JP4871881B2 - cRNAの調製方法 - Google Patents
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Description
(a)逆転写反応により調製されたmRNA−cDNAハイブリッドをRNaseHで処理して一本鎖cDNAを調製するための反応、及び前記一本鎖cDNAから二本鎖cDNAを調製するための反応を行った後、反応液に含まれるRNaseHを失活させる工程
(b)前記反応液と、カチオン性基を表面に有する固体支持体とを、前記カチオン性基が正に帯電するpH条件下で接触させる工程
(c)前記反応液から前記固体支持体を分離する工程
(d)前記固体支持体から二本鎖cDNAを溶離させる工程
(e)前記二本鎖cDNAからcRNAを調製するための転写反応を行う工程
工程(a)は、逆転写反応により調製されたmRNA−cDNAハイブリッドをRNaseHで処理して一本鎖cDNAを調製するための反応、及び前記一本鎖cDNAから二本鎖cDNAを調製するための反応を行った後、反応液に含まれるRNaseHを失活させる工程である。
工程(b)は、前記反応液と、カチオン性基を表面に有する固体支持体とを、前記カチオン性基が正に帯電するpH条件下で接触させる工程である。
工程(b)は、工程(a)の後に行われる。
カチオン性基が正に帯電するpHは、カチオン性基の種類に応じて異なるが、通常pH6.0以下、好ましくはpH5.0である。pHの調整は、リン酸、酢酸、クエン酸等の弱酸を用いて行うことができる。
工程(c)は、前記反応液から前記固体支持体を分離する工程である。
工程(c)は、工程(b)の後に行われる。
工程(d)は、前記固体支持体から二本鎖cDNAを溶離させる工程である。
工程(d)は、工程(c)の後に行われる(但し、工程(c)の後に固体支持体を洗浄する場合、工程(d)は当該洗浄の後に行われる)。
固体支持体からの二本鎖cDNAの溶離は、例えば、固体支持体をpH8.0以上に調整したバッファー(Tris−HCl等)等のアルカリで処理し、固体支持体の表面に存在するカチオン性基を電気的に中性に戻すことにより行うことができる。
工程(e)は、前記二本鎖cDNAからcRNAを調製するための転写反応を行う工程である。
二本鎖cDNAからcRNAを調製するための転写反応は常法に従って行うことができる。転写反応には、例えば、in vitro転写系を使用することができる。in vitro転写反応としては、例えば、チューブ内にビオチン化したUTPをdNTPミックスとともに精製したcDNAに加え、さらにT7 RNAポリメラーゼを加え、転写反応をチューブ内で行う方法等が挙げられる。in vitro転写系を用いた転写反応における反応温度は、通常35〜40℃、好ましくは37℃であり、反応時間は通常4時間〜16時間、好ましくは14時間である。転写反応においてcRNA合成の基質として、ATP、UTP、CTP、GTP等のNTPが用いられる。
(1)二本鎖cDNAの調製
逆転写反応を利用して二本鎖cDNAの調製を行った。
逆転写反応は、CodeLink Expression Bioarray System(CodeLink Expression Bioarray System Kit 24反応分,GEヘルスケア/アマシャム・バイオサイエンス社製 Cat.320012)を使用して行い、作業手順は、CodeLink USER GUIDE Rev.2004−09 ver1.2を参照した。
逆転写反応により調製した二本鎖cDNAの精製には、サンプルと等量の有機溶媒(フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール=25:24:1)を加え、核酸を水層中に分離し、酢酸アンモニウム及びエタノールで洗浄した後、Nuclease−Free滅菌水にて抽出する方法が広く一般的に行われているが、方法1では、CodeLink USER GUIDE Rev.2004−09 ver1.2を参照して、QIAquick PCR Purification Kit(QIAquick PCR Purification Kit,QIAGEN社製,Cat.No.28104/28106)を使用して逆転写反応により調製した二本鎖cDNAの精製を行った。また、方法2では、自動化による簡便性及びサンプル間汚染防止を達成するために、磁性体粒子試薬であるCST PCR Purification Kit(CST PCR Purification Kit,Invitrogen社(販売元)/DRI社製,Cat.CS12000)及び自動核酸抽出機Magtration System−12GC(以下「12GC」という)(プレシジョン・システム・サイエン社製,Cat.A1006)を使用し、逆転写反応による二本鎖cDNAの精製を行った。
