JP2017209051A - 標的生体分子の検出方法、標的生体分子検出用基板、及び標的生体分子検出装置 - Google Patents

Abstract

【課題】生体分子を含む試料において、複数の標的生体分子を効率よく検出することが可能な核酸検出方法を提供する。【解決手段】標的生体分子の検出方法であって、（ａ）生体分子を含む試料を、複数の標的生体分子の１つに結合し得る第１のリガンドと、少なくとも１部に核酸を含み、前記第１の生体分子と同じ標的生体分子に結合し得る第２のリガンドとが固定化された、複数の反応槽に分配する工程と、（ｂ）前記反応槽内に固定化された前記第２のリガンドを、前記反応槽内の液中に遊離させる工程と、（ｃ）前記反応槽内で核酸増幅反応を行う工程と、（ｄ）前記核酸増幅反応中の各反応槽内のプロトン発生量を測定する工程と、（ｅ）測定したプロトン発生量に基づいて、前記各反応槽内における核酸増幅の有無を判定する工程と、を含む、標的生体分子の検出方法。【選択図】図２

Description

本発明は、標的生体分子の検出方法、標的生体分子検出用基板、及び標的生体分子検出装置に関する。

ハイスループットで核酸分析を行う方法としては、光切断部位を介してビーズにプライマーを結合し、プライマーに試料中の核酸を捕捉させた後、プライマーを光誘導切断してＰＣＲを行い、標的核酸を増幅して増幅産物を分析する技術が知られている（特許文献１参照）。しかしながら、特許文献１に記載の技術では、増幅産物の分析を行う場合には、ビーズエマルジョンを回収して配列解析等を行う必要があった。

米国特許出願公開第２０１３／０１９０１９１号明細書

本発明の一実施態様は、標的生体分子の検出方法であって、
（ａ）生体分子を含む試料を、複数の標的生体分子の１つに結合し得る第１のリガンドと、少なくとも１部に核酸を含み、前記第１の生体分子と同じ標的生体分子に結合し得る第２のリガンドとが固定化された、複数の反応槽に分配する工程と、
（ｂ）反応槽内に固定化された前記第２のリガンドを、反応槽内の液中に遊離させる工程と、
（ｃ）反応槽内で核酸増幅反応を行う工程と、
（ｄ）核酸増幅反応中の各反応槽内のプロトン発生量を測定する工程と、
（ｅ）測定したプロトン発生量に基づいて、各反応槽内における核酸増幅の有無を判定する工程と、を含む標的生体分子の検出方法である。

また、本発明の一実施態様は、複数の標的生体分子の１つに結合し得る第１のリガンドと、少なくとも１部に核酸を含み、第１の生体分子と同じ標的生体分子に結合し得る第２のリガンドとが固定化されており、前記第２のリガンドは、光切断部位、１本鎖核酸切断酵素切断部位又は前記第２のリガンドに含まれる核酸と相補的な配列を有する核酸を介して固定化されている反応槽を複数備える、標的生体分子検出用基板である。

また、本発明の一実施態様は複数の標的生体分子の１つに結合し得る第１のリガンドと、少なくとも１部に核酸を含み、第１の生体分子と同じ標的生体分子に結合し得る第２のリガンドとが固定化されており、前記第２のリガンドは、光切断部位、１本鎖核酸切断酵素切断部位又は前記第２の核酸に含まれる核酸と相補的な配列を有する核酸を介して固定化されている複数の反応槽と、前記反応槽内での核酸増幅反応によって生じるプロトンを前記反応槽毎に検出する検出部と、前記検出部が検出する前記反応槽毎のプロトンの発生量に基づいて、前記反応槽内における核酸増幅の有無を前記反応槽毎に判定する核酸増幅判定部と、を備える標的生体分子検出装置である。

第１実施形態における反応槽配置基板の一例を示す模式図である。 第１実施形態における標的核酸用プライマーの反応槽への固定化の一例を示す模式図である。 核酸伸長反応におけるプロトン放出の模式図である。 本実施形態におけるセンサの一例を示す模式図である。 本実施形態における標的核酸配列検出装置の構成の一例を示す図である。 本実施形態における核酸配列記憶部の構成の一例を示す図である。 第２実施形態における標的抗原検出用抗体の反応槽への固定化の一例を示す模式図である。 第２実施形態における抗原記憶部の構成の一例を示す図である。

本実施形態の標的生体分子の検出方法は、
（ａ）生体分子を含む試料を、複数の標的生体分子の１つに結合し得る第１のリガンドと、少なくとも１部に核酸を含み、前記第１の生体分子と同じ標的生体分子に結合し得る第２のリガンドとが固定化された、複数の反応槽に分配する工程と、
（ｂ）前記反応槽内に固定化された前記第２のリガンドを、前記反応槽内の液中に遊離させる工程と、
（ｃ）前記反応槽内で核酸増幅反応を行う工程と、
（ｄ）前記核酸増幅反応中の各反応槽内のプロトン発生量を測定する工程と、
（ｅ）測定したプロトン発生量に基づいて、前記各反応槽内における核酸増幅の有無を判定する工程と、を含む。

＜第１実施形態＞
一例として、本実施形態の方法における標的生体分子は、所望の標的核酸配列を有する核酸である。また、第１のリガンドと第２のリガンドは、当該標的核酸配列にアニーリングし得るプライマー（以下「標的核酸用プライマー」という）である。本実施形態においては、標的生体分子が核酸である場合について説明する。

