KR20170098823A - 핵산의 모노클로날 클러스터를 형성시키고 시퀀싱하기 위한 방법 및 어레이 - Google Patents

핵산의 모노클로날 클러스터를 형성시키고 시퀀싱하기 위한 방법 및 어레이 Download PDF

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매튜 윌리엄 켈링거
존 엠. 베이얼리
조나단 마크 보텔
로베르토 리가티
마리아 칸델라리아 로게르트 바시가루포
보얀 보야노브
클라우스 마이싱어
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일루미나 케임브리지 리미티드
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Abstract

본 발명은 특히, 마이크로어레이에서의 웰에서, 고체 표면 상에 타겟 폴리누클레오티드를 캡쳐하고 증폭시키는 방법으로서, 마이크로어레이가 a) 적어도 하나의 웰, 웰을 둘러싸는 표면, 및 내부 웰 표면을 포함하는 기판, b) 내부 웰 표면을 덮고 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍을 포함하는 제1 층, 및 c) 제1 층 및 웰을 둘러싸는 표면을 덮는 제2 층을 포함할 수 있는 방법에 관한 것이다. 대안적으로, 마이크로어레이는 a) 적어도 하나의 웰, 웰을 둘러싸는 표면 및 내부 웰 표면을 포함하는 기판, 및 b) 내부 웰 표면을 덮고 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍 및 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 포함하는 층을 포함할 수 있다. 특히, 웰에서 핵산의 모노클로날 집단을 생성시키는데 역학적 배제 증폭이 사용된다. 본 출원은 또한, a) 하나 이상의 고정된 주형 핵산을 형성시키기 위해 복수의 고정된 캡쳐 프라이머를 포함하는 기판을 복수의 주형 핵산과 접촉시키되, 복수의 고정된 캡쳐 프라이머가 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 제1의 복수의 프라이머, 예를 들어, 프라이머 P5, 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 제2의 복수의 프라이머, 예를 들어, 프라이머 P7을 포함하며, 각 주형 핵산이 5'-종결 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y 또는 Z에 의해 측면 배치되고 하나 이상의 예를 들어, SapI, 제한 사이트, 및 하나 이상의 제한 사이트와 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 사이의 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하고, b) 하나 이상의 고정된 캡쳐 프라이머를 확장시키는 것을 포함하는 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법을 기술한다. 마지막으로, 본 출원은 a) 복수의 상이한 고정된 시드 핵산을 형성시키기 위해 복수의 고정된 캡쳐 프라이머를 포함하는 기판을 복수의 상이한 시드 핵산과 접촉시키고, b) 복수의 상이한 고정된 시드 핵산 중 둘 이상에 대해 상보적인 복수의 상이한 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 고정된 캡쳐 프라이머들 중 둘 이상을 확장시키고, c) 활성화된 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 복수의 상이한 고정된 확장 생성물들 중 하나의 고정된 확장 생성물을 활성화시키는 것을 포함하는, 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법을 기술한다.

Description

핵산의 모노클로날 클러스터를 형성시키고 시퀀싱하기 위한 방법 및 어레이{METHODS AND ARRAYS FOR PRODUCING AND SEQUENCING MONOCLONAL CLUSTERS OF NUCLEIC ACID}
본 출원은 2014년 11월 11일에 출원된 미국가출원번호 제62/078,346호 및 2014년 12월 23일에 출원된 미국가출원번호 제62/096,464호를 우선권으로 주장하며, 이러한 문헌들은 전문이 본원에 포함된다.
분야
본 발명은 본 발명은 분자 생물학 분야 관한 것으로서, 상세하게 고체 표면 상에서 타겟 폴리누클레오티드(target polynucleotide)를 캡쳐하고 증폭시키는 방법에 관한 것이다.
차세대 시퀀싱(next generation sequencing)은 전체 게놈 시퀀싱 및 전체 게놈 분석을 가능하게 한다. 차세대 시퀀싱 방법은 종종 먼저 유니버셜 증폭 영역(universal amplification region)이 장착되고 이후에 고체 표면 상에 유니버셜 캡쳐 프라이머에 의해 분별없이 캡쳐되는 게놈 단편의 유니버셜 증폭을 필요로 한다. 유니버셜 캡쳐 프라이머는 폴리누클레오티드 캡쳐 및 브릿지 증폭 둘 모두를 매개하는데, 이는 차세대 시퀀싱 방법에서 유용한 요소이다[예를 들어, WO 2011/025477 A1호, US 2011/0172119 A1호 참조].
여러 현 방법들이 전체 게놈의 시퀀싱을 효과적으로 지지할 수 있지만, 이러한 방법들은 일반적으로 특정 폴리누클레오티드의 타겟화된 캡쳐를 허용하지 못하고, 이에 따라, 일반적으로, 예를 들어, 부분 게놈의 타겟화된 시퀀싱을 지지하지 못한다. 그러나, 예를 들어, 유기체의 엑솜(exome) 또는 전사체의 특정 분절의 타겟화된 시퀀싱을 용이하게 하는 방법에 대한 요구가 더욱 커지고 있다. 이러한 요구는 일부 비용에 의해 그리고 데이타 조작 고려사항에 의해 유도된다.
이에 따라, 부분 게놈의 타겟화된 차세데 시퀀싱을 가능하게 하는 새로운 방법이 요구되고 있다. 본 발명은 표면 상에 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키기 위한 방법을 제공함으로써 이러한 요구를 다룬다. 관련된 장점들이 또한 제공된다.
본원에는 마이크로어레이, 및 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법이 제공된다.
일 양태에서, 본원에는 a) 적어도 하나의 웰, 웰을 둘러싸는 표면, 및 내부 웰 표면을 포함하는 기판; b) 내부 웰 표면을 덮고 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍을 포함하는 제1 층; 및 c) 제1 층 및 웰을 둘러싸는 표면을 덮는 제2 층을 포함하는 마이크로어레이가 제공된다.
일부 구체예에서, 웰의 직경은 약 1 ㎛ 미만이다.
일부 구체예에서, 웰의 직경은 약 400 nm이다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍은 복수의 제1 캡쳐 프라이머 쌍이다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 시퀀싱 프라이머 결합 사이트(SBS)를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 제2 층은 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 포함한다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 복수의 제2 캡쳐 프라이머 쌍이다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 3'-단부에서 블로킹된다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 3'-포스페이트-종결된다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 3'-포스페이트 종결 프라이머는 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 3'-단부에서 블로킹되지 않는다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 복수의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 복수의 캡쳐 프라이머는 각각 타겟 폴리누클레오티드에 부착된다.
일부 구체예에서, 복수의 타겟 폴리누클레오티드는 적어도 하나의 웰에서 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 형성시킨다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 웰은 복수의 웰을 포함하며, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰은 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함한다.
일부 구체예에서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰은 동일한 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함한다.
일부 구체예에서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰은 둘 이상의 상이한 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함한다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍은 복수의 제1 캡쳐 프라이머 쌍이며, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 복수의 제2 캡쳐 프라이머 쌍이며, 복수의 제1 캡쳐 프라이머 쌍 및 복수의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 복수의 프라이머는 복수의 타겟 폴리누클레오티드에 부착된다.
일부 구체예에서, 복수의 타겟 폴리누클레오티드는 적어도 하나의 웰에서 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 형성시킨다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 웰은 복수의 웰이며, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰은 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함한다.
일부 구체예에서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰은 동일한 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함한다.
일부 구체예에서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰은 둘 이상의 상이한 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함한다.
다른 양태에서, 본원에는 a) 적어도 하나의 웰, 웰을 둘러싸는 표면, 및 내부 웰 표면을 포함하는 기판; 및 b) 내부 웰 표면을 덮고 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍 및 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 포함하는 층을 포함하는 마이크로어레이가 제공된다.
일부 구체예에서, 제38항에 있어서, 웰의 직경은 약 1 ㎛ 이상인 마이크로어레이.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍은 복수의 제1 캡쳐 프라이머 쌍이다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 복수의 제2 캡쳐 프라이머 쌍이다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 유니버셜 캡쳐 영역 및 SBS를 포함한다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍은 복수의 제1 캡쳐 프라이머 쌍이며, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 복수의 제2 캡쳐 프라이머 쌍이며, 복수의 제1 캡쳐 프라이머 쌍 및 복수의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 복수의 프라이머는 복수의 타겟 폴리누클레오티드에 부착된다.
일부 구체예에서, 복수의 타겟 폴리누클레오티드는 적어도 하나의 웰에서 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 형성시킨다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 웰은 복수의 웰이며, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰은 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함한다.
일부 구체예에서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰 각각은 동일한 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함한다.
일부 구체예에서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰은 둘 이상의 상이한 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함한다.
다른 양태에서, 본원에는 a) 기판 상에 제1 층을 형성시키되, 기판은 적어도 하나의 웰, 웰을 둘러싸는 표면, 및 내부 웰 표면을 포함하고, 제1 층은 내부 웰 표면을 덮고; b) 제1 층에서 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍을 침적시키고; c) 제1 층 및 웰을 둘러싸는 표면을 덮는 기판 상에 제2 층을 형성시키고; d) 타겟 폴리누클레오티드를 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 캡쳐 프라이머와 혼성화시키기에 충분하 조건 하에서, 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 포함하는 샘플을 기판과 접촉시키고; e) 웰 내측에 타겟 폴리누클레오티드로부터 앰플리콘의 클론 집단을 형성시키기 위해 제1 역학적 배제 검정(KEA)을 수행하고, 이에 의해 타겟 폴리누클레오티드를 중폭시키는 것을 포함하는, 핵산을 증폭시키는 방법에 제공된다.
일부 구체예에서, 복수의 폴리누클레오티드를 포함하는 샘플은 웰 당 단일 타겟 폴리누클레오티드를 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 캡쳐 프라이머와 혼성화시키기에 충분한 조건 하에서 기판과 접촉된다.
일부 구체예에서, 제1 KEA는 적어도 하나의 웰에서 캡쳐 프라이머와 혼성화된 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터 앰플리콘의 모노클로날 집단을 형성시킨다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 웰은 복수의 웰이며, 앰플리콘의 모노클로날 집단은 복수의 웰 중 둘 이상의 웰에서 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터 형성된다.
일부 구체예에서, 앰플리콘의 모노클로날 집단은 복수의 웰 중 둘 이상의 웰에서 동일한 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터 형성된다.
일부 구체예에서, 앰플리콘의 모노클로날 집단은 복수의 웰 중 둘 이상의 웰에서 둘 이상의 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터 수행된다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍은 복수의 제1 캡쳐 프라이머 쌍이다.
일부 구체예에서, 본 방법은 제2 층에서 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 침적시키는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 복수의 제2 캡쳐 프라이머 쌍이다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 제1 KEA를 수행하기 전에 침적된다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 복수의 타겟 폴리누클레오티드는 하나 이상의 상보적 유니버셜 캡쳐 영역에 의해 측면 배치된다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 3'-단부에서 블로킹된다.
일부 구체예에서, 3'-블로킹된 프라이머는 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 방법은 제1 KEA를 수행한 후에 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머를 탈블로킹시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 T4-키나아제를 사용하여 탈블로킹된다.
일부 구체예에서, 본 방법은 타겟 폴리누클레오티드 앰플리콘의 클론 집단을 확장시키기 위해 브릿지 증폭 또는 제2 KEA를 수행하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 SBS를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 복수의 타겟 폴리누클레오티드는 하나 이상의 상보적 SBS에 의해 측면 배치된다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 3'-단부에서 탈블로킹된다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 프라이머 쌍의 프라이머는 유니버셜 캡쳐 영역을 포하만다.
일부 구체예에서, 제1 KEA는 적어도 하나의 웰을 초과하여 앰플리콘의 클론 집단을 확장시키기 위해 연장된 시간 동안 수행된다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 제1 KEA를 수행한 후에 침적된다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머 및 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 방법은 적어도 하나의 웰을 초과하여 타겟 폴리누클레오티드 앰플리콘의 클론 집단을 확장시키기 위해 브릿지 증폭 또는 제2 KEA를 수행하는 것을 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 본원에는 a) 기판 상에 제1 층을 형성시키되, 기판은 적어도 하나의 웰, 웰을 둘러싸는 표면, 및 내부 웰 표면을 포함하고, 제1 층은 내부 웰 표면을 적어도 일부 덮고; b) 제1 층에서 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍을 침적시키되, 제1 캡쳐 프라이머 쌍은 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제1 캡쳐 프라이머, 및 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제2 캡쳐 프라이머를 포함하고; c) 제1 층 및 웰을 둘러싸는 표면을 덮는 기판 상에 제2 층을 형성시키고; d) 제2 층에 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 침적시키되, 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 3' 포스페이트-종결되고, Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제1 캡쳐 프라이머, 및 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제2 캡쳐 프라이머를 포함하고; e) 웰 당 단일 타겟 폴리누클레오티드를 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머와 혼성화시키기에 충분한 조건 하에서 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 포함하는 샘플을 기판과 접촉시키되, 타겟 폴리누클레오티드는 상보적 Illumina® P5' 프라이머 누클레오티드 서열 또는 상보적 Illumina® P7' 프라이머 누클레오티드 서열을 각각 포함하는 상보적 유니버셜 프라이머 영역에 의해 측면 배치되고; f) 적어도 하나의 웰 내측에 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터의 앰플리콘의 모노클로날 집단을 형성시키기 위해 제1 KEA를 수행하고, 이에 의해 타겟 폴리누클레오티드를 증폭시키고; g) 제2 프라이머 쌍의 프라이머를 탈블로킹하기 위해 기판을 T4-키나아제와 접촉시키고; h) 웰을 넘어 단일 타겟 폴리누클레오티드의 앰플리콘의 모노클로날 집단을 확장시키기 위해 브릿지 증폭 또는 제2 KEA를 수행하는 것을 포함하는 핵산을 증폭시키는 방법이 제공된다.
다른 양태에서, 본원에는 a) 기판 상에 제1 층을 형성시키되, 기판은 적어도 하나의 웰, 웰을 둘러싸는 표면, 및 내부 웰 표면을 포함하고, 여기서 제1 층은 내부 웰 표면을 적어도 일부 덮고; b) 제1 층에 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍을 침적시키고, 여기서, 제1 캡쳐 프라이머 쌍은 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS3 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머, 및 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS8 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머를 포함하고; c) 제1 층 및 웰을 둘러싸는 표면을 덮는 기판 상에 제2 층을 형성시키고; d) 제2 층에 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 침적시키고, 여기서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제1 캡쳐 프라이머, 및 Illumina® P7 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제2 캡쳐 프라이머를 포함하고; e) 웰 당 단일 타겟 폴리누클레오티드를 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머와 혼성화시키기에 충분한 조건 하에서 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 포함하는 샘플을 기판과 접촉시키고, 여기서, 복수의 타겟 폴리누클레오티드는 각각 상보적 Illumina® SBS3' 프라이머 누클레오티드 서열 또는 상보적 Illumina® SBS8' 누클레오티드 서열을 포함하는 상보적 SBS에 의해 측면 배치되고, f) 적어도 하나의 웰 내측 및 외측에서 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터의 앰플리콘의 모노클로날 집단을 형성시키기 위해 연장된 시간 동안 KEA를 수행하고, 이에 의해 웰 내측에서 단일 타겟 폴리누클레오티드를 증폭시키고 적어도 하나의 웰을 초과하여 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 확장시키는 것을 포함하는 핵산을 증폭시키는 방법이 제공된다.
다른 양태에서, 본원에는 a) 기판 상에 제1 층을 형성시키되, 기판은 적어도 하나의 웰, 웰을 둘러싸는 표면, 및 내부 웰 표면을 포함하고, 제1 층은 내부 웰 표면을 적어도 일부 덮고; b) 제1 층에 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍을 침적시키되, 제1 프라이머 쌍은 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제1 캡쳐 프라이머, 및 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제2 캡쳐 프라이머를 포함하고; c) 제1 층 및 웰을 둘러싸는 표면을 덮는 기판 상에 제2 층을 형성시키고; d) 웰 당 단일 타겟 폴리누클레오티드를 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머와 혼성화시키기에 충분한 조건 하에서 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 포함하는 샘플을 기판과 접촉시키되, 복수의 폴리누클레오티드는 상보적 Illumina® P5' 프라이머 누클레오티드 서열 또는 상보적 Illumina® P7' 프라이머 누클레오티드 서열을 각각 포함하는 상보적인 유니버셜 프라이머 영역에 의해 측면 배치되고; e) 적어도 하나의 웰 내측에 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터 앰플리콘의 모노클로날 집단을 형성시키기 위해 제1 KEA를 수행하고, 이에 의해 타겟 폴리누클레오티드를 증폭시키고; f) 제2 층에 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 침적시키되, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제1 캡쳐 프라이머, 및 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제2 캡쳐 프라이머를 포함하고; g) 단일 타겟 폴리누클레오티드의 앰플리콘의 모노클로날 집단을 확장시키기 위해 브릿지 증폭 또는 제2 KEA를 수행하는 것을 포함하는 핵산을 증폭시키는 방법이 제공된다.
다른 양태에서, 본원에는 a) 기판 상에 층을 형성시키되, 기판은 적어도 하나의 웰, 웰을 둘러싸는 표면, 및 내부 웰 표면을 포함하고, 웰은 약 1 ㎛ 이상의 직경을 가지고, 층은 내부 웰 표면을 적어도 일부 덮고; b) 층에 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍 및 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 침적시키되, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머 밀도는 적어도 제2 프라이머 쌍의 프라이머 밀도 보다 높고; c) 웰 당 단일 타겟 폴리누클레오티드를 제2 프라이머와 혼성화시키기에 충분한 조건 하에서 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 포함하는 샘플을 기판과 접촉시키고; d) 웰 내측에 제2 프라이머에 혼성화된 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터 앰플리콘의 모노클로날 집단을 형성시키기 위해 KEA를 수행하고, 이에 의해 단일 타겟 폴리누클레오티드를 증폭시키는 것을 포함하는 핵산을 증폭시키는 방법이 제공된다.
다른 양태에서, 본원에는 a) 하나 이상의 고정된 주형 핵산을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 복수의 고정된 캡쳐 프라이머를 포함하는 기판을 복수의 주형 핵산을 접촉시키되, 복수의 고정된 캡쳐 프라이머는 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 제1의 복수의 프라이머, 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 제2의 복수의 프라이머를 포함하고, 각 주형 핵산은 5'-말단 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y 또는 Z에 의해 측면 배치되고, 하나 이상의 제한 사이트, 및 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역과 하나 이상의 제한 사이트 사이에 또는 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역과 하나 이상의 제한 사이트 사이에 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하고; b) 하나 이상의 주형 핵산에 대해 상보적인 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 하나 이상의 고정된 캡쳐 프라이머를 확장시키는 것을 포함하는 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법이 제공된다.
일부 구체예에서, 각 주형 핵산의 타겟-특이적 캡쳐 영역은 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역과 하나 이상의 제한 사이트 사이에 존재한다.
일부 구체예에서, 각 주형 핵산은 두 개의 제한 사이트, 및 두 개의 제한 사이트 사이의 스페이서 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 두 개의 제한 사이트는 SapI 사이트이다.
일부 구체예에서, 스페이서 영역은 약 150개의 염기를 포함한다.
일부 구체예에서, 기판은 복수의 패드를 포함하는 패턴화된 흐름 셀이다.
일부 구체예에서, 각 패드는 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 제1의 복수의 고정된 유니버셜 캡쳐 프라이머, 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 제2의 복수의 고정된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 포함한다.
일부 구체예에서, 단일의 고정된 확장 생성물은 복수의 패드 중 패드 당 형성된다.
일부 구체예에서, 패드 당 형성된 단일의 고정된 확장 생성물은 복수의 패드의 모든 패스에서 동일한 주형 핵산에 대해 상보적이다.
일부 구체예에서, 패드 당 형성된 단일의 고정된 확장 생성물은 복수의 패드 중 둘 이상의 패드에서 둘 이상의 상이한 주형 핵산에 대해 상보적이다.
일부 구체예에서, 패드 당 형성된 단일의 고정된 확장 생성물은 복수의 패드 중 적어도 1%, 적어도 3%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 패드 중 각 하나에서 상이한 주형 핵산에 대해 상보적이다.
일부 구체예에서, 단일의 고정된 확장 생성물은 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 초과의 패드에 형성된다.
일부 구체예에서, 단일의 고정된 확장 생성물은 100%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 또는 1% 미만의 패드에서 형성된다.
일부 구체예에서, 본 방법은 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 하나 이상의 모노클로날 클러스터를 형성시키기 위해 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, PCR에 의해 증폭시키는 것은 브릿지 증폭 또는 KEA를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 방법은 유니버셜 캡쳐 영역 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머 및 복수의 이중 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 복수의 고정된 이중 가닥 주형 핵산에서 하나 이상의 제한 사이트를 절단하도록 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 하나 이상의 모노클로날 클러스터를 제한 효소와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 본 방법은 복수의 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 단일 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 복수의 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머 및 이중 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 열변성시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 본 방법은 복수의 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 단일 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 복수의 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머 및 이중 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 5'-3' 이중 가닥 데옥시리보핵산(dsDNA) 엑소누클레아제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 기판은 복수의 패드를 포함하는 패턴화된 흐름 셀이다.
일부 구체예에서, 각 패드는 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 제1의 복수의 캡쳐 프라이머, 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 제2의 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 포함한다.
일부 구체예에서, 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 캡쳐 프라이머의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 초과는 복수의 패드 중 하나 이상의 패드에서 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머로 전환된다.
일부 구체예에서, 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 캡쳐 프라이머의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 초과는 복수의 패드 중 하나 이상의 패드에서 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머로 전환된다.
일부 구체예에서, 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 캡쳐 프라이머 중 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 초과는 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머로 전환되며, 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 캡쳐 프라이머 중 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 초과는 복수의 패드 중 하나 이상의 패드에서 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머로 전환된다.
다른 양태에서, 본원에는 a) 하나 이상의 고정된 주형 핵산을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 복수의 고정된 캡쳐 프라이머를 포함하는 기판을 복수의 주형 핵산과 접촉시키되, 복수의 고정된 캡쳐 프라이머는 3'-말단 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 제1의 복수의 프라이머, 및 3'-말단 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 제2의 복수의 프라이머를 포함하고, 각 주형 핵산은 3'-말단 상보적 Illumina® P5' 프라이머 누클레오티드 서열 및 5'-말단 상보적 Illumina® P7' 프라이머 누클레오티드 서열에 의해 측면 배치되고, 두 개의 SapI 제한 사이트, SapI 제한 사이트 사이의 스페이서 영역, 및 3'-말단 상보적 Illumina® P5' 프라이머 누클레오티드 서열과 SapI 제한 사이트 사이의 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하고; b) 하나 이상의 주형 핵산에 대해 상보적인 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 하나 이상의 고정된 캡쳐 프라이머를 확장시키고; c) 하나 이상의 모노클로날 클러스터s of 고정된 이중 가닥 주형 핵산을 형성시키기 위해 브릿지 증폭 또는 KEA에 의해 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 증폭시키고; d) Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머, 및 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 복수의 고정된 이중 가닥 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 복수의 고정된 이중 가닥 주형 핵산에서 두 개의 제한 사이트를 절단하도록 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 하나 이상의 모노클로날 클러스터를 SapI와 접촉시키고; e) 임의적으로, 복수의 고정화된 단일 가닥 키메라 캡쳐 프라이머 및 복수의 고정화된 단일 가닥 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 복수의 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머 및 고정된 이중 가닥 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 5'-3' dsDNA-엑소누클레아제와 접촉시키는 것을 포함하는, 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법이 제공된다.
다른 양태에서, 본원에는 a) 하나 이상의 고정된 주형 핵산을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 복수의 고정된 캡쳐 프라이머를 포함하는 기판을 복수의 주형 핵산과 접촉시키되, 복수의 고정된 캡쳐 프라이머는 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역을 포함하는 제1의 복수의 프라이머 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 제2의 복수의 프라이머를 포함하고, 각 주형 핵산은 5'-말단 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y 또는 Z에 의해 측면 배치되고, 하나 이상의 제한 사이트 및 하나 이상의 제한 사이트와 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 사이의 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하고; b) 하나 이상의 주형 핵산에 대해 상보적인 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 하나 이상의 고정된 캡쳐 프라이머를 확장시키고; c) 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 하나 이상의 모노클로날 클러스터를 형성시키기 위해 PCR에 의해 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 증폭시키고; d) 유니버셜 캡쳐 영역 Z 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머, 및 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 복수의 고정된 이중 가닥 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 복수의 고정된 이중 가닥 주형 핵산에서 하나 이상의 제한 사이트를 절단하도록 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 하나 이상의 모노클로날 클러스터를 제한 효소와 접촉시키는 것을 포함하는, 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법이 제공된다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 증폭시키는 것은 브릿지 증폭 또는 KEA를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 방법은 복수의 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 복수의 단일 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 복수의 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머 및 복수의 고정된 이중 가닥 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 변성시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 주형 핵산은 타겟-특이적 부분과 3' 부분 사이에 SBS를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머는 3'-종결 부분 제한 사이트를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 방법은 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머로부터 3'-종결 부분 제한 사이트를 제거하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머는 사전결정된 분열 사이트를 포함한다.
일부 구체예에서, 사전결정된 분열 사이트는 디올 링커, 8-옥소구아닌(8-oxo-G), 우라실 염기, 리보누클레오티드, 메틸화된 누클레오티드, 또는 펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 부분 제한 사이트를 제거하는 것은 비-효소 화학적 분열을 포함한다.
일부 구체예에서, 비-효소 화학적 분열은 퍼요오데이트 처리, 희토류 금속 이온 처리, 알칼리 처리 또는 광화학적 반응을 포함한다.
일부 구체예에서, 3'-종결 부분 제한 사이트를 제거하는 것은 효소적 분열을 포함한다.
일부 구체예에서, 효소적 분열은 우라실-DNA 글리코실라아제 분열, 엔도누클레아제 분열, 리보누클레아제 (RNAse) 처리, 제한 효소 분열 또는 프로테아제 분열을 포함한다.
일부 구체예에서, 3'-종결 부분 제한 사이트를 제거하는 것은 이중-가닥 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 형성시키기 위해 역 상보적 올리고누클레오티드를 단일 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머에 혼성화시키는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 방법은 이중 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 역 상보적 올리고누클레오티드를 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머에 혼성화시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 본 방법은 3'-종결 부분 제한 사이트를 제거하기 위해 기판을 누클레아제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 누클레아제는 엑소누클레아제 I이다.
일부 구체예에서, 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머의 3'-종결 타겟-특이적 캡쳐 영역은 절단된다.
일부 구체예에서, 각 주형 핵산은 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y, 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z, 제1 및 제2 제한 사이트를 포함하는 중심 부분, 및 제1 제한 사이트와 제2 사이트 사이의 스페이서 영역, 및 중심 부분과 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z 사이의 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 각 주형 핵산은 타겟-특이적 영역과 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z 사이에 SBS를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 본 방법은 e) 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 포함하는 핵산 샘플을 적어도 하나의 프라이머와 접촉시키되, 상기 적어도 하나의 프라이머는 어댑터를 포함하고; f) 복수의 앰플리콘을 형성시키기 위해 PCR에 의해 상기 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 증폭시키고; g) 제1의 복수의 고정화된 앰플리콘을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 복수의 고정된 키메라 캡쳐 프라이머를 상기 복수의 앰플리콘과 직접적으로 접촉시키고; h) 상기 타겟 폴리누클레오티드에 대해 상보적인 복수의 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 복수의 고정된 키메라 캡쳐 프라이머를 확장시키고; i) 제2의 복수의 고정화된 앰플리콘을 형성시키기 위해 PCR에 의해 상기 복수의 고정된 확장 생성물을 증폭시키되, 상기 고정화된 앰플리콘의 집단은 85% 이상의 균일성을 포함하는 것을 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 본원에는 a) 하나 이상의 고정된 주형 핵산을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 기판 상에 고정화된 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 복수의 주형 핵산과 접촉시키되, 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머는 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역을 포함하는 제1의 복수의 프라이머 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 제2의 복수의 프라이머를 포함하고, 각 주형 핵산은 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y, 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z, 타겟-특이적 캡쳐 영역, 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y와 타겟-특이적 캡쳐 영역 사이의 제한 사이트, 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z와 타겟-특이적 캡쳐 부분 사이의 SBS를 포함하고; b) 하나 이상의 고정된 주형 핵산에 대해 상보적인 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 하나 이상의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 확장시키고; c) 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 형성시키기 위해 브릿지 증폭 또는 KEA에 의해 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 증폭시키고; d) 유니버셜 캡쳐 영역 Z 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 고정된 키메라 캡쳐 프라이머, 및 유니버셜 캡쳐 영역 Y 및 부분 제한 사이트를 포함하는 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 클러스터를 제한 효소와 접촉시키는 것을 포함하는, 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법이 제공된다.
다른 양태에서, 본원에는 a) 하나 이상의 고정된 주형 핵산을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 기판 상에 고정화된 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 복수의 주형 핵산과 접촉시키되, 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머는 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 및 제1 사전결정된 분열 사이트를 포함하는 제1의 복수의 프라이머 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z 및 제2 사전결정된 분열 사이트를 포함하는 5'-부분을 포함하는 제2의 복수의 프라이머를 포함하고, 각 주형 핵산은 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y, 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z, 타겟-특이적 캡쳐 영역, 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y와 타겟-특이적 캡쳐 영역 사이의 제한 사이트, 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z와 타겟-특이적 캡쳐 영역 사이의 SBS를 포함하고; b) 하나 이상의 주형 핵산에 대해 상보적인 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 하나 이상의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 확장시키고; c) 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 형성시키기 위해 브릿지 증폭 또는 KEA에 의해 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 증폭시키고; d) 유니버셜 캡쳐 영역 Z 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 고정된 키메라 캡쳐 프라이머, 및 유니버셜 캡쳐 영역 Y 및 부분 제한 사이트를 포함하는 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 제한 효소와 접촉시키고; e) 제1 사전결정된 분열 사이트에서 분열을 통해 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머로부터 부분 제한 사이트를 제거하는 것을 포함하는, 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법이 제공된다.
일부 구체예에서, 제1 사전결정된 분열 사이트는 우라실 염기를 포함하며, 제2 사전결정된 분열 사이트는 디올-링커를 포함한다.
다른 양태에서, 본원에는 a) 하나 이상의 고정된 주형 핵산을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 기판 상에 고정화된 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 복수의 주형 핵산과 접촉시키되, 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머는 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 제1의 복수의 프라이머, 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 제2의 복수의 프라이머를 포함하며, 각 주형 핵산은 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y, 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z, 제1 및 제2 제한 사이트를 포함하는 중심 부분, 및 제1 제한 사이트와 제2 사이트 사이의 스페이서 영역, 및 중심 부분과 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z 사이의 타겟-특이적 영역을 포함하고; b) 하나 이상의 주형 핵산에 대해 상보적인 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머의 하나 이상의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 확장시키고; c) 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 형성시키기 위해 브릿지 증폭 또는 KEA에 의해 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 증폭시키고; d) 유니버셜 캡쳐 영역 Z 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 고정된 키메라 캡쳐 프라이머, 및 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 제한 효소와 접촉시키는 것을 포함하는, 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법이 제공된다.
다른 양태에서, 본원에는 a) 하나 이상의 고정된 주형 핵산을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 기판 상에 고정화된 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 복수의 주형 핵산과 접촉시키되, 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머는 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역을 포함하는 제1의 복수의 프라이머 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 제2의 복수의 프라이머를 포함하며, 각 주형 핵산은 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y, 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z, 타겟-특이적 캡쳐 영역 및 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y와 타겟-특이적 캡쳐 영역 사이의 제한 사이트를 포함하고; b) 하나 이상의 주형 핵산에 대해 상보적인 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머 중 하나 이상의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 확장시키고; c) 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 형성시키기 위해 브릿지 증폭 또는 KEA에 의해 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 증폭시키고; d) 유니버셜 캡쳐 영역 Z 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 이중-가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머, 및 유니버셜 캡쳐 영역 Y 및 단일-가닥 부분 제한 사이트를 포함하는 복수의 이중 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 제한 효소와 접촉시키고; e) 복수의 단일-가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 복수의 단일 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 복수의 이중-가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 복수의 이중 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 변성시키고; f) 이중-가닥 유니버셜 캡쳐 영역 및 이중-가닥 타겟-특이적 영역을 형성시키기 위해 역 상보적 올리고누클레오티드를 복수의 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 복수의 단일 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머에 혼성화시키고; g) 복수의 이중 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머로부터 단일-가닥 부분 제한 사이트를 제거하기 위해 표면을 엑소누클레아제 I과 접촉시키는 것을 포함하는, 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법이 제공된다.
다른 양태에서, 본원에는 a) 하나 이상의 고정된 주형 핵산을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 기판 상에 고정화된 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 복수의 주형 핵산과 접촉시키되, 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머는 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y을 포함하는 제1의 복수의 프라이머, 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 제2의 복수의 프라이머, 및 3'-종결 영역 X 및 사전결정된 분열 사이트를 포함하는 5' 부분을 포함하는 제3의 복수의 프라이머를 포함하며, 각 주형 핵산은 5'-말단 영역 X, 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z, 타겟-특이적 캡쳐 영역, 및 영역 X와 타겟-특이적 캡쳐 영역 사이의 제한 사이트를 포함하고; b) 하나 이상의 주형 핵산에 대해 상보적인 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 하나 이상의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 확장시키고; c) 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 형성시키기 위해 브릿지 증폭 또는 KEA에 의해 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 증폭시키고; d) 유니버셜 캡쳐 영역 Z 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 고정된 키메라 캡쳐 프라이머, 및 영역 X 및 부분 제한 사이트를 포함하는 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘과 제한 효소를 접촉시키고; e) 사전결정된 분열 사이트에서 분열을 통해 기판으로부터 영역 X를 포함하는 복수의 고정화된 재생된 캡쳐 프라이머를 제거하는 것을 포함하는, 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법이 제공된다.
다른 양태에서, 본원에는 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y 또는 Z, 제한 사이트 및 3'-종결 다이머화 영역 DR을 포함하는 제1 올리고누클레오티드, 및 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y 또는 Z 및 3'-종결 다이머화 영역 DR을 포함하는 제2 올리고누클레오티드를 포함하는 올리고누클레오티드 다이머가 제공된다.
일부 구체예에서, 제1 올리고누클레오티드의 3'-종결 DR, 및 제2 올리고누클레오티드의 3'-종결 DR은 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 제1 올리고누클레오티드의 3'-종결 DR 및 제2 올리고누클레오티드의 3'-종결 DR은 SBS를 포함한다.
다른 양태에서, 본원에는 a) 복수의 상이한 고정된 시드 핵산을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 복수의 고정된 캡쳐 프라이머를 포함하는 기판을 복수의 상이한 시드 핵산과 접촉시키고; b) 복수의 상이한 고정된 시드 핵산 중 둘 이상에 상보적인 복수의 상이한 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 고정된 캡쳐 프라이머 중 둘 이상을 확장시키고; c) 활성화된 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 복수의 상이한 고정된 확장 생성물 중 하나의 고정된 확장 생성물을 활성화시키고; 및 d) 임의적으로, 고정된 개질된 캡쳐 프라이머의 모노클로날 클러스터를 형성시키기 위해 활성화된 캡쳐 프라이머를 증폭시키는 것을 포함하는, 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법이 제공된다.
일부 구체예에서, 고정된 확장 생성물을 활성화시키는 것은 타겟화된 활성화를 포함한다. 일부 구체예에서, 타겟화된 활성화는 복수의 상이하게 라벨링된 시드 핵산을 형성시키기 위해 복수의 상이한 시드 핵산을 복수의 상이한 라벨로 라벨링시키는 초기 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 타겟화된 활성화는 복수의 상이하게 라벨링된 고정된 시드 핵산을 형성시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 타겟화된 활성화는 복수의 상이하게 라벨링된 고정된 확장 생성물을 형성시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 타겟화된 활성화는 하나의 고정된 확장 생성물을 활성화시키기 위해 복수의 상이하게 라벨링된 고정된 확장 생성물을 하나 이상의 라벨-특이적 트리거 분자과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 초기 라벨링 단계는 복수의 상이한 시드 핵산의 렌덤 라벨링을 포함한다. 일부 구체예에서, 초기 라벨링 단계는 복수의 상이한 시드 핵산의 타겟화된 라벨링을 포함한다. 일부 구체예에서, 타겟화된 라벨링은 서열-특이적 라벨링이다. 일부 구체예에서, 복수의 상이한 시드 핵산은 50 미만, 45 미만, 40 미만, 35 미만, 30 미만, 25 미만, 20 미만, 18 미만, 16 미만, 14 미만, 12 미만, 10 미만, 8 미만, 6 미만, 4 또는 2개 미만의 상이한 라벨로 라벨링된다. 일부 구체예에서, 복수의 상이한 시드 핵산은 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4, 또는 2개의 상이한 라벨로 라벨링된다. 일부 구체예에서, 복수의 상이한 시드 핵산은 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 80개 이상, 90개 이상, 100개 이상, 150개 이상, 200개 이상, 250개 이상, 300개 이상, 400개 이상, 500개 이상, 600개 이상, 700개 이상, 800개 이상, 900개 이상, 또는 1,000개 이상 상이한 라벨로 라벨링된다. 일부 구체예에서, 상이한 라벨은 상이한 핵산 서열을 갖는 상이한 프라이머이다. 일부 구체예에서, 초기 라벨링 단계는 복수의 상이한 시드 핵산에 복수의 상이한 프라이머를 결찰시키는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 트리거 분자는 트리거 영역을 포함하는 핵산이다. 일부 구체예에서, 트리거 영역은 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 트리거 영역은 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 유니버셜 캡쳐 영역은 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 또는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 트리거 분자는 고정된 캡쳐 프라이머이다. 일부 구체예에서, 고정된 캡쳐 프라이머는 복수의 고정된 캡쳐 프라이머이다. 일부 구체예에서, 복수의 고정된 캡쳐 프라이머는 복수의 상이한 캡쳐 프라이머이다. 일부 구체예에서, 복수의 고정된 캡쳐 프라이머는 동일한 핵산 서열을 갖는 복수의 동일한 캡쳐 프라이머이다. 일부 구체예에서, 고정된 캡쳐 프라이머는 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 복수의 상이한 고정된 확장 생성물의 하나의 고정된 확장 생성물을 활성화시키는 것은 확률적 활성화(stochastic activation)를 포함한다. 일부 구체예에서, 확률적 활성화는 헤어핀 구조를 포함하는 복수의 상이한 고정된 시드 핵산을 형성시키기 위해 복수의 고정된 캡쳐 프라이머를 갖는 기판을 헤어핀 구조를 갖는 복수의 상이한 시드 핵산과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 확률적 활성화는 헤어핀 구조를 포함하는 복수의 상이한 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 복수의 고정된 캡쳐 프라이머 중 둘 이상을 확장시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 확률적 활성화는 헤어핀 구조를 포함하는 복수의 고정된 확장 생성물 중 하나를 분열 시약으로 활성화시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 상이한 시드 핵산 중 하나 이상의 상이한 시드 핵산은 분열 가능한 염기를 포함한다.
