JP4338402B2 - N4ウイルス一本鎖dna依存的rnaポリメラーゼ - Google Patents
N4ウイルス一本鎖dna依存的rnaポリメラーゼ Download PDFInfo
- Publication number
- JP4338402B2 JP4338402B2 JP2002592465A JP2002592465A JP4338402B2 JP 4338402 B2 JP4338402 B2 JP 4338402B2 JP 2002592465 A JP2002592465 A JP 2002592465A JP 2002592465 A JP2002592465 A JP 2002592465A JP 4338402 B2 JP4338402 B2 JP 4338402B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- rna
- dna
- promoter
- rna polymerase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
本願は、米国仮特許出願番号第60/292,845号(2001年5月22日出願、この開示全体が、本明細書中に参考として詳細に援用される)に対する優先権を主張する。National Institute of Healthからの補助金番号第R01 A1 12575号により、政府が本発明における権利を有し得る。
本発明は、一般に、RNAポリメラーゼに関する。より詳細には、本発明は、一本鎖DNAテンプレートを用いて所望の配列のRNAを合成するためのバクテリオファージN4ウイルスRNAポリメラーゼを提供する。
宿主細胞におけるタンパク質をコードする遺伝子の発現は、RNAポリメラーゼ酵素によるDNAからのメッセンジャーRNA(mRNA)の転写を含む。続いて、mRNAが、プロセシングされる。このプロセシングは、ポリアデニル化酵素による3’UTR領域の認識およびmRNAの3’末端へのポリアデニル化ヌクレオチドのテール(tail)の付加を含む。転写後、このmRNAは、このmRNAの5’UTR領域と結合し、そしてmRNAに沿って3’方向に転移するリボソームと遭遇する。転移の間、アミノ酸が、順々に互いに付加されてタンパク質をコードする遺伝子のポリペプチド産物を形成する。原核生物の転写−翻訳のために、翻訳開始部位の6〜9ヌクレオチド前に位置する細菌mRNAのShine−Dalgarno配列が、リボソームローディングのために使用され得る。この配列は、16S rRNAの3’末端上の配列と相補的であり、そしてリボソームを刺激してmRNAに結合する。Shine−Dalgarno配列とRNA配列との間の塩基対形成は、解読のための開始AUGを整列させる役割を果たす。
本発明は、新規N4ウイルス性RNAポリメラーゼ(vRNAP)およびミニ−vRNAポリメラーゼならびにその使用方法を提供する。新規のポリメラーゼは、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、または配列番号15に示されるアミノ配列を有するポリペプチドをコードする領域を含む単離された核酸により記載される。この核酸は、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7または配列番号14の核酸配列を含み得る。vRNAPポリメラーゼおよびミニ−vRNAポリメラーゼは、N4プロモーター(例えば、配列番号16、配列番号19、配列番号27、配列番号28、または配列番号29のP2プロモーター)に作動可能に連結した核酸を転写する。配列番号16または配列番号28のプロモーターが好ましい。
本発明は、一本鎖DNAを使用する安定なRNAポリメラーゼを提供することによって、当該分野における欠点を克服し、そして所望の配列のRNAを合成するための独特の系を提供する。RNAポリメラーゼおよびミニvRNAポリメラーゼは、DNAまたはRNAのRNaseプロテクション研究、インサイチュハイブリダイゼーション研究、ならびにサザンブロット分析およびノザンブロット分析におけるプローブとしての使用のため、所望のRNA:DNAハイブリッドの合成のため、RNAのNMR構造決定のため、スプライセオソームアセンブリ、スプライシング反応およびアンチセンス実験のインビトロ研究のため、インビトロ翻訳またはマイクロインジェクションのため、そして核酸増幅のためのRNA合成のために使用され得る。本発明は、誘導体化されたRNAの合成を可能にし、そして一本鎖pリゴヌクレオチドの形態でssDNAを使用して、DNAを変成させるか、またはDNAをM13テンプレートにクローン化し得る。
(a.DNA依存性RNAポリメラーゼの構造およびプロモーター認識)
ファージ、古細菌、真正細菌、真核生物およびウイルスのDNA依存性RNAポリメラーゼの検査は、2つの酵素ファミリーの存在を明らかにした。この真正細菌、真核生物、古細菌、葉緑体およびワクシニアウイルスのRNAポリメラーゼは、2つの大きなサブユニットから構成される複雑なマルチサブユニット酵素(5〜14サブユニット)であり、1つは、中程度の分子量(30〜50kDa)のいくつかのサブユニットであり、そしてそれ以外は、低分子量(<30kDa)のいくつかのサブユニットである(Archambaultら、1993;Recordら、1995)。真正細菌のRNAポリメラーゼは、α2ββ’コア構造を有する最も単純なものである。これらの酵素の異なるサブユニットをコードする遺伝子の配列比較は、以下を明らかにした:1)β’と他のRNAポリメラーゼの最大のサブユニットとの間の8個のセグメント(A〜H)における配列相同性;2)βと他のRNAポリメラーゼの次に大きいのサブユニットとの間の9個のセグメント(A〜I)におこえる配列相同性;3)αとRNAポリメラーゼI、IIおよびIIIにおけるサブユニットとの間の3個のセグメント(1.1、1.2および2)における配列相同性(Puhlerら、1989;Sweetserら、1987)。当然のように、酵母RNAP IIとE.coli RNAPコアの結晶構造は、顕著な類似性を明らかにした(Zhangら、1999;Cramerら、2001)。
バクテリオファージN4ビリオンRNAポリメラーゼ(N4 vRNAP)は、N4ビリオン中に存在し、そして感染の初期でE.coli中に注入され、ここでこれはN4初期遺伝子の転写を生じる(Falcoら、1977;Falcoら、1979;Maloneら、1988)。N4 vRNAP遺伝子は、N4ゲノムのレイト領域にマッピングされる(Zivinら、1981)。ビリオンから精製されたN4 vRNAPは、約320,000kDの見かけの分子量を有する単一のポリペプチドから構成される(Falcoら、1980)。他のDNA依存性RNAPaseとは対照的に、N4 vRNAPは、一本鎖テンプレート上のプロモーターを認識する(Falcoら、1978)。これらのプロモーターは、保存配列、および5bpのステム構造、3塩基のループヘアピン構造によって特徴付けられる(図1)(Haynesら、1985;Glucksmannら、1992)。インビボでは、E.coliジャイレースおよび一本鎖結合タンパク質は、N4 vRNAPによる転写に要求される(Falcoら、1980;Markiewiczら、1992)。
RNA合成は、RNAポリメラーゼ、DNAテンプレート、活性化前駆体(リボヌクレオシド三リン酸ATP,GTP、UTPおよびCTP(XTP))、ならびに二価金属イオン(例えば、Mg2+またはMn2+)を必要とする。金属イオンMg2+が非常に好ましい。RNAの合成は、DNAのプロモーター部位で開始する。この部位は、RNAポリメラーゼが認識および結合する配列を含む。RNA合成は、終結部位に到達するまで進む。N4 vRNAP終結シグナルは、新しく合成されたRNAにおいて形成するヘアピンループを含み、これにウラシルの1文字が続く(ポリU)。N4ゲノム中に存在するvRNAPについての終結シグナルの配列としては、配列番号21〜26が挙げられる、これらのN4 vRNAP終結シグナルは、真正細菌の配列依存性ターミネーターの全ての特徴を保有する。
本発明の重要な局面は、単離されたDNAセグメント、およびN4 vRNAP(より詳細には、ミニ−vRNAPもしくはミニ−vRNAPの変異体)をコードする組換えベクター、ならびに野生型、多型もしくは変異体vRNAPを発現するDNA技術の適用を介した組換え宿主細胞の作製および使用に関する。本発明の他の局面は、単離された核酸セグメントおよびvRNAPをコードする組換えベクターに関する。配列番号1、3、4、7、14および生物学的なその機能的等価物の配列が、近年の発明において使用される。一本鎖DNAオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが、DNAテンプレートとして使用され得る。
本明細書中に開示される核酸配列は、種々の使用を有する。vRNAP核酸配列由来の連続配列は、例えばvRNAPを合成するためのテンプレートとして使用され得る。
n〜n+y
ここでnは、1から配列の最後の数までの整数であり、そしてyは、核酸セグメントから1を引いた長さであり、ここで、n+yは、配列の最後の数を超えない。従って、10マーの場合、その核酸セグメントは、塩基1〜10、2〜11、3〜12...などに対応する。15マーの場合、その核酸セグメントは、塩基1〜15、2〜16、3〜17...などに対応する。20マーの場合、その核酸セグメントは、塩基1〜20、2〜21、3〜22...などに対応する。特定の実施形態において、核酸セグメントは、プローブまたはプライマーであり得る。本明細書中で使用される場合、「プローブ」とは、一般的に、検出方法または組成物において使用される核酸をいう。本明細書中で使用される場合、「プライマー」は、一般的には伸長法もしくは増幅法または組成物において使用される核酸のことをいう。