本実施形態の標的核酸配列の検出方法は、（ａ１）核酸を含む試料を、複数の標的核酸配列の１つにアニーリングし得る第１の標的核酸用プライマーと、前記第１のプライマーと同じ標的核酸配列にアニーリングし得る第２の標的核酸用プライマーとが固定化された、複数の反応槽に分配する工程と、（ｂ１）反応槽内に固定化された前記第２の標的核酸用プライマーを、反応槽内の液中に遊離させる工程と、（ｃ１）反応槽内で核酸増幅反応を行う工程と、（ｄ１）核酸増幅反応中の各反応槽内のプロトン発生量を測定する工程と、（ｅ１）測定したプロトン発生量に基づいて、各反応槽内における核酸増幅の有無を判定する工程と、の各工程を有する。以下、各工程について説明する。

［反応槽への試料の分配］
工程（ａ１）は、核酸を含む試料を、複数の標的核酸配列の１つにアニーリングし得る第１の標的核酸用プライマーと、前記第１の標的核酸用プライマーと同じ標的核酸配列にアニーリングし得る第２の標的核酸用プライマーとが固定化された、複数の反応槽に分配する工程である。本実施形態の工程（ａ１）を、図１を参照して、説明する。図１中、２０は反応槽配置基板であり、２１は反応槽である。この一例においては、反応槽配置基板２０は、ｍ×ｎ個（ｍ、ｎはいずれも自然数。）の反応槽２１を備える。この反応槽２１をウエルＷともいう。

また、反応槽２１は、水素濃度を検知するためのセンサ３０を備えている。反応槽２１のうち、例えば、ウエルＷ１１は、センサ３０−１１を備える。ウエルＷｍｎは、センサ３０−ｍｎを備える。一例として、センサ３０は、反応槽２１の底面に配設される。センサ３０の配設位置は、これに限るものではない。また、一例として、センサ３０は、イオン感応性電界効果トランジスタ（Ｉｏｎ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｆｉｅｌｄ Ｅｆｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ；ＩＳＦＥＴ）である。

本実施形態において、反応槽配置基板２０の材質は、特に限定されないが、ガラス、シリコン、ポリマー等とすることができる。なお、反応槽配置基板２０にエラストラマー材料を用いる場合、微小なゴミなどの粒子が反応槽２１と反応槽配置基板２０との間に挟まれたときに生じる反応槽２１全体の反応槽配置基板２０との密着性に及ぼす悪影響がエラストラマーの局所的な変形により回避される利点がある。

反応槽配置基板２０には、複数の反応槽２１が配設されている。配設される反応槽２１の数は、標的核酸配列の数に合わせて適宜設定することができる。反応槽２１の容量は、特に限定されないが、例えば、１ｐＬ〜１００μＬとすることができる。なお、反応槽配置基板２０の表面や反応槽２１の内壁は、核酸等の非特異的吸着を防止するブロッキング剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や２−メテクリオイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）等でコーティングされていてもよい。このようなコーティングが施してあることで、反応槽配置基板２０の表面や反応槽２１の内壁への核酸の非特異的吸着を抑制することができる。また、一例として、反応槽２１の内壁は、親水化されている。内壁が親水化されていることにより、試料を各反応槽２１に分配する際に、反応槽２１内部への試料の充填効率が向上する。

各反応槽２１には、反応槽２１毎に異なる標的核酸配列にアニーリングし得る第１の標的核酸用プライマー２Ｆと第２の標的核酸用プライマー２Ｒが固定化されている。なお、図１では、第１の標的核酸用プライマー２Ｆと第２の標的核酸用プライマー２Ｒとを合わせて「標的核酸用プライマー２」として表している。以下、第１の標的核酸用プライマー２Ｆと第２の標的核酸用プライマー２Ｒとを合わせて、「標的核酸用プライマー２」と表現する場合がある。

標的核酸用プライマー２は、目的とする標的核酸配列にアニーリングし得る配列を有する。一例として、標的核酸用プライマー２は、標的核酸配列の一部に相補的な配列を有する核酸である。標的核酸用プライマー２は、標的核酸配列にアニーリングし、標的核酸配列を鋳型とした核酸伸長反応を誘導する。一例として、標的核酸用プライマー２は、ＤＮＡである。標的核酸用プライマー２の配列は、目的とする標的核酸配列に応じて、適宜選択することができる。本実施形態においては、個々の反応槽２１には、それぞれ異なる配列を有する標的核酸用プライマー２が固定化されている。

反応槽２１のうち、例えば、ウエルＷ１１には、標的核酸用プライマー２−１１が固定化されている。ウエルＷｍｎには、ビーズ体１００−ｍｎが固定化されている。ウエルＷ１〜Ｗｍｎには、それぞれ異なる標的核酸配列を増幅し得る標的核酸用プライマー２が固定化されている。なお、本明細書において、「標的核酸用プライマー」とは、所定の標的核酸配列を増幅するために必要な全てのプライマーのセットをいう。すなわち、ＰＣＲ法により、標的核酸配列の増幅反応を行う場合には、当該標的核酸配列に特異的なフォワードプライマーとリバースプライマーのセットが、「標的核酸用プライマー」である。また、例えば、ＬＡＭＰ法により核酸増幅を行う場合には、標的核酸配列の６つの領域に対して設定される４種類のプライマーのセットが、「標的核酸用プライマー」である。「第１の標的核酸用プライマー」は、標的核酸用プライマーのうち、フォワードプライマー若しくはフォワードプライマーのセット、又はリバースプライマー若しくはリバースプライマーのセットである。また、「第２の標的核酸用プライマー」は、第１の標的核酸用プライマーの対となるプライマー又はプライマーのセットをいう。すなわち、第１の標的核酸用プライマーがフォワードプライマー又はフォワードプライマーのセットである場合、第２の標的核酸用プライマーは、リバースプライマー又はリバースプライマーのセットである。第１の標的核酸用プライマーがリバースプライマー又はリバースプライマーのセットである場合、第２の標的核酸用プライマーは、フォワードプライマー又はフォワードプライマーのセットである。

