら、２）複
製効率は確かに基質の３’末端配列に依存する。第２に、Ｐ２ポリメラーゼはま
た、３種のφ６ ＲＮＡセグメントのいずれにも関連していない幾つかの非相同
的ｓｓＲＮＡテンプレート類を効果的に複製することも示された。試験されたＲ
ＮＡ類の全てが複製反応にとって好適な基質であることが判ったが、生成される
ｄｓＲＮＡの収率は投入されたテンプレートの性質に依存した（図５、レーン９
〜１２）。Ｔ７ファージ転写体の混合物は、数種のｄｓＲＮＡ種の非常に効果的
な合成できた（レーン９）。効果的なテンプレート類は、ホタル・ルシフェラー
ゼのメッセンジャーＲＮＡとブルータング・ウィルスのプラスセンス転写体であ
った（レーン１０とレーン１２）。大腸菌ファージＭＳ２のゲノムＲＮＡの複製
は、再現的に効率が悪く、元のＥｔＢｒ染色ゲル中でｄｓＲＮＡ生成物は殆ど認
められなかった。この場合でもオートラジオグラム上では、生成物のバンドは明
らかに検出できた（レーン１１）。さらに、幾つかの他のＲＮＡ、すなわちチオ
レドキシンをコードするｍＲＮＡ（ＸｈｏＩで切断したｐＥＴ３２ｂ（＋）のＴ
７転写体）、緑色蛍光タンパク質（ＥｃｏＲＩで切断したｐＴＵ５８のＴ７転写
体）およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩと融合させたホタル・ル
シフェラーゼ（ＸｈｏＩで切断したｐＴＺｌｕｃ（ＮＰＴ２）のＴ７転写体）、
および大腸菌の１６Ｓおよび２３ＳリボゾームＲＮＡの混合物（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ社）もまた、Ｐ２タンパク質で複製可能であった（データは示さず）。該
酵素は、ＲＮＡテンプレートを長さ１３．５ｋｂまで（図５、レーン７）および
恐らくより長く（図５、レーン９）複製することができ、高い進歩性を示したこ
ともまた注目すべきことである。

【００５０】 種々のｓｓＲＮＡテンプレートの完全で効果的な複製により、本発明のポリメ
ラーゼタンパク質を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｓＲＮＡ製造の一般的な方法が
示唆される。多くの細胞プロセスの強力な調節物質としてのｄｓＲＮＡの重要性
を知ると（Ｓｈａｒｐ、１９９９年）、本発明方法は特に有用であると思われる
。この数十年間、ｄｓＲＮＡ分子は、高等真核生物における翻訳の強力な阻害剤
として知られてきた。最近、ｄｓＲＮＡは、昆虫、線虫、トリパソノーマおよび
ゼブラフィッシュなどの幾つかの動物において、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ
）を起こすことが示された。ｄｓＲＮＡを介した生化学経路についてのさらなる
知見は、植物から得られており、それらは転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧ
Ｓ）の形でｄｓＲＮＡに応答することが示されている。明らかに、ＲＮＡｉおよ
びＰＴＧＳの双方とも配列特異的機構であり、標的遺伝子の発現が、該遺伝子ま
たはその部分と相同の配列を有するｄｓＲＮＡ断片によって阻害されていること
を示唆している。ｄｓＲＮＡ依存性の調節のさらなる例は、ごく近い将来発見さ
れる可能性が高い。この点で、予め決定された配列を有するｄｓＲＮＡの合成の
ために提出された方法は、ｄｓＲＮＡにより引き起こされるメカニズムの研究お
よび可能な適用における真の突破口となることを示している。本発明の好ましい
実施形態において、ｄｓＲＮＡ製造方法に用いられるポリメラーゼは、バクテリ
オファージφ６由来のＲＮＡポリメラーゼＰ２である。この方法のためのｓｓＲ
ＮＡ基質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成できるか、または細胞源またはウィルス源
から精製できる。ｓｓＲＮＡ複製に好適な条件は、本技術の具体的実施形態（実
施例２を参照）で記載されたとおりでもいいし、または検出可能な量のｄｓＲＮ
Ａ生成物の生成を低下させないように変えることもできる。使用者の要求と意図
に依り、生成されたｄｓＲＮＡは、反応混合物の他の成分からさらに精製して、
または精製しないで用いることができる。

【００５１】 本技術の具体的実施形態において、Ｐ２はまた、φ６のｄｓＲＮＡゲノムまた
は他のウィルス（Ｌ−Ａ、ＢＴＶ、ＣＰＶ）の非特異的ｄｓＲＮＡゲノムから精
製された２本鎖ＲＮＡをＲＮＡ合成のためのテンプレートとして使用することも
示された（図８、および非図示）。本発明において、ｄｓＲＮＡ基質存在下での
ＲＮＡ合成反応を、ＲＮＡ転写と称す。ＲＮＡ転写結果として、新たに合成され
たＲＮＡは、ｄｓＲＮＡテンプレートのテンプレート鎖との２本鎖を形成し、古
い非テンプレート鎖と置き換わる。φ６に由来するｄｓＲＮＡ基質の場合、Ｐ２
は、圧倒的にプラス鎖ＲＮＡを合成することが示される（図９）。

【００５２】 ＤＮＡ基質上のＲＮＡ合成 本発明は、 （ａ）ｓｓＤＮＡ基質またはｄｓＤＮＡ基質を用意するステップ； （ｂ）前記ｓｓＤＮＡ基質を、ＲＮＡ合成に十分な条件下で本発明のタンパク
質と接触させるステップ；および （ｃ）反応混合物から新たに生成した核酸を回収するステップ を含むｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを製造する方法に関する。

【００５３】 天然由来のｄｓＲＮＡ類に加えて、Ｐ２はまた、合成ｄｓＲＮＡテンプレート
上のＲＮＡ転写を触媒する（図９Ａ、本発明で請求されたｄｓＲＮＡ製造方法を
用いてｓｓＲＮＡから調製されたｍ^＋）。具体的には、以下のステップを用いて
上記実験のための合成ｄｓＲＮＡ基質を調製した（詳細については実施例２も参
照）： ａ）Ｔ７プロモーターの制御下にｍ^＋ｃＤＮＡ複製物を含む線状化プラスミド
をＴ７ ＲＮＡポリメラーゼでｉｎ ｖｉｔｒｏ転写してｍ^＋ｓｓＲＮＡをつく
ること； ｂ）Ｐ２ポリメラーゼによるｍ^＋ｓｓＲＮＡの複製；および ｃ）続いてＭセグメントの新たに形成されたｄｓＲＮＡを１％アガロース・ゲ
ルで精製して、そのｄｓＲＮＡを複製混合物の他の成分から分離すること。

【００５４】 本技術の幾つかのさらなる実施形態によれば、一連の１本鎖ＤＮＡ（例として
は合成デオキシリボオリゴヌクレオチド、Ｍ１３ファージ線状ｓｓＤＮＡ）を、
１本鎖ＲＮＡに関して上述したのと同様な条件下でＰ２により複製できることが
示された（図１０Ａ、および非図示）。この反応により、テンプレートＤＮＡお
よび新たに生成したＲＮＡレプリカから成る２本鎖を生じる。さらに、幾つかの
線状ｄｓＤＮＡが、Ｐ２触媒ＲＮＡ合成のためのテンプレートとして働くことが
示された（図１０（Ｂ））。ここでも、ＲＮＡテンプレートの場合のように、１
本鎖ＤＮＡは２本鎖ＤＮＡよりも効率がはるかに高い基質である。

【００５５】 ＲＮＡ基質およびＤＮＡ基質でのＲＮＡ合成条件 ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを生成する方法は、 −ＲＮＡ基質またはＤＮＡ基質を用意し； −前記ＲＮＡ基質またはＤＮＡ基質を、 （ａ）核酸基質、好ましくは４０〜４００μｇ／ｍｌ； （ｂ）請求項１〜５のタンパク質、好ましくは０．００５〜０．５ｍｇ／ｍｌ
； （ｃ）緩衝剤、好ましくはｐＨ７．３〜９．３； （ｄ）ＭｇＣｌ_２イオン、好ましくは０〜１０ｍＭ、より好ましくは５〜１０
ｍＭ； （ｅ）ヌクレオシド三リン酸、好ましくは各ＮＴＰの０．２〜３ｍＭ； （ｆ）ＰＥＧ、好ましくは０〜９％； （ｇ）酢酸アンモニウム、好ましくは０〜２００ｍＭ； （ｈ）ＭｎＣｌ_２、好ましくは０〜３ｍＭ； （ｉ）ＢＳＡ、好ましくは０〜１．０ｍｇ／ｍｌ； （ｊ）ＤＴＴ、好ましくは０〜５ｍＭ； （ｋ）非イオン性界面活性剤、好ましくは０〜０．５％ を含む混合物中ＲＮＡ合成に十分な条件下で本発明のタンパク質と接触させ、 −該反応混合物を２０℃〜４０℃でインキュベーションし、 −反応混合物から新たに生成した核酸種を回収する ことを含む。

【００５６】 ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ増幅法 本発明は、 （ａ）ＲＮＡ基質を用意するステップ； （ｂ）前記ＲＮＡ基質を、ＲＮＡ複製およびＲＮＡ転写の双方に十分な条件下
で本発明のいずれか１種のタンパク質と接触させるステップ；および （ｃ）該反応混合物から新たに生成した増幅ＲＮＡの混合物を回収するステッ
プ を含むｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを増幅させる方法に関する。

