JP2003334095A - 単一成分から成るトリ骨芽球症ウイルス逆転写酵素とその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】ＡＭＶＲＴに含まれる各成分（αモノマー、α
βヘテロダイマー及びββホモダイマー）は、いずれも
逆転写活性を発現するが、ＲＮＡの増幅反応という観点
では、驚くべきことに、αβヘテロダイマーのみが活性
を発現し、他の成分は活性を発現しないことが明らかと
なった。 【解決手段】イオン交換クロマトグラフィーを用いる、
分子量６８０００のαサブユニットと分子量９２０００
のβサブユニットとからなるαヘテロダイマーと、前記
αサブユニットのモノマー及び／又は前記βサブユニッ
トのホモダイマーとを含むトリ骨芽球症ウイルス逆転写
酵素溶液から前記αβヘテロダイマーを製造する方法及
びそれにより製造される、ＲＮＡの増幅試薬として有効
な、その成分の８０％以上が分子量６８０００のαサブ
ユニットと分子量９２０００のβサブユニットとからな
るαβヘテロダイマーである、トリ骨芽球症ウイルス逆
転写酵素組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本願発明は、トリ骨芽球症ウ
イルス逆転写酵素組成物等に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（以
下「ＡＭＶＲＴ」という）は、トリ骨髄芽球症ウイルス
（ＡＭＶ）に感染した個体から精製し得る酵素であり、
分子生物学的研究や遺伝子の増幅反応に広く用いられて
いる。ＡＭＶに感染した固体から精製されたＡＭＶＲＴ
は、分子量６８０００のαサブユニット１分子からなる
αモノマー（αサブニットはβサブユニットが断片化し
て生じる）、αサブユニットと分子量９２０００のβサ
ブユニットの各１分子からなるヘテロダイマー（αβヘ
テロダイマー）及びβサブユニット２分子からなるホモ
ダイマー（ββホモダイマー）の三成分を含むことが知
られている。

【０００３】ＡＭＶＲＴの主要な酵素活性は逆転写活
性、即ちＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース活性であるた
め、従来からＡＭＶＲＴの活性は、ｐｏｌｙ（Ａ）・Ｏ
ｌｉｇｏ（ｄＴ）をテンプレート・プライマーとして用
い、３７℃で１０分間に１ｎｍｏｌのデオキシリボヌク
レオチドを酸沈殿画分に取り込ませる酵素量を１ユニッ
トとする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース活性を用い
て表現されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】近年では、被検試料中
の微量核酸を定性・定量し得る遺伝子診断が、特に感染
症等の疾病の早期発見と治療効果のモニタリング、輸血
用血液のスクリーニング、食品や環境のモニタリング等
のために広く使用されるようになっているが、ＡＭＶＲ
Ｔはかかる遺伝子診断の前提となる遺伝子の増幅反応に
も用いられている。

【０００５】ＡＭＶＲＴを用いる遺伝子の増幅反応に
は、一例を示せば、例えば、特許第２６５０１５９号公
報に記載されたいわゆるＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ）法や特表平４−５００７５９号公報
に記載されたいわゆるＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉ
ｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ）法、更には本出願人らが報告した特開２０００−１
４４００号公報記載のＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉ
ｏｎ−Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄｒｅａｃｔｉｏｎ）法がある。