増幅のためのテンプレートとして使用される核酸は、標準的な方法論に従って、生物学的サンプル中に含まれる細胞から単離される(Sambrookら,1989)。この核酸は、ゲノムDNAまたは分画された細胞RNAもしくは全細胞RNAであり得る。RNAが使用される場合、RNAが相補DNAへ転換されることが所望され得る。1つの実施形態において、RNAは全細胞RNAであり、そして増幅のためのテンプレートとして直接的に使用される。
特定の実施形態では、本発明の核酸配列(例えば、配列番号1、3、5、7、14またはこれらの変異体の全てまたは一部)を、ハイブリダイゼーションアッセイ、RNaseプロテクション、およびノーザンハイブリダイゼーションについての適切な手段(例えば、標識)と組み合わせて用いることは有利である。広範な種々の適切なインジケーター手段は、当該分野で公知であり、これらとしては、蛍光リガンド、放射性リガンド、酵素リガンドまたは検出され得る他のリガンド(例えば、アビジン/ビオチン)が挙げられる。好ましい実施形態では、放射性試薬または他の環境的に望ましくない試薬の代わりに蛍光標識または酵素タグ(例えば、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼ)を用いることを所望し得る。酵素タグの場合、相補的核酸含有サンプルとの特異的ハイブリダイゼーションを同定する、ヒトの眼または分光光度計的に可視の検出手段を提供するために用いられ得る比色インジケーター基質が公知である。
本発明は、vRNAP、またはより具体的にはミニvRNAP遺伝子をクローニングすることを企図する。今日、タンパク質生成のために当業者によってしばしば使用される技術は、タンパク質のいわゆる「組換え」形態を獲得すること、このタンパク質を組換え細胞において発現させること、そしてこのような細胞から、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを獲得することである。これらの技術は、DNAライブラリーからタンパク質をコードする核酸分子の「クローニング」、すなわち、DNAの他の部分とは異なる特定のDNA分子を獲得すること、に基づく。このことは、例えば、cDNA分子のクローニング、またはゲノム様DNA分子のクローニングによって達成され得る。
組換えベクターは、本発明の重要なさらなる局面を形成する。用語「発現ベクターまたは構築物」とは、遺伝子産物をコードする核酸を含む、任意の型の遺伝子構築物を意味し、ここで、配列をコードする一部または全部の核酸が転写され得る。この転写物は、タンパク質性の分子に翻訳され得るが、1本鎖DNAテンプレートを使用してRNAを転写するミニvRNAPの場合のように、転写物が翻訳される必要はない。従って、特定の実施形態において、発現は、1本鎖DNAの転写およびRNAのタンパク質産物への翻訳の両方を含む。他の実施形態において、発現は核酸の転写のみを含む。組換えベクターもまた、本発明のRNAの送達のために使用され得る。
天然の状態の宿主細胞において通常見出される任意のプロモーターが、N4 vRNAポリメラーゼ、またはミニvRNAポリメラーゼの発現を駆動するために、本発明において使用される。また、天然の、通常の天然の宿主細胞RNAポリメラーゼ、または細胞内で発現された非天然のRNAポリメラーゼによって認識される、天然の状態の宿主細胞において見出される、正常でないプロモーターが、RNAポリメーラーゼの発現を駆動するために本明細書において使用され得る。他のプロモーターは、当業者にアクセス可能な核酸配列データベース(例えば、GenBank)から選択されるか、またはプロモーターはスクリーニング方法によって単離され得る。宿主細胞によって認識されるプロモーターは、N4 RNAポリメラーゼをコードする遺伝子(または遺伝子群)と作動可能に連結され得る。この作動可能な連結は、本明細書中に参照されるように、DNA操作についての任意の公知技術を使用して構築され得る。
本発明の他の実施形態において、T7様のバクテリオファージ由来のRNAポリメラーゼによって認識されるプロモーターが使用される。試験された全てのT7様バクテリオファージの遺伝子構造は、本質的にT7の遺伝子構造と同じであることが見出された。本発明に従うT7様バクテリオファージの例としては、Escherichia coliのファージT3、ファージphiI、ファージphiII、ファージW31、ファージH、ファージY、ファージA1、ファージ122、ファージcro、ファージC21、ファージC22、およびファージC23;Pseudomonas putidaのファージgh−1;Salmonella typhimuriumのファージSP6;Serratia marcescensのファージIV;CitrobacterのファージViIII;およびKlebsiellaのファージNo.11(Hausmann、1976;Korstenら、1975;Dunnら、1971;Towleら、1975;ButlerおよびChanberlin、1982)が挙げられるが、これらに限定されない。
エンハンサーは、元々、同じDNA分子上の離れて位置されるプロモーターからの転写を増加する遺伝子エレメントとして検出された。このエンハンサーの、大きな距離を越えて作用する能力は、原核細胞生物の転写調節の古典的研究において、ほとんど先例がない。その後の研究は、エンハンサー活性を有するDNA領域が、プロモーターに非常に似た構成であることを示した。すなわち、これらDNA領域は、多くの個々のエレメントから構成され、その各々は1つ以上の転写タンパク質に結合する。
本発明のいくつかの実施形態において、vRNAポリメラーゼを使用し、アンチセンスRNAまたはリボザイムを合成し得る。
宿主細胞は、原核生物または真核生物(酵母細胞を含む)、昆虫細胞、および哺乳動物細胞から由来し得、所望の結果が、ベクターの複製かまたはベクターがコードする核酸配列の一部もしくは全ての発現であるかどうかに依存する。多くの細胞株および培養物が、宿主細胞としての使用のために入手可能であり、これらは、American Type Culture Collection(ATCC)を通して得られ得る。このATCCは、生育培養物および遺伝的材料のための保管所として役に立つ組織である(www.atcc.org)。適切な宿主は、ベクター骨格および所望される結果に基づいて当業者によって決定され得る。例えば、プラスミドまたはコスミドは、多くのベクターコピーの複製のために原核生物の宿主細胞に導入され得る。ベクター複製および/または発現のための宿主細胞として使用される細菌細胞としては、DH5α、BL21、JM109、およびKC8、ならびに多くの市販の細菌宿主(例えば、SURE(登録商標)Competent CellsおよびSOLOPACK Gold Cells(STRATAGENE(登録商標),La Jolla,CA))。あるいは、細菌細胞(例えば、E.coli LE392)は、宿主細胞として使用され得る。適切な酵母細胞としては、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces pombe、およびPichia pastorisが挙げられる。
細胞における導入遺伝子の作用を媒介するために、細胞中に本発明の発現構築物(例えば、治療構築物)を導入することが必要である。このような導入は、遺伝子導入のウイルス方法または非ウイルス方法を使用し得る。この節は、アンチセンス配列の導入を含む、遺伝子または核酸の導入の方法および組成物の議論を提供する。
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも1つのタンパク質性分子を含む、新規の組成物または方法に関する。タンパク質性分子は、本質的に、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8または配列番号15に記載されるような配列を有し得る。このタンパク質性分子は、vRNAPもしくは、より好ましくは、ミニ−vRNAP、または送達薬剤であり得る。タンパク質性分子はまた、変異ミニ−vRNAPでもあり得る。
vRNAPまたはミニ−vRNAPを含む組成物を調製するために、これらの成分または改変体を精製することが望ましい。ミニ−vRNAP(配列番号4)の精製は、アフィニティーカラムを使用する2工程でなされ得る。配列番号6のミニ−vRNAPは、Hisタグを含むように改変されたので、精製は、金属アフィニティーカラム(例えば、ニッケル、コバルトまたは亜鉛を使用するカラム)を使用する場合、1工程でなされ得る。配列番号15の全長vRNAPもまた、精製のためにHisタグ化される。
RNAの合成後、お互いから、そしてそのテンプレートおよび過剰のプライマーから、いくつかの異なる長さの増幅産物を分離することが好ましくあり得る。
1つの実施形態において、増幅産物は、標準的な方法を使用して、アガロース、アガロース−アクリルアミド、またはポリアクリルアミドのゲル電気泳動によって、分離される(Sambrookら、1989)。
あるいは、分離を生じるために、クロマトグラフィー技術が使用され得る。本発明において使用され得る、多くの種類のクロマトグラフィー(吸着、分配、イオン交換および分子ふるい)、ならびにこれらを使用するための多くの特殊化された技術(カラムクロマトグラフィー、濾紙クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーおよびガスクロマトグラフィーが挙げられる)が存在する(Freifelder,1982)。なお別の代替において、標識されたcDNA産物(例えば、ビオチン標識または抗原標識されたもの)が、それぞれアビジンまたは抗体を保有するビーズで捕捉され得る。