標的核酸用プライマー２の反応槽２１への固定化は、リソグラフィー技術やスポッティング技術を用いて行うことができる。また、例えば、金ナノ粒子や銀ナノ粒子等の金属ナノ粒子を用いた導電性インクに標的核酸用プライマー２を混合し、プリンティング技術を用いて反応槽２１に標的核酸用プライマー２を固定化してもよい。標的核酸用プライマー２は、反応槽２１の底面に固定化されていてもよく、壁面に固定化されていてもよい。なお、本明細書において、反応槽２１の「内壁」とは、反応槽２１の内部に面する底面及び壁面の両方をさす。

本実施形態においては、第２の標的核酸用プライマー２Ｒは、刺激により、反応槽２１の内壁から遊離して、反応槽２１内の液中に放出されるように、反応槽２１の内壁に固定かされている。一例として、第２の標的核酸用プライマー２Ｒは、光や熱等の物理的刺激を与えることにより、反応槽２１内部の液中に遊離する。また、一例として、第２の標的核酸用プライマー２Ｒは、１本鎖核酸切断酵素等の化学的刺激を与えることにより、反応槽２１内部の液中に遊離する。

図２に例示するように、反応槽２１には、第１の標的核酸用プライマー２Ｆと、第２の標的核酸用プライマー２Ｒとが固定化されている。図２（ａ）、（ｂ）の例では、第１の標的核酸用プライマー２Ｆ及び第２の標的核酸用プライマー２Ｒは、切断部位５０を介して反応槽２１の内壁に固定化されている。なお、切断部位５０は、第１の標的核酸用プライマー２Ｆ及び第２の標的核酸用プライマー２Ｒの両方にあってもよい。また、切断部位５０は、第２の標的核酸用プライマーのみにあってもよい。図２（ａ）は、切断部位５０が、第１の標的核酸用プライマー２Ｆ及び第２の標的核酸用プライマー２Ｒの両方にある例であり、図２（ｂ）は、切断部位５０が、第２の標的核酸用プライマー２Ｒのみにある例である。

切断部位５０は、刺激を与えることによって切断される部位である。そのような切断部位の例としては、光切断部位や１本鎖核核酸切断酵素切断部位等が挙げられる。

光切断部位とは、紫外線などの光を照射すると切断される性質を有する基をいい、かかる基を用いたものとしては、例えば、ＰＣ Ｌｉｎｋｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、フラーレンを含有してなる核酸の光切断用組成物（核酸の光切断用組成物：特開２００５−２４５２２３）、特許文献１に記載のものなどを挙げることができる。光切断部位としては、当技術分野において市販されているか、または知られているいずれの基を用いてもよい。例えば、ニトロベンジル基なども好適に用いることができる。

また、１本鎖核酸切断酵素切断部位とは、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼなどの１本鎖核酸切断酵素により切断されることができる核酸基をいい、ヌクレオチドおよびその誘導体が含まれる。そのような核酸基としては、例えば、エンドヌクレアーゼＶに認識されるデオキシイオシンなどを挙げることができる。

あるいは、第２の標的核酸用プライマー２Ｒは、その配列に相補的な配列を有する固定化用配列５１を介して反応槽２１に固定化してもよい。図２（ｃ）は、第２の標的核酸用プライマー２Ｒを、固定化用配列５１を介して、反応槽２１に固定化した例である。固定化用配列５１は、第２の標的核酸用プライマー２Ｒの少なくとも一部に相補的な配列を有する核酸であり、反応槽２１の内壁に固定化されている。第２の標的核酸用プライマーは、固定化用配列５１にハイブリダイズすることにより、反応槽２１の内壁に固定化される。この場合、反応槽２１内の温度を固定化用配列５１の融解温度以上に上昇させることにより、第２の標的核酸用プライマー２Ｒは、固定化用配列５１から遊離する。なお、第１の標的核酸用プライマーも、その配列に相補的な配列を有する固定化用配列５１を介して反応槽２１に固定化されていてもよい。

なお、図２では、第１の標的核酸用プライマー２Ｆ及び第２の標的核酸用プライマー２Ｒは、それぞれ１分子ずつしか反応槽２１に固定化されていないが、第１の標的核酸用プライマー２Ｆ及び第２の標的核酸用プライマー２Ｒは、複数分子が反応槽２１に固定化されていてもよい。反応槽２１の容量に応じて、適切な数の第１の標的核酸用プライマー２Ｆ及び第２の標的核酸用プライマー２Ｒを反応槽２１に固定化することができる。

また、ＬＡＭＰ法などの等温増幅法により標的核酸配列の増幅反応を行う場合、標的核酸配列の増幅反応に必要な全てのプライマーのセットが反応槽２１に固定化される。例えば、ＬＡＭＰ法の例では、フォワードプライマー２種類とリバースプライマー２種類の４種類のプライマーが反応槽２１に固定化される。この場合、これらのプライマーの少なくとも１種が、刺激により、反応槽２１内の液中に遊離するように、反応槽２１に固定化される。例えば、切断部位５０又は固定化用配列５１を介して、反応槽２１に固定化される。一例として、１種のフォワードプライマーを除く３種類のプライマーが、切断部位５０又は固定化用配列５１を介して、反応槽２１に固定化される。また、他の例として、４種類全てのプライマーが、切断部位５０又は固定化用配列５１を介して、反応槽２１に固定化される。