【０００６】上記した増幅方法は、比較的低温かつ一定
温度という条件下で、いずれも転写反応を介在させて検
出しようとする核酸（標的ＲＮＡ）と相同又は相補的な
ＲＮＡコピーを生成するものである。具体的には、例え
ば、標的ＲＮＡに対して第一のＤＮＡプライマー（プロ
モーター部位を含む）を付着、伸長させてＤＮＡ−ＲＮ
Ａヘテロ二重鎖核酸を生成し、該ヘテロ二重鎖核酸中の
標的ＲＮＡを分解し、該分解後に残ったＤＮＡに対して
第二のＤＮＡプライマーを付着、伸長させてプロモータ
ー部位を含む二重鎖ＤＮＡを生成し、該二重鎖ＤＮＡか
ら標的ＲＮＡに相補的なＲＮＡコピーを生成する方法で
ある（ここで生成したＲＮＡコピーに対して前記第二の
ＤＮＡプライマーが付着、伸長してＤＮＡ−ＲＮＡヘテ
ロ二重鎖核酸が生成し、該ヘテロ二重鎖核酸中の標的Ｒ
ＮＡが分解された後に残ったＤＮＡに対して前記第一の
ＤＮＡプライマーが付着、伸長してプロモーター部位を
含む二重鎖ＤＮＡが生成し、該二重鎖ＤＮＡから標的Ｒ
ＮＡに相補的なＲＮＡコピーが生成される、という増幅
サイクルが成立する）。また具体的に例えば、標的ＲＮ
Ａに対して第一のＤＮＡプライマーを付着、伸長させて
ＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二重鎖核酸を生成し、該ヘテロ二
重鎖核酸中の標的ＲＮＡを分解し、該分解後に残ったＤ
ＮＡに対して第二のＤＮＡプライマー（プロモーター部
位を含む）を付着、伸長させてプロモーター部位を含む
二重鎖ＤＮＡを生成し、該二重鎖ＤＮＡから標的ＲＮＡ
と相同なＲＮＡコピーを生成する方法である（ここで生
成したＲＮＡコピーに対して前記第一のＤＮＡプライマ
ーが付着、伸長してＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二重鎖核酸が
生成し、該ヘテロ二重鎖核酸中の標的ＲＮＡが分解され
た後に残ったＤＮＡに対して前記第二のＤＮＡプライマ
ーが付着、伸長してプロモーター部位を含む二重鎖ＤＮ
Ａが生成し、該二重鎖ＤＮＡから標的ＲＮＡと相同なＲ
ＮＡコピーが生成される、という増幅サイクルが成立す
る）。なおこれら増幅方法における標的ＲＮＡは、上記
のような転写が介在する反応系によって生成されたＲＮ
Ａであっても制限はない。

【０００７】ＡＭＶＲＴは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメ
レース活性だけでなく、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレー
ス活性及びリボヌクレアーゼＨ活性を有している。上記
の増幅方法においては、ＡＭＶＲＴの主要活性であるＲ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース活性だけでなく、ＤＮＡ
依存性ＤＮＡポリメレース活性及びリボヌクレアーゼＨ
活性もまた重要となる。とりわけリボヌクレアーゼＨ活
性は、前記増幅方法から、温度上昇によるヘテロ二重鎖
の分離とその後の反応のための温度下降という操作を省
くために重要であり、ＲＮａｓｅＨ等を追加的に使用し
ない増幅方法においては、特に重要である。

【０００８】ところが、ＡＭＶＲＴの酵素活性が従来か
ら逆転写活性（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース活性）
で表現されていたことからも明らかなように、ＡＭＶＲ
Ｔに含まれる各成分については、逆転写活性のみが注目
され、その他の活性の観点からは何ら検討はされていな
い。即ち、ＡＭＶＲＴの逆転写活性はαモノマー、αβ
ヘテロダイマー及びββホモダイマーのいずれでも発現
することは知られているが、それ以外の活性については
何ら検討はされていないのである。

【０００９】かかる状況に鑑みて本願発明者らは、ＡＭ
ＶＲＴの各成分について鋭意検討を行ったところ、逆転
写活性は確かにはαモノマー、αβヘテロダイマー及び
ββホモダイマーのいずれもが発現するが、かかる成分
を単独で前記したような増幅方法用試薬として使用する
と、驚くべきことに、αβヘテロダイマーのみが有効
で、αモノマー成分又はββヘテロダイマーでは増幅反
応が進行しないことが明らかになった。

【００１０】そこで本願発明の第１の目的は、前記した
ようなＲＮＡ増幅方法に有効なＡＭＶＲＴを提供するこ
とにある。また本願発明の第２の目的は、かかるＡＭＶ
ＲＴの製造方法を提供することにある。そして本願発明
の第３の目的は、かかるＡＭＶＲＴを含む、前記のよう
な核酸増幅方法用試薬を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】前記第１の目的を達成す
るためになされた本願請求項１の発明は、その成分の８
０％以上が分子量６８０００のαサブユニットと分子量
９２０００のβサブユニットとからなるαβヘテロダイ
マーである、ＡＭＶＲＴ組成物である。本願請求項２の
発明は、請求項１の発明に係り、実質的に分子量６８０
００のαサブユニットと分子量９２０００のβサブユニ
ットとからなるαβヘテロダイマーのみからなることを
特徴とするＡＭＶＲＴ組成物である。