微小流体技術としては、ACLARA Biosciences Inc.によって設計されたマイクロキャピラリー、またはCaliper Technologies Inc.によって製造されるLabChipTM「液体集積回路」のようなプラットフォームにおける分離が挙げられる。これらの微小流体プラットフォームは、他の分離技術によって必要とされるマイクロリットルの容量とは対照的に、ナノリットルの容量のサンプルのみを必要とする。遺伝子分析に関与するプロセスのいくつかを小型化することは、微小流体デバイスを使用して達成されてきた。例えば、NorthrupおよびWhiteに対する公開されたPCT出願番号WO94/05414(本明細書中に参考として援用される)は、標本から核酸を収集および増幅するための、一体化された微小PCRTM装置を報告する。Wildingらに対する米国特許第5,304,487号およびKrickaらに対する同第5,296,375号は、細胞含有サンプルの収集および分析のためのデバイスを議論し、そして本明細書中に参考として援用される。米国特許第5,856,174号は、核酸分析に関与する種々のプロセスおよび分析の操作を組み合わせる装置を記載し、そして本明細書中に参考として援用される。
いくつかの実施形態において、増幅された遺伝子を分析するための、さらなる手段、または代替の手段を提供することが、望ましくあり得る。これらの実施形態において、マイクロキャピラリーアレイが、分析のために使用されることが企図される。
質量分析は、分子を減圧下でイオン化させ、そしてこれらを揮発によって「飛行」させることによって、個々の分子を「秤量する」手段である。電場と磁場との組合せの影響下で、これらのイオンは、それらの個々の質量(m)および電荷(z)に依存して、軌道に従う。低分子量の分子については、質量分析は、親分子イオンの質量の決定による、有機分子の分析および特徴付けのための、慣用的な物理有機化学的レパートリーの一部である。さらに、この親分子イオンと他の粒子(例えば、アルゴン原子)との衝突を手配することによって、分子イオンは、いわゆる衝突解離(CID)によってフラグメント化し、二次イオンを形成する。フラグメント化のパターン/経路は、詳細な構造情報の誘導を、非常にしばしば可能にする。当該分野において公知の質量分析法の他の適用は、Methods in Enzymology,第193巻:「Mass Spectrometiry」(J.A.McCloscey編)、1990、Academic Press,New Yorkに要約されたものが見出され得る。
蛍光標識でハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドプローブを標識することは、当該分野において周知の技術であり、そしてプローブハイブリダイゼーションの検出を容易にするための、高感度な非放射性の方法である。より最近開発された検出方法は、プローブハイブリダイゼーションの検出のために、蛍光強度の直接の検出よりむしろ、蛍光エネルギー移動(FET)のプロセスを使用する。FETは、ドナー発蛍光団とアクセプター色素(これは、発蛍光団であってもそうでなくてもよい)との間で、一方(アクセプター)の吸収スペクトルが他方(ドナー)の発光スペクトルと重なり、そしてこれら2つの色素が近く近接している場合に、起こる。これらの特性を有する色素は、ドナー/アクセプター色素対またはエネルギー移動色素対と称される。ドナー発蛍光団の励起状態エネルギーは、共鳴双極子により誘導される双極子相互作用によって、隣接するアクセプターに移動される。これによって、ドナー蛍光の消光が起こる。いくつかの場合において、アクセプターもまた発蛍光団である場合、その蛍光の強度は、増強され得る。エネルギー移動の効率は、ドナーとアクセプターとの間の距離に非常に依存し、そしてこれらの関係を予測する式が開発された(Forster,1948)。エネルギー効率が50%である、ドナー色素とアクセプター色素との間の距離は、Forster距離(RO)と称される。蛍光の消光の他の機構もまた公知であり、例えば、電荷移動および衝突消光が挙げられる。
本発明の合成RNAは、スプライセオソームアッセイ、スプライシング反応、またはアンチセンス実験のインビトロ研究のために使用され得る。
本明細書中に記載される任意の組成物が、キット中に含まれ得る。非限定的な例において、vRNAP、またはより好ましくは、ミニvRNAP、誘導体化ミニvRNAP、変異体vRNAPおよび/もしくはさらなる薬剤が、キットに含まれ得る。従って、このキットは、適切な容器手段中に、本発明のミニvRNAP、誘導体化ミニvRNAP、変異体vRNAPおよび/またはさらなる薬剤を含む。本発明者らは、キットに含まれ得る他の成分を予測する。これらとしては、免疫検出薬剤(例えば、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼに結合した、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体)、免疫沈降試薬(例えば、プロテインAまたはプロテインGに結合したビーズ)、免疫細胞増殖試薬(例えば、TALONまたはmonoQカラム)発現ベクターを操作するためのクローニング試薬、ならびにタンパク質発現のための、原核生物細胞および真核生物細胞を含む、タンパク質発現試薬が挙げられるが、これらに限定されない。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に記載される技術は、本発明の実施において良好に機能することが本発明者らによって発見された技術に相当し、従って、その実施のために好ましい様式を構築するとみなされ得ることが、当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示を考慮して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態において多くの変化がなされ得、そして依然として、同様または類似の結果を得ることを理解するべきである。
(N4ビリオンRNAポリメラーゼの転写活性ドメインの同定)
RNAポリメラーゼ活性を保有する哺乳動物のドメインを決定するために、制御されたタンパク質分解を実施し、続いて触媒(転写)自己標識を実施した(Hartmannら、1988)。RNAポリメラーゼを開始ヌクレオチドのベンズアルデヒド誘導体とインキュベーションすると、ベンズアルデヒド基は、ヌクレオチド結合部位の12Å内に位置するリジンのε−アミノ基と、シッフ塩基を形成する。架橋工程を、DNAテンプレートの存在下で実施した。なぜなら、これは、開始ヌクレオチドの結合を刺激するからである。不安定なシッフ塩基を、ホウ素化水素ナトリウムを使用するマイルドな条件下での還元によって、安定な第二級アミンに転換し、これは、未反応ベンズアルデヒド誘導体の共存還元を伴った。次のテンプレート特異的α−32P標識NTPの添加は、転写活性なポリペプチドのホスホジエステル結合の形成および触媒性自己標識をもたらす。vRNAPの制御されたトリプシンタンパク質分解を実施し、続いて触媒性自己標識およびSDS−PAGEでの分析を実施した(図3A)。最初に、3つのタンパク質分解フラグメントが生成し、これらのうちの小さい方の2つは、触媒的に活性である。トリプリンとのさらなるインキュベーションの際に、単一の安定な転写活性生成物(約1,100アミノ酸長)が残る。最初の3つのタンパク質分解フラグメントのN末端配列(図3B)は、安定な活性ポリペプチド(ミニvRNAP)が、vRNAPの中央の1/3(上に記載された3つのモチーフを含む領域)に対応することを示した(図2A、配列番号3〜4)。
(N4ミニvRNAPのクローニングおよび精製)
全長vRNAPおよびミニvRNAP(配列番号6および15)のORFを、pBADの制御下で、N末端ヘキサヒスチジンタグを用いてクローニングした(図4)。ミニvRNAPドメインを、pBAD B発現プラスミド(これを、Invitrogenから購入した)にクローニングした。pBAD Bにおける5つの制限酵素部位が、変化した;SnaI部位は、HpaI部位に転換され、そしてPflMI部位およびEcoRV部位は、破壊され、全てが、部位特異的変異誘発によった。BstBI部位およびHindIII部位は、酵素消化によって破壊され、続いて、クレノウ処理およびライゲーションを行った。図5(左側)は、同じ容量のE.coli BL21誘導細胞からTALONカラムで精製された、全長vRNAPタンパク質およびミニvRNAPタンパク質の相対量を示す。クローニングされたミニvRNAPは、クローニングされた全長vRNAPより100倍高いレベルで発現される。MonoQカラムでのさらなる濃縮は、全長vRNAPとは対照的に、ミニvRNAPは、インキュベーション後に安定であることを明らかにする(図5、右側)。20mg/mlの濃度のミニvRNAPの少なくとも10mgが、1Lの誘導細胞から、2つのみの精製工程(TALONおよびMonoQミニカラム)において得られた。ヒスチジンでタグ化されていないミニvRNAPのバージョンもまたクローニングした(配列番号4)。この場合、この酵素を、2工程(プロモーターDNAアフィニティーカラムおよびMonoQ)で、誘導細胞の組成抽出物から精製した。
(一本鎖テンプレートの転写に対するEcoSSBの効果)
本発明者らは、EcoSSBが、インビボでのN4 vRNAP転写に必要であることを以前に示した(Glucksmannら、1992)。EcoSSBは、vRNAP転写に対する効果が試験された他のSSBとは異なり、プロモーターヘアピン構造をなくさない点で、独特である(Glucksmann−Kuisら、1996)。最近、本発明者らは、一本鎖テンプレートのvRNAP転写に対するEcoSSBの効果を再調査した。図6は、3つの異なるssDNAテンプレート濃度での、EcoSSBの非存在下および存在下での転写を示す。EcoSSB活性化の程度は、テンプレート濃度依存性であり、最高の活性化は、低DNAテンプレート濃度においてである。これらの結果は、EcoSSBが、ssDNAテンプレートに対するテンプレート制限を克服することを示唆する。
(ミニ−vRNAP転写特性の特徴付け)