【００５７】 さらに本発明は、 （ａ）ｓｓＲＮＡ基質を用意するステップ； （ｂ）前記ｓｓＲＮＡ基質を、ｄｓＲＮＡを形成するために請求項１から５の
いずれか一項に記載のタンパク質により複製するステップ； （ｃ）前記ｄｓＲＮＡを、本発明のタンパク質により転写してｓｓＲＮＡを得
るステップ；および （ｄ）ＲＮＡ合成生成物の十分な量が得られるまで増幅ステップを反復するス
テップ を含む方法に関する。

【００５８】 興味深いことに、合成ＭセグメントのＰ２による転写（図９、Ｍ）は、ｍ^＋複
製に好ましく用いられた条件とよく似た条件下で実施された。この事実は、Ｐ２
が触媒するｓｓＲＮＡ基質の複製で新たに形成されたｄｓＲＮＡがＰ２が触媒す
る転写のテンプレートとして働き得ることを示唆するものである。一本の試験管
中でこのように複製と転写が同時に起こるということは、１本鎖ＲＮＡ基質用に
組まれた反応が、ｄｓＲＮＡ種（投入したｓｓＲＮＡの複製生成物）のみならず
ｓｓＲＮＡ種（新たに形成されたｄｓＲＮＡ種の転写生成物）をも生じさせるこ
とを意味する。少なくともいくらかの新たに合成されたｓｓＲＮＡは、投入ｓｓ
ＲＮＡ基質と同じ極性となるであろうから、Ｐ２含有反応混合物中での投入基質
の増幅がおこるであろう。おおむね、上述の新たに生成したｓｓＲＮＡは順次、
もう１回このような増幅ラウンド、あるいは数回のラウンドさえも経ると思われ
る。このスキームに基づいて、本発明は、（ａ）ＲＮＡ基質を用意するステップ
；（ｂ）このＲＮＡを本発明のポリメラーゼタンパク質と接触させ、増幅ＲＮＡ
を回収するステップ、から成るＲＮＡ増幅方法を提供する。現在のところ好まし
い条件下でのｄｓＲＮＡの転写は、バンド強度をホスホロイメージャー分析して
算出したところ、ｓｓＲＮＡの複製よりも効率的にはいくらか劣る。

【００５９】 本発明はまた、 （ａ）ＤＮＡテンプレートを、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼにより転写する
ことによりｓｓＲＮＡ基質を用意するステップ；および （ｂ）前記ｓｓＲＮＡ基質を請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク
質により複製してｄｓＲＮＡを形成するステップ を含むｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを増幅する方法に関する。

【００６０】 この方法は、以下のステップをさらに含むｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを増幅す
る方法に用いることができる： （ｃ）前記ｄｓＲＮＡを請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質に
より転写してｓｓＲＮＡを得るステップ；および （ｄ）ＲＮＡ合成生成物の十分な量が得られるまで増幅ステップを反復するス
テップ。

【００６１】 本発明の具体的な実施形態において、Ｐ２が触媒する複製のためのｓｓＲＮＡ
基質は、ＤＮＡテンプレートをＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼで転写することに
より用意できる。好ましい事例では、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼは、バクテ
リオファージから得られる。そのバクテリオファージは、Ｔ７、Ｔ３、およびＳ
Ｐ６バクテリオファージから成る群から選択することが最も有利である。幾つか
の本技術の実施形態では、前記ＤＮＡテンプレートのＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラ
ーゼによる転写および新たに生成した線状ｓｓＲＮＡのＰ２触媒複写は、同じ反
応容器内で行わせることができる。後者のアプローチの可能性を証明するために
特別な実験を実施した。これらの実験において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ用の
プロモーターを含む線状ｄｓＤＮＡ（すなわち、ＳｍａＩで切断されたｐＬＭ６
５９）を、温度が３７℃である以外はＰ２触媒ＲＮＡ複製に関する実施例２に記
載されたものと本質的に同じ条件下で、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼとＰ２ ＲＮ
Ａポリメラーゼの両方とインキュベーションした。その反応生成物は基本的には
、標準アガロース・ゲル電気泳動で対応するφ６ｓ＋およびＳセグメント（示し
ていない）の位置に移動するｓｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの混合物を含んでいた
。Ｐ２を反応混合物から除くとｓｓＲＮＡ種のみが形成された。

【００６２】 上に掲げた知見に基づいて、本発明は種々の核酸テンプレートと接触させた本
発明のポリメラーゼを用いてＲＮＡを生成する方法を提供する。幾つかのこれら
の方法は、核酸の安定性を増し、プライマー非依存配列決定、およびプライマー
を伸長するなどの特別な用途に使用するために設計される。

【００６３】 核酸の安定化法 本発明は、 （ａ）１本鎖核酸基質を用意するステップ； （ｂ）前記１本鎖核酸基質を、ＲＮＡ合成に十分な条件下で本発明のタンパク
質と接触させて、少なくとも１本鎖核酸基質の一部を２本鎖核酸体に変換するス
テップ； （ｃ）反応混合物から全核酸を回収するステップ を含む核酸を安定化する方法に関するものであり； この方法は、場合によっては： （ｄ）前記全核酸を、ヌクレアーゼまたは１本鎖核酸を選択的に分解するが２
本鎖核酸は分解しないヌクレアーゼを含む調製物と接触させるステップ；および （ｅ）ヌクレアーゼによる分解に対して安定性の増した２本鎖核酸を回収する
ステップ をさらに含むことができる。

【００６４】 １本鎖核酸の安定性増加法は、２本鎖核酸が、ある一定条件下で１本鎖特異的
ヌクレアーゼによる分解に抵抗性があるという現象（例えば図３（Ｃ）に示され
る）に基づく。

【００６５】 線状核酸のヌクレオチド塩基配列決定法 本発明は、 （ａ）線状核酸分子を用意するステップ； （ｂ）本発明のタンパク質； ４種のヌクレオシド三リン酸またはそれらの機能性類縁体；および 特定のヌクレオチド塩基でＲＮＡ合成を終結させる４種のＲＮＡ合成終止
剤のうち少なくとも１種（それらの剤はそれぞれ異なるヌクレオチド塩基でＲＮ
Ａ合成を終結させる） を含む混合物中、ＲＮＡ合成に十分な条件下で前記核酸分子をインキュベートす
るステップ；および （ｃ）インキュベーション反応で終結したＲＮＡ産物をサイズにより分離して
、前記核酸分子の少なくとも一部のヌクレオチド塩基配列を決定するステップ を含む線状核酸分子のヌクレオチド塩基配列を決定する方法に関する。

【００６６】 核酸のプライマー非依存酵素的配列決定法は、本発明のポリメラーゼ（好まし
い実施形態ではＰ２タンパク質）が、１）プライマー無しでＲＮＡ合成を開始で
き、２）核酸テンプレート（好ましい実施形態ではｓｓＲＮＡ）のまさに３’末
端ヌクレオチドから出発するという事実（図７）に依る。後者の特徴によって、
新たに生成されたＲＮＡ鎖は、テンプレート調製が均質である場合、均一の５’
末端を有することになろう。都合のいいことに本発明のポリメラーゼは、伸びて
ゆくＲＮＡ鎖に３’−デオキシヌクレオチドを取込むことができ、その結果特定
の位置で鎖を終結させることが証明された（非図示）。ＤＮＡまたはＲＮＡ重合
反応に基づく核酸配列決定の方法のいくつかは、先行技術に記載されている（例
えば、米国特許第５１７３４１１号およびその中の引用文献；Ａｘｅｌｒｏｄお
よびＫｒａｍｅｒ、１９８５年）。これら全ての方法において、塩基特異的鎖終
止剤、例えばジデオキシヌクレオチド類（ＤＮＡポリメラーゼに対し）または３
’−デオキシヌクレオチド類（ＲＮＡポリメラーゼに対し）の取込みにより重合
を特定の塩基において終結させる。ＤＮＡポリメラーゼに基づく配列決定の場合
、重合は、関心のあるテンプレートに相補的なプライマーから開始される。ＤＮ
Ａ依存ＲＮＡポリメラーゼは、プライマー無しでＤＮＡを配列決定するのに用い
られた（Ａｘｅｌｒｏｄら、１９８５年）。しかしこの場合、ＤＮＡテンプレー
トは、ＲＮＡ合成開始のために特別なプロモーターを含まねばならない。都合の
良いことに、本技術の核酸配列決定法は、プライマーまたはプロモーターのいず
れも必要としない。本発明方法の唯一の限定は、配列決定されるポリヌクレオチ
ドにおける遊離の３’末端の存在である。

【００６７】 プライマー伸長法 本発明はまた、本発明のポリメラーゼを用いたプライマー伸長法を開示する。
このプライマー伸長法は、基本的にｓｓＲＮＡテンプレートとそのテンプレート
の中のある部分に相補的な標識デオキシリボオリゴヌクレオチドプライマーとか
らなる核酸テンプレートの存在下でＰ２を用いＲＮＡを合成した本発明の具体的
実施形態で成された観察に基づいている。Ｐ２ポリメラーゼは、ヌクレオチド類
をその３’末端に付加することによりプライマーを伸長できることが示された。
このタイプのＲＮＡ合成は、完全にｓｓＲＮＡテンプレートの存在に依存する。
主反応生成物のサイズは、ＲＮＡ重合化がプライマーの３’末端から開始してポ
リメラーゼがｓｓＲＮＡテンプレートのちょうど５’末端に到達するまで続くと
いう想定と一致した（示さず）。