일부 구체예에서, 분열 시약은 누클레아제이다. 일부 구체예에서, 누클레아제는 엔도누클레아제이다. 일부 구체예에서, 분열 시약은 증폭 시약 혼합물에 존재한다. 일부 구체예에서, 분열 시약은 복수의 활성화된 모노클로날 고정된 캡쳐 프라이머를 증폭시킬 때 존재한다.
일부 구체예에서, 복수의 상이한 고정된 확장 생성물은 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 상이한 고정된 확장 생성물 중 헤어핀 구조는 유니버셜 캡쳐 영역을 마스킹한다.
일부 구체예에서, 복수의 상이한 시드 핵산은 트리거 영역을 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 확률적 활성화는 복수의 상이한 시드 핵산 중 하나를 트리거 영역을 포함하는 키메라 프라이머로 증폭시키는 초기 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 상이한 시드 핵산 중 하나를 키메라 프라이머로 증폭시키는 초기 단계에서, 하나 이상의 시드 핵산은 키메라 프라이머에 비해 5배 초과, 10배 초과, 25배 초과, 50배 초과, 100배 초과, 250배 초과, 500배 초과, 1,000배 초과, 2,500배 초과, 5,000배 초과, 10,000배 초과, 25,000배 초과, 50,000배, 또는 100,000배 초과 과량으로 존재한다. 일부 구체예에서, 트리거 영역은 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 트리거 영역은 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 프라이머는 트리거 영역 및 SBS를 포함한다.
일부 구체예에서, 확률적 활성화는 a) 복수의 상이한 고정된 시드 핵산을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 복수의 고정된 캡쳐 프라이머를 갖는 기판을 복수의 상이한 시드 핵산과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서, 상이한 시드 핵산 각각은 하나 이상의 개질된 누클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 확률적 활성화는 b) 복수의 상이한 고정된 시드 핵산에 대해 상보적인 복수의 상이한 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 둘 이상의 고정된 캡쳐 프라이머를 확장시키는 것을 추가로 포함하며, 여기서, 복수의 상이한 고정된 확장 생성물 각각은 하나 이상의 개질된 누클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 확률적 활성화는 c) 활성화된 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 복수의 상이한 고정된 확장 생성물 중 하나를 활성화시키는 것을 추가로 포함하며, 여기서, 활성화된 캡쳐 프라이머는 개질된 누클레오티드를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 개질된 누클레오티드는 이소구아닌(isoG) 또는 이소시토신(isoC)을 포함한다.
일부 구체예에서, 확률적 활성화는 결합된 블로킹제를 각각 갖는 복수의 상이한 고정된 시드 핵산을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 복수의 고정된 캡쳐 프라이머를 갖는 기판을 결합된 블로킹 시약을 각각 갖는 복수의 상이한 시드 핵산과 접촉시키고, 블로킹제를 탈블로킹제와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 블로킹제는 핵산 결합 단백질이며, 탈블로킹제는 프로테아제이다. 일부 구체예에서, 블로킹제는 비드이다.
일부 구체예에서, 고정된 개질된 캡쳐 프라이머의 모노클로날 클러스터를 형성시키기 위해 활성화된 캡쳐 프라이머를 증폭시키는 것은 KEA 또는 브릿지 증폭을 포함한다.
일부 구체예에서, 표면은 복수의 웰을 포함하는 패턴화된 흐름 셀이다. 일부 구체예에서, 상이한 고정된 확장 생성물은 복수의 웰 중 둘 이상의 웰에 형성된다. 일부 구체예에서, 활성화된 캡쳐 프라이머는 복수의 웰 중 둘 이상의 웰 각각에 형성된다. 일부 구체예에서, 활성화된 캡쳐 프라이머는 복수의 웰 중 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 웰 각각에 형성된다. 일부 구체예에서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰 각각에 형성된 활성화된 캡쳐 프라이머는 적어도 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 웰에 상이한 활성화된 캡쳐 프라이머이다. 일부 구체예에서, 고정된 개질된 캡쳐 프라이머의 모노클로날 클러스터는 복수의 웰 중 둘 이상의 웰 각각에 형성된다. 일부 구체예에서, 고정된 개질된 캡쳐 프라이머의 모노클로날 클러스터는 복수의 웰 중 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 웰 각각에 형성된다. 일부 구체예에서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰 각각에 형성된 고정된 개질된 캡쳐 프라이머의 모노클로날 클러스터는 적어도 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 웰에 고정된 개질된 캡쳐 프라이머의 상이한 모노클로날 클러스터이다.
도 1은 패턴화된 클러스터의 이중 증폭(dual amplification)에 의해 패턴화된 기판 상에서 핵산을 증폭시키는 방법의 일 구체예를 예시한 개략도이다. 패턴화된 기판은 1.5 ㎛의 피치의 복수의 400 nm 웰(1)을 갖는다. 패턴화된 표면은 먼저 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸)아크릴아미드-코-아크릴아미드(PAZAM) 층으로 덮혀지며, 패턴화된 표면은 이후에, 웰들 사이에 표면으로부터 PAZAM 층을 제거하기 위해 폴리싱되며, 웰 내에 PAZAM 층을 유지시키며, 유니버셜 캡쳐 프라이머, 예를 들어, 유니버셜 Illumina® 캡쳐 프라이머 P5 또는 P7은 웰에서 PAZAM에서 그라프팅된다(2). 패턴화된 표면은 표면에서 그리고 웰들 사이의 표면 상 둘 모두에서, PAZAM 또는 실란 유리 아크릴아미드(SFA)의 제2 층으로 덮혀진다(3). 제2 층은 3'-블로킹된 유니버셜 캡쳐 프라이머, 예를 들어, 포스페이트 말단 Illumina® 프라이머 P5 또는 P7와 그라프팅된다(4). 패턴화된 표면은 유니버셜 캡쳐 영역, 예를 들어, Illumina® P5 또는 P7 영역에 의해 측면 배치된 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 갖는 시퀀싱 라이브러리와 접촉되며, 제1 역학적 배제 검정(KEA)은 시딩을 개시하고 웰 내에서 타겟 폴리누클레오티드로부터의 앰플리콘의 클론 집단을 형성시키기 위해 수행된다(3). 3'-블로킹된 유니버셜 캡쳐 프라이머는 예를 들어, 포스페이트 말단 Illumina® 프라이머 P5 또는 P7을 T4-키나아제로 탈포스포릴화시킴으로써 탈블로킹된다(6). 제2 KEA 또는 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)은 웰을 초과하여 타겟 폴리누클레오티드 앰플리콘의 클론 집단을 확장시키기 위해 수행된다(7).
도 2는 캡쳐 프라이머로의 1-단계 증폭에 의해 패턴화된 기판 상에 핵산을 증폭시키는 방법의 일 구체예를 예시한 개략도이다. 패턴화된 기판은 1.5 ㎛ 피치의 복수의 400 nm 웰을 갖는다(1). 패턴화된 표면은 먼저 PAZAM 층으로 덮혀진다. 패턴화된 표면은 이후에, 웰들 사이의 표면으로부터 PAZAM 층을 제거하기 위해 폴리싱되며, 웰 내에 PAZAM 층을 유지시키며, 유니버셜 캡쳐 영역 및 시퀀싱 프라이머 결합 사이트(SBS)를 갖는 키메라 캡쳐 프라이머, 예를 들어, Illumina® 캡쳐 프라이머 P5-SBS3 또는 P7-SBS8은 웰에서 PAZAM 층에서 그라프팅된다(2). 패턴화된 표면은 웰에서 그리고 웰들 사이의 표면 상 둘 모두에서 PAZAM 또는 실란 유리 아크릴아미드(SFA)의 제2 층으로 덮혀진다(3). 제2 층은 유니버셜 캡쳐 프라이머, 예를 들어, Illumina® 프라이머 P5 또는 P7로 그라프팅된다(4). 패턴화된 표면은 SBS로 측면 배치된 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 갖는 시퀀싱 라이브러리, 예를 들어, Illumina® SBS3 또는 SBS8와 접촉되며, 역학적 배제 검정(KEA)은 타겟 폴리누클레오티드로부터 앰플리콘의 클론 집단을 형성시키기 위해 수행된다. 타겟 폴리누클레오티드 앰플리콘의 클론 집단은 초기에 키메라 캡쳐 프라이머를 사용하여 웰 내에 형성된다. 지연된 KEA 반응 시간 후에 또는 브릿지 PCR로의 스위칭에 의해, 앰플리콘의 클론 집단은 웰 외측의 제2 층에서 그라프팅된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 사용하여 웰을 초과하여 확장된다.
도 3은 증폭-그라프팅-증폭에 의해 패턴화된 기판 상에 핵산을 증폭시키는 방법의 일 구체예를 예시한 개략도이다. 패턴화된 기판은 1.5 ㎛ 피치의 복수의 400 nm 웰을 갖는다(1). 패턴화된 표면은 먼저 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸)아크릴아미드-코-아크릴아미드(PAZAM) 층으로 덮혀지며, 패턴화된 표면은 웰 사이의 표면으로부터 PAZAM 층을 제거하기 위해 폴리싱되며, 웰 내에 PAZAM 층을 보유하며, 유니버셜 캡쳐 프라이머, 예를 들어, 유니버셜 Illumina® 캡쳐 프라이머 P5 또는 P7은 웰에서 PAZAM 층에서 그라프팅된다(2). 패턴화된 표면은 웰에서 그리고 웰들 사이의 표면 상 둘 모두에서 PAZAM 또는 실란 유리 아크릴아미드(SFA)의 제2 층으로 덮혀진다(3). 패턴화된 표면은 유니버셜 캡쳐 영역, 예를 들어, Illumina® P5 또는 P7 영역에 의해 측면 배치된 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 갖는 시퀀싱 라이브러리와 접촉되며, 제1 역학적 배제 검정(KEA)은 웰 내에서 타겟 폴리누클레오티드로부터의 앰플리콘의 클론 집단을 형성시키기 위해 수행된다(4). 제2 층은 유니버셜 캡쳐 프라이머, 예를 들어, Illumina® primers P5 또는 P7과 그라프팅된다(5). 제2 KEA 또는 브릿지 PCR은 웰 내측에 제2 층에서 유니버셜 캡쳐 프라이머를 사용하여 웰을 초과하여 타겟 폴리누클레오티드 앰플리콘의 클론 집단을 확장시키기 위해 수행된다(6).
도 4는 큰 웰에서 혼합된 프라이머를 사용하여 패턴화된 기판 상에 핵산을 증폭시키는 방법의 일 구체예를 예시한 개략도이다. 패턴화된 기판은 1.5 ㎛ 피치의 복수의 1.0 ㎛ 웰을 갖는다(1). 패턴화된 표면은 먼저 PAZAM 층으로 덮혀지며, 패턴화된 표면은 웰 내에 PAZAM 층을 보유하면서, 웰 사이의 표면으로부터 PAZAM 층을 제거하기 위해 폴리싱되며, 유니버셜 캡쳐 프라이머, 예를 들어, 유니버셜 Illumina® 캡쳐 프라이머 P5 또는 P7, 및 유니버셜 캡쳐 영역 및 SBS를 갖는 키메라 캡쳐 프라이머, 예를 들어, Illumina® 캡쳐 프라이머 P5-SBS3 또는 P7-SBS8의 혼합물은 웰에서 PAZAM 층에서 그라프팅된다. 키메라 캡쳐 프라이머는 보다 낮은 밀도로 그라프팅되며, 유니버셜 캡쳐 프라이머는 보다 높은 밀도로 그라프팅된다(2). 패턴화된 표면은 SBS, 예를 들어, Illumina® SBS3 또는 SBS8에 의해 측면 배치된 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 갖는 시퀀싱 라이브러리와 접촉되며, KEA는 웰 내에서 타겟 폴리누클레오티드로부터 앰플리콘의 클론 집단을 형성시키기 위해 수행된다(3).
도 5는 본원에 제공된 이중층 프라이머 그라프팅 방법으로 얻어진 예시적인 결과를 도시한 것이다. 상부 패널은 패턴화된 흐름 셀을 제1 층(PAZAM)으로 코팅학, 표면을 폴리싱하고, 제1 캡쳐 프라이머(SBS3-P5)를 침적시키고, 제1 캡쳐 프라이머를 테트라클로로플루오레세인(TET) 올리고누클레오티드 프로브로 프로빙시킨 후에 얻어진 결과를 도시한 것이다. 중간 패널은 패널 A의 패턴화된 흐름 셀을 제2 층(SFA)로 추가 코팅하고 제1 캡쳐 프라이머를 TET 올리고누클레오티드 프로브로 재프로빙한 후에 얻어진 결과를 도시한 것이다. 하부 패널은 제2 층에 제2 캡쳐 프라이머(P5/P7)를 추가로 침적시키고, 제2 캡쳐 프라이머를 TET 올리고누클레오티드 프로브로 프로빙한 후 얻어진 결과를 도시한 것이다.
도 6은 주형 핵산의 예시적인 구조를 예시한 개략적 도면을 도시한 것이다. 주형 핵산은 3'-단부 및/또는 5'-단부에서 유니버셜 캡쳐 영역에 의해 측면 배치될 수 있다. 유니버셜 캡쳐 영역은 예를 들어, Illumina® 유니버셜 캡쳐 프라이머 P5 또는 P7의 서열을 가질 수 있다. 주형 핵산은 하나 이상의 타겟-특이적 캡쳐 영역("타겟"), 및 둘 이상의 제한 사이트를 분리시키는 하나 이상의 스페이서 영역을 갖는 둘 이상의 제한 사이트(예를 들어, SapI 사이트, 도 6d)를 추가로 포함할 수 있다. 타겟-특이적 캡쳐 영역은 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역과 제1 제한 사이트 사이에(도 6a), 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역과 제2 제한 사이트 사이에(도 6b), 또는 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역과 제1 제한 사이트 사이 및 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역과 제2 제한 사이트 사이 둘 모두에 위치될 수 있다(도 6c).
도 7은 고정된 캡쳐 프라이머의 개질을 위해 본원에 제공된 방법을 예시한 개략도를 도시한 것이다. 도 7a는 유니버셜 캡쳐 영역을 통해 고정된 캡쳐 프라이머와 혼성화하는 주형 핵산을 예시한 것이다. 혼성화된 캡쳐 프라이머의 연장은 주형 핵산에 대해 상보적인 고정된 확장 생성물의 형성을 야기시킨다. 확장 생성물의 3'-단부는 상보적인 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역을 갖는 다른 고정된 캡쳐 프라이머와 혼성화시킬 수 있고, 이에 의해 브릿지 구조를 형성시킨다. KEA의 하나 이상의 라운드(round)는 고정된 주형 핵산의 모노클로날 클러스터의 형성을 야기시킨다. 도 7b는 제한 효소로의 고정된 주형 핵산의 분열을 예시한 것이다. 도 7c는 도 7b에서 제한 효소 분열로부터 형성된 고정된 키메라 캡쳐 프라이머를 예시한 것이다. 키메라 캡쳐 프라이머 각각은 유니버셜 캡쳐 영역 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 갖는다. 제한 효소 분열은 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 추가로 수득한다. 도 7d는 패턴화된 흐름 셀의 각 웰이 키메라 캡쳐 프라이머의 모노클로날 집단을 갖도록, 패턴화된 흐름 셀 상에, 키메라 캡쳐 프라이머의 복수의 모노클로날 집단이 형성될 수 있고, 이에 의해 집단에서 모든 키메라 캡쳐 프라이머가 동일한 타겟-특이적 캡쳐 영역을 갖는 것을 예시한 것이다. 패턴화된 흐름 셀의 상이한 셀은 동일한 타겟-특이적 캡쳐 영역 또는 상이한 타겟-특이적 캡쳐 영역을 갖는 키메라 캡쳐 프라이머의 모노클로날 집단을 가질 수 있다.
도 8은 개질된 캡쳐 프라이머를 사용한 타겟 폴리누클레오티드의 타겟-특이적 캡쳐를 위한 예시적인 방법을 예시한 개략도를 도시한 것이다. 도 8a는 DNA 샘플, 예를 들어, 게놈 DNA 샘플로부터 시퀀싱 라이브러리의 제조를 예시한 것이다. 멀티플렉스화된 PCR 반응에서, 타겟 폴리누클레오티드는 풍부하게 되며, 어댑터는 풍부한 타겟 폴리누클레오티드의 한 단부에 첨가된다. 도 8b는 도 8a의 타겟 폴리누클레오티드를 유니버셜 캡쳐 영역 및 타겟 특이적 캡쳐 영역을 포함하는 고정된 키메라 캡쳐 프라이머를 갖는 차세대 시퀀싱(NGS) 흐름 셀과 접촉시키는 단계를 예시한 것이다. 도 8c는 타겟 폴리누클레오티드의 상보적 서열 및 이의 어댑터 서열을 도입하기 위해 타겟 폴리누클레오티드에 혼성화되는 키메라 캡쳐 프라이머의 초기 연장을 예시한 것이다. 도 8c는 연장된 캡쳐 프라이머의 후속 브릿지 증폭을 추가로 예시한 것이다.
도 9는 타겟 폴리누클레오티드의 타겟-특이적 캡쳐를 수행하고자 할 때 직면하게 되는 과제(challenge)를 예시한 그래프를 도시한 것이다. 도 9a 및 도 9b는 이의 종결 유니버셜 캡쳐 영역을 통한 흐름 셀 상의 타겟 폴리누클레오티드의 초기 캡쳐를 수반하는 NGS 프로토콜을 예시한 것이다. 도 9c는 타겟-특이적 캡쳐 영역을 갖는 고정된 캡쳐 프라이머에 의한 흐름 셀 상의 타겟 폴리누클레오티드의 초기 캡쳐를 수반하는 NGS 프로토콜을 예시한 것이다.
도 10은 패턴화된 흐름 셀 상에 모노클로날 캡쳐 패드를 형성시키기 위한 그리고 타겟-폴리누클레오티드를 타겟-특이적으로 캡쳐하고 연장시키고 패턴화된 흐름 셀의 각 패드에서 타겟-폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 형성시키기 위한 예시적인 방법을 예시한 그래프를 도시한 것이다.
도 11은 고정화된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 개질시키기 위한 본원에 제공된 예시적 방법을 예시한 그래프를 도시한 것이다.
도 12a 및 도 12b는 고정화된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 개질시키기 위한 본원에 제공된 예시적 방법을 예시한 그래프를 도시한 것이다.
도 13은 고정화된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 개질시키기 위한 본원에 제공된 예시적 방법을 예시한 그래프를 도시한 것이다.
도 14는 고정화된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 개질시키기 위한 본원에 제공된 예시적 방법을 예시한 그래프를 도시한 것이다.
도 15는 고정화된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 개질시키기 위한 본원에 제공된 예시적 방법을 예시한 그래프를 도시한 것이다.
도 16은 부분 주형 핵산의 예시적인 다이머를 예시한 그래프를 도시한 것이다. 다이머는 이의 5'-단부(P5)에 제1 유니버셜 캡쳐 영역, 제한 사이트(SapI) (SEQ ID NO: 9 및 10), 및 이의 3'-단부에 타겟-특이적 캡쳐 영역(CP)을 포함하는 제1 올리고누클레오티드를 갖는다. 다이머 주형 핵산은 3'-단부(CP')에 상보적 타겟-특이적 캡쳐 영역, 시퀀싱 프라이머 결합 사이트(SBS) 및 이의 5'-단부(P7)에 제2 유니버셜 캡쳐 영역을 포함하는 제2 올리고누클레오티드를 갖는다.
도 17은 패턴화된 흐름 셀 상의 웰의 모노클로날 점유가 초기 시딩 조건(예를 들어, 시딩의 단일 사이클 후에 점유된 사이트의 %, x-축) 및 시딩 이벤트의 수(모델링된 2 내지 16개의 이벤트: 다이아몬드: 2개의 이벤트; 사각형: 3개의 이벤트; 삼각형: 4개의 이벤트; 십자형: 16개의 이벤트)에 따라 어떻게 달라질 수 있는 지를 기술하기 위한 컴퓨터 시뮬레이션의 결과를 예시한 그래프를 도시한 것이다.
도 18은 가용성 트리거 분자를 사용하여 패턴화된 흐름 셀 상의 고정된 확장 생성물의 타겟화된 활성화를 위한 본원에 제공된 예시적인 방법을 예시한 그래프를 도시한 것이다. 상이한 고정된 확장 생성물은 A, B, 및 C로 라벨링된다.
도 19는 고정된 트리거 분자를 사용하여 패턴화된 흐름 셀 상의 고정된 확장 생성물의 타겟화된 활성화를 위한 본원에 제공된 예시적인 방법을 예시한 그래프를 도시한 것이다. 상이한 고정된 확장 생성물은 A, B, 및 C로 라벨링된다. 패턴화된 흐름 셀의 패드는 상이한 단부를 갖는 3개의 분자로 시딩되었으며, 소량의 키메라 P5/B' 프라이머는 각 패드에서 고정된다. 분자 B는 키메라 프라이머의 상보적 B' 단부에 혼성화시킬 수 있으며, 이는 연장될 수 있고, 패드의 증폭을 개시할 수 있다. 다른 패드는 상이한 단부를 갖는 키메라 프라이머(예를 들어, P5/A' 프라이머 또는 P5/C' 프라이머)를 가질 수 있다.
도 20은 분열 가능한 헤어핀을 사용하여 고정된 확장 생성물의 확률적 활성화를 위한 본원에 제공된 예시적 방법을 예시한 그래프를 도시한 것이다.
도 21은 트리거 서열이 결여된 적은 분율의 시드 핵산을 증폭시키기 위해 트리거 서열을 갖는 소량의 가용성 프라이머를 사용하여 고정된 확장 생성물의 확률적 활성화를 위한 본원에 제공된 방법의 예시적인 결과를 도시한 것이다.
차세대 시퀀싱(NGS) 기술은 예를 들어 브릿지 증폭에 의해 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터 형성된, 표면 상에 고정화된 단일 타겟 폴리누클레오티드의 고도의 병렬 시퀀싱, 또는 타겟 누클레오티드의 클론 집단의 시퀀싱에 따른다. 타겟 폴리누클레오티드의 시퀀싱 클론 집단은 시퀀싱 단일 폴리누클레오티드 보다 훨씬 큰 신호-대-노이즈 비(SNR)를 산출하고, 시퀀싱 반응의 감도 및 정확성을 개선시키고, 시퀀싱 기기에서 저비용 옵틱(optics)의 사용을 가능하게 한다.
본 발명은 부분적으로, NGS의 데이타 품질 및 경제가 시퀀싱 반응의 SNR을 추가로 개선시키는, 타겟 폴리누클레오티드의 고정된 클론 집단의 크기 및 밀도를 증가시킴으로써 추가로 개선될 수 있다는 것으로 기초로 한 것이다.
NGS에서, 타겟 폴리누클레오티드는 개개 타겟 폴리누클레오티드가 서로 공간적으로 분리되고 시퀀싱의 후속 사이클에서 구별 가능하도록, 예를 들어, 흐름 셀(FC)의 기판 상에 캡쳐될 수 있다. 당해 분야에 공지된 캡쳐 방법은 자연에서 통상적으로 무작위적이고, 적어도 일부, 기판 상에서 고정된 타겟 폴리누클레오티드의 최적 밀도를 달성하기 위해 실험 조건의 정확한 조절을 필요로 한다. 적절치 않은 조건은 개개 타겟 폴리누클레오티드가 구별 가능하지 않거나 대안적으로 고가의 시퀀싱 시약을 소비하는 시퀀싱 구동에 따라 획득된 정보를 감소시킬 수 있는 높은 결원율(vacancy rate)을 야기시킬 수 있도록 과잉 수용(overcrowding)을 야기시킬 수 있다.
최근에, 여러 상업적으로 입수 가능한 흐름 셀 상에 클론 타겟 폴리누클레오티드 집단 보다 크고 보다 높은 밀도로 배열된 고정된 타겟 폴리누클레오티드의 클론 집단의 정렬된 성장을 가능하게 하는 패턴화된 흐름 셀이 개발되었다[예를 들어, US 2013/0096034 A1호 참조; Illumina® HiSeq-X10 패턴화된 흐름 셀). 예를 들어, 일부 패턴화된 흐름 셀은 1.5 ㎛ 피치의 400 nm 직경의 나노웰을 갖는 마이크로어레이를 특징으로 한다[예를 들어, 도 1.1 참조]. 나노웰 각각에는 하이드로겔 및 하이드로겔에 엠베딩된 프라이머로 채워진다[예를 들어, US 2014/0079923 A1호 참조]. 나노웰을 둘러싸는 표면에는 프라이머가 존재하지 않을 수 있고, 이에 의해 타겟 폴리누클레오티드의 클론 집단의 크기를 나노웰의 크기, 예를 들어, 400 nm의 직경으로 제한한다.
원칙적으로, 역학적 배제 검정(KEA)은 페턴화된 흐름 셀 상의 웰 당 단일 타겟 폴리누클레오티드의 증폭 및 웰들 중 하나 이상에서 모노클로날 타겟 폴리누클레오티드 집단의 생산을 가능하게 한다[예를 들어, US 2013/0338042 A1호 참조]. KEA에서, 웰 내의 제1 캡쳐된 타겟 폴리누클레오티드의 증폭 속도는 타겟 폴리누클레오티드 이동 및 캡쳐의 훨썬 느린 속도와 비교하여 훨씬 더 빠르다. 웰에서 캡쳐된 제1 타겟 폴리누클레오티드는 빠르게 증폭되고 전체 웰을 채울 수 있어서, 동일한 웰에서 추가적인 타겟 폴리누클레오티드의 캡쳐를 방지한다.
본 발명은 부분적으로, 나노웰의 크기가 증가함에 따라 패턴화된 흐름 셀의 나노웰에서 모노클로날 타겟 폴리누클레오티드 집단의 생산과 관련한 KEA의 효과성(effectiveness)이 감소한다는 인식을 기초로 한 것이다. 제1 캡쳐된 타겟 폴리누클레오티드의 중폭 및 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단으로 웰의 충전은 보다 작은 웰에서 보다 보다 큰 웰에서 더욱 느리며, 제2 타겟 폴리누클레오티드의 캡쳐는 보다 작은 웰에서 보다 보다 큰 웰에서 더욱 빠르다. 이에 따라, 하나 초과의 타겟 폴리누클레오티드가 나노웰 내에서 캡쳐되고 증폭될 가능성은 나노웰의 크기와 함께 증가한다. 웰로부터의 시퀀싱 데이타 품질은 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단에 대해 최적화된다. 제1의 고정된 타겟 폴리누클레오티드와는 다른 타겟 폴리누클레오티드의 공유(share)가 증가함에 따라 웰로부터의 데이타 품질은 감소한다.
이에 따라, 패턴화된 흐름 셀의 큰 나노웰에서 모노클로날 타겟 폴리누클레오티드 집단의 생산을 촉진시키기 위한 새로운 방법이 요구되고 있다.
본 발명은 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키기 위한 방법 및 키트를 제공한다. 하나의 유용한 구체예에서, 본 발명은 패턴화된 흐름 셀의 웰에서 타겟-폴리누클레오티드의 모노클로날 집단의 생산을 가능하게 한다. 상세하게, 본 발명은 크기에 있어서 확장되고 당해 분야에 공지된 통상적으로 사용되는 NGS 방법으로 형성된 타겟 폴리누클레오티드의 클론 집단 보다 더욱 높은 밀도로 배열된 타겟-폴리누클레오티드의 클론 집단의 생산을 촉진시킨다. 본 발명의 방법은 특히, 일부 게놈의 타겟화된 시퀀싱와 관련된 적용에서, 보다 높은 처리량으로 고품질의 NGS 데이타의 수집을 촉진시킨다. 본 발명의 방법으로 달성된 보다 높은 SNR은 단순한 옵틱 및 검출 기기의 사용을 가능하게 할 수 있어서, 검정 비용을 낮출 수 있다. 높은 데이타 품질 및 개선된 샘플 처리량은 예를 들어, 질병 진단 및 예후에서, 타겟-특이적 NGS에 대한 새로운 넓은 적용 분야를 열 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 드문 유전적 돌연변이의 신뢰성 있는 조기 검출을 용이하게 함으로써, 예를 들어, 드문 유전적 돌연변이를 수반하는 질병으로부터 고통 당하는 환자, 예를 들어, 암 환자에게 유익할 것으로 예상된다. 조기 질병 검출은 보다 많은 수의 치료 옵션 및 개선된 치료 결과로 옮겨질 수 있다.
본 발명은 또한, 부분적으로, 상보적 유니버셜 캡쳐 영역을 갖는 핵산의 브릿지 증폭을 가능하게 하지만 고려되는 개개 폴리누클레오티드의 타겟-특이적 캡쳐를 가능하지 못하게 하는, 여러 패턴화된 흐름 셀의 웰이 유니버셜 캡쳐 프라이머의 쌍을 갖는 인식을 기초로 한 것이다. 패턴화된 흐름 셀의 유용한 양태가 높은 피쳐 밀도로 인한 NGS 반응의 증가된 처리량 및 공지된 패드 위치로 인한 보다 용이한 클러스터 등록이지만, 패턴화된 흐름 셀의 단점은 모노클로날 패드(웰)를 합성하기 위한 요구로서, 여기서, 특정 패드 상의 DNA의 클러스터는 단지, 단일 DNA 분자로부터 발생한다. 폴리클로날 패드는 불가능하지 않는 경우에, 베이스 콜링(base calling)을 제공하기 어렵다(낮은 %PF).
본 발명은 또한, 부분적으로, 타겟 폴리누클레오티드의 타겟-특이적 캡쳐를 수반하는 NGS 프로토콜이 유니버셜 캡쳐 영역을 사용한 타겟-폴리누클레오티드의 캡쳐를 수반하는 NGS 프로토콜에 비해 더욱 낮은 품질의 시퀀싱 데이타를 수득할 수 있다는 인식을 기초로 한 것이다[예를 들어, 도 9 참조]. 도 9a 및 도 9b는 유니버셜 캡쳐 영역을 통해 흐름 셀 상에서의 타겟 폴리누클레오티드의 초기 캡쳐를 수반하는 NGS 프로토콜을 예시한 것이다. 도 9c는 고정된 타겟-특이적 캡쳐 프라이머에 의해 타겟 폴리누클레오티드의 초기 캡쳐를 수반하는 NGS 프로토콜의 양태를 예시한 것이다. 다수의 NGS 흐름 셀 상에서 타겟-특이적 캡쳐 영역을 갖는 고정된 캡쳐 프라이머가 (캡쳐된 타겟 폴리누클레오티드의 효과적인 브릿지 증폭 및 타겟 폴리누클레오티드 클러스터의 분리를 가능하게 하기 위해) 고정화된 유니버셜 캡쳐 프라이머에 비해 훨씬 덜 빈번하기 때문에, 그리고, 특정 타겟 폴리누클레오티드가 예를 들어, 게놈 DNA 단편의 집단에서 드물 수 있기 때문에, 타겟-특이적 시딩율은 유니버셜 캡쳐 영역을 기초로 한 시딩율에 비해 훨쓴 더 느릴 수 있다. 이에 따라, 경쟁하는 부반응 및 불규칙적인 증폭 이벤트는 유니버셜 캡쳐를 필요로 하는 프로토콜에서 보다 타겟-특이적 캡쳐를 시도할 때 더욱 잘 일어날 수 있으며, 이는 궁극적으로, 타겟 특이적 캡쳐를 따르는 NGS 시퀀싱 반응의 데이타 품질을 낮출 수 있다.
본원에는 고려되는 개개 폴리누클레오티드가 패턴화된 흐름 셀의 하나 이상의 웰에서 타겟-특이적으로 캡쳐될 수 있도록, 패턴화된 흐름 셀의 개개 웰에서 (예를 들어, 유니버셜) 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법이 제공된다. 본원에 제공된 방법의 일부 구체예에서, 타겟-특이적 캡쳐 영역을 갖는 캡쳐 프라이머의 고밀도 모노클로날 집단을 갖는 모노클로날 캡쳐 패드가 형성된다. 일부 구체예에서, 모노클로날 캡쳐 패드는 타겟 폴리누클레오티드의 타겟-특이적 시딩률을 증가시키고, 경쟁하는 부반응 및 불규칙적인 증폭 이벤트를 억제할 수 있으며, 이에 의해, NGS 데이타 품질을 개선시킨다. 본원에 제공된 방법의 대타겟인 예시는, 예를 들어, 도 10에 도시되어 있다. 고려되는 타겟-특이적으로 캡쳐된 폴리누클레오티드의 브릿지 증폭은 이후에, 패턴화된 흐름 셀 중 하나 이상의 웰에 타겟 폴리누클레오티드 앰플리콘의 모노클로날 집단을 형성시키기 위해 사용될 수 있다. 본원에 제공된 방법에 따르면, 타겟-특이적 캡쳐 서열을 포함하는 단일 주형 핵산은 초기에 이의 유니버셜 캡쳐 영역을 통해 패턴화된 흐름 셀의 개개 패드 상에 시딩될 수 있으며, 단일 주형 핵산의 후속 증폭은 동일한 패드로부터 추가적인 주형 핵산을 배제하여, 모노클로날 캡쳐 패드의 형성을 야기시킨다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 단수 형태는 문맥이 달리 명확하게 명시하지 않는 한 복수 대상체를 포함한다는 것이 주지되어야 한다. 이에 따라, 예를 들어, "바이오마커"에 대한 언급은 둘 이상의 바이오마커의 혼합물, 등을 포함한다.
특히 제공된 양에 관한 용어 "약"은 플러스 또는 마이너스 5%의 편차를 포함하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "포함하다," "포함하는," "함유하다," "함유하는" 및 이들의 변형은 구성요소 또는 구성요소들의 리스트를 포함하거나 함유하는 공정, 방법, 공정에 의한 산물, 또는 물질의 조성물이 단지 그러한 구성요소들을 포함하지 않고, 이러한 공정, 방법, 공정에 의한 산물, 또는 물질의 조성물에 명확하게 나열되거나 내재되지 않는 다른 구성요소들을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "기판"은 고체 지지체를 의미하는 것으로 의도된다. 그러한 용어는 핵산, 폴리펩티드 및/또는 다른 폴리머를 포함하는 바이오폴리머의 침적을 위해 웰과 같은 피쳐의 생성을 위해 고체 또는 반-고체 기초로서 기능할 수 있는 임의 물질을 포함한다. 본 발명의 기판은 예를 들어, 개질되거나, 당업자에게 널리 공지된 다양한 방법에 의해 바이오폴리머의 부착을 수용하기 위해 개질될 수 있다. 기판 물질의 예시적인 타입은 유리, 개질된 유리, 작용화된 유리, 무기 유리, 불활성 및/또는 자성 입자를 포함하는 미소구체, 플라스틱, 다당류, 나일론, 니트로셀룰로오스, 세라믹, 수지, 실리카, 실리카-기반 물질, 탄소, 금속, 광학적 섬유 또는 광학적 섬유 번들, 상기에 예시된 것과는 다른 다양한 폴리머, 및 다중웰 마이크로티어(microtier) 플레이트를 포함한다. 예시적인 플라스틱의 특정 타입은 아크릴, 폴리스티렌, 스티렌과 다른 물질의 코폴리머, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄 및 Teflon™을 포함한다. 예시적 실리카-기반 물질의 특정 타입은 실리콘 및 다양한 형태의 개질된 실리콘을 포함한다.
당업자는 본 발명의 기판의 조성 및 기하학적 구조가 의도된 용도 및 사용자의 선호도에 따라 달라질 수 있다는 것을 인지하거나 이해할 것이다. 이에 따라, 평면 기판, 예를 들어, 슬라이드, 칩 또는 웨이퍼가 본원에서 예시를 위해 마이크로어레이에 관하여 예시되어 있지만, 본원에 제공된 교시 및 안내를 고려하여, 당업자는 본원에 예시되거나 당해 분야에서 널리 공지된 매우 다양한 다른 기판이 또한 본 발명의 방법 및/또는 조성물에서 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
일부 구체예에서, 고체 지지체는 패턴화된 표면을 포함한다. "패턴화된 표면(patterned surface)"은 고체 지지체의 노출된 층 안에 또는 노출된 층 상에 상이한 영역의 배열을 지칭한다. 예를 들어, 하나 이상의 영역은 하나 이상의 증폭 프라이머가 존재하는 피쳐일 수 있다. 이러한 피쳐는 증폭 프라이머가 존재하지 않는 개재 영역(interstitial region)에 의해 분리될 수 있다. 일부 구체예에서, 패턴은 열 및 컬럼으로 존재하는 x-y 포맷의 피쳐일 수 있다. 일부 구체예에서, 패턴은 피쳐 및/또는 개재 영역의 반복 배열일 수 있다. 일부 구체예에서, 패턴은 피쳐 및/또는 개재 영역의 랜덤 배열일 수 있다. 본원에 기술된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는 예시적인 패턴화된 표면은 미국일련번호 제13/661,524호 또는 미국특허출원공개번호 제2012/0316086 A1호에 기재되어 있으며, 이러한 문헌 각각은 본원에 참고로 포함된다.
일부 구체예에서, 고체 지지체는 표면에서 웰 또는 오목부(depression)의 어레이를 포함한다. 이는 포토리소그래피, 스탬핑 기술, 모울딩 기술 및 마이크로에칭 기술을 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 다양한 기술을 이용하여 당해 분야에서 일반적으로 알려진 바와 같이 제작될 수 있다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 사용되는 기술은 어레이 기판의 조성 및 형상에 따를 것이다.