全長RNAポリメラーゼおよびミニ−vRNAPの初期特性を、同様のモル濃度で比較した(図9A)。この比較には、触媒自己標識アッセイおよび2つの反応条件を使用した。第1の条件は、+1Cを含むテンプレート、GTPのベンズアルデヒド誘導体およびα32 P−ATPを使用し、または第2の条件は、+1Tを含むテンプレート、ATPのベンズアルデヒド誘導体およびα32 P−GTPを使用した。図9Bおよび9Cにおける結果の比較は、ミニ−vRNAPが、全長vRNAPと類似する初期特性を示すことを示す。さらに、両方の酵素は、同じ程度までdATP取り込みを区別する。ミニ−vRNAPは、その転写物の最初の4ヌクレオチドが50%以上のGヌクレオチドまたはCヌクレオチドから構成される場合には、失敗産物を合成しない。
(ミニ−vRNAPプロモーター結合の配列決定基)
N4ゲノム中に存在する3つのN4初期プロモーターは、5bpプロモーターステムの塩基から4ヌクレオチド分隔てられた一対のCを含む。好ましいプロモーターP2において、これらの4塩基はAであり、Cの後にTが続く。好ましくは、ミニ−vRNAPは、転写開始部位のすぐ上流に位置する17ヌクレオチドプロモーター配列を使用する。N4 vRNAポリメラーゼのプロモーターは、Haynesら(1985)およびDaiら(1998)(本明細書中に参考として援用される)に記載される。vRNAPプロモーター認識配列およびvRNAPプロモーター活性は、特定の配列と、テンプレート鎖上のヘアピン構造とを必要とする。配列番号27〜29のvRNAPプロモーターは、5〜7bpステムと3bプリン含有ループ(表6において太字で示される)とから構成されるヘアピン構造をとる(逆方向反復に、表6において下線を付す)。−11位は、そのループの中心に対応し、+1は、転写開始部位を示す。
(ミニvRNAP活性に必須な配列モチーフの同定)
図2Aに示されるように、vRNAPは、配列Rx3Kx6−7YG(Pol IポリメラーゼおよびPolαDNAポリメラーゼならびにT7様RNAポリメラーゼにおいてモチーフBと称される)を含む。vRNAP活性に対するこのモチーフの関連性を決定するために、2つの変異体(K670AおよびY678F(配列番号8)(ミニvRNAP中の位置番号))を、ミニvRNAPの部位特異的変異誘発によって構築した。T7様RNAポリメラーゼにおいて、リジンは、ヌクレオチド結合に関与し、チロシンは、デオキシヌクレオシドトリホスフェートの区別に関与するので、これらの2つの位置を選択した(Maksimovaら、1991;Bonnerら、1992;Osumi−Davisら、1992)。Hisタグ化Y678FミニvRNAP遺伝子(配列番号7)は、2つの位置でミニvRNAPドメイン配列(配列番号3)と異なる:ヌクレオチド2033(A)を、Tに交換し、そしてヌクレオチド2034(T)を、Cに交換した。
(ミニvRNAPおよびN4 vRNAPプロモーターを使用するRNAおよびタンパク質のインビボでの発現のためのインビボシステムの開発)
プラスミド鋳型を、2つの方向のいずれかで存在するvRNAPプロモーターP2制御下でクローン化されたレポーター遺伝子(β−ガラクトシダーゼのα−ペプチド)を用いて構築した(図17B)。レポーター構築物を、プラスミドpACYC177(これは、New England Biolabsから入手した)へカセットをクローニングすることによって生産した。このカセットは、pT7Acから始まる約30bp長のフラグメント(United States Biochemicalから購入)、N4プロモーターおよびlacZのαフラグメントをコードする配列(lacZ’)を含む。N4プロモーターおよびlacZ’を、それぞれ、オリゴヌクレオチドアニーリングおよびPCRTM増幅によって生産した。このカセットを、制限酵素ApaLIの切断部位とおよびBamHIの切断部位との間に位置したpACY177配列に置換した。これらのレポータープラスミドおよびプラスミドを発現する組換え全長vRNAPまたはミニvRNAPを、E.coli DH5α(ΔM15)(この株は、β−ガラクトシダーゼ ω−ペプチドをコードする)に導入した。この株におけるレポーター遺伝子(α−ペプチド)の発現は、活性β−ガラクトシダーゼの合成、そして結果としてのX−galプレートでの青色コロニーの生産を生じる。全長vRNAPおよびミニRNAPによるα−エプチドの転写を、誘導X−gal培地上でアッセイし、そして図17Aに示した。全長ポリメラーゼの導入は、β−ガラクトシダーゼ活性を有さない小さなコロニーを生じる。これは、全長のvRNAPが、これらの細胞において分解されたので、驚くべきことではない(図17C)。対照的に、ミニvRNAPの導入は、検出可能なレベルのタンパク質(図17C)および適切な方向にプロモーターP2を含むプラスミドのみに由来するβガラクトシダーゼ活性を導いた(図17A)。これらの結果は、このシステムがミニ−N4 vRNAPプロモーター制御下で、RNAおよびタンパク質のインビボ発現に適切であることを示す。
以下の参考文献は、それらが本明細書中に示される手順または詳細を補充する例示的手順または他の詳細を提供する程度まで、特に本明細書中で参考として援用される。
Claims (97)
- 単離された核酸であって、配列番号4、配列番号6、または、配列番号8に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする領域からなる、核酸。
- 前記核酸が、配列番号3、配列番号5、または、配列番号7の核酸配列からなる、請求項1に記載の核酸。
- 前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項1に記載の核酸。
- 前記プロモーターが、配列番号16、配列番号19、配列番号27、配列番号28または配列番号29に示されるN4 vRNAPプロモーターである、請求項3に記載の核酸。
- 前記プロモーターが、配列番号16または配列番号28に示されるP2配列である、請求項3に記載の核酸。
- 組換え宿主細胞であって、配列番号4または配列番号6に示されるアミノ酸配列を有するN4ビリオンRNAポリメラーゼをコードするDNAセグメントを含む、組換え宿主細胞。
- 前記DNAセグメントが、1本鎖DNAセグメントである、請求項6に記載の組換え宿主細胞。
- 前記DNAセグメントが、2本鎖DNAセグメントである、請求項6に記載の組換え宿主細胞。
- 前記DNAセグメントが、配列番号4に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項6に記載の組換え宿主細胞。
- 前記DNAセグメントが、配列番号6に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項6に記載の組換え宿主細胞。
- 前記細胞が、E.coli細胞である、請求項6に記載の組換え宿主細胞。
- 組換えベクターであって、プロモーターの制御下に、配列番号4または配列番号6に示されるアミノ酸配列を有するN4ビリオンRNAポリメラーゼポリペプチドをコードするDNAセグメントを含む、組換えベクター。
- 単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号3と同一または相補的な配列からなる、ポリヌクレオチド。
- 前記ポリペプチドが、少なくとも1つのヒスチジンタグを有する、請求項1に記載の核酸。
- 前記ポリペプチドが、配列番号4のY679位に変異を有するか、または、配列番号6のY715に変異を有する、請求項1に記載の核酸。
- RNAを作製する方法であって、以下:
(a)N4ビリオンRNAポリメラーゼを得る工程;
(b)DNAを得る工程;
(c)該RNAポリメラーゼと該DNAとを混合する工程;ならびに
(d)該RNAポリメラーゼおよび該DNAを、RNA合成を可能にするに有効な条件下で培養する工程
を包含する、方法であって、
ここで、該RNAポリメラーゼは、配列番号4または配列番号6に示されるアミノ酸配列を有するRNAポリメラーゼ、および、配列番号4または配列番号6に示されるアミノ酸配列を有するRNAポリメラーゼの変異体からなる群から選択され、ここで、該変異体は、配列番号4の位置番号Y679に変異を有するか、または、配列番号6の位置番号Y715に変異を有する、方法。 - 修飾リボヌクレオチドまたは修飾デオキシリボヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを合成する工程をさらに包含する、請求項16に記載の方法。
- 前記DNAが、1本鎖DNAである、請求項16に記載の方法。
- 前記DNAが、2本鎖DNAである、請求項16に記載の方法。
- 前記混合する工程が、宿主細胞内で起こる、請求項16に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、E.coli宿主細胞である、請求項20に記載の方法。
- 前記RNAポリメラーゼが、配列番号4に示されるアミノ酸配列を有する、請求項16に記載の方法。
- 前記RNAポリメラーゼが、配列番号4または配列番号6に示されるアミノ酸配列を有するRNAポリメラーゼ変異体である、請求項16に記載の方法であって、
ここで、該変異体は、配列番号4の位置番号Y679に変異を有するか、または、配列番号6の位置番号Y715に変異を有する、方法。 - 前記変異体が、ヒスチジンタグ化されている、請求項23に記載の方法。
- 前記RNAが、誘導体化ヌクレオチドを含む、請求項16に記載の方法。
- プロモーターを用いる工程をさらに包含する、請求項16に記載の方法。
- 前記プロモーターが、配列番号16、配列番号19、配列番号27、配列番号28または配列番号29に示されるN4 vRNAPプロモーターである、請求項26に記載の方法。
- 前記プロモーターが、配列番号16または配列番号28に示されるP2配列である、請求項27に記載の方法。
- 前記プロモーターが、2〜7塩基対長のステムおよび3〜5塩基のループを有するヘアピンであって、該ループの中央の位置および/または中央の位置の隣にプリンを有するヘアピンを形成する逆方向反復のセットを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記プロモーター配列が、転写開始部位の上流にある、請求項26に記載の方法。