逆転写反応により調製した二本鎖cDNA溶液に対し、5倍量のBuffer PBを添加し、ピペッティングでよく混合した後、Buffer PBと混合した二本鎖cDNA溶液(cDNA/Buffer PB溶液)を、キット付属の2mL遠心チューブにセットしたQIAquickスピンカラムに注入した。cDNA/Buffer PB溶液を注入した後、QIAquickスピンカラムを10000×gで60秒間遠心処理した。cDNA/Buffer PB溶液を添加したQIAquickスピンカラムを遠心処理した後、QIAquickスピンカラムを通過し、2mL遠心チューブ内に残った溶液を除去し、再びQIAquickスピンカラムを搭載した。700μLのBuffer PEをQIAquickスピンカラムに添加し、10000×gで60秒間遠心処理を行った。Buffer PE溶液を添加したQIAquickスピンカラムを遠心処理した後、QIAquickスピンカラムを通過し、2mL遠心チューブ内に残った溶液を除去し、再びQIAquickスピンカラムを搭載した。再度、10000×gで60秒間で遠心処理を行った。遠心処理後、QIAquickスピンカラムを新しい1.5mLチューブに搭載し、30μLのNuclease−Free滅菌水をスピンカラム内のメンブレンに添加し、60秒間静置した後、10000×gで60秒間遠心処理を行った。さらに再度30μLのNuclease−Free滅菌水をスピンカラム内のメンブレンに添加し、30〜60秒間、好ましくは60秒間静置した後、10000×gで60秒間遠心処理を行い、総量60μLの二本鎖cDNA溶液を確保した。
12GC専用の試薬カートリッジの所定のウェルに、100μLのPurification Buffer(ウェル1)、20μLのCST Magnetic Beads(ウェル2)、700μLのWash Buffer 1(100mM 硫酸アンモニウム)(ウェル3)、700μLのWash Buffer 2(50mM 塩化マグネシウム)(ウェル4)、700μLのWash Buffer 3(Nuclease−Free滅菌水)(ウェル5)、及び100μLのElution Buffer(10mM Tris−HCl、pH8.5)(ウェル6)を搭載した後、12GC用プロトコールに従い、逆転写反応により調製した二本鎖cDNAの精製を実施した。12GCによるcDNAの精製工程は以下の通りである。
cRNA合成(In Vitro Transcription,IVT)前のサンプル調製には、cDNA量が極力少なくなるように精製を行い、そのままの量のcDNAをcRNAの合成試薬と混合する方法が現在最も広く行われており、本実施例でもこの方法を使用した。cDNA精製量は通常10〜30μLであるが、本実施例では60μLにて精製を完了し、精製物を遠心濃縮器にて10μL程度に濃縮し、次工程(cRNA合成)に使用した。遠心濃縮器としてはDNAプチVac(WAKENYAKU社製,Cat.PV1200)を使用した。条件は、1800〜2000rpm、0.06Mpa及び55℃に設定し、この条件により約25分で60μLの溶液を10μLほどに濃縮した。
in vitro転写反応によるcRNAの調製には、精製した二本鎖cDNAを、transcription buffer(Ambion)、rNTPミックス(T7 ATP,T7 GTP,T7 CTP,T7 UTP/各25mM)、100mM DTT、RNase Inhibitor(Ambion)、10mM Biotin−11−UTP、及び2500U/μL T7 RNA Polymeraseに添加し、37℃で4〜一晩(約16時間)(好ましくは14時間)で処理する方法が広く一般的に行われているが、本実施例では、CodeLink USER GUIDE Rev.2004−09 ver1.2のQIAquick PCR Purification Kit(QIAquick PCR Purification Kit,QIAGEN社製,Cat.No.28104/28106)の手順に従い、以下の通りに行った。
cRNAの精製は以下の方法3又は4によって行った。
[方法3]