패턴화된 표면에서의 피쳐는 패턴화된 공유 결합된 겔, 예를 들어, 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸)아크릴아미드-코-아크릴아미드)(PAZAM, 예를 들어, 미국가특허출원번호 제61/753,833호 참조, 이러한 문헌은 본원에 참고로 포함됨)를 갖는 유리, 실리콘, 플라스틱 또는 다른 적합한 고체 지지체 상의 웰(예를 들어, 마이크로웰 또는 나노웰)의 어레이에서의 웰일 수 있다. 이러한 공정은 다수의 사이클에서 시퀀싱 실행에 걸쳐 안정할 수 있는 시퀀싱에 대해 사용되는 겔 패드를 형성시킨다. 웰에 대한 폴리머의 공유 결합은 다양한 사용 동안 구조화된 기판의 수명 전반에 걸쳐 구조화된 피쳐에 겔을 유지시키는데 도움을 준다. 그러나, 여러 구체예에서, 겔은 웰에 공유 결합될 필요는 없다. 예를 들어, 일부 조건에서, 구조화된 기판의 임의 부분에 공유 결합되지 않은 실란 유리 아크릴아미드(SFA, 예를 들어, 미국특허출원공개번호 제2011/0059865 A1호 참조, 이러한 문헌은 본원에 참고로 포함됨)는 겔 물질로서 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 구조화된 기판은 웰(예를 들어, 마이크로웰 또는 나노웰)을 갖는 고체 지지체 물질을 패턴화시키고, 패턴화된 지지체를 겔 물질(예를 들어, PAZAM, SFA 또는 화학적으로 개질된 이의 변형체, 예를 들어, SFA의 아지돌화된 버젼(아지도-SFA))으로 코팅하고, 예를 들어, 화학적 또는 기계적 폴리싱을 통해 겔 코팅된 지지체를 폴리싱하여, 이에 의해 웰에서 겔을 유지시키면서 웰들 사이의 구조화된 기판의 표면 상에 개재 영역으로부터 실질적으로 모든 겔을 제거하거나 비활성화시킴으로써 제조될 수 있다. 프라이머 핵산은 겔 물질에 부착될 수 있다. 타겟 핵산(예를 들어, 단편화된 인간 게놈)의 용액은 이후에, 개개 타겟 핵산이 겔 물질에 부착된 프라이머와의 상호작용을 통해 개개 웰을 시딩하도록 폴리싱된 기판과 접촉될 수 있다. 그러나, 타겟 핵산은 겔 물질의 부재 또는 비활성화로 인해 개재 영역을 점유하지 않을 것이다. 개재 영역에서 겔의 부재 또는 비활성화가 성장하는 핵산 콜로니의 외측 이동을 방지하기 때문에, 타겟 핵산의 증폭이 웰에 한정될 것이다. 이러한 공정은 편리하게 제작 가능하고 확장 가능하고 통상적으로 사용되는 마이크로- 또는 나노-제작 방법이다.
패턴화된 기판은 예를 들어, 슬라이드 또는 칩에 에칭된 웰을 포함할 수 있다. 에칭의 패턴 및 웰의 기하학적 구조는 이러한 피쳐가 서로 물리적으로 또는 기능적으로 분리 가능한 한 다양한 상이한 형상 및 크기를 채용할 수 있다. 이러한 구조 피쳐를 갖는 특히 유용한 기판은 미소구체와 같은 고체 지지체 입자의 크기를 선택할 수 있는 패턴화된 기판이다. 이러한 특징을 갖는 예시적인 패턴화된 기판은 BeadArray 기술[Illumina, Inc., San Diego, Calif.]과 관련하여 사용되는 에칭된 기판이다. 추가 예는 미국특허번호 제6,770,441호에 기재되어 있으며, 이러한 문헌은 본원에 참고로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산과 관련하여 사용되는 경우 용어 "고정된"은 공유 또는 비-공유 결합(들)을 통한 고형 지지체로의 직접 또는 간접 부착을 의미하고자 한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 공유 부착이 사용될 수 있으나, 요구되는 모든 것은 핵산이 예를 들어, 핵산 증폭 및/또는 시퀀싱이 필요한 적용에서 지지체를 사용하고자 하는 조건하에 지지체에 부착된 채 유지되거나 정지된 채 유지되는 것이다. 캡쳐 프라이머 또는 증폭 프라이머로서 사용될 올리고누클레오티드는 3' 단부가 효소 연장에 이용가능하고 서열의 적어도 일부가 상보적 서열에 혼성화될 수 있도록 고정화된다. 혼성화를 통해 표면 부착된 올리고누클레오티드로의 고정화가 발생할 수 있으며, 이 경우 고정된 올리고누클레오티드 또는 폴리누클레오티드는 3'-5' 배향일 수 있다. 대안적으로, 고정화는 염기-쌍 혼성화 예컨대, 상기 제시된 공유 부착 이외의 수단에 의해 발생할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "어레이"는 상대적인 위치에 따라 서로 구분될 수 있는 사이트의 집단을 나타낸다. 어레이의 상이한 사이트에 있는 상이한 분자는 어레이에서 사이트의 위치에 따라 서로 구분될 수 있다. 어레이의 개별 사이트에는 특정 타입의 하나 이상의 분자가 포함될 수 있다. 예를 들어, 사이트에는 특정 서열을 갖는 단일 타겟 핵산 분자가 포함될 수 있거나 부위에는 동일한 서열(및/또는 이들의 상보적 서열)을 갖는 몇몇 핵산 분자가 포함될 수 있다. 어레이의 사이트는 동일한 기재 상에 배치된 상이한 특징부일 수 있다. 예시적 특징부에는 비제한적으로 기재 내의 웰, 기내 내 또는 상의 비드(또는 다른 입자), 기재로부터의 돌출부, 기재 상의 융기 또는 기재 내의 채널이 포함된다. 어레이의 사이트는 각각 상이한 분자를 보유하는 별도의 기재일 수 있다. 별도의 기재에 부착된 상이한 분자는 기재가 연합되는 표면 상 기재의 위치에 따라 또는 액체 또는 겔 중 기재의 위치에 따라 확인될 수 있다. 별도의 기재가 표면 상에 배치된 예시적 어레이에는 비제한적으로 웰 내 비드를 갖는 것들이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "복수"는 둘 이상의 상이한 일원의 집단을 의미하는 것으로 의도된다. 복수는 크기에 크기에 있어서 작은, 중간, 큰 것에서 매우 큰 것까지의 범위일 수 있다. 작은 복수의 크기는 예를 들어, 수 개의 일원 내지 수십 개의 일원의 범위일 수 있다. 중간 크기의 복수는 예를 들어, 수십 개의 일원 내지 약 100개 일원 내지 수백 개의 일원의 범위일 수 있다. 큰 복수는 예를 들어, 약 수백 개의 일원 내지 약 1000개의 일원, 수천 개의 일원 및 최대 수만 개의 일원의 범위일 수 있다. 매우 큰 복수는 예를 들어, 수만 개의 일원 내지 약 수십만, 백만, 수백만, 수천만 및 최대 수억 이상의 일원의 범위일 수 있다. 이에 따라, 복수는 크기에 있어서 일원의 수에 의해 측정하는 경우에, 둘 내지 1억개의 일원, 뿐만 아니라 모든 크기의 범위일 수 있고, 상기 예시된 범위 사이 및 이보다 더욱 큰 범위일 수 있다. 마이크로어레이 내의 예시적인 피쳐의 수는 1.28 cm2 내에서 복수의 약 500,000개 이상의 별개의 피쳐를 포함한다. 예시적인 핵산 복수성은 예를 들어, 약 1×105, 5×105 및 1×106 이상의 상이한 핵산 종의 집단을 포함한다. 이에 따라, 이러한 용어의 정의는 2 초과의 모든 정수 값을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 복수의 상한치는 예를 들어, 본 발명의 핵산 샘플에서 누클레오티드 서열의 이론적 다양성에 의해 셋팅될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "핵산"은 임의 문맥에서 제시된 핵산 분석물을 포함하는 리보핵산 또는 데옥시리보핵산 또는 이의 유사체; 예를 들어, 프로브, 타겟 또는 프라이머를 의미하는 것으로 의도된다. 본 발명의 특정 형태의 핵산은 유기체에서 발견된 모든 타입의 핵산, 뿐만 아니라, 합성 핵산, 예를 들어, 화학적 합성에 의해 형성된 폴리누클레오티드를 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 형성된 마이크로어레이에 도입을 통한 분석을 위해 적용 가능한 핵산의 특정 예는 게놈 DNA(gDNA), 발현된 서열 태그(ESTs), DNA 복사된 메신져 RNA(cDNA), RNA 복사된 메신져 RNA(cRNA), 미토콘드리아 DNA 또는 게놈, RNA, 메신져 RNA(mRNA) 및/또는 RNA의 다른 집단을 포함한다. 이러한 예시적인 핵산의 단편 및/또는 부분은 또한, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어의 의미 내에 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "이중쇄"는 핵산 분자에 대해 이용되는 경우, 핵산 분자에서 실질적으로 모든 누클레오티드가 상보적 누클레오티드에 수소 결합됨을 의미한다. 부분 이중쇄 핵산은 그 누클레오티드의 적어도 10%, 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%가 상보적 누클레오티드에 수소 결합될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "단쇄"는, 핵산 분자에 관하여 사용될 때, 본질적으로 핵산 분자 중의 누클레오티드가 상보적인 누클레오티드에 수소 결합되지 않음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "타겟 폴리누클레오티드"는 분석 또는 작용의 대상인 폴리누클레오티드를 의미하고자 한다. 분석 또는 작용은 폴리누클레오티드의 복사, 증폭, 시퀀싱 및/또는 핵산 조회(interrogation)를 위한 기타 절차로의 처리를 포함한다. 타겟 폴리누클레오티드는 분석될 타겟 서열에 추가적인 누클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 타겟 폴리누클레오티드는 분석하고자 하는 타겟 폴리누클레오티드 서열의 측면에 인접한 프라이머 결합 자리로서 작용하는 어댑터를 포함하는 하나 이상의 어댑터를 포함할 수 있다. 타겟 올리고누클레오티드 또는 타겟 프라이머로 혼성화된 타겟 폴리누클레오티드는 타겟 폴리누클레오티드 전부가 연장되도록 보정되는 것은 아닌 방식으로 타겟 올리고누클레오티드의 5' 또는 3' 말단을 넘어서 연장하는 누클레오티드를 함유할 수 있다. 특정 구체예에서, 하기 추가로 상세히 제시된 바와 같이, 복수의 타겟 폴리누클레오티드는 이들의 타겟 폴리누클레오티드 서열이 상이한 상이한 종을 포함하나, 2개 이상의 상이한 종에 있어서 동일한 어댑터를 갖는다. 특정 타겟 폴리누클레오티드 서열의 측면에 인접할 수 있는 2개의 어댑터는 동일한 서열을 가질 수 있거나 2개의 어댑터는 상이한 서열을 가질 수 있다. 따라서, 복수의 상이한 타겟 폴리누클레오티드는 타겟 폴리누클레오티드 서열의 각 말단에서 동일한 어댑터 서열 또는 2개의 상이한 어댑터 서열을 가질 수 있다. 따라서, 복수의 타겟 폴리누클레오티드에서의 종은 예를 들어, 시퀀싱에 의해 평가하고자 하는 비공지의 서열 부위의 측면에 인접한 공지된 서열 부위를 포함할 수 있다. 타겟 폴리누클레오티드가 단일 말단에서 어댑터를 수반하는 경우, 어댑터는 타겟 폴리누클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단에 위치할 수 있다. 타겟 폴리누클레오티드는 임의의 어댑터 없이 사용될 수 있으며, 이 경우 프라이머 결합 서열은 타겟 폴리누클레오티드에서 발견된 서열로부터 직접적으로 비롯될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "타겟 프라이머"는 예를 들어, 증폭 또는 시퀀싱 반응의 프라이머 어닐링 단계에서 직면한 조건하에 분석되거나 핵산 조회 처리될 단일 가닥 폴리누클레오티드 서열에 특이적으로 어닐링될 수 있는 누클레오티드 서열을 갖는 올리고누클레오티드를 의미하고자 한다. 일반적으로, 용어 "핵산," "폴리누클레오티드" 및 "올리고누클레오티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 다양한 용어는 달리 구체적으로 명시하지 않는 한 크기, 서열 또는 기타 특성에서의 임의의 특정한 차이를 나타내고자 하는 것은 아니다. 설명의 명확성을 위해, 용어는 수개의 핵산 종을 포함하는 특정 방법 또는 조성물을 기술하는 경우 다른 것으로부터 한 종의 핵산을 구별하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 타겟 프라이머 또는 기타 올리고누클레오티드와 관련하여 사용되는 경우 용어 "타겟 특이적"은 타겟 폴리누클레오티드 서열에 특이적인 누클레오티드 서열 즉, 타겟 폴리누클레오티드의 식별 부위에 선택적으로 어닐링될 수 있는 누클레오티드의 서열을 포함하는 타겟 프라이머 또는 기타 올리고누클레오티드를 의미하고자 한다. 타겟 특이적 타겟 프라이머는 단일 종의 올리고누클레오티드를 가질 수 있거나, 이는 상이한 서열을 갖는 2개 이상의 종을 포함할 수 있다. 따라서, 타겟 특이적 타겟 프라이머는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 초과의 상이한 서열을 포함하는 2개 또는 그 초과의 서열일 수 있다. 타겟 특이적 타겟 올리고누클레오티드는 타겟 특이적 타겟 프라이머 서열 및 보편적 타겟 프라이머 서열을 포함할 수 있다. 기타 서열 예컨대, 시퀀싱 프라이머 서열 및 기타 등등은 또한, 타겟 특이적 타겟 프라이머에 포함될 수 있다.
비교시, 타겟 프라이머 또는 기타 올리고누클레오티드 서열과 관련하여 사용되는 경우 용어 "유니버셜"은 복수의 타겟 프라이머 중에서 공통의 누클레오티드 서열을 갖는 타겟 프라이머 또는 기타 올리고누클레오티드를 의미하고자 한다. 공통의 서열은 예를 들어, 동일한 어댑터 서열에 상보적인 서열일 수 있다. 유니버셜 타겟 프라이머는 상이한 종을 반드시 구별할 필요 없이 복수의 상이한 폴리누클레오티드의 조회에 적용될 수 있는 반면, 타겟 특이적 타겟 프라이머는 상이한 종을 구별하기 위해 적용가능하다.
본원에서 사용되는 용어 "앰플리콘"은 핵산에 대해 이용되는 경우, 핵산 복제 산물을 의미하며, 여기서 산물은 핵산의 적어도 일부 누클레오티드 서열과 동일하거나 상보적인 누클레오티드 서열을 갖는다. 앰플리콘은, 예를 들어 폴리머라아제 연장, 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR), 순환원 증폭(RCA), 결찰 연장, 또는 결찰 연쇄 반응을 포함하는, 주형으로서 핵산 또는 이들의 앰플리콘을 이용하는 다양한 임의의 증폭 방법에 의해 생성될 수 있다. 앰플리콘은 특정 누클레오티드 서열의 단일 사본(예로 PCR 산물) 또는 누클레오티드 서열의 다중 사본(예로 RCA의 콘카타머 산물)을 갖는 핵산 분자일 수 있다. 타겟 핵산의 첫 번째 앰플리콘은 전형적으로 상보적 사본이다. 후속 앰플리콘은 첫 번째 앰플리콘의 생성 후 타겟 핵산으로부터 또는 첫 번째 앰플리콘으로부터 생성되는 사본이다. 후속 앰플리콘은 타겟 핵산에 실질적으로 상보적이거나 타겟 핵산과 실질적으로 동일한 서열을 가질 수 있다.
형성될 수 있는 주형 복사본 또는 앰플리콘의 수는 예를 들어, 증폭 사이클 실행의 수를 변경시키고/거나 증폭 반응에서 다양한 진행도의 폴리머라아제를 사용하고/거나 증폭 반응이 실행되는 시간의 길이를 변경시키는 것을 포함하는 증폭 반응의 적절한 개질, 뿐만 아니라, 증폭 수율에 영향을 미치기 위해 당해 분야에 공지된 다른 조건들의 개질에 의해 조절될 수 있다. 핵산 주형의 복사본의 수는 적어도 1, 10, 100, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 및 10,000개의 복사본일 수 있고, 특정 적용에 따라 달라질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "클론 집단"은 특정 누클레오티드 서열에 대해 동종성인 핵산 집단을 나타낸다. 상동성 서열은 전형적으로 적어도 10 누클레오티드 길이지만, 예를 들어 적어도 50, 100, 250, 500 또는 1000 누클레오티드 길이를 포함하여 더 길 수 있다. 클론 집단은 단일 타겟 핵산 또는 주형 핵산에서 유래될 수 있다. 전형적으로 클론 집단에서의 모든 핵산은 동일한 누클레오티드 서열을 가질 것이다. 클론성에서 벗어나지 않고 소수의 돌연변이(예로 증폭 인공물로 인한 것)가 클론 집단에서 일어날 수 있음이 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "각각"은 항목의 집합에 대해 이용되는 경우, 집합에서의 개별 항목을 나타내기 위한 것이지만 문맥 상 명백히 달리 나타내지 않는 한, 반드시 집합에서의 모든 항목을 나타내는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 용어 "직접적으로"는 기판의 표면을 덮는 층에 관하여 사용될 때, 층이 예를 들어, 접착층과 같은 유의미한 중간층 없이 기판의 표면을 덮는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 표면을 직접적으로 덮는 층은 공유 결합 또는 비-공유 접착을 포함하는 임의 화학적 또는 물리적 상호작용을 통해 이러한 표면에 부착될 수 있다.
본원에는 마이크로어레이, 기판 상에 고정된 핵산을 증폭시키기 위한 방법 및 키트, 및 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법이 제공된다.
본원에 제공된 방법은 웰 또는 피쳐에서 제1 층에서 제1 캡쳐 프라이머 쌍을 사용하여 패턴화된 흐름 셀의 웰 또는 피쳐에 대한 단일 타겟 폴리누클레오티드의 캡쳐 및 고정화를 포함할 수 있다. 초기 타겟 폴리누클레오티드 캡쳐는 예를 들어, KEA에 의해 웰 또는 피쳐 내에 타겟 폴리누클레오티드 앰플리콘의 모노클로날 집단을 형성시키기 위해 단일 타겟 폴리누클레오티드의 초기 증폭 이후에 이루어질 수 있다. 예를 들어, 도 1 내지 도 4 참조. 타겟 폴리누클레오티드 앰플리콘의 모노클로날 집단은 후속하여 후속 시퀀싱 반응에서 피쳐 또는 웰의 휘도, 신호 세기 또는 SNR을 증가시키기 위해 예를 들어, KEA 또는 PCR에 의해 웰 또는 피쳐의 한계를 넘어 확장될 수 있다.
웰 또는 피쳐를 넘어 타겟 폴리누클레오티드 앰플리콘의 모노클로날 집단의 확장은 본원에 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 타겟 폴리누클레오티드 앰플리콘의 모노클로날 집단을 함유한 웰 또는 피쳐를 둘러싸는 제2 층에서 3'-블로킹된 유니버셜 프라이머를 그라프팅시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 도 1.4 및 도 1.5 참조. 앰플리콘 확장은 3'-블로킹된 유니버셜 프라이머를 탈보호화시킨 후에 예를 들어, PCR 또는 KEA에 의해 일어날 수 있다. 예를 들어, 도 1.6 및 1.7 참조.
본원에 제공된 일부 방법에서, 웰 또는 피쳐 내에서의 타겟 폴리누클레오티드의 초기 캡쳐는 폴리누클레오티드 라이브러리의 일원으로서 타겟 폴리누클레오티드를 인지하는 캡쳐 프라이머(예를 들어, SBS3 또는 SBS8 프라이머)에 의해 일어난다. 예를 들어, 도 2.2 및 2.6 참조. 모노클로날 타겟 폴리누클레오티드 앰플리콘의 후속 확장은 웰 또는 피쳐를 둘러싸는 층에서 그라프팅되고 모노클로날 타겟 폴리누클레오티드 앰플리콘의 타겟 폴리누클로에티드를 인지하는 유니버셜 캡쳐 프라이머(예를 들어, P5 또는 P7 프라이머)를 사용하여 일어난다. 예를 들어, 도 2.4 및 2.6 참조.
본원에 제공된 일부 방법에서, 웰 또는 피쳐 내에서의 타겟 폴리누클레오티드의 초기 캡쳐는 웰 또는 피쳐 내의 제1 층에 위치된 제1 캡쳐 프라이머 쌍을 사용하여 일어나고, 후속하여 타겟 폴리누클레오티드 앰플리콘의 모노클로날 집단을 형성시키기 위해 웰 내에서 캡쳐된 타겟 폴리누클레오티드의 증폭으로 이어진다. 예를 들어, 도 3.1 내지 3.4 참조. 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 후속하여 웰을 둘러싸는 층에서 그라프팅되며, 타겟 폴리누클레오티드 앰플리콘의 모노클로날 집단의 확장은 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 또는 KEA에 의해 달성된다. 예를 들어, 도 3.5 및 3.6 참조.
본원에서 제공되는 일부 방법에서, 타겟 폴리누클레오티드의 초기 캡쳐, 이의 증폭 및 타겟 폴리누클레오티드 앰플리콘의 얻어진 집단의 확장은 유니버셜 캡쳐 프라이머(예를 들어, P5 및 P7 프라이머) 및 폴리누클레오티드 라이브러리의 타겟 폴리누클레오티드를 인식하는 캡쳐 프라이머(예를 들어, P5-SBS3 및 P7-SBS8 프라이머)의 혼합물을 함유한 패턴화된 흐름 셀(예를 들어, >1.0 ㎛ 직경)의 확장된 웰 또는 피쳐 내에서 일어난다.예를 들어, 도 4 참조.
본원에 제공된 방법은 패턴화된 흐름 셀 상에서 고밀도의 타겟 폴리누클레오티드 앰플리콘의 확장된 모노클로날 집단의 생산을 가능하게 함으로써 타겟-특이적 NGS 반응의 처리량, 감도 및 데이타 품질을 증가시킬 수 있다. 본원에 제공된 방법은 시퀀싱 반응의 처리량, 감도 및 데이타 품질(예를 들어, 보다 낮은 시퀀싱 오차율)을 증가시킬 수 있고, 비교적 단순한 광학 및 경제적인 기기의 사용을 가능하게 한다.
본원에 제공된 마이크로어레이는 하나 이상의 웰, 및/또는 웰의 내부 표면 및/또는 웰을 둘러싸는 표면을 덮는 하나 이상의 층을 갖는 기판을 포함한다.
본원에 제공된 일부 마이크로어레이는 복수의 웰을 가지며, 각 웰은 고정화된 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 갖는다. 예를 들어, 도 1.5, 2.6, 3.4, 및 4.3 참조. 복수의 웰 중 상이한 웰은 동일한 타겟 폴리누클레오티드 또는 상이한 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 가질 수 있다.
본원에 제공된 일부 마이크로어레이는 하나 이상의 층, 및 하나 이상의 층 각각에서의 하나 이상의 캡쳐 프라이머 쌍을 갖는다. 예를 들어, 도 1.2, 1.4, 2.2, 2.4, 3.2, 3.3, 및 4.2 참조. 이러한 마이크로어레이는 마이크로어레이의 웰에 고정화된 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단의 형성을 가능하게 한다. 예를 들어, 도 1.5, 2.6, 3.4, 및 4.3 참조. 일부 마이크로어레이는 고정화된 타겟 폴리누클레오티드의 동력학 배지 증폭(KEA) 및 웰의 범위 내에서 고정화된 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단의 형성을 촉진시키기 위해 소정의 치수를 갖는 웰(예를 들어, 웰 직경은 1 ㎛ 미만임)을 갖는다. 예를 들어, 도 1.5, 2.6(중앙 패널) 및 3.4 참조. 마이크로어레이는 제2 증폭 단계에서 웰의 범위를 넘어 모노클로날 타겟 폴리누클레오티드 집단의 확장을 추가로 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 도 1.7, 2.6(하부 패널) 및 3.6 참조. 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단의 형성을 가능하게 하는 다른 마이크로어레이는 역학적 배제를 선호하지 않는 확장된 웰(예를 들어, 웰 직경은 1 ㎛ 초과함)을 갖는다. 예를 들어, 도 4 참조. 일부 구체예에서, 역학적 배제를 선호하지 않는 확장된 웰은 캡쳐 프라이머의 적어도 두 개의 쌍(예를 들어, P5/P7 캡쳐 프라이머 쌍)을 갖는다. 예를 들어, 도 4.2 참조.
일부 구체예에서, 등온 증폭은 배제 증폭(ExAmp)으로서도 지칭되는 역학적 배제 증폭(KEA)을 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 핵산 라이브러리는 각각이 사이트를 시딩한 개개 타겟 핵산으로부터 앰플리콘의 실질적인 클론 집단을 포함하는 복수의 증폭 사이트를 형성시키기 위해 증폭 시약을 반응시키는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 증폭 반응은 상당한 수의 앰플리콘이 개개 증폭 사이트의 용량을 채우기 위해 발생될 때까지 진행된다. 이러한 바와 같이 최대한으로 이미 시딩된 사이트의 충전은 사이트에서 랜딩(landing) 및 증폭으로부터 타겟 핵산을 억제하고, 이에 의해 사이트에서 앰플리콘의 클론 집단을 형성시킨다. 일부 구체예에서, 겉보기 클론형성능(apparent clonality)은 심지어 증폭 사이트가 사이트에 제2 타겟 핵산에 도달하기 전에 최대한 채워지지 않는 경우에도 달성될 수 있다. 일부 조건 하에서, 제1 타겟 핵산의 증폭은 충분한 수의 복사본이 사이트로 전달되는 제2 타겟 핵산으로부터 복사본의 생산을 효과적으로 가능하게 하거나 압도하기 위해 제조되는 포인트까지 진행할 수 있다. 예를 들어, 직경이 599 nm 보다 작은 원형 피쳐 상에서 브릿지 증폭 공정을 사용하는 구체예에서, 제1 타겟 핵산을 위한 14 사이클의 대수 증폭(exponential amplification) 후에, 동일한 사이트에서 제2 타겟 핵산으로부터의 오염이 Illumina 시퀀싱 플랫폼에 대해 합성에 의한 시퀀싱 분석(sequencing-by-synthesis analysis)에 악영향을 미치게 하기 위해 불충분한 수의 오염 앰플리콘을 형성시킨다는 것이 결정되었다.
상기 예에서 의해 나타낸 바와 같이, 어레이에서 증폭 사이트는 특정 구체예에서 전체적으로 클로날(clonal)일 수 있지만, 반드시 그러할 필요는 없다. 오히려, 일부 적용에 대하여, 개개 증폭 사이트는 주로 제1 타겟 핵산으로부터 앰플리콘과 함께 집단화될 수 있고, 또한, 제2 타겟 핵산으로부터 낮은 수준의 오염된 앰플리콘을 가질 수 있다. 어레이는, 오염 수준이 어레이의 후속 사용에 대해 허용되지 않는 영향을 미치지 않는 한, 낮은 수준의 오염된 앰플리콘을 갖는 하나 이상의 증폭 사이트를 가질 수 있다. 예를 들어, 어레이가 검출 적용에서 사용될 때, 허용 가능한 오염 수준은 허용되는 않는 방식으로 검출 기술의 노이즈에 대한 신호 또는 해상도에 영향을 미치지 않는 수준일 것이다. 이에 따라, 겉보기 클론형성능은 일반적으로 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 어레이의 특정 용도 또는 적용과 관련될 것이다. 특정 적용을 위해 개개 증폭 사이트에서 허용 가능할 수 있는 예시적인 오염 수준은 최대 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10% 또는 25% 오염 앰플리콘을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 어레이는 이러한 예시적인 오염 앰플리콘 수준을 갖는 하나 이상의 증폭 사이트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 어레이에서 최대 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 심지어 100%의 증폭 사이트는 일부 오염 앰플리콘을 가질 수 있다. 어레이 또는 사이트의 다른 콜렉션에서, 적어도 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 사이트가 클로날일 수 있거나 명백하게 클로날일 수 있다는 것이 이해될 것이다.
일부 구체예에서, 역학적 배제는 다른 이벤트 또는 공정이 일어나는 것을 효과적으로 배제하기 위해 공정이 충분히 빠른 속도로 일어날 때 일어날 수 있다. 예를 들어 보면, 어레이의 사이트가 타겟 핵산의 용액 및 복사본으로부터의 타겟 핵산으로 랜덤하게 시딩되는 핵산 어레이를 제조하는 것은 각 사딩된 사이트를 최대한으로 채우기 위해 증폭 공정에서 발생된다. 본 발명의 역학적 배제 방법에 따르면, 시딩 및 증폭 공정은 증폭 속도가 시딩 속도를 초과하는 조건 하에서 동시에 진행할 수 있다. 이와 같이, 복사본이 제1 타겟 핵산에 의해 시딩된 사이트에서 제조된 비교적 빠른 속도는 증폭을 위한 사이트를 시딩하는 것으로부터 제2 핵산을 효과적으로 배제할 것이다. 역학적 배제 증폭 방법은 미국출원공개번호 제2013/0338042호의 명세서에서 상세히 기술된 바와 같이 수행될 수 있으며, 이러한 문헌은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
역학적 배제는 타겟 핵산의(또는 타겟 핵산의 제1 복사본의) 후속 복사본을 제조하기 위한 비교적 빠른 속도에 대한 증폭을 개시하기 위한 비교적 느린 속도(타겟 핵산의 제1 복사본을 제조하는 느린 속도)를 이용할 수 있다. 이전 문단의 예에서, 역학적 배제는 핵산 시드의 복사본으로 사이트를 채우기 위해 증폭이 일어나는 비교적 바른 속도에 대한 타겟 핵산 시딩의 비교적 느린 속도(예를 들어, 비교적 느린 확산 또는 이송)로 인해 일어난다. 다른 예시적인 구체예에서, 역학적 배제는 사이트를 채우기 위해 후속 복사본이 제조되는 비교적 빠른 속도에 대한 사이트에 시딩된 타겟 핵산의 제1 복사본의 형성의 지연(예를 들어, 지연되거나 느린 활성화)으로 인해 일어날 수 있다. 이러한 예에서, 개개 사이트는 여러 상이한 타겟 핵산으로 시딩될 수 있다(예를 들어, 여러 타겟 핵산은 증폭 이전에 각 사이트에 존재할 수 있다). 그러나, 임의 제공된 타겟 핵산을 위한 제1 복사본 형성은, 제1 복사본 형성의 평균 속도가 후속 복사본이 발생되는 속도와 비교하여 비교적 느리도록 랜덤하게 활성화될 수 있다. 이러한 경우에, 개개 사이트가 여러 상이한 타겟 핵산으로 시딩될 수 있지만, 역학적 배제는 그러한 타겟 핵산들 중 단지 하나를 증폭시킬 수 있을 것이다. 더욱 상세하게, 제1 타겟 핵산이 증폭을 위해 활성화된 직후에, 사이트는 이의 복사본으로 최대하 빠르게 채울 것이며, 이에 의해 사이트에서 제2 타겟 핵산의 복사본이 제조되는 것을 방지한다.
증폭 시약은 앰플리콘 형성을 촉진시키고 일부 경우에 앰플리콘 형성의 속도를 증가시키는 성분들을 추가로 포함할 수 있다. 일 예는 리콤비나아제(recombinase)이다. 리콤비나아제는 반복된 침습/확장을 가능하게 함으로써 앰플리콘 형성을 촉진시킬 수 있다. 더욱 상세하게, 리콤비나아제는 폴리머라아제에 의한 타겟 핵산의 침습 및 앰플리콘 형성을 위한 주형으로서 타겟 핵산을 사용하여 폴리머라아제에 의한 프라이머의 확장을 촉진시킬 수 있다. 이러한 공정은 연쇄 반응으로서 반복될 수 있으며, 여기서, 침습/확장의 각 라운드로부터 형성된 앰플리콘이 후속 라운드에서 주형으로서 기능한다. 본 공정은, 변성 사이클(예를 들어, 가열 또는 화학적 변성을 통함)이 요망되지 않기 때문에 표준 PCR 보다 더욱 빠르게 일어날 수 있다. 이와 같이, 리콤비나아제-촉진된 증폭은 등온에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 증폭을 촉진시키기 위해 리콤비나아제-촉진된 증폭 시약에서 ATP, 또는 다른 누클레오티드(또는 일부 경우에, 이의 비-가수분해 가능한 유사체)를 포함하는 것이 요망된다. 리콤비나아제와 단쇄 결합(SSB) 단백질의 혼합물은 SSB가 증폭을 추가로 촉진시킬 수 있기 때문에 특히 유용하다. 리콤비나아제-촉진된 증폭을 위한 예시적인 포뮬레이션은 TwistDx(Cambridge, UK)에 의해 TwistAmp 키트로서 상업적으로 시판되는 것을 포함한다. 리콤비나아제-촉진된 증폭 시약의 유용한 성분 및 반응 조건은 US 5,223,414호 및 US 7,399,590호에 기재되어 있으며, 이러한 문헌 각각은 본원에 참고로 포함된다.
앰플리콘 형성을 촉진시키고 일부 경우에 앰플리콘 형성 속도를 증가시키기 위해 증폭 시약에 포함될 수 있는 성분의 다른 예는 헬리카제이다. 헬리카제는 앰플리콘 형성의 연쇄 반응을 가능하게 함으로써 앰플리콘 형성을 촉진시킬 수 있다. 이러한 공정은, 변성 사이클(예를 들어, 가열 또는 화학적 변성을 통함)이 요망되지 않기 때문에, 표준 PCR 보다 더욱 빠르게 일어날 수 있다. 이와 같이, 헬리카제-촉진된 증폭은 등온에서 수행될 수 있다. 헬리카제와 단쇄 결합(SSB) 단백질의 혼합물은, SSB가 증폭을 추가로 촉진시킬 수 있기 때문에 특히 유용하다. 헬리카제-촉진된 증폭을 위한 예시적인 포뮬레이션은 Biohelix(Beverly, MA)로부터 IsoAmp 키트로서 상업적으로 시판되는 것을 포함한다. 또한, 헬리카제 단백질을 포함하는 유용한 포뮬레이션의 예는 US 7,399,590호 및 US 7,829,284호에 기재되어 있으며, 이러한 문헌 각각은 본원에서 참고로 포함된다.
앰플리콘 형성을 촉진시키고 일부 경우에 앰플리콘 형성 속도를 증가시키기 위해 증폭 시약에 포함될 수 있는 성분의 또 다른 예는 최초 결합 단백질(origin binding protein)이다.
일 양태에서, a) 적어도 하나의 웰, 웰을 둘러싸는 표면, 및 내부 웰 표면을 포함하는 기판; b) 내부 웰 표면을 덮고 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍을 포함하는 제1 층; 및 c) 제1 층 및 웰을 둘러싸는 표면을 덮는 제2 층을 포함하는 마이크로어레이가 제공된다.
일부 마이크로어레이에서, 웰 크기(예를 들어, 직경)는 역학적 배제 증폭(KEA) 및 웰 내에서 타겟-특이적 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단의 형성을 선호하는 범위에서 선택된다. 핵산 라이브러리의 역학적 배제 증폭은 예를 들어, 미국특허공개번호 제2013/0338042호에 기재되어 있으며, 이러한 문헌은 본원에 참고로 포함된다. 예를 들어, 웰 크기(예를 들어, 직경)는 약 30 nm 내지 약 1 ㎛, 약 50 nm 내지 약 800 nm, 약 70 nm 내지 약 600 nm, 또는 100 nm 내지 약 400 nm에서 변경될 수 있다. 일부 구체예에서, 웰은 약 400 nm의 직경을 갖는다. 예를 들어, 도 1.1 참조. 일부 구체예에서, 웰은 약 1 ㎛ 미만의 직경을 갖는다. 예시적인 마이크로어레이는 Illumina® HiSeq-X10 패턴화된 흐름 셀 상에 마이크로어레이를 포함한다.
다른 양태에서, 본원에는 a) 적어도 하나의 웰, 웰을 둘러싸는 표면, 및 내부 웰 표면을 포함하되, 웰의 직경이 약 1 ㎛ 이상인 기판; 및 b) 내부 웰 표면을 덮고 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍 및 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 포함하는 층을 포함하는 마이크로어레이가 제공된다.
본원에 제공된 마이크로어레이는 예를 들어, 미국특허공개번호 제2013/0096034호에 기술된 바와 같이 형성될 수 있다.
일부 마이크로어레이에서, 웰은 약 1 ㎛ 내지 약 10 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 8 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 6 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 4 ㎛, 또는 약 1 ㎛ 내지 약 2 ㎛의 직경을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 웰은 약 1.5 ㎛의 직경을 갖는다. 예를 들어, 도 4.1 참조. 일부 구체예에서, 웰은 약 1 ㎛ 초과의 직경을 갖는다. 예를 들어, 도 4.1 참조.
기판은 핵산 마이크로어레이의 생산을 위해 유용한 당해 분야에 공지된 임의 물질로 제조될 수 있다. 예를 들어, 기판은 실리콘 또는 다른 실리카 또는 실리케이트, 유리, 플라스틱, 다당류, 나일론, 니트로셀룰로오스 수지, 탄소 및 금속 또는 다른 고체 지지체일 수 있다. 예시적인 기판 물질은 미국특허공개번호 제2013/0096034호에 제공되며, 이러한 문헌은 본원에 참고로 포함된다.
마이크로어레이는 둘 이상의 웰(복수의 웰)을 가질 수 있다. 복수의 웰의 웰은 동일한 거리 또는 상이한 거리로 이격될 수 있다. 웰들의 간격은 예를 들어, 두 개의 웰들 간의 사이공간 거리로서, 또는 두 개의 웰 사이의 사이 공간 거리 및 하나의 웰의 직경을 포함하는 "피치"로서 표현될 수 있다. 예를 들어, 도 1.1 참조(두 개의 웰들 사이의 사이 공간 거리는 700 nm이며; 피치는 1.5 ㎛이다).
일부 구체예에서, 마이크로어레이는 약 100,000 내지 약 5,000,000 웰/㎟, 약 250,000 내지 약 4,500,000 웰/㎟, 약 500,000 내지 약 4,000,000 웰/㎟, 약 750,000 내지 약 3,5000,000 웰/㎟, 약 1,000,000 내지 약 3,000,000 웰/㎟, 약 1,250,000 내지 약 2,500,000 웰/㎟, 약 1,500,000 내지 약 2,500,000 웰/㎟, 약 1,750,000 내지 약 2,250,000 웰/㎟, 또는 약 2,000,000 내지 약 2,250,000 웰/㎟를 갖는다. 일부 구체예에서, 마이크로어레이는 약 2,100,000 웰/㎟를 갖는다(예를 들어, Illumina® HiSeq 패턴화된 흐름 셀).
일부 구체예에서, 마이크로어레이는 약 10,000 내지 약 1,000,000 웰/㎟, 약 50,000 내지 약 900,000 웰/㎟, 약 100,000 내지 약 800,000 웰/㎟, 약 200,000 내지 약 700,000 웰/㎟, 약 300,000 내지 약 600,000 웰/㎟, 또는 약 400,000 내지 약 500,000 웰/㎟을 갖는다. 일부 구체예에서, 마이크로어레이는 약 450,000 웰/㎟를 갖는다(예를 들어, Illumina® NextSeq 패턴화된 흐름 셀).
마이크로어레이 웰은 이의 튼튼한 광학적 해상도를 가능하게 하면서, 웰 밀도를 취적화하기 위해 이격될 수 있다. 예를 들어, 복수의 웰 중 두 개의 웰은 약 10 nm 내지 10 ㎛, 약 50 nm 내지 약 8 ㎛, 약 100 nm 내지 약 6 ㎛, 약 200 nm 내지 약 4 ㎛, 약 300 nm 내지 약 2 ㎛, 약 400 nm 내지 약 1 ㎛, 약 500 nm 내지 약 900 nm, 또는 약 600 nm 내지 약 800 nm의 사이 공간 거리로 이격될 수 있다. 일부 구체예에서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰은 약 700 nm의 거리로 이격된다. 예를 들어, 도 1.1 참조. 일부 구체예에서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰은 약 1 ㎛ 미만의 거리로 이격된다. 일부 구체예에서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰은 약 1 ㎛ 초과의 거리로 이격된다.