【００６８】 ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ合成用および配列決定用キット 本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ合成用キットを提供する。該キット
には、本発明のポリメラーゼタンパク質の標品および十分なレベルでのＲＮＡ合
成に必要な添加物を含んでいる。これら添加物の性質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｒ
ＮＡ合成の詳細な説明（実施例２および３）から容易に理解される。添加物とし
ては、典型的には緩衝剤、塩、ＰＥＧおよび／またはＤＴＴを含む。本発明の具
体的実施形態において、該キットには、ヌクレオシド三リン酸および／または検
出可能なＲＮＡ合成を活性化させるために示された１種または複数の核酸調製物
を含んでもよい。他の具体的実施形態において、ヌクレオシド三リン酸混合物は
、検出可能な標識を持つよう修飾された少なくとも１種のヌクレオシド三リン酸
を含むこともできる。

【００６９】 本発明はまた、配列決定に特に用いられるキットを開示する。このキットは、
特定のヌクレオチド塩基でＲＮＡ合成を終結させる少なくとも１種のＲＮＡ合成
終止剤を含む。

【００７０】 化学的に修飾されたヌクレオチド類のＲＮＡ生成物への取込み 正常または放射性標識ヌクレオシド三リン酸に加えて、本発明者らは、本発明
のポリメラーゼが、ＲＮＡ生成物に化学的に修飾されたヌクレオチド類を取込ま
せることを示した。この取込みは、蛍光または化学発光検出に基づくものなど非
放射性方式でのＲＮＡ合成アッセイを可能にする。蛍光標識または他の非放射性
標識を含有するＲＮＡ生成物は、例えばＲＮＡプローブとしても使用できる。

【００７１】 好ましい実施形態において、ｓｓＲＮＡ基質を含有する標準Ｐ２複製混合物に
は、０．０２〜０．１ｍＭのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８−５−
ＵＴＰ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）、クマリン−５−ＣＴＰ（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社）、またはビオチン−１１−ＣＴＰ（Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社）を加えた。反応物を３０℃で１時間
インキュベーションした。次に反応混合物をＡｕｔｏＳｅｑ Ｇ−５０スピンカ
ラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を通して非反応ヌクレオチド類縁体および他の低
分子量不純物からＲＮＡ生成物を精製した。次にヌクレオチド類縁体の新たに生
成したＲＮＡへの取込みを、フロースルーフラクションを用い分光蛍光光度計（
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８−５−ＵＴＰおよびクマリン−５−ＣＴＰの場合
）またはドットブロット・アッセイ（ビオチン−１１−ＣＴＰの場合）を用いて
測定した。どちらの場合も、検出できる量の類縁体がＲＮＡ生成物フラクション
に見出された（図１１）。

【００７２】 実施例１ 組換えバクテリオファージφ６Ｐ２ポリメラーゼの発現および精製 Ｐ２生産株の構築 Ｐ２タンパク質発現のためのプラスミドを構築するために、Ｐ２遺伝子（配列
番号１）を、組換えＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）および
オリゴヌクレオチドでｐＬＭ６８７（Ｍｉｎｄｉｃｈら、１９９４年）テンプレ
ートからＰＣＲ増幅した。 ５’−ＧＧＴＡＡＧＣＧＣＣＡＴＡＴＧＣＣＧＡＧＧＡＧＡ−３’（配列番号
２）および５’−ＴＡＣＧＡＡＴＴＣＣＧＧＣＡＴＧＡＴＴＡＣＣＴＡＧＧＣＡ
ＴＴＡＣＡ−３’（配列番号３）は、それぞれ上流および下流プライマーとして
働く。ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化されたＰＣＲ断片（プライマー配列内の
下線部）をゲルで精製しＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩで切断したベクターｐＥＴ３２ｂ
（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）の大型断片と結合させた。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３
）（ＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔｔ、１９８６年：Ｎｏｖａｇｅｎ社から
購入）を、得られたプラスミドｐＥＭ２で形質転換してＰ２生産株ＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３／ｐＥＭ２）を得た。全Ｐ２挿入体の配列を決定した（配列番号８）。公表
されたタンパク質配列（ジーンバンク、ＡＡＡ３２３５５）と比較すると、すな
わちＩｌｅ４５７がＭｅｔに変わった１つのアミノ酸の変化が見出された。この
位置でのメチオニンコドンは遺伝子増幅のテンプレートとして用いられたプラス
ミドｐＬＭ６８７中にも見出された。このプラスミドは、φ６ファージの全大型
ゲノム・セグメントのｃＤＮＡコピーを含有し、以前に逆遺伝学実験に使用され
て生ウィルス粒子を生じた（Ｍｉｎｄｉｃｈら、１９９４年）。したがって、観
察された変化は、ウィルス内のＰ２活性を損なわない。

【００７３】 組換えＰ２タンパク質の発現および精製 Ｐ２タンパク質の精製を、１２．５％アクリルアミドゲル中のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ（ＯｌｋｋｏｎｅｎおよびＢａｍｆｏｒｄ、１９８９年）、および組換えポリ
メラーゼ複合体（ＰＣ）粒子（ＦｒｉｌａｎｄｅｒおよびＢａｍｆｏｒｄ、１９
９５年）に対するウサギポリクローナル抗体による免疫ブロット法によりモニタ
ーした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット分析（図１、レーン１〜３）によ
る判定では、ＢＬ２１（ＤＥ３／ｐＥＭ２）株は１５〜２３℃で可溶性のＰ２タ
ンパク質を検出可能な量で生産した。注目すべきことに、２８〜３７℃で発現さ
せると、Ｐ２の生産は極めて高くなり、合成されたタンパク質の殆ど全てが不溶
性形態であった（示さず）。可溶性Ｐ２の発現を達成するために、１５０ｍｇ／
ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ培地中でＢＬ２１（ＤＥ３／ｐＥＭ２）株のス
ターター培養を３７℃で振とうし、ＯＤ_５４０が０．５に達するまで増殖させた
。次にこれを３Ｌの同一培地中に５０倍希釈した。さらに、希釈した培養菌を３
７℃でＯＤ_５４０１．０まで増殖させた。培養を氷で冷却し、１ｍＭのイソプロ
ピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導をかけた。ＩＰＴ
Ｇで誘導した細胞を次に１５℃に移して１８時間振とうした（図１、レーン１〜
２）。あるいは誘導した培養菌を１４時間振とうして２０〜２３℃で発現を行っ
た。他に特に指示しない限り、以下のステップはすべて４℃で実施した。菌を遠
心分離で集め、３０ｍｌの緩衝液Ａ１（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ トリ
スＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した。懸濁液は〜１０５Ｍ
Ｐａで予め冷却したフレンチプレスのセルを３回通した。一回通した後にフッ化
フェニルメチルスルホニルを１ｍＭになるよう加えた。溶菌液を１２０，０００
ｇで２時間３０分遠心分離した。上清画分（図１、レーン１）をダイアフィニテ
ィーカラム（Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ ３ＧＡ、Ｓｉｇｍａ社）に充填した
。カラムに結合したタンパク質を緩衝液ＡＳ（５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ
トリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で溶出した。Ｐ２を含有する
フラクションをプールしたもの（図１、レーン４）を氷冷蒸留水で５倍希釈し、
ヘパリン・アガロース・カラム（シグマ社）に載せた。タンパク質を、５０ｍＭ
トリスＨＣｌ、ｐＨ８．０および１ｍＭ ＥＤＴＡで緩衝化した０．１〜１Ｍ
ＮａＣｌの直線勾配で溶出した。Ｐ２を含む画分（図１、レーン５）を集めて
２０ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ８．０で１０倍希釈しろ過して、Ｒｅｓｏｕｒｃ
ｅＱカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社；室温）に注入した。結合タンパク質の溶出
は、５０ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ８．０および０．１ｍＭ ＥＤＴＡで緩衝化
した０〜０．５ＭＮａＣｌの勾配で実施した。Ｐ２は、凡そ９０〜１００ｍＭ
ＮａＣｌで単独ピークとして溶出した（図１、レーン６）。精製Ｐ２タンパク質
の濃度を６Ｍ塩酸グアニジン中２８０ｎｍにおける吸光度により測定した（折り
たたまれていないタンパク質について算出された１ｍｇ／ｍｌ当たり１．３９の
値を基準にした；Ｅｄｅｌｈｏｃｈ、１９６７年）。精製タンパク質の推定収量
は、細菌培養１リットル当たり約１ｍｇであった。Ｐ２を２０〜２３℃で発現さ
せた場合、通常いくらか良好な収量が得られた。精製Ｐ２は、活性やタンパク質
の完全性の検出できるほどの損失なしに、１カ月間までは氷上で保存できた。

【００７４】 実施例２ ＲＮＡ複製 細菌株とプラスミド 大腸菌ＤＨ５α（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を、プラスミド増幅および分子クロ
ーニングの宿主とした。プラスミドｐＬＭ６５９（Ｇｏｔｔｌｉｅｂら、１９９
２年ｂ）、ｐＬＭ６５６（Ｏｌｋｋｏｎｅｎら、１９９０年）およびｐＬＭ６８
７（Ｍｉｎｄｉｃｈら、１９９４年）はそれぞれ、バクテリオファージゲノム・
セグメントｓ^＋、ｍ^＋およびｌ^＋のポジティブセンスｓｓＲＮＡコピーをつくる
ことができた。プラスミドｐＬＭ１８０９（Ｑｉａｏら、１９９７年）は、融合
したｓ^＋、ｍ^＋、ｌ^＋セグメントを含む長いＲＮＡ合成に使用された。プラスミ
ドｐＧＥＭｌｕｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）は、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ
ルシフェラーゼｍＲＮＡをつくるのに用いられた。プラスミドｐＴＵ５８（Ｃｈ
ａｌｆｉｅら、１９９４年）およびｐＴＺｌｕｃ（ＮＰＴ２）（Ｍａｋｅｙｅｖ
ら、１９９６年）は、緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡ類およびホタル
・ルシフェラーゼとネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩの翻訳融合体を
つくるためのテンプレートであった。