- 工程(c)が、6と9との間のpHで実施される、請求項16に記載の方法。
- 工程(c)が、7.5と8.5との間のpHで実施される、請求項31に記載の方法。
- Mg+2またはMn+2を混合する工程をさらに包含する、請求項16に記載の方法。
- Mg+2を混合する工程を包含する、請求項33に記載の方法。
- 25℃〜50℃の温度で実施されるとさらに規定される、請求項16に記載の方法。
- 30℃〜45℃の温度で実施されるとさらに規定される、請求項35に記載の方法。
- 32℃〜42℃の温度で実施されるとさらに規定される、請求項36に記載の方法。
- 翻訳の工程をさらに包含する、請求項16に記載の方法。
- レポーター遺伝子を用いる工程をさらに包含する、請求項16に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼのα−ペプチドである、請求項39に記載の方法。
- 前記混合する工程が、インビボで起こる、請求項16に記載の方法。
- 前記混合する工程が、インビトロで起こる、請求項16に記載の方法。
- E.coli1本鎖結合タンパク質(EcoSSB)、EcoSSBに相同なSSBタンパク質またはEcoSSBに相同な別の天然に存在するかもしくはキメラのSSBタンパク質と、前記DNAおよび前記ポリメラーゼとを混合する工程をさらに包含する、請求項16に記載の方法。
- 前記RNAを翻訳する工程をさらに包含する、請求項43に記載の方法。
- 前記DNAが、1本鎖直鎖状DNAである、請求項16に記載の方法。
- 前記DNAが、1本鎖環状DNAである、請求項16に記載の方法。
- 前記環状DNAが、バクテリオファージM13 DNAである、請求項46に記載の方法。
- 前記DNAが、変性したDNAである、請求項16に記載の方法。
- 前記変性したDNAが、1本鎖DNAである、請求項48に記載の方法。
- 前記RNAが、精製されたRNAである、請求項16に記載の方法。
- 前記RNAが、修飾ヌクレオチドを含む、請求項16に記載の方法。
- 混合されたRNA−DNAオリゴヌクレオチドが作製される、請求項16に記載の方法。
- EcoSSBが、前記RNAポリメラーゼおよび前記DNAと混合されず、そして該RNAが、DNA/RNAハイブリッドの形態である、請求項16に記載の方法。
- 前記RNAが、検出可能な標識を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記検出可能な標識が、蛍光タグである、請求項54に記載の方法。
- 前記検出可能な標識が、ビオチンである、請求項54に記載の方法。
- 前記検出可能な標識が、ジゴキシゲニンである、請求項54に記載の方法。
- 前記検出可能な標識が、2’−フルオロヌクレオシド三リン酸である、請求項54に記載の方法。
- 前記検出可能な標識が、放射性標識である、請求項54に記載の方法。
- 前記放射性標識が、35S標識または32P標識である、請求項59に記載の方法。
- 前記RNAが、ブロッティング実験またはインサイチュハイブリダイゼーションのためのプローブとしての使用に適合している、請求項54に記載の方法。
- ヌクレオシド三リン酸(NTP)が、前記RNA中に取り込まれる、請求項16に記載の方法。
- 前記NTPが、検出可能な標識を含む、請求項62に記載の方法。
- 前記NTPが、誘導体化NTPである、請求項63に記載の方法。
- デオキシヌクレオシド三リン酸が、前記RNAに取り込まれる、請求項16に記載の方法。
- 前記RNAが、NMR構造決定に適合している、請求項16に記載の方法。
- 前記RNAが、10と1000との間の塩基を有する、請求項66に記載の方法。
- 前記RNAが、10と300との間の塩基を有する、請求項67に記載の方法。
- 前記RNAが、スプライセオソームアセンブリに適合している、請求項16に記載の方法。
- 前記RNAが、スプライシング反応に適合している、請求項16に記載の方法。
- 前記RNAが、アンチセンス実験における使用に適合している、請求項16に記載の方法。
- 前記RNAが、相補性ヌクレオチド配列をプローブする際の使用に適合している、請求項16に記載の方法。
- 前記RNAが、RNaseプロテクションの研究におけるプローブとしての使用に適合している、請求項16に記載の方法。
- 前記RNAを細胞に送達する工程をさらに包含する、請求項16に記載の方法。
- 前記送達する工程が、マイクロインジェクションによる、請求項74に記載の方法。
- 前記RNAを増幅する工程をさらに包含する、請求項16に記載の方法。
- RNAを作製する方法であって、以下:
(a)N4ビリオンRNAポリメラーゼを得る工程;
(b)1本鎖DNAオリゴヌクレオチドを得る工程であって、ここで、該オリゴヌクレオチドは、N4ビリオンRNAポリメラーゼプロモーター配列を含む、工程;
(c)該RNAポリメラーゼと該オリゴヌクレオチドとを混合する工程;ならびに
(d)該RNAポリメラーゼおよび該オリゴヌクレオチドを、RNA合成を可能にするに有効な条件下で培養する工程
を包含する、方法であって、
ここで、該RNAポリメラーゼは、配列番号4、配列番号6、または、配列番号8に示されるアミノ酸配列を有する、方法。 - 前記DNAが、20と200との間の塩基を有する、請求項77に記載の方法。
- RNAを作製する方法であって、以下:
(a)N4ビリオンRNAポリメラーゼを得る工程;
(b)1本鎖DNAを得る工程であって、ここで、該DNAは、N4ビリオンRNAポリメラーゼプロモーター配列を含む、工程;
(c)リボヌクレオシド三リン酸(XTP)または誘導体化リボヌクレオシド三リン酸を得る工程;
(d)該RNAポリメラーゼと、該DNAと、該XTPとを混合する工程;ならびに
(e)該RNAポリメラーゼおよび該オリゴヌクレオチドを、RNA合成を可能にするに有効な条件下で培養する工程であって、ここで、該RNAは、誘導体化RNAである、工程
を包含する、方法であって、
ここで、該RNAポリメラーゼは、配列番号4または配列番号8に示されるアミノ酸配列を有するRNAポリメラーゼ、および、配列番号4または配列番号6に示されるアミノ酸配列を有するRNAポリメラーゼの変異体からなる群から選択され、ここで、該変異体は、配列番号4の位置番号Y679位に変異を有するか、または、配列番号6の位置番号Y715に変異を有する、方法。 - 前記RNAポリメラーゼが、配列番号4に示されるアミノ酸配列を有する、請求項79に記載の方法。
- 前記RNAポリメラーゼが、配列番号4または配列番号6に示されたとおりのアミノ酸配列を有するRNAポリメラーゼの変異体であり、ここで、該変異体は、配列番号4の位置番号Y679に変異を有するか、または、配列番号6の位置番号Y715に変異を有する、請求項79に記載の方法。
- 前記RNAポリメラーゼが、配列番号8に示されるアミノ酸配列を有する、請求項79に記載の方法。
- インビボでのタンパク質合成のための方法であって、以下:
(a)配列番号4に示されるアミノ酸配列を有するRNAポリメラーゼまたはその変異体を得る工程であって、ここで該変異体は、配列番号4の位置番号Y679での変異を有する、工程;
(b)DNAを得る工程であって、ここで、該DNAは、N4ビリオンRNAポリメラーゼプロモーター配列を含む、工程;
(c)該RNAポリメラーゼと該DNAとを混合する工程;
(d)該RNAポリメラーゼおよび該DNAを、RNA合成を可能にするに有効な条件下で培養する工程;ならびに
(e)該RNAを、タンパク質合成を可能にするに有効な条件下でインビボで培養する工程
を包含する、方法。 - 工程(e)が、2つのプラスミド系を用いることを包含する、請求項83に記載の方法。
- 工程(e)が、1つのプラスミド系を用いることを包含する、請求項83に記載の方法。
- レポーター遺伝子および前記RNAポリメラーゼが、同じプラスミドに存在する、請求項85に記載の方法。
- ミニ−vRNAPを作製する方法であって、以下:
(a)vRNAPを発現する工程であって、ここ、該vRNAPは、配列番号4、配列番号6、配列番号8に示されるアミノ酸配列またはそれらの変異体を有する、工程であって、ここで、該変異体は、配列番号4の位置番号Y679に変異を有するか、または、配列番号6の位置番号Y715に変異を有する、工程;および
(b)該vRNAPを精製する工程
を包含する、方法。 - 前記発現する工程が、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、CHO宿主細胞、Cos宿主細胞、HeLa宿主細胞、NIH3T3宿主細胞、Jurkat宿主細胞、293宿主細胞、Saos宿主細胞、またはPC12宿主細胞において生じる、請求項87に記載の方法。
- 用いられる宿主細胞株における発現に適切なプロモーターを用いる工程をさらに包含する、請求項87に記載の方法。
- 前記プロモーターは、pBADである、請求項89に記載の方法。
- 前記プロモーターが、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼまたはSP6 RNAポリメラーゼによって認識されるプロモーターである、請求項89に記載の方法。
- 前記プロモーターが、T7様バクテリオファージ由来のRNAポリメラーゼによって認識されるプロモーターである、請求項89に記載の方法。
- 前記vRNAPが、精製において使用するための特定の組換え配列を有する、請求項87に記載の方法。
- 前記vRNAPが、少なくとも1つのヒスチジンタグ、FLAGタグ、ヘマグルチニンタグ、またはc−mycタグを有する、請求項92に記載の方法。
- 前記vRNAPが、少なくとも1つのヒスチジンタグを有する、請求項92に記載の方法。
- 前記精製する工程が、1工程で行われる、請求項93に記載の方法。