복수의 웰 중 둘 이상의 웰은 약 10 nm 내지 10 ㎛, 약 50 nm 내지 8 ㎛, 약 100 nm 내지 약 6 ㎛, 약 500 nm 내지 약 4 ㎛, 또는 약 1 ㎛ 내지 약 2 ㎛의 피치로 배열될 수 있다. 일부 구체예에서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰은 약 1.5 ㎛의 피치로 배열된다. 예를 들어, 도 1.1 참조. 일부 구체예에서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰은 약 1 ㎛ 미만의 피치로 배열된다. 일부 구체예에서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰은 약 1 ㎛ 초과의 피치로 배열된다.
본원에 제공된 마이크로어레이는 하나 이상의 층을 포함한다. 예를 들어, 마이크로어레이는 단일 층, 제1 층 및 제2 층, 제1 층, 제2 층 및 제3 층, 등을 포함할 수 있다.
제1 층은 내부 웰 표면 및/E는 웰을 둘러싸는 표면을 덮을 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 층은 웰을 둘러싸는 표면을 덮지 않는다. 제1 층은 예를 들어, 웰의 벽의 표면 및 웰의 바닥 상의 표면을 포함하는, 웰의 내부 표면을 전체적으로 덮을 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 층은 내부 웰 표면을 단지 일부 덮는다. 예를 들어, 제1 층은 웰의 바닥 상의 단지 표면을 덮을 수 있지만, 웰의 벽의 표면을 덮지 않는다. 제1 층은 복수의 웰의 모든 웰 또는 복수의 웰의 웰의 단지 일부분의 내부 표면을 덮을 수 있다. 예를 들어, 제1 층은 복수의 웰의 100% 미만, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하의 웰의 내부 표면을 덮을 수 있다. 다른 예에서, 제1 층은 복수의 웰의 1% 초과, 2% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 또는 99% 초과의 웰의 내부 표면을 덮을 수 있다. 제1 층은 직접적으로 또는 간접적으로, 예를 들어, 하나 이상의 중간층을 통해, 내부 웰 표면을 포함하는 기판 표면을 덮을 수 있다. 하나 이상의 중간층은 예를 들어, 기판에, 예를 들어, 내부 웰 표면에 대한 제1 층의 접착을 개선시키기 위해 사용될 수 있다.
제2 층은 제1 층 및/또는 웰을 둘러싸는 표면을 덮을 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 층은 제1 층을 단지 일부 덮는다. 예를 들어, 제2 층은 단지 웰의 바닥에서 제1 층을 덮을 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 층은 제1 층을 덮지 않는다. 제2 층은 웰을 둘러싸는 표면을 전체 또는 단지 일부 덮을 수 있다. 제2 층은 복수의 웰의 모든 웰 또는 복수의 웰의 단지 일부의 웰을 둘러싸는 표면을 덮을 수 있다. 예를 들어, 제2 층은 복수의 웰의 100% 이하, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하의 웰을 둘러싸는 표면을 덮을 수 있다. 다른 예에서, 제1 층은 복수의 웰의 1% 초과, 2% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 또는 99% 초과의 웰을 둘러싸는 표면을 덮을 수 있다. 제2 층은 제1 층 및/또는 웰을 둘러싸는 표면을 직접적으로 또는 간접적으로, 예를 들어, 하나 이상의 중간층을 통해 덮을 수 있다. 하나 이상의 중간층은 예를 들어, 제2 층과 제1 층 간의 접착 및/또는 제2 층과 웰을 둘러싸는 기판 간의 접착을 개선시키기 위해 사용될 수 있다.
층은 표면 상에 침적될 수 있고 핵산에 대한 친화력을 가지고 프라이머와 같은 핵산의 침적을 위해 유용한 당해 분야에 공지된 임의 물질을 포함할 수 있다. 핵산의 침적을 위해 유용한 폴리머 코팅은 당해 분야에 공지된 웰이다. 핵산의 침적을 위해 유용한 일부 폴리머 코팅은 미국특허공개번호 제2014/0079923 A1호에 기재되어 있으며, 이러한 문헌은 본원에 참고로 포함된다. 예시적인 폴리머 코팅은 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸) 아크릴아미드-코-아크릴아미드(PAZAM) 및 실란 유리 아크릴아미드(SFA)를 포함한다.
일부 구체예에서, 층은 폴리머 코팅을 포함한다. 일부 구체예에서, 층에서 폴리머 코팅은 PAZAM을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 층에서 폴리머 코팅은 PAZAM 또는 SFA를 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 층에서 폴리머 코팅은 PAZAM 또는 SFA를 포함한다.
층은 하나 이상의 캡쳐 프라이머를 포함할 수 있다. 예를 들어, 층은 단일 캡쳐 프라이머, 제1 및 제2 캡쳐 프라이머, 제1, 제2 및 제3 캡쳐 프라이머, 등을 포함할 수 있다.
둘 이상의 캡쳐 프라이머는 웰에 임의 비율로 존재할 수 있다. 예를 들어, 제1 캡쳐 프라이머 및 제2 캡쳐 프라이머는 약 동일한 양으로 또는 임의 다른 비율로, 예를 들어, 몰비율로 존재할 수 있다. 웰은 제2 캡쳐 프라이머에 비해 1.1배 초과, 1.2배 초과, 1.3배 초과, 1.4배 초과, 1.5배 초과, 2.0배 초과, 2.5x배 초과, 3.0배 초과, 5.0배 초과, 10배 초과, 15배 초과, 20배 초과, 20배 초과, 25배 초과, 30배 초과, 50배 초과, 100배 초과, 300배 초과, 500x 초과, 또는 1,000x 과량의 제1 캡쳐 프라이머를 가질 수 있다. 마이크로어레이에서 상이한 웰은 동일한 비율 또는 다른 비율의 둘 이상의 캡쳐 프라이머를 가질 수 있다.
캡쳐 프라이머는 하나 이상의 캡쳐 영역을 포함할 수 있다. 캡쳐 영역은 예를 들어, 유니버셜 캡쳐 영역, 시퀀싱 프라이머 결합 사이트(SBS), 타겟-특이적 캡쳐 영역, 사전결정된 분열 사이트, 예를 들어, 제한 사이트, 및 링커 영역, 예를 들어, 둘 이상의 제한 사이트를 분리시키는 링커 영역을 포함할 수 있다. 일부 캡쳐 프라이머는 예를 들어, 유니버셜 캡쳐 영역 및 SBS를 포함할 수 있다. 다른 캡쳐 프라이머는 유니버셜 캡쳐 영역 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함할 수 있다. 캡쳐 프라이머는 3'-단부에서 블로킹되거나(3'-블로킹되거나) 3'-단부에서 비블로킹될 수 있다(3'-비블로킹될 수 있다). 블로킹된 3'-단부를 갖는 프라이머는 예를 들어, 3'-포스페이트 종결될 수 있다. 블로킹된 3'-단부를 갖는 일부 프라이머는 탈블로킹될 수 있다. 탈블로킹화는 효소 반응 또는 화학 반응에서 일어날 수 있다. 효소 반응은 예를 들어, 키나아제 또는 포스파타아제에 의해 매개될 수 있다. 예를 들어, 3'-포스페이트-종결된 프라이머는 T4 키나아제와 같은 키나아제에 의해 탈블로킹될 수 있다.
유니버셜 캡쳐 영역은 예를 들어, 유니버셜 Illumina® 캡쳐 프라이머의 서열을 갖는 영역 또는 유니버셜 Illumina® 캡쳐 프라이머와 특이적으로 혼성화하는 영역을 포함할 수 있다. 유니버셜 Illumina® 캡쳐 프라이머는 예를 들어, P5 5'- AATGATACGGCGACCACCGA-3'((SEQ ID NO: 1)) 또는 P7 (5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3'(SEQ ID NO: 2)), 또는 이들의 분절을 포함한다. 유니버셜 Illumina® 캡쳐 프라이머와 특이적으로 혼성화시키는 영역은 Illumina® 캡쳐 프라이머 P5 ("항-P5": 5'-TCGGTGGTCGCCGTATCATT-3'(SEQ ID NO: 3) 또는 P7 ("항-P7": 5'-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'(SEQ ID NO: 4)), 또는 이들의 분절의 역상보적 서열을 포함할 수 있다.
SBS는 예를 들어, Illumina® 시퀀싱 프라이머 또는 이의 단편의 서열을 갖는 영역, 또는 Illumina® 시퀀싱 프라이머, 또는 이의 단편과 특이적으로 혼성화시키는 영역을 포함할 수 있다. Illumina® 시퀀싱 프라이머는 예를 들어, SBS3 (5'- ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'(SEQ ID NO: 5)) 또는 SBS8 (5'-CGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3'(SEQ ID NO: 6))을 포함한다. Illumina® 시퀀싱 프라이머, 또는 이의 단편과 특이적으로 혼성화하는 영역은 예를 들어, Illumina® 시퀀싱 프라이머 SBS3 ("항-SBS3": 5'-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-3'(SEQ ID NO: 7)) 또는 SBS8 ("항-SBS8": 5'-AGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAGACCG-3' (SEQ ID NO: 8)), 또는 이의 단편의 역상보적 서열을 포함할 수 있다.
캡쳐 프라이머는 영역들의 임의 조합, 예를 들어, P5-SBS3 및 P7-SBS8, 또는 이의 단편의 조합을 포함하는 Illumina® P5, P7, SBS3, 또는 SBS8 프라이머 영역, 또는 이의 단편의 임의 조합을 가질 수 있다.
캡쳐 프라이머는 사전결정된 (바-랜덤) 분열 사이트를 포함할 수 있다. 가능한 사전결정된 분열 사이트는 예를 들어, 미국특허번호 제8,715,966 B2호에 기재되어 있으며, 이러한 문헌은 본원에 참고로 포함된다. 사전결정된 사이트에서의 분열은 예를 들어, 효소적 분열 또는 비-효소적 분율, 예를 들어, 화학적 분율로서 일어날 수 있다. 제한 사이트와 같은 사전결정된 사이트에서의 효소적 분열은 예를 들어, 제한 효소, 예를 들어, 제한 엔도누클레아제에 의해 매개될 수 있다. 일부 구체예에서, 프라이머에서 사전결정된 분열 사이트는 우라실 염기를 포함할 수 있다. 분열은 프라이머에서 무염기 사이트를 형성시키기 위한 우라실 DNA 글리코실라아제로의 우라실 함유 프라이머의 처리, 이후 무염기 사이트에서 프라이머를 분열시키기 위한 엔도누클레아제, 열 또는 알카리로의 처리를 통해 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 사전결정된 분열 사이트는 디올 링커를 포함하는데, 이는 퍼요오데이트로의 처리에 의해 분열될 수 있다. 일부 구체예에서, 사전결정된 분열 사이트는 8-옥소-구아닌을 포함한다.
사전결정된 분열 사이트는 효소 제한 사이트를 포함할 수 있다. 당업자에게 공지된 임의 제한 효소 또는 임의 효소 제한 사이트는 본원에 제공된 방법 또는 조성물에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 제한 엔도누클레아제는 타입 I 효소(EC 3.1.21.3), 타입 II 효소(EC 3.1.21.4), 타입 III 효소(EC 3.1.21.5), 또는 타입 IV 효소(EC 3.1.21.5)일 수 있다. 제한 엔도누클레아제는 예를 들어, 비제한적으로 Alu I, Ava I, Bam HI, Bgl II, Eco P15 I, Eco RI, Eco RII, Eco RV, Hae III, Hga I, Hha I, Hind III, Hinf I, Hpa I, Kpn I, Mbo I, Not I, Pst I, Pvu II, Sac I, Sal I, SapI, Sau 3A, Sca I, Sma I, Spe I, Sph I, Sst I, Stu I, Taq I, Xba I 또는 Xma I을 포함할 수 있다. 제한 엔도누클레아제는 재조합 제한 효소일 수 있다. 재조합 제한 효소는 비제한적으로, 천연 또는 공학처리된 DNA 결합 도메인(예를 들어, 징크 핑거(zink finger) 도메인, TAL 이펙터 도메인) 및 누클레아제 도메인(예를 들어, 타입 IIS 제한 효소 Fokl의 분열 도메인)을 포함하는 융합 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 제한 효소 인식 사이트는 SapI 사이트("5'-GCTCTTCNvNNN-3' (SEQ ID NO: 9)를 포함한다. 예를 들어, 도 6d 참조.
제한 효소는 진핵 생물(예를 들어, 식물, 곤충, 포유동물) 및 원생 동물을 포함하는 개개 생체분자를 발현시키는 임의 유기체로부터 유래될 수 있다. 특정 구체예에서, 생체분자는 진정세균(예를 들어, 그램 양성, 그램 음성), 고세균, 효모, 진균, 조류로부터 유래된다. 원생 생물은 예를 들어 비제한적으로 아스로박터 루테우스(Arthrobacter luteus), 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 글로비기이(Bacillus globigii), 대장균(Escherichia coli) RY 13, 대장균 R245, 하에모필러스 아에깁티우스(Haemophilus aegyptius), 하에모필루스 하에몰리티쿠스(Haemophilus haemolyticus), 하에모필루스 인플루엔자에(Haemophilus inflenzae) Rd, 하에모필루스 갈리나룸(Haemophilus gallinarum), 하에모필루스 파라인플루엔자에(Haemophilus parainflenzae), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia), 모락셀라 보비스(Moraxella bovis), 노카르디아 오티티디스(Nocardia otitidis), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 프로비덴시아 스투아르티이(Providencia stuartii), 세라티아 마르세스센스(Serratia marcescens), 스파에로틸루스 나탄스(Sphaerotilus natans), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토마이세스 아크로모게네스(Streptomyces achromogenes), 스트렙토마이세스 알부스 쥐(Streptomyces albus G), 스트렙토마이세스 카에스피토수스(Streptomyces caespitosus), 스트렙토마이세스 스탄포르드(Streptomyces stanford), 스트렙토마이세스 투베르시디쿠스(Streptomyces tubercidicus), 스트렙토마이세스 파에오크로모게네스(Streptomyces phaeochromogenes), 테르모필루스 아쿠아티쿠스(Thermophilus aquaticus), 잔토모나스 바드리이(Xanthomonas badrii) 또는 잔타모나스 말바세아룸(Xanthamonas malvacearum)을 포함할 수 있다.
제한 효소는 야생형 또는 돌연변이 형태일 수 있다. 제한 효소는 재조합 생체분자일 수 있다.
일부 구체예에서, 본 방법은 부분 제한 사이트를 포함하는 캡쳐 프라이머를 누클레아제와 접촉시키는 것을 추가로 포함하며, 여기서, 부분 제한 사이트는 누클레아제에 의해 제한된다. 일부 구체예에서, 누클레아제는 엑소누클레아제이다. 일부 구체예에서, 엑소누클레아제는 엑소누클레아제 I이다.
캡쳐 프라이머는 캡쳐 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 캡쳐 프라이머는 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 캡쳐 프라이머 및 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 프라이머를 포함하는 제1 캡쳐 프라이머 쌍일 수 있다. 다른 예에서, 제2 캡쳐 프라이머는 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 캡쳐 프라이머 및 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 캡쳐 프라이머를 포함하는 제2 캡쳐 프라이머 쌍일 수 있다.
캡쳐 프라이머 쌍의 캡쳐 프라이머는 임의 캡쳐 영역 또는 캡쳐 영역들의 임의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 프라이머는 제1 유니버셜 캡쳐 영역을 포함할 수 있으며, 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 프라이머는 제2 유니버셜 캡쳐 영역을 포함할 수 있다. 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 SBS를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 프라이머는 제1 유니버셜 캡쳐 프라이머 영역 및 제1 SBS를 포함할 수 있으며, 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 프라이머는 제2 유니버셜 캡쳐 영역 및 제2 SBS를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 프라이머는 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 프라이머는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 도 1.2 참조.
일부 구체예에서, 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 프라이머는 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS3 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 프라이머는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS8 프라이머 누클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 도 2.2 참조.
다른 예에서, 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 캡쳐 프라이머는 제1 유니버셜 캡쳐 영역을 포함할 수 있으며, 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 캡쳐 프라이머는 제2 유니버셜 캡쳐 영역을 포함할 수 있으며, 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 캡쳐 프라이머는 제1 유니버셜 캡쳐 프라이머 영역 및 제1 SBS를 포함할 수 있으며, 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 캡쳐 프라이머는 제2 유니버셜 캡쳐 영역 및 제2 SBS를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 캡쳐 프라이머는 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 캡쳐 프라이머는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 the 제1 캡쳐 프라이머는 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS3 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 캡쳐 프라이머는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS8 프라이머 누클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 도 4.2 참조.
캡쳐 프라이머 쌍은 단일 캡쳐 프라이머 쌍 또는 복수의 캡쳐 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 캡쳐 프라이머 쌍은 복수의 제1 캡쳐 프라이머 쌍일 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 캡쳐 프라이머 쌍은 적어도 하나의 캡쳐 프라이머 쌍이다. 다른 예에서, 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 복수의 제2 캡쳐 프라이머 쌍일 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 적어도 하나의 캡쳐 프라이머 쌍이다.
캡쳐 프라이머는 단일 캡쳐 프라이머 또는 복수의 캡쳐 프라이머를 포함할 수 있다.
캡쳐 프라이머 쌍의 제1 및 제2 캡쳐 프라이머는 각각 복수의 캡쳐 프라이머일 수 있다. 예를 들어, 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 캡쳐 프라이머는 복수의 제1 캡쳐 프라이머일 수 있다. 다른 예에서, 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 캡쳐 프라이머는 복수의 제2 캡쳐 프라이머일 수 있다.
일부 구체예에서, 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 캡쳐 프라이머는 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 복수의 제1 캡쳐 프라이머를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 캡쳐 프라이머는 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 복수의 제2 캡쳐 프라이머를 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 캡쳐 프라이머는 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 복수의 제1 캡쳐 프라이머를 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 캡쳐 프라이머는 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 복수의 제2 캡쳐 프라이머를 포함한다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍은 복수의 제1 캡쳐 프라이머 쌍이다.
일부 구체예에서, 제2 층은 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 복수의 제2 캡쳐 프라이머 쌍이다.
본원에 제공된 일부 마이크로어레이는 유니버셜 캡쳐 영역에 의해 측면 배치된 DNA 시퀀싱 라이브러리에서 타겟 폴리누클레오티드를 캡쳐할 수 있다. 이러한 마이크로어레이는 유니버셜 캡쳐 영역을 가지고 이의 3'-단부에서 비블로킹된 제1 층에서 제1 캡쳐 프라이머를 가질 수 있다. 이러한 마이크로어레이들 중 일부는 제1 층에서 프라이머와 동일한 유니버셜 캡쳐 영역을 가지고 3'-블로킹된 제2 캡쳐 프라이머를 갖는 제2 층을 갖는다. 예를 들어, 도 1.4 참조. 이러한 마이크로어레이들 중 일부 다른 것들은 제2 캡쳐 프라이머를 가지지 않고/거나 제2 층을 가지지 않는다. 예를 들어, 도 3.2 및 도 3.3 참조.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 프라이머는 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 프라이머는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 제2 층은 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 복수의 제2 캡쳐 프라이머 쌍이다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 3'-단부에서 블로킹된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 3'-포스페이트-종결된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 3'-포스페이트 종결 프라이머는 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 프라이머는 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 프라이머는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함한다.
본원에 제공된 일부 마이크로어레이는 SBS 영역에 의해 측면 배치된 DNA 시퀀싱 라이브러리에서 타겟 폴리누클레오티드를 캡쳐할 수 있다. 예를 들어, 도 2.2 참조. 이러한 마이크로어레이는 SBS와 조합한 유니버셜 캡쳐 영역을 갖는 이의 제1층에 캡쳐 프라이머를 가질 수 있다. 제2 층은 유니버셜 캡쳐 영역을 가지고 3'-탈블로킹된 캡쳐 프라이머를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, DNA 시퀀싱 라이브러리는 P5-SBS3 및/또는 P7-SBS8 누클레오티드 서열, 또는 이의 단편들에 의해 측면 배치된 타겟 폴리누클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, P5-SBS3 및/또는 P7-SBS8 누클레오티드 서열의 분절은 전장 P5-SBS3 및/또는 P7-SBS8 누클레오티드 서열에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상의 누클레오티드 더욱 짧을 수 있다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 SBS를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 프라이머는 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS3 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 프라이머는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS8 프라이머 누클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 3'-단부에서 블로킹되지 않는다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 프라이머는 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 프라이머는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함한다.
본원에 제공된 일부 마이크로어레이는 복수의 웰을 가지며, 이에 의해 복수의 웰의 각 웰은 고정화된 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 갖는다. 고정화된 타겟 폴리누클레오티드는 예를 들어, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 임의 캡쳐 프라이머 또는 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 임의 캡쳐 프라이머를 포함하는 임의 캡쳐 프라이머에 부착될 수 있다. 타겟 폴리누클레오티드는 웰 내에서 일부 또는 모든 캡쳐 프라이머에 부착될 수 있다. 마이크로어레이의 임의 수의 웰은 하나의 웰, 일부 웰, 또는 모든 웰을 포함하는 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 가질 수 있다.
타겟 폴리누클레오티드의 일부 모노클로날 집단은 단일 타겟 폴리누클레오티드의 앰플리콘을 본질적으로 포함할 수 있다. 타겟 폴리누클레오티드의 일부 모노클로날 집단은 작은 분율의 하나 이상의 추가적인 폴리누클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 타겟 폴리누클레오티드의 일부 모노클로날 집단은 대부분의 단일 타겟 폴리누클레오티드 및 30% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만의 작은 분율의 다른 폴리누클레오티드의 앰플리콘을 포함할 수 있다.
타겟 폴리누클레오티드는 웰 내에 일부 또는 모든 캡쳐 프라이머에 부착될 수 있다. 예를 들어, 타겟 폴리누클레오티드는 웰 내에서 캡쳐 프라이머의 0.5% 초과, 1% 초과, 2% 초과, 3% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 98% 초과, 99% 초과, 99.9% 초과, 99.99% 초과 또는 100%에 부착될 수 있다.
일부 마이크로어레이에서, 1% 초과, 2% 초과, 3% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과는 고정화된 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 갖는다.
상이한 웰은 동일한 타겟 폴리누클레오티드 또는 상이한 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 가질 수 있다. 일부 마이크로어레이에서, 웰의 1% 초과, 2% 초과, 3% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과는 동일한 고정화된 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 갖는다. 일부 마이크로어레이에서, 웰의 1% 초과, 2% 초과, 3% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 98% 초과, 99% 초과, 99.9% 초과 또는 99.99% 초과는 상이한 고정화된 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 갖는다. 일부 마이크로어레이에서, 1개 초과, 3개 초과, 30개 초과, 100개 초과, 300개 초과, 1,000개 초과, 3,000개 초과, 10,000개 초과, 또는 30,000개 초과의 웰 각각은 상이한 고정화된 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 갖는다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 복수의 캡쳐 프라이머는 타겟 폴리누클레오티드에 부착된다. 일부 구체예에서, 복수의 타겟 폴리누클레오티드는 적어도 하나의 웰에서 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 형성시킨다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 웰은 복수의 웰을 포함하며, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰은 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰은 동일한 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰은 둘 이상의 상이한 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함한다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍은 복수의 제1 캡쳐 프라이머 쌍이며, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 복수의 제2 캡쳐 프라이머 쌍이며, 여기서, 복수의 제1 캡쳐 프라이머 쌍 및 복수의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 복수의 프라이머는 복수의 타겟 폴리누클레오티드에 부착된다. 일부 구체예에서, 복수의 타겟 폴리누클레오티드는 적어도 하나의 웰에서 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 형성시킨다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 웰은 복수의 웰이며, 여기서 복수의 웰 중 둘 이상의 웰은 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰은 동일한 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰은 둘 이상의 상이한 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함한다.
핵산을 증폭시키기 위한 본원에 제공된 방법은 웰, 예를 들어, 마이크로어레이 웰에서 고정화된 타켓 폴리누클레오티드의 확장된 모노클로날 집단의 형성을 가능하게 한다. 일부 방법은 2-단계 증폭 공정을 수반한다. 예를 들어, 도 1 내지 도 3 참조. 이러한 2-단계 공정에서, 타겟 폴리누클레오티드는 KEA 촉진시키기 위해 치수화된 웰에서 제1 캡쳐화되며, KEA는 웰의 범위 내에서 고정화된 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 형성시키기 위해 수행된다. 단일 타겟-폴리누클레오티드는 웰 내에서 캡쳐되고 증폭될 수 있다. 제2 단계에서, 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단은 예를 들어, 브릿지 증폭 또는 제2 KEA에 의해 웰의 한계를 넘어서 확장된다.
다른 양태에서, a) 기판 상에 제1 층을 형성시키되, 기판은 적어도 하나의 웰, 웰을 둘러싸는 표면, 및 내부 웰 표면을 포함하고, 제1 층은 내부 웰 표면을 덮고; b) 제1 층에서 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍을 침적시키고; c) 제1 층 및 웰을 둘러싸는 표면을 덮는 기판 상에 제2 층을 형성시키고; d) 타겟 폴리누클레오티드를 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 캡쳐 프라이머와 혼성화시키기 위해 충분한 조건 하에서 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 포함하는 샘플을 기판과 접촉시키고; e) 웰 내측에 타겟 폴리누클레오티드로부터 앰플리콘의 모노클로날 집단을 형성시키기 위해 제1 KEA를 수행하고, 이에 의해 타겟 폴리누클레오티드를 형성시키는 것을 포함하는, 핵산을 증폭시키는 방법이 제공된다. 이러한 방법의 대타겟인 예시는 예를 들어, 도 1에서 확인된다.
일부 구체예에서, 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 포함하는 샘플은 웰 당 단일 타겟 폴리누클레오티드가 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 캡쳐 프라이머와 혼성화시키기 위해 충분한 조건 하에서 기판과 접촉된다.
일부 구체예에서, 제1 KEA는 적어도 하나의 웰에서 캡쳐 프라이머와 혼성화된 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터 앰플리콘의 모노클로날 집단을 형성시킨다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 웰은 복수의 웰이며, 앰플리콘의 모노클로날 집단은 복수의 웰 중 둘 이상의 웰에서 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터 형성된다. 복수의 웰 중 둘 이상의 웰은 예를 들어, 마이크로어레이의 웰 중 1% 초과, 2% 초과, 3% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 98% 초과, 99% 초과, 99.9% 초과, 99.99% 초과 100%를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 앰플리콘의 모노클로날 집단은 복수의 웰 중 둘 이상의 웰에서 동일한 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터 형성된다. 일부 구체예에서, 앰플리콘의 모노클로날 집단은 복수의 웰 중 둘 이상의 웰에서 둘 이상의 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터 형성된다. 둘 이상의 단일 타겟 폴리누클레오티드는 예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 30개, 적어도 100개, 적어도 300개, 적어도 1,000개, 적어도 3,000개, 적어도 10,000개, 적어도 30,000개, 또는 적어도 100,000개의 단일 타겟 폴리누클레오티드를 포함할 수 있다.
고려되는 타겟 폴리누클레오티드를 함유하는 것으로 예상되는 임의 예가 사용될 수 있다. 샘플은 DNA 시퀀싱 라이브러리를 포함할 수 있다. DNA 시퀀싱 라이브러리는 예를 들어, 고체 조직 샘플 또는 액체 생검으로부터 얻어질 수 있다. 고체 조직 샘플 또는 액체 생검은 예를 들어, 질병에 걸린 피검체 또는 건강한 피검체로부터 얻어질 수 있다. 질병에 걸린 피검체는 예를 들어, 암 환자 또는 유전 질병으로부터 고통 당하는 환자를 포함할 수 있다. 건강한 피검체는 예를 들어, 임상 시험의 음성 대조군에서의 피검체, 또는 질병 상태로부터 고통당할 위험을 받을 의심을 받는 피검체를 포함할 수 있다. 피검체 또는 환자는 인간, 또는 예를 들어, 임의 포유동물(예를 들어, 원숭이, 유인원, 랫트, 마우스, 햄스터, 고양이, 개, 말, 소, 양, 등)을 포함하는 동물을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 방법은 제2 층에서 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 침적시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 제1 KEA를 수행하기 전에 침적된다.
본원에 제공된 일부 방법에서, 제1 층은 마이크로어레이의 웰에서 형성되며, 제1 유니버셜 캡쳐 프라이머 쌍은 제1 층에 침적된다. 예를 들어, 1.1 및 도 1.2 참조. 제1 층 및 웰을 둘러싸는 마이크로어레이 표면을 덮는 제2 층이 형성되며, 제2 유니버셜 캡쳐 프라이머 쌍은 제2 층에서 침적되며, 제2 프라이머 쌍은 제1 쌍과 동일한 유니버셜 캡쳐 영역을 가지만, 3'-블로킹된다. 예를 들어, 도 1.3 및 도 1.4 참조. 3'- 및/또는 5'-단부에서 유니버셜 프라이머 영역을 측면 배치되는 타겟 폴리누클레오티드는 웰에서 캡쳐되며, 제1 쌍의 블로킹되지 않은 캡쳐 프라이머는 확장되며, 제1 라운드의 KEA는 웰 내에 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단의 형성을 야기시킨다. 예를 들어, 도 1.5 참조. 제2 유니버셜 캡쳐 프라이머 쌍은 탈블로킹되며, 제2 라운드의 KEA 또는 브릿지 증폭은 웰의 범위를 넘어서 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 확장시키기 위해 이어진다. 예를 들어, 도 1.6 및 도 1.7 참조.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 캡쳐 프라이머는 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 캡쳐 프라이머는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 타겟 폴리누클레오티드는 하나 이상의 유니버셜 캡쳐 영역에 의해 측면 배치된다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 3'-단부에서 블로킹된다. 일부 구체예에서, 유니버셜 캡쳐 영역은 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 또는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 방법은 제1 KEA를 수행한 후에 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머를 탈블로킹시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 T4-키나아제를 사용하여 탈블로킹된다. 일부 구체예에서, 본 방법은 타겟 폴리누클레오티드 앰플리콘의 모노클로날 집단을 확장시키기 위해 브릿지 증폭 또는 제2 KEA를 수행하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 3'-단부에서 블로킹되지 않는다.
또 다른 양태에서, 본원에는 핵산을 증폭시키는 방법으로서, a) 기판 상에 제1 층을 형성시키되, 기판은 적어도 하나의 웰, 웰을 둘러싸는 표면, 및 내부 웰 표면을 포함하고, 제1 층은 적어도 부분적으로 내부 웰 표면을 덮고; b) 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍을 제1 층에 침적시키되, 제1 캡쳐 프라이머 쌍은 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제1 캡쳐 프라이머 및 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제2 캡쳐 프라이머를 포함하고; c) 제1 층 및 웰을 둘러싸는 표면을 덮는 기판 상에 제2 층을 형성시키고; d) 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 제2 층에 침적시키되, 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 3' 포스페이트-종결되고, Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제1 캡쳐 프라이머, 및 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제2 캡쳐 프라이머를 포함하고; e) 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 포함하는 샘플을 웰 당 단일 타겟 폴리누클레오티드에 대해 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머와 혼성화시키기에 충분한 조건 하에서 기판에 접촉시키되, 타겟 폴리누클레오티드는 각각 Illumina® P5' 프라이머 누클레오티드 서열 또는 Illumina® P7' 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 유니버셜 프라이머 영역에 의해 측면 배치되고; f) 제1 KEA을 수행하여 적어도 하나의 웰 내부에서 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터 앰플리콘의 모노클로날 집단을 생성시킴으로써, 타겟 폴리누클레오티드를 증폭시키고; g) 기판을 T4-키나아제과 접촉시켜 제2 프라이머 쌍의 프라이머를 탈블로킹시키고; h) 브릿지 증폭 또는 제2 KEA을 수행하여 단일 타겟 폴리누클레오티드의 앰플리콘의 모노클로날 집단을 웰을 초과하여 확장시키는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 이러한 방법의 예시적인 예가 예를 들어 도 1에서 보여진다.
다른 양태에서, 본원에서 핵산을 증폭시키는 방법으로서, a) 기판 상에 제1 층을 형성시키되, 기판은 적어도 하나의 웰, 웰을 둘러싸는 표면, 및 내부 웰 표면을 포함하고, 제1 층은 내부 웰 표면을 덮고; b) 제1 층에서 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍을 증착시키고; c) 제1 층 및 웰을 둘러싸는 표면을 덮는 기판 상에 제2 층을 형성시키고; d) 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 포함하는 샘플을 타겟 폴리누클레오티드에 대해 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 캡쳐 프라이머와 혼성화시키기에 충분한 조건 하에서 기판과 접촉시키고; e) 제1 KEA를 수행하여 웰 내부에서 타겟 폴리누클레오티드로부터 앰플리콘의 모노클로날 집단을 생성시킴으로써, 타겟 폴리누클레오티드를 증폭시키는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
일부 구체예에서, 제1 층은 마이크로어레이의 웰에서 형성되고, 캡쳐 프라이머의 제1 쌍은 제1 층에서 침적된다(예를 들어, 도 2.1 및 2.2 참조). 캡쳐 프라이머의 제1 쌍의 캡쳐 프라이머는 유니버셜 캡쳐 영역 및 SBS를 포함할 수 있다. 제1 층 및 웰을 둘러싸는 마이크로어레이 표면을 덮는 제2층이 형성되고, 캡쳐 프라이머의 제2 쌍이 제2 층에 침적된다. 제2 쌍의 캡쳐 프라이머는 비블로킹되고, 제1 쌍의 캡쳐 프라이머로서 동일한 유니버셜 캡쳐 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 2.3 및 2.4 참조. 측면 배치되는 SBS 영역을 갖는 타겟 폴리누클레오티드가 웰에서 캡쳐되고, 제1 쌍의 캡쳐 프라이머가 연장되고, KEA의 제1 라운드가 웰 내에서 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단의 형성을 야기한다. 예를 들어, 도 1.6 (상부 패널 및 중앙 패널) 참조. KEA는 계속되도록 허용되고, 계속된 KEA가 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 제2 층에서 제2 쌍의 캡쳐 프라이머를 사용하여 웰을 초과하여 확장시킨다. 예를 들어, 도 2.6 (저부 패널) 참조.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 프라이머 쌍의 프라이머는 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 SBS를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 프라이머 쌍의 제1 프라이머는 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS3 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하고, 적어도 하나의 제1 프라이머 쌍의 제2 프라이머는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS8 프라이머 누클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 타겟 폴리누클레오티드는 하나 이상의 SBS에 의해 측면 배치된다.
일부 구체예에서, 제1 KEA는 적어도 하나의 웰을 초과하여 앰플리콘의 클론 집단을 확장시키기 위해 연장된 기간 동안 수행된다.
또 다른 양태에서, 본원에는 핵산을 증폭시키는 방법으로서, a) 기판 상에 제1 층을 형성시키되, 기판은 적어도 하나의 웰, 웰을 둘러싸는 표면, 및 내부 웰 표면을 포함하고, 제1 층은 적어도 부분적으로 내부 웰 표면을 덮고; b) 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍을 제1 층에 침적시키되, 제1 캡쳐 프라이머 쌍은 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS3 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 및 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS8 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머를 포함하고; c) 제1 층 및 웰을 둘러싸는 표면을 덮는 기판 상에 제2 층을 형성시키고; d) 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 제2 층에 침적시키되, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제1 캡쳐 프라이머 및 Illumina® P7 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제2 캡쳐 프라이머를 포함하고; e) 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 포함하는 샘플을 웰 당 단일 타겟 폴리누클레오티드에 대해 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머와 혼성화시키기에 충분한 조건 하에서 기판과 접촉시키되, 복수의 타겟 폴리누클레오티드는 각각 Illumina® SBS3' 프라이머 누클레오티드 서열 또는 Illumina® SBS8' 누클레오티드 서열을 포함하는 SBS에 의해 측면 배치되고; f) 연장된 기간 동안 KEA를 수행하여 적어도 하나의 웰의 내부 및 외부에서 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터 앰플리콘의 모노클로날 집단을 생성시킴으로써, 웰 내부에서 단일 타겟 폴리누클레오티드를 증폭시키고, 적어도 하나의 웰을 초과하여 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 확장시키는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 이러한 방법의 예시적인 예가 예를 들어 도 2에서 보여진다.
본원에서 제공되는 일부 방법에서, 제1 층은 마이크로어레이의 웰에서 형성되고, 캡쳐 프라이머의 제1 쌍은 제1 층에 침적된다. 예를 들어, 도 3.1 및 3.2 참조. 캡쳐 프라이머의 제1 상의 캡쳐 프라이머는 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다. 제1 층 및 웰을 둘러싸는 마이크로어레이 표면을 덮는 제2 층이 형성된다. 예를 들어, 도 3.2 참조. 측면 배치되는 유니버셜 캡쳐 영역을 갖는 타겟 폴리누클레오티드는 웰에서 캡쳐되고, 제1 쌍의 캡쳐 프라이머는 연장되고, KEA의 제1 라운드가 웰 내에서 타겟 폴린클레오티드의 모노클로날 집단의 형성을 야기한다. 예를 들어, 도 3.4 참조. 캡쳐 프라이머의 제2 쌍은 제2 층에 침적된다. 제2 쌍의 캡쳐 프라이머는 비블로킹되고, 제1 쌍의 캡쳐 프라이머와 동일한 유니버셜 캡쳐 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 3.5 참조. 제2 KEA 또는 브릿지 증폭이 수행됨으로써 제2 층에서 캡쳐 프라이머의 제2 쌍을 사용하여 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 웰을 초과하여 확장시킨다. 예를 들어, 도 3.6 참조.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 제1 KEA를 수행한 후 침적된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머 및 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 유니버셜 캡쳐 영역은 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 또는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 브릿지 증폭 또는 제2 KEA을 수행하여 타겟 폴리누클레오티드 앰플리콘의 클론 집단을 적어도 하나의 웰을 초과하여 확장시키는 것을 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 본원에는 핵산을 증폭시키는 방법으로서, a) 기판 상에 제1 층을 형성시키되, 기판이 적어도 하나의 웰, 웰을 둘러싸는 표면, 및 내부 웰 표면을 포함하고, 제1 층은 적어도 부분적으로 내부 웰 표면을 덮고; b) 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍을 제1 층에 침적시키되, 제1 프라이머 쌍은 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제1 캡쳐 프라이머 및 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제2 캡쳐 프라이머를 포함하고; d) 제1 층 및 웰을 둘러싸는 표면을 덮는 제2 층을 기판 상에 형성시키고; d) 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 포함하는 샘플을 웰 당 단일 타겟 폴리누클레오티드에 대해 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머와 혼성화시키기에 충분한 조건 하에서 기판과 접촉시키되, 복수의 폴리누클레오티드는 각각 Illumina® P5' 프라이머 누클레오티드 서열 또는 Illumina® P7' 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 유니버셜 프라이머 영역에 의해 측면 배치되고; e) 제1 KEA를 수행하여 적어도 하나의 웰 내부에서 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터 앰플리콘의 모노클로날 집단을 생성시킴으로써 타겟 폴리누클레오티드를 증폭시키고; f) 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 제2 층에 침적시키되, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제1 캡쳐 프라이머 및 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제2 캡쳐 프라이머를 포함하고; g) 브릿지 증폭 또는 제2 KEA를 수행하여 단일 타겟 폴리누클레오티드의 앰플리콘의 모노클로날 집단을 확장시키는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 이러한 방법의 예시적인 예가 예를 들어, 도 3에서 보여진다.