【００７５】 ｓｓＲＮＡ基質の調製 合成１本鎖ＲＮＡ基質は、ＳＰ６（ｐＧＥＭｌｕｃについて）またはＴ７（残
りのＤＮＡテンプレートについて）ＲＮＡポリメラーゼを用いてｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ転写により調製された。非標識ＲＮＡは、原則としてＭａｋｅｙｅｖら、１９
９６年に記載されるようにして５０μｌ転写混合物中で作った。混合物を３７℃
で２時間インキュベーションしてから、投入ＤＮＡテンプレートの１μｇ当たり
１単位のＤＮａｓｅ ＲＱ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を加えて停止させた。インキュ
ベーションはさらに３７℃で１５分間続けた。ＲＮＡ標品はフェノール／クロロ
ホルム（１：１）、クロロホルムの順で抽出し、３Ｍ ＬｉＣｌで沈殿させ、滅
菌水に溶解した。標識ｍ^＋ＲＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ社により推奨されたとおり
合成した。混合物（２５μｌ）は、１ｍＣｉ／ｍｌの［α^３２Ｐ］ＵＴＰ（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ社、３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、２０単位のＲＮａｓｉｎ、Ｘｂａ
Ｉ（ＮＥＢ社）およびマングビーン・ヌクレアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で処理
された４μｇのｐＬＭ６５６、４０単位のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを含む。反
応を１時間実施してから、標識ＲＮＡをＬｉＣｌ沈殿ステップ後にセファデック
スＧ２５スピンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を通すことによりさらに精製す
ること以外は、非標識転写について記載されるように処理した。天然φ６転写体
の混合物（１本鎖セグメントｓ^＋、ｍ^＋およびｌ^＋）は、ヌクレオカプシドによ
る転写（Ｂａｍｆｏｒｄら、１９９５年）、次いでフェノール抽出、３連続Ｌｉ
Ｃｌ沈殿により調製した。ＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍにおける光学密度により測
定した。ＲＮＡの品質は、７．５Ｍ尿素を含有する５％ポリアクリルアミドゲル
（ＰＡＡＧ）中または標準１％アガロース・ゲル（ＰａｇｒａｔｉｓおよびＲｅ
ｖｅｌ、１９９０年）中のいずれかでの電気泳動により決定した。

【００７６】 ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ合成のアッセイ 実施例１に記載されたとおりに調製したＰ２タンパク質の複製活性のアッセイ
は、通常５０ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ８．９、８０ｍＭ 酢酸アンモニウム（
ＮＨ_４ＯＡｃ）、６％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ
ＭｎＣｌ_２、２ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、各１ｍＭ のＡＴＰお
よびＧＴＰ、各０．２ｍＭのＣＴＰおよびＵＴＰ（４種ヌクレオチド三リン酸は
全てＰｈａｒｍａｃｉａ社から入手）、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（ヌクレアー
ゼフリー、ＮＥＢ社）、および０．８ｕ／μｌ ＲＮａｓｉｎを含有する１０μ
ｌ反応混合物中で行った。添加したＲＮＡ基質の最終濃度は、４０μｇ／ｍｌか
ら３００μｇ／ｍｌの範囲であった。別に指示しない限り、該混合物に、０．２
５〜０．５ｍＣｉ／ｍｌの［α^３２Ｐ］ＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、３０００
Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を加えた。反応は０．２〜２μｌのＰ２タンパク質標品の添加
により開始した。コントロール反応（「緩衝剤のみ」）では、Ｐ２を等容量のＰ
２緩衝液（５０ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、９０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１
ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）に換えた。この混合物を２８℃で
１時間インキュベートし、次の分析のために処理した。この試験におけるＲＮＡ
分析には、２つのタイプのアガロース・ゲル電気泳動（両方ともＰａｇｒａｔｉ
ｓおよびＲｅｖｅｌ（１９９０年）により最初に記載された）を使用した。ポジ
ティブセンスｓｓＲＮＡおよび対応するｄｓＲＮＡセグメントを分離するために
用いられる第１のすなわち標準的タイプの電気泳動は、０．２５μｇ／ｍｌのＥ
ｔＢｒを含み、１×ＴＢＥ（５０ｍＭトリス−ホウ酸塩、ｐＨ８．３、１ｍＭ
ＥＤＴＡ）で緩衝化された１％アガロース・ゲル中で実施された。Ｐ２重合生成
物の分析のために、反応を等容量のＵ２緩衝液（８Ｍ尿素、１０ｍＭ ＥＤＴＡ
、０．２％ＳＤＳ、６％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０５％ブロモフェノール
ブルーおよび０．０５％キシレンシアノールＦＦ）の加えて停止させた。ＲＮＡ
を分離（５Ｖ／ｃｍ）したのち、ゲルをＵＶ光で照射して撮影した。放射活性標
識バンドの位置を決めるために、ゲルを乾燥してフジスーパーＲＸフィルムに曝
露した。図２および図５は、標準的電気泳動で分析したＰ２触媒ＲＮＡ複製の典
型的な結果を示す。

【００７７】 第２の方法は鎖分離ゲル分析であった。この場合、電気泳動は１×ＴＢＥで緩
衝化されＥｔＢｒを含まない１％アガロース・ゲル中で実施された。分析用のサ
ンプルは、Ｐ２反応混合物を４倍容量の１００ｍＭ ＥＤＴＡで反応を停止させ
、フェノール／クロロホルム（１：１）ついでクロロホルムで抽出することによ
り調製した。水相をＮＨ_４ＯＡｃ２．５Ｍとし、２．５倍容量のエタノールで沈
殿させた。ペレットを無菌水で２倍希釈したＵ２緩衝液に溶解した。適当な時期
に、サンプルを３分間煮沸して、さらに３分間氷上に置いた。ＲＮＡ分離後（５
Ｖ／ｃｍ）、ゲルをＥｔＢｒで染色し、標準ゲルに関して指示されたとおり処理
した。鎖分離分析は、新たに合成されたＲＮＡ生成物の性質を明らかにするため
に用いられた。加熱処理をしないと、前の実験で見出されたように、ｍ^＋テンプ
レート上でのＰ２触媒反応の放射活性生成物は鎖分離ゲル中で２本鎖Ｍセグメン
トの位置に移動した（図３（Ａ）および３（Ｂ））。しかし、熱変性ステップ後
の生成物の易動度は、Ｍセグメントのマイナス鎖（ｍ⁻）の易動度に変化する。
したがって我々は、Ｐ２タンパク質が投入したプラス鎖テンプレートに相補的な
マイナス鎖の合成、すなわち複製反応を触媒すると結論した。

【００７８】 ＲＮａｓｅ保護活性 次の実験で、我々は、ＲＮＡ基質と新たに合成された鎖の２本鎖がｄｓＲＮＡ
分子の性質を有しているかどうかを調べた。その実験は、大腸菌のＲＮａｓｅが
、１本鎖および部分的に２本鎖のＲＮＡを容易に加水分解するが、完全ＲＮＡ２
本鎖は加水分解しないという事実（Ｂｒｅｗｅｒら、１９９２年）に基づく。Ｒ
Ｎａｓｅ保護アッセイは、１０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ
ＮＨ_４ＯＡｃ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１単位のＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ ＯＮＥ
；Ｐｒｏｍｅｇａ社）、Ｐ２ポリメラーゼ・アッセイ混合物からフェノール／ク
ロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製したＲＮＡサンプル、を含有す
る１０μｌ反応混合物中で実施した。反応は２８℃で１時間実施し、０．１％Ｓ
ＤＳおよび１０μｇの大腸菌ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ社）の添加により停止させた
。反応生成物をアガロース・ゲル中、標準的電気泳動により分析した。図３（Ｃ
）に示される結果から明らかなように、複製生成物（ｍ^＋とｍ⁻の２本鎖）はＲ
Ｎａｓｅ消化にほぼ完全に耐えたが、ＲＮＡ基質（ｍ^＋）は同一の条件下で完全
に分解された。したがって、複製生成物は、相補的ｍ^＋鎖とｍ⁻鎖から成る完全
２本鎖ＲＮＡであることが示された。