- 前記vRNAPが、タグを有さない、請求項87に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US29284501P | 2001-05-22 | 2001-05-22 | |
PCT/US2002/016295 WO2002095002A2 (en) | 2001-05-22 | 2002-05-22 | N4 virion single-stranded dna dependent rna polymerase |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004533828A JP2004533828A (ja) | 2004-11-11 |
JP4338402B2 true JP4338402B2 (ja) | 2009-10-07 |
Family
ID=23126447
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002592465A Expired - Fee Related JP4338402B2 (ja) | 2001-05-22 | 2002-05-22 | N4ウイルス一本鎖dna依存的rnaポリメラーゼ |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7452705B2 (ja) |
EP (1) | EP1399541A4 (ja) |
JP (1) | JP4338402B2 (ja) |
CA (1) | CA2448097A1 (ja) |
WO (1) | WO2002095002A2 (ja) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2003303395A1 (en) * | 2001-05-22 | 2004-07-22 | Dahl, Gary, A. | Target-dependent transcription using deletion mutants of n4 rna polymerase |
EP1576188B1 (en) * | 2002-11-21 | 2008-10-15 | Epicentre Technologies | Methods for using riboprimers for strand displacement replication of target sequences |
US7727744B2 (en) * | 2004-03-30 | 2010-06-01 | Epicentre Technologies Corporation | Methods for obtaining directionally truncated polypeptides |
WO2006086668A2 (en) * | 2005-02-09 | 2006-08-17 | Epicentre Technologies | Compositions and methods employing 5'-phosphate-dependent nucleic acid exonucleases |
WO2009135212A2 (en) | 2008-05-02 | 2009-11-05 | Epicentre Technologies Corporation | Selective 5' ligation tagging of rna |
CN102076847A (zh) | 2008-05-02 | 2011-05-25 | Epi中心科技公司 | Rna多磷酸酶组合物、试剂盒及其应用 |
CN103689221B (zh) * | 2013-12-20 | 2015-10-28 | 大连赛姆生物工程技术有限公司 | 一种猫自主采食型植物源复合药效营养品及其制备方法 |
EP3947663A4 (en) * | 2019-04-05 | 2023-01-11 | The Broad Institute, Inc. | PSEUDO RANDOM DNA EDITOR FOR EFFICIENT AND CONTINUOUS NUCLEOTIDE DIVERSIFICATION IN HUMAN CELLS |
Family Cites Families (61)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL8200523A (nl) | 1982-02-11 | 1983-09-01 | Univ Leiden | Werkwijze voor het in vitro transformeren van planteprotoplasten met plasmide-dna. |
JPS59131909A (ja) | 1983-01-19 | 1984-07-28 | Nec Corp | 光記録ヘツド |
US5693489A (en) | 1984-03-30 | 1997-12-02 | Associated Universities, Inc. | Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase |
US4883750A (en) | 1984-12-13 | 1989-11-28 | Applied Biosystems, Inc. | Detection of specific sequences in nucleic acids |
US4797368A (en) | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4682195A (en) | 1985-09-30 | 1987-07-21 | General Electric Company | Insulated gate device with configured emitter contact pad |
US5139941A (en) | 1985-10-31 | 1992-08-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV transduction vectors |
US4946773A (en) | 1985-12-23 | 1990-08-07 | President And Fellows Of Harvard College | Detection of base pair mismatches using RNAase A |
US4800159A (en) | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
US4987071A (en) | 1986-12-03 | 1991-01-22 | University Patents, Inc. | RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods |
AU622104B2 (en) | 1987-03-11 | 1992-04-02 | Sangtec Molecular Diagnostics Ab | Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore |
IL86724A (en) | 1987-06-19 | 1995-01-24 | Siska Diagnostics Inc | Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences |
AU622426B2 (en) | 1987-12-11 | 1992-04-09 | Abbott Laboratories | Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization |
US5672344A (en) | 1987-12-30 | 1997-09-30 | The Regents Of The University Of Michigan | Viral-mediated gene transfer system |
ATE92538T1 (de) | 1988-01-21 | 1993-08-15 | Genentech Inc | Verstaerkung und nachweis von nukleinsaeuresequenzen. |
US4952500A (en) | 1988-02-01 | 1990-08-28 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Cloning systems for Rhodococcus and related bacteria |
CA1340807C (en) | 1988-02-24 | 1999-11-02 | Lawrence T. Malek | Nucleic acid amplification process |
US4932207A (en) | 1988-12-28 | 1990-06-12 | Sundstrand Corporation | Segmented seal plate for a turbine engine |
US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
US5082592A (en) | 1989-05-02 | 1992-01-21 | Betz Laboratories, Inc. | Corrosion inhibitors for ferrous metals in aqueous solutions comprising a nonionic surfactant and an anionic oxygen containing group |
WO1990014148A1 (en) | 1989-05-19 | 1990-11-29 | Fenn John B | Multiply charged ions and a method for determining the molecular weight of large molecules |