본원에서 제공되는 방법은 고정된 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95%, 또는 100% 초과로 확장시킬 수 있다. 모노클로날 집단의 크기 및 확장은 예를 들어, 모노클로날 집단의 직경 측면에서, 모노클로날 집단 내 타겟 폴리누클레오티드 앰플리콘의 수의 측면에서, 또는 시퀀싱 반응 동안 모노클로날 집단에 의해 생성된 상대적 신호 세기의 측면에서 측정될 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에서 제공되는 방법은 KEA에 유리하지 않게 치수화된 보다 큰 웰에서 1-단계 증폭 공정을 포함한다. 예를 들어, 도 4 참조. 확장된 웰은 DNA 시퀀싱 라이브러리로부터 타겟 폴리누클레오티드를 캡쳐하기 위한 저-과다(low-abundance) 캡쳐 프라이머, 캡쳐된 타겟 폴리누클레오티드를 증폭시키기 위한 고-과다(high-abundance) 캡쳐 프라이머를 함유할 수 있음으로써, 보다 큰 웰의 경계 내에서 고정된 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 생성시킨다.
다른 양태에서, 본원에는 핵산을 증폭시키는 방법으로서, a) 기판 상에 층을 형성시키되, 기판은 적어도 하나의 웰, 웰을 둘러싸는 표면, 및 내부 웰 표면을 포함하고, 층은 적어도 부분적으로 내부 웰 표면을 덮고; b) 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍 및 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 층에 침적시키되, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머 밀도가 적어도 제2 프라이머 쌍의 프라이머 밀도보다 높고; c) 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 포함하는 샘플을 웰 당 단일 타겟 폴리누클레오티드에 대해 제2 프라이머와 혼성화시키기에 충분한 조건 하에서 기판과 접촉시키고; d) KEA를 수행하여 웰 내부에서 제2 프라이머에 혼성화되는 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터 앰플리콘의 모노클로날 집단을 생성시킴으로써, 단일 타겟 폴리누클레오티드를 증폭시키는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 이러한 방법의 예시적 예가 예를 들어 도 4에서 보여진다.
일부 구체예에서, 웰은 약 1 ㎛의 직경을 갖는다. 일부 구체예에서, 웰은 약 1 ㎛ 이상의 직경을 갖는다. 일부 구체예에서, 웰은 약 1 ㎛ 또는 그 미만의 직경을 갖는다.
일부 구체예에서, 웰 당 단일 타겟 폴리누클레오티드에 대해 제2 프라이머와 혼성화시키기에 충분한 조건은 타겟 폴리누클레오티드의, 또는 DNA 시퀀싱 라이브러리의 낮은 농도를 포함한다. 일부 구체예에서, 웰 당 단일 타겟 폴리누클레오티드에 대해 제2 프라이머와 혼성화시키기에 충분한 조건은 KEA에 의한 제1 캡쳐된 타겟 폴리누클레오티드의 급속 증폭을 포함한다. KEA에 의한 제1 캡쳐된 타겟 폴리누클레오티드의 급속 증폭은 제2 타겟 폴리누클레오티드가 제1 캡쳐된 타겟 폴리누클레오티드와 동일한 웰에서 캡쳐 프라이머에 혼성화되는 것을 방지할 수 있다.
일부 구체예에서, 복수의 타겟 폴리누클레오티드는 SBS 각각 Illumina® SBS3' 프라이머 누클레오티드 서열 또는 Illumina® SBS8' 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 SBS에 의해 측면 배치된다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 제1 캡쳐 프라이머 쌍은 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 복수의 제1 캡쳐 프라이머 및 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 복수의 제2 캡쳐 프라이머를 포함한다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머는 유니버셜 캡쳐 영역 및 SBS를 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 제2 캡쳐 프라이머 쌍은 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS3 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 복수의 제1 캡쳐 프라이머 및 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS8 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 제2의 복수의 캡쳐 프라이머를 포함한다.
다른 양태에서, 본원에는 기판 상에 고정된 캡쳐 프라이머를 개질화시키는 방법이 제공된다. 구체적으로 본원에서 제공되는 방법은 패턴화된 흐름 셀의 웰에서 유니버셜 캡쳐 프라이머를 개질화시켜 패턴화된 흐름 셀의 하나 이상의 웰에서 모노클로날 타겟-폴리누클레오티드 특이적 캡쳐 프라이머를 생성하고, 패턴화된 흐름 셀 상에 모노클로날 타겟 누클레오티드 특이적 웰 또는 패드를 생성한다. 예를 들어, 도 10 참조. 상기 방법은 패턴화된 흐름 셀 상에 주형 핵산 라이브러리의 배제 증폭(KEA에 의해)을 포함할 수 있다. 본원에서 제공되는 일부 방법의 예시적인 예가 예를 들어, 도 6 및 7에 도시된다. 각각의 주형 핵산은 하나 이상의 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 6.A-d 참조. 패턴화된 흐름 셀 상에서의 주형 핵산 라이브러리의 배제 증폭은 패턴화된 흐름 셀의 하나 이상의 웰 또는 패드에서 주형 핵산 앰플리콘의 모노클로날 집단의 형성을 야기한다. 예를 들어, 도 7A 참조. 예를 들어, 제한 효소를 사용하여, 주형 핵산 앰플리콘의 모노클로날 집단을 추가로 처리함으로써 유니버셜 캡쳐 영역 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 키메라 캡쳐 프라이머, 및 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 생성할 수 있다. 예를 들어, 도 7.B-C 참조. 일부 구체예에서, 복수의 모노클로날 타겟-특이적 웰 또는 패드가 패턴화된 흐름 셀 상에 형성됨으로써, 상이한 웰 또는 패드는 주목받는 상이한 타겟 폴리누클레오티드를 타겟-틀이적으로 캡쳐할 수 있다. 예를 들어, 도 7.D 참조.
본원에서 제공되는 방법은 주형 핵산을 고정된 캡쳐 프라이머에 혼성화시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 7A 참조. 주형 핵산은 그것의 3'-단부 및/또는 5'-단부에서 측면 배치되는 유니버셜 캡쳐 영역, 타겟-특이적 캡쳐 영역, 및 하나 이상의 제한 사이트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 6A-D 참조. 주형 핵산은 주형의 측면 배치되는 유니버셜 캡쳐 영역 및 프라이머의 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 중 하나 이상을 통해 고정된 캡쳐 프라이머와 혼성화될 수 있다. 예를 들어, 도 7A 참조.
일부 구체예에서, 복수의 주형 핵산은 복수의 고정된 캡쳐 프라이머와 혼성화된다. 복수의 주형 핵산은 복수의 동일한 주형 핵산 및/또는 복수의 상이한 주형 핵산을 포함할 수 있다. 상이한 주형 핵산은 예를 들어, 상이한 타겟-특이적 캡쳐 영역을 가짐으로써, 또는 상이한 위치에서 동일한 타겟-특이적 캡쳐 영역을 가짐으로써 서로 구별될 수 있다.
패턴화된 흐름 셀 상에서 주형 핵산을 고정된 캡쳐 프라이머와 혼성화시키는 경우, 혼성화 조건은 패드 당 단지 단일 주형 핵산이 패드에서 고정된 캡쳐 프라이머와 혼성화하도록 조절될 수 있다. 패드 당 단지 단일 주형 핵산의 혼성화는 패턴화된 흐름 셀 상의 하나 이상의 패드 상에서 일어날 수 있다. 패턴화된 흐름 셀의 둘 이상의 패드는 각각 동일한 핵산 서열 (예를 들어, 동일한 타겟-특이적 캡쳐 시퀀스) 또는 상이한 핵산 서열 (예를 들어, 상이한 타겟-특이적 캡쳐 시퀀스)를 갖는 단일 주형 핵산과 혼성화될 수 있다.
타겟 핵산과 혼성화된 캡쳐 프라이머는 연장되어 주형 핵산과 상보적인 고정된 확장 생성물을 형성한다. 패턴화된 흐름 셀 상에서, 하나 이상의 패드는 단지 단일 확장 생성물을 가질 수 있다. 패턴화된 흐름 셀 상의 둘 이상의 패드는 각각 동일한 핵산 서열 또는 상이한 핵산 서열을 갖는 단일 확장 생성물을 가질 수 있다. 상이한 확장 생성물은 예를 들어, 상이한 타겟-특이적 캡쳐 영역을 가짐으로써 또는 상이한 위치에서 동일한 타겟-특이적 캡쳐 영역을 가짐으로써 구별될 수 있다.
확장 생성물의 3'-단부는 그것의 상보적인 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역을 통해 비-연장된 고정된 캡쳐 프라이머와 혼성화될 수 있음으로써 브릿지 구조를 형성한다. 브릿지 증폭의 하나 이상의 라운드가 수행되어 패드 당 단일 확장 생성물로부터 고정된 주형 핵산의 모노클론 클러스터를 형성한다. 패턴화된 흐름 셀 상의 상이한 패드는 동일한 고정된 주형 핵산의, 또는 상이한 고정된 주형 핵산의 모노클론 클러스터를 가질 수 있다.
고정된 주형 핵산은 제한 효소로 분해되어 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 생성할 수 있다. 예를 들어, 도 7B-C 참조. 키메라 캡쳐 프라이머는 각각 캡쳐 영역 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 갖는다. 패턴화된 흐름 셀 상에서, 하나 이상의 패드는 각각 동일한 복수의 키메라 캡쳐 프라이머를 갖는다. 예를 들어, 도 7C 참조. 패턴화된 흐름 셀 상의 둘 이상이 패드는 동일한 키메라 캡쳐 프라이머 또는 상이한 키메라 캡쳐 프라이머인 복수의 키메라 캡펴 프라이머를 가질 수 있다. 예를 들어, 도 7D 참조. 상이한 키메라 캡쳐 프라이머는 예를 들어, 상이한 타겟-특이적 캡쳐 영역을 가짐으로써 구별될 수 있다. 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머는 절단된(truncated) 유니버셜 캡쳐 영역 또는 누클레오티드 연장부를 갖는 3'-말단 단부를 가질 수 있다. 일부 누클레오티드 연장부는 부분 제한 사이트를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 고정된 캡쳐 프라이머를 개질화시키는 방법으로서, 복수의 고정된 캡쳐 프라이머를 포함하는 기판을 적어도 하나의 고정된 주형 핵산을 생성하는 혼성화에 충분한 조건 하에서 적어도 하나의 주형 핵산과 접촉시키되, 복수의 고정된 캡쳐 프라이머는 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역을 포함하는 제1의 복수의 프라이머 및 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 제2의 복수의 프라이머를 포함하고, 각각의 주형 핵산은 5'-말단 및 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Y 또는 Z에 의해 측면 배치되고, 하나 이상의 제한 사이트, 및 5'-말단 유니버셜 캡쳐 영역과 하나 이상의 제한 사이트 사이 또는 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역과 하나 이상의 제한 사이트 사이에 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하고, b) 주형 핵산에 혼성화되는 적어도 하나의 고정된 캡쳐 프라이머를 연장하여 적어도 하나의 주형 핵산에 상보적인 적어도 하나의 고정된 확장 생성물을 생성하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 주형 핵산의 유니버셜 캡쳐 영역 Y 및/또는 Z는 고정된 캡쳐 프라이머의 유니버셜 캡쳐 영역에서의 핵산 서열과 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 주형 핵산의 유니버셜 캡쳐 영역 Y 및/또는 Z은 고정된 캡쳐 프라이머의 유니버셜 캡쳐 영역에서의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 주형 핵산의 제1 유니버셜 캡쳐 영역 Y 또는 Z는 제1 고정된 캡쳐 프라이머의 유니버셜 캡쳐 영역에서의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함할 수 있고, 주형 핵산의 제2 유니버셜 캡쳐 영역 Y 또는 Z는 제2 고정된 캡쳐 프라이머의 유니버셜 캡쳐 영역에서의 핵산 서열과 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있다.
유니버셜 캡쳐 영역 Y 또는 Z는 동일한 핵산 서열 또는 상이한 핵산 서열을 가질 수 있다. 유니버셜 캡쳐 영역 Y는 주형 핵산의 3'-단부에 또는 5'-단부에 존재할 수 있다. 유니버셜 캡쳐 영역 Z는 주형 핵산의 3'-단부에 또는 5'-단부에 존재할 수 있다. 유니버셜 캡쳐 영역 Y 또는 Z는 어떠한 유니버셜 캡쳐 영역을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 주형 핵산은 제1 고정된 캡쳐 프라이머의 유니버셜 캡쳐 영역 및 제1 유니버셜 캡쳐 영역으로부터 대립(3' 또는 5') 단부에 있는 제2 유니버셜 캡쳐 영역의 핵산 서열을 포함하는 그것의 3'단부 또는 5'-단부에 제1 유니버셜 캡쳐 영역을 가짐으로써 제2 유니버셜 캡쳐 영역은 제2 고정된 캡쳐 프라이머의 유니버셜 캡쳐 영역에 상보적인 핵산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 주형 핵산은 그것의 5'-단부에 제1 고정된 캡쳐 프라이머의 유니버셜 캡쳐 영역 Y'의 누클레오티드 서열을 포함하는 제1 유니버셜 캡쳐 영역 Y 및 그것의 3'-단부에 제2 고정된 캡쳐 프라이머의 유니버셜 캡쳐 영역 Z의 누클레오티드 서열에 상보적인 누클레오티드 서열을 포함하는 제2 유니버셜 캡쳐 영역 Z'를 포함한다.
일부 구체예에서, 주형 핵산은 그것의 5'-단부에 제1 고정된 캡쳐 프라이머의 유니버셜 캡쳐 영역 Z'의 누클레오티드 서열을 포함하는 제1 유니버셜 캡쳐 영역 Z, 및 그것의 3'-단부에 제2 고정된 캡쳐 프라이머의 유니버셜 캡쳐 영역 Y의 누클레오티드 서열에 상보적인 누클레오티드 서열을 포함하는 제2 유니버셜 캡쳐 영역 Y'을 포함한다.
일부 구체예에서, 주형 핵산은 그것의 5'-단부에 제1 고정된 캡쳐 프라이머의 유니버셜 캡쳐 영역 Y의 누클레오티드 서열을 포함하는 제1 유니버셜 캡쳐 영역 Y' 및 그것의 3'-단부에 제2 고정된 캡쳐 프라이머의 유니버셜 캡쳐 영역 Z'의 누클레오티드 서열에 상보적인 누클레오티드 서열을 포함하는 제2 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함한다.
일부 구체예에서, 주형 핵산은 그것의 5'-단부에 제1 고정된 캡쳐 프라이머의 유니버셜 캡쳐 영역 Z의 누클레오티드 서열을 포함하는 제1 유니버셜 캡쳐 영역 Z' 및 그것의 3'-단부에 제2 고정된 캡쳐 프라이머의 유니버셜 캡쳐 영역 Y'의 누클레오티드 서열에 상보적인 누클레오티드 서열을 포함하는 제2 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함한다.
일부 구체예에서, 주형 핵산은 그것의 5'-단부에 Illumina® P7 프라이머의 누클레오티드 서열을 포함하는 제1 유니버셜 캡쳐 영역 및 그것의 3'-단부에 Illumina® P5 프라이머의 누클레오티드 서열에 상보적인 누클레오티드 서열을 포함하는 제2 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다. 예를 들어, 도 7A 참조.
일부 구체예에서, 주형 핵산은 그것의 3'-단부에 Illumina® P7 프라이머의 누클레오티드 서열을 포함하는 제1 유니버셜 캡쳐 영역 및 그것의 5'-단부에 Illumina® P5 프라이머의 누클레오티드 서열에 상보적인 누클레오티드 서열을 포함하는 제2 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 주형 핵산은 그것의 5'-단부에 Illumina® P5 프라이머의 누클레오티드 서열을 포함하는 제1 유니버셜 캡쳐 영역 및 그것의 3'-단부에 Illumina® P7 프라이머의 누클레오티드 서열에 상보적인 누클레오티드 서열을 포함하는 제2 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 주형 핵산은 그것의 3'-단부에 Illumina® P5 프라이머의 누클레오티드 서열을 포함하는 제1 유니버셜 캡쳐 영역 및 그것의 5'-단부에 Illumina® P7 프라이머의 누클레오티드 서열에 상보적인 누클레오티드 서열을 포함하는 제2 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다.
주형 핵산은 하나 이상의 타겟-특이적 캡쳐 영역을 가질 수 있다. 타겟-특이적 캡쳐 영역은 8개 초과, 10개 초과, 12개 초과, 14개 초과, 16개 초과, 16개 초과, 18개 초과, 20개 초과, 22개 초과, 24개 초과, 26개 초과, 28, 또는 30개 초과의 핵산의 타겟-특이적 캡쳐 시퀀스를 가질 수 있다. 일부 타겟-특이적 캡쳐 영역은 10 내지 20개의 핵산의 타겟-특이적 캡쳐 시퀀스를 갖는다. 일부 주형 핵산에서, 하나 이상의 타겟-특이적 캡쳐 영역은 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역과 제한 사이트 사이에 또는 5'-말단 유니버셜 캡쳐 영역과 제한 사이트 사이에 위치할 수 있다. 예를 들어, 도 6A 및 B 참조.
주형 핵산은 둘 이상의 타겟-특이적 캡쳐 영역을 가질 수 있다. 예를 들어, 도 6C 참조. 둘 이상의 타겟-특이적 캡쳐 영역은 동일한 타겟-특이적 캡쳐 영역 또는 상이한 타겟-특이적 캡쳐 영역일 수 있다. 일부 주형 핵산은 제1 및 제2 타겟-특이적 캡쳐 영역을 갖는다. 제1 타겟-특이적 캡쳐 영역은 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역과 제1 제한 사이트 사이에 위치할 수 있으며, 제2 타겟-특이적 캡쳐 영역은 5'-말단 유니버셜 캡쳐 영역과 제2 제한 사이트 사이에 위치할 수 있다. 제1 및 제2 타겟-특이적 캡쳐 영역은 동일한 타겟-특이적 캡쳐 영역 또는 상이한 타겟-특이적 캡쳐 영역일 수 있다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 주형 핵산은 두 개의 제한 사이트 및 두 제한 사이트 사이에 스페이서 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 두 제한 사이트는 SapI 제한 사이트이다. 일부 구체예에서, 스페이서 영역은 약 150개의 염기를 포함한다.
적어도 하나의 주형 핵산은 복수의 주형 핵산일 수 있다. 복수의 주형 핵산은 복수의 동일한 주형 핵산 또는 복수의 상이한 주형 핵산일 수 있다. 일부 방법에서, 적어도 하나의 주형 핵산은 2개 초과, 3개 초과, 5개 초과, 8개 초과, 10개 초과, 15개 초과, 20개 초과, 30개 초과, 100개 초과, 300개 초과, 1,000개 초과, 3,000개 초과, 10,000개 초과, 30,000개 초과, 100,000개 초과, 300,000개 초과, 또는 1,000,000개 초과의 복수의 상이한 주형 핵산을 포함한다. 각각의 상이한 주형 핵산은 동일한 복수의 주형 핵산일 수 있다.
주형 핵산은 하나 이상의 제한 사이트를 가질 수 있다. 일부 주형 핵산은 둘 이상의 제한 사이트를 갖는다. 둘 이상의 제한 사이트는 동일한 제한 사이트 또는 상이한 제한 사이트일 수 있다. 일부 주형 핵산은 하나 이상의 SapI 제한 사이트를 가질 수 있다. 일부 주형 핵산은 5'-GCTCTTC-3' 핵산 서열 또는 5'-GAAGACG-3' 누클레오티드 서열을 포함하는 제한 사이트를 갖는다. 일부 주형 핵산은 5'-GCTCTTCN/NNN-3' 핵산 서열 또는 5'-N/NNNGAAGACG-3' 핵산 서열을 포함하는 제한 사이트를 갖는다. 예를 들어, 도 6D 참조.
주형 핵산의 둘 이상의 제한 사이트는 임의로 스페이서 영역에 분리될 수 있다. 스페이서 영역의 길이는 그것의 측면 배치되는 유니버셜 캡쳐 영역을 통해 두 개의 고정된 캡쳐 프라이머에 대한 주형 핵산의 혼성화를 용이하게 하도록, 그리고 브릿지 형성을 용이하게 하도록 최적화될 수 있다. 예를 들어, 도 6A 및 7A 참조. 스페이서 영역의 길이는 3개 초과, 5개 초과, 8개 초과, 10개 초과, 15개 초과, 20개 초과, 25개 초과, 50개 초과, 75개 초과, 100개 초과, 125개 초과, 150개 초과, 175개 초과, 200개 초과, 225개 초과, 또는 250개 초과의 핵산일 수 있다. 일부 주형 핵산은 약 150개의 핵산의 스페이서 영역을 갖는다.
주형 핵산은 하나 이상의 추가의 영역, 예를 들어, SBS를 포함할 수 있다. 추가의 영역은 주형 핵산 상의 어디에나 위치할 수 있다. 예를 들어, SBS는 예를 들어, 타겟-특이적 영역과 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 사이에 위치할 수 있다. 일부 주형 핵산은 둘 이상의 SBS를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 기판은 복수의 패드를 포함하는 패턴화된 흐름 셀이다. 예를 들어, 도 7A-C 참조. 일부 구체예에서, 복수의 패드는 마이크로어레이로서 배열된 복수의 웰이다. 일부 패턴화된 흐름 셀은 3개 초과, 10개 초과, 30개 초과, 100개 초과, 300개 초과, 1,000개 초과, 3,000개 초과, 10,000개 초과, 30,000개 초과, 100,000개 초과, 300,000개 초과, 또는 1,000,000개 초과의 패드를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 복수의 패드의 각각의 패드는 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Y을 포함하는 제1의 복수의 고정된 유니버셜 캡쳐 프라이머 및 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Z을 포함하는 제2의 복수의 고정된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 도 7A 참조.
일부 구체예에서, 패드 당 단일 주형 핵산은 복수의 패드의 하나 이상의 패드에서 패드 당 단일 캡쳐 프라이머에 혼성화된다. 예를 들어, 도 10 참조. 복수의 패드의 둘 이상의 패드에서, 각각의 둘 이상의 패드에서 단일 캡쳐 프라이머에 혼성화되는 단일 주형 핵산은 동일한 타겟-특이적 캡쳐 영역 또는 상이한 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 주형 핵산일 수 있다.
단일 주형 핵산과 혼성화되는 단일 캡쳐 프라이머는 예를 들어, DNA 중합에 의해 연장되어 주형 핵산과 상보적인 단일의 고정된 확장 생성물을 형성할 수 있다. 패턴화된 흐름 셀 상에서, 하나 이상의 패드는 각각 단지 단일의 고정된 확장 생성물을 가질 수 있다. 패턴화된 흐름 셀의 둘 이상의 패드에서, 단일의 고정된 확장 생성물은 동일한 타겟-특이적 캡쳐 영역 또는 상이한 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 패드 당 단일의 고정된 확장 생성물은 패턴화된 흐름 셀의 복수의 패드의 하나 이상의 패드에서 생성된다. 예를 들어, 도 10 참조. 일부 구체예에서, 복수의 패드에서, 패드 당 단일의 고정된 확장 생성물은 동일한 주형 핵산에 대해 상보적이다. 일부 구체예에서, 복수의 패드에서, 패드 당 단일의 고정된 확장 생성물은 둘 이상의 상이한 주형 핵산에 대해 상보적이다. 일부 구체예에서, 패드 당 단일의 고정된 확장 생성물은 상이한 주형 핵산에 대해 복수의 패드 중 패드의 적어도 1%, 적어도 3%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%로 상보적이다. 일부 구체예에서, 패드 당 단일의 고정된 확장 생성물은 복수의 패드 중 패드의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 초과로 생성된다. 일부 구체예에서, 패드 당 단일의 고정된 확장 생성물은 복수의 패드 중 패드의 100%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 또는 1% 미만으로 생성된다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 고정된 확장 생성물을 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭시켜 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 적어도 하나의 모노클론 클러스터를 생성하는 것을 추가로 포함한다. 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 모노클론 클러스터는 복수의 고정된 이중 가닥 주형 핵산을 포함한다. 예를 들어, 모노클론 클러스터는 3개 초과, 10개 초과, 30개 초과, 100개 초과, 300개 초과, 1,000개 초과, 3,000개 초과, 10,000개 초과, 30,000개 초과, 100,000개 초과, 300,000개 초과, 또는 1,000,000개 초과의 고정된 이중 가닥 주형 핵산을 포함할 수 있다.
본원에서 제공되는 방법에서, PCR에 의한 증폭은 브릿지 증폭 또는 KEA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 8C 참조.
도 11-15은 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 모노클론 클러스터를 변환시켜 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 개질된 캡쳐 프라이머를 형성시키는 방법의 예시적인 구체예를 도시한 것이다. 이중-가닥 주형 핵산의 개별 쌍의 변환이 도시된다.
도 11은 단일 SapI 제한 사이트를 포함하는 고정된 이중 가닥 주형 핵산을 처리하는 예시적인 방법을 도시한 것이다. 주형 핵산은 3'-단부 (P7'; Illumina® P7 프라이머 서열에 상보적임) 및 5'-단부 (P5; Illumina® P5 프라이머 서열 포함)에 유니버셜 캡쳐 영역, 타겟-특이적 캡쳐 영역 (CP) 및 시퀀싱 프라이머 결합 사이트(SBS)를 추가로 포함한다. 도 11의 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 SapI 분해는 유니버셜 캡쳐 영역 (P7) 및 타겟-특이적 캡쳐 영역 (CP)을 포함하는 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머, 및 유니버셜 캡쳐 영역 및 부분 SapI 제한 사이트 (NCTTCTCG)를 포함하는 복수의 이중 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머의 형성을 야기한다. 이중 가닥 캡쳐 프라이머의 변성은 단일 가닥 라이브러리-준비 캡쳐 프라이머의 형성을 야기한다. 도 11의 라이브러리-준비 캡쳐 프라이머는 P5 누클레오티드 서열 및 부분 SapI 제한 사이트를 갖는 개질된 유니버셜 캡쳐 영역을 포함하는 시퀀싱 라이브러리로부터 타겟-폴리누클레오티드를 시퀀싱하는데 사용될 수 있다.
도 12는 고정된 Illumina® P7 캡쳐 프라이머를 사용하여 형성되고, 이로써 고정된 Illumina® P7 캡쳐 프라이머가 선결된 절단 사이트 (U; 8oG)를 포함하는, 고정된 이중 가닥 주형 핵산을 처리하는 예시적인 방법을 도시한 것이다. 도 12의 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 SapI 분해는 유니버셜 캡쳐 영역 (P7) 및 타겟-특이적 캡쳐 영역 (CP)을 포함하는 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머 및 유니버셜 캡쳐 영역, 부분 SapI 제한 사이트 (NCTTCTCG) 및 선결된 절단 사이트 (U; 8oG)를 포함하는 복수의 이중 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머의 형성을 야기한다. 도 12A 참조. 부분 SapI 제한 사이트는 그것의 선결된 절단 사이트에서 프라이머를 절단시킴으로써 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머로부터 분리될 수 있다. 도 12B 참조. 이중 가닥 캡쳐 프라이머의 변성은 단일 가닥 라이브러리-준비 캡쳐 프라이머의 형성을 야기한다. 도 12B의 라이브러리-준비 캡쳐 프라이머는 P5 누클레오티드 서열 (그리고, 부분 SapI 제한 사이트 없음)을 갖는 유니버셜 캡쳐 영역을 포함하는 시퀀싱 라이브러리로부터 타겟-폴리누클레오티드를 시퀀싱하는데 사용될 수 있다.
도 13은 두 개의 SapI 제한 사이트를 포함하는 고정된 이중 가닥 주형 핵산을 처리하는 예시적인 방법을 도시한 것이다. 도 13의 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 SapI 분해는 유니버셜 캡쳐 영역 (P7) 및 타겟-특이적 캡쳐 영역 (CP)을 포함하는 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머, 및 복수의 이중 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머의 형성을 야기한다. 이중 가닥 캡쳐 프라이머의 변성은 단일 가닥 라이브러리-준비 캡쳐 프라이머의 형성을 야기한다. 도 13의 방법에서, 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 SapI 분해는 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머의 타겟-특이적 캡쳐 영역의 하나의 누클레오티드를 제거한다. 도 12B의 라이브러리-준비 캡쳐 프라이머는 P5 누클레오티드 서열 (그리고, 부분 SapI 제한 사이트 없음)을 갖는 유니버셜 캡쳐 영역을 포함하는 시퀀싱 라이브러리로부터 타겟-폴리누클레오티드를 시퀀싱하는데 사용될 수 있다.
도 14는 하나의 SapI 제한 사이트를 포함하는 고정된 이중 가닥 주형 핵산을 처리하기 위한 예시적인 방법을 예시한다. 도 14의 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 SapI 분해는 유니버셜 캡쳐 영역(P7) 및 타겟-특이적 캡쳐 영역(CP)을 포함하는 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머, 및 유니버셜 캡쳐 영역(P5) 및 부분 SapI 제한 사이트(NCTTCTCG)를 포함하는 복수의 이중 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머의 형성을 발생시킨다. 이중 가닥 캡쳐 프라이머의 변성은 단일 가닥 캡쳐 프라이머의 형성을 발생시킨다. 단일 가닥 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머로부터 부분 SapI 제한 사이트를 제거하기 위해, 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머의 키메라 캡쳐 프라이머 및 유니버셜 캡쳐 영역은 상보적인 올리고누클레오티드와 하이브리드화되어, 재생된 캡쳐 프라이머 단일 가닥의 부분 제한 사이트를 남기면서, 이중 가닥 DNA의 영역을 형성할 수 있다. 단일 가닥 부분 제한 사이트는 엑소누클레아제 I과 같은 엑소누클레아제로의 처리에 의해 제거될 수 있다. 상보적인 올리고누클레오티드는, 예를 들어, 변성(예를 들어, 화학적 또는 열적)에 의해 제거되어 단일 가닥 라이브러리-준비된 캡쳐 프라이머를 형성할 수 있다. 도 14의 라이브러리-준비된 캡쳐 프라이머를 이용하여 P5 누클레오티드 서열(및 부분 SapI 제한 사이트 없음)을 갖는 유니버셜 캡쳐 영역을 포함하는 시퀀싱 라이브러리로부터 타겟-폴리누클레오티드를 시퀀싱할 수 있다.
도 15는 하나의 SapI 제한 사이트 및 유니버셜 캡쳐 영역 PX를 포함하는 고정된 이중 가닥 주형 핵산을 처리하기 위한 예시적인 방법을 예시한다. 도 15의 흐름 셀은 사전결정된 절단 사이트(디올)를 포함하는, Illumina® P5 및 P7 캡쳐 프라이머 및 유니버셜 캡쳐 프라이머 PX를 포함하는 3개의 고정된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 포함한다. 도 15의 고정된 이중 가닥 주형 핵산은 Illumina® P7 캡쳐 프라이머 및 유니버셜 캡쳐 프라이머 PX를 수반한다. 도 16의 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 SapI 분해는 유니버셜 캡쳐 영역(P7) 및 타겟-특이적 캡쳐 영역(CP)을 포함하는 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머, 및 부분 SapI 제한 사이트(NCTTCTCG)를 포함하는 복수의 이중 가닥 고정된 유니버셜 캡쳐 프라이머 PX의 형성을 발생시킨다. 이중 가닥 캡쳐 프라이머의 변성은 단일 가닥 캡쳐 프라이머의 형성을 발생시킨다. 부분 SapI 제한 사이트(NCTTCTCG)를 포함하는 이중 가닥 고정된 유니버셜 캡쳐 프라이머 PX는 사전결정된 절단 사이트에서의 절단을 통해 도 15의 흐름 셀로부터 제거될 수 있다. 도 15의 라이브러리-준비된 캡쳐 프라이머는 유니버셜 캡쳐 영역(P7) 및 타겟-특이적 캡쳐 영역(CP)을 포함하는 키메라 캡쳐 프라이머 및 Illumina® P5 캡쳐 프라이머를 포함한다. 도 15의 라이브러리-준비된 캡쳐 프라이머를 이용하여 P5 누클레오티드 서열(및 부분 SapI 제한 사이트 없음)을 갖는 유니버셜 캡쳐 영역을 포함하는 시퀀싱 라이브러리로부터 타겟-폴리누클레오티드를 시퀀싱할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 적어도 하나의 모노클로날 클러스터를 적어도 하나의 제한 효소와 접촉시켜 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 하나 이상의 제한 사이트를 절단함으로써 유니버셜 캡쳐 영역 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머, 및 복수의 이중 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 생산하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 도 7b 및 c를 참조하라.
이중 가닥 주형 핵산은 하나 이상의 상이한 제한 효소와 접촉할 수 있다. 일부 방법에서, 이중 가닥 주형 핵산은 2, 3, 4, 5개 이상의 상이한 제한 효소와 접촉한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 제한 효소는 SapI을 포함한다.
이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머 및 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머에서, 한 가닥은 표면에 공유적으로 부착되는 반면, 다른 가닥은 표면에 공유적으로 부착되지 않는다. 상기 방법은 표면에 공유적으로 부착된 두 가닥 형태인 단일 가닥 키메라 캡쳐 프라이머 및 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 분리시키는 단계를 포함할 수 있다. 가닥은, 예를 들어, 변성, 예컨대 열적 또는 화학적 변성에 의해, 또는 효소적 분해에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 도 11-15를 참조하라. 효소적 분해는 누클레아제 분해를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이중 가닥 프라이머는 엑소누클레아제, 예컨대 이중 가닥 DNA에서 누클레오티드 가닥을 5'→ 3' 방향으로 특이적으로 분해시키는 5'-3' dsDNA 엑소누클레아제(예를 들어, T7 엑소누클레아제)로 처리될 수 있다. 예를 들어, 도 14를 참조하라. 표면 부착은 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머 및 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머에서 공유적으로 부착된 가닥의 5'-단부를 5'-3' dsDNA 엑소누클레아제 분해로부터 보호하는 반면, 표면에 공유적으로 부착되지 않은 가닥은 분해된다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 복수의 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머 및 복수의 이중 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 변성시켜 복수의 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 복수의 단일 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 생산하는 것을 추가로 포함한다. 변성은, 예를 들어, 열적 변성 또는 화학적 변성, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 10 및 11을 참조하라.
일부 구체예에서, 상기 방법은 복수의 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머 및 복수의 이중 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 5'-3' 이중 가닥 데옥시리보핵산(dsDNA) 엑소누클레아제와 접촉시켜 복수의 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 복수의 단일 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 생산하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 기판은 복수의 패드를 포함하는 패턴화된 흐름 셀이다. 일부 구체예에서, 복수의 패드는 마이크로어레이에 배열된 복수의 웰이다. 일부 구체예에서, 복수의 패드의 하나 이상의 패드는 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 제1의 복수의 캡쳐 프라이머 및 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 제2의 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 포함한다. 일부 구체예에서, 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 캡쳐 프라이머의 1% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 99% 초과, 99.9% 초과, 또는 99.99% 초과는 복수의 패드의 하나 이상의 패드에서 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머로 전환된다. 일부 구체예에서, 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 캡쳐 프라이머의 1% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 99% 초과, 99.9% 초과, 또는 99.99% 초과는 복수의 패드의 하나 이상의 패드에서 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머로 전환된다. 일부 구체예에서, 복수의 패드의 하나 이상의 패드에서 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 캡쳐 프라이머의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 초과는 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머로 전환되고 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 캡쳐 프라이머의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 초과는 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머로 전환된다.
다른 양태에서, a) 복수의 고정된 캡쳐 프라이머를 포함하는 기판을 하이브리드화에 충분한 조건 하에 적어도 하나의 주형 핵산과 접촉시켜 적어도 하나의 고정된 주형 핵산을 생산하는 단계로서, 복수의 고정된 캡쳐 프라이머가 3'-말단 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 제1의 복수의 프라이머 및 3'-말단 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 제2의 복수의 프라이머를 포함하고, 각각의 주형 핵산이 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열에 상보적인 3'-말단 서열 및 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열에 상보적인 5'-말단 서열에 측면 배치되고, 2개의 SapI 제한 사이트, SapI 제한 사이트들 사이의 스페이서 영역, 및 Illumina® P5' 프라이머 누클레오티드 서열에 상보적인 3'-말단 서열 및 SapI 제한 사이트 사이의 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는, 단계; 및 b) 적어도 하나의 고정된 주형 핵산에 하이브리드화된 적어도 하나의 고정된 캡쳐 프라이머를 확장시켜 적어도 하나의 주형 핵산에 상보적인 적어도 하나의 고정된 확장 생성물을 생산하는 단계; c) 적어도 하나의 고정된 확장 생성물을 브릿지 증폭 또는 KEA에 의해 증폭시켜 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 적어도 하나의 모노클로날 클러스터를 생산하는 단계; d) 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 적어도 하나의 모노클로날 클러스터를 SapI와 접촉시켜 고정된 이중 가닥 주형 핵산에서 2개의 제한 사이트를 절단함으로써 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머 및 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 복수의 고정된 이중 가닥 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 생산하는 단계, 및 e) 임의로, 복수의 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머 및 복수의 고정된 이중 가닥 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 5'-3' dsDNA-엑소누클레아제와 접촉시켜 복수의 고정된 단일 가닥 키메라 캡쳐 프라이머 및 복수의 고정된 단일 가닥 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 생산하는 단계를 포함하는, 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법이 본원에 제공된다. 이 방법의 예시적인 설명은, 예를 들어, 도 7에 도시되어 있다.
다른 양태에서, a) 복수의 고정된 캡쳐 프라이머를 포함하는 기판을 하이브리드화에 충분한 조건 하에 적어도 하나의 주형 핵산과 접촉시켜 적어도 하나의 고정된 주형 핵산을 생산하는 단계로서, 복수의 고정된 캡쳐 프라이머가 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 제1의 복수의 프라이머를 포함하고 제2의 복수의 프라이머가 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Z을 포함하며, 적어도 하나의 주형 핵산이 5'-말단 및 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Y 또는 Z에 측면 배치되고 하나 이상의 제한 사이트 및 하나 이상의 제한 사이트와 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 사이의 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는, 단계; b) 적어도 하나의 주형 핵산에 하이브리드화된 적어도 하나의 고정된 캡쳐 프라이머를 확장시켜 적어도 하나의 주형 핵산에 상보적인 적어도 하나의 고정된 확장 생성물을 생산하는 단계; c) 적어도 하나의 고정된 확장 생성물을 PCR에 의해 증폭시켜 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 적어도 하나의 모노클로날 클러스터를 생산하는 단계; d) 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 적어도 하나의 모노클로날 클러스터를 제한 효소와 접촉시켜 고정된 이중 가닥 주형 핵산에서 하나 이상의 제한 사이트를 절단함으로써 유니버셜 캡쳐 영역 Z 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머 및 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 복수의 고정된 이중 가닥 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 생산하는 단계를 포함하는, 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법이 본원에 제공된다. 예를 들어, 도 7a를 참조하라.