本工程では、核酸を含む試料が、各反応槽２１に分配される。本実施形態において、核酸を含む試料は、特に限定されず、例えば、生体サンプルや環境サンプルからの核酸抽出物等を含む試料等を使用することができる。一例として、試料に含まれる核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの例としては、ｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを挙げることができる。試料に含まれる核酸は、ＤＮＡに限定されず、ＲＮＡや修飾核酸であってもよい。

反応槽２１に、試料を分配する方法は、特に限定されず、例えば、核酸を含む試料を、反応槽配置基板２０上に滴下し、撹拌、振盪、遠心分離等の手段により、試料を反応槽２１に誘導してもよい。あるいは、試料に反応槽配置基板２０を浸漬し、撹拌、振盪、遠心分離等の手段を用いてもよい。

一例として、反応槽２１に試料を分配した後、反応槽２１は、標的核酸用プライマー２が標的核酸配列にアニーリングし得る条件に置かれる。アニーリング条件は、標的核酸用プライマー２の配列に応じて、適宜設定することができる。

［標的核酸用プライマーの遊離］
工程（ｂ１）は、反応槽内に固定化された第２の標的核酸用プライマーを、反応槽内の液中に遊離させる工程である。

上記のように、第２の標的核酸用プライマー２Ｒは、刺激により、反応槽２１内の液中に遊離するように、反応槽２１に固定化されている。本工程では、第２の標的核酸用プライマーの固定化様式に応じた刺激を与えることにより、第２の標的核酸用プライマー２Ｒを、反応槽２１内の液中に遊離させる。

例えば、標的核酸用プライマー２が、図２（ａ）及び（ｂ）に示すように、切断部位５０を介して反応槽２１に固定化されている場合には、切断部位５０の種類に応じた刺激を与えることにより、標的核酸用プライマー２を反応槽２１の内壁から切断し、反応槽２１内の液中に遊離させることができる。一例として、切断部位５０が光切断部位である場合には、紫外線などの光を照射することにより、標的核酸用プライマー２を遊離させることができる。光刺激の種類は、光切断部位の種類に応じて、適宜選択すればよい。また、切断部位５０が１本鎖核酸切断酵素切断部位である場合には、デオキシリボヌクレアーゼやリボヌクレアーゼなどの１本鎖核酸切断酵素を添加することにより、標的核酸用プライマー２を遊離させることができる。

一方、標的核酸用プライマー２が、図２（ｃ）に示すように、固定化用配列５１を介して反応槽２１に固定化されている場合には、反応槽２１内の温度を上昇させることにより、標的核酸用プライマー２を遊離させることができる。一例として、温度を、固定化用配列５１の融解温度以上に上昇させる。各反応槽２１に使用される固定化用配列５１の配列に応じて、各反応槽２１の温度を個別に制御してもよく、全ての反応槽２１の温度を下限温度以上の同じ温度に制御してもよい。

［核酸増幅反応］
工程（ｃ１）は、反応槽内で核酸増幅反応を行う工程である。
核酸増幅反応は、ＤＮＡポリメラーゼ等を用いた公知の方法により行うことができる。核酸増幅反応を行う際には、核酸増幅反応に必要な試薬を、反応槽２１に添加する。核酸増幅反応に必要な試薬としては、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、適切なバッファ等が挙げられる。これらの試薬の一部は、試料を反応槽２１に分配する前に、試料に添加するようにしてもよい。また、ＤＮＡポリメラーゼなどは、あらかじめ反応槽２１の内壁に結合させておいてもよい。

核酸増幅反応は、公知の方法で行うことができる。一例として、核酸増幅反応には、ＰＣＲ法を用いる。また、他の例として、ＬＡＭＰ法などの等温増幅法を用いる。核酸増幅反応の条件は、使用する方法に応じて、適宜設定することができる。

本実施形態においては、上記工程（ｂ１）により、標的核酸用プライマー２の少なくとも一部が、反応槽２１内の液中に遊離している。例えば、図２（ａ）の例では、第１の標的核酸用プライマー２Ｆと第２の標的核酸用プライマー２Ｒの両方が、反応槽２１内の液中に遊離しており、図２（ｂ）及び図２（ｃ）の例では、第２の標的核酸用プライマー２Ｒが反応槽２１内の液中に遊離している。このように、本実施形態においては、プライマーの一部が反応槽２１内の反応液中に遊離しているため、全てのプライマーが反応槽２１の内壁に固定されている場合よりも、プライマーと鋳型核酸配列とのアニーリング効率が高くなる。そのため、効率よく標的核酸配列を増幅することができる。このような効率的な核酸増幅により、より短時間で核酸増幅反応を終了することが可能となる。

［プロトン発生量の測定］
工程（ｄ１）は、核酸増幅反応の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程である。

まず、図３を参照して、核酸伸長反応におけるプロトンの発生について説明する。図３中、Ｂ１〜Ｂ４は、塩基を示す。図３は、Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３の塩基配列を有する核酸に、塩基Ｂ４を有するデオキシヌクレオシド三リン酸が結合して、Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３―Ｂ４の塩基配列を有する核酸が生成する例である。図３に示すように、Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３の塩基配列を有する核酸から、１塩基伸長して、Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３―Ｂ４の塩基配列を有する核酸が生成する際には、１分子のプロトンとピロリン酸が放出される。すなわち、核酸伸長反応によって核酸が１塩基伸長すると、１分子のプロトンが発生する。したがって、核酸伸長反応中、各反応槽２１中のプロトン発生量を測定することにより、核酸伸長が生じたか否か反応槽２１毎に判定することができる。本工程において測定されたプロトン発生量は、後述の工程（ｅ１）における核酸伸長の有無の判定に供される。