【００１２】前記第２の目的を達成するためになされた
本願請求項３の発明は、分子量６８０００のαサブユニ
ットと分子量９２０００のβサブユニットとからなるα
βヘテロダイマーと、前記αサブユニットのモノマー
（αモノマー）及び／又は前記βサブユニットのホモダ
イマー（ββホモダイマー）とを含むＡＭＶＲＴ溶液か
ら前記αβヘテロダイマーを製造する方法であり、該溶
液をイオン交換クロマトグラフィーに供することからな
る方法である。本願請求項４の発明は、前記請求項３の
発明に係り、前記イオン交換クロマトグラフィーがイオ
ン交換基としてＤＥＡＥ基を有するイオン交換体を用い
るイオン交換クロマトグラフィーであることを特徴とす
る。

【００１３】前記第３の目的を達成するためになされた
本願請求項５の発明は、標的ＲＮＡに対する第一のＤＮ
Ａプライマーの付着と伸長、該伸長によって生じるＤＮ
Ａ−ＲＮＡヘテロ二重鎖核酸中の標的ＲＮＡの分解、該
分解後に残るＤＮＡに対する第二のＤＮＡプライマーの
付着と伸長、該伸長によって生じる二重鎖ＤＮＡに基づ
く標的ＲＮＡ又は標的ＲＮＡと相補的ＲＮＡの転写、の
各反応からなる、前記標的ＲＮＡ又は標的ＲＮＡと相補
的ＲＮＡの増幅反応（ここで前記第一又は第二のＤＮＡ
プライマーのいずれかは、ＲＮＡ転写のためのプロモー
ター部位又は該部位の相補部位を有する）に用いる試薬
であって、前記請求項１のＡＭＶＲＴ組成物を含むこと
を特徴とする試薬である。

【００１４】以下、本願発明を詳細に説明する。本願発
明のＡＭＶＲＴ組成物は、ＡＭＶに感染した個体から得
たＡＭＶＲＴや市販されている天然由来のＡＭＶＲＴ試
薬（例えばＣＨＩＭＥＲｘ社、商品名；ＡＭＶ Ｒｅｖ
ｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、４０Ｕ／μ
ｌ）から製造することができる。遺伝子組換えで製造し
た現状のＡＭＶＲＴは、αモノマーのみからなるため、
本願発明のＡＭＶＲＴ組成物を製造するための原料とし
ては不適当である。

【００１５】本願発明のＡＭＶＲＴ組成物は、上記の市
販ＡＭＶＲＴ試薬等を原料として、液体クロマトグラフ
ィーを実施することで製造できる。液体クロマトグラフ
ィーは、使用するカラム（充填剤）の機械的強度等が十
分に確保できるのであれば、いわゆる高速液体クロマト
グラフィーを採用することが特に好ましい。

【００１６】液体クロマトグラフィーは、具体的にはエ
ーテルカラムを用いるものが例示できるが、充填剤とし
て例えばＤＥＡＥ基を有するイオン交換体を用いるイオ
ン交換クロマトグラフィーが特に好ましい。充填剤の基
材等には特に制限はなく、シリカ系、ポリマー系等のも
のが使用できるが、中でもペプチド等の吸着容量が大き
いものが好ましい。一方、充填剤を充填するカラムには
特に制限はなく、通常のステンレス、ポリエーテルエー
テルケトン又はガラス等を使用することができる。かか
る好適な市販充填剤充填済カラムとして、例えばＴＳＫ
ｇｅｌ ＤＥＡＥ−５ＰＷ（商品名、東ソー（株）製）
を例示することができる。

【００１７】本願発明のＡＭＶＲＴ組成物を製造するた
めの原料は、市販のＡＭＶＲＴを適当な緩衝液等に溶解
したＡＭＶＲＴ溶液である。溶解に使用する緩衝液等に
も特に制限はなく、例えば２０ｍＭリン酸カルシウム
（ｐＨ７．２）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．２
％）、ジチオスレイトール（以下ＤＴＴとする）（２ｍ
Ｍ）及びグリセロール（１０％）を含む緩衝液が例示で
きる。なおＤＴＴは、ＡＭＶＲＴの保護のために添加す
るものである。本願発明者らの知見によれば、ＡＭＶＲ
Ｔのαβヘテロダイマーは、２ｍＭ程度のＤＴＴではモ
ノマー化されない。またＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００はＡ
ＭＶＲＴのカラムへの吸着を防止するために添加するも
のである。本願発明者らの知見によれば、ＡＭＶＲＴの
αβヘテロダイマーは、０．２％程度のＴｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００ではモノマー化されない。