일부 구체예에서, 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머는 3'-말단 부분 제한 사이트를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머로부터 3'-말단 부분 제한 사이트를 제거하는 것을 포함한다. 예를 들어, 도 12-15를 참조하라.
일부 구체예에서, 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머는 사전결정된 절단 사이트를 포함한다. 일부 구체예에서, 사전결정된 절단 사이트는 디올 링커, 8-옥소구아닌(8-옥소-G), 우라실 염기, 리보누클레오티드, 메틸화된 누클레오티드, 또는 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 도 12a 및 b를 참조하라.
일부 구체예에서, 부분 제한 사이트를 제거하는 것은 비-효소 화학적 분열을 포함한다. 일부 구체예에서, 비-효소 화학적 분열은 퍼요오데이트 처리, 희토류 금속 이온 처리, 알칼리 처리 또는 광화학적 반응을 포함한다.
일부 구체예에서, 3'-말단 부분 제한 사이트를 제거하는 것은 효소적 절단을 포함한다. 일부 구체예에서, 효소적 절단은 우라실-DNA 글리코실라아제 절단, 엔도누클레아제 절단, 리보누클레아제(RNAse) 처리, 제한 효소 절단 또는 프로테아제 절단을 포함한다. 예를 들어, 도 12를 참조하라.
일부 구체예에서, 3'-말단 부분 제한 사이트를 제거하는 것은 역 상보적 올리고누클레오티드를 단일 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머에 하이브리드화시켜 이중 가닥 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 형성하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 역 상보적 올리고누클레오티드를 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머에 하이브리드화시켜 이중 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머를 형성하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 기판을 누클레아제와 접촉시켜 3'-말단 부분 제한 사이트를 제거하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 누클레아제는 엑소누클레아제이다. 일부 구체예에서, 엑소누클레아제는 엑소누클레아제 I이다. 예를 들어, 도 14를 참조하라.
일부 구체예에서, 3'-말단 타겟-특이적 캡쳐 영역 고정된 키메라 캡쳐 프라이머는 트렁케이션된다. 예를 들어, 도 13에 도시된 예시적인 구체예를 참조하라.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 주형 핵산은 5'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Y, 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Z, 제1 및 제2 제한 사이트 및 제1 제한 사이트와 제2 사이트 사이의 스페이서 영역을 포함하는 중심 부분, 및 중심 부분과 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Z 사이의 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 주형 핵산은 타겟-특이적 영역 및 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Z 사이에 SBS를 추가로 포함한다. 예를 들어, 도 13을 참조하라.
일부 구체예에서, 상기 방법은 e) 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 포함하는 핵산 샘플을 하이브리드화에 충분한 조건 하에 적어도 하나의 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 상기 적어도 하나의 프라이머가 어댑터를 함유하는, 단계; f) PCR에 의해 상기 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 증폭시켜 복수의 앰플리콘을 생산하는 단계; g) 복수의 고정된 키메라 캡쳐 프라이머를 하이브리드화에 충분한 조건 하에 상기 복수의 앰플리콘과 직접 접촉시켜 제1의 복수의 고정된 앰플리콘을 생산하는 단계; h) 복수의 고정된 키메라 캡쳐 프라이머를 확장시켜 상기 타겟 폴리누클레오티드에 상보적인 복수의 고정된 확장 생성물을 생산하는 단계, 및 i) PCR에 의해 상기 복수의 고정된 확장 생성물을 증폭시켜 제2의 복수의 고정된 앰플리콘을 생산하는 단계로서, 상기 고정된 앰플리콘의 집단이 50% 이상의 균일성을 포함하는, 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 고정된 앰플리콘의 집단은 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 균일성을 포함한다. 일부 구체예에서, 균일성은 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95 이상을 포함한다.
고정된 앰플리콘의 균일성(클러스터 균일성으로도 언급된)은, 예를 들어, 본원에 참조로서 포함되는 미국 특허 출원 61/928,368호에 기재된 대로 결정될 수 있다.
일부 구체예에서, 어댑터는 유니버셜 캡쳐 영역 Y 또는 Z를 포함한다.
일부 구체예에서, 어댑터는 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 또는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함한다.
다른 양태에서, a) 기판 상에 고정된 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 하이브리드화에 충분한 조건 하에 복수의 주형 핵산과 접촉시켜 하나 이상의 고정된 주형 핵산을 생산하는 단계로서, 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머가 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 제1의 복수의 프라이머 및 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 제2의 복수의 프라이머를 포함하고, 각각의 주형 핵산이 5'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Y, 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Z, 타겟-특이적 캡쳐 영역, 5'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Y와 타겟-특이적 캡쳐 영역 사이의 제한 사이트, 및 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Z와 타겟-특이적 캡쳐 부분 사이의 SBS를 포함하는, 단계; b) 하나 이상의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 확장시켜 하나 이상의 고정된 주형 핵산에 상보적인 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 생산하는 단계; c) 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 브릿지 증폭 또는 KEA에 의해 증폭시켜 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 생산하는 단계; d) 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 클러스터를 제한 효소와 접촉시켜 유니버셜 캡쳐 영역 Z 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 유니버셜 캡쳐 영역 Y 및 부분 제한 사이트를 포함하는 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 생산하는 단계를 포함하는, 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법이 본원에 제공된다. 이 방법의 예시적인 설명은, 예를 들어, 도 11에 도시되어 있다.
다른 양태에서, a) 기판 상에 고정된 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 하이브리드화에 충분한 조건 하에 복수의 주형 핵산과 접촉시켜 하나 이상의 고정된 주형 핵산을 생산하는 단계로서, 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머가 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Y 및 제1의 사전결정된 절단 사이트를 포함하는 제1의 복수의 프라이머 및 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Z 및 제2의 사전결정된 절단 사이트를 포함하는 5'-부분을 포함하는 제2의 복수의 프라이머를 포함하고, 각각의 주형 핵산이 5'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Y, 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Z, 타겟-특이적 캡쳐 영역, 5'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Y와 타겟-특이적 캡쳐 영역 사이의 제한 사이트, 및 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Z와 타겟-특이적 캡쳐 영역 사이의 SBS를 포함하는, 단계; b) 하나 이상의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 확장시켜 하나 이상의 주형 핵산에 상보적인 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 생산하는 단계; c) 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 브릿지 증폭 또는 KEA에 의해 증폭시켜 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 생산하는 단계; d) 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 제한 효소와 접촉시켜 유니버셜 캡쳐 영역 Z 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 유니버셜 캡쳐 영역 Y 및 부분 제한 사이트를 포함하는 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 생산하는 단계, 및 e) 제1의 사전결정된 절단 사이트에서의 절단을 통해 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머로부터 부분 제한 사이트를 제거하는 단계를 포함하는, 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법이 본원에 제공된다. 예를 들어, 도 12a 및 b를 참조하라. 일부 구체예에서, 유니버셜 캡쳐 영역 Y는 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하고 유니버셜 캡쳐 영역 Z는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1의 사전결정된 절단 사이트는 우라실 염기를 포함하고 제2의 사전결정된 절단 사이트는 디올-링커를 포함한다. 이 방법의 예시적인 설명은, 예를 들어, 도 12a 및 b에 도시되어 있다.
다른 양태에서, a) 기판 상에 고정된 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 하이브리드화에 충분한 조건 하에 복수의 주형 핵산과 접촉시켜 하나 이상의 고정된 주형 핵산을 생산하는 단계로서, 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머가 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 제1의 복수의 프라이머 및 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 제2의 복수의 프라이머를 포함하고, 각각의 주형 핵산이 5'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Y, 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Z, 제1 및 제2 제한 사이트 및 제1 제한 사이트와 제2 사이트 사이의 스페이서 영역을 포함하는 중심 부분, 및 중심 부분과 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Z 사이의 타겟-특이적 영역을 포함하는, 단계; b) 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머의 하나 이상의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 확장시켜 하나 이상의 주형 핵산에 상보적인 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 생산하는 단계; c) 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 브릿지 증폭 또는 KEA에 의해 증폭시켜 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 생산하는 단계, 및 d) 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 제한 효소와 접촉시켜 유니버셜 캡쳐 영역 Z 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 생산하는 단계를 포함하는, 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법이 본원에 제공된다. 이 방법의 예시적인 설명은, 예를 들어, 도 13에 도시되어 있다.
다른 양태에서, a) 기판 상에 고정된 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 하이브리드화에 충분한 조건 하에 복수의 주형 핵산과 접촉시켜 하나 이상의 고정된 주형 핵산을 생산하는 단계로서, 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머가 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 제1의 복수의 프라이머 및 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 제2의 복수의 프라이머를 포함하고, 각각의 주형 핵산이 5'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Y, 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Z, 타겟-특이적 캡쳐 영역 및 5'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Y와 타겟-특이적 캡쳐 영역 사이의 제한 사이트를 포함하는, 단계; b) 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머의 하나 이상의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 확장시켜 하나 이상의 주형 핵산에 상보적인 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 생산하는 단계; c) 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 브릿지 증폭 또는 KEA에 의해 증폭시켜 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 생산하는 단계; d) 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 제한 효소와 접촉시켜 유니버셜 캡쳐 영역 Z 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 이중 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 유니버셜 캡쳐 영역 Y 및 단일 가닥 부분 제한 사이트를 포함하는 복수의 이중 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 생산하는 단계; e) 복수의 이중 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 복수의 이중 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 변성시켜 복수의 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 복수의 단일 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 생산하는 단계; f) 역 상보적 올리고누클레오티드를 복수의 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 복수의 단일 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머에 하이브리드화시켜 이중 가닥 유니버셜 캡쳐 영역 및 이중 가닥 타겟-특이적 영역을 형성하는 단계, 및 g) 표면을 엑소누클레아제 I과 접촉시켜 단일 가닥 부분 제한 사이트를 복수의 이중 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머로부터 제거하는 단계를 포함하는, 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법이 본원에 제공된다. 이 방법의 예시적인 설명은, 예를 들어, 도 14에 도시되어 있다.
다른 양태에서, a) 기판 상에 고정된 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 하이브리드화에 충분한 조건 하에 복수의 주형 핵산과 접촉시켜 하나 이상의 고정된 주형 핵산을 생산하는 단계로서, 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머가 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 제1의 복수의 프라이머, 및 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 제2의 복수의 프라이머 및 3'-말단 영역 X 및 사전결정된 절단 사이트를 포함하는 5' 부분을 포함하는 제3의 복수의 프라이머를 포함하고, 각각의 주형 핵산이 5'-말단 영역 X, 3'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Z, 타겟-특이적 캡쳐 영역, 및 영역 X와 타겟-특이적 캡쳐 영역 사이의 제한 사이트를 포함하는, 단계; b) 하나 이상의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 확장시켜 하나 이상의 주형 핵산에 상보적인 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 생산하는 단계; c) 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 브릿지 증폭 또는 KEA에 의해 증폭시켜 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 생산하는 단계; d) 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 제한 효소와 접촉시켜 유니버셜 캡쳐 영역 Z 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 영역 X 및 부분 제한 사이트를 포함하는 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 생산하는 단계, 및 e) 영역 X를 포함하는 복수의 고정된 재생된 캡쳐 프라이머를 사전결정된 절단 사이트에서의 절단을 통해 기판으로부터 제거하는 단계를 포함하는, 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법이 본원에 제공된다. 예를 들어, 도 15를 참조하라. 일부 구체예에서, 유니버셜 캡쳐 영역 Y는 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하고 유니버셜 캡쳐 영역 Z는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 사전결정된 절단 사이트는 디올-링커를 포함한다. 이 방법의 예시적인 설명은, 예를 들어, 도 15에 도시되어 있다.
그 안에 제공된 주형 핵산은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 주형 핵산은, 예를 들어, 도 6a-c에 예시된 대로, 올리고누클레오티드 합성에 의해 이들의 전장 형태로 생산될 수 있다.
다른 양태에서, 예를 들어, 도 16에 예시된 대로, 2개 이상의 부분 주형 핵산의 생산을 포함하는, 본원에 제공된 주형 핵산을 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구체예에서, 2개 이상의 부분 주형 핵산은 서로 부분적으로 하이브리드화되어 부분 주형 핵산의 다이머를 형성할 수 있는 부분 주형 핵산의 쌍이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 부분 주형 핵산의 다이머에서 부분 주형 핵산을 확장시켜 전장 주형 핵산의 다이머를 형성하는 것을 포함한다.
다른 양태에서, 부분 주형 핵산의 다이머를 형성하기 위해 서로 부분적으로 하이브리드화될 수 있는 부분 주형 핵산의 쌍이 본원에 제공된다. 쌍의 제1 부분 주형 핵산은 제2 부분 주형 핵산의 핵산 서열의 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 또는 10% 미만과 부분적으로 하이브리드화될 수 있다. 일부 구체예에서, 쌍의 부분 주형 핵산들은 이들의 3'-단부에서 서로 부분적으로 하이브리드화될 수 있다. 일부 구체예에서, 쌍의 부분 주형 핵산들은 이들의 타겟-특이적 캡쳐 영역에서 서로 하이브리드화될 수 있다.
일부 구체예에서, 부분 주형 핵산의 다이머는 5'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Y 또는 Z, 제한 사이트 및 3'-말단 다이머화 영역 DR을 포함하는 제1 부분 주형 핵산 및 5'-말단 유니버셜 캡쳐 영역 Y 또는 Z 및 3'-말단 다이머화 영역 DR을 포함하는 제2 부분 주형 핵산을 포함하고, 제1 부분 주형 핵산의 3'-말단 DR 및 제2 부분 주형 핵산의 3'-말단 DR은 서로 하이브리드화된다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 부분 주형 핵산의 3'-말단 DR들은 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 부분 주형 핵산의 3'-말단 DR들은 시퀀싱-프라이머 결합 사이트(SBS)를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 부분 주형 핵산의 3'-말단 DR들은 제한 사이트(예를 들어, SapI 제한 사이트)를 포함한다.
일부 구체예에서, 부분 주형 핵산의 다이머는 그 5'-단부에 제1 유니버셜 캡쳐 영역을 포함하는 제1 부분 주형 핵산(P5), 제한 사이트(SapI), 및 그 3'-단부에 타겟-특이적 캡쳐 영역(CP)을 포함한다. 일부 구체예에서, 부분 주형 핵산의 다이머는 그 3'-단부에 상보적인 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 제2 부분 주형 핵산(CP'), 시퀀싱 프라이머 결합 사이트(SBS) 및 그 5'-단부에 제2 유니버셜 캡쳐 영역(P7)을 갖는다. 예를 들어, 도 16을 참조하라.
KEA는 임의의 추가 타겟 핵산이 동일한 구역에 시딩(seed)될 수 있기 전에 표면 구역에 '시딩'되는 단일 타겟 핵산의 급속 증폭에 의해, 표면 구역 상에, 예를 들어, 패턴화된 흐름셀 위의 패드 상에 모노클로날 타겟 핵산 클러스터(예를 들어, 타겟 핵산 앰플리콘)의 생산을 가능하게 할 수 있고 KEA는 포이즌(Poisson) 한계를 초과하는 모노클로날 핵산 클러스터의 밀도를 달성할 수 있다. 전형적으로, KEA에서, 타겟 핵산의 시딩 속도는 타겟 핵산의 증폭 속도보다 훨씬 낮고, 증폭 기계는 전형적으로 타겟 폴리누클레오티드 시딩 동안 존재한다. 이 설명은, 이러한 특징들이 KEA로 하여금 흐름셀-내 시약이나 표면으로의 단일 분자의 전달 속도에 대한 경쟁 요건을 갖는 다수의 일반적으로 이용되는 시퀀싱 라이브러리 제조 방법과 양립될 수 없게 할 수 있다는 자각에 부분적으로 기반한다.
이 설명은 추가로, 상기 언급된 문제들이 타겟 핵산 시딩을 타겟 핵산 증폭으로부터 분리하거나 샘플 제조 및 타겟 핵산 시딩을 타겟 핵산 증폭으로부터 분리시킴에 의해 회피될 수 있다는 자각에 부분적으로 기반한다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법의 구체예에서, 처음에 당 분야에 공지된 타겟 핵산 시딩 방법은 표면 구역(예를 들어, 패턴화된 흐름 셀의 패드 또는 웰)의 폴리클로날 타겟 핵산 점유를 발생시키는 타겟 핵산 부하 밀도로 수행된다. 선택된 타겟 핵산 시딩 조건 하에 소 분획의 표면 엘리먼트(예를 들어, 유니버셜 캡쳐 프라이머)가 타겟 핵산(예를 들어, 타겟-폴리누클레오티드 또는 주형 핵산)에 하이브리드화된다. 선택된 실험 조건 하에, 시딩 사건 자체는 핵산 증폭 및 모노클로날 클러스터의 형성을 위한 트리거로서 효과적으로 이용될 수 없다. 분리된 방법 단계에서, 분리된 트리거가 도입되어 타겟 핵산을 증폭 속도보다 훨씬 낮은 속도로 활성화시켜, 대부분의 경우 여러 시딩된 타겟 핵산 중 단 하나만이 증폭되어, 예를 들어 패턴화된 흐름 셀의 웰 또는 패드에서, 타겟 핵산의 모노클로날 클러스터를 형성하도록 보장한다.
본 설명은 추가로, 타겟 핵산의 활성화가 타겟화 공정(예를 들어, 도 17-19를 참조하라) 또는 확률 공정(예를 들어, 도 20-21을 참조하라)으로 촉발될 수 있다는 자각에 부분적으로 기반한다. 타겟화 공정에서, 타겟 핵산은, 예를 들어, 개별적으로 그리고 독립적으로 활성화될 수 있는 상이한 서브그룹을 포함할 수 있다. 확률 공정에서, 상이한 타겟 핵산은 무작위로 활성화될 수 있고 활성화 조건은 타겟 핵산의 무작위 활성화가 낮은 빈도로 발생하도록 선택될 수 있다.
타겟화된 활성화 공정의 한 예에서, 타겟 핵산의 상이한 서브그룹을 구별하기 위해 상이한 타겟 핵산이 상이한 라벨에 부착될 수 있고, 타겟 핵산의 각 구성원은 동일한 종류의 라벨을 지닌다. 타겟 핵산 라벨링은, 예를 들어, 샷-건 라벨링(예를 들어, 바코딩)에 의해 무작위로 수행될 수 있거나, 라벨링은 타겟화될 수 있다(예를 들어, 서열 특이적 라벨링).
도 18은 타겟 핵산의 타겟화된 활성화를 이용한 본원에 제공된 예시적인 방법의 일부를 예시한다. 첫 번째 단계에서, 상이한 라벨 A, B, C를 갖는 타겟 핵산의 상이한 서브그룹이 패턴화된 흐름 셀의 패드(예를 들어, 패드 1)에 시딩되었다. 라벨-특이적 트리거 분자를 분리된 단계에서 이용하여 타겟 핵산의 특이적 서브그룹을 활성화시킨다. 일부 구체예에서, 타겟 핵산-특이적 라벨은 타겟 핵산-특이적 핵산 서열일 수 있고 라벨-특이적 트리거 분자는 상보적인 타겟 특이적 핵산 서열을 포함하는 핵산 프라이머일 수 있다. 라벨-특이적 트리거 분자는, 예를 들어, 도 18에 도시된 가용성 핵산 프라이머일 수 있다. 일부 구체예에서, 라벨-특이적 트리거 분자는, 예를 들어, 도 19에 도시된 대로, 자신을 표면에 고정화시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 라벨-특이적 트리거 분자는 시딩된 타겟 핵산보다 훨씬 낮은 농도로 표면에 존재한다. 일부 구체예에서, 가용성 또는 고정된 트리거 분자는, 예를 들어, 유니버셜 캡쳐 영역 및 타겟-특이적 캡쳐 영역(예를 들어, 도 19의 P5/B')을 포함하는 키메라 프라이머일 수 있다.
도 20은 타겟 핵산의 확률적 활성화를 수반하는 본원에 제공된 방법의 예시적인 구체예를 예시한다. 이 실시예에서, 시딩된 타겟 핵산은 유니버셜 캡쳐 영역 P5를 차폐시키는 헤어핀 구조를 포함하고 절단가능한 염기를 추가로 포함한다. 타겟 핵산의 확률적 활성화는, 예를 들어, 헤어핀 구조의 엔도누클레아제 분해 및 유니버셜 캡쳐 영역의 비차폐(umasking)에 의해 달성될 수 있다.
타겟 핵산의 확률적 활성화를 수반하는 본원에 제공된 방법의 또 다른 구체예에서, 타겟 핵산은 부착된 차단제(예를 들어, 단백질 또는 비드)와 함께 시딩될 수 있다. 개별적인 시딩된 타겟 핵산의 확률적 활성화는 탈차단제(예를 들어, 프로테아제)의 후속 첨가를 통해 달성될 수 있다.
타겟 핵산의 확률적 활성화를 수반하는 본원에 제공된 방법의 또 다른 구체예에서, 시딩된 타겟 핵산은 비자연 발생 누클레오티드(예를 들어, 이소구아닌 또는 이소시토신 염기를 지님)를 포함할 수 있다. 개별적인 타겟 핵산의 확률적 활성화는 비자연적으로 발생하는 누클레오티드 대신에 타겟 핵산 앰플리콘으로 자연 누클레오티드를 "잘못 혼입(misincorporating)"시킴으로써 KEA에 의해 달성될 수 있다. 자연 발생 누클레오티드는 전형적으로 타겟 핵산의 비자연 발생 누클레오티드와 낮은 효율 및 낮은 빈도로만 쌍을 이룬다.
타겟 핵산의 확률적 활성화를 수반하는 또 다른 예시적인 방법에서, 예를 들어, 시퀀싱 라이브러리의 타겟 핵산에는 처음에 트리거 서열이 없다. 초기 단계에서 트리거 서열은 트리거 서열(예를 들어, P5 서열) 및 타겟 핵산에 상보적인 서열(예를 들어, SBS3 서열) 둘 모두를 포함하는 낮은 수준의 키메라 프라이머를 KEA에서 포함시킴으로써 확률적 공정의 개별적인 타겟 핵산에 첨가될 수 있다. 첨가된 트리거 서열(예를 들어, P5)을 갖는 개별적인 타겟 핵산은, 그 후, 예를 들어, 패턴화된 흐름 셀의 웰에 시딩될 수 있고, 증폭되어 모노클로날 클러스터를 형성할 수 있다. 예를 들어, 도 21 및 실시예 2를 참조하라.
다른 양태에서, a) 복수의 고정된 캡쳐 프라이머를 갖는 기판을 하이브리드화에 충분한 조건 하에 복수의 상이한 시드 핵산과 접촉시켜 복수의 상이한 고정된 시드 핵산을 생산하는 단계; b) 복수의 고정된 캡쳐 프라이머 중 2개 이상을 확장시켜 복수의 상이한 고정된 시드 핵산 중 2개 이상에 상보적인 복수의 상이한 고정된 확장 생성물을 생산하는 단계; c) 복수의 상이한 고정된 확장 생성물 중 하나의 고정된 확장 생성물을 활성화시켜 활성화된 캡쳐 프라이머를 형성하는 단계, 및 d) 임의로, 활성화된 캡쳐 프라이머를 증폭시켜 고정된 개질된 캡쳐 프라이머의 모노클로날 클러스터를 생산하는 단계를 포함하는, 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구체예에서, 시드 핵산은, 예를 들어, DNA 시퀀싱 라이브러리 또는 유전체 DNA에 타겟 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 시드 핵산은 본원에 제공된 주형 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, 타겟 핵산은 하나 이상의 이종 핵산을 포함하는 RNA 또는 핵산이다.
고정된 확장 생성물의 활성화는 타겟화된 활성화일 수 있고, 이 때 모든 고정된 확장 생성물이 동등하게 활성화되는 것은 아니다. 활성화는 고정된 확장 프라이머의 다른 서브그룹보다 활성화될 가능성이 높은 사전결정된 고정된 확장 생성물의 서브그룹에 타겟화될 수 있다. 다른 구체예에서, 고정된 확장 생성물의 활성화는 확률적 활성화이고, 일부 고정된 확장 생성물은 다른 고정된 확장 생성물보다 더 일찍 활성하되지만, 이것은, 예를 들어, 고정된 확장 생성물의 구조적 또는 기능적 특징에 기반하여, 미리 결정될 수 없는 것이며, 복수의 고정된 확장 생성물 중의 고정된 확장 생성물은 더 일찍 활성화되고 나중에 활성화된다.
일부 구체예에서, 복수의 상이한 고정된 확장 생성물 중 한 고정된 확장 생성물을 활성화시키는 것은 타겟화된 활성화를 포함한다. 일부 구체예에서, 타겟화된 활성화는 복수의 상이한 시드 핵산을 복수의 상이한 라벨로 라벨링시켜 복수의 상이하게 라벨링된 시드 핵산을 생산하는 초기 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 타겟화된 활성화는 복수의 상이하게 라벨링된 고정된 시드 핵산을 형성하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 타겟화된 활성화는 복수의 상이하게 라벨링된 고정된 확장 생성물을 형성하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 타겟화된 활성화는 복수의 상이하게 라벨링된 고정된 확장 생성물을 하나 이상의 라벨-특이적 트리거 분자와 접촉시켜 하나의 고정된 확장 생성물을 활성화시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 초기 라벨링 단계는 복수의 상이한 시드 핵산을 무작위로 라벨링시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 초기 라벨링 단계는 복수의 상이한 시드 핵산의 타겟화된 라벨링을 포함한다. 일부 구체예에서, 타겟화된 라벨링은 서열-특이적 라벨링이다. 일부 구체예에서, 복수의 상이한 시드 핵산은 50개 미만, 45개 미만, 40개 미만, 35개 미만, 30개 미만, 25개 미만, 20개 미만, 18개 미만, 16개 미만, 14개 미만, 12개 미만, 10개 미만, 8개 미만, 6개 미만, 4개 미만 또는 2개 미만의 상이한 라벨로 라벨링된다. 일부 구체예에서, 복수의 상이한 시드 핵산은 20개, 18개, 16개, 14개, 12개, 10개, 8개, 6개, 4개, 또는 2개의 상이한 라벨로 라벨링된다. 일부 구체예에서, 복수의 상이한 시드 핵산은 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 80개 이상, 90개 이상, 100개 이상, 150개 이상, 200개 이상, 250개 이상, 300개 이상, 400개 이상, 500개 이상, 600개 이상, 700개 이상, 800개 이상, 900개 이상, 또는 1,000개 이상 상이한 라벨로 라벨링된다. 일부 구체예에서, 상이한 라벨은 상이한 핵산 서열을 갖는 상이한 프라이머이다. 일부 구체예에서, 초기 라벨링 단계는 복수의 상이한 시드 핵산에 복수의 상이한 프라이머를 라이게이션시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 시드 핵산의 각각의 시드 핵산은 독특한 라벨로 라벨링된다. 일부 구체예에서, 복수의 시드 핵산의 둘 이상의 상이한 시드 핵산은 동일한 라벨로 라벨링된다(예를 들어, 도 21 참조; 라벨로서 SBS3).
일부 구체예에서, 트리거 분자는 트리거 영역을 포함하는 핵산이다. 일부 구체예에서, 트리거 영역은 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 트리거 영역은 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 유니버셜 캡쳐 영역은 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 또는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 트리거 분자는 가용성 핵산이다. 일부 구체예에서, 트리거 분자는 고정된 캡쳐 프라이머이다. 일부 구체예에서, 고정된 캡쳐 프라이머는 복수의 고정된 캡쳐 프라이머이다. 일부 구체예에서, 복수의 고정된 캡쳐 프라이머는 복수의 상이한 캡쳐 프라이머이다. 일부 구체예에서, 복수의 고정된 캡쳐 프라이머는 복수의 동일한 캡쳐 프라이머이다. 일부 구체예에서, 고정된 캡쳐 프라이머는 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 고정된 캡쳐 프라이머는 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 유니버셜 캡쳐 영역은 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 또는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 복수의 상이한 고정된 확장 생성물의 하나의 고정된 확장 생성물을 활성화시키는 것은 확률적 활성화를 포함한다. 일부 구체예에서, 확률적 활성화는 복수의 고정된 캡쳐 프라이머를 갖는 기판과 헤어핀 구조를 갖는 복수의 상이한 시드 핵산을 접촉시켜 헤어핀 구조를 포함하는 복수의 상이한 고정된 시드 핵산을 생성시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 도 20을 참조한다. 일부 구체예에서, 확률적 활성화는 복수의 고정된 캡쳐 프라이머 중 2개 이상을 확장시켜 헤어핀 구조를 포함하는 복수의 상이한 고정된 확장 생성물을 생성시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 확률적 활성화는 헤어핀 구조를 포함하는 복수의 고정된 확장 생성물 중 하나를 분열 시약으로 활성화시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 분열 시약은 누클레아제이다. 일부 구체예에서, 누클레아제는 엔도누클레아제이다. 일부 구체예에서, 엔도누클레아제는 니킹 엔도누클레아제이다. 일부 구체예에서, 분열 시약은 USER™ 믹스(New England Biolabs, Ipswich, MA) 또는 Fpg-단백질(예를 들어, E. 콜리 유래)을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 상이한 시드 핵산의 하나 이상의 상이한 시드 핵산은 분열 가능한 염기를 포함한다. 일부 구체예에서, 분열 가능한 염기는 우라실 또는 8-옥소-구아닌(8-옥소-dG)이다.
일부 구체예에서, 복수의 상이한 시드 핵산은 트리거 영역을 포함하지 않고, 확률적 활성화는 트리거 영역을 포함하는 키메라 프라이머로 복수의 상이한 시드 핵산 중 하나를 증폭시키는 최초 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 복수의 상이한 시드 핵산 중 하나를 증폭시키는 최초 단계에서, 복수의 상이한 시드 핵산은 트리거 영역을 포함하는 키메라 프라이머에 비해 5배 초과, 10배 초과, 25배 초과, 50배 초과, 100배 초과, 250배 초과, 500배 초과, 1,000배 초과, 2,500배 초과, 5,000배 초과, 10,000배 초과, 25,000배 초과, 50,000배 초과, 또는 100,000배 초과의 과량으로 존재한다.
일부 구체예에서, 트리거 영역은 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 트리거 영역은 유니버셜 캡쳐 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 프라이머는 트리거 영역 및 SBS를 포함한다. 일부 구체예에서, 트리거 영역은 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 또는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하고, SBS는 Illumina® SBS3 프라이머 누클레오티드 서열 또는 Illumina® SBS8 프라이머 누클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 프라이머는 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS3 프라이머 누클레오티드 서열 또는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS8 프라이머 누클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 확률적 활성화는 a) 복수의 상이한 고정된 시드 핵산을 생성시키기 위한 혼성화에 충분한 조건하에서 복수의 고정된 캡쳐 프라이머를 갖는 기판과 복수의 상이한 시드 핵산을 접촉시키는 것을 포함하며, 상이한 시드 핵산 각각은 하나 이상의 개질된 누클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 확률적 활성화는 b) 2개 이상의 고정된 캡쳐 프라이머를 확장시켜 복수의 상이한 고정된 시드 핵산에 상보적인 복수의 상이한 고정된 확장 생성물을 생성시키는 것을 추가로 포함하며, 복수의 상이한 고정된 확장 생성물 각각은 하나 이상의 개질된 누클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 확률적 활성화는 c) 복수의 상이한 고정된 확장 생성물 중 하나를 활성화시켜 활성화된 캡쳐 프라이머를 형성시키는 것을 추가로 포함하며, 활성화된 캡쳐 프라이머는 개질된 누클레오티드를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 개질된 누클레오티드는 이소구아닌(isoG) 또는 이소시토신(isoC)을 포함한다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 개질된 누클레오티드를 이용한 확률적 활성화 방법은 확률적 활성화가 자연 발생 누클레오티드에 비해 핵산의 합성 동안 개질된 누클레오티드의 혼입의 상이한 훨씬 낮은 속도를 기초로 하는 조건하에서 수행될 수 있다. 확률적 활성화 방법은 개질된 누클레오티드의 농도를 조정함으로써 추가로 개질될 수 있다. 예를 들어, 성장하는 핵산 가닥으로의 개질된 누클레오티드의 혼입 속도는 합성 반응에서 개질된 누클레오티드의 농도를 낮춤으로써 추가로 감소될 수 있다.
일부 구체예에서, 확률적 활성화는 블로킹 작용제를 포함하는 복수의 상이한 고정된 시드 핵산을 생성시키기 위한 혼성화에 충분한 조건하에서 복수의 고정된 캡쳐 프라이머를 갖는 기판과 시드 핵산 각각의 한 말단에 결합된 블로킹 시약을 포함하는 복수의 상이한 시드 핵산을 접촉시키고, 블로킹 작용제와 탈블로킹(deblocking) 작용제를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 탈블로킹 작용제는 프로테아제(예를 들어, 프로테이나제 K)이다. 일부 구체예에서, 탈블로킹 작용제는 세제 또는 무질서유발제(예를 들어, DNA 또는 단백질 변성제)를 포함한다. 일부 구체예에서, 블로킹 작용제는 핵산 결합 단백질이다. 일부 구체예에서, 블로킹 작용제는 비드(예를 들어, 스트렙타비딘 또는 항-DIG 코팅된 비드, 또는 아가로스 또는 중합체 비드)이다. 일부 구체예에서, 블로킹 작용제는 바이러스 입자, 예를 들어, 박테리오파지, 수용체-공수용체 쌍, 또는 소수성 분자와 소수성 입자의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 블로킹 작용제는 비오티닐화된 누클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 블로킹 작용제는 스트렙타비딘을 포함한다.
일부 구체예에서, 고정된 개질된 캡쳐 프라이머의 모노클론 클러스터를 생성시키기 위해 활성화된 캡쳐 프라이머를 증폭시키는 것은 KEA 또는 브릿지 증폭을 포함한다. 일부 구체예에서, 고정된 개질된 캡쳐 프라이머의 모노클론 클러스터를 생성시키기 위해 활성화된 캡쳐 프라이머를 증폭시키는 것은 와일드파이어(wildfire) 프로토콜(예를 들어, 와일드파이어 쌍 말단 시퀀싱) 또는 롤링 서클 증폭을 이용한 DNA 합성을 포함한다.
일부 구체예에서, 표면은 복수의 웰을 포함하는 패턴화된 흐름 셀이다. 일부 구체예에서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰에 상이한 고정된 확장 생성물이 형성된다. 일부 구체예에서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰 각각에 활성화된 캡쳐 프라이머가 형성된다. 일부 구체예에서, 활성화된 캡쳐 프라이머는 복수의 웰의 웰의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 각각에서 형성된다. 일부 구체예에서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰 각각에 형성된 활성화된 캡쳐 프라이머는 웰의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 내의 상이한 활성화된 캡쳐 프라이머이다. 일부 구체예에서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰 각각에서 고정된 개질된 캡쳐 프라이머의 모노클론 클러스터가 형성된다. 일부 구체예에서, 고정된 개질된 캡쳐 프라이머의 모노클론 클러스터는 복수의 웰의 웰의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 각각에서 형성된다. 일부 구체예에서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰 각각에서 형성된 고정된 개질된 캡쳐 프라이머의 모노클론 클러스터는 웰의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 내의 고정된 개질된 캡쳐 프라이머의 상이한 모노클론 클러스터이다.
본원에 기재된 방법은 다양한 핵산 시퀀싱 기술과 함께 사용될 수 있다. 특히 적용 가능한 기술은 핵산이 어레이 내의 고정된 위치에 부착되어 이들의 상대 위치가 변하지 않고, 어레이가 반복적으로 이미지화되는 기술이다. 예를 들어, 하나의 누클레오티드 염기 타입을 다른 것과 구별하기 위해 사용되는 상이한 라벨과 일치하는 상이한 색 채널에서 이미지가 획득되는 구체예가 특히 적용 가능하다. 일부 구체예에서, 타겟 핵산의 누클레오티드 서열을 결정하기 위한 방법은 자동화된 방법일 수 있다. 바람직한 구체예는 합성에 의한 시퀀싱(sequencing-by-synthesis; "SBS") 기술을 포함한다.
SBS 기술은 주형 가닥에 대한 누클레오티드의 반복 첨가를 통한 초기 핵산 가닥의 효소적 확장을 포함할 수 있다. 당 분야에 공지된 SBS 방법에서, 단일 누클레오티드 모노머가 각각의 전달에서 중합효소의 존재하에서 타겟 누클레오티드에 제공될 수 있다. 그러나, 본원에 기재된 방법에서, 하나 이상의 타입의 누클레오티드 모노머가 전달에서 중합효소의 존재하에서 타겟 핵산에 제공될 수 있다.
SBS는 터미네이터 모이어티를 갖는 누클레오티드 모노머 또는 임의의 터미네이터 모이어티가 결여된 누클레오티드 모노머를 이용할 수 있다. 터미네이터가 결여된 누클레오티드 모노머를 이용하는 방법은, 예를 들어, 하기에 추가로 상세히 기재되는 바와 같은 γ-포스페이트-라벨링된 누클레오티드를 이용한 파이로시퀀싱 및 시퀀싱을 포함한다. 터미네이터가 결여된 누클레오티드 모노머를 이용한 방법에서, 각각의 사이클에 첨가되는 누클레오티드의 수는 가변적일 수 있고, 주형 서열 및 누클레오티드 전달 방식에 의존될 수 있다. 터미네이터 모이어티를 갖는 누클레오티드 모노머를 이용하는 SBS 기술에 대해, 터미네이터는 디데옥시누클레오티드를 이용하는 생거 시퀀싱의 경우와 같이 이용되는 시퀀싱 조건하에서 효과적으로 비가역적일 수 있거나, 터미네이터는 Solexa(현재 Illumina, Inc.)에 의해 개발된 시퀀신 방법의 경우와 같이 가역적일 수 있다.
SBS 기술은 라벨 모이어티를 갖는 누클레오티드 모노머 또는 라벨 모이어티가 결여된 누클레오티드 모노머를 이용할 수 있다. 따라서, 혼입 사건은 라벨의 특징, 예를 들어, 라벨의 형광; 누클레오티드 모노머의 특징, 예를 들어, 분자량 또는 전하; 누클레오티드의 혼입의 부산물, 예를 들어, 파이로포스페이트의 방출 등을 기초로 하여 검출될 수 있다. 구체예에서, 둘 이상의 상이한 누클레오티드가 시퀀싱 시약에 존재하는 경우, 상이한 누클레오티드는 서로 구별될 수 있거나, 대안적으로 둘 이상의 상이한 라벨은 이용되는 검출 기술하에서 구별될 수 없다. 예를 들어, 시퀀싱 시약에 존재하는 상이한 누클레오티드는 상이한 라벨을 가질 수 있고, 이들은 Solexa(현재 Illumina, Inc.)에 의해 개발된 시퀀싱 방법에 의해 예시된 바와 같이 적절한 광학을 이용하여 구별될 수 있다.