反応槽２１内のプロトン発生量の変化は、センサ３０によって検出される。一例として、センサ３０は、ＩＳＦＥＴである。本実施形態に使用可能なＩＳＦＥＴとしては、例えば、国際公開公報ＷＯ２００８／１０７０１４号に記載のもの等を挙げることができる。

センサ３０がＩＳＦＥＴである場合の、プロトン発生量の測定例について説明する。図４に、各反応槽２１に備えられるセンサ３０の構成を示す。センサ３０は、ゲート絶縁膜ＧＩＦと、Ｎ型半導体ＳＮ（ソースｓｒｃ）と、ソース端子ＴＳと、Ｎ型半導体ＳＮ（ドレインｄｒｎ）と、ドレイン端子ＴＤと、Ｐ型半導体ＳＰと、参照電極ＥＲと、ゲート電源ＶＧと、バイアス電源ＶＢと、電流検出器ＣＤとを備える。これら各部の構成については、既知のＩＳＦＥＴと同様であるため、説明を省略する。センサ３０は、溶液とゲート絶縁膜ＧＩＦとの間に発生する界面電位に応じた電流値のドレイン電流を電流検出器ＣＤによって検出することにより、プロトン発生量を測定する。

［核酸増幅の有無の判定］
工程（ｅ１）は、測定された前記プロトン発生量に基づいて、各反応槽内における核酸増幅の有無を判定する工程である。

センサ３０による反応槽２１内のプロトン発生量の測定値が上昇したか否かに基づいて、反応槽２１内での核酸増幅の有無を判定する。反応槽２１内のプロトン発生量が上昇した場合には、核酸増幅が生じたと判定され、反応槽２１内のプロトン発生量の上昇が検出されない場合には、核酸増幅が生じていないと判定される。

本実施形態においては、反応槽２１毎に配置されたセンサ３０によって、個々の反応槽２１内のプロトン発生量を検出し、反応槽２１毎に、核酸増幅の有無を判定する。

本実施形態においては、各反応槽２１に固定化された標的核酸用プライマー２の配列は、予め特定されている。したがって、核酸増幅有と判定された反応槽２１の位置情報と、標的核酸用プライマー２の位置情報とを照合することにより、核酸増幅のあった反応槽２１に固定化された標的核酸用プライマー２の配列を特定することができる。これにより、試料中に含まれる標的核酸配列の種類を特定することができる。

本実施形態の方法によれば、核酸を含む試料において、複数の標的核酸配列を短時間で効率よく検出することができる。

本実施形態の方法は、感染症の原因となる病原体遺伝子の検出・同定や癌などの疾患関連遺伝子の検出・同定、疾患関連遺伝子の発現解析等に利用することができ、感染症や癌などの疾患の診断、治療効果のモニタリング等に有用である。
<第２実施形態>
一例として、本実施形態の方法における標的生体分子は、所望のタンパク質である。また、標的生体分子と結合し得るリガンドは、当該タンパク質に結合し得る抗体（以下「標的抗原検出用抗体」という）である。本実施形態においては、標的生体分子がタンパク質である場合について説明する。

本実施形態の方法は、（ａ２）タンパク質を含む試料を、複数の標的タンパク質の１つに結合し得る第１の標的抗原検出用抗体と、核酸が結合されており、かつ第１の標的抗原検出用抗体と同じ標的タンパク質に結合し得る第２の標的抗原検出用抗体とが固定化された、複数の反応槽に分配する工程と、（ｂ２）前記反応槽内に固定化された前記第２の標的抗原検出用抗体を、前記反応槽内の液中に遊離させる工程と、（ｃ２）前記反応槽内で核酸増幅反応を行う工程と、（ｄ２）前記核酸増幅反応中の各反応槽内のプロトン発生量を測定する工程と、（ｅ２）測定したプロトン発生量に基づいて、前記各反応槽内における核酸増幅の有無を判定する工程と、の各工程を有する。
以下、各工程について説明する。

［反応槽への試料の分配］
工程（ａ２）は、タンパク質を含む試料を、複数の標的タンパク質の１つに結合し得る第１の標的抗原検出用抗体（以下「一次抗体」という）と、核酸が結合されており、かつ前記第１の標的抗原検出用抗体と同じ標的タンパク質に結合し得る第２の標的抗原検出用抗体（以下「二次抗体」という）とが固定化された、複数の反応槽に分配する工程である。

本実施形態においては、図７に例示するように、第１実施形態の標的核酸用プライマー２に替り、一次抗体５と、シグナル生成用核酸３１０が結合された二次抗体３０１とが、反応槽２１に固定化されている。一次抗体５は、目的とする標的タンパク質に特異的に結合し得る抗体である。一次抗体５は、公知の抗体取得方法により、得ることができる。また、一次抗体５は、どのような動物由来のものであってもよい。マウス抗体、ニワトリ抗体、ウサギ抗体等、当技術分野で一般的に用いられる抗体を使用することができる。また、一次抗体５は、キメラ抗体、ヒト化抗体等の組み換え抗体であってもよい。また、一次抗体５は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体等の抗体断片であってもよい。本明細書において、「抗体」という用語は、抗原に対する特異性及び結合性が維持されるこれらの抗体断片を包含する。

本実施形態においては、図７に示すように、反応槽２１には、一次抗体５に加えて、シグナル生成用核酸３１０が結合された二次抗体３０１が固定化されている。二次抗体３０１は、標的タンパク質４００に特異的に結合し得る抗体である。二次抗体３０１は、一次抗体５と同じ抗体であってもよく、違う抗体であってもよい。一例として、二次抗体３０１は、一次抗体５と同一のタンパク質に結合し、異なるエピトープを有する抗体である。