【００７９】 分析ゲルろ過 ＲＮＡ合成活性とＰ２タンパク質の直接的関連は、非変性ゲルろ過を用いて示
された。クロマトグラフィは、室温で５０ｍＭ トリスＨＣｌ、１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌおよび０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する緩衝液を用い、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ
７５ＨＲ １０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）上０．５ｍｌ／分の流
速で実施された。精製マウスＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ社）および大豆トリプシン阻害
剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）以外のキャリブレーション用タンパク質とブルー
・デキストランはＳｉｇｍａ社から入手した。典型的には、２００μｇの精製Ｐ
２をカラムに注入し、０．５ｍｌづつのフラクションを採集した。各フラクショ
ンから１マイクロリットルづつとり、上記のｍ^＋ＲＮＡ基質を用いてレプリカー
ゼ活性をアッセイした。その結果、Ｐ２は見かけ上４５ｋＤａの分子質量を有し
単一ピークとして移動することが判ったが（図４）、一方、Ｐ２の実際の分子量
は７５ｋＤａである。この相違はタンパク質の分解によるということでは説明で
きなかった（図１および図４（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ参照）。ゲルろ過マトリ
ックス（セファデックス）に対するタンパク質の相互作用の可能性という解釈も
成り立ちがたいように思われた。というのは、同様に見かけ上低分子量の物が、
異なるカラム（Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ５００、Ｗａｔｅｒｓ社、示さず）
でも得られたからである。したがって、このタンパク質は、溶液中で極めてコン
パクトな球形モノマーであることを提案するのが妥当である。この結論は、さら
に予備的光散乱データ（Ｒ．Ｔｕｍａ、未発表結果）により確認された。ポリメ
ラーゼ活性は、タンパク質ピーク中にのみ見出され、したがってＰ２は、それ自
体がＲＮＡポリメラーゼ活性を有し、その活性はＰ２モノマーと関連することが
示された。

【００８０】 Ｐ２開始部位および伸長速度 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰ２による複製の開始と伸長の性質を明らかにするため
にさらにいくつかの方法が使用された。 （ａ）プライマー伸長アッセイ（図７）は、少なくとも完全長ｓ^＋セグメント
の場合、精製Ｐ２はインビボでの実際のφ６複製のようにテンプレートのまさし
く３’末端ヌクレオチドから複製を開始することを示した。このアッセイは、５
０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ _２ 、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ スペルミジン、各０．６ｍＭの４種のデオ
キシヌクレオチド三リン酸、および５単位のＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ
社）を含有する１０μｌ反応混合物中で実施した。反応液は、プライマーとして
末端をポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）および［γ^３２Ｐ］ＡＴ
Ｐ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で標識された０．５ｐｍｏ
ｌのオリゴヌクレオチド（５’−ＧＧＡＴＡＡＡＣＡＡＧＴＣＣＴＴＧＴＡＴＡ
ＡＣ−３’）（配列番号４）を含有した。このプライマーは小型のφ６ゲノム・
セグメントのマイナス鎖に相補的になるようにデザインした。アッセイのための
変性ＲＮＡは以下のとおり調製した：Ｐ２ポリメラーゼまたはＰ２コントロール
緩衝液を含み標識ヌクレオチドを含まない標準１０μｌ複製混合物をフェノール
／クロロホルム（１：１）およびクロロホルムで抽出し、ＮＨ_４ＯＡで２．５Ｍ
にし、エタノールで沈殿させた。ＲＮＡペレットを無菌水に溶解し、１００℃で
３分間加熱し、さらに３分間氷上で冷却し、室温に移した。ＲＮＡサンプルをア
ッセイ成分の残りと混合し、この混合物を４２℃で１０分間インキュベートした
。７．５μｌの９５％ ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ブロ
モフェノールブルーおよび０．０５％ キシレンシアノールＦＦの添加により反
応を中止した。停止混合物を次に８０℃で５分間インキュベートし、７．５Ｍ
尿素を含有する６％ＰＡＡＧ中で分析した。

【００８１】 （ｂ）複製中のＰ２ポリメラーゼの伸長速度を決定するために、動力学実験を
設計した。天然のφ６転写体の複製を、Ｐ２タンパク質を混合物に加えることに
より開始し、一定量を異なる時点でサンプル採取して電気泳動分析した。図６（
Ａ）に示されるオートラジオグラムから明らかなようにまず完全長Ｓ生成物が短
い遅滞時間の後に現れ、次に続いてＭとＬが現れた。そしてバンド強度は、少な
くとも１時間（３６００秒）の時点まで増加した。個々のｄｓＲＮＡの時間内蓄
積もまた、経時曲線としてプロットした（図６（Ｂ）〜（Ｄ））。曲線の直線部
を時間軸に対して外挿すると、各２本鎖生成物の完全合成に必要な特性時間が得
られる。３種すべてのｓｓＲＮＡに対して等しい開始が起こると仮定して、平均
伸長速度（Ｖ_ａｖ）は以下のように計算できる： Ｖ_ａｖ＝［（Ｌ−Ｍ）／（τ_Ｌ−τ_Ｍ）＋（Ｍ−Ｓ）／（τ_Ｍ−τ_Ｓ）＋（Ｌ
−Ｓ）（τ_Ｌ−τ_Ｓ）］／３、 式中Ｌ、ＭおよびＳは、対応するセグメントの長さである（Ｓ＝２９４８ｂｐ
、Ｍ＝４０６３ｂｐおよびＬ＝６３７４ｂｐ；ＭｃＧｒａｗら、１９８６年；Ｇ
ｏｔｔｌｉｅｂら、１９８８年；Ｍｉｎｄｉｃｈら、１９８８年）；τ_Ｌ、τ_Ｍ およびτ_Ｓは、観測された特性時間である（図６（Ｂ）〜（Ｄ））。その結果、
試験条件下でのＰ２の伸長速度は、およそ１２０ｂｐ／秒であった。

【００８２】 実施例３ ｄｓＲＮＡ基質、ｓｓＤＮＡ基質およびｄｓＤＮＡ基質でプログラム化された
反応混合物におけるＲＮＡ合成 核酸調製物 精製ｄｓＲＮＡウィルス（バクテリオファージφ６、ＢＴＶ、ＣＰＶ、Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅウィルス Ｌ−Ａ）から２本鎖Ｒ
ＮＡ基質をフェノール−クロロホルム抽出により調製した。ＲＮＡをエタノール
で沈殿させて、無菌水に溶解した。ＢＴＶおよびＣＰＶの場合、細心の注意を払
ってＲＮＡ調製物が感染ウィルス粒子を含んでいないことを確かめた。短い線状
１本鎖ＤＮＡ基質（デオキシリボオリゴヌクレオチド）を化学合成により調製し
た。具体的に、以下のオリゴヌクレオチドを本実施例で用いた； ５’−ＣＧＴＴＣＡＧＴＴＣＴＣＡＧＴＴＣＴ−３’（配列番号５）； ５’−ＧＧＴＡＡＧＣＧＣＣＡＴＡＴＧＣＣＧＡＧＧＡＧＡ−３’（配列番号
６）；および ５’−ＣＴＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＴＣＣＧＡ
ＣＣＧＴＡＧ−３’（配列番号７）。

【００８３】 制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｆＩにより線状化された組換えバクテリオファ
ージＭ１３（Ｍ１３ｍｐ１０、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）の長いｓｓＤＮＡもＲＮＡ
合成の基質として用いた。線状ｄｓＤＮＡ基質は、種々の制限エンドヌクレアー
ゼ類：ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、Ｓａ
ｃＩ、ＳｍａＩおよびＸｂａＩによりプラスミドｐＵＣ１８の環状ＤＮＡを切断
することにより調製した。制限酵素によるインキュベーション後は、常にフェノ
ール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行った。ｄｓＲＮＡおよびＤＮ
Ａ双方の濃度は、２６０ｎｍの光学密度により測定した。核酸標品の品質は、１
％ アガロース・ゲル（ＰａｇｒａｔｉｓおよびＲｅｖｅｌ、１９９０年）中ま
たは７．５Ｍ 尿素を含有するポリアクリルアミドゲル中の電気泳動により決定
した。

【００８４】 ＲＮＡ合成アッセイ 本アッセイは、４０〜３００μｇ／ｍｌのｄｓＲＮＡ、または４０〜１００μ
ｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ、または１００μｇ／ｍｌのｄｓＤＮＡ基質をｓｓＲＮＡ
の代わりに反応混合物に加えた以外は基本的に実施例２に記載されたとおり実施
された。核酸基質、Ｐ２ポリメラーゼおよび全ての必要な添加物を含有する混合
物を典型的には２８℃で１時間インキュベートし、反応生成物を実施例２に記載
されるとおり行われた通常ゲル（図８、図９（Ａ）、図１０）または鎖分離ゲル
（図９（Ｂ））のいずれかの電気泳動により分析した。電気泳動後、ゲルを乾燥
し、フジスーパーＲＸフィルムに曝した。Ｐ２ポリメラーゼは、種々のｄｓＲＮ
Ａテンプレートの存在下ＲＮＡを合成する（図８）。特に、プラスセンスＲＮＡ
鎖が、φ６ ｄｓＲＮＡ上ＲＮＡ合成の主生成物である（図９）。これは、イン
ビボでのφ６転写状況を想起させる。Ｐ２ポリメラーゼ存在下でバクテリオファ
ージＭ１３の線状ｓｓＤＮＡをインキュベートすると（図１０（Ａ）、レーンＮ
）、対応するサイズ（約７ｋｂ）の２本鎖核酸種として移動する反応生成物を生
じる。標識生成物は、Ｐ２を含まないコントロール反応（図１０（Ａ）、レーン
Ｎ）、または４種のヌクレオシド三リン酸の混合物の代わりにＵＴＰのみを含む
反応では現れない（示さず）。これらのデータは生成物がテンプレートＤＮＡと
新たに合成されたＲＮＡ鎖の２本鎖として生じていることを強く示唆する。同様
にまた、反応混合物が短い合成デオキシリボオリゴヌクレオチドでプログラムさ
れた場合、標識ＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖の形成が生じることも示された（示さず）
。したがって、ｓｓＤＮＡテンプレート上のＰ２触媒ＲＮＡ合成はｓｓＲＮＡテ
ンプレートによる反応と似ている確率が高い。Ｐ２と幾つかの線状ｄｓＤＮＡテ
ンプレートをインキュベートすると、投入ｄｓＤＮＡとして移動する標識核酸体
が現れる（図１０（Ｂ））。特に、ＲＮＡ合成の効率はｄｓＤＮＡ末端の性質に
依存する。ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳｍａＩまたは
ＸｂａＩにより切断されたｐＵＣ１８ＤＮＡは標識ヌクレオチドの検出可能な取
込みを促進したが、ＨｉｎＩＩまたはＫｐｎＩで切断された同じＤＮＡは促進し
なかった。標識生成物は、Ｐ２のないコントロール反応、または４種のヌクレオ
シド三リン酸混合物の代わりにＵＴＰのみを含む反応では検出されなかった。ｄ
ｓＤＮＡテンプレート上の反応がｄｓＲＮＡ転写と似ていることが提起できる。