【００１８】上記のような緩衝液に溶解したＡＭＶＲＴ
をカラムに供した後、充填剤に保持されたＡＭＶＲＴを
溶出させる。ＡＭＶＲＴの溶出は、例えばカラムに供す
る緩衝液の塩濃度を段階的に又は連続的に上昇させるこ
とにより行うことができる。例えば前記したような緩衝
液（以下緩衝液Ａとする）をＡＭＶＲＴの溶解及び充填
剤への保持のために供した場合には、例えば２０ｍＭリ
ン酸カルシウム（ｐＨ７．２）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０（０．２％）、ＤＴＴ（２ｍＭ）、グリセロール（１
０％）及びＮａＣｌ（１Ｍ）を含む緩衝液（以下緩衝液
Ｂとする）を一定割合で混合して供することが例示でき
る。より具体的には、１ｍｌ／分程度の流速で、まず緩
衝液Ａを１５分程度供して充填剤に保持されない成分を
溶出させた後、２０分間に渡って緩衝液Ｂの割合を５０
％にまで徐々に増やし、その後１０分間に渡って緩衝液
Ｂの割合を１００％にまで徐々に増やし、そしてその後
１５分に渡って緩衝液Ｂのみを供してカラムを洗浄する
ことが例示できる。ここで、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
はＡＭＶＲＴのカラムへの吸着を防止するために添加す
るものである。

【００１９】以上のようなグラディエント溶出を行うこ
とにより、ＡＭＶＲＴの各成分は、αモノマー、αβヘ
テロダイマーそしてββホモダイマーの順に溶出する。
これらは全てＡＭＶＲＴの主要な酵素活性である逆転写
活性を有するが、各成分を用いて遺伝子の増幅反応に使
用するとαβヘテロダイマーのみが該反応を進行させる
ことができ、αモノマー及びββホモダイマーでは増幅
反応は進行しない。従って溶出液を一定量ずつフラクシ
ョンとして分取し、各フラクション中のαサブユニット
とβサブユニットの量比を確認して目的とするαβヘテ
ロダイマーの画分、即ち両者がほぼ１対１で存在する画
分を取得すれば良い。各フラクション中の各サブユニッ
トの量比の確認のためには、例えば各サブユニットを特
異的に認識し得る抗体を用いる酵素免疫測定（ＥＩＡ）
や、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施すれば良
い。ここでいう還元条件下とは、各フラクションから被
検液を取得し、例えばメルカプトエタノール等の強力な
還元剤を５％程度となるように添加したり、例えば９５
℃で５分間加熱する等してダイマーを強制的にモノマー
化できる程度のものであれば良い。なおＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによるαサブユニットとβサブユニットの量比確認に
おいては、泳動後のゲルを銀染色試薬等で染色した後に
デンシトメーター等を用いて各バンドの濃さを数値化す
ることが例示できる。

【００２０】本願発明の他のＡＭＶＲＴ組成物、即ち、
実質的にαβヘテロダイマーのみからなるＡＭＶＲＴ組
成物は、例えば上記のように製造されたＡＭＶＲＴ組成
物を、αサブユニットに対する抗体を固定化したアフィ
ニティー充填剤を充填したカラムとβサブユニットに対
する抗体を固定化したアフィニティー充填剤を充填した
カラムとに供することにより、製造することができる。

【００２１】以上の操作により、その成分の８０％以上
がαβヘテロダイマーであるＡＭＶＲＴ組成物や実質的
にαβヘテロダイマーのみからなるＡＭＶＲＴ組成物を
製造することができる。このようにして製造される本願
発明のＡＭＶＲＴ組成物は、例えば透析等の通常の方法
により濃縮することが可能であり、また一般的な酵素の
保存方法に従って保存することが可能である。

【００２２】

【発明の実施の形態】以下本願発明をさらに詳細に説明
するために実施例を示すが、本願発明はこれら実施例に
限定されるものではない。

【００２３】実施例１ ＡＭＶＲＴ組成物の製造 市販のＡＭＶＲＴ試薬（ＣＨＩＭＥＲｘ社製、商品名；
ｎａｔｉｖｅ、４０Ｕ／μｌ）５００μｌを下記緩衝液
Ａ（４．５ｍｌ）で希釈した。