二次抗体３０１には、一例として、図７に示すように、シグナル生成用核酸３１０が結合されている。二次抗体３０１とシグナル生成用核酸３１０との結合は、一例として、アビジン-ビオチン結合を利用して行うことができる。

シグナル生成用核酸３１０は、一例として、図７に示すように、プライマーアニーリング領域３１１とシグナル生成用配列３１２とを含む。プライマーアニーリング領域３１１は、シグナル生成用核酸３１０の３’側に位置している。シグナル生成用核酸３１０は、一例として、複数の反応槽に固定された全ての種類の二次抗体に対して、同じ配列であることができる。また、シグナル生成用核酸３１０は、一例として、プライマーアニーリング領域３１１が、複数の反応槽に固定された全ての種類の二次抗体に対して、同じ配列である。シグナル生成用核酸３１０の配列は、特に限定されず、適宜選択することができる。なお、図７において、３００は、二次抗体３０１にシグナル生成用核酸３１０を結合させた複合体プローブを示す。

一次抗体５及び複合体プローブ３００の反応槽２１への固定は、リソグラフィー技術やスポッティング技術を用いて行うことができる。また、例えば、金ナノ粒子や銀ナノ粒子等の金属ナノ粒子を用いた導電性インクに標的核酸用プライマー２を混合し、プリンティング技術を用いて、反応槽２１に一次抗体５及び複合体プローブ３００を固定化してもよい。

なお、図７では、一次抗体５及び複合体プローブ３００は、それぞれ１分子ずつしか反応槽２１に固定化されていないが、一次抗体５及び複合体プローブ３００は、複数分子が反応槽２１に固定化されていてもよい。反応槽２１の容量に応じて、適切な数の一次抗体５及び複合体プローブ３００が反応槽２１に固定化されていればよい。なお、反応槽２１に対して、２分子以上の一次抗体５及び複合体プローブ３００を固定化する場合、１つの反応槽２１に固定化される一次抗体５及び複合体プローブ３００は、全て同一のタンパク質を標的とする。

複合体プローブ３００は、刺激により、反応槽２１内の液中に遊離するように、反応槽２１に固定化されている。例えば、複合体プローブ３００は、切断部位５０又は固定化用配列５１を介して、反応槽２１の内壁に固定化されている。

図７（ａ）の例では、複合体プローブ３００が、切断部位５０を介して反応槽２１の内壁に固定化されている。切断部位５０は、刺激を加えることによって切断される部位である。切断部位５０としては、第１実施形態と同様に、光切断部位や１本鎖核核酸切断酵素切断部位等が挙げられる。切断部位５０については、第１実施形態と同様である。

また、図７（ｂ）の例では、複合体プローブ３００は、固定化用配列５１を介して、反応槽２１に固定化されている。固定化用配列５１は、シグナル生成用核酸３１０の少なくとも一部に相補的な配列を有する核酸である。この場合、反応槽２１内の温度を固定化用配列５１の融解温度以上に上昇させることにより、複合体プローブ３００は、固定化用配列５１から遊離する。固定化用配列５１についても、第１実施例と同様である。

その他の反応槽の構成は第１実施形態と同様とすることができる。また、タンパク質を含む試料の反応槽への分配も、第１実施形態における核酸を含む試料の反応槽への分配と同様に行うことができる。

本実施形態において、試料はタンパク質を含む試料である。タンパク質を含む試料は、特に限定されず、例えば、生体サンプルや環境サンプルからのタンパク質抽出物等を含む試料等を使用することができる。試料に含まれるタンパク質は、天然タンパク質に限定されず、修飾タンパク質や組み換えタンパク質等であってもよい。

［複合体プローブの遊離］
工程（ｂ２）は、反応槽内に固定化された複合体プローブ３００を、反応槽内の液中に遊離させる工程である。
複合体プローブ３００の遊離は、第１実施形態における第２の標的核酸用プライマー２Ｒの遊離と同様に行うことができる。

一例として、複合体プローブ３００を遊離させた後、反応槽２１は、一次抗体５及び二次抗体３０１が標的タンパク質に結合し得る条件に置かれる。結合条件は、一次抗体５及び二次抗体３０１の種類等に応じて、適宜設定することができる。

一例として、上記結合反応後、反応槽２１を洗浄することにより、標的抗原タンパク質に結合していない複合体プローブ３００を反応槽２１から除去することができる。

［核酸増幅反応］
工程（ｃ２）は、反応槽内で核酸増幅反応を行う工程である。
核酸増幅反応は、第１実施形態の工程（ｃ１）と同様に行うことができる。ただし、本実施形態においては、第１実施形態で用いた試薬に加えて、シグナル生成用プライマー３２０を反応槽２１に添加する。シグナル生成用プライマー３２０は、シグナル生成用核酸３１０のプライマーアニーリング領域３１１に相補的な配列を有し、プライマーアニーリング領域３１１にアニーリングする。一例として、シグナル生成用プライマー３２０は、フォワードプライマーとリバースプライマーの両方を添加してもよい。

本工程では、図７に示すように、シグナル生成用配列３１２を鋳型とする核酸伸長反応が起こる。第１実施形態と同様に、一次抗体５に標的タンパク質４００が結合していない場合には、核酸伸長反応は起こらない。

［プロトン発生量の測定］
工程（ｄ２）は、核酸増幅反応の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程である。本工程は、第１実施形態の工程（ｄ１）と同様に行うことができる。

［核酸増幅の有無の判定］
工程（ｅ２）は、測定された前記プロトン発生量に基づいて、各反応槽内における核酸増幅の有無を判定する工程である。本工程は、第１実施形態の工程（ｅ２）と同様に行うことができる。