US5302523A (en) | 1989-06-21 | 1994-04-12 | Zeneca Limited | Transformation of plant cells |
US7705215B1 (en) | 1990-04-17 | 2010-04-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
US5550318A (en) | 1990-04-17 | 1996-08-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
US5322783A (en) | 1989-10-17 | 1994-06-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Soybean transformation by microparticle bombardment |
US5484956A (en) | 1990-01-22 | 1996-01-16 | Dekalb Genetics Corporation | Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin |
US5670488A (en) | 1992-12-03 | 1997-09-23 | Genzyme Corporation | Adenovirus vector for gene therapy |
US5384253A (en) | 1990-12-28 | 1995-01-24 | Dekalb Genetics Corporation | Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes |
AU2515992A (en) | 1991-08-20 | 1993-03-16 | Genpharm International, Inc. | Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs |
US5610042A (en) | 1991-10-07 | 1997-03-11 | Ciba-Geigy Corporation | Methods for stable transformation of wheat |
US5304487A (en) | 1992-05-01 | 1994-04-19 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Fluid handling in mesoscale analytical devices |
US5296375A (en) | 1992-05-01 | 1994-03-22 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Mesoscale sperm handling devices |
ATE398679T1 (de) | 1992-07-07 | 2008-07-15 | Japan Tobacco Inc | Verfahren zur transformation einer monokotyledon pflanze |
US5702932A (en) | 1992-07-20 | 1997-12-30 | University Of Florida | Microinjection methods to transform arthropods with exogenous DNA |
HUT70467A (en) | 1992-07-27 | 1995-10-30 | Pioneer Hi Bred Int | An improved method of agrobactenium-mediated transformation of cultvred soyhean cells |
US5639423A (en) | 1992-08-31 | 1997-06-17 | The Regents Of The University Of Calfornia | Microfabricated reactor |
GB9222888D0 (en) | 1992-10-30 | 1992-12-16 | British Tech Group | Tomography |
US5279721A (en) | 1993-04-22 | 1994-01-18 | Peter Schmid | Apparatus and method for an automated electrophoresis system |
AU7839594A (en) | 1993-09-20 | 1995-04-10 | Regents Of The University Of Colorado, The | Strategy for the production of rna from immobilized templates |
US5610287A (en) | 1993-12-06 | 1997-03-11 | Molecular Tool, Inc. | Method for immobilizing nucleic acid molecules |
US5547861A (en) | 1994-04-18 | 1996-08-20 | Becton, Dickinson And Company | Detection of nucleic acid amplification |
US5656610A (en) | 1994-06-21 | 1997-08-12 | University Of Southern California | Producing a protein in a mammal by injection of a DNA-sequence into the tongue |
US6613749B1 (en) | 1994-07-26 | 2003-09-02 | Imperial College Innovations Limited | Papovavirus pseudocapsids and use thereof for exogenous material transfer |
US5736524A (en) | 1994-11-14 | 1998-04-07 | Merck & Co.,. Inc. | Polynucleotide tuberculosis vaccine |
EP0803058B1 (en) | 1994-12-30 | 2008-11-05 | Georgetown University | Fluorometric assay for detecting nucleic acid cleavage |
US5856174A (en) | 1995-06-29 | 1999-01-05 | Affymetrix, Inc. | Integrated nucleic acid diagnostic device |
JP4191797B2 (ja) * | 1995-09-27 | 2008-12-03 | エモリー ユニバーシティー | 組み換えc型肝炎ウイルスrnaレプリカーゼ |
US6013516A (en) | 1995-10-06 | 2000-01-11 | The Salk Institute For Biological Studies | Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells |
US5780448A (en) | 1995-11-07 | 1998-07-14 | Ottawa Civic Hospital Loeb Research | DNA-based vaccination of fish |
US5945100A (en) | 1996-07-31 | 1999-08-31 | Fbp Corporation | Tumor delivery vehicles |
US5981274A (en) | 1996-09-18 | 1999-11-09 | Tyrrell; D. Lorne J. | Recombinant hepatitis virus vectors |
US5904824A (en) | 1997-03-07 | 1999-05-18 | Beckman Instruments, Inc. | Microfluidic electrophoresis device |
US5994624A (en) | 1997-10-20 | 1999-11-30 | Cotton Incorporated | In planta method for the production of transgenic plants |
US5994136A (en) | 1997-12-12 | 1999-11-30 | Cell Genesys, Inc. | Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors |
US6218145B1 (en) | 1998-04-02 | 2001-04-17 | Monsanto Company | Bacterial expression systems based on plastic or mitochondrial promoter combinations |
GB9818124D0 (en) | 1998-08-19 | 1998-10-14 | Glaxo Group Ltd | CD28 binding protein |
US6436703B1 (en) | 2000-03-31 | 2002-08-20 | Hyseq, Inc. | Nucleic acids and polypeptides |