【００２４】緩衝液Ａ（濃度はすべて終濃度） ２０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．２） ２ｍＭ ジチオスレイトール ０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ １０％ グリセロール市販のイオン交換クロマトグラフ
ィー用カラム（東ソー（株）製、商品名；Ｄ ＥＡＥ−５ＰＷ、７．５ｍｍＩＤ×７．５ｃｍ）に前記
希釈したＡＭＶＲＴ溶液を供した後、４℃にて下記緩衝
液Ｂを供し、溶出時間に従って１分毎に１ｍｌづつ、６
０のフラクションを取得した。なおグラディエントの条
件は以下の通りであり、緩衝液の流速は１ｍｌ／分であ
る。

【００２５】緩衝液Ｂ（濃度はすべて終濃度） ２０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．２） ２ｍＭ ジチオスレイトール ０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ １０％ グリセロール １Ｍ ＮａＣｌ グラジエント条件 ０〜１５分まで：緩衝液Ａ １００％ １５〜３５分まで：緩衝液Ａ １００％から、緩衝液Ａ
５０％＋緩衝液Ｂ５０％のグラディエント ３５〜４５分まで：緩衝液Ａ ５０％＋緩衝液Ｂ ５０
％から、緩衝液Ｂ１００％のグラディエント ４５〜６０分まで：緩衝液Ｂ １００％ 次に、各フラクション中のαサブユニットとβサブユニ
ットの量比を確認するために、還元条件下でのＳＤＳ−
ＰＡＧＥを実施した。

【００２６】まず、各フラクションから被検液を５μｌ
ずつ取得し、下記のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル緩衝液
５μｌを加え、９５℃で５分加熱した後、市販の１０％
泳動ゲル（アトー（社）製、商品名；ｅ・パジェル、型
式；Ｅ−Ｒ１０Ｌ、９０ｍｍ（Ｗ）×７３ｍｍ（Ｈ）×
１ｍｍ（ｔ））に７μｌずつ供して３０ｍＡで泳動し
た。なお泳動用緩衝液は以下の通りである。

【００２７】サンプル緩衝液 ０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８） ２０％ ＳＤＳ ５０％ グリセロール ０．０５％ ブロムフェノールブルー 泳動用緩衝液（以下を蒸留水で１リットルに調整したも
の） ３．０ｇ Ｔｒｉｓ−塩酸 １４．４ｇ グリシン １．０ｇ ＳＤＳ 泳動後のゲルを、市販の銀染色試薬（第一化学薬品
（株）製、商品名；第一）により染色した。染色後のゲ
ルの様子を図１に示す。また染色後のゲルをデンシトメ
ーター（アトー（株）製、商品名；Ｄｅｎｓｉｔｏｇｒ
ａｐｈ ＬａｎｅＡｎａｌｙｚｅｒ）に供し、αサブユ
ニットとβサブユニットの量比を確認した。その結果、
フラクション４〜１６及び２６〜２８にはαモノマー
が、フラクション３０〜３４にαβヘテロダイマーが、
そしてフラクション３６〜５８にはββホモダイマーが
溶出した。各フラクションのデンシトメーターでの測定
結果（αサブユニットのバンドの濃さ：βサブユニット
のバンドの濃さ）は、フラクション４〜１６では１：
０、フラクション２６〜２８では１：０、フラクション
３０〜３４では５５：４５、フラクション３６〜５８で
は１６：８４であった。以上の通り、本実施例によりα
モノマー、αβヘテロダイマー、ββホモダイマーをそ
れぞれ製造することができた。フラクション３０〜３４
（αβヘテロダイマーのフラクション）はデンシトメー
ターでの測定結果が５５：４５であった。デンシトメー
ターでの解析結果は、このフラクションはその成分の８
０％以上がαβヘテロダイマーであり、αモノマーとβ
βホモダイマーの合計が２０％以下であることを示す。 実施例２ ＲＴ活性の測定 実施例１で用いたＡＭＶＲＴ試薬を水で希釈して、各種
濃度（３０Ｕ／μｌ、１０Ｕ／μｌ、３Ｕ／μｌ、１Ｕ
／μｌ、０．１Ｕ／μｌ）のＡＭＶＲＴ溶液を調製し
た。前記各濃度のＡＭＶＲＴ溶液（それぞれ５μｌ）を
下記組成の反応溶液（２０μｌ）を３７℃で１０分間イ
ンキュベーションした。