本実施形態においては、各反応槽２１に固定化された一次抗体５は、予め特定されている。したがって、核酸増幅有と判定された反応槽２１の位置情報と、一次抗体５の位置情報とを照合することにより、核酸増幅のあった反応槽２１に固定化された一次抗体５の標的タンパク質を特定することができる。これにより、試料中に含まれる標的タンパク質の種類を特定することができる。

本実施形態の方法によれば、タンパク質を含む試料において、複数の標的タンパク質を短時間で効率よく検出することができる。

本実施形態の方法は、感染症の原因となる病原体抗原の検出・同定や癌などの疾患関連遺伝子の検出・同定、疾患関連遺伝子の発現解析等に利用することができ、感染症や癌などの疾患の診断、治療効果のモニタリング等に有用である。

＜標的生体分子特定装置＞
［標的核酸配列検出装置の構成例］
上述した第１実施形態の方法を実現する標的核酸配列検出装置２００の構成の一例について、図５を参照して説明する。
図５は、本実施形態における標的核酸配列検出装置２００の構成の一例を示す図である。標的核酸配列検出装置２００は、反応槽配置基板２０と、演算装置２１０とを備える。
反応槽配置基板２０は、反応槽２１と、センサ３０とをそれぞれ複数備える。１つの反応槽２１には、所定の標的核酸用プライマー２が切断部位５０又は固定化用配列５１を介して固定化される。

演算装置２１０は、例えばＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）を備えており、その機能部としての核酸増幅判定部２１１を備えている。

核酸増幅判定部２１１は、センサ３０が検出する反応槽２１毎のプロトンの発生量に基づいて、反応槽２１内における核酸増幅の有無を反応槽２１毎に判定する。具体的には、核酸増幅判定部２１１は、センサ３０の出力電流値と、プロトンの発生量との対応を示す情報を予め有している。核酸増幅判定部２１１は、センサ３０の出力電流値を取得し、取得した出力電流値に基づいて、プロトンの発生量を推定する。核酸増幅判定部２１１は、推定したプロトンの発生量に基づいて、核酸増幅の有無を判定する。ここで、センサ３０は反応槽２１毎に備えられている。核酸増幅判定部２１１は、反応槽２１毎にセンサ３０の出力電流値を取得することにより、核酸増幅の有無を反応槽２１毎に判定する。

本実施形態の標的核酸配列検出装置２００によれば、複数の標的核酸配列について、核酸増幅の有無を複数の反応槽２１において同時に検出することができる。すなわち、本実施形態の標的核酸配列検出装置２００によれば、核酸を含む試料において、複数の標的核酸配列の有無を効率よく検出することができる。

なお、演算装置２１０は、その機能部としての標的核酸配列特定部２１２と、核酸配列記憶部２１３とを更に備えていてもよい。上述した標的核酸用プライマー２の配列情報と、反応槽２１との対応関係は、演算装置２１０が備える核酸配列記憶部２１３に記憶されている。この核酸配列記憶部２１３の構成の具体例について、図５を参照して説明する。

図６は、本実施形態における核酸配列記憶部２１３の構成の一例を示す図である。核酸配列記憶部２１３には、反応槽ＩＤと、標的核酸用プライマー２の配列を示す情報とが、互いに対応付けられて記憶されている。ここで、反応槽ＩＤとは、反応槽２１の位置を識別する情報である。反応槽ＩＤと、当該反応槽ＩＤが示す反応槽２１に備えられるセンサ３０とが互いに対応づけられている。例えば、反応槽ＩＤ（Ｗ１１）は、ウエルＷ１１に備えられるセンサ３０−１１に対応付けられている。

標的核酸配列特定部２１２は、核酸増幅有と判定する反応槽２１の反応槽ＩＤに基づいて、当該反応槽２１に固定化された標的核酸用プライマー２の配列を特定する。具体的には、標的核酸配列特定部２１２は、核酸増幅有と判定する反応槽２１の反応槽ＩＤが（Ｗ１１）である場合には、標的核酸用プライマー配列Ａを標的核酸用プライマー２の配列として特定する。

本実施形態の標的核酸配列検出装置２００によれば、核酸を含む試料において、核酸増幅有又は核酸増幅無と判定された標的核酸配列を、複数の反応槽２１において同時に検出することができる。すなわち、本実施形態の標的核酸配列検出装置２００によれば、核酸を含む試料において、複数の標的核酸配列を効率よく検出することができる。

本実施形態の標的核酸配列検出装置２００は、感染症の原因となる病原体遺伝子の検出・同定や癌などの疾患関連遺伝子の検出・同定、疾患関連遺伝子の発現解析等に利用することができ、感染症や癌などの疾患の診断、治療効果のモニタリング等に有用である。

なお、本実施形態の標的核酸配列検出装置２００の各処理を実行するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、当該記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することにより、上述した種々の処理を行ってもよい。

なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものであってもよい。また、「コンピュータシステム」は、ＷＷＷシステムを利用している場合であれば、ホームページ提供環境（あるいは表示環境）も含むものとする。また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、フラッシュメモリ等の書き込み可能な不揮発性メモリ、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。

さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムが送信された場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリ（例えばＤＲＡＭ（Dynamic Random Access Memory））のように、一定時間プログラムを保持しているものも含むものとする。また、上記プログラムは、このプログラムを記憶装置等に格納したコンピュータシステムから、伝送媒体を介して、あるいは、伝送媒体中の伝送波により他のコンピュータシステムに伝送されてもよい。ここで、プログラムを伝送する「伝送媒体」は、インターネット等のネットワーク（通信網）や電話回線等の通信回線（通信線）のように情報を伝送する機能を有する媒体のことをいう。また、上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであっても良い。さらに、前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるもの、いわゆる差分ファイル（差分プログラム）であってもよい。