まずIVT反応液にNuclease−Free滅菌水を加えて100μLにし、350μLのBuffer RLTを添加してよく混合した。混合後、250μLの100%エタノールを添加してさらによく混合した。混合後、全量又は半分量をRNeasyミニスピンカラムに添加して8000×g前後で15秒間〜30秒間ほど遠心処理を行った。遠心後、RNeasyミニスピンカラムを通過し、2mL遠心チューブ内に残った溶液を除去した。半分量を添加した場合は同工程をもう一度行った。500μLのBuffer RPEをRNeasyミニスピンカラムに添加し、8000×gで15秒間遠心処理を行った。遠心後、RNeasyミニスピンカラムを通過し、2mL遠心チューブ内に残った溶液を除去し、再度500μLのBuffer RPEをRNeasyミニスピンカラムに添加し、8000×gで15秒間遠心処理を行った。遠心後、RNeasyミニスピンカラムを通過し、2mL遠心チューブ内に残った溶液を除去した。溶液除去後、ミニスピンカラムを遠心処理により乾燥させるため、再度遠心器に搭載し、8000×gで2分間遠心処理を行った。エタノール溶液が十分に蒸発したことを確認した上で、50μLのNuclease−Free滅菌水をRNeasyミニスピンカラムのメンブレンに添加し、10分間静置した後、8000×gで1分間遠心処理を行い、再度、50μLのNuclease−Free滅菌水をRNeasyミニスピンカラムのメンブレンに添加し、10分間静置した後、8000×gで1分間遠心処理を行い、最終的に100μLのcRNA溶液を確保した。
磁性体粒子試薬であるMagaZorb RNA Mini-Prep Kit(Cortex社製,Cat.MB2001,MB2004,MB2008)及び自動核酸抽出機Magtration System−12GC(プレシジョン・システム・サイエン社製,Cat.A1006)を使用して、in vitro転写反応により二本鎖cDNAから合成されたcRNAの精製を行った。
12GC専用の試薬カートリッジの所定のウェルに、300μLのBinding Buffer(ウェル1)、40μLのMagaZorb Reagent(Magnetic Beads)(ウェル2)、1000μLのWash Buffer 1(ウェル3)、1000μLのWash Buffer 2(Wash Buffer 1を1/2に希釈)(ウェル4)、100μLのElution Buffer(Nuclease−Free滅菌水)(ウェル5)を搭載した後、12GC用プロトコールに従って、in vitro転写反応により二本鎖cDNAから合成されたcRNAの精製を実施した。12GCを用いたcRNAの精製工程は以下の通りである。
精製cRNAの濃度及び収量を以下のように算出した。精製cRNA 2μLにNuclease−Free滅菌水 98μLを添加して全量100μL(50倍希釈)とし、100μLのうち60μLをガラス・セルに添加し、分光光度計DU530 Life SCIENCE UV/Vis Spectrophotometer (Beckman Coulter社製,Cat.DU530)を用いて220nmから320nmの間における吸光度を測定した。260nm及び280nmにおける吸光度が0.15以下の場合は希釈率を20倍に下げて同様の操作を行った。cRNAの濃度は260nmにおける吸光度値から以下のように計算した。なお、320nmにおける吸光度値で260nmにおける吸光度値を補正してから上記計算式からcRNA濃度を算出した。
cRNA濃度(μg/mL)=260nmにおける吸光度値×希釈率×10/セル光路長(mm)×40(μg/mL)
なお、光路長10mmのセルを用いて260nmにおける吸光度値=1の時、cRNA濃度は40μg/mLとなる。また、今回の方法では希釈率は50となる。
精製cRNAの純度を以下のように算出した。精製cRNA 2μLに100mM Tris−HCl(pH7.5)98μLを添加して全量100μL(50倍希釈)とし、100μLのうち60μLをガラス・セルに添加し、分光光度計DU530 Life SCIENCE UV/Vis Spectrophotometer (Beckman Coulter社製,Cat.DU530)を用いて220nmから320nmの間における吸光度を測定した。260nm及び280nmにおける吸光度が0.15以下の場合は希釈率を20倍に下げて同様の操作を行った。cRNAの純度は、320nmにおける吸光度値で260nmにおける吸光度値を補正した後、260nm/280nmの吸光度比から計算した。
方法1及び3を組み合わせた従来法(スピン・カラム法)とともに、方法1及び方法4を組み合わせた自動精製法(磁性体粒子法)の変法を実施し、精製cRNAの純度、濃度、収量及びサンプル分布図を測定した。