바람직한 구체예는 파이로시퀀싱 기술을 포함한다. 파이로시퀀싱은 특정 누클레오티드가 초기 가닥에 혼입됨에 따라 무기 파이로포스페이트(PPi)의 방출을 검출한다(Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M. and Nyren, P. (1996) "Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release." Analytical Biochemistry 242(1), 84-9; Ronaghi, M. (2001) "Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing." Genome Res. 11(1), 3-11; Ronaghi, M., Uhlen, M. and Nyren, P. (1998) "A sequencing method based on real-time pyrophosphate." Science 281(5375), 363; U.S. Pat. No. 6,210,891; U.S. Pat. No. 6,258,568 및 U.S. Pat. No. 6,274,320, 이들의 전체내용은 참조로서 본원에 포함됨). 파이로시퀀싱에서, 방출된 PPi는 ATP 설푸릴라제에 의해 아데노신 트리포스페이트(ATP)로 즉시 전환됨에 따라 검출될 수 있고, 생성된 ATP의 수준은 루시페라제-생성된 광자를 통해 검출된다. 시퀀싱되는 핵산은 어레이 내의 특징부에 부착될 수 있고, 어레이는 어레이의 특징부에서 누클레오티드의 혼입으로 인해 생성되는 화학발광 신호를 포착하기 위해 이미지화될 수 있다. 이미지는 어레이가 특정 누클레오티드 타입(예를 들어, A, T, C 또는 G)로 처리된 후에 획득될 수 있다. 각각의 누클레오티드 타입의 첨가 후에 획득된 이미지는 어레이에서 어떠한 특징부가 검출되는지에 따라 상이할 것이다. 이들 이미지에서의 차이는 어레이 상의 특징부의 상이한 서열 함량을 반영한다. 그러나, 각각의 특징부의 상대 위치는 이미지에서 변하지 않은 채로 남아 있을 것이다. 이미지는 본원에 기재된 방법을 이용하여 저장되고, 처리되고, 분석될 수 있다. 예를 들어, 각각의 상이한 누클레오티드 타입을 이용한 어레이의 처리 후에 획득된 이미지는 가역적 터미네이터-기반 시퀀싱 방법을 위한 상이한 검출 채널로부터 획득된 이미지에 대해 본원에 예시된 것과 동일한 방식으로 처리될 수 있다.
또 다른 예시적 타입의 SBS에서, 사이클 시퀀싱은, 예를 들어, 개시내용이 참조로서 본원에 포함되는 WO 04/018497호 및 미국 특허 번호 7,057,026호에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 분열 가능하거나 광표백 가능한 염료 라벨을 함유하는 가역성 터미네이터 누클레오티드의 단계적 첨가에 의해 달성된다. 이러한 접근법은 Solexa(현재, Illumina Inc.)에 의해 상용화되어 있으며, 이는 또한 각각 참조로서 본원에 포함되는 WO 91/06678호 및 WO 07/123,744호에 기재되어 있다. 종결이 역전될 수 있고, 형광 라벨이 분열될 수 있는 형광-라벨링된 터미네이터의 이용가능성은 효율적인 순환 가역 종결(CRT) 시퀀싱을 촉진한다. 중합효소는 또한 이들 개질된 누클레오티드로부터 효율적으로 혼입되고 확장되도록 공동 공학처리될 수 있다.
바람직하게는, 가역적 터미네이터-기반 시퀀싱 구체예에서, 라벨은 SBS 반응 조건하에서 확장을 실질적으로 억제하지 않는다. 그러나, 검출 라벨은, 예를 들어, 분열 또는 분해에 의해 제거될 수 있다. 이미지는 어레이된 핵산 특징부로의 라벨의 혼입 후에 포착될 수 있다. 특정 구체예에서, 각각의 사이클은 어레이로의 4개의 상이한 누클레오티드 타입의 동시 전달을 포함하고, 각각의 누클레오티드 타입은 스펙트럼적으로 별개의 라벨을 갖는다. 4개의 상이한 라벨 중 하나에 대해 선택적인 검출 채널을 각각 이용하여 4개의 이미지가 이후 획득될 수 있다. 대안적으로, 상이한 누클레오티드 타입이 순차적으로 첨가될 수 있고, 어레이의 이미지가 각각의 첨가 단계 사이에 획득될 수 있다. 이러한 구체예에서, 각각의 이미지는 특정 타입의 혼입된 누클레오티드를 갖는 핵산 특징부를 나타낼 것이다. 각각의 특징부의 상이한 서열 함량으로 인해 상이한 이미지에 상이한 특징부가 존재하거나 부재할 것이다. 그러나, 특징부의 상대 위치는 이미지에서 변하지 않은 채로 남아 있을 것이다. 상기 가역성 터미네이터-SBS 방법으로부터 획득된 이미지는 본원에 기재된 바와 같이 저장되고, 처리되고, 분석될 수 있다. 이미지 포착 단계 후, 라벨은 제거될 수 있고, 가역성 터미네이터 모이어티는 누클레오티드 첨가 및 검출의 후속 사이클을 위해 제거될 수 있다. 라벨이 특정 사이클에서 검출된 후 및 이후 사이클 전의 라벨의 제거는 백그라운드 신호 및 사이클 사이의 누화(crosstalk)를 감소시키는 장점을 제공할 수 있다. 유용한 라벨 및 제거 방법의 예는 하기에 기재된다.
특정 구체예에서, 누클레오티드 모노머의 일부 또는 전부는 가역성 터미네이터를 포함할 수 있다. 상기 구체예에서, 가역성 터미네이터/분열 가능한 형광체는 3' 에스테르 결합을 통해 리보스 모이어티에 연결된 형광체를 포함할 수 있다(Metzker, Genome Res. 15:1767-1776 (2005), 참조로서 본원에 포함됨). 다른 접근법은 형광 라벨의 분열로부터 터미네이터 화학을 분리시켰다(Ruparel et al., Proc Natl Acad Sci USA 102: 5932-7 (2005), 전체내용이 참조로서 본원에 포함됨). 루파렐 등(Ruparel et al)은 확장을 막기 위해 작은 3' 알릴기를 사용하나, 팔라듐 촉매를 이용한 짧은 처리에 의해 용이하게 탈블로킹될 수 있는 가역성 터미네이터의 개발을 기재하였다. 형광체는 장파장 UV 광에 대한 30초 노출에 의해 용이하게 분열될 수 있는 광분열성 링커를 통해 염기에 부착되었다. 따라서, 디설파이드 환원 또는 광분열이 분열 가능한 링커로서 이용될 수 있다. 가역성 종료에 대한 또 다른 접근법은 dNTP 상의 부피가 큰 염료의 배치 후에 발생하는 자연 종결의 이용이다. dNTP 상의 하전된 부피가 큰 염료의 존재는 입체 장애 및/또는 정전기적 장애를 통해 효과적인 터미네이터로서 작용할 수 있다. 하나의 혼입 사건의 존재는 염료가 제거되지 않는 한 추가 혼입을 방지한다. 염료의 분열은 형광체를 제거하고, 종료를 효과적으로 역전시킨다. 개질된 누클레오티드의 예는 또한 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 7,427,673호, 및 미국 특허 번호 7,057,026호에 기재되어 있다.
본원에 기재된 방법 및 시스템과 함께 이용될 수 있는 추가의 예시적인 SBS 시스템 및 방법은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 출원 공개 번호 2007/0166705호, 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0188901호, 미국 특허 번호 7,057,026호, 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0240439호, 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0281109호, PCT 공개 번호 WO 05/065814호, 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0100900호, PCT 공개 번호 WO 06/064199호, PCT 공개 번호 WO 07/010,251호, 미국 특허 출원 공개 번호 2012/0270305호 및 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0260372호에 기재되어 있다.
일부 구체예는 4개 미만의 상이한 라벨을 이용한 4개의 상이한 누클레오티드의 검출을 이용할 수 있다. 예를 들어, SBS는 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0079232호의 혼입된 물질에 기재된 방법 및 시스템을 이용하여 수행될 수 있다. 첫번째 예로서, 한쌍의 누클레오티드 타입은 동일한 파장에서 검출될 수 있으나, 상기 쌍의 다른 일원에 비한 상기 쌍의 한 일원에 대한 강도에서의 차이, 또는 상기 쌍의 다른 일원에 대해 검출된 신호에 비해 명백한 신호가 나타나거나 사라지게 하는 상기 쌍의 한 일원에 대한 변화(예를 들어, 화학적 개질, 광화학적 개질 또는 물리적 개질을 통함)를 기초로 하여 구별될 수 있다. 두번째 예로서, 4개의 상이한 누클레오티드 타입 중 3개는 특정 조건하에서 검출될 수 있는 반면, 네번째 누클레오티드 타입은 상기 조건하에서 검출가능한 라벨이 결여되거나, 상기 조건하에서 최소로 검출(예를 들어, 백그라운드 형광 등으로 인한 최소 검출)된다. 핵산으로의 처음 3개의 누클레오티드 타입의 혼입은 이들 각각의 신호의 존재를 기초로 하여 결정될 수 있고, 핵산으로의 네번째 누클레오티드 타입의 혼입은 임의의 신호의 부재 또는 최소 검출을 기초로 하여 결정될 수 있다. 세번째 예로서, 하나의 누클레오티드 타입은 2개의 상이한 채널에서 검출되는 라벨(들)을 포함할 수 있는 반면, 다른 누클레오티드 타입은 하나 이하의 채널에서 검출된다. 상기 언급된 3개의 예시적 구성은 상호 배타적인 것으로 간주되지 않으며, 다양한 조합으로 이용될 수 있다. 3개 모두의 예를 조합시키는 예시적 구체예는 첫번째 채널에서 검출되는 첫번째 누클레오티드 타입(예를 들어, 첫번째 여기 파장에 의해 여기되는 경우 첫번째 채널에서 검출되는 라벨을 갖는 dATP), 두번째 채널에서 검출되는 두번째 누클레오티드 타입(예를 들어, 두번째 여기 파장에 의해 여기되는 경우 두번째 채널에서 검출되는 라벨을 갖는 dCTP), 첫번째 및 두번째 채널 둘 모두에서 검출되는 세번째 누클레오티드 타입(예를 들어, 첫번째 및/또는 두번째 여기 파장에 의해 여기되는 경우 둘 모두의 채널에서 검출되는 적어도 하나의 라벨을 갖는 dTTP) 및 어느 채널에서도 검출되지 않거나 최소로 검출되는 라벨이 결여된 네번째 누클레오티드 타입(예를 들어, 라벨을 갖지 않는 dGTP)을 이용하는 형광-기반 SBS 방법이다.
추가로, 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0079232호의 혼입된 물질에 기재된 바와 같이, 시퀀싱 데이터는 단일 채널을 이용하여 획득될 수 있다. 이러한 소위 1-염료 시퀀싱 접근법에서, 첫번째 누클레오티드 타입은 라벨링되나, 라벨은 첫번째 이미지가 생성된 후에 제거되고, 두번째 누클레오티드 타입은 첫번째 이미지가 생성된 후에만 라벨링된다. 세번째 누클레오티드 타입은 첫번째 및 두번째 이미지 둘 모두에서 이의 라벨을 보유하며, 네번째 누클레오티드 타입은 둘 모두의 이미지에서 라벨링되지 않은 채로 유지된다.
일부 구체예는 라이게이션 기술에 의한 시퀀싱을 이용할 수 있다. 상기 기술은 올리고누클레오티드를 혼입시키고, 상기 올리고누클레오티드의 혼입을 확인하기 위해 DNA 리가제를 이용한다. 올리고누클레오티드는 올리고누클레오티드가 혼성화되는 서열 내의 특정 누클레오티드의 정체와 연관된 상이한 라벨을 가질 수 있다. 다른 SBS 방법에서와 같이, 이미지는 라벨링된 시퀀싱 시약을 이용한 핵산 특징부 어레이의 처리 후에 획득될 수 있다. 각각의 이미지는 특정 타입의 라벨이 혼입된 핵산 특징부를 나타낼 것이다. 상이한 특징부는 각각의 특징부의 상이한 서열 함량으로 인해 상이한 이미지에서 존재하거나 부재할 것이나, 특징부의 상대 위치는 이미지에서 변하지 않은 채로 남아 있을 것이다. 라이게이션-기반 시퀀싱 방법으로부터 획득된 이미지는 본원에 기재된 바와 같이 저장되고, 처리되고, 분석될 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 시스템과 함께 이용될 수 있는 예시적 SBS 시스템 및 방법은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 6,969,488호, 미국 특허 번호 6,172,218호, 및 미국 특허 번호 6,306,597호에 기재되어 있다.
일부 구체예는 나노포어 시퀀싱을 이용할 수 있다(Deamer, D. W. & Akeson, M. "Nanopores and nucleic acids: prospects for ultrarapid sequencing." Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000); Deamer, D. and D. Branton, "Characterization of nucleic acids by nanopore analysis". Acc. Chem. Res. 35:817-825 (2002); Li, J., M. Gershow, D. Stein, E. Brandin, and J. A. Golovchenko, "DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope" Nat. Mater. 2:611-615 (2003), 전체내용이 참조로서 본원에 포함됨). 상기 구체예에서, 타겟 핵산은 나노포어를 통해 통과한다. 나노포어는 합성 포어 또는 생물학적 막 단백질, 예를 들어, α-용혈소일 수 있다. 타겟 핵산이 나노포어를 통해 통과함에 따라, 각각의 염기쌍은 포어의 전기 전도도에서의 변동을 측정함으로써 확인될 수 있다(U.S. Pat. No. 7,001,792; Soni, G. V. & Meller, "A. Progress toward ultrafast DNA sequencing using solid-state nanopores." Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007); Healy, K. "Nanopore-based single-molecule DNA analysis." Nanomed. 2, 459-481 (2007); Cockroft, S. L., Chu, J., Amorin, M. & Ghadiri, M. R. "A single-molecule nanopore device detects DNA polymerase activity with single-nucleotide resolution." J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008), 전체내용이 참조로서 본원에 포함됨). 나노포어 시퀀싱으로부터 획득된 데이터는 본원에 기재된 바와 같이 저장되고, 처리되고, 분석될 수 있다. 특히, 데이터는 광학 이미지 및 본원에 기재되는 다른 이미지의 예시적 처리에 따라 이미지로서 처리될 수 있다.
일부 구체예는 DNA 중합효소 활성의 실시간 모니터링을 포함하는 방법을 이용할 수 있다. 누클레오티드 혼입은, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,329,492호 및 미국 특허 번호 7,211,414호(이들 각각은 참조로서 본원에 포함됨)에 기재된 바와 같이 형광체-함유 중합효소와 γ-포스페이트-라벨링된 누클레오티드 사이의 형광 공명 에너지 전달(FRET) 상호작용을 통해 검출될 수 있거나, 누클레오티드 혼입은, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,315,019호(참조로서 본원에 포함됨)에 기재된 바와 같고, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,405,281호 및 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0108082호(이들 각각은 참조로서 본원에 포함됨)에 기재된 바와 같이 형광 누클레오티드 유사체 및 공학처리된 중합효소를 이용하는 제로-모드 도파관으로 검출될 수 있다. 조명은 형광 라벨링된 누클레오티드의 혼입이 낮은 백그라운드로 관찰될 수 있도록 표면-결합 중합효소 주위의 제토리터(zeptoliter)-규모의 부피로 제한될 수 있다(Levene, M. J. et al. "Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations." Science 299, 682-686 (2003); Lundquist, P. M. et al. "Parallel confocal detection of single molecules in real time." Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008); Korlach, J. et al. "Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nano structures." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008), 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 포함됨). 상기 방법으로부터 획득된 이미지는 본원에 기재된 바와 같이 저장되고, 처리되고, 분석될 수 있다.
일부 SBS 구체예는 확장 생성물로의 누클레오티드의 혼입시에 방출되는 양성자의 검출을 포함한다. 예를 들어, 방출된 양성자의 검출을 기초로 하는 시퀀싱은 Ion Torrent(Guilford, CT, Life Technologies 자회사)로부터 상업적으로 이용 가능한 전기 검출기 및 관련 기술 또는 각각이 참조로서 본원에 포함되는 US 2009/0026082 A1호; US 2009/0127589 A1호; US 2010/0137143 A1호; 또는 US 2010/0282617 A1호에 기재된 시퀀싱 방법 및 시스템을 이용할 수 있다. 역학 배제(kinetic exclusion)를 이용하여 타겟 핵산을 증폭시키기 위한 본원에 기재된 방법은 양성자를 검출하는데 사용되는 기판에 용이하게 적용될 수 있다. 더욱 특히, 본원에 기재된 방법은 양성자를 검출하는데 사용되는 앰플리콘의 클론 집단을 생성시키기 위해 사용될 수 있다.
상기 SBS 방법은 다수의 상이한 타겟 핵산이 동시에 조작되도록 다중 포맷으로 유리하게 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 상이한 타겟 핵산은 공통의 반응 용기 또는 특정 기판의 표면에서 처리될 수 있다. 이는 시퀀싱 시약의 편리한 전달, 미반응된 시약의 제거 및 다중 방식의 혼입 사건의 검출을 가능케 한다. 표면 결합된 타겟 핵산을 이용하는 구체예에서, 타겟 핵산은 어레이 포맷일 수 있다. 어레이 포맷에서, 타겟 핵산은 공간적으로 구별 가능한 방식으로 표면에 결합될 수 있다. 타겟 핵산은 직접적인 공유적 부착, 비드 또는 다른 입자로의 부착 또는 중합효소 또는 표면에 부착되는 다른 분자에 대한 결합에 의해 결합될 수 있다. 어레이는 각각의 부위(특징부로도 언급됨)에서 타겟 핵산의 하나의 카피를 포함할 수 있거나, 동일한 서열을 갖는 다수의 카피가 각각의 부위 또는 특징부에 존재할 수 있다. 증폭 방법, 예를 들어, 하기에 추가로 상세히 기재되는 바와 같은 에멀젼 PCR 또는 브릿지 증폭에 의해 다수의 카피가 생성될 수 있다.
본원에 기재된 방법은, 예를 들어, 적어도 약 10 특징부/cm2, 100 특징부/cm2, 500 특징부/cm2, 1,000 특징부/cm2, 5,000 특징부/cm2, 10,000 특징부/cm2, 50,000 특징부/cm2, 100,000 특징부/cm2, 1,000,000 특징부/cm2, 5,000,000 특징부/cm2, 또는 그 초과를 포함하는 다양한 밀도 중 임의의 밀도의 특징부를 갖는 어레이를 이용할 수 있다.
본원에 기재된 방법의 장점은 이들이 동시에 복수의 타겟 핵산의 신속하고 효율적인 검출을 제공한다는 점이다. 따라서, 본 발명의 개시는 상기 예시된 것과 같은 당 분야에 공지된 기술을 이용하여 핵산을 제조하고 검출할 수 있는 통합 시스템을 제공한다. 따라서, 본 발명의 개시의 통합 시스템은 증폭 시약 및/또는 시퀀싱 시약을 하나 이상의 고정된 DNA 단편에 전달할 수 있는 유체 성분을 포함할 수 있으며, 상기 시스템은 펌프, 밸브, 저장소, 유체 라인 등과 같은 구성요소를 포함한다. 흐름 셀이 타겟 핵산의 검출을 위한 통합 시스템에서 구성되고/되거나 사용될 수 있다. 예시적 흐름 셀은, 예를 들어, 각각이 참조로서 본원에 포함되는 US 2010/0111768 A1호 및 미국 일련 번호 13/273,666호에 기재되어 있다. 흐름 셀에 대해 예시된 바와 같이, 통합 시스템의 유체 구성요소 중 하나 이상이 증폭 방법 및 검출 방법에 사용될 수 있다. 예로서 핵산 시퀀싱 구체예를 취하면, 통합 시스템의 유체 구성요소 중 하나 이상은 본원에 기재된 증폭 방법 및 상기 예시된 것과 같은 시퀀싱 방법에서의 시퀀싱 시약의 전달에 사용될 수 있다. 대안적으로, 통합 시스템은 증폭 방법을 수행하고, 검출 방법을 수행하기 위한 별개의 유체 시스템을 포함할 수 있다. 증폭된 핵산을 생성시킬 수 있고, 또한 핵산의 서열을 결정할 수 있는 통합 시퀀싱 시스템의 예는, 비제한적인 예로, MiSeq™ 플랫폼(Illumina, Inc., San Diego, CA) 및 참조로서 본원에 포함되는 미국 일련 번호 13/273,666호에 기재된 장치를 포함한다.
본 발명의 개시는 추가로 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키기 위한 키트에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 키트는 a) 본원에 제공된 주형 핵산, 및 b) 둘 이상의 웰을 갖는 패턴화된 흐름 셀을 포함하며, 둘 이상의 웰은 한 쌍의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 갖는다. 일부 구체예에서, 키트는 추가로 제한 효소를 포함한다. 일부 구체예에서, 제한 효소는 SapI이다. 일부 구체예에서, 키트는 고정된 캡쳐 프라이머의 개질을 위해 키트의 구성요소를 이용하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 키트를 시험하는데 사용하기 위한 하나 이상의 대조 분석 혼합물, 예를 들어, 2개 이상의 대조 분석물을 추가로 포함한다.
상기 기재로부터, 다양한 용도 및 조건에 적합화시키기 위해 본원에 기재된 발명에 대한 변화 및 변형이 이루어질 수 있음이 명백할 것이다. 상기 구체예는 또한 하기 청구항의 범위 내이다.
본원의 변수의 임의의 정의에서의 요소의 목록의 언급은 나열된 요소의 임의의 단일한 요소 또는 조합(또는 하위조합)으로서의 상기 변수의 정의를 포함한다. 본원의 구체예의 언급은 임의의 하나의 구체예로서의 구체예 또는 임의의 다른 구체예 또는 이의 일부와 조합된 구체예를 포함한다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 각각의 독립적 특허 및 간행물이 특별히 및 개별적으로 참조로서 포함되는 것으로 지정되는 것과 동일한 정도로 참조로서 본원에 포함된다.
하기 실시예는 제한이 아닌 예시로서 제공된다.
실시예
실시예 1: 이중층 프라이머 그래프팅
본 실시예는 제1 층 및 제2 층의 패턴화된 흐름 셀로의 침적 및 제1 프라이머의 제1 층으로의 침적 및 제2 프라이머의 제2 흐름 셀로의 침적을 포함하는 실험을 기재한다.
제1 층(PAZAM)을 실질적으로 미국 특허 공개 번호 US 2014/0079923 A1호 및 US 2013/0096034 A1호에 기재된 바와 같이 700nm 이격된 400nm 웰을 갖는 패턴화된 흐름 셀에 코팅시켰다. 연마 후, 제1 캡쳐 프라이머를 제1 층에 침적시켰고, 제1 프라이머는 Illumina® P5 프라이머 서열 및 Illumina® SBS3 프라이머 서열을 포함하였다. 테트라-클로로-플루오레세인 라벨링된 올리고누클레오티드를 이용한 혼성화("TET-올리고 혼성화")는 직사각형 패턴을 나타내었고, 이는 P5-SBS3 프라이머가 나노웰 내부에 특이적으로 침적된 것을 나타낸다. 또한 도 5(상부 패널)를 참조한다.
제2 층(SFA)을 나노웰 내의 제1 층 및 웰 주의의 흐름 셀의 표면 상에 코팅시켰다. TET-올리고 혼성화는 직사각형 패턴을 나타내었고, 이는 제1 층 내의 제1 캡쳐 프라이머가 여전히 존재하고, 제2 층 침적 후에 기능적임을 나타낸다. 또한 도 5(중앙 패널)를 참조한다.
Illumina® 캡쳐 프라이머 쌍 P5 및 P7 형태의 제2 프라이머를 제2 층에 침적시켰다. TET-올리고 혼성화는 제2 프라이머가 웰 뿐만 아니라 웰 주의의 표면을 포함하는 제2 층 전체에 걸쳐 성공적으로 침적된 것을 나타내었다.
이러한 실험은 패턴화된 흐름 셀이 상이한 캡쳐 프라이머를 포함하는 적어도 2개의 층으로 코팅될 수 있음을 나타낸다. 제1 캡쳐 프라이머를 패턴화된 흐름 셀의 웰 내의 제1 층에 침적시켰다. 제2 캡쳐 프라이머를 웰 주위의 표면 상의 제2 층에 침적시켰다. 제1 및 제2 프라이머를 특정한 올리고누클레오티드 프로브와 혼성화시켰다.
실시예 2: 타겟 핵산 증폭의 확률적 활성화
본 실시예는 트리거 서열 및 트리거 서열이 결여된 타겟 핵산과 조합된 타겟 핵산 특이적 서열을 포함하는 KEA에서 키메라 프라이머를 이용한 타겟 핵산의 확률적 활성화를 포함하는 실험을 기재한다. 본 실시예에서, 트리거 서열로서 Illumina 유니버셜 캡쳐 프라이머 서열 P5를 사용하였고, 타겟 핵산 특이적 서열로서 Illumina SBS3 서열(P5/SBS3)을 사용하였다.
실험 계획은 표 1에 제시되어 있다. 예시적 결과가 도 21에 제시되어 있다.
Figure pct00001
무작위 P5/P7 표면 흐름 셀을 레인 1 내지 5에서 SBS3에서 종결되나, P5 서열이 결여된 주형 핵산으로 시딩하였다. 레인 6 내지 8에는 주형 핵산을 시딩하지 않았다. KEA를 P5/SBS3 키메라 프라이머의 존재 또는 부재하에서 수행하였다. 클러스터 형성이 KEA에서 P5/SBS3 키메라 프라이머를 포함한 레인(레인 2-4)에서 관찰되었으나, KEA에서 P5/SBS3 키메라 프라이머를 포함하지 않거나(레인 1), 주형 핵산을 포함하지 않은(레인 6-8) 레인에서는 관찰되지 않았다. 레인 5에서, P5/SBS3 프라이머의 낮은 농도로 인해 클러스터가 관찰되지 않았다.
본 실험은 모노클론 클러스터가 주형 핵산의 확률적 활성화를 포함하는 본원에 제공된 방법을 이용하여 생성될 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 개시는 개시된 구체예를 참조로 하여 기재되었으나, 당업자는 상기 상술된 특정 실시예 및 연구가 단지 본 발명의 개시의 예시임을 즉시 인지할 것이다. 본 발명의 개시로부터 벗어남이 없이 다양한 변형이 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명의 개시는 하기 청구항에 의해서만 제한된다.
SEQUENCE LISTING <110> ILLUMINA, Inc. et al. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING <130> 103949PC <140> To be assigned <141> on even date herewith <150> US 62/078,346 <151> 2014-11-11 <150> US 62/096,464 <151> 2014-12-23 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal Illumina capture primer P5 <400> 1 aatgatacgg cgaccaccga 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal Illumina capture primer P7 <400> 2 caagcagaag acggcatacg a 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal Illumina capture primer anti-P5 <400> 3 tcggtggtcg ccgtatcatt 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal Illumina capture primer anti-P7 <400> 4 tcgtatgccg tcttctgctt g 21 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Illumina sequencing primer SBS3 <400> 5 acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Illumina sequencing primer SBS8 <400> 6 cggtctcggc attcctgctg aaccgctctt ccgatct 37 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Illumina sequencing primer anti-SBS3 <400> 7 agatcggaag agcgtcgtgt agggaaagag tgt 33 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Illumina sequencing primer anti-SBS8 <400> 8 agatcggaag agcggttcag caggaatgcc gagaccg 37 <210> 9 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> restriction enzyme recognition site <220> <221> misc_feature <222> (8)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 9 gctcttcnnn n 11 <210> 10 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> restriction enzyme recognition site <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 10 nnnngaagac g 11

Claims (222)

  1. a) 하나 이상의 웰, 웰을 둘러싸는 표면 및 내부 웰 표면을 포함하는 기판;
    b) 내부 웰 표면을 덮고 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍(capture primer pair)을 포함하는 제1 층; 및
    c) 제1 층 및 웰을 둘러싸는 표면을 덮는 제2 층을 포함하는 마이크로어레이(microarray).
  2. 제1항에 있어서, 제1 층이 웰을 둘러싸는 표면을 덮지 않는 마이크로어레이.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1층이 내부 웰 표면을 일부 또는 전부 덮는 마이크로어레이.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 웰이 복수의 웰인 마이크로어레이.
  5. 제4항에 있어서, 복수의 웰이 약 700 nm의 피치(pitch)로 이격되어 있는 마이크로어레이.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 웰의 직경이 약 1 ㎛ 미만인 마이크로어레이.
  7. 제6항에 있어서, 웰의 직경이 약 30 nm 내지 약 900 nm인 마이크로어레이.
  8. 제7항에 있어서, 웰의 직경이 약 100 nm 내지 400 nm인 마이크로어레이.
  9. 제8항에 있어서, 웰의 직경이 약 400 nm인 마이크로어레이.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 층이 폴리머 코팅을 포함하는 마이크로어레이.
  11. 제10항에 있어서, 폴리머 코팅이 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸)아크릴아미드-코-아크릴아미드(PAZAM)를 포함하는 마이크로어레이.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 층이 폴리머 코팅을 포함하는 마이크로어레이.
  13. 제12항에 있어서, 폴리머 코팅이 PAZAM 또는 실란 유리 아크릴아미드(SFA)를 포함하는 마이크로어레이.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍이 복수의 제1 캡쳐 프라이머 쌍인 마이크로어레이.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머가 유니버셜 캡쳐 영역(universal capture region)을 포함하는 마이크로어레이.
  16. 제15항에 있어서, 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 프라이머가 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 프라이머가 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 마이크로어레이.
  17. 제16항에 있어서, 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머가 시퀀싱 프라이머 결합 사이트(sequencing primer binding site; SBS)를 추가로 포함하는 마이크로어레이.
  18. 제17항에 있어서, 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 프라이머가 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS3 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 프라이머가 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS8 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 마이크로어레이.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 층이 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 포함하는 마이크로어레이.
  20. 제19항에 있어서, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍이 복수의 제2 캡쳐 프라이머 쌍인 머아크로어레이.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머가 3'-단부에서 블로킹되어 있는 마이크로어레이.
  22. 제21항에 있어서, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머가 3'-포스페이트-종결되어 있는 마이크로어레이.
  23. 제22항에 있어서, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 3'-포스페이트 종결 프라이머가 유니버셜 캡쳐 영역을 포함하는 마이크로어레이.
  24. 제23항에 있어서, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 프라이머가 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 프라이머가 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 마이크로어레이.
  25. 제19항 또는 제20항에 있어서, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머가 3'-단부에서 블로킹되지 않은 마이크로어레이.
  26. 제25항에 있어서, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머가 유니버셜 캡쳐 영역을 포함하는 마이크로어레이.
  27. 제26항에 있어서, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 프라이머가 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 프라이머가 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 마이크로어레이.
  28. 제14항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 복수의 캡쳐 프라이머가 각각 타겟 폴리누클레오티드에 부착되어 있는 마이크로어레이.
  29. 제28항에 있어서, 복수의 타겟 폴리누클레오티드가 하나 이상의 웰에서 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단(monoclonal population)을 형성하는 마이크로어레이.
  30. 제29항에 있어서, 하나 이상의 웰이 복수의 웰을 포함하며, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰이 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함하는 마이크로어레이.
  31. 제30항에 있어서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰이 동일한 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함하는 마이크로어레이.
  32. 제30항에 있어서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰이 둘 이상의 상이한 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함하는 마이크로어레이.
  33. 제19항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍이 복수의 제1 캡쳐 프라이머 쌍이며, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍이 복수의 제2 캡쳐 프라이머 쌍이며, 복수의 제1 캡쳐 프라이머 쌍 및 복수의 제2 캡쳐 프라이머 쌍 중 복수의 프라이머가 복수의 타겟 폴리누클레오티드에 부착되어 있는 마이크로어레이.
  34. 제33항에 있어서, 복수의 타겟 폴리누클레오티드가 하나 이상의 웰에서 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 형성하는 마이크로어레이.
  35. 제34항에 있어서, 하나 이상의 웰이 복수의 웰이며, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰이 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함하는 마이크로어레이.
  36. 제35항에 있어서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰이 동일한 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함하는 마이크로어레이.
  37. 제35항에 있어서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰이 둘 이상의 상이한 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함하는 마이크로어레이.
  38. a) 하나 이상의 웰, 웰을 둘러싸는 표면 및 내부 웰 표면을 포함하는 기판; 및
    b) 내부 웰 표면을 덮고 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍 및 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 포함하는 층을 포함하는 마이크로어레이.
  39. 제38항에 있어서, 층이 웰을 둘러싸는 표면을 덮지 않는 마이크로어레이.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 층이 내부 웰 표면을 일부 또는 전부 덮는 마이크로어레이.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 웰의 직경이 약 1 ㎛ 이상인 마이크로어레이.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 웰이 복수의 웰인 마이크로어레이.
  43. 제42항에 있어서, 복수의 웰이 약 700 nm의 피치로 이격되어 있는 마이크로어레이.
  44. 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 층이 폴리머 코팅을 포함하는 마이크로어레이.
  45. 제44항에 있어서, 폴리머 코팅이 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸)아크릴아미드-코-아크릴아미드(PAZAM)를 포함하는 마이크로어레이.
  46. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍이 복수의 제1 캡쳐 프라이머 쌍인 마이크로어레이.
  47. 제38항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍이 복수의 제2 캡쳐 프라이머 쌍인 마이크로어레이.
  48. 제38항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머가 유니버셜 캡쳐 영역을 포함하는 마이크로어레이.
  49. 제48항에 있어서, 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 캡쳐 프라이머가 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 캡쳐 프라이머가 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 마이크로어레이.
  50. 제39항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머가 유니버셜 캡쳐 영역 및 SBS를 포함하는 마이크로어레이.
  51. 제50항에 있어서, 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 캡쳐 프라이머가 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 캡쳐 프라이머가 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 캡쳐 프라이머가 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS3 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 캡쳐 프라이머가 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS8 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 마이크로어레이.
  52. 제38항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍이 복수의 제1 캡쳐 프라이머 쌍이며, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍이 복수의 제2 캡쳐 프라이머 쌍이며, 복수의 제1 캡쳐 프라이머 쌍 및 복수의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 복수의 프라이머가 복수의 타겟 폴리누클레오티드에 부착되어 있는 마이크로어레이.
  53. 제52항에 있어서, 복수의 타겟 폴리누클레오티드가 하나 이상의 웰에서 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 형성하는 마이크로어레이.
  54. 제53항에 있어서, 하나 이상의 웰이 복수의 웰이며, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰이 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함하는 마이크로어레이.
  55. 제54항에 있어서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰 각각이 동일한 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함하는 마이크로어레이.
  56. 제54항에 있어서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰이 둘 이상의 상이한 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 포함하는 마이크로어레이.
  57. 핵산을 증폭시키는 방법으로서,
    a) 기판 상에 제1 층을 형성시키되, 기판이 하나 이상의 웰, 웰을 둘러싸는 표면, 및 내부 웰 표면을 포함하고 제1 층이 내부 웰 표면을 덮고;
    b) 제1 층에 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍을 침적시키고;
    c) 기판 상에 제2 층을 형성시켜 제1 층 및 웰을 둘러싸는 표면을 덮고;
    d) 타겟 폴리누클레오티드를 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 캡쳐 프라이머와 혼성화시키기에 충분한 조건 하에서 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 포함하는 샘플을 기판과 접촉시키고;
    e) 웰 내측에 타겟 폴리누클레오티드로부터의 앰플리콘(amplicon)의 클론 집단을 형성시키기 위해 제1 역학적 배제 검정(kinetic exclusion assay, KEA)을 수행하여, 이에 의해 타겟 폴리누클레오티드를 증폭시키는 것을 포함하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 포함하는 샘플이 웰 당 단일 타겟 폴리누클레오티드를 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 캡쳐 프라이머와 혼성화시키기에 충분한 조건 하에서 기판과 접촉되는 방법.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 제1 KEA가 하나 이상의 웰에서 캡쳐 프라이머와 혼성화된 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터 앰플리콘의 모노클로날 집단을 형성시키는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 하나 이상의 웰이 복수의 웰이며, 앰플리콘의 모노클로날 집단이 복수의 웰 중 둘 이상의 웰에서 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터 형성되는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 앰플리콘의 모노클로날 집단이 복수의 웰 중 둘 이상의 웰에서 동일한 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터 형성되는 방법.
  62. 제60항에 있어서, 앰플리콘의 모노클로날 집단이 복수의 웰 중 둘 이상의 웰에서 둘 이상의 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터 형성되는 방법.
  63. 제57항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 층이 웰을 둘러싸는 표면을 덮지 않는 방법.
  64. 제57항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 층이 내부 웰 표면을 일부 또는 전부 덮는 방법.
  65. 제57항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 웰의 직경이 약 1 ㎛ 미만인 방법.
  66. 제57항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 웰이 복수의 웰인 방법.
  67. 제57항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 층이 폴리머 코팅을 포함하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 폴리머 코팅이 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸)아크릴아미드-코-아크릴아미드(PAZAM)를 포함하는 방법.
  69. 제57항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 층이 폴리머 코팅을 포함하는 방법.
  70. 제69항에 있어서, 폴리머 코팅이 PAZAM 또는 SFA를 포함하는 방법.
  71. 제57항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍이 복수의 제1 캡쳐 프라이머 쌍인 방법.
  72. 제57항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 층에서 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 침적시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍이 복수의 제2 캡쳐 프라이머 쌍인 방법.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍이 제1 KEA를 수행하기 전에 침적되는 방법.
  75. 제57항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머가 유니버셜 캡쳐 영역을 포함하는 방법.
  76. 제75항에 있어서, 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제1 캡쳐 프라이머가 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 제2 캡쳐 프라이머가 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  77. 제57항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 타겟 폴리누클레오티드가 하나 이상의 상보적 유니버셜 캡쳐 영역에 의해 측면 배치되어 있는 방법.
  78. 제72항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머가 3'-단부에서 블로킹되어 있는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 3'-블로킹된 프라이머가 유니버셜 캡쳐 영역을 포함하는 방법.
  80. 제79항에 있어서, 유니버셜 캡쳐 영역이 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 또는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  81. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 KEA를 수행한 후에 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머를 탈블로킹시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  82. 제81항에 있어서, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머가 T4-키나아제를 사용하여 탈블로킹되어 있는 방법.
  83. 제57항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 타겟 폴리누클레오티드 앰플리콘의 클론 집단을 확장시키기 위해 브릿지 증폭(bridge amplification) 또는 제2 KEA를 수행하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  84. 제83항에 있어서, 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머가 SBS를 추가로 포함하는 방법.