［標的タンパク質特定装置の構成例］
上述した第２実施形態の方法を実現する標的タンパク質検出装置の構成は、上述の標的核酸配列検出装置２００において、核酸配列記憶部２１３に替えて抗原記憶部２１４、標的核酸配列特定部２１２に替えて標的タンパク質特定部を備えたものとすることができる。図８は、抗原記憶部２１４の構成の一例を示す図である。抗原記憶部２１４には、反応槽ＩＤと、一次抗体５の抗原を示す情報とが、互いに対応付けられて記憶されている。

本実施形態の標的核タンパク質検出装置によれば、タンパク質を含む試料において、核酸増幅有又は核酸増幅無と判定された反応槽２１における一次抗体５の標的タンパク質を、複数の反応槽２１において同時に検出することができる。すなわち、本実施形態の標的タンパク質検出装置によれば、タンパク質を含む試料において、複数の標的タンパク質を効率よく検出することができる。

本実施形態の標的タンパク質検出装置は、感染症の原因となる病原体抗原の検出・同定や癌などの疾患関連遺伝子の検出・同定、疾患関連遺伝子の発現解析等に利用することができ、感染症や癌などの疾患の診断、治療効果のモニタリング等に有用である。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。

２…標的核酸用プライマー、５…一次抗体、２０…反応槽配置基板、２１…反応槽、３０…センサ、５０…切断部位、５１…固定化用配列、２００…標的核酸配列検出装置、２１１…核酸増幅判定部、２１２…標的核酸配列特定部、２１３…核酸配列記憶部、２１４…抗原記憶部、３００…複合体プローブ、３０１…二次抗体、３１０…シグナル生成用核酸、３１１…プライマーアニーリング領域、３１２…シグナル生成用配列、３２０…シグナル生成用プライマー、４００…標的タンパク質

Claims (10)

1. 標的生体分子の検出方法であって、
   （ａ）生体分子を含む試料を、複数の標的生体分子の１つに結合し得る第１のリガンドと、少なくとも１部に核酸を含み、前記第１の生体分子と同じ標的生体分子に結合し得る第２のリガンドとが固定化された、複数の反応槽に分配する工程と、
   （ｂ）前記反応槽内に固定化された前記第２のリガンドを、前記反応槽内の液中に遊離させる工程と、
   （ｃ）前記反応槽内で核酸増幅反応を行う工程と、
   （ｄ）前記核酸増幅反応中の各反応槽内のプロトン発生量を測定する工程と、
   （ｅ）測定したプロトン発生量に基づいて、前記各反応槽内における核酸増幅の有無を判定する工程と、
   を含む、標的生体分子の検出方法。
2. 前記第２のリガンドは、前記反応槽に固定化される側に光切断部位を有し、
   前記前記第２のリガンドの遊離が、前記反応槽に対する光照射により行われることを特徴とする、請求項１に記載の標的生体分子の検出方法。
3. 前記第２のリガンドは、前記反応槽に固定化される側に１本鎖核酸切断酵素切断部位を有し、
   前記第２のリガンドの遊離が、前記反応槽に対する１本鎖核酸切断酵素の添加により行われることを特徴とする、請求項１に記載の標的生体分子の検出方法。
4. 前記第２のリガンドが、前記第２のリガンドに含まれる核酸と相補的な配列を有する核酸を介して、前記反応槽内に固定化されており、
   前記第２のリガンドの遊離が、前記反応槽内の温度を上昇させることにより行われることを特徴とする、請求項１に記載の標的生体分子の検出方法。
5. 前記標的生体分子が核酸であり、前記第１のリガンドと前記第２のリガンドとが、前記標的生体分子である核酸にアニーリングし得るプライマーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の標的生体分子の検出方法。
6. 前記標的生体分子がタンパク質であり、前記第１のリガンドと前記第２のリガンドが、前記標的生体分子であるタンパク質に結合し得る抗体を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の標的生体分子の検出方法。
7. 前記工程（ｃ）の核酸増幅反応が、ＰＣＲ法又は等温増幅法により行われることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の標的生体分子の検出方法。
8. 前記工程（ｄ）のプロトン発生量の測定が、ＩＳＦＥＴにより行われることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の標的生体分子の検出方法。
9. 複数の標的生体分子の１つに結合し得る第１のリガンドと、少なくとも１部に核酸を含み、第１の生体分子と同じ標的生体分子に結合し得る第２のリガンドとが固定化されており、前記第２のリガンドは、光切断部位、１本鎖核酸切断酵素切断部位又は前記第２のリガンドに含まれる核酸と相補的な配列を有する核酸を介して固定化されている反応槽を複数備える、標的生体分子検出用基板。
10. 複数の標的生体分子の１つに結合し得る第１のリガンドと、少なくとも１部に核酸を含み、第１の生体分子と同じ標的生体分子に結合し得る第２のリガンドとが固定化されており、前記第２のリガンドは、光切断部位、１本鎖核酸切断酵素切断部位又は前記第２の核酸に含まれる核酸と相補的な配列を有する核酸を介して固定化されている、複数の反応槽と、
    前記反応槽内での核酸増幅反応によって生じるプロトンを前記反応槽毎に検出する検出部と、
    前記検出部が検出する前記反応槽毎のプロトンの発生量に基づいて、前記反応槽内における核酸増幅の有無を前記反応槽毎に判定する核酸増幅判定部と、
    を備える標的生体分子検出装置。

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