【００８５】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 大腸菌細胞中で作られた組換えＰ２の精製を示す図である。Ｐ２発現は、実施
例１に記載されるように１５℃で１８時間実施された。（Ａ）クーマシー・ブル
ーＧ−２５０で染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。レーン：ＩＰＴＧによるＰ２
合成の誘導前（１）および誘導後（２）の細菌細胞ＢＬ２１（ＤＥ３／ｐＥＭ２
）の蛋白組成；透明な細胞溶解物（３）；シバクロン・ブルー・アガロースで精
製後のサンプル（４）、ヘパリン・アガロースで精製後（５）、およびリソース
Ｑカラムで精製後（６）。野生型φ６のタンパク質は右側に記される。（Ｂ）全
φ６ポリメラーゼ複合体（タンパク質Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４、およびＰ７）に対して
作製された抗体を用いた同一タンパク質サンプルの免疫ブロット分析。レーン指
定は、（Ａ）のとおりである。

【図２】 ｓｓＲＮＡテンプレート存在下、組換えＰ２触媒ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ合
成を示す図である。φ６ファージの合成１本鎖ポジティブセンスｍセグメント（
ｍ^＋ＲＮＡ；１００μｇ／ｍｌ）を含有する（レーン８を除いて）標準的１０μ
ｌポリメラーゼ・アッセイ混合物からとった一定量のアガロース・ゲル分析。重
要な添加物は、枠の下に示してある。Ｐ２は、精製Ｐ２タンパク質を言う（図１
のレーン６）。Ｐ２−ＣＢＡは、シバクロン・ブルー・アガロース・カラム後の
部分精製Ｐ２（図１、レーン４）であり、ｍｏｃｋＣＢＡは、ｐＥＴ３２ｂ（＋
）プラスミド含有ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞からＩＰＴＧ誘導され、同様に調製さ
れたタンパク質のフラクションである。ヌクレオカプシド転写で生成した標識φ
６セグメント（Ｎ）の位置を左レーンに示す。２本鎖セグメントは、大文字（Ｌ
、ＭおよびＳ）で印し、プラスセンス１本鎖セグメントを小文字（ｌ^＋、ｍ^＋お
よびｓ^＋）で示す。（Ａ）ＥｔＢｒ染色ゲル；（Ｂ）同じゲルのオートラジオグ
ラム。

【図３】 ＲＮＡ合成の生成物がテンプレートおよび相補的に新たに生成した鎖により形
成されたｄｓＲＮＡであることを示す図である。ｍ^＋ＲＮＡ複製アッセイの生成
物は鎖分離ゲルで分析された。ｐと印したレーンはアッセイ中にＰ２タンパク質
を含んでいた（図２のレーン４と同じ条件）；ｂと印したものは、同量のＰ２コ
ントロール緩衝剤を入れたものである（図２のレーン２と同じ）。Ｎと印したレ
ーンは、ヌクレオカプシド転写でつくられた標識φ６セグメントを含む。２本鎖
ＲＮＡセグメントを熱変性（煮沸）して個々のプラス（ｌ^＋、ｍ^＋およびｓ^＋）
およびマイナス（１⁻、ｍ⁻およびｓ⁻）ＲＮＡが得られた。煮沸ステップを省
略すると（非煮沸）鎖分離は生じなかった。パネル（Ａ）はＥｔＢｒ染色ゲルで
あり；（Ｂ）は同じゲルのオートラジオグラムである。（Ｃ）はＲＮａｓｅ保護
アッセイである。［α^３２Ｐ］ＵＭＰ標識ｍ^＋ＲＮＡテンプレートと非標識ヌク
レオチド三リン酸を含みＰ２を含む複製混合物から精製した反応生成物（ｐ）ま
たはＰ２を含まないコントロールの複製混合物（ｂ）から精製した反応生成物を
、ＲＮａｓｅＩ添加（＋ＲＮａｓｅ）または無添加（−ＲＮａｓｅ）でインキュ
ベートし、標準アガロース・ゲル中で分析した。

【図４】 レプリカーゼ活性がＰ２モノマーに関連することを示す図である。精製Ｐ２を
、スーパーデックス７５ゲルろ過カラムで分析し、採取したフラクションでレプ
リカーゼ活性を測定した。レプリカーゼ活性のピークは、Ｐ２タンパク質ピーク
と一致する。（Ａ）カラム溶出液の吸光度（２８０ｎｍ）プロフィール。矢印は
、Ｐ２注入時間（注入）および分子質量標品、すなわちＢＤはブルー・デキスト
ラン（２０００ｋＤａ）；βＡｍはβ−アミラーゼ（２００ｋＤａ）；ＩｇＧは
マウス免疫グロブリンＧ（１５０ｋＤａ）；ＢＳＡはウシ血清アルブミン（６７
ｋＤａ）；ＯＡはオボアルブミン（４５ｋＤａ）；ＳＴＩは大豆トリプシン阻害
剤（２０．１ｋＤａ）；αＬＡはα−ラクトアルブミン（１４．２ｋＤａ）の位
置を示す。挿入図はフラクション９から２２中の蛋白含量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分
析図。（Ｂ）フラクション１から２９中のレプリカーゼ活性を示すアガロース・
ゲルのオートラジオグラム。レーンＮは、図２に定義されるとおりである。

【図５】 Ｐ２が非特異的にｓｓＲＮＡ基質を複製することを示す図である。（Ａ）精製
Ｐ２タンパク質を含有する反応の複製生成物（ｐ）またはコントロール緩衝剤を
含有する反応の複製生成物（ｂ）を示すＥｔＢｒ染色ゲル。プログラム反応に使
用される１本鎖ＲＮＡ基質は以下のとおりであった。１、ｌ^＋ＲＮＡ（ＸｂａＩ
およびマングビーン・ヌクレアーゼ（ＭＢＮ）で処理されたｐＬＭ６８７のＴ７
転写により生成したφ６ファージの合成ポジティブセンス大型セグメント）；２
、ｍ^＋ＲＮＡ（中型セグメント、図２と同じ）；３、ｓ^＋ＲＮＡ（小型セグメン
ト；ＸｂａＩおよびＭＢＮで処理されたｐＬＭ６５９のＴ７転写体）；４、短い
ｓ^＋ＲＮＡ（Ｅｃｏ４７１１１で切断されたｐＬＭ６５９のＴ７転写体）；５、
伸長ｓ^＋ＲＮＡ（ＳｍａＩで切断されたｐＬＭ６５９のＴ７転写体）；６、伸長
ｓ^＋ＲＮＡ（ＥｃｏＲＩで切断されたｐＬＭ６５９のＴ７転写体）；７、ｓ^＋、
ｍ^＋およびｌ^＋融合セグメント（ＸｂａＩおよびＭＢＮで処理されたｐＬＭ１８
０９のＴ７転写体）を含む１３．５ｋｂ長ＲＮＡ；８、φ６ヌクレオカプシドに
よる転写から精製された天然ｓ^＋、ｍ^＋およびｌ^＋セグメントの混合物；９、バ
クテリオファージＴ７の全ＤＮＡのＴ７転写により生成したＲＮＡ混合物；１０
、ホタル・ルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＳｔｕＩで切断されたｐＧＥＭｌｕｃのＳ
Ｐ６転写体）；１１、コリファージＭＳ２のゲノムＲＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ社）；１２、ブルータング・ウィルス、株１（ＢＴＶ１）、ＢＴＶ１ヌクレオ
カプシド転写からＬｉＣｌ沈殿させたｓｓＲＮＡセグメントの混合物。ヌクレオ
カプシド転写されたφ６セグメント（Ｎ）は、左側に印される。ＢＴＶ１のビリ
オンからフェノール抽出された１０種のゲノムｄｓＲＮＡセグメント類の位置を
右側（Ｂ１〜Ｂ１０）に示す。（Ｂ）同一ゲルのオートラジオグラム。

【図６】 Ｐ２による複製の経時を示す図である。（Ａ）３種の天然ポジティブセンス・
セグメントを用いた１００μｌ複製混合物をＰ２タンパク質存在下、２８℃でイ
ンキュベーションした。示された時点でサンプリングした５μｌの一定分割量を
、標準的アガロース・ゲル中で分析し、オートラジオグラフ化した。レーンＮは
、図２のとおりである（Ｂ、ＣおよびＤ）。複製生成物Ｌ、ＭおよびＳそれぞれ
の時間依存的蓄積のホスホイメージャー（Ｆｕｊｉ ＢＡＳ １５００）分析。
各枠内の最も高い観測値を１００％に設定するようにグラフを標準化する。Ｂ、
ＣならびにＤの挿入図は、最初の３００秒の経時を示す。線は、時間軸に対する
プロットの直線部分を外挿する。τ_Ｌ、τ_Ｍおよびτ_Ｓは、関連する完全長のｄ
ｓＲＮＡセグメントが出現する前の遅滞時間(ラグタイム)を示す。