【００２８】反応溶液（濃度はすべて終濃度） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３） ４０ｍＭ ＫＣｌ ８．７５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ １０ｍＭ ジチオスレイトール ０．１％牛血清アルブミン ２５０ｍＭ Ｐｏｌｙ（Ａ）（ファルマシア社製） ５ｍＭ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）３０ １ｍＭ Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅ（ＴＴＰ） ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ ［ｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ］（第
一化学薬品（株）製） 次に混合液（ＴＥ ８０μｌ、Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ３μ
ｌ、７．５Ｍ アンモニウムアセテート ５０μｌの混
合液）１３３μｌを加え、１００％エタノール３７５μ
ｌを添加し、−２０℃で３０分静置した。４℃、１５０
００ｒｐｍ（回転半径７ｃｍ）で１０分間遠心後、上清
を注意深く除去し、７０％エタノールを５００μｌ添加
し、再び４℃、１５０００ｒｐｍ（回転半径７ｃｍ）で
１０分間遠心後、上清を注意深く除去した。これをＴＥ
１００μｌに懸濁し、全量をシンチレーションカウン
ターで測定し、検量線を作成した。なお、ＴＥとは１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ
ＥＤＴＡである。

【００２９】続いて、ＡＭＶＲＴ溶液として実施例１で
製造した各フラクション５μｌを、上記と同じ処理を行
った後、その全量についてシンチレーションカウンター
で測定し、上記のようにして作成した検量線から各フラ
クションの逆転写活性を求めた。結果を図２に示す。図
２から明らかなように、フラクション２６〜４４の全
て、即ちαモノマー、αβヘテロダイマー及びββホモ
ダイマーの何れのフラクションにおいても逆転写活性が
認められた。

【００３０】実施例３ ＲＮＡ増幅活性の測定 特開２００１−３５３０００号公報に記載した方法に従
い、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌ
ｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｉｔａｎｔ Ｓｔｅｐｈｙｒｏｃｏ
ｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ、以下ＭＲＳＡとする）のｍｅ
ｃＡ遺伝子に由来するＲＮＡ（以下ｍｅｃＡ−ＲＮＡと
する）を標的とした増幅反応を行った。なお本実施例で
いうｍｅｃＡ−ＲＮＡとは、ｍｅｃＡの塩基配列を含む
２本鎖ＤＮＡを鋳型としたインビトロ転写により合成、
精製されたＲＮＡである。 （１）ＭＲＳＡが産生する細胞壁合成蛋白質ＰＢＰ−
２’をコードするｍｅｃＡ−ＲＮＡの塩基番号１〜２０
１３（ＲＮＡの塩基番号は松橋ら「ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔ．２２１、１６７〜１７１（１９８７）」に従った）
を含む標準ＲＮＡ（２０１６ｍｅｒ）を試料とし、２６
０ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉ
ｔｏｒ、５．０ｍＭ ＤＴＴ）を用い１．０×１０³コ
ピー／２．５μｌとなるよう希釈した。コントロール試
験区（Ｎｅｇａ）には希釈液のみを用いた。なお初期Ｒ
ＮＡ量は１０³コピー／試験である。 （２）以下の組成の反応液２３．３μｌを０．５ｍｌ容
ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａ
ｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエ
ルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料２．５μｌ
を添加した。

【００３１】反応液の組成（濃度は酵素溶液添加後の反
応系の最終濃度） ６０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐH８．６） １３．０ｍＭ 塩化マグネシウム ９０．０ｍＭ 塩化カリウム １．０ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ 各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ ２．２５ｍＭ ＧＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各１．０μＭの第一のプライマー（配列番号１）と第二
のプライマー（配列番号２） ０．１６μＭの切断用オリゴヌクレオチドプローブ（配
列番号３、標的ＲＮＡを第一のプライマーが結合し得る
位置で切断するためのオリゴヌクレオチド、３’末端は
アミノ化してある） ２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識された
オリゴヌクレオチド（配列番号４、なおインターカレー
ター性蛍光色素は、配列番号４のオリゴヌクレオチドに
おける５’端６番目の「Ｇ」と７番目の「Ａ」の間に標
識されており、またその３’末端の水酸基はグリコール
基で修飾されている。特許第３１８９０００号公報参
照。） ３９Ｕ リボヌクレエース インヒビター（宝酒造
（株）製） １５．０％ ＤＭＳＯ 容量調製用蒸留水 （３）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、液量３０
μｌあたり実施例１で製造した各フラクションのＡＭＶ
ＲＴ溶液５μｌを含む、以下の組成の予め４１℃で２分
間保温した酵素液４．２μｌを添加した。