  85. 제84항에 있어서, 하나 이상의 제1 프라이머 쌍의 제1 프라이머가 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS3 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 하나 이상의 제1 프라이머 쌍의 제2 프라이머가 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS8 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  86. 제85항에 있어서, 복수의 타겟 폴리누클레오티드가 하나 이상의 상보적 SBS에 의해 측면 배치되어 있는 방법.
  87. 제72항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머가 3'-단부에서 비블로킹되지 않은 방법.
  88. 제87항에 있어서, 하나 이상의 제2 프라이머 쌍의 프라이머가 유니버셜 캡쳐 영역을 포함하는 방법.
  89. 제88항에 있어서, 유니버셜 캡쳐 영역이 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 또는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  90. 제89항에 있어서, 제1 KEA가 하나 이상의 웰을 초과하여 앰플리콘의 클론 집단을 확장시키기 위해 연장된 시기 동안 수행되는 방법.
  91. 제72항 또는 제73항에 있어서, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍이 제1 KEA를 수행한 후에 침적되는 방법.
  92. 제91항에 있어서, 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍 및 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머가 유니버셜 캡쳐 영역을 포함하는 방법.
  93. 제92항에 있어서, 유니버셜 캡쳐 영역이 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 또는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  94. 제93항에 있어서, 하나 이상의 웰을 초과하여 타겟 폴리누클레오티드 앰플리콘의 클론 집단을 확장시키기 위해 브릿지 증폭 또는 제2 KEA를 수행하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  95. 핵산을 증폭시키기 위한 방법으로서,
    a) 기판 상에 제1 층을 형성시키되, 기판이 하나 이상의 웰, 웰을 둘러싸는 표면, 및 내부 웰 표면을 포함하고, 제1 층이 내부 웰 표면을 일부 또는 전부 덮고;
    b) 제1 층에서 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍을 침적시키되, 제1 캡쳐 프라이머 쌍이 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제1 캡쳐 프라이머, 및 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제2 캡쳐 프라이머를 포함하고;
    c) 기판 상에 제2 층을 형성시켜 제1 층 및 웰을 둘러싸는 표면을 덮고;
    d) 제1 층에서 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 침적시키되, 제2 캡쳐 프라이머 쌍이 3' 포스페이트-종결되고, Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제1 캡쳐 프라이머, 및 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제2 캡쳐 프라이머를 포함하고;
    e) 웰 당 단일 타겟 폴리누클레오티드를 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머와 혼성화시키기에 충분한 조건 하에서 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 포함하는 샘플을 기판과 접촉시키되, 타겟 폴리누클레오티드가 각각 상보적 Illumina® P5' 프라이머 누클레오티드 서열 또는 상보적 Illumina® P7' 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 상보적 유니버셜 프라이머 영역에 의해 측면 배치되고;
    f) 하나 이상의 웰 내측에 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터 앰플리콘의 모노클로날 집단을 형성시키기 위해 제1 KEA를 수행하여, 이에 의해 타겟 폴리누클레오티드를 증폭시키고;
    g) 제2 프라이머 쌍의 프라이머를 탈블로킹시키기 위해 기판을 T4-키나아제와 접촉시키고;
    h) 웰을 초과하여 단일 타겟 폴리누클레오티드의 앰플리콘의 모노클로날 집단을 확장시키기 위해 브릿지 증폭 또는 제2 KEA를 수행하는 것을 포함하는 방법.
  96. 핵산을 증폭시키는 방법으로서,
    a) 기판 상에 제1 층을 형성시키되, 기판이 하나 이상의 웰, 웰을 둘러싸는 표면, 및 내부 웰 표면을 포함하고, 제1 층이 내부 웰 표면을 일부 또는 전부 덮고;
    b) 제1 층에서 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍을 침적시키되, 제1 캡쳐 프라이머 쌍이 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS3 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머, 및 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열 및 Illumina® SBS8 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머를 포함하고;
    c) 기판 상에 제2 층을 형성시켜 제1 층 및 웰을 둘러싸는 표면을 덮고;
    d) 제2 층에서 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 침적시키되, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍이 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제1 캡쳐 프라이머, 및 Illumina® P7 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제2 캡쳐 프라이머를 포함하고;
    e) 웰 당 단일 타겟 폴리누클레오티드를 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머와 혼성화시키기에 충분한 조건 하에서 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 포함하는 샘플을 기판과 접촉시키되, 복수의 타겟 폴리누클레오티드가 각각 상보적 Illumina® SBS3' 프라이머 누클레오티드 서열 또는 상보적 Illumina® SBS8' 누클레오티드 서열을 포함하는 상보적 SBS에 의해 측면 배치되고;
    f) 하나 이상의 웰 내측 및 외측에 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터 앰플리콘의 모노클로날 집단을 형성시키기 위해 연장된 시간 동안 KEA를 수행하고, 이에 의해 웰 내측에 단일 폴리누클레오티드를 증폭시키고 하나 이상의 웰을 초과하여 타겟 폴리누클레오티드의 모노클로날 집단을 확장시키는 것을 포함하는 방법.
  97. 핵산을 증폭시키는 방법으로서,
    a) 기판 상에 제1 층을 형성시키되, 기판이 하나 이상의 웰, 웰을 둘러싸는 표면, 및 내부 웰 표면을 포함하고, 제1 층이 내부 웰 표면을 일부 또는 전부 덮고;
    b) 제1 층에서 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍을 침적시키되, 제1 프라이머 쌍이 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제1 캡쳐 프라이머, 및 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제2 캡쳐 프라이머를 포함하고;
    c) 기판 상에 제2 층을 형성시켜 제1 층 및 웰을 둘러싸는 표면을 덮고;
    d) 웰 당 단일 타겟 폴리누클레오티드를 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머와 혼성화시키기에 충분한 조건 하에서 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 포함하는 샘플을 기판과 접촉시키되, 복수의 폴리누클레오티드가 각각 상보적 Illumina® P5' 프라이머 누클레오티드 서열 또는 상보적 Illumina® P7' 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 상보적 유니버셜 프라이머 영역에 의해 측면 배치되고;
    e) 하나 이상의 웰 내측에 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터 앰플리콘의 모노클로날을 형성시키기 위해 제1 KEA를 수행하여, 이에 의해 타겟 폴리누클레오티드를 증폭시키고;
    f) 제2 층에서 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 침적시키되, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍이 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제1 캡쳐 프라이머 및 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 복수의 제2 캡쳐 프라이머를 포함하고;
    g) 단일 타겟 폴리누클레오티드의 앰플리콘의 모노클로날 집단을 확장시키기 위하여 브릿지 증폭 또는 제2 KEA를 수행하는 것을 포함하는 방법.
  98. 핵산을 증폭시키는 방법으로서.
    a) 기판 상에 층을 형성시키되, 기판이 하나 이상의 웰, 웰을 둘러싸는 표면, 및 내부 웰 표면을 포함하고, 웰이 약 1 ㎛ 이상의 직경을 가지고, 층이 내부 웰 표면을 일부 또는 전부 덮고;
    b) 층에 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍 및 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍을 침적시키되, 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머 밀도가 적어도 제2 프라이머 쌍의 프라이머 밀도 보다 높고;
    c) 웰 당 단일 타겟 폴리누클레오티드를 제2 프라이머와 혼성화시키기에 충분한 조건 하에서 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 포함하는 샘플을 기판과 접촉시키고;
    d) 웰 내측에 제2 플아미어에 혼성화된 단일 타겟 폴리누클레오티드로부터 앰플리콘의 모노클로날 집단을 형성시키기 위해 KEA를 수행하여, 이에 의해 단일 타겟 폴리누클레오티드를 증폭시키는 것을 포함하는 방법.
  99. 제98항에 있어서, 복수의 타겟 폴리누클레오티드가 각각 상보적 Illumina® SBS3' 프라이머 누클레오티드 서열 또는 상보적 Illumina® SBS8' 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 상보적 SBS에 의해 측면 배치되는 방법.
  100. 제98항에 있어서, 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머가 유니버셜 캡쳐 영역을 포함하는 방법.
  101. 제100항에 있어서, 하나 이상의 제1 캡쳐 프라이머 쌍이 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 복수의 제1 캡쳐 프라이머, 및 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 복수의 제2 캡쳐 프라이머를 포함하는 방법.
  102. 제98항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍의 프라이머가 유니버셜 캡쳐 영역 및 SBS를 포함하는 방법.
  103. 제102항에 있어서, 하나 이상의 제2 캡쳐 프라이머 쌍이 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열, 또는 이의 단편 및 Illumina® SBS3 프라이머 누클레오티드 서열, 또는 이의 단편을 포함하는 복수의 제1 캡쳐 프라이머, 및 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열, 또는 이의 단편, 및 Illumina® SBS8 프라이머 누클레오티드 서열, 또는 이의 단편을 포함하는 복수의 제2 캡쳐 프라이머를 포함하는 방법.
  104. 고정된 캡쳐 프라이머를 증폭시키는 방법으로서,
    a) 하나 이상의 고정된 주형 핵산을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 복수의 고정된 캡쳐 프라이머를 포함하는 기판을 복수의 주형 핵산과 접촉시키되,
    복수의 고정된 캡쳐 프라이머가 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 제1의 복수의 프라이머, 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 제2의 복수의 프라이머를 포함하고,
    각 주형 핵산이 5'-말단 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y 또는 Z에 의해 측면 배치되고, 하나 이상의 제한 사이트, 및 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역과 하나 이상의 제한 사이트 사이 또는 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역과 하나 이상의 제한 사이트 사이의 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하고,
    b) 하나 이상의 주형 핵산에 대해 상보적인 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 하나 이상의 고정된 캡쳐 프라이머를 확장시키는 것을 포함하는 방법.
  105. 제104항에 있어서, 유니버셜 캡쳐 영역 Y가 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 유니버셜 캡쳐 영역 Z가 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  106. 제105항에 있어서, 각 주형 핵산의 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역이 상보적 Illumina® P5' 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 각 주형 핵산의 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역이 상보적 Illumina® P7' 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  107. 제106항에 있어서, 각 주형 핵산의 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역이 상보적 Illumina® P3' 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 각 주형 핵산의 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역이 상보적 Illumina® P7' 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  108. 제107항에 있어서, 각 주형 핵산의 타겟-특이적 캡쳐 영역이 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역과 하나 이상의 제한 사이트 사이에 있는 방법.
  109. 제104항에 있어서, 각 주형 핵산의 타겟-특이적 캡쳐 영역이 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역과 하나 이상의 제한 사이트 사이에 있는 방법.
  110. 제104항에 있어서, 각 주형 핵산이 두 개의 제한 사이트, 및 두 개의 제한 사이트 사이의 스페이서 영역을 포함하는 방법.
  111. 제110항에 있어서, 두 개의 제한 사이트가 SapI 사이트인 방법.
  112. 제110항 또는 제111항에 있어서, 스페이서 영역이 약 150개의 염기를 포함하는 방법.
  113. 제104항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 기판이 복수의 패드를 포함하는 패턴화된 흐름 셀(patterned flow cell)인 방법.
  114. 제113항에 있어서, 각 패드가 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 제1의 복수의 고정된 유니버셜 캡쳐 프라이머, 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 제2의 복수의 고정된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 포함하는 방법.
  115. 제114항에 있어서, 단일의 고정된 확장 생성물이 복수의 패드들 중 패드 당 형성되는 방법.
  116. 제115항에 있어서, 패드 당 형성된 단일의 고정된 확장 생성물이 복수의 패드의 모든 패드에서 동일한 주형 핵산에 대해 상보적인 방법.
  117. 제116항에 있어서, 패드 당 형성된 단일의 고정된 확장 생성물이 복수의 패드 중 둘 이상의 패드에서 둘 이상의 상이한 주형 핵산에 대해 상보적인 방법.
  118. 제117항에 있어서, 패드 당 형성된 단일의 고정된 확장 생성물이 복수의 패드 중 1% 이상, 3% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상 중 각 하나의 패드에서 상이한 주형 핵산에 대해 상보적인 방법.
  119. 제118항에 있어서, 단일의 고정된 확장 생성물이 패드 중 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 초과로 형성되는 방법.
  120. 제118항에 있어서, 단일의 고정된 확장 생성물이 패드 중 100%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 또는 1% 미만으로 형성되는 방법.
  121. 제104항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 하나 이상의 모노클로날 클러스터를 형성시키기 위해 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  122. 제121항에 있어서, PCR에 의해 증폭시키는 것이 브릿지 증폭 또는 KEA를 포함하는 방법.
  123. 제122항에 있어서, 유니버셜 캡쳐 영역 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머, 및 복수의 이중 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 복수의 고정된 이중 가닥 주형 핵산에서 하나 이상의 제한 사이트를 절단하기 위해 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 하나 이상의 모노클로날 클러스터를 제한 효소와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  124. 제123항에 있어서, 제한 효소가 SapI인 방법.
  125. 제124항에 있어서, 복수의 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 단일 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 복수의 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머 및 이중 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 열 변성시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  126. 제125항에 있어서, 복수의 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 단일 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 복수의 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머 및 이중 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 5'-3' 이중 가닥 데옥시리보핵산(dsDNA) 엑소누클레아제(exonuclease)와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  127. 제126항에 있어서, 기판이 복수의 패드를 포함하는 패턴화된 흐름 셀인 방법.
  128. 제127항에 있어서, 각 패드가 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 제1의 복수의 캡쳐 프라이머, 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 제2의 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 포함하는 방법.
  129. 제128항에 있어서, 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 캡쳐 프라이머의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 초과가 복수의 패드 중 하나 이상의 패드에서 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머로 전환되는 방법.
  130. 제128항에 있어서, 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 캡쳐 프라이머의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 초과가 복수의 패드 중 하나 이상의 패드에서 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머로 전환되는 방법.
  131. 제128항에 있어서, 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 캡쳐 프라이머의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 초과가 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머로 전환되며, 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 캡쳐 프라이머의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 초과가 복수의 패드 중 하나 이상의 패드에서 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머로 전환되는 방법.
  132. 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법으로서,
    a) 하나 이상의 고정된 주형 핵산을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 복수의 고정된 캡쳐 프라이머를 포함하는 기판을 복수의 주형 핵산과 접촉시키되,
    복수의 고정된 캡쳐 프라이머가 3'-말단 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 제1의 복수의 프라이머, 및 3'-말단 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 제2의 복수의 프라이머를 포함하고,
    각 주형 핵산이 3'-말단 상보적 Illumina® P5' 프라이머 누클레오티드 서열 및 5'-말단 상보적 Illumina® P7' 프라이머 누클레오티드 서열에 의해 측면 배치되고, 두 개의 SapI 제한 사이트, SapI 제한 사이트 사이의 스페이서 영역, 및 3'-말단 상보적 Illumina® P5' 프라이머 누클레오티드 서열과 SapI 제한 사이트 사이의 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하고;
    b) 하나 이상의 주형 핵산에 대해 상보적인 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 하나 이상의 고정된 캡쳐 프라이머를 확장시키고;
    c) 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 하나 이상의 모노클로날 클러스터를 형성시키기 위해 브릿지 증폭 또는 KEA에 의해 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 증폭시키고;
    d) Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머, 및 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 복수의 고정된 이중 가닥 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 복수의 고정된 이중 가닥 주형 핵산에서 두 개의 제한 사이트를 절단시키도록 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 하나 이상의 모노클로날 클러스터를 SapI와 접촉시키고;
    e) 임의적으로, 복수의 고정화된 단일 가닥 키메라 캡쳐 프라이머 및 복수의 고정화된 단일 가닥 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 복수의 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머 및 고정된 이중 가닥 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 5'-3' dsDNA-엑소누클레아제와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  133. 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법으로서,
    a) 하나 이상의 고정된 주형 핵산을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 복수의 고정된 캡쳐 프라이머를 포함하는 기판을 복수의 주형 핵산과 접촉시키되,
    복수의 고정된 캡쳐 프라이머가 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 제1의 복수의 프라이머, 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 제2의 복수의 프라이머를 포함하고,
    각 주형 핵산이 5'-말단 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y 또는 Z에 의해 측면 배치되고 하나 이상의 제한 사이트, 및 하나 이상의 제한 사이트와 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 사이의 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하고;
    b) 하나 이상의 주형 핵산에 대해 상보적인 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 하나 이상의 고정된 캡쳐 프라이머를 확장시키고;
    c) 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 하나 이상의 모노클로날 클러스터를 형성시키기 위해 PCR에 의해 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 증폭시키고;
    d) 유니버셜 캡쳐 영역 Z 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머, 및 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 복수의 고정된 이중 가닥 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 복수의 고정된 이중 가닥 주형 핵산에서 하나 이상의 제한 사이트를 절단시키도록 고정된 이중 가닥 주형 핵산의 하나 이상의 모노클로날 클러스터를 제한 효소와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  134. 제133항에 있어서, 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 증폭시키는 것이 브릿지 증폭 또는 KEA를 포함하는 방법.
  135. 제133항에 있어서, 복수의 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 복수의 단일 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 복수의 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머 및 복수의 고정된 이중 가닥 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 변성시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  136. 제133항에 있어서, 주형 핵산이 타겟-특이적 부분과 3' 부분 사이에 SBS를 추가로 포함하는 방법.
  137. 제133항에 있어서, 제한 효소가 SapI인 방법.
  138. 제133항에 있어서, 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머가 3'-종결 부분 제한 사이트를 포함하는 방법.
  139. 제138항에 있어서, 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머로부터 3'-종결 부분 제한 사이트를 제거하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  140. 제139항에 있어서, 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머가 사전결정된 분열 사이트를 포함하는 방법.
  141. 제140항에 있어서, 사전결정된 분열 사이트가 디올 링커, 8-옥소구아닌(8-oxo-G), 우라실 염기, 리보누클레오티드, 메틸화된 누클레오티드, 또는 펩티드를 포함하는 방법.
  142. 제141항에 있어서, 부분 제한 사이트를 제거하는 것이 비-효소 화학적 분열을 포함하는 방법.
  143. 제142항에 있어서, 비-효소 화학적 분열이 퍼요오데이트 처리, 희토류 금속 이온 처리, 알칼리 처리 또는 광화학적 반응을 포함하는 방법.
  144. 제140항에 있어서, 3'-종결 부분 제한 사이트를 제거하는 것이 효소적 분열을 포함하는 방법.
  145. 제144항에 있어서, 효소적 분열이 우라실-DNA 글리코실라아제 분열, 엔도누클레아제 분열, 리보누클레아제(RNAse) 처리, 제한 효소 분열 또는 프로테아제 분열을 포함하는 방법.
  146. 제139항에 있어서, 3'-종결 부분 제한 사이트를 제거하는 것이 이중-가닥 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 형성시키기 위해 역 상보적 올리고누클레오티드를 단일 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머에 혼성화시키는 것을 포함하는 방법..
  147. 제146항에 있어서, 이중 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 역 상보적 올리고누클레오티드를 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머에 혼성화시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  148. 제147항에 있어서, 3'-종결 부분 제한 사이트를 제거하기 위해 기판을 누클레아제와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  149. 제148항에 있어서, 누클레아제가 엑소누클레아제 I인 방법.
  150. 제133항에 있어서, 고정된 이중 가닥 키메라 캡쳐 프라이머의 3'-종결 타겟-특이적 캡쳐 영역이 절단된 방법.
  151. 제133항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 유니버셜 캡쳐 영역 Y가 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 유니버셜 캡쳐 영역 Z가 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  152. 제133항에 있어서, 각 주형 핵산이 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y, 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z, 제1과 제2 제한 사이트를 포함하는 중심 부분, 및 제1 제한 사이트와 제2 제한 사이트 사이의 스페이서 영역, 및 중심 부분과 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z 사이의 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 방법.
  153. 제152항에 있어서, 각 주형 핵산이 타겟-특이적 영역과 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z 사이의 SBS를 추가로 포함하는 방법.
  154. 제133항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서,
    e) 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 포함하는 핵산 샘플을 하나 이상의 프라이머와 접촉시키되, 상기 하나 이상의 프라이머가 어댑터를 함유하고;
    f) 복수의 앰플리콘을 형성시키기 위해 PCR에 의해 상기 복수의 타겟 폴리누클레오티드를 증폭시키고;
    g) 제1의 복수의 고정화된 앰플리콘을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 복수의 고정된 키메라 캡쳐 프라이머를 상기 복수의 앰플리콘과 직접적으로 접촉시키고;
    h) 상기 타겟 폴리누클레오티드에 대해 상보적인 복수의 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 복수의 고정된 키메라 캡쳐 프라이머를 확장시키고;
    i) 제2의 복수의 고정화된 앰플리콘을 형성시키기 위해 PCR에 의해 상기 복수의 고정된 확장 생성물을 증폭시키되, 상기 고정화된 앰플리콘의 집단이 85% 이상의 균일성을 포함하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  155. 제154항에 있어서, 어댑터가 유니버셜 캡쳐 영역 Y 또는 Z를 포함하는 방법.
  156. 제155항에 있어서, 어댑터가 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 또는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  157. 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법으로서,
    a) 하나 이상의 고정된 주형 핵산을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 기판 상에 고정화된 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 복수의 주형 핵산과 접촉시키되,
    복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머가 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 제1의 복수의 프라이머 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z의 제2의 복수의 프라이머를 포함하며,
    각 주형 핵산이 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y, 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z, 타겟-특이적 캡쳐 영역, 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y와 타겟-특이적 캡쳐 영역 사이의 제한 사이트, 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z와 타겟-특이적 캡쳐 부분 사이의 SBS를 포함하고;
    b) 하나 이상의 고정된 주형 핵산에 대해 상보적인 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 하나 이상의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 확장시키고;
    c) 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 형성시키기 위해 브릿지 증폭 또는 KEA에 의해 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 증폭시키고;
    d) 유니버셜 캡쳐 영역 Z 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 고정된 키메라 캡쳐 프라이머, 및 유니버셜 캡쳐 영역 Y 및 부분 제한 사이트를 포함하는 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 클러스터를 제한 효소와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  158. 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법으로서,
    a) 하나 이상의 고정된 주형 핵산을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 기판 상에 고정화된 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 복수의 주형 핵산과 접촉시키되,
    복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머가 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y 및 제1 사전결정된 분열 사이트를 포함하는 제1의 복수의 프라이머, 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z 및 제2 사전결정된 분열 사이트를 포함하는 5'-부분을 포함하는 제2의 복수의 프라이머를 포함하고,
    각 주형 핵산이 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y, 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z, a 타겟-특이적 캡쳐 영역, 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y와 타겟-특이적 캡쳐 영역 사이의 제한 사이트, 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z와 타겟-특이적 캡쳐 영역 사이의 SBS를 포함하고;
    b) 하나 이상의 주형 핵산에 대해 상보적인 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 하나 이상의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 확장시키고;
    c) 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 형성시키기 위해 브릿지 증폭 또는 KEA에 의해 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 증폭시키고;
    d) 유니버셜 캡쳐 영역 Z 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 고정된 키메라 캡쳐 프라이머, 및 유니버셜 캡쳐 영역 Y 및 부분 제한 사이트를 포함하는 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 제한 효소와 접촉시키고;
    e) 제1 사전결정된 분열 사이트에서 절단을 통해 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머로부터 부분 제한 사이트를 제거하는 것을 포함하는 방법.
  159. 제158항에 있어서, 유니버셜 캡쳐 영역 Y가 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 유니버셜 캡쳐 영역 Z가 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  160. 제158항에 있어서, 제1 사전결정된 분열 사이트가 우라실 염기를 포함하며, 제2 사전결정된 분열 사이트가 디올-링커를 포함하는 방법.
  161. 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법으로서,
    a) 하나 이상의 고정된 주형 핵산을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 기판 상에 고정화된 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 복수의 주형 핵산과 접촉시키되,
    복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머가 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 제1의 복수의 프라이머 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 제2의 복수의 프라이머를 포함하고,
    각 주형 핵산이 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y, 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z, 제1 및 제2 제한 사이트를 포함하는 중심 부분, 및 제1 제한 사이트와 제2 제한 사이트 사이의 스페이서 영역, 및 중심 부분과 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z 사이의 타겟-특이적 영역을 포함하고;
    b) 하나 이상의 주형 핵산에 대해 상보적인 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머 중 하나 이상의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 확장시키고;
    c) 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 형성시키기 위해 브릿지 증폭 또는 KEA에 의해 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 증폭시키고,
    d) 유니버셜 캡쳐 영역 Z 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 제한 효소와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  162. 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법으로서,
    a) 하나 이상의 고정된 주형 핵산을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 기판 상에 고정화된 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 복수의 주형 핵산과 접촉시키되, 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머가 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 제1의 복수의 프라이머, 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 제2의 복수의 프라이머를 포함하고,
    각 주형 핵산이 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y, 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z, 타겟-특이적 캡쳐 영역, 및 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y와 타겟-특이적 캡쳐 영역 사이의 제한 사이트를 포함하고;
    b) 하나 이상의 주형 핵산에 대해 상보적인 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머 중 하나 이상의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 확장시키고;
    c) 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 형성시키기 위해 브릿지 증폭 또는 KEA에 의해 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 증폭시키고;
    d) 유니버셜 캡쳐 영역 Z 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 이중-가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머, 및 유니버셜 캡쳐 영역 Y 및 단일-가닥 부분 제한 사이트를 포함하는 복수의 이중 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 제헌 효소와 접촉시키고;
    e) 복수의 단일-가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 복수의 단일 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 복수의 이중-가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 복수의 이중 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 변성시키고;
    f) 이중-가닥 유니버셜 캡쳐 영역 및 이중-가닥 타겟-특이적 영역을 형성시키기 위해 역 상보적 올리고누클레오티드를 복수의 단일 가닥 고정된 키메라 캡쳐 프라이머 및 복수의 단일 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 혼성화시키고,
    g) 복수의 이중 가닥 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머로부터 단일-가닥 부분 제한 사이트를 제거하기 위하여 표면을 엑소누클레아제 I과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  163. 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법으로서,
    a) 하나 이상의 고정된 주형 핵산을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서, 기판 상에 고정화된 복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 복수의 주형 핵산과 접촉시키되,
    복수의 유니버셜 캡쳐 프라이머가 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y를 포함하는 제1의 복수의 프라이머, 및 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z를 포함하는 제2의 복수의 프라이머, 및 3'-종결 영역 X 및 사전결정된 분열 사이트를 포함하는 5' 부분을 포함하는 제3의 복수의 프라이머를 포함하고,
    각 주형 핵산이 5'-말단 영역 X, 3'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Z, 타겟-특이적 캡쳐 영역, 및 영역 X와 타겟-특이적 캡쳐 영역 사이의 제한 사이트를 포함하고;
    b) 하나 이상의 주형 핵산에 대해 상보적인 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 하나 이상의 유니버셜 캡쳐 프라이머를 확장시키고;
    c) 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 형성시키기 위해 브릿지 증폭 또는 KEA에 의해 하나 이상의 고정된 확장 생성물을 증폭시키고;
    d) 유니버셜 캡쳐 영역 Z 및 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 복수의 고정된 키메라 캡쳐 프라이머, 및 영역 X 및 부분 제한 사이트를 포함하는 복수의 고정된 재생된 유니버셜 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 고정된 확장 생성물의 하나 이상의 모노클로날 앰플리콘을 제한 효소와 접촉시키고;
    e) 사전결정된 분열 사이트에서 절단을 통해 기판으로부터 영역 X를 포함하는 복수의 고정화된 재생된 캡쳐 프라이머를 제거하는 것을 포함하는 방법.
  164. 제163항에 있어서, 유니버셜 캡쳐 영역 Y가 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하며, 유니버셜 캡쳐 영역 Z가 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  165. 제163항에 있어서, 사전-결정된 분열 사이트가 디올-링커를 포함하는 방법.
  166. 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y 또는 Z, 제한 사이트 및 3'-종결 다이머화 영역 DR을 포함하는 제1 올리고누클레오티드, 및 5'-종결 유니버셜 캡쳐 영역 Y 또는 Z 및 3'-종결 다이머화 영역 DR을 포함하는 제2 올리고누클레오티드를 포함하는 올리고누클레오티드 다이머.
  167. 제166항에 있어서, 제1 올리고누클레오티드의 3'-종결 DR 및 제2 올리고누클레오티드의 3'-종결 DR이 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 방법.
  168. 제167항에 있어서, 제1 올리고누클레오티드의 3'-종결 DR 및 제2 올리고누클레오티드의 3'-종결 DR이 SBS를 포함하는 올리고누클레오티드.
  169. 고정된 캡쳐 프라이머를 개질시키는 방법으로서,
    a) 복수의 상이한 고정된 시드 핵산을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 복수의 고정된 캡쳐 프라이머를 포함하는 기판을 복수의 상이한 시드 핵산과 접촉시키고;
    b) 복수의 상이한 고정된 시드 핵산 중 둘 이상에 대해 상보적인 복수의 상이한 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 고정된 캡쳐 프라이머 중 둘 이상을 확장시키고;
    c) 활성화된 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 복수의 상이한 고정된 확장 생성물 중 하나의 고정된 확장 생성물을 활성화시키고;
    d) 임의적으로, 고정된 개질된 캡쳐 프라이머의 모노클로날 클러스터를 형성시키기 위해 활성화된 캡쳐 프라이머를 증폭시키는 것을 포함하는 방법.
  170. 제169항에 있어서, 고정된 확장 생성물을 활성화시키는 것이 타겟화된 활성화를 포함하는 방법.
  171. 제170항에 있어서, 타겟화된 활성화가 복수의 상이하게 라벨링된 시드 핵산을 형성시키기 위해 복수의 상이한 시드 핵산을 복수의 상이한 라벨로 라벨링시키는 초기 단계를 포함하는 방법.
  172. 제171항에 있어서, 타겟화된 활성화가 복수의 상이하게 라벨링된 고정된 시드 핵산을 형성시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  173. 제172항에 있어서, 타겟화된 활성화가 복수의 상이하게 라벨링된 고정된 확장 생성물을 형성시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  174. 제170항에 있어서, 타겟화된 활성화가 하나의 고정된 확장 생성물을 활성화시키기 위해 복수의 상이하게 라벨링된 고정된 확장 생성물을 하나 이상의 라벨-특이적 트리거 분자(label-specific trigger molecule)와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  175. 제171항에 있어서, 초기 라벨링 단계가 복수의 상이한 시드 핵산의 랜덤 라벨링(random labeling)을 포함하는 방법.
  176. 제171항에 있어서, 초기 라벨링 단계가 복수의 상이한 시드 핵산의 타겟화된 라벨링을 포함하는 방법.
  177. 제176항에 있어서, 타겟화된 라벨링이 서열-특이적 라벨링인 방법.
  178. 제177항에 있어서, 복수의 상이한 시드 핵산이 50개 미만, 45개 미만, 40개 미만, 35개 미만, 30개 미만, 25개 미만, 20개 미만, 18개 미만, 16개 미만, 14개 미만, 12개 미만, 10개 미만, 8개 미만, 6개 미만, 4개 미만, 또는 2개 미만의 상이한 라벨로 라벨링되는 방법.
  179. 제177항에 있어서, 복수의 상이한 시드 핵산이 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4, 또는 2개의 상이한 라벨로 라벨링되는 방법.
  180. 제177항에 있어서, 복수의 상이한 시드 핵산이 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 80개 이상, 90개 이상, 100개 이상, 150개 이상, 200개 이상, 250개 이상, 300개 이상, 400개 이상, 500개 이상, 600개 이상, 700개 이상, 800개 이상, 900개 이상, 또는 1,000개 이상의 상이한 라벨로 라벨링되는 방법.
  181. 제171항에 있어서, 상이한 라벨이 상이한 핵산 서열을 갖는 상이한 프라이머인 방법.
  182. 제171항에 있어서, 초기 라벨링 단계가 복수의 상이한 시드 핵산에 복수의 상이한 프라이머를 결찰시키는 것을 포함하는 방법.
  183. 제174항에 있어서, 트리거 분자가 트리거 영역을 포함하는 핵산인 방법.
  184. 제182항에 있어서, 트리거 영역이 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 방법.
  185. 제176항에 있어서, 트리거 영역이 유니버셜 캡쳐 영역을 포함하는 방법.
  186. 제182항에 있어서, 유니버셜 캡쳐 영역이 Illumina® P5 프라이머 누클레오티드 서열 또는 Illumina® P7 프라이머 누클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  187. 제186항에 있어서, 트리거 분자가 고정된 캡쳐 프라이머인 방법.
  188. 제187항에 있어서, 고정된 캡쳐 프라이머가 복수의 고정된 캡쳐 프라이머인 방법.
  189. 제188항에 있어서, 복수의 고정된 캡쳐 프라이머가 복수의 상이한 캡쳐 프라이머인 방법.
  190. 제188항에 있어서, 복수의 고정된 캡쳐 프라이머가 동일한 핵산 서열을 갖는 복수의 동일한 캡쳐 프라이머인 방법.
  191. 제187항에 있어서, 고정된 캡쳐 프라이머가 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 방법.
  192. 제169항에 있어서, 고정된 확장 생성물을 활성화시키는 것이 확률적 활성화(stochastic activation)를 포함하는 방법.
  193. 제192항에 있어서, 확률적 활성화가 헤어핀 구조(hairpin structure)를 포함하는 복수의 상이한 고정된 시드 핵산을 형성시키기 위해 복수의 고정된 캡쳐 프라이머를 갖는 기판을 복수의 상이한 시드 핵산과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  194. 제193항에 있어서, 확률적 활성화가 헤어핀 구조를 포함하는 복수의 상이한 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 복수의 고정된 캡쳐 프라이머 중 둘 이상을 확장시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  195. 제194항에 있어서, 확률적 활성화가 헤어핀 구조를 포함하는 복수의 고정된 확장 생성물 중 하나를 분열 시약으로 활성화시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  196. 제195항에 있어서, 분열 시약이 누클레아제인 방법.
  197. 제196항에 있어서, 누클레아제가 엔도누클레아제인 방법.
  198. 제195항에 있어서, 분열 시약이 증폭 혼합물(amplification mix)에 존재하는 방법.
  199. 제198항에 있어서, 분열 시약이 활성화된 캡쳐 프라이머를 증폭시킬 때 존재하는 방법.
  200. 제193항에 있어서, 복수의 상이한 고정된 확장 생성물이 유니버셜 캡쳐 영역을 포함하는 방법.
  201. 제193항에 있어서, 복수의 상이한 고정된 확장 생성물에서 헤어핀 구조가 유니버셜 캡쳐 영역을 마스킹하는 방법.
  202. 제174항에 있어서, 복수의 상이한 시드 핵산이 트리거 영역을 포함하지 않는 방법.
  203. 제202항에 있어서, 확률적 활성화가 복수의 상이한 시드 핵산 중 하나를 트리거 영역을 포함하는 키메라 프라이머로 증폭시키는 초기 단계를 포함하는 방법.
  204. 제203항에 있어서, 복수의 상이한 시드 핵산 중 하나를 키메라 프라이머로 증폭시키는 초기 단계에서, 하나 이상의 시드 핵산이 키메라 프라이머에 비해 5배 초과, 10배 초과, 25배 초과, 50배 초과, 100배 초과, 250배 초과, 500배 초과, 1,000배 초과, 2,500배 초과, 5,000배 초과, 10,000배 초과, 25,000배 초과, 50,000배 초과, 또는 100,000배 초과 과량으로 존재하며, 일부 구체예에서, 트리거 영역이 타겟-특이적 캡쳐 영역을 포함하는 방법.
  205. 제203항에 있어서, 트리거 영역이 유니버셜 캡쳐 영역을 포함하는 방법.
  206. 제203항에 있어서, 키메라 프라이머가 트리거 영역 및 SBS를 포함하는 방법.
  207. 제192항에 있어서, 확률적 활성화가 복수의 상이한 고정된 시드 핵산을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 복수의 고정된 캡쳐 프라이머를 갖는 기판을 복수의 상이한 시드 핵산과 접촉시키는 것을 포함하며, 상이한 시드 핵산 각각이 하나 이상의 개질된 누클레오티드를 포함하는 방법.
  208. 제207항에 있어서, 확률적 활성화가 복수의 상이한 고정된 시드 핵산에 대해 상보적인 복수의 상이한 고정된 확장 생성물을 형성시키기 위해 둘 이상의 고정된 캡쳐 프라이머를 확장시키는 것을 추가로 포함하며, 복수의 상이한 고정된 확장 생성물 각각이 하나 이상의 개질된 누클레오티드를 포함하는 방법.
  209. 제208항에 있어서, 확률적 활성화가 활성화된 캡쳐 프라이머를 형성시키기 위해 복수의 상이한 고정된 확장 생성물 중 하나를 활성화시키는 것을 추가로 포함하며, 활성화된 캡쳐 프라이머가 개질된 누클레오티드를 포함하지 않는 방법.
  210. 제207항에 있어서, 개질된 누클레오티드가 이소구아닌(isoG) 또는 이소시토신(isoC)을 포함하는 방법.
  211. 제192항에 있어서, 확률적 활성화가 각각이 결합된 블로킹제를 갖는 복수의 상이한 고정된 시드 핵산을 형성시키기 위한 혼성화를 위해 충분한 조건 하에서 결합된 블로킹 시약을 각각 갖는 복수의 상이한 시드 핵산을 복수의 고정된 캡쳐 프라이머를 갖는 기판과 접촉시키고 블로킹제를 탈블로킹제와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  212. 제211항에 있어서, 블로킹제가 핵산 결합 단백질이며, 탈블로킹제가 프로테아제인 방법.
  213. 제211항에 있어서, 블로킹제가 비드인 방법.
  214. 제169항에 있어서, 고정된 개질된 캡쳐 프라이머의 모노클로날 클러스터를 형성시키기 위해 활성화된 캡쳐 프라이머를 증폭시키는 것이 KEA 또는 브릿지 증폭을 포함하는 방법.
  215. 제169항에 있어서, 표면이 복수의 웰을 포함하는 패턴화된 흐름 셀인 방법.
  216. 제215항에 있어서, 상이한 고정된 확장 생성물이 복수의 웰 중 둘 이상의 웰에 형성된 방법.
  217. 제215항에 있어서, 활성화된 캡쳐 프라이머가 복수의 웰 중 둘 이상의 웰 각각에 형성된 방법.
  218. 제217항에 있어서, 활성화된 캡쳐 프라이머가 복수의 웰 중 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 웰 각각에 형성된 방법.
  219. 217항에 있어서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰 각각에 형성된 활성화된 캡쳐 프라이머가 적어도 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 웰에서 상이한 활성화된 캡쳐 프라이머인 방법.
  220. 제217항에 있어서, 고정된 개질된 캡쳐 프라이머의 모노클로날 클러스터가 복수의 웰 중 둘 이상의 웰 각각에 형성되는 방법.
  221. 제220항에 있어서, 고정된 개질된 캡쳐 프라이머의 모노클로날 클러스터가 복수의 웰 중 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 웰 각각에서 형성되는 방법.
  222. 제220항에 있어서, 복수의 웰 중 둘 이상의 웰 각각에 형성된 고정된 개질된 캡쳐 프라이머의 모노클로날 클러스터가 웰의 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상에서 고정된 개질된 캡쳐 프라이머의 상이한 모노클로날 클러스터인 방법.
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