【図７】 図７は、Ｐ２が、ｓｓＲＮＡテンプレートのまさしく３’−末端ヌクレオチド
から複製を開始することを示す図である。天然のｓｓＲＮＡセグメントｓ^＋、ｍ ^＋ およびｌ^＋の混合物とＰ２タンパク質を含有する複製反応のＲＮＡ生成物（ｐ
）または緩衝液を含有する複製反応のＲＮＡ生成物（ｂ）は、小型φ６セグメン
トのマイナス鎖（ｓ）に相補的な標識プライマーを用いるプライマー伸長実験で
アッセイされた。コントロールとして、プライマー伸長はまた、野生型φ６から
抽出された熱変性ｄｓＲＮＡゲノム（ｄ）上でも行われた。ジデオキシヌクレオ
チド終止配列決定レーン（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）は四角で囲んである。それらは
ｓ^＋セグメントのクローン化ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＬＭ６５９を用い
て同じプライマーおよびＴ７シークエナーゼ２．０（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）によ
り作製した。配列読取りを左側に示す。ｓ^＋の３’−末端「Ｔ」は、矢印で示さ
れ、図５に述べられた特有の制限部位には下線が引かれている。

【図８】 Ｐ２ポリメラーゼがｄｓＲＮＡテンプレートの存在下、ＲＮＡ合成（転写）を
触媒することを示す図である。ＥｔＢｒ染色ゲル（Ａ）および同一ゲルのオート
ラジオグラム（Ｂ）は、精製Ｐ２タンパク質を含有する反応生成物（ｐ）または
コントロール緩衝剤を含有する反応生成物（ｂ）を示す。２本鎖ＲＮＡ基質は次
のとおりであった。φ６はバクテリオファージφ６から抽出されたゲノムｄｓＲ
ＮＡセグメントの混合物；Ｌ−ＡはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅウィルスＬ−ＡのゲノムｄｓＲＮＡ；ＢＴＶ１はブルータング・ウィル
ス、株１のゲノムｄｓＲＮＡセグメントの混合物。φ６のＬ、ＭおよびＳセグメ
ントの位置を左側レーンに示し、１０種のＢＴＶＩセグメント（Ｂ１〜Ｂ１０）
の位置は右側に示す。

【図９】 φ６特異的ｄｓＲＮＡ基質のＰ２触媒転写が、主にプラスセンスＲＮＡ鎖合成
の結果となることを示す図である。（Ａ）２種のｓｓＲＮＡ基質および２種のｄ
ｓＲＮＡ基質を、別個の精製Ｐ２を含む反応混合物（ｐ）またはコントロール緩
衝剤を含有する反応混合物（ｂ）中２８℃にインキュベートした。１時間の時点
で混合物から一定量を取り出して標準アガロース・ゲル中で分析した。１本鎖Ｒ
ＮＡ類は以下のとおりであった：φ６ｓｓはφ６ヌクレオカプシドによる転写か
ら精製された天然ｓ^＋、ｍ^＋およびｌ^＋セグメントの混合物；ｍ^＋はｍ^＋ＲＮＡ
。２本鎖ＲＮＡ類：φ６ｄｓはバクテリオファージφ６から抽出された３種のゲ
ノム・セグメントの混合物；ＭはＰ２によるｓｓＲＮＡ ｍ^＋の複製に続いて、
新たに形成されたｄｓＲＮＡを標準アガロース・ゲル電気泳動を用いて精製する
ことにより調製された合成Ｍセグメント。レーンＮは図２に定義されたとおりで
ある。（Ｂ）（Ａ）に記載されたＰ２存在下で調製され、ゲル分析前に熱処理さ
れた反応生成物の鎖分離電気泳動。

【図１０】 Ｐ２ポリメラーゼがＤＮＡテンプレートの存在下でＲＮＡ合成を触媒すること
を示す図である。（Ａ）Ｈｉｎｆｌで切断されたＭ１３ｍｐ１０のｓｓＤＮＡを
、実施例３に記載されたとおりＰ２ポリメラーゼと共に（１）または無しで（２
）インキュベーションした。Ｎは図２におけるようなマーカー・レーンである。
（Ｂ）種々の制限エンドヌクレアーゼで切断されたｐＵＣ１８のｄｓＤＮＡ類：
１、ＨｉｎｃＩＩ；２、ＳｍａＩ；３、ＫｐｎＩ；４、ＰｓｔＩ；５、ＳａｃＩ
；６、ＢａｍＨＩ；７、ＨｉｎｄＩＩＩ；８、ＸｂａＩをＰ２ポリメラーゼと共
にインキュベーションし、実施例３の記載のとおり分析した。レーン９は、Ｘｂ
ａＩで切断されたｐＵＣ１８をＰ２無しの反応混合物中でインキュベーションし
た結果である。

【図１１】 ヌクレオチド類縁体が新たに生成したＲＮＡへ取込まれたことを示す図である
。標準Ｐ２複製混合物に、（Ａ）２５μＭのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標
）４８８−５−ＵＴＰ；（Ｂ）２５μＭのクマリン−５−ＣＴＰ；または（Ｃ）
１００μＭビオチン−１１−ＣＴＰを補足した。これらヌクレオチド類縁体の各
々について、３つの別個の反応が、（Ｐ）Ｐ２ポリメラーゼ（４０μｇ／ｍｌ）
を含むがＲＮＡは含まない；（Ｒ）ｍ^＋ｓｓＲＮＡテンプレート（７５μｇ／ｍ
ｌ；ＭａｋｅｙｅｖおよびＢａｍｆｏｒｄ（２０００）ＥＭＢＯ Ｊ．、１９、
６２７５〜６２８４）を含むがポリメラーゼは含まない；（ＰＲ）Ｐ２ポリメラ
ーゼおよびｓｓＲＮＡテンプレートの双方を含む；ように実施された。３０℃で
１時間インキュベーション後、反応液をゲルろ過カラムを通し、流出(flow-thro
ugh)フラクション（ＲＮＡ反応生成物を含む）をさらなる分析のために用いた。
精製フラクションの蛍光発光スペクトルは、固定励起波長の４９０ｎｍ（Ａ）；
４０２ｎｍ（Ｂ）で記録された。（Ｃ）ビオチン−ストレプタビジン・ドット−
ブロット・アッセイ。手短に言えば、流出フラクションからの一定量を、ハイボ
ンドＮ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）にスポットし、ストレプタビジン−
ＨＲＰ複合体（ＮＥＮ）で染色し、続いてＥＣＬ検出法（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社のキット、イスラエル国）を行った。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｐ 19/34 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA10 CA01 GA11 HA12 HA19 4B050 CC01 CC03 DD20 EE10 FF01C FF11C FF14C LL05 4B063 QA13 QQ52 QR08 QR32 QR35 QR42 QR62 QS25 QX01 4B064 AF27 CA21 CB30 CC24 CD12 DA13 4B065 AA98Y AB01 AC14 BA02 BD01 BD15 CA23 CA29 CA46