【００３２】酵素液の組成（反応時の再終濃度） １．７％ ソルビトール １４２ユニット Ｔ７ ＲＮＡポリメレース （ＧＩＢ
ＣＯ社製） ３μｇ 牛血清アルブミン 容量調製用蒸留水 ＰＣＲチューブを、温調を行いつつチューブ内の反応液
について蛍光強度を測定可能に構成した装置（特開２０
００−２１４０９０号公報参照）を用いて、反応液を４
１℃で保温しつつ、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１
０ｎｍでの蛍光測定を酵素液添加時の時刻を０分とし
て、反応液からの蛍光増加比（所定時刻の蛍光強度値÷
バックグラウンドの蛍光強度値）の経時変化を測定し
た。結果を図３に示す。

【００３３】図３より、フラクション３０〜３４に蛍光
強度の増加が観測され、当該フラクションに含まれるα
βヘテロダイマーのみが、上記のＲＮＡ増幅反応を有効
に進め得ること、即ち逆転写活性のみならず、少なくと
もリボヌクレアーゼＨ活性を有することが確認された。
一方その他のフラクションではＲＮＡ増幅反応は進行し
なかった。

【００３４】実施例４ 濃縮とＲＮＡ増幅活性の測定 実施例１で製造したαβヘテロダイマーを含むフラクシ
ョン（フラクション３０〜３４）を以下の２種類の方法
で濃縮した。

【００３５】まず第１の方法として、フラクション３０
〜３４を混合液１．３ｍｌを透析チューブ（ＳＰＥＣＴ
ＲＡ／ＰＯＲ、スペクトラムメディカルインダストリー
ズ社製）に入れ、４℃で外液（２０ｍＭリン酸カリウム
（ｐＨ７．２）、２ｍＭジチオスレイトール、０．２％
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）５００ｍｌに対し３時間透析
した。外液を新液と交換後、更に１０時間透析した。透
析後で残ったフラクション混合液は濃縮器（商品名；セ
ントリコン３０、ミリポア社製）で２５μｌまで濃縮し
た。濃縮後、保存のためにグリセロールを終濃度５０％
となるように添加した。以下、このようにして製造した
αβヘテロダイマーを含む溶液を濃縮液１とする。

【００３６】次に、第２の方法として、前記混合液の
１．３ｍｌを透析チューブ（ＳＰＥＣＴＲＡ／ＰＯＲ、
スペクトラムメディカルインダストリーズ社製）に入
れ、４℃で外液（２ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．
２）、０．２ｍＭジチオスレイトール、０．０２％Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ−１００、０．０１Ｍトレハロース）５００
ｍｌに対し３時間透析した。外液を新液と交換後、更に
１０時間透析した。透析後で残ったフラクション混合液
は濃縮器（商品名；セントリコン３０、ミリポア社製）
で１３０μｌまで濃縮した。濃縮後、保存のためにグリ
セロールを終濃度５０％となるように添加した。以下、
このようにして製造したαβヘテロダイマーを含む溶液
を濃縮液２とする。

【００３７】上記のようにして製造した濃縮液１及び濃
縮液２を実施例３と同様のｍｅｃＡ−ＲＮＡの増幅に使
用した。ただし実施例３において使用したＡＭＶＲＴに
代えて濃縮液１又は濃縮液２を反応液３０μｌあたり
０．２５μｌ使用した。結果を図４に示す。図４から明
らかなように、濃縮液１又は濃縮液２のいずれを用いて
もＲＮＡを増幅することができた。

【００３８】

【発明の効果】従来のＡＭＶＲＴは、その主要活性であ
る逆転写活性、即ちＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース活
性に基づいて酵素量（ユニット）が表現されている。従
って、従来のようにαモノマー、αβヘテロダイマー及
びββホモダイマーの三成分を含むＡＭＶＲＴを前記ユ
ニットに基づいて所定量使用したとしても、先に説明し
たような遺伝子の増幅反応に真に寄与するＡＭＶＲＴの
量を一定にすることは不可能である。またＡＭＶＲＴの
製造ロットや購入先によってαモノマー、αβヘテロダ
イマー及びββホモダイマーの三成分の含有比率が変動
する可能性が大きいが、これらの含有比率の変動に従っ
てＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース活性、ＤＮＡ依存性
ＤＮＡポリメレース活性又はリボヌクレアーゼＨ活性の
比が変動するとなれば、たとえ同一ユニットの酵素量を
使用したとしても増幅反応の効率が異なり、かかる増幅
反応を利用する遺伝子の定性・定量も影響を受けること
が容易に予想される。

【００３９】従って本願発明で提供されるＡＭＶＲＴ組
成物を用いることにより、添加するＡＭＶＲＴ組成物当
たりの増幅効率を向上して、より少量のＡＭＶＲＴを使
用することで従来と比較して同等の遺伝子増幅を達成す
ることが可能となり、また同時に、より厳密な意味で、
遺伝子の増幅反応条件を均一化して異なるロットのＡＭ
ＶＲＴを使用した場合の定性・定量結果の比較を容易な
らしめることが可能となる。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TOSOH Corporation <120> 単一成分から成るトリ骨芽球症ウイルス逆転写酵素とその用途 <130> PA211-1013 <150> JP2002-071841 <151> 2002-02-15 <160> 4 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー <400> 1 caactaacta ttgatgctaa agttcaaa 28 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー <400> 2 ttctttttta tcttcggtta 20 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プローブ <400> 3 gttagttgaa tatctttgcc atcttttttc tttttctct 39 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Art <220> <223> インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド <400> 4 tgtttgaggg tggatagcag 20

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例１の電気泳動の結果を示す図で
あり、電気泳動用ゲルを銀染色した様子を示すものであ
る。フラクション２〜６０の偶数フラクションを泳動し
た。レーンＭは分子量マーカーであり、ＡＭＶ ８Ｕは
精製前のＡＭＶＲＴである。

【図２】図２は、実施例２のＲＴ活性測定結果である。
フラクション１０〜５０の偶数フラクションの活性を測
定した。

【図３】図３は、実施例３のＴＲＣ反応の結果である。
フラクション２０〜４８の偶数フラクションの活性を測
定した。

【図４】図４は、実施例４に示す方法で得られたαβヘ
テロダイマー濃縮物のＴＲＣ反応の結果である。図中、
αβ体濃縮物１は濃縮物液１を、αβ体濃縮物２は濃縮
液２をそれぞれ示す。陰性対照はＲＮＡを添加せずにＴ
ＲＣ反応を行ったものである。なお初期ＲＮＡ量１０³
コピー／試験である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA05 CA09 CA11 HA03 HA08 4B050 CC07 DD20 FF11C LL03 4B063 QA01 QA13 QQ52 QR07 QR08 QR14 QR42 QR43 QR46 QR50 QR55 QS12 QS25 QS34 QX02 QX07

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】その成分の８０％以上が、分子量６８００
   ０のαサブユニットと分子量９２０００のβサブユニッ
   トとからなるαβヘテロダイマーである、トリ骨芽球症
   ウイルス逆転写酵素組成物。
2. 【請求項２】実質的に、分子量６８０００のαサブユニ
   ットと分子量９２０００のβサブユニットとからなるα
   βヘテロダイマーのみからなることを特徴とする、請求
   項１のトリ骨芽球症ウイルス逆転写酵素組成物。
3. 【請求項３】分子量６８０００のαサブユニットと分子
   量９２０００のβサブユニットとからなるαβヘテロダ
   イマーと、前記αサブユニットのモノマー及び／又は前
   記βサブユニットのホモダイマーとを含むトリ骨芽球症
   ウイルス逆転写酵素溶液から前記αβヘテロダイマーを
   製造する方法であり、該溶液をイオン交換クロマトグラ
   フィーに供することからなる、方法。
4. 【請求項４】前記イオン交換クロマトグラフィーが、イ
   オン交換基としてＤＥＡＥ基（ジエチルアミノエチル）
   基を有するイオン交換体を用いるイオン交換クロマトグ
   ラフィーであることを特徴とする、請求項３の製造方
   法。
5. 【請求項５】標的ＲＮＡに対する第一のＤＮＡプライマ
   ーの付着と伸長、該伸長によって生じるＤＮＡ−ＲＮＡ
   ヘテロ二重鎖核酸中の標的ＲＮＡの分解、該分解後に残
   るＤＮＡに対する第二のＤＮＡプライマーの付着と伸
   長、該伸長によって生じる二重鎖ＤＮＡに基づく標的Ｒ
   ＮＡ又は標的ＲＮＡと相補的ＲＮＡの転写、の各反応か
   らなる、前記標的ＲＮＡ又は標的ＲＮＡと相補的ＲＮＡ
   の増幅反応（ここで前記第一又は第二のＤＮＡプライマ
   ーのいずれかは、ＲＮＡ転写のためのプロモーター部位
   を有する）に用いる試薬であって、請求項１のトリ骨芽
   球症ウイルス逆転写酵素組成物を含むことを特徴とす
   る、試薬。