試験例2の結果を踏まえ、方法1及び3を組み合わせた従来法(スピン・カラム法)とともに、方法2及び方法3を組み合わせた自動精製法(磁性体粒子法)の変法を実施し、精製cRNAの純度、濃度、収量及びサンプル分布図を測定した。
試験例3の結果を踏まえ、方法1及び3を組み合わせた従来法(スピン・カラム法)とともに、方法2、方法1及び方法3を組み合わせた自動精製法(磁性体粒子法)の変法(方法2による二本鎖cDNAの精製の後、さらに方法1による二本鎖cDNAの精製を行う)を実施し、精製cRNAの純度、濃度、収量及びサンプル分布図を測定した。
簡便かつ効率よくRNaseHを変性するために、二本鎖cDNA合成時に各試薬に還元剤として配合されている0.1MのDTTに着目した。一般的に60〜70℃(好ましくは65℃)で10分間保温すると、DTTの働きによりRNaseHを変性又は失活させることが可能である。
(1)cRNAの調製
実施例1に準じ、方法1及び3を組み合わせた従来法(スピン・カラム法)とともに、方法2及び方法4を組み合わせた自動精製法(磁性体粒子法)を実施した。自動精製法(磁性体粒子法)においては、実施例5に準じ、方法2により二本鎖cDNAを精製する前にサンプルを65℃で10分間保温することにより、サンプル中に含まれるRNaseを変性又は失活させた。
なお、総RNAとしては、Rat Liver Total RNA(Ambion社製,Cat.7910)の代わりに、Human Kidney Total RNA(Ambion社製,Cat.7976)を使用した(総RNAの使用量:2μg)。また、増幅用試薬としては、MessageAmp II Biotin Enhanced(Ambion社製,Cat.1791)を使用した(IVT時間:4時間)。
eukaryotic GeneChipプローブアレイを用いたサンプルM、A1及びA2の測定は、GeneChip Expression Analysis Technical Mannual(AFFYMETRIX社)に従って行った。すなわち、cRNAサンプルを約35〜200塩基長に断片化した後、pre−Hybridization bufferをeukaryoticGeneChipプローブアレイにインサートし、プレハイブリダイゼーションを行った。プレハイブリダイゼーション後、断片化したcRNAサンプルをプローブアレイにインサートし、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、cRNAサンプルがインサートされたアレイをFluidics Station 400/450に搭載し、アレイを洗浄した後、蛍光固定化を行い、GeneArray Scaner又はGenechip scanner 3000によりシグナルを読み取った。測定結果を図9に示す。
Claims (7)
- 下記工程(a)〜(e)を含むことを特徴とするcRNAの調製方法。
(a)逆転写反応により調製されたmRNA−cDNAハイブリッドをRNaseHで処理して一本鎖cDNAを調製するための反応、及び前記一本鎖cDNAから二本鎖cDNAを調製するための反応を行った後、反応液に含まれるRNaseHを失活させる工程
(b)前記反応液と、カチオン性基を表面に有する固体支持体とを、前記カチオン性基が正に帯電するpH条件下で接触させる工程
(c)前記反応液から前記固体支持体を分離する工程
(d)前記固体支持体から二本鎖cDNAを溶離させる工程
(e)前記二本鎖cDNAからcRNAを調製するための転写反応を行う工程 - 前記工程(b)において、前記カチオン性基が正に帯電するpH条件下かつアンモニウムイオンの存在下で、前記反応液と前記固体支持体とを接触させることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記工程(c)で分離した前記固体支持体をアンモニウムイオンの存在下で洗浄する工程を前記工程(d)の前に含むことを特徴とする請求項1又は2記載の方法。
- 前記固体支持体が粒子であることを特徴とする請求項1又は2記載の方法。
- 前記粒子が磁性体粒子であることを特徴とする請求項4記載の方法。
- 前記工程(c)において、磁石を使用して前記反応液から前記磁性体粒子を分離することを特徴とする請求項5記載の方法。
- 前記cRNAがマイクロアレイ解析用サンプルである請求項1又は2記載の方法。
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