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 十分な条件下で核酸基質と接触させた場合、ｉｎ ｖｉｔｒ
   ｏで非特異的にＲＮＡ合成を行う能力を有する単離されたポリメラーゼタンパク
   質。
2. 【請求項２】 タンパク質が、ｄｓＲＮＡウィルスに由来する、請求項１に
   記載のタンパク質。
3. 【請求項３】 タンパク質が、Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅウィルス、Ｒｅｏ
   ｖｉｒｉｄａｅウィルス、ＢｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅウィルスまたはＴｏｔｉｖ
   ｉｒｉｄａｅウィルスに由来し、好ましくはφ６、φ７、φ８、φ９、φ１０、
   φ１１、φ１２、φ１３またはφ１４などのＣｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ科のφ６
   関連バクテリオファージ群に由来する、請求項１または２に記載のタンパク質。
4. 【請求項４】 タンパク質が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ
   のバクテリオファージであるφ６のＰ２タンパク質であるか、或いはＰ２の改変
   体または遺伝的に改変されたものである、請求項１から３のいずれか一項に記載
   のタンパク質。
5. 【請求項５】 （ａ）少なくとも配列番号１の部分的核酸配列を有する核酸
   配列； （ｂ）少なくとも配列番号８の部分的アミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
   ードする核酸配列； （ｃ）遺伝子コードの縮退により（ａ）または（ｂ）の核酸配列とは異なる核
   酸配列； （ｄ）（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の核酸配列にハイブリダイズする
   核酸配列；および （ｅ）（ｂ）の配列に対して少なくとも２０％同一性、好ましくは少なくとも
   ５０％同一性を示すアミノ酸配列をコードする核酸配列 からなる群から選択される核酸配列によりコードされる、請求項１から４のい
   ずれか一項に記載のタンパク質。
6. 【請求項６】 請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質をコード
   する核酸配列を含むベクター。
7. 【請求項７】 請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質をコード
   する核酸配列または請求項６に記載のベクターを含む宿主細胞。
8. 【請求項８】 （ａ）請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質を
   コードする核酸配列を含む宿主細胞をインキュベーションしてタンパク質を発現
   させるステップ； （ｂ）宿主または培地からタンパク質を回収するステップ； （ｃ）タンパク質を精製するステップ；および、場合によっては （ｄ）そのタンパク質のＲＮＡ合成活性をアッセイするステップ を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質を製造する方法。
9. 【請求項９】 請求項８に記載のタンパク質を単離して精製する方法であっ
   て、該方法が： （ａ）緩衝液中で宿主細胞を破壊して細胞溶解物を得るステップ； （ｂ）その溶解物を遠心分離により清澄化するステップ； （ｃ）少なくとも１回、より好ましくは２回のアフィニティー・クロマトグラ
   フィを用いてタンパク質を精製するステップ； （ｄ）少なくとも１ステップのイオン交換クロマトグラフィを用いてタンパク
   質をさらに精製して本質的にヌクレアーゼ活性およびプロテアーゼ活性のないフ
   ラクションを得るステップ を含む請求項８に記載のタンパク質を単離、精製する方法。
10. 【請求項１０】 （ａ）ｓｓＲＮＡ基質を用意するステップ； （ｂ）そのｓｓＲＮＡ基質を、ＲＮＡ合成に十分な条件下で請求項１から５の
    いずれか一項に記載のタンパク質と接触させるステップ；および （ｃ）反応混合物から新たにつくられたＲＮＡ種を回収するステップ を含むｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを製造する方法。
11. 【請求項１１】 新たにつくられたそのＲＮＡ種がｄｓＲＮＡである、請求
    項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 （ａ）ｄｓＲＮＡ基質を用意するステップ； （ｂ）そのｄｓＲＮＡ基質を、ＲＮＡ合成に十分な条件下で請求項１から５の
    いずれか一項に記載のタンパク質と接触させるステップ；および （ｃ）反応混合物から新たにつくられたＲＮＡ種を回収するステップ を含むｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを製造する方法。
13. 【請求項１３】 （ａ）ＲＮＡ基質を用意するステップ； （ｂ）そのＲＮＡ基質を、ＲＮＡ複製およびＲＮＡ転写の双方に十分な条件下
    で請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質と接触させるステップ；お
    よび （ｃ）反応混合物から新たにつくれられた増幅ＲＮＡの混合物を回収するステ
    ップ を含むｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを増幅させる方法。
14. 【請求項１４】 （ａ）ｓｓＲＮＡ基質を用意するステップ； （ｂ）そのｓｓＲＮＡ基質を、請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパ
    ク質により複製してｄｓＲＮＡを形成するステップ； （ｃ）そのｄｓＲＮＡを、請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質
    により転写してｓｓＲＮＡを得るステップ；および （ｄ）ＲＮＡ合成生成物の十分な量が得られるまで増幅ステップを反復するス
    テップ を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 （ａ）ＤＮＡテンプレートをＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
    ゼにより転写することにより、ｓｓＲＮＡ基質を用意するステップ；および （ｂ）そのｓｓＲＮＡ基質を請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク
    質により複製してｄｓＲＮＡを形成するステップ を含むｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを製造する方法。
16. 【請求項１６】 （ａ）ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼによりＤＮＡテンプ
    レートを転写することによりｓｓＲＮＡ基質を用意するステップ； （ｂ）そのｓｓＲＮＡ基質を請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク
    質により複製してｄｓＲＮＡを形成するステップ； （ｃ）そのｄｓＲＮＡを請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質に
    より転写してｓｓＲＮＡを得るステップ；および （ｄ）ＲＮＡ合成産物の十分な量が得られるまで増幅ステップを反復するステ
    ップ を含むｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを増幅する方法。
17. 【請求項１７】 そのＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼが、バクテリオファー
    ジ、好ましくはＴ７、Ｔ３、およびＳＰ６バクテリオファージを含む群から選択
    されるバクテリオファージ由来である、請求項１５または１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 ステップ（ａ）および（ｂ）が、同じ反応容器内で同時に
    または連続して実施される、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 【請求項１９】 （ａ）１本鎖核酸基質を用意するステップ； （ｂ）その１本鎖核酸基質を、ＲＮＡ合成に十分な条件下で請求項１から５の
    いずれか一項に記載のタンパク質と接触させて少なくとも１本鎖核酸基質の一部
    を２本鎖核酸体に変換するステップ； （ｃ）反応混合物から全核酸を回収するステップ；および、場合によっては （ｄ）その全核酸を、２本鎖核酸ではなく１本鎖核酸を選択的に分解するヌク
    レアーゼを含む製剤と接触させるステップ；および （ｅ）ヌクレアーゼによる分解に対して安定性が増加した２本鎖核酸を回収す
    るステップ を含む核酸を安定化する方法。
20. 【請求項２０】 （ａ）ｓｓＤＮＡ基質を用意するステップ； （ｂ）そのｓｓＤＮＡ基質を、ＲＮＡ合成に十分な条件下で請求項１から５の
    いずれか一項に記載のタンパク質と接触させるステップ；および （ｃ）反応混合物から新たに生成した核酸種を回収するステップ を含むｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを製造する方法。
21. 【請求項２１】 （ａ）ｄｓＤＮＡ基質を用意するステップ； （ｂ）そのｄｓＤＮＡ基質を、ＲＮＡ合成に十分な条件下で請求項１から５の
    いずれか一項に記載のタンパク質と接触させるステップ；および （ｃ）反応混合物から新たに生成した核酸種を回収するステップ を含むｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを製造する方法。
22. 【請求項２２】 新たに生成した核酸種が、テンプレートＤＮＡおよびＲＮ
    Ａ複製物から成る２本鎖を含む請求項２０または２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 １本鎖または２本鎖の核酸基質が線状である、請求項１０
    から２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 【請求項２４】 ＲＮＡ合成用の混合物が、放射活性同位元素で標識されて
    いるか、または化学的に修飾されている少なくとも１種のヌクレオシド三リン酸
    を含有する、請求項１０から２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 【請求項２５】 −ＲＮＡまたはＤＮＡ基質を用意するステップ； −核酸基質、請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質、ヌクレオシ
    ド三リン酸、および、場合によっては、緩衝剤、酢酸アンモニウム、ＤＴＴ、Ｐ
    ＥＧ、Ｍｇ^２＋イオン類、Ｍｎ^２＋イオン類および／またはＢＳＡを含む混合物
    中、そのＲＮＡまたはＤＮＡ基質をＲＮＡ合成に十分な条件下で請求項１から５
    のいずれか一項に記載のタンパク質と接触させるステップ； −ＲＮＡ合成に十分な温度で反応混合物をインキュベートするステップ； −反応混合物から新たに生成した核酸種を回収するステップ を含むｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを製造する方法。
26. 【請求項２６】 ＲＮＡ合成が、核酸基質に相補的なプライマーの３’末端
    から開始される、請求項１０から２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 【請求項２７】 そのプライマーが、１本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡである、請
    求項２６に記載の方法。
28. 【請求項２８】 （ａ）請求項１から５のいずれか一項に記載のポリメラー
    ゼタンパク質；および、場合によっては （ｂ）検出可能な濃度のＲＮＡ合成に必要な添加物 を含むｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを製造するためのキット。
29. 【請求項２９】 ＲＮＡ合成に十分な濃度のヌクレオシド三リン酸を含む、
    請求項２８に記載のキット。
30. 【請求項３０】 少なくとも１種のヌクレオシド三リン酸が、放射性同位元
    素で標識されているか、または化学的に修飾されている、請求項２８または２９
    に記載のキット。
31. 【請求項３１】 キットがさらに、ＲＮＡ合成のためのテンプレート（複数
    のテンプレート）として働くことのでできる標準的な核酸標品を含有する、請求
    項２８から３０のいずれか一項に記載のキット。
32. 【請求項３２】 核酸分子を配列決定するために特に使用され、特定のヌク
    レオチド塩基でＲＮＡ合成を終結させる少なくとも１種のＲＮＡ合成終止剤を場
    合によっては含む、請求項２８から３１のいずれか一項に記載のキット。
33. 【請求項３３】 そのＲＮＡ合成終止剤が、３’−デオキシヌクレオチド三
    リン酸またはその機能的誘導体である、請求項３２に記載のキット。
34. 【請求項３４】 （ａ）線状核酸分子を用意するステップ； （ｂ）請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質； ４種のヌクレオシド三リン酸またはそれらの機能的類縁体；および 特定のヌクレオチド塩基でＲＮＡ合成を終結させる４種のＲＮＡ合成終止剤の
    うち少なくとも１種、ここでその終止剤は、それぞれ異なるヌクレオチド塩基に
    おいてＲＮＡ合成を終結させる； を含む混合物中、ＲＮＡ合成に十分な条件下でその核酸分子をインキュベートす
    るステップ；および （ｃ）インキュベーション反応物の終結されたＲＮＡ生成物をサイズによって
    分離してその核酸分子の少なくとも一部のヌクレオチド塩基配列を決定するステ
    ップ を含む線状核酸分子のヌクレオチド塩基配列を決定する方法。
35. 【請求項３５】 その核酸分子が、１本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡである、請求
    項３４に記載の方法。
36. 【請求項３６】 その核酸分子が、２本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡである、請求
    項３４に記載の方法。
37. 【請求項３７】 検出可能な標識を持つように修飾されたヌクレオシド三リ
    ン酸またはそれらの機能性類縁体を少なくとも１種使用することを含む、請求項
    ３４から３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 【請求項３８】 検出可能な標識を持つように修飾されたＲＮＡ合成終止剤
    を少なくとも１種使用することを含む、請求項３４から３７のいずれか一項に記
    載の方法。
39. 【請求項３９】 そのＲＮＡ合成終止剤が、３’−デオキシヌクレオシド三
    リン酸またはそれらの機能的誘導体である、請求項３４から３８のいずれか一項
    に記載の方法。