US8312249B1 (en) | 2008-10-10 | 2012-11-13 | Apple Inc. | Dynamic trampoline and structured code generation in a signed code environment |
FR2957821B1 (fr) | 2010-03-24 | 2014-08-29 | Inst Francais Du Petrole | Nouvelle zone de regeneration du catalyseur divisee en secteurs pour unites catalytiques regeneratives |
-
2002
- 2002-05-22 US US10/153,219 patent/US7452705B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-05-22 JP JP2002592465A patent/JP4338402B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-05-22 WO PCT/US2002/016295 patent/WO2002095002A2/en active Application Filing
- 2002-05-22 EP EP02737107A patent/EP1399541A4/en not_active Withdrawn
- 2002-05-22 CA CA002448097A patent/CA2448097A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1399541A4 (en) | 2005-04-13 |
WO2002095002A3 (en) | 2003-11-13 |
JP2004533828A (ja) | 2004-11-11 |
CA2448097A1 (en) | 2002-11-28 |
US20030096349A1 (en) | 2003-05-22 |
WO2002095002A2 (en) | 2002-11-28 |
US7452705B2 (en) | 2008-11-18 |
EP1399541A2 (en) | 2004-03-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Henderson et al. | Cap 1 messenger RNA synthesis with co‐transcriptional cleancap® analog by in vitro transcription | |
US8137911B2 (en) | Preparation and use of single-stranded transcription substrates for synthesis of transcription products corresponding to target sequences | |
Gagliardi et al. | Polyadenylation accelerates the degradation of the mitochondrial mRNA associated with cytoplasmic male sterility in sunflower | |
EP1585824A2 (en) | Preparation and use of single-stranded transcription substrates for synthesis of transcription products corresponding to target sequences | |
EP3317424B1 (en) | Method for analysis of an rna molecule | |
US7838270B2 (en) | Target-dependent transcription using deletion mutants of N4 RNA polymerase | |
Ueda et al. | Phosphorothioate-containing RNAs show mRNA activity in the prokaryotic translation systems in vitro | |
US20080176293A1 (en) | RNA-Dependent RNA Polymerase, Methods And Kits For The Amplification And/Or Labelling Of RNA | |
WO2021041260A1 (en) | Enzymatic rna capping method | |
US20230080988A1 (en) | Chaotropic agents for reducing formation of double-stranded rna | |
JP4338402B2 (ja) | N4ウイルス一本鎖dna依存的rnaポリメラーゼ | |
Urban et al. | Cysteine tRNAs of plant origin as novel UGA suppressors | |
KR20220046693A (ko) | 효소학적 rna 캡핑 방법 | |
EP1242586B1 (en) | Rna polymerases from bacteriophage phi 6-phi 14 and use thereof | |
BR112020011605A2 (pt) | Dna polimerases | |
Cannon et al. | Partial purification and characterization of a DNA helicase from chloroplasts of Glycine max | |
Micol et al. | [15] Isolation and assay of mitochondrial transcription termination factor from human cells | |
CN115927246B (zh) | 一种具有高加帽效率的牛痘加帽酶突变体 | |
JP4329365B2 (ja) | 単一成分から成るトリ骨芽球症ウイルス逆転写酵素とその用途 | |
AU2002310067A1 (en) | N4 virion single-stranded DNA dependent RNA polymerase | |
EP3763811A1 (en) | Reverse transcriptase and uses thereof | |
CN117264921A (zh) | 一种rna聚合酶融合蛋白及其应用 | |
Heubeck et al. | Cyanelle Ribonuclease P: Isolation and Structure–Function Studies of an Organellar Ribonucleoprotein Enzyme | |
Barbone et al. | Yeast killer virus transcription initiation in vitro | |
US6309839B1 (en) | Screening methods for compounds that inhibit or stimulate helicase enzyme activity |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050509 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080520 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080804 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080811 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080916 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080924 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081020 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081114 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090213 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090306 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090312 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090319 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090414 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090605 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090630 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120710 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120710 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130710 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |