WO2017204294A1 - 標的生体分子の特定方法、標的生体分子特定用ビーズ、ビーズのセット、及び標的生体分子特定装置 - Google Patents

標的生体分子の特定方法、標的生体分子特定用ビーズ、ビーズのセット、及び標的生体分子特定装置 Download PDF

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bead
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田中　修平
了 濱田
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a target biomolecule identification method, a target biomolecule identification bead, a bead set, and a target biomolecule identification apparatus.
  • a primer is bound to a bead via a photocleavage site, the primer captures the nucleic acid in the sample, the primer is photoinduced cleaved, PCR is performed, and the target nucleic acid is A technique for amplifying and analyzing an amplification product is known (see Patent Document 1).
  • Patent Document 1 A technique for amplifying and analyzing an amplification product is known (see Patent Document 1).
  • Patent Document 1 when analyzing an amplification product, it was necessary to collect a bead emulsion and perform sequence analysis or the like.
  • One embodiment of the present invention is: (A) A plurality of beads in which a ligand capable of binding a sample containing a biomolecule to one of a plurality of target biomolecules and a bead identifying nucleic acid having a specific sequence for each type of the ligand are immobilized Contacting with, (B) arranging the plurality of beads in contact with the sample for each bead in a separate reaction vessel; (C) adding a reagent necessary for a nucleic acid extension reaction to the reaction vessel in which the beads are arranged; (D) performing a nucleic acid extension reaction in the reaction vessel in which the beads are disposed; (E) measuring a proton generation amount in each reaction tank during the nucleic acid extension reaction; (F) determining the presence or absence of nucleic acid elongation in each reaction vessel based on the proton generation amount; (G) performing a nucleic acid extension reaction using the bead-identifying nucleic acid as a template in the reaction vessel in which the beads are disposed
  • One embodiment of the present invention is a target biomolecule identifying bead in which a ligand capable of binding to a target biomolecule and a bead identifying nucleic acid having a specific sequence for each type of the ligand are immobilized.
  • One embodiment of the present invention includes a plurality of beads for identifying a target biomolecule in which a ligand capable of binding to a target biomolecule and a bead identifying nucleic acid having a specific sequence for each type of the ligand are immobilized. , A set of beads for identifying target biomolecules.
  • a plurality of beads each having a ligand capable of binding to one of a plurality of target biomolecules and a bead-identifying nucleic acid having a specific sequence for each type of the ligand,
  • a reaction vessel arranged for each bead, a detection unit for detecting for each reaction vessel protons generated by a nucleic acid extension reaction in the reaction vessel in which the beads are arranged, and the reaction vessel for detection by the detection unit
  • a nucleic acid extension determination unit that determines for each reaction tank whether or not nucleic acid is elongated in the reaction tank based on the amount of proton generated for each reaction; and the nucleic acid extension determination for a nucleic acid extension reaction using the bead specifying nucleic acid as a template.
  • a bead specifying unit for specifying the sequence of the bead specifying nucleic acid for each reaction tank based on the presence or absence of nucleic acid extension determined by the unit, and the bead specifying nucleic acid specified by the bead specifying unit Based on the sequence, and the target biomolecule specifying unit that specifies a type of the target ligand for each of the reaction vessel, is a target biomolecule specific apparatus comprising a.
  • the method for identifying a target biomolecule of this embodiment is as follows: (A) A plurality of beads in which a ligand capable of binding a sample containing a biomolecule to one of a plurality of target biomolecules and a bead identifying nucleic acid having a specific sequence for each type of the ligand are immobilized Contacting with, (B) arranging the plurality of beads in contact with the sample for each bead in a separate reaction vessel; (C) adding a reagent necessary for a nucleic acid extension reaction to the reaction vessel in which the beads are arranged; (D) performing a nucleic acid extension reaction in the reaction vessel in which the beads are disposed; (E) measuring a proton generation amount in each reaction tank during the nucleic acid extension reaction; (F) determining the presence or absence of nucleic acid elongation in each reaction vessel based on the proton generation amount; (G) performing a nucleic acid extension reaction using the bead-identifying nucleic acid as a template in the
  • the target biomolecule in the method of the present embodiment is a nucleic acid having a desired target nucleic acid sequence.
  • the ligand capable of binding to the target biomolecule is a primer that can anneal to the target nucleic acid sequence (hereinafter referred to as “target nucleic acid primer”).
  • target nucleic acid primer a primer that can anneal to the target nucleic acid sequence
  • the method of this embodiment is (A1) A target nucleic acid primer capable of annealing a nucleic acid-containing sample with one of a plurality of target nucleic acid sequences, and a bead identifying nucleic acid having a specific sequence for each type of the target nucleic acid primer.
  • a step of contacting with a plurality of beads (B1) arranging the plurality of beads in contact with the sample for each bead in a separate reaction tank; (C1) adding a reagent necessary for a nucleic acid extension reaction to the reaction vessel in which the beads are arranged; (D1) performing a nucleic acid extension reaction in the reaction vessel in which the beads are disposed; (E1) measuring the amount of proton generation in each reaction tank during the nucleic acid extension reaction; (F1) a step of determining the presence or absence of nucleic acid elongation in each reaction tank based on the proton generation amount; (G1) In the reaction vessel in which the beads are arranged, a nucleic acid extension reaction is performed using the bead specifying nucleic acid as a template, Based on the amount of protons generated in each reaction vessel during a nucleic acid extension reaction using the bead specifying nucleic acid as a template, the bead specifying nucleic acid sequence is specified for each reaction vessel, Identifying the type of
  • a target nucleic acid primer capable of annealing a sample containing a nucleic acid to one of a plurality of target nucleic acid sequences, and a bead specifying nucleic acid having a specific sequence for each type of the target nucleic acid primer It is a step of contacting with a plurality of immobilized beads.
  • 1 is a bead
  • 2 is a primer for target nucleic acid
  • 10 is a nucleic acid for specifying bead
  • 11 is a primer annealing region for specifying bead
  • 12 is a sequence region for specifying bead
  • 100 is a primer for target nucleic acid 2
  • the bead body to which the bead specifying nucleic acid 10 is immobilized is shown.
  • the bead 1 is used as a carrier for immobilizing the target nucleic acid primer 2 and the bead specifying nucleic acid 10.
  • the shape of the beads 1 is a spherical shape or a shape close thereto.
  • the shape of the beads 1 is not limited to this.
  • the beads 1 have an average diameter of 1 to 250 ⁇ m.
  • the size of the beads 1 has an average diameter of 30 to 80 ⁇ m. The size of the beads 1 is not limited to these.
  • the material of the beads 1 is not particularly limited, and examples thereof include silicon, titanium dioxide, aluminum oxide, glass, polystyrene, cellulose, and polyamide. Moreover, you may use a magnetic bead from a viewpoint of arrangement
  • the beads 1 may be composed of not only one kind of substance but also two or more kinds of substances.
  • the beads 1 may be surface-coated.
  • a target nucleic acid primer 2 and a bead specifying nucleic acid 10 are immobilized on a bead 1. Immobilization of these nucleic acids to the beads 1 can be performed using a known method.
  • the target nucleic acid primer 2 and the bead specifying nucleic acid 10 are modified with biotin, and the surface of the bead 1 is coated with avidin to immobilize both nucleic acids on the bead 1 using the avidin-biotin bond. be able to.
  • target nucleic acid primer 2 and the bead specifying nucleic acid 10 are modified with a functional group such as an amino group, formyl group, or SH group, and the bead 1 is surfaced with a silane coupling agent having an amino group, formyl group, epoxy group, or the like. Immobilization may be performed by processing.
  • the target nucleic acid primer 2 has a sequence that can be annealed to the target nucleic acid sequence.
  • the target nucleic acid primer 2 is a nucleic acid having a sequence complementary to a part of the target nucleic acid sequence.
  • the target nucleic acid primer 2 anneals to the target nucleic acid sequence and induces a nucleic acid extension reaction using the target nucleic acid sequence as a template.
  • the target nucleic acid primer 2 is DNA.
  • the sequence of the target nucleic acid primer 2 can be appropriately selected according to the target nucleic acid sequence of interest. In this embodiment, a target nucleic acid primer 2 having a different sequence is immobilized on each bead 1.
  • a bead specifying nucleic acid 10 is immobilized on the bead 1.
  • the bead specifying nucleic acid 10 is for specifying the sequence of the target nucleic acid primer 2 immobilized on the bead 1 for each reaction tank after the beads 1 are placed in the reaction tank.
  • the bead specifying nucleic acid 10 those having different sequences depending on the type of the target nucleic acid sequence of the target nucleic acid primer 2 are immobilized.
  • the bead specifying nucleic acid 10 is DNA.
  • the bead specifying nucleic acid 10 has a bead specifying primer annealing region 11 and a bead specifying sequence region 12.
  • the bead specifying primer annealing region 11 has the same sequence in all beads 1.
  • the bead specifying sequence region 12 has a different sequence depending on the type of the target nucleic acid sequence of the target nucleic acid primer 2.
  • the bead specifying primer annealing region 11 is arranged on the 3 ′ side of the bead specifying nucleic acid 10.
  • only one molecule of the target nucleic acid primer 2 and the bead specifying nucleic acid 10 is immobilized on the bead 1, but the number of molecules of these nucleic acids immobilized on the bead 1.
  • the number of molecules of these nucleic acids immobilized on the bead 1. is not limited to one molecule.
  • two or more target nucleic acid primers 2 targeting the same target nucleic acid sequence may be immobilized on the beads 1, and two or more bead identifying nucleic acids 10 having the same sequence may be immobilized on the beads 1.
  • two or more molecules of the target nucleic acid primer 2 and the bead specifying nucleic acid 10 are immobilized on the beads 1.
  • the target nucleic acid primer 2 and the bead specifying nucleic acid 10 need only be immobilized at a density that does not interfere with the annealing and extension reaction according to the surface area of the beads 1.
  • the target nucleic acid primers 2 immobilized on one bead 1 are all the same target nucleic acid.
  • Target the sequence.
  • all the bead specifying nucleic acids 10 immobilized on one bead 1 have the same sequence.
  • the bead body 100 in which the target nucleic acid primer 2 and the bead specifying nucleic acid 10 are immobilized on the beads 1 is brought into contact with a sample containing nucleic acids.
  • the sample containing a nucleic acid is not specifically limited,
  • the sample etc. which contain the nucleic acid extract etc. from a biological sample or an environmental sample can be used.
  • the nucleic acid contained in the sample is DNA. Examples of DNA include cDNA and genomic DNA.
  • the nucleic acid contained in the sample is not limited to DNA, but may be RNA or modified nucleic acid.
  • the contact between the bead body 100 and the sample containing the nucleic acid can be performed, for example, by mixing the bead body 100 and the sample containing the nucleic acid.
  • the mixture of the bead body 100 and the sample containing nucleic acid is placed under conditions that allow the target nucleic acid primer 2 to anneal with the target nucleic acid.
  • the annealing conditions can be appropriately set according to the length of the target nucleic acid primer 2 and the like.
  • 3 indicates a target nucleic acid.
  • the target nucleic acid 3 has a target nucleic acid sequence in the sequence, and the target nucleic acid primer 2 can be annealed to at least a part of the target nucleic acid sequence. Therefore, when the target nucleic acid of the target nucleic acid primer 2 is contained in the sample, the target nucleic acid primer 2 anneals to the target nucleic acid 3 as shown in FIG. Be captured. On the other hand, when the target nucleic acid of the target nucleic acid primer 2 is not contained in the sample, the target nucleic acid primer 2 does not anneal with the nucleic acid in the sample.
  • the bead body 100 in which the target nucleic acid primer 2 is annealed to the target nucleic acid and the bead body 100 in which the target nucleic acid primer 2 is not annealed to the target nucleic acid
  • a mixture of is formed.
  • the target nucleic acid primer 2a and the target nucleic acid primer 2d are annealed to the target nucleic acid 3a and the target nucleic acid 3d, respectively.
  • the target nucleic acid primer 2b and the target nucleic acid primer 2c are not annealed to the target nucleic acid.
  • the number of the bead bodies 100 brought into contact with the sample can be appropriately selected according to the number of target nucleic acids to be detected.
  • Step (b1) is a step of placing the bead body 100 brought into contact with the sample containing nucleic acid in a separate reaction tank for each bead.
  • the step (b1) of the present embodiment will be described with reference to FIG.
  • 20 is a substrate for bead arrangement
  • 21 is a reaction vessel.
  • the material of the bead arrangement substrate 20 is not particularly limited, but may be glass, silicon, polymer, or the like.
  • the entire bead arrangement substrate of the reaction tank 21 generated when particles such as fine dust are sandwiched between the reaction tank 21 and the bead arrangement substrate 20.
  • a plurality of reaction vessels 21 are arranged on the bead arrangement substrate 20.
  • the number of reaction tanks 21 to be arranged needs to be equal to or more than the number of bead bodies 100 used in step (a1).
  • the size of the reaction vessel 21 is slightly larger than the bead 1.
  • the size of the reaction vessel 21 is about 1 to 2 times the size of the beads 1 and is large enough to accommodate one bead 1.
  • the surface of the bead-arranging substrate 20 and the inner wall of the reaction vessel 21 are blocking agents that prevent non-specific adsorption of nucleic acids and the like, such as polyethylene glycol (PEG), 2-metheoyloxyoxyphosphorylcholine (MPC), etc. It may be coated with.
  • the inner wall of the reaction vessel 21 is hydrophilized. Since the inner wall is hydrophilized, the efficiency of filling the bead body 100 into the reaction vessel 21 is improved when the dispersion liquid of the bead body 100 is dropped onto the bead placement substrate 20.
  • the reaction vessel 21 is provided with a sensor 30 for detecting the hydrogen concentration.
  • the sensor 30 is disposed on the bottom surface of the reaction vessel 21.
  • the sensor 30 is an ion sensitive field effect transistor (ISFET).
  • a plurality of bead bodies 100 brought into contact with a sample containing nucleic acid are arranged one by one in the reaction vessel 21.
  • the method for disposing the bead body 100 in the reaction vessel 21 is not particularly limited.
  • a liquid in which the bead body 100 is dispersed is dropped onto the bead disposition substrate 20 and stirred, shaken, centrifuged, or the like.
  • the bead body 100 may be guided to the reaction vessel 21.
  • the bead arrangement substrate 20 may be immersed in the dispersion of the bead body 100, and means such as stirring, shaking, and centrifugation may be used.
  • a magnetic plate and a magnet can be arranged under the substrate material of the bead arrangement substrate 20, and the bead body 100 can be guided to the reaction vessel by the magnetic force of the magnet. .
  • the strength of the magnetic field applied to the bead arranging substrate 20 by the magnet is not particularly limited, but is 100 to 10,000 gauss as an example.
  • the magnetization of the magnetic plate remains after the magnet is removed, the bead body 100 can continue to maintain a stable arrangement.
  • metals such as nickel, nickel alloys, iron and iron alloys can be suitably used.
  • Step (c1) is a step of adding a reagent necessary for the nucleic acid extension reaction to the reaction vessel in which the beads are arranged.
  • reagents necessary for the nucleic acid extension reaction include DNA polymerase, deoxynucleoside triphosphate, an appropriate buffer, and the like.
  • the DNA polymerase is a heat-resistant DNA polymerase such as Taq polymerase or a strand displacement DNA polymerase.
  • the reagent necessary for the nucleic acid extension reaction can be appropriately selected according to the method of the nucleic acid extension reaction performed in the step (d1) described later. As an example, some reagents such as DNA polymerase may not be added in this step but may be bound to the inner wall of the reaction vessel 21 in advance.
  • a reverse primer can be added in this step.
  • the reverse primer may be a universal primer common to all target nucleic acid sequences, or may be a primer specific for each target nucleic acid sequence.
  • the reverse primer can be immobilized on the beads 1.
  • the reverse primer is a universal primer common to all target nucleic acid sequences
  • the universal reverse primer can be immobilized on the inner wall of the reaction vessel 21.
  • the reverse primer has, for example, a light cutting site on the bead 1 side or the inner wall side of the reaction vessel 21.
  • the photocleavage site refers to a group having a property of being cleaved when irradiated with light such as ultraviolet rays. Examples of the group using such a group include PC Linker Phosphoramidite (Glen research) and nucleic acids containing fullerene.
  • the reverse primer may have a single-stranded nucleic acid cleaving enzyme cleavage site.
  • the single-stranded nucleic acid cleaving enzyme cleavage site refers to a nucleic acid group that can be cleaved by a single-stranded nucleic acid cleaving enzyme such as deoxyribonuclease and ribonuclease, and includes nucleotides and derivatives thereof. Examples of such a nucleic acid group include deoxyiocin recognized by endonuclease V.
  • nucleic acid amplification reaction Prior to the start of the nucleic acid amplification reaction, it is possible to efficiently carry out the nucleic acid amplification reaction by carrying out light irradiation or single-stranded nucleic acid cleaving enzyme treatment to separate the reverse primer from the bead 1.
  • Step (d1) is a step of performing a nucleic acid extension reaction in a reaction vessel in which beads are arranged.
  • the nucleic acid extension reaction can be performed by a known method using DNA polymerase or the like.
  • the conditions for the nucleic acid extension reaction can be appropriately set according to the method used.
  • the nucleic acid extension reaction may be performed while maintaining the temperature in the reaction vessel 21 at about 55 to 70 ° C.
  • one bead body 100 is arranged in the reaction tank 21, one bead body 100 is arranged. As shown in FIG. 3, in the bead body 100 in which the target nucleic acid primer 2 is annealed to the target nucleic acid 3, a nucleic acid extension reaction occurs using the target nucleic acid 3 as a template. On the other hand, in the bead body 100 in which the target nucleic acid primer 2 is not annealed to the target nucleic acid 3, no nucleic acid extension reaction occurs.
  • the nucleic acid extension reaction is not necessarily a nucleic acid amplification reaction.
  • the density of the target nucleic acid primer 2 immobilized on the beads 1 is high, protons sufficient for detection are generated in one extension reaction.
  • the nucleic acid extension reaction is performed only once, it is not necessary to add a reverse primer to the reaction tank 21.
  • a nucleic acid amplification reaction can also be performed.
  • a publicly known method can be used for the method of nucleic acid amplification reaction.
  • the PCR method is used for the nucleic acid amplification reaction.
  • an isothermal amplification method such as the LAMP method is used.
  • Step (e1) is a step of measuring the amount of proton generation in each reaction tank of the nucleic acid extension reaction.
  • FIG. 4 is an example in which a nucleic acid having a base sequence of B1-B2-B3-B4 is generated by binding a deoxynucleoside triphosphate having a base B4 to a nucleic acid having a base sequence of B1-B2-B3. .
  • a nucleic acid having a base sequence of B1-B2-B3-B4 is produced by extending one base from a nucleic acid having the base sequence of B1-B2-B3, one molecule of proton And pyrophosphate are released.
  • nucleic acid extension reaction when a nucleic acid is extended by one base by a nucleic acid extension reaction, one molecule of proton is generated. Therefore, during the nucleic acid extension reaction, it is possible to determine for each reaction tank 21 whether or not nucleic acid extension has occurred by measuring the amount of proton generated in each reaction tank 21. The amount of proton generation measured in this step is used for determination of the presence or absence of nucleic acid elongation in step (f1) described later.
  • the amount of protons generated in the reaction tank 21 is detected by the sensor 30.
  • the sensor 30 is an ISFET as an example. Examples of the ISFET that can be used in the present embodiment include those described in International Publication No. WO2008 / 107014.
  • the sensor 30 includes a gate insulating film GIF, an N-type semiconductor SN (source src), a source terminal TS, an N-type semiconductor SN (drain drn), a drain terminal TD, a P-type semiconductor SP, and a reference electrode ER. , A gate power supply VG, a bias power supply VB, and a current detector CD. Since the configuration of each part is the same as that of a known ISFET, description thereof is omitted.
  • the sensor 30 measures the amount of proton generation by detecting a drain current having a current value corresponding to the interface potential generated between the solution and the gate insulating film GIF by the current detector CD.
  • Step (f1) is a step of determining the presence or absence of nucleic acid elongation in each reaction tank based on the proton generation amount measured in step (e1). Based on the measurement of the proton generation amount in the reaction tank 21 by the sensor 30, the presence or absence of nucleic acid elongation in the reaction tank 21 is determined. If proton generation is detected in the reaction tank 21, it is determined that nucleic acid elongation has occurred. If proton generation in the reaction tank 21 is not detected, it is determined that nucleic acid extension has not occurred.
  • a change in proton concentration in each reaction tank 21 is detected by a sensor 30 arranged for each reaction tank 21, and the presence or absence of nucleic acid elongation is determined for each reaction tank 21.
  • the bead arrangement substrate 20 includes 36 reaction vessels 21 as shown in FIG. 3, numbers 1 to 36 are assigned to the reaction vessels 21.
  • a sensor 30 is provided for each reaction tank 21, and it is possible to specify in which reaction tank 21 the nucleic acid extension reaction has occurred depending on which sensor 30 has detected the generation of protons. That is, based on the output of the sensor 30, the number of the reaction tank 21 in which the nucleic acid extension reaction has occurred is specified.
  • the types of the bead body 100 include a plurality of types according to the sequence type of the target nucleic acid primer 2. It is not specified which kind of bead body 100 is arranged in which reaction tank 21 among a plurality of reaction tanks 21. That is, even if the number of the reaction tank 21 in which the nucleic acid extension reaction has occurred is specified by the sensor 30, the type of the sequence of the target nucleic acid primer 2 in which the nucleic acid extension reaction has occurred is not specified.
  • the specific procedure of the target nucleic acid primer 2 in each reaction tank will be described.
  • step (g1) a nucleic acid extension reaction using the bead specifying nucleic acid as a template is performed in the reaction vessel in which the beads are arranged, and protons are generated in each reaction vessel during the nucleic acid extension reaction using the bead specifying nucleic acid as a template.
  • the sequence of the bead specifying nucleic acid is specified for each reaction tank, and the type of the target nucleic acid primer is specified for each reaction tank based on the sequence of the bead specifying nucleic acid specified for each reaction tank. It is a process.
  • a bead specifying nucleic acid 10 is immobilized on the bead 1.
  • the type of sequence of the bead specifying nucleic acid 10 and the type of the target nucleic acid sequence of the target nucleic acid primer 2 have a 1: 1 correspondence. Therefore, by specifying the type of sequence of the bead specifying nucleic acid 10, the type of sequence of the target nucleic acid primer 2 can also be specified.
  • the bead specifying nucleic acid 10 includes a bead specifying primer annealing region 11 and a bead specifying sequence region 12, as shown in FIG.
  • the bead specifying primer annealing region 11 is a region for annealing the bead specifying primer when performing nucleic acid extension using the bead specifying sequence region 12 as a template.
  • the sequence of the bead specifying primer annealing region 11 is, for example, the same sequence in all the bead bodies 100. Further, as an example, the sequence of the bead specifying primer annealing region 11 may be changed for each fixed number of bead bodies 100.
  • the primers corresponding to the sequence of the used bead specifying primer annealing region 11 when performing nucleic acid extension using the bead specifying sequence region described later as a template.
  • the sequence of the bead specifying primer annealing region is not particularly limited, and an appropriate primer may be designed to have a sequence complementary to the primer.
  • the bead specifying sequence region 12 is a region for specifying the target nucleic acid primer 2 immobilized on the bead 1.
  • the sequence of the bead specifying sequence region 12 differs depending on the type of the sequence of the target nucleic acid primer 2 immobilized on the same bead 1 and has a 1: 1 correspondence with the type of the target sequence of the target nucleic acid primer 2.
  • the bead specifying sequence region 12 is either a continuous sequence of adenine (A), a continuous sequence of guanine (G), a continuous sequence of cytosine (C), or a continuous sequence of thymine (T). It is a combination of these continuous sequences.
  • the bead specifying sequence region 12 is a sequence in which each continuous sequence of adenine (A), thymine (T), guanine (G), and cytosine (C) is arranged in the order described above.
  • each bead specifying sequence region 12 is a sequence in which consecutive sequences of adenine (A), thymine (T), guanine (G), and cytosine (C) are combined. Yes.
  • the order of each continuous array of adenine (A), thymine (T), guanine (G), and cytosine (C) is the same order in all the bead specifying array regions 12.
  • a continuous sequence of each base is linked in the order of adenine (A), thymine (T), guanine (G), and cytosine (C). ing.
  • Each of the bead specifying sequence regions 12a to 12d has a different number of bases in the continuous sequence.
  • adenine (A), thymine (T), guanine (G), and cytosine (C) are consecutive in the same number.
  • Adenine (A) and guanine (G) have a larger number in the continuous sequence than thymine (T) and cytosine (C).
  • the bead specifying sequence region 12 need not include all four types of bases.
  • thymine (T) is not included, and the bead specifying sequence region 12d is not included. In this example, only the adenine (A) is arranged.
  • a method for identifying the bead identifying nucleic acid disposed in each reaction vessel will be described. Since the bead bodies 100 are randomly arranged in each reaction tank 21, it is not known which bead specifying nucleic acid 10 is arranged in which reaction tank 21. Therefore, as an example, a nucleic acid extension reaction is performed using the bead specifying sequence region 12 as a template, and the sequence of the bead specifying nucleic acid 10 is specified for each reaction tank based on the amount of protons generated during the nucleic acid extension reaction. In the example of FIG. 6, the sequence of the bead specifying nucleic acid 10 can be specified by the following procedure.
  • a thymidine (T) continuous sequence is synthesized using the adenine (A) continuous sequence in the bead specifying sequence region 12 as a template. Is done. Along with this, protons are generated, and the amount of proton generation varies depending on the length of the adenine (A) continuous array in the bead specifying array region 12. In the example of FIG. 6, the amount of proton generation increases in the order of the bead specifying array regions 12a, 12b, 12c, and 12d.
  • dATP is added to the reaction tank 21 to perform a nucleic acid extension reaction.
  • an adenine (A) continuous sequence is synthesized using the thymine (T) continuous sequence in the bead specifying sequence region 12 as a template.
  • protons are generated, and the amount of proton generation varies depending on the length of the continuous thymine (T) array in the bead specifying array region 12.
  • the amount of proton generation increases in the order of the bead specifying array regions 12b and 12a, and no proton is generated in the bead specifying array regions 12c and 12d.
  • a nucleic acid extension reaction is also performed with dCTP and dGTP.
  • a cytosine (C) continuous sequence is synthesized using the guanine (G) continuous sequence in the bead specifying sequence region 12 as a template.
  • a guanine (G) continuous sequence is synthesized using the cytosine (C) continuous sequence in the bead specifying sequence region 12 as a template.
  • the amount of proton generation during each nucleic acid extension reaction varies depending on the lengths of the guanine (G) continuous sequence and cytosine (C) continuous sequence in the bead specifying sequence region 12.
  • the nucleic acid extension reaction is performed with all four types of bases, and the amount of protons generated during the nucleic acid extension reaction with each base is measured for each reaction tank.
  • the ratio of the amount of protons generated during nucleic acid extension by each base coincides with the ratio of the number of bases contained in the bead specifying sequence region 12 of each bead specifying nucleic acid 10.
  • dTTP: dATP: dCTP: dGCP 50: 0: 25: 25
  • dTTP: dATP: dCTP: dGCP 100: 0: 0: 0. Become.
  • sequence of the bead specifying sequence region 12 of the bead specifying nucleic acid 10 arranged in each reaction tank is specified by calculating the ratio of the amount of protons generated during the nucleic acid extension reaction by each base for each reaction tank. can do.
  • the bead specifying primer is annealed to the bead specifying primer annealing region, and a nucleic acid extension reaction is performed for each of four types of bases using the bead specifying sequence region 12 as a template. To identify.
  • the nucleic acid extension reaction using the bead specifying sequence region 12 as a template is performed after the nucleic acid extension reaction using the target nucleic acid 3 as a template.
  • the target nucleic acid primer 2 is in a state of being annealed to the target nucleic acid 3. Therefore, when a nucleic acid extension reaction is performed in this state, both a nucleic acid extension reaction using the target nucleic acid 3 as a template and a nucleic acid extension reaction using the bead specifying nucleic acid 10 as a template can occur. In this case, protons generated by the nucleic acid extension reaction may be mixed.
  • the target nucleic acid 3 is removed from the reaction vessel 21 or the nucleic acid extension reaction using the target nucleic acid 3 as a template is stopped.
  • the temperature in the reaction vessel 21 is raised to about 90 to 100 ° C. to release the target nucleic acid 3 from the target nucleic acid primer 2.
  • the target nucleic acid 3 can be removed from the reaction vessel 21 by washing the reaction vessel 21 with an appropriate washing buffer.
  • an appropriate washing buffer As an example, by adding ddNTP, the nucleic acid extension reaction using the target nucleic acid 3 as a template can be stopped. Thereafter, the reaction tank 21 may be cleaned with an appropriate cleaning buffer to remove ddNTP from the reaction tank 21.
  • the nucleic acid extension reaction using the bead specifying sequence region 12 as a template can be performed before the nucleic acid extension reaction using the target nucleic acid 3 as a template.
  • the bead body 100 is placed in each reaction tank without performing the step (a1), and the step (a1) is performed after the nucleic acid extension reaction using the target nucleic acid 3 as a template.
  • the temperature in the reaction vessel 21 is raised to about 90 to 100 ° C. to release the bead specifying primer from the bead specifying nucleic acid,
  • the primer for identifying beads may be removed from the reaction vessel 21 by washing with an appropriate washing buffer.
  • a bead specifying primer is added to the reaction vessel 21.
  • the bead specifying primer is annealed to the bead specifying sequence region 12 by appropriately setting an appropriate annealing condition according to the sequence of the bead specifying primer.
  • the annealing conditions can be appropriately set according to the sequence of the bead specifying primer.
  • one type of dNTP is added to the reaction tank 21 one by one to perform a nucleic acid extension reaction.
  • the order of adding dNTPs is appropriately selected according to the order of the continuous sequence of each base in the bead specifying sequence region 12.
  • the order in the bead specifying sequence region 12 is the order of adenine (A), thymine (T), guanine (G), and cytosine (C)
  • the order is dTNP, dATP, dCTP, dGTP.
  • the order of the continuous sequence of each base in the bead specifying sequence region 12 is not limited to this, and can be changed as appropriate. Further, the continuous arrangement may be repeated twice or more. Moreover, it is not always necessary to use a continuous sequence of all four types of bases.
  • the amount of proton generated in the reaction vessel 21 is measured, and the amount of proton generated by the nucleic acid extension reaction at each base is determined.
  • the sequence of the bead specifying sequence region 12 can be specified for each reaction tank 21 from the ratio of the amount of protons generated in the nucleic acid extension reaction by each base.
  • the arrangement of the bead specifying array region 12 in each reaction tank 21 can be specified.
  • the kind of nucleic acid 10 for bead identification can be specified for every reaction tank.
  • the presence or absence of nucleic acid extension is determined by comparing the presence / absence of nucleic acid extension in each reaction vessel 21 determined in step (f1) with the type of target nucleic acid primer 2 in each reaction vessel 21 specified in this step.
  • the type of the target nucleic acid primer 2 in the reaction vessel 21 thus identified is specified. That is, the target nucleic acid sequence contained in the sample containing nucleic acid can be specified.
  • the target nucleic acid primer 2 in which the nucleic acid extension reaction has occurred is specified even if it is not specified which kind of bead body 100 is placed in which reaction tank 21. be able to. That is, according to the method of the present embodiment, the target nucleic acid sequence contained in the sample can be specified even if the correspondence relationship between the type of the bead body 100 and the number of the reaction tank 21 is not specified.
  • the sample and the bead 1 on which the target nucleic acid primer 2 is immobilized can be brought into contact before placing the bead 1 in the reaction vessel 21, the target nucleic acid for the target nucleic acid is used.
  • Primer 2 can be annealed efficiently.
  • a plurality of target nucleic acid sequences can be efficiently detected in a sample containing nucleic acids.
  • the method of this embodiment can be used for detection / identification of pathogen genes causing infectious diseases, detection / identification of disease-related genes such as cancer, expression analysis of disease-related genes, etc. It is useful for diagnosis of diseases and monitoring of therapeutic effects.
  • the target biomolecule in the method of the present embodiment is a desired protein.
  • the ligand capable of binding to the target biomolecule is an antibody that can bind to the protein (hereinafter referred to as “target antigen detection antibody”).
  • target antigen detection antibody an antibody that can bind to the protein
  • the method of this embodiment is (A2) A plurality of target antigen detection antibodies capable of binding a protein-containing sample to one of a plurality of target proteins and a bead specifying nucleic acid having a specific sequence for each type of the antibody Contacting with the beads of (B2) placing the plurality of beads in contact with the sample for each bead in a separate reaction tank; (C2) adding a reagent necessary for a nucleic acid extension reaction to the reaction vessel in which the beads are arranged; (D2) performing a nucleic acid extension reaction in the reaction vessel in which the beads are disposed; (E2) measuring a proton generation amount in each reaction tank during the nucleic acid extension reaction; (F2) determining the presence or absence of nucleic acid elongation in each reaction tank based on the proton generation amount; (G2) In the reaction vessel in which the beads are arranged, a nucleic acid extension reaction is performed using the bead specifying nucleic acid as a template, Based on the amount of protons generated in each reaction vessel
  • the step (a2) includes a target antigen detection antibody capable of binding a protein-containing sample to one of a plurality of target proteins, and a bead specifying nucleic acid having a specific sequence for each type of the target antigen detection antibody. Is a step of bringing a plurality of beads into contact with each other.
  • 1 is a bead
  • 5 is an antibody for detecting a target antigen
  • 10 is a nucleic acid for identifying a bead
  • 11 is a primer annealing region for identifying a bead
  • 12 is a sequence region for identifying a bead
  • 100 ′ is for detecting a target antigen on the bead 1.
  • a bead body on which the antibody 5 and the bead specifying nucleic acid 10 are immobilized, 400 indicates a target protein.
  • a target antigen detection antibody 5 is immobilized on the beads 1.
  • the target antigen detection antibody 5 is an antibody that can specifically bind to the target protein of interest.
  • the target antigen detection antibody 5 can be obtained by a known antibody acquisition method.
  • the target antigen detection antibody 5 may be derived from any animal. Antibodies generally used in the art such as mouse antibody, chicken antibody, rabbit antibody and the like can be used.
  • the target antigen detection antibody 5 may be a recombinant antibody such as a chimeric antibody or a humanized antibody.
  • the target antigen detection antibody 5 may be an antibody fragment such as a Fab fragment, an F (ab ′) 2 fragment, an Fv fragment, or a single chain antibody.
  • the term “antibody” encompasses those antibody fragments in which specificity and binding to the antigen are maintained.
  • Immobilization of the target antigen detection antibody 5 to the beads 1 can be performed using a known method.
  • the target nucleic acid primer 2 of the first embodiment it can be immobilized using an avidin-biotin bond.
  • a functional group such as an amino group, formyl group, or SH group
  • a silane coupling agent having an amino group, formyl group, epoxy group, or the like
  • the target antigen detection antibody 5 can immobilize a plurality of molecules on the beads 1. As an example, two or more molecules of the target antigen detection antibody 5 are immobilized on the beads 1. The target antigen detection antibody 5 only needs to be immobilized at a density that does not interfere with the annealing and extension reaction according to the surface area of the beads 1. When two or more molecules of target antigen detection antibody 5 are immobilized on beads 1, target antigen detection antibodies 5 immobilized on one bead 1 all target the same protein.
  • the bead 1 has a different type of bead identifying nucleic acid 10 immobilized for each type of protein targeted by the target antigen detection antibody 5.
  • the bead specifying nucleic acid 10 is the same as that of the first embodiment except that the bead specifying nucleic acid 10 corresponds to the target antigen detecting antibody 5 instead of the target nucleic acid primer 2.
  • the bead 1 is the same as that in the first embodiment.
  • the bead body 100 ′ in which the target antigen detection antibody 5 and the bead specifying nucleic acid 10 are immobilized on the beads 1 is brought into contact with a sample containing a protein.
  • the sample containing protein is not specifically limited,
  • the sample containing the protein extract from a biological sample, an environmental sample, etc. can be used.
  • the protein contained in the sample is not limited to a natural protein, and may be a modified protein or a recombinant protein.
  • the contact between the bead body 100 ′ and the sample containing the protein can be performed, for example, by mixing the bead body 100 ′ and the sample containing the protein.
  • the mixture of the bead body 100 and the sample containing the protein is placed under conditions that allow the target antigen detection antibody 5 to bind to the target protein. Binding conditions can be appropriately set according to the type of target antigen detection antibody 5 and the like.
  • the target antigen detection antibody 5 binds to the target protein 400 when the target protein 400 is contained in the sample. That is, the target protein 400 binds to the target antigen detection antibody 5 and is captured by the bead body 100 ′.
  • the target protein 400 binds to the target antigen detection antibody 5 and is captured by the bead body 100 ′.
  • the target protein 400 is not contained in the sample, nothing binds to the target antigen detection antibody 5. Therefore, when a plurality of bead bodies 100 ′ are brought into contact with the sample, the bead body 100 ′ in which the target antigen detection antibody 5 is bound to the target protein 400 and the target antigen detection antibody 5 are bound to the target protein 400.
  • a mixture with the non-bead body 100 ' is formed. Note that the number of bead bodies 100 ′ to be brought into contact with the sample can be appropriately selected according to the number of target proteins to be detected.
  • step (b2) of the present embodiment can be performed in the same manner as the step (b1) of the first embodiment.
  • Step (c2) is a step of adding a reagent necessary for the nucleic acid extension reaction to the reaction vessel in which the beads are arranged.
  • the secondary antibody 301 to which the signal generating nucleic acid 310 is bound is added.
  • the secondary antibody 301 is an antibody that can specifically bind to the target protein 400.
  • the secondary antibody 301 may be the same antibody as the target antigen detection antibody 5 or a different antibody.
  • the secondary antibody 301 is an antibody against the same antigen as the target antigen detection antibody 5 and has a different epitope.
  • a signal generating nucleic acid 310 is bound to the secondary antibody 301.
  • the binding between the secondary antibody 301 and the signal generating nucleic acid 310 can be performed using an avidin-biotin bond.
  • the signal generating nucleic acid 310 includes a primer annealing region 311 and a signal generating sequence 312 as shown in FIG.
  • the primer annealing region 311 is located on the 3 ′ side of the signal generating nucleic acid 310.
  • the signal generating nucleic acid 310 can have the same sequence for all types of secondary antibodies.
  • the primer annealing region 311 has the same sequence for all types of secondary antibodies.
  • the sequence of the signal generating nucleic acid 310 is not particularly limited and can be appropriately selected.
  • reference numeral 300 denotes a complex probe in which the signal generating nucleic acid 310 is bound to the secondary antibody 301.
  • the complex probe 300 is added to the reaction vessel 21 before adding other reagents necessary for the nucleic acid extension reaction.
  • the bead 1 is a magnetic bead
  • the complex probe 300 that is not bound to the target protein 400 is removed from the reaction vessel 21 by fixing the bead 1 to the reaction vessel 21 and washing the reaction vessel 21. 21 can be removed.
  • the complex probe 300 may be added to the sample or the reaction vessel 21 at any timing as long as it is before the nucleic acid extension reaction in the step (d2) described later.
  • a signal generating primer 320 is further added.
  • the signal generating primer 320 is added to the reaction vessel 21 after the complex probe 300 is added.
  • the complex probe 300 not bound to the target protein 400 is removed from the reaction vessel 21 by washing before the addition of the signal generating primer 320.
  • the signal generating primer 320 can be added to the reaction vessel 21 together with other reagents necessary for nucleic acid extension.
  • Step (d2) is a step of performing a nucleic acid extension reaction in a reaction vessel in which beads are arranged. This process can be performed similarly to the process (d1) of 1st Embodiment. In this step, as shown in FIG. 10, a nucleic acid extension reaction using the signal generating sequence 312 as a template occurs. Similar to the first embodiment, when the target protein 400 is not bound to the target antigen detection antibody 5, the nucleic acid elongation reaction does not occur.
  • Step (e2) is a step of measuring the amount of proton generation in each reaction tank of the nucleic acid extension reaction. This process can be performed similarly to the process (e1) of 1st Embodiment.
  • Step (f2) is a step of determining the presence or absence of nucleic acid elongation in each reaction tank based on the proton generation amount measured in step (e2). This process can be performed similarly to the process (f1) of 1st Embodiment.
  • step (g2) a nucleic acid extension reaction using the bead specifying nucleic acid as a template is performed in the reaction vessel in which the beads are arranged, and protons are generated in each reaction vessel during the nucleic acid extension reaction using the bead specifying nucleic acid as a template. Based on the quantity, the sequence of the bead identifying nucleic acid is identified for each reaction tank, and the type of target antigen detection antibody is identified for each reaction tank based on the sequence of the bead identifying nucleic acid identified for each reaction tank. It is a process to do.
  • This step can also be performed in the same manner as in the first embodiment, except that the target antigen detection antibody 5 is used instead of the target nucleic acid primer 2 in the first embodiment. That is, as in the first embodiment, the sequence of the bead specifying nucleic acid 10 in each reaction tank is specified, and the type of the target antigen detection antibody 5 in each reaction tank is determined based on the sequence of the bead specifying nucleic acid 10. Can be identified.
  • the presence / absence of nucleic acid extension is determined by comparing the presence / absence of nucleic acid extension in each reaction vessel 21 determined in step (f2) with the type of target antigen detection antibody 5 in each reaction vessel 21 specified in this step.
  • the type of the target antigen detection antibody 5 in the determined reaction tank 21 is specified. That is, the target protein contained in the sample containing the protein can be identified.
  • the target antigen detection antibody 5 to which the target protein 400 is bound can be obtained even if it is not specified which kind of bead body 100 ′ is placed in which reaction tank 21. Can be identified. That is, according to the method of the present embodiment, the target protein contained in the sample can be specified even if the correspondence relationship between the type of the bead body 100 ′ and the number of the reaction tank 21 is not specified.
  • the sample and the bead 1 on which the target antigen detection antibody 5 is immobilized can be brought into contact before placing the bead 1 in the reaction vessel 21, the target antigen for the target protein can be contacted.
  • the detection antibody 5 can be efficiently bound.
  • a plurality of target proteins can be efficiently detected in a sample containing proteins.
  • the method of this embodiment can be used for detection / identification of pathogen antigens causing infectious diseases, detection / identification of disease-related genes such as cancer, expression analysis of disease-related genes, etc. It is useful for diagnosis of diseases and monitoring of therapeutic effects.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating an example of the configuration of the target nucleic acid sequence identification device 200 in the present embodiment.
  • the target nucleic acid sequence identification device 200 includes a bead arrangement substrate 20 and an arithmetic device 210.
  • the bead arrangement substrate 20 includes a plurality of reaction vessels 21 and sensors 30.
  • One bead 1 is disposed in one reaction vessel 21.
  • the above-described target nucleic acid primer 2 and bead specifying nucleic acid 10 are immobilized on the bead 1.
  • the bead specifying nucleic acid 10 has a nucleic acid sequence corresponding to the nucleic acid sequence of the target nucleic acid primer 2 immobilized on the bead 1. That is, the beads 1 on which the target nucleic acid primer 2 and the bead specifying nucleic acid 10 having a nucleic acid sequence corresponding to the nucleic acid sequence of the target nucleic acid primer 2 are immobilized are disposed in the reaction tank 21. .
  • the correspondence between the nucleic acid sequence of the target nucleic acid primer 2 and the nucleic acid sequence of the bead specifying nucleic acid 10 is stored in the nucleic acid sequence storage unit 214 provided in the arithmetic unit 210. A specific example of the configuration of the nucleic acid sequence storage unit 214 will be described with reference to FIG.
  • FIG. 8 is a diagram showing an example of the configuration of the nucleic acid sequence storage unit 214 in the present embodiment.
  • a bead ID information indicating the sequence of the bead specifying nucleic acid 10
  • information indicating the sequence of the target nucleic acid primer 2 are stored in association with each other.
  • the bead ID is information for identifying the type of the bead 1, that is, the type of the sequence of the target nucleic acid primer 2 immobilized on the bead 1. More specifically, the identification sequence A and the target nucleic acid primer sequence A are associated with the bead ID-100A.
  • the target nucleic acid primer 2 corresponding to the nucleic acid sequence of the bead specifying nucleic acid 10 The sequence can be specified.
  • the arithmetic device 210 includes, for example, a CPU (Central Processing Unit), and includes a nucleic acid extension determination unit 211, a bead specifying unit 212, and a target nucleic acid sequence specifying unit 213 as functional units thereof. Yes.
  • the nucleic acid extension determination unit 211 determines for each reaction tank 21 whether or not there is nucleic acid extension in the reaction tank 21 based on the amount of protons generated for each reaction tank 21 detected by the sensor 30. Specifically, the nucleic acid extension determination unit 211 has information in advance indicating correspondence between the output current value of the sensor 30 and the amount of protons generated.
  • the nucleic acid elongation determination unit 211 acquires the output current value of the sensor 30, and estimates the generation amount of protons based on the acquired output current value.
  • the nucleic acid extension determination unit 211 determines the presence or absence of nucleic acid extension based on the estimated generation amount of protons.
  • the sensor 30 is provided for each reaction vessel 21.
  • the nucleic acid extension determination unit 211 determines the presence or absence of nucleic acid extension for each reaction tank 21 by acquiring the output current value of the sensor 30 for each reaction tank 21.
  • the bead specifying unit 212 specifies the sequence of the bead specifying nucleic acid 10 for each reaction tank 21 based on the presence or absence of nucleic acid extension determined by the nucleic acid extension determining unit 211. Since the specific procedure for specifying the sequence of the bead specifying nucleic acid 10 has been described in detail in the above (Specifying bead specifying nucleic acid), description thereof is omitted here.
  • the target nucleic acid sequence specifying unit 213 specifies the sequence of the target nucleic acid primer 2 for each reaction tank 21 based on the sequence of the bead specifying nucleic acid 10 specified by the bead specifying unit 212. Specifically, the target nucleic acid sequence specifying unit 213 acquires information indicating the sequence of the bead specifying nucleic acid 10 specified by the bead specifying unit 212. The target nucleic acid sequence specifying unit 213 searches the nucleic acid sequence storage unit 214 using the acquired information indicating the sequence of the bead specifying nucleic acid 10 as a search key.
  • the nucleic acid sequence storage unit 214 stores information indicating the sequence of the bead specifying nucleic acid 10 and information indicating the sequence of the target nucleic acid primer 2 in association with each other. Accordingly, the target nucleic acid sequence specifying unit 213 searches for the target nucleic acid corresponding to the information indicating the sequence of the bead specifying nucleic acid 10 as a result of the search of the nucleic acid sequence storage unit 214 using the information indicating the sequence of the bead specifying nucleic acid 10 as a search key. Information indicating the sequence of primer 2 for use is obtained.
  • the target nucleic acid sequence specifying unit 213 specifies the sequence of the target nucleic acid primer 2 corresponding to the sequence of the bead specifying nucleic acid 10.
  • the target nucleic acid sequence specifying unit 213 specifies the sequence of the target nucleic acid primer 2 corresponding to the sequence of the bead specifying nucleic acid 10 for each reaction tank 21 by repeating the above procedure for each reaction tank 21.
  • the target nucleic acid primer in which the nucleic acid extension reaction has occurred even if it is not specified which type of beads 1 is placed in which reaction tank 21 2 can be specified. That is, according to the target nucleic acid sequence specifying apparatus 200 of the present embodiment, the target nucleic acid sequence included in the sample is specified even if the correspondence relationship between the type of the bead 1 and the number of the reaction vessel 21 is not specified. be able to.
  • the target nucleic acid sequence identification device 200 of the present embodiment can be used for detection and identification of pathogen genes that cause infectious diseases, detection and identification of disease-related genes such as cancer, expression analysis of disease-related genes, etc. It is useful for diagnosing diseases such as infectious diseases and cancer, and monitoring therapeutic effects.
  • the program for executing each process of the target nucleic acid sequence specifying apparatus 200 in the embodiment of the present invention is recorded on a computer-readable recording medium, and the program recorded on the recording medium is read by a computer system,
  • the various processes described above may be performed by executing.
  • the “computer system” referred to here may include an OS and hardware such as peripheral devices. Further, the “computer system” includes a homepage providing environment (or display environment) if a WWW system is used.
  • the “computer-readable recording medium” means a flexible disk, a magneto-optical disk, a ROM, a writable nonvolatile memory such as a flash memory, a portable medium such as a CD-ROM, a hard disk built in a computer system, etc. This is a storage device.
  • the “computer-readable recording medium” means a volatile memory (for example, DRAM (Dynamic DRAM) in a computer system that becomes a server or a client when a program is transmitted through a network such as the Internet or a communication line such as a telephone line. Random Access Memory)), etc., which hold programs for a certain period of time.
  • the program may be transmitted from a computer system storing the program in a storage device or the like to another computer system via a transmission medium or by a transmission wave in the transmission medium.
  • the “transmission medium” for transmitting the program refers to a medium having a function of transmitting information, such as a network (communication network) such as the Internet or a communication line (communication line) such as a telephone line.
  • the program may be for realizing a part of the functions described above. Furthermore, what can implement
  • FIG. 11 is a diagram illustrating an example of the configuration of the antigen storage unit 215 according to the present embodiment.
  • the antigen storage unit 215 stores a bead ID, information indicating the sequence of the bead specifying nucleic acid 10, and information indicating the antigen of the target antigen detection antibody 5 in association with each other.
  • the target protein identification apparatus of this embodiment even if it is not specified which kind of beads 1 are arranged in which reaction tank 21, they are arranged in the reaction tank 21 in which the nucleic acid extension reaction has occurred.
  • the target antigen detection antibody 5 can be identified. That is, according to the target protein specifying device of this embodiment, the target protein contained in the sample can be specified even if the correspondence relationship between the type of the bead 1 and the number of the reaction tank 21 is not specified. .
  • the target protein sequence detection apparatus of the present embodiment can be used for detection / identification of pathogen antigens causing infectious diseases, detection / identification of disease-related genes such as cancer, expression analysis of disease-related genes, etc. It is useful for diagnosis of diseases such as infectious diseases and cancer, and monitoring of therapeutic effects.

Abstract

（ａ）生体分子を含む試料を、標的生体分子に結合し得るリガンドと前記リガンドの種類に対応するビーズ特定用核酸とが固定化された、複数のビーズと接触させる工程と、（ｂ）試料と接触させた複数のビーズを、各反応槽に配置する工程と、（ｃ）各反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程と、（ｄ）各反応槽内で、核酸伸長反応を行う工程と、（ｅ）核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程と、（ｆ）プロトン発生量に基づいて、各反応槽内での核酸伸長の有無を判定する工程と、（ｇ）ビーズ特定用核酸の配列を反応槽毎に特定し、当該ビーズ特定用核酸の配列に基づいて、反応槽毎にリガンドの種類を特定する工程と、を含む標的生体分子の特定方法。

Description

標的生体分子の特定方法、標的生体分子特定用ビーズ、ビーズのセット、及び標的生体分子特定装置
　本発明は、標的生体分子の特定方法、標的生体分子特定用ビーズ、ビーズのセット、及び標的生体分子特定装置に関する。
　本願は、２０１６年５月２５日に、日本に出願された特願２０１６－１０４２９０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ハイスループットで核酸分析を行う方法としては、光切断部位を介してビーズにプライマーを結合し、プライマーに試料中の核酸を捕捉させた後、プライマーを光誘導切断してＰＣＲを行い、標的核酸を増幅して増幅産物を分析する技術が知られている（特許文献１参照）。しかしながら、特許文献１に記載の技術では、増幅産物の分析を行う場合には、ビーズエマルジョンを回収して配列解析等を行う必要があった。
米国特許出願公開第２０１３／０１９０１９１号明細書
　本発明の一実施態様は、
（ａ）生体分子を含む試料を、複数の標的生体分子の１つと結合し得るリガンドと、前記リガンドの種類毎に特異的な配列を有するビーズ特定用核酸とが固定化された、複数のビーズと接触させる工程と、
　（ｂ）前記試料と接触させた前記複数のビーズを、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程と、
　（ｃ）前記ビーズが配置された前記反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程と、
　（ｄ）前記ビーズが配置された前記反応槽内で、核酸伸長反応を行う工程と、
　（ｅ）前記核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程と、
　（ｆ）前記プロトン発生量に基づいて、前記各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程と、
　（ｇ）前記ビーズが配置された前記反応槽内で、前記ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応を行い、
　前記ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量に基づいて、前記ビーズ特定用核酸の配列を前記反応槽毎に特定し、
　前記反応槽毎に特定されたビーズ特定用核酸の配列に基づいて、前記反応槽毎に前記リガンドの種類を特定する工程と、を含む
　標的生体分子の特定方法である。
　本発明の一実施態様は、標的生体分子に結合し得るリガンドと、前記リガンドの種類毎に特異的な配列を有するビーズ特定用核酸とが固定化された、標的生体分子特定用ビーズである。
　本発明の一実施態様は、標的生体分子に結合し得るリガンドと、前記リガンドの種類毎に特異的な配列を有するビーズ特定用核酸とが固定化された、標的生体分子特定用ビーズを複数含む、標的生体分子を特定するためのビーズのセットである。
　本発明の一実施態様は、複数の標的生体分子の１つと結合し得るリガンドと、前記リガンドの種類毎に特異的な配列を有するビーズ特定用核酸とがそれぞれ固定化された複数のビーズが、当該ビーズ毎に配置される反応槽と、前記ビーズが配置された前記反応槽内での核酸伸長反応によって生じるプロトンを前記反応槽毎に検出する検出部と、前記検出部が検出する前記反応槽毎のプロトンの発生量に基づいて、前記反応槽内における核酸伸長の有無を前記反応槽毎に判定する核酸伸長判定部と、前記ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応について前記核酸伸長判定部が判定する核酸伸長の有無に基づいて、前記ビーズ特定用核酸の配列を前記反応槽毎に特定するビーズ特定部と、前記ビーズ特定部が特定する前記ビーズ特定用核酸の配列に基づいて、前記標的リガンドの種類を前記反応槽毎に特定する標的生体分子特定部と、を備える標的生体分子特定装置である。
第１実施形態におけるビーズ体の一例を示す模式図である。 第１実施形態におけるビーズ体に標的核酸配列がアニーリングした状態の一例を示す模式図である。 第１実施形態における反応槽へのビーズ体の配置の一例を示す模式図である。 核酸伸長反応におけるプロトン放出の一例を示す模式図である。 本実施形態におけるビーズ特定用核酸の一例を示す模式図である。 本実施形態におけるビーズ特定用核酸の一例を示す模式図である。 本実施形態における標的核酸配列特定装置の構成の一例を示す図である。 本実施形態における核酸配列記憶部の構成の一例を示す図である。 本実施形態におけるセンサの一例を示す模式図である。 第２実施形態におけるビーズ体の一例を示す模式図である。 第２実施形態における抗原記憶部の構成の一例を示す図である。
　本実施形態の標的生体分子の特定方法は、
　（ａ）生体分子を含む試料を、複数の標的生体分子の１つと結合し得るリガンドと、前記リガンドの種類毎に特異的な配列を有するビーズ特定用核酸とが固定化された、複数のビーズと接触させる工程と、
　（ｂ）前記試料と接触させた前記複数のビーズを、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程と、
　（ｃ）前記ビーズが配置された前記反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程と、
　（ｄ）前記ビーズが配置された前記反応槽内で、核酸伸長反応を行う工程と、
　（ｅ）前記核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程と、
　（ｆ）前記プロトン発生量に基づいて、前記各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程と、
　（ｇ）前記ビーズが配置された前記反応槽内で、前記ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応を行い、
　前記ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量に基づいて、前記ビーズ特定用核酸の配列を前記反応槽毎に特定し、
　前記反応槽毎に特定されたビーズ特定用核酸の配列に基づいて、前記反応槽毎に前記リガンドの種類を特定する工程と、を有する。
＜第１実施形態＞
　一例として、本実施形態の方法における標的生体分子は、所望の標的核酸配列を有する核酸である。また、標的生体分子と結合し得るリガンドは、当該標的核酸配列にアニーリングし得るプライマー（以下「標的核酸用プライマー」という）である。本実施形態においては、標的生体分子が核酸である場合について説明する。
　本実施形態の方法は、
　（ａ１）核酸を含む試料を、複数の標的核酸配列の１つとアニーリングし得る標的核酸用プライマーと、前記標的核酸用プライマーの種類毎に特異的な配列を有するビーズ特定用核酸とが固定化された、複数のビーズと接触させる工程と、
　（ｂ１）前記試料と接触させた前記複数のビーズを、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程と、
　（ｃ１）前記ビーズが配置された前記反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程と、
　（ｄ１）前記ビーズが配置された前記反応槽内で、核酸伸長反応を行う工程と、
　（ｅ１）前記核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程と、
　（ｆ１）前記プロトン発生量に基づいて、前記各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程と、
　（ｇ１）前記ビーズが配置された前記反応槽内で、前記ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応を行い、
　前記ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量に基づいて、前記ビーズ特定用核酸の配列を前記反応槽毎に特定し、
　前記反応槽毎に特定されたビーズ特定用核酸の配列に基づいて、前記反応槽毎に前記標的核酸用プライマーの種類を特定する工程と、を含む。
　以下、各工程について説明する。
［標的核酸用プライマーとのアニーリング］
　工程（ａ１）は、核酸を含む試料を、複数の標的核酸配列の１つとアニーリングし得る標的核酸用プライマーと、前記標的核酸用プライマーの種類毎に特異的な配列を有するビーズ特定用核酸とが固定化された、複数のビーズと接触させる工程である。
　まず、本実施形態で用いるビーズについて、図１を参照して説明する。図１中、１はビーズ、２は標的核酸用プライマー、１０はビーズ特定用核酸、１１はビーズ特定用プライマーアニーリング領域、１２はビーズ特定用配列領域、１００はビーズ１に標的核酸用プライマー２及びビーズ特定用核酸１０が固定化されたビーズ体を示す。
　本実施形態において、ビーズ１は、標的核酸用プライマー２及びビーズ特定用核酸１０を固定化するための担体として用いられる。一例として、ビーズ１の形状は、球状又はそれに近い形状である。ビーズ１の形状は、これに限るものではない。一例として、ビーズ１の大きさは、平均直径１～２５０μｍである。また一例として、ビーズ１の大きさは、平均直径３０～８０μｍである。ビーズ１の大きさは、これらに限るものではない。
　ビーズ１の材質は、特に限定されないが、例えば、ケイ素、二酸化チタン、酸化アルミニウム、ガラス、ポリスチレン、セルロース、ポリアミド等を挙げることができる。また、反応槽への配置の観点から、磁性ビーズを用いてもよい。ビーズ１は、１種類の物質のみならず、２種類以上の物質からなるものであってもよい。また、ビーズ１は、表面コーティングされたものであってもよい。
　図１に示すように、ビーズ１には、標的核酸用プライマー２及びビーズ特定用核酸１０が固定化されている。これらの核酸のビーズ１への固定化は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、標的核酸用プライマー２及びビーズ特定用核酸１０をビオチン修飾し、ビーズ１の表面をアビジンでコーティングすることにより、アビジン－ビオチン結合を利用して、ビーズ１への両核酸の固定化を行うことができる。また、標的核酸用プライマー２及びビーズ特定用核酸１０をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基などの官能基で修飾し、ビーズ１をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理することにより、固定化を行ってもよい。
　標的核酸用プライマー２は、目的とする標的核酸配列にアニーリングし得る配列を有する。一例として、標的核酸用プライマー２は、標的核酸配列の一部に相補的な配列を有する核酸である。標的核酸用プライマー２は、標的核酸配列にアニーリングし、標的核酸配列を鋳型とした核酸伸長反応を誘導する。一例として、標的核酸用プライマー２は、ＤＮＡである。標的核酸用プライマー２の配列は、目的とする標的核酸配列に応じて、適宜選択することができる。本実施形態においては、個々のビーズ１には、それぞれ異なる配列を有する標的核酸用プライマー２が固定化されている。
　本実施形態においては、標的核酸用プライマー２に加えて、ビーズ特定用核酸１０がビーズ１に固定化されている。ビーズ特定用核酸１０は、ビーズ１が反応槽に配置された後、ビーズ１に固定化された標的核酸用プライマー２の配列を反応槽毎に特定するためのものである。ビーズ特定用核酸１０は、標的核酸用プライマー２の標的核酸配列の種類に応じて、それぞれ異なる配列を有するものが固定化されている。一例として、ビーズ特定用核酸１０は、ＤＮＡである。
　一例として、ビーズ特定用核酸１０は、ビーズ特定用プライマーアニーリング領域１１とビーズ特定用配列領域１２とを有する。一例として、ビーズ特定用プライマーアニーリング領域１１は、全てのビーズ１で同じ配列である。一方、ビーズ特定用配列領域１２は、標的核酸用プライマー２の標的核酸配列の種類に応じて、それぞれ異なる配列を有する。なお、ビーズ特定用プライマーアニーリング領域１１は、ビーズ特定用核酸１０の３’側に配置されている。
　なお、図１では、ビーズ１に対して、標的核酸用プライマー２及びビーズ特定用核酸１０が１分子ずつしか固定化されていないが、ビーズ１に対して固定化されるこれらの核酸の分子数は１分子に限定されない。例えば、同一の標的核酸配列を標的とする標的核酸用プライマー２を２分子以上ビーズ１に固定化してもよく、同一配列を有するビーズ特定用核酸１０を２分子以上ビーズ１に固定化してもよい。一例として、標的核酸用プライマー２及びビーズ特定用核酸１０は、２分子以上がビーズ１に固定化される。標的核酸用プライマー２及びビーズ特定用核酸１０は、ビーズ１の表面積に応じて、アニーリング及び伸長反応を妨げない程度の密度で、固定化されていればよい。なお、ビーズ１に対して、２分子以上の標的核酸用プライマー２及びビーズ特定用核酸１０を固定化する場合、１つのビーズ１に固定化される標的核酸用プライマー２は、全て同一の標的核酸配列を標的とする。また、１つのビーズ１に固定化されるビーズ特定用核酸１０は、全て同一配列を有する。
　本実施形態の工程（ａ１）では、ビーズ１に標的核酸用プライマー２及びビーズ特定用核酸１０が固定化されたビーズ体１００を、核酸を含む試料と接触させる。本実施形態において、核酸を含む試料は、特に限定されず、例えば、生体サンプルや環境サンプルからの核酸抽出物等を含む試料等を使用することができる。一例として、試料に含まれる核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの例としては、ｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを挙げることができる。試料に含まれる核酸は、ＤＮＡに限定されず、ＲＮＡや修飾核酸であってもよい。
　ビーズ体１００と核酸を含む試料との接触は、例えば、ビーズ体１００と核酸を含む試料とを混合することにより行うことができる。一例として、ビーズ体１００と核酸を含む試料との混合物は、標的核酸用プライマー２が標的核酸とアニーリングし得る条件に置かれる。アニーリング条件は、標的核酸用プライマー２の長さ等に応じて、適宜設定することができる。
　図２において、３は標的核酸を示す。標的核酸３は、配列内に標的核酸配列を有しており、標的核酸用プライマー２は、該標的核酸配列の少なくとも一部にアニーリングすることができる。そのため、試料中に標的核酸用プライマー２の標的核酸が含まれている場合には、図２に示すように、標的核酸用プライマー２が標的核酸３にアニーリングし、ビーズ体１００に標的核酸３が捕捉される。一方、試料中に標的核酸用プライマー２の標的核酸が含まれていない場合には、標的核酸用プライマー２は試料中の核酸とはアニーリングしない。したがって、複数のビーズ体１００を試料と接触させた場合、標的核酸用プライマー２が標的核酸にアニーリングしているビーズ体１００と、標的核酸用プライマー２に標的核酸がアニーリングしていないビーズ体１００との混合物が形成される。図３の例では、ビーズ体１００ａ及び１００ｄでは、標的核酸用プライマー２ａ及び標的核酸用プライマー２ｄは標的核酸３ａ及び標的核酸３ｄにそれぞれアニーリングしている。一方、ビーズ体１００ｂ及び１００ｃでは、標的核酸用プライマー２ｂ及び標的核酸用プライマー２ｃは、標的核酸にアニーリングしていない。なお、試料と接触させるビーズ体１００の数は、検出したい標的核酸の数に応じて、適宜選択することができる。
［反応槽へのビーズの配置］
　工程（ｂ１）は、核酸を含む試料と接触させたビーズ体１００を、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程である。本実施形態の工程（ｂ１）を、図３を参照して、説明する。図３中、２０はビーズ配置用基板であり、２１は反応槽である。
　本実施形態において、ビーズ配置用基板２０の材質は、特に限定されないが、ガラス、シリコン、ポリマー等とすることができる。なお、ビーズ配置用基板２０にエラストラマー材料を用いる場合、微小なゴミなどの粒子が反応槽２１とビーズ配置用基板２０との間に挟まれたときに生じる反応槽２１全体のビーズ配置用基板２０との密着性に及ぼす悪影響がエラストラマーの局所的な変形により回避される利点がある。
　ビーズ配置用基板２０には、複数の反応槽２１が配設されている。配設される反応槽２１の数は、工程（ａ１）で使用したビーズ体１００の数以上である必要がある。一例として、反応槽２１のサイズは、ビーズ１よりも若干大きいサイズである。一例として、反応槽２１のサイズは、ビーズ１のサイズの１～２倍程度であり、１個のビーズ１を収納可能な程度の大きさとなっている。なお、ビーズ配置用基板２０の表面や反応槽２１の内壁は、核酸等の非特異的吸着を防止するブロッキング剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や２－メテクリオイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）等でコーティングされていてもよい。このようなコーティングが施してあることで、ビーズ配置用基板２０の表面や反応槽２１の内壁への核酸の非特異的吸着を抑制することができる。また、一例として、反応槽２１の内壁は、親水化されている。内壁が親水化されていることにより、ビーズ体１００の分散液をビーズ配置用基板２０上に滴下した際、反応槽２１内部へのビーズ体１００の充填効率が向上する。
　また、反応槽２１は、水素濃度を検知するためのセンサ３０を備えている。一例として、センサ３０は、反応槽２１の底面に配設される。また、一例として、センサ３０は、イオン感応性電界効果トランジスタ（Ｉｏｎ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　Ｆｉｅｌｄ　Ｅｆｆｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ；ＩＳＦＥＴ）である。
　本実施形態の工程（ｂ１）では、図３に示すように、核酸を含む試料と接触させた複数のビーズ体１００を、反応槽２１に、１個ずつ配置する。反応槽２１に、ビーズ体１００を配置する方法は、特に限定されず、例えば、ビーズ体１００を分散させた液体を、ビーズ配置用基板２０上に滴下し、撹拌、振盪、遠心分離等の手段により、ビーズ体１００を反応槽２１に誘導してもよい。あるいは、ビーズ体１００の分散液にビーズ配置用基板２０を浸漬し、撹拌、振盪、遠心分離等の手段を用いてもよい。
　また、ビーズ１に磁気ビーズを用いた場合には、ビーズ配置用基板２０の基板材料下に磁性体板と磁石を配置し、該磁石による磁力によりビーズ体１００を反応槽に誘導することもできる。この場合、基板材料下の磁石をビーズ配置用基板２０に対して平行方向に動かすことで、ビーズ体が分散し、反応槽２１へのビーズ体の充填効率が向上する。磁石によりビーズ配置用基板２０に印加する磁場の強さは、特に限定されないが、一例として、１００～１００００ガウスである。また、磁石を取り除いた後も磁性体板の磁化は残るため、ビーズ体１００は安定した配置を保持し続けることが可能となる。かかる磁性体の材料としては、ニッケル、ニッケル合金、鉄および鉄合金などの金属を好適に用いることができる。
［核酸伸長反応に必要な試薬の添加］
　工程（ｃ１）は、ビーズが配置された反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程である。
　本実施形態においては、核酸伸長反応に必要な試薬として、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、適切なバッファ等を挙げることができる。一例として、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼである。核酸伸長反応に必要な試薬は、後述の工程（ｄ１）で行う核酸伸長反応の方法に応じて、適宜選択することができる。なお、一例として、ＤＮＡポリメラーゼなどの一部の試薬は、本工程で添加せず、あらかじめ反応槽２１の内壁に結合させておいてもよい。
　一例として、核酸伸長反応としてＰＣＲ法や等温増幅法等の核酸増幅反応を行う場合は、本工程において、リバースプライマーを添加するもできる。リバースプライマーは、全ての標的核酸配列に共通なユニバーサルプライマーとしてもよく、各標的核酸配列に特異的なプライマーとしてもよい。
　リバースプライマーは、一例として、ビーズ１に固定化しておくこともできる。また、リバースプライマーが、全ての標的核酸配列に共通なユニバーサルプライマーである場合には、一例として、当該ユニバーサルリバースプライマーは、反応槽２１の内壁に固定化しておくこともできる。リバースプライマーをビーズ１又は反応槽２１の内壁に固定化する場合、リバースプライマーは、一例として、ビーズ１側又は反応槽２１の内壁側に光切断部位を有する。光切断部位とは、紫外線などの光を照射すると切断される性質を有する基をいい、かかる基を用いたものとしては、例えば、ＰＣ　Ｌｉｎｋｅｒ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、フラーレンを含有してなる核酸の光切断用組成物（核酸の光切断用組成物：特開２００５－２４５２２３）、特許文献１に記載のものなどを挙げることができる。あるいは、リバースプライマーは、１本鎖核酸切断酵素切断部位を有していてもよい。１本鎖核酸切断酵素切断部位とは、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼなどの１本鎖核酸切断酵素により切断されることができる核酸基をいい、ヌクレオチドおよびその誘導体が含まれる。そのような核酸基としては、例えば、エンドヌクレアーゼＶに認識されるデオキシイオシンなどを挙げることができる。核酸増幅反応開始前に、光照射又は１本鎖核酸切断酵素処理を行って、リバースプライマーをビーズ１から切り離すことにより、核酸増幅反応を効率よく行うことが可能になる。
［核酸伸長反応］
　工程（ｄ１）は、ビーズが配置された反応槽内で核酸伸長反応を行う工程である。核酸伸長反応は、ＤＮＡポリメラーゼ等を用いた公知の方法により行うことができる。核酸伸長反応の条件は、用いる方法に応じて、適宜設定することができる。例えば、反応槽２１内の温度を５５～７０℃程度に維持して、核酸伸長反応を行ってもよい。
　反応槽２１には、ビーズ体１００が１個ずつ配置されている。図３に示すように、標的核酸用プライマー２が標的核酸３にアニーリングしているビーズ体１００では、標的核酸３を鋳型として、核酸伸長反応が起こる。一方、標的核酸用プライマー２が標的核酸３にアニーリングしていないビーズ体１００では、核酸伸長反応は起こらない。
　本実施形態において、核酸伸長反応は、必ずしも核酸増幅反応である必要はない。ビーズ１に固定化された標的核酸用プライマー２の密度が高い場合には、１度の伸長反応で検出に十分なプロトンが発生する。核酸伸長反応を１回しか行わない場合には、反応槽２１にリバースプライマーを添加する必要はない。
　一方、本実施形態では、核酸増幅反応を行うこともできる。核酸増幅反応の方法には、公知の方法を用いることができる。一例として、核酸増幅反応には、ＰＣＲ法を用いる。また、他の例として、ＬＡＭＰ法等の等温増幅法を用いる。なお、核酸増幅反応を行う場合には、上記のとおり、反応槽２１内にリバースプライマーを存在させておく必要がある。
［プロトン濃度の検出］
　工程（ｅ１）は、核酸伸長反応の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程である。
　まず、図４を参照して、核酸伸長反応におけるプロトンの発生について説明する。図４中、Ｂ１～Ｂ４は、塩基を示す。図４は、Ｂ１－Ｂ２－Ｂ３の塩基配列を有する核酸に、塩基Ｂ４を有するデオキシヌクレオシド三リン酸が結合して、Ｂ１－Ｂ２－Ｂ３―Ｂ４の塩基配列を有する核酸が生成する例である。図４に示すように、Ｂ１－Ｂ２－Ｂ３の塩基配列を有する核酸から、１塩基伸長して、Ｂ１－Ｂ２－Ｂ３―Ｂ４の塩基配列を有する核酸が生成する際には、１分子のプロトンとピロリン酸が放出される。すなわち、核酸伸長反応によって核酸が１塩基伸長すると、１分子のプロトンが発生する。したがって、核酸伸長反応中、各反応槽２１中のプロトン発生量を測定することにより、核酸伸長が生じたか否かを反応槽２１毎に判定することができる。本工程において測定されたプロトン発生量は、後述の工程（ｆ１）における核酸伸長の有無の判定に供される。
　反応槽２１内のプロトン発生量は、センサ３０によって検出される。センサ３０は、一例として、ＩＳＦＥＴである。本実施形態に使用可能なＩＳＦＥＴとしては、例えば、国際公開公報ＷＯ２００８／１０７０１４号に記載のもの等を挙げることができる。
　センサ３０がＩＳＦＥＴである場合の、プロトン発生量の測定例について説明する。図９に、各反応槽２１に備えられるセンサ３０の構成を示す。センサ３０は、ゲート絶縁膜ＧＩＦと、Ｎ型半導体ＳＮ（ソースｓｒｃ）と、ソース端子ＴＳと、Ｎ型半導体ＳＮ（ドレインｄｒｎ）と、ドレイン端子ＴＤと、Ｐ型半導体ＳＰと、参照電極ＥＲと、ゲート電源ＶＧと、バイアス電源ＶＢと、電流検出器ＣＤとを備える。これら各部の構成については、既知のＩＳＦＥＴと同様であるため、説明を省略する。センサ３０は、溶液とゲート絶縁膜ＧＩＦとの間に発生する界面電位に応じた電流値のドレイン電流を電流検出器ＣＤによって検出することにより、プロトン発生量を測定する。
［核酸増幅の有無の判定］
　工程（ｆ１）は、工程（ｅ１）で測定されたプロトン発生量に基づいて、各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程である。センサ３０による反応槽２１内のプロトン発生量の測定に基づいて、反応槽２１内での核酸伸長の有無を判定する。反応槽２１内でプロトン発生が検出された場合には、核酸伸長が生じたと判定され、反応槽２１内のプロトン発生が検出されない場合には、核酸伸長が生じていないと判定される。
　本実施形態においては、反応槽２１毎に配置されたセンサ３０によって、個々の反応槽２１内のプロトン濃度の変化を検出し、反応槽２１毎に、核酸伸長の有無を判断する。例えば、図３に示すようにビーズ配置用基板２０が３６個の反応槽２１を備える場合においては、反応槽２１には１から３６までの番号が割り当てられる。センサ３０は反応槽２１毎に配置されており、いずれのセンサ３０がプロトン発生を検出したかによって、いずれの反応槽２１において核酸伸長反応が生じたかを特定することができる。つまり、センサ３０の出力に基づけば、核酸伸長反応が生じた反応槽２１の番号が特定される。
　ここで、ビーズ体１００の種類には、標的核酸用プライマー２の配列の種類に応じた複数の種類がある。いずれの種類のビーズ体１００が、複数ある反応槽２１のうち、いずれの反応槽２１に配置されるのかは特定されない。すなわち、核酸伸長反応が生じた反応槽２１の番号がセンサ３０によって特定されたとしても、それだけでは、核酸伸長反応が生じた標的核酸用プライマー２の配列の種類が特定されない。以下、各反応槽における標的核酸用プライマー２の特定手順について説明する。
［各反応槽における標的核酸用プライマーの特定］
　工程（ｇ１）は、ビーズが配置された前記反応槽内で、ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応を行い、ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量に基づいて、ビーズ特定用核酸の配列を前記反応槽毎に特定し、反応槽毎に特定されたビーズ特定用核酸の配列に基づいて、反応槽毎に標的核酸用プライマーの種類を特定する工程である。
（ビーズ特定用核酸の特定）
　本実施形態においては、ビーズ１に、標的核酸用プライマー２に加えて、ビーズ特定用核酸１０が固定化されている。ビーズ特定用核酸１０の配列の種類と標的核酸用プライマー２の標的核酸配列の種類とは、１：１の対応関係を有している。そのため、ビーズ特定用核酸１０の配列の種類を特定することにより、標的核酸用プライマー２の配列の種類も特定することができる。
　本実施形態において、ビーズ特定用核酸１０は、図１に示すように、ビーズ特定用プライマーアニーリング領域１１とビーズ特定用配列領域１２とを含む。ビーズ特定用プライマーアニーリング領域１１は、ビーズ特定用配列領域１２を鋳型として核酸伸長を行う際に、ビーズ特定用プライマーがアニーリングするための領域である。ビーズ特定用プライマーアニーリング領域１１の配列は、一例として、全てのビーズ体１００で同一の配列である。また、一例として、ビーズ特定用プライマーアニーリング領域１１の配列は、一定数のビーズ体１００毎に変更してもよい。この場合、後述するビーズ特定用配列領域を鋳型とした核酸伸長を行う際に、使用したビーズ特定用プライマーアニーリング領域１１の配列に対応するプライマーを全て添加する必要がある。ビーズ特定用プライマーアニーリング領域の配列は、特に限定されず、適切なプライマーを設計し、当該プライマーと相補的な配列とすればよい。
　ビーズ特定用配列領域１２は、ビーズ１に固定化された標的核酸用プライマー２を特定するための領域である。ビーズ特定用配列領域１２の配列は、同じビーズ１に固定化される標的核酸用プライマー２の配列の種類に応じて異なっており、標的核酸用プライマー２の標的配列の種類と１：１の対応関係を有している。一例として、ビーズ特定用配列領域１２は、アデニン（Ａ）の連続配列、グアニン（Ｇ）の連続配列、シトシン（Ｃ）の連続配列、又はチミン（Ｔ）の連続配列のいずれかであるか、これらの連続配列の組み合わせである。図５の例では、ビーズ特定用配列領域１２は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）の各連続配列が、前記の順に並んだ配列となっている。
　一例として、図６に例示するように、各ビーズ特定用配列領域１２は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）の各連続配列を組み合わせた配列となっている。アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）の各連続配列の順番は、一例として、全てのビーズ特定用配列領域１２で、同じ順番である。図６の例では、ビーズ特定用配列領域１２ａ～１２ｄは、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）の順で各塩基の連続配列が連結されるようになっている。ビーズ特定用配列領域１２ａ～１２ｄは、それぞれ、連続配列中の各塩基の数が異なっている。例えば、図６中、ビーズ特定用配列領域１２ａでは、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）がそれぞれ同じ数ずつ連続しており、ビーズ特定用配列領域１２ｂでは、アデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）は、チミン（Ｔ）とシトシン（Ｃ）よりも、連続配列中の数が多くなっている。ビーズ特定用配列領域１２は、４種類の塩基全てを含む必要はなく、図６中、ビーズ特定用配列領域１２ｃの例では、チミン（Ｔ）が含まれておらず、ビーズ特定用配列領域１２ｄの例では、アデニン（Ａ）のみの配列となっている。
　次に、図６を例として、各反応槽に配置されたビーズ特定用核酸の特定方法について説明する。ビーズ体１００は、各反応槽２１にランダムに配置されているため、どの反応槽２１にどのビーズ特定用核酸１０が配置されているかわからない。そこで、一例として、ビーズ特定用配列領域１２を鋳型とした核酸伸長反応を行い、該核酸伸長反応中に発生するプロトン量に基づいて、ビーズ特定用核酸１０の配列を反応槽毎に特定する。図６の例では、ビーズ特定用核酸１０の配列は、以下のような手順で特定することができる。
　図６の例の場合、まずｄＴＴＰを反応槽２１に添加して核酸伸長反応を行うと、ビーズ特定用配列領域１２中のアデニン（Ａ）連続配列を鋳型として、チミジン（Ｔ）連続配列が合成される。それに伴い、プロトンが発生するが、プロトン発生量は、ビーズ特定用配列領域１２中のアデニン（Ａ）連続配列の長さによって、異なってくる。図６の例では、ビーズ特定用配列領域１２ａ、１２ｂ、１２ｃ、１２ｄの順で、プロトン発生量が多くなる。
　上記ｄＴＴＰによる核酸伸長反応においてすべての反応槽２１で、プロトン発生が検出されなくなった後、次にｄＡＴＰを反応槽２１に添加して核酸伸長反応を行う。この場合、ビーズ特定用配列領域１２中のチミン（Ｔ）連続配列を鋳型として、アデニン（Ａ）連続配列が合成される。それに伴い、プロトンが発生するが、プロトン発生量は、ビーズ特定用配列領域１２中のチミン（Ｔ）連続配列の長さによって、異なってくる。図６の例では、ビーズ特定用配列領域１２ｂ、１２ａの順で、プロトン発生量が多くなり、ビーズ特定用配列領域１２ｃ、１２ｄではプロトンは発生しない。
　同様に、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰでもそれぞれ核酸伸長反応を行う。ｄＣＴＰでの核酸伸長反応では、ビーズ特定用配列領域１２中のグアニン（Ｇ）連続配列を鋳型として、シトシン（Ｃ）連続配列が合成される。また、ｄＧＴＰでの核酸伸長反応では、ビーズ特定用配列領域１２中のシトシン（Ｃ）連続配列を鋳型として、グアニン（Ｇ）連続配列が合成される。各核酸伸長反応中のプロトン発生量は、ビーズ特定用配列領域１２中のグアニン（Ｇ）連続配列及びシトシン（Ｃ）連続配列の長さによって、それぞれ異なってくる。
　このようにして、４種類全ての塩基で核酸伸長反応を行い、各塩基による核酸伸長反応中に発生するプロトン量を、反応槽毎に測定する。各塩基による核酸伸長中に発生するプロトン量の比は、各ビーズ特定用核酸１０のビーズ特定用配列領域１２に含まれる各塩基数の比と一致する。例えば、図６のビーズ特定用核酸１０ａでは、各塩基による核酸反応中に発生するプロトン量の比は、ｄＴＴＰ：ｄＡＴＰ：ｄＣＴＰ：ｄＧＣＰ＝２５：２５：２５：２５となる。また、ビーズ特定用核酸１０ｂでは、各塩基による核酸反応中に発生するプロトン量の比は、ｄＴＴＰ：ｄＡＴＰ：ｄＣＴＰ：ｄＧＣＰ＝３０：２０：３０：２０となる。同様に、ビーズ特定用核酸１０ｃでは、ｄＴＴＰ：ｄＡＴＰ：ｄＣＴＰ：ｄＧＣＰ＝５０：０：２５：２５となり、ビーズ特定用核酸１０ｄでは、ｄＴＴＰ：ｄＡＴＰ：ｄＣＴＰ：ｄＧＣＰ＝１００：０：０：０となる。したがって、各塩基による核酸伸長反応中に発生するプロトン量の比を、反応槽毎に算出することにより、各反応槽に配置されたビーズ特定用核酸１０のビーズ特定用配列領域１２の配列を特定することができる。
　以下に、ビーズ特定用配列領域１２の配列特定の具体的な手順を例示する。一例として、ビーズ特定用配列領域１２の配列は、ビーズ特定用プライマーを、ビーズ特定用プライマーアニーリング領域にアニーリングさせ、ビーズ特定用配列領域１２を鋳型として、４種類の塩基毎に核酸伸長反応を行うことにより特定する。
　一例として、ビーズ特定用配列領域１２を鋳型とした核酸伸長反応は、標的核酸３を鋳型とする核酸伸長反応の後に行う。工程（ａ１）の後に反応槽２１に配置されたビーズ体１００において、標的核酸用プライマー２は、標的核酸３にアニーリングした状態である。そのため、この状態で核酸伸長反応を行うと、標的核酸３を鋳型とする核酸伸長反応と、ビーズ特定用核酸１０を鋳型とする核酸伸長反応との両方の核酸伸長反応が起こり得る。この場合、両者の核酸伸長反応で発生するプロトンが混在する恐れがある。そこで、一例として、工程（ｄ１）及び（ｅ１）の後に、標的核酸３を反応槽２１から除去するか、標的核酸３を鋳型とする核酸伸長反応を停止させる。これにより、ビーズ特定用配列領域１２を鋳型として核酸伸長反応を行う際に、標的核酸３を鋳型とする核酸伸長反応から生じるプロトンの混入を避けることができる。一例として、標的核酸３を鋳型とした核酸伸長反応を終えた後、反応槽２１内の温度を９０～１００℃程度に上昇させて、標的核酸３を標的核酸用プライマー２から遊離させる。その後、反応槽２１内を適切な洗浄バッファで洗浄することにより、標的核酸３を反応槽２１内から除去することができる。また、一例として、ｄｄＮＴＰを添加することにより、標的核酸３を鋳型とする核酸伸長反応を停止させることができる。その後、反応槽２１内を適切な洗浄バッファで洗浄して、反応槽２１内からｄｄＮＴＰを除去してもよい。
　一例として、ビーズ特定用配列領域１２を鋳型とする核酸伸長反応は、標的核酸３を鋳型とする核酸伸長反応の前に行うこともできる。この場合、一例として、工程（ａ１）を行わずにビーズ体１００を各反応槽に配置し、標的核酸３を鋳型とする核酸伸長反応の後に、工程（ａ１）を行う。この場合、一例として、工程（ａ１）を行う前に、反応槽２１内の温度を９０～１００℃程度に上昇させて、ビーズ特定用プライマーをビーズ特定用核酸から遊離させ、反応槽２１内を適切な洗浄バッファで洗浄することにより、ビーズ特定用プライマーを反応槽２１内から除去してもよい。
　ビーズ特定用配列領域１２を鋳型とする核酸伸長反応を行う際には、ビーズ特定用プライマーを反応槽２１に添加する。ビーズ特定用プライマーの配列に応じて、適宜適切なアニーリング条件におくことにより、ビーズ特定用プライマーはビーズ特定用配列領域１２にアニーリングする。アニーリング条件は、ビーズ特定用プライマーの配列に応じて、適宜設定することができる。
　アニーリング反応後、反応槽２１に、ｄＮＴＰを１種類ずつ添加して、核酸伸長反応を行う。ｄＮＴＰを添加する順番は、ビーズ特定用配列領域１２における各塩基の連続配列の順番に応じて、適宜選択する。図６の例では、ビーズ特定用配列領域１２における順番が、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）の順であるため、ｄＴＮＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰの順に添加する。ビーズ特定用配列領域１２における各塩基の連続配列の順番は、これに限定されず、適宜変更可能である。また、連続配列を２回以上繰り返すようにしてもよい。また、必ずしも、４種類の塩基全ての連続配列を使用する必要はない。
　各塩基での核酸伸長反応中、反応槽２１内のプロトン発生量を測定し、各塩基での核酸伸長反応によるプロトン発生量を求める。そして、各塩基による核酸伸長反応におけるプロトン発生量の比から、ビーズ特定用配列領域１２の配列を、反応槽２１毎に特定することができる。
　このようにして、各反応槽２１内におけるビーズ特定用配列領域１２の配列を特定することができる。これにより、ビーズ特定用核酸１０の種類を各反応槽毎に特定することができる。
（標的核酸用プライマーの特定）
　上述したビーズ特定用核酸１０の特定手順において、反応槽２１の番号と、ビーズ特定用核酸１０の配列の種類との対応関係が特定される。
　ここで、ビーズ特定用核酸１０と標的核酸用プライマー２とは、１：１の対応関係にあるため、上記で特定したビーズ特定用核酸１０の種類に基づいて、各反応槽２１に配置された標的核酸用プライマー２の配列が特定される。
　そして、工程（ｆ１）により判定された各反応槽２１における核酸伸長の有無と、本工程により特定された各反応槽２１内の標的核酸用プライマー２の種類との照合により、核酸伸長有と判定された反応槽２１内の標的核酸用プライマー２の種類が特定される。すなわち、核酸を含む試料中に含まれる標的核酸配列を特定することができる。
　本実施形態の方法によれば、いずれの種類のビーズ体１００が、いずれの反応槽２１に配置されるのかが特定されていなくても、核酸伸長反応が生じた標的核酸用プライマー２を特定することができる。つまり本実施形態の方法によれば、ビーズ体１００の種類と反応槽２１の番号との対応関係が特定されていなくても、試料中に含まれていた標的核酸配列を特定することができる。
　本実施形態の方法によれば、ビーズ１を反応槽２１に配置する前に、試料と標的核酸用プライマー２が固定化されたビーズ１とを接触させることができるため、標的核酸に対する標的核酸用プライマー２のアニーリングを効率よく行うことができる。
　本実施形態の方法によれば、核酸を含む試料において、複数の標的核酸配列を効率よく検出することができる。
　本実施形態の方法は、感染症の原因となる病原体遺伝子の検出・同定や癌などの疾患関連遺伝子の検出・同定、疾患関連遺伝子の発現解析等に利用することができ、感染症や癌などの疾患の診断や治療効果のモニタリング等に有用である。
＜第２実施形態＞
　一例として、本実施形態の方法における標的生体分子は、所望のタンパク質である。また、標的生体分子と結合し得るリガンドは、当該タンパク質に結合し得る抗体（以下「標的抗原検出用抗体」という）である。本実施形態においては、標的生体分子がタンパク質である場合について説明する。
　本実施形態の方法は、
　（ａ２）タンパク質を含む試料を、複数の標的タンパク質の１つと結合し得る標的抗原検出用抗体と、当該抗体の種類毎に特異的な配列を有するビーズ特定用核酸とが固定化された、複数のビーズと接触させる工程と、
　（ｂ２）前記試料と接触させた前記複数のビーズを、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程と、
　（ｃ２）前記ビーズが配置された前記反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程と、
　（ｄ２）前記ビーズが配置された前記反応槽内で、核酸伸長反応を行う工程と、
　（ｅ２）前記核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程と、
　（ｆ２）前記プロトン発生量に基づいて、前記各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程と、
　（ｇ２）前記ビーズが配置された前記反応槽内で、前記ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応を行い、
　前記ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量に基づいて、前記ビーズ特定用核酸の配列を前記反応槽毎に特定し、
　前記反応槽毎に特定されたビーズ特定用核酸の配列に基づいて、前記反応槽毎に前記標的抗原検出用抗体の種類を特定する工程と、を含む。
　以下、各工程について説明する。
［標的タンパク質との抗原抗体反応］
　工程（ａ２）は、タンパク質を含む試料を、複数の標的タンパク質の１つと結合し得る標的抗原検出用抗体と、前記標的抗原検出用抗体の種類毎に特異的な配列を有するビーズ特定用核酸とが固定化された、複数のビーズと接触させる工程である。
　まず、本実施形態で用いるビーズについて、図１０を参照して説明する。図１０中、１はビーズ、５は標的抗原検出用抗体、１０はビーズ特定用核酸、１１はビーズ特定用プライマーアニーリング領域、１２はビーズ特定用配列領域、１００’はビーズ１に標的抗原検出用抗体５及びビーズ特定用核酸１０が固定化されたビーズ体、４００は標的タンパク質を示す。
　本実施形態においては、第１実施形態の標的核酸用プライマー２に替り、標的抗原検出用抗体５がビーズ１に固定化されている。標的抗原検出用抗体５は、目的とする標的タンパク質に特異的に結合し得る抗体である。標的抗原検出用抗体５は、公知の抗体取得方法により、得ることができる。また、標的抗原検出用抗体５は、どのような動物由来のものであってもよい。マウス抗体、ニワトリ抗体、ウサギ抗体等、当技術分野で一般的に用いられる抗体を使用することができる。また、標的抗原検出用抗体５は、キメラ抗体、ヒト化抗体等の組み換え抗体であってもよい。また、標的抗原検出用抗体５は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体等の抗体断片であってもよい。本明細書において、「抗体」という用語は、抗原に対する特異性及び結合性が維持されるこれらの抗体断片を包含する。
　標的抗原検出用抗体５のビーズ１への固定化は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、第１実施形態の標的核酸用プライマー２と同様に、アビジン－ビオチン結合を利用して固定化することができる。また、標的抗原検出用抗体５をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基などの官能基で修飾し、ビーズ１をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理することにより、固定化を行ってもよい。
　標的抗原検出用抗体５は、ビーズ１に対して、複数分子を固定化することができる。一例として、標的抗原検出用抗体５は、２分子以上がビーズ１に固定化される。標的抗原検出用抗体５は、ビーズ１の表面積に応じて、アニーリング及び伸長反応を妨げない程度の密度で、固定化されていればよい。なお、ビーズ１に対して、２分子以上の標的抗原検出用抗体５を固定化する場合、１つのビーズ１に固定化される標的抗原検出用抗体５は、全て同一のタンパク質を標的とする。
　ビーズ１には、標的抗原検出用抗体５が標的とするタンパク質の種類毎に、異なる種類のビーズ特定用核酸１０が固定化されている。ビーズ特定用核酸１０は、標的核酸用プライマー２に替り標的抗原検出用抗体５に対応させている他は、第１実施形態と同様である。また、ビーズ１についても、第１実施形態と同様である。
　本実施形態の工程（ａ２）では、ビーズ１に標的抗原検出用抗体５及びビーズ特定用核酸１０が固定化されたビーズ体１００’を、タンパク質を含む試料と接触させる。本実施形態において、タンパク質を含む試料は、特に限定されず、例えば、生体サンプルや環境サンプルからのタンパク質抽出物等を含む試料等を使用することができる。試料に含まれるタンパク質は、天然タンパク質に限定されず、修飾タンパク質や組み換えタンパク質等であってもよい。
　ビーズ体１００’とタンパク質を含む試料との接触は、例えば、ビーズ体１００’とタンパク質を含む試料とを混合することにより行うことができる。一例として、ビーズ体１００とタンパク質を含む試料との混合物は、標的抗原検出用抗体５が標的タンパク質に結合し得る条件に置かれる。結合条件は、標的抗原検出用抗体５の種類等に応じて、適宜設定することができる。
　図１０において、ビーズ体１００’をタンパク質を含む試料と接触させると、該試料に標的タンパク質４００が含まれている場合、標的抗原検出用抗体５は、標的タンパク質４００に結合する。すなわち、標的タンパク質４００は、標的抗原検出用抗体５に結合し、ビーズ体１００’に捕捉される。一方、試料中に標的タンパク質４００が含まれていない場合には、標的抗原検出用抗体５には何も結合しない。したがって、複数のビーズ体１００’を試料と接触させた場合、標的抗原検出用抗体５が標的タンパク質４００に結合しているビーズ体１００’と、標的抗原検出用抗体５が標的タンパク質４００に結合していないビーズ体１００’との混合物が形成される。なお、試料と接触させるビーズ体１００’の数は、検出したい標的タンパク質の数に応じて、適宜選択することができる。
［反応槽へのビーズの配置］
　本実施形態の工程（ｂ２）は、第１実施形態の工程（ｂ１）と同様に行うことができる。
［核酸伸長反応に必要な試薬の添加］
　工程（ｃ２）は、ビーズが配置された反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程である。
　本実施形態の工程（ｃ２）では、第１実施形態の工程（ｃ１）で添加する試薬に加えて、シグナル生成用核酸３１０を結合させた２次抗体３０１を添加する。２次抗体３０１は、標的タンパク質４００に特異的に結合し得る抗体である。２次抗体３０１は、標的抗原検出用抗体５と同じ抗体であってもよく、違う抗体であってもよい。一例として、２次抗体３０１は、標的抗原検出用抗体５と同じ抗原に対する抗体であって、異なるエピトープを有する抗体である。
　２次抗体３０１には、一例として、図１０に示すように、シグナル生成用核酸３１０が結合されている。２次抗体３０１とシグナル生成用核酸３１０との結合は、一例として、アビジン－ビオチン結合を利用して行うことができる。
　シグナル生成用核酸３１０は、一例として、図１０に示すように、プライマーアニーリング領域３１１とシグナル生成用配列３１２とを含む。プライマーアニーリング領域３１１は、シグナル生成用核酸３１０の３’側に位置している。シグナル生成用核酸３１０は、一例として、全ての種類の２次抗体に対して、同じ配列であることができる。また、シグナル生成用核酸３１０は、一例として、プライマーアニーリング領域３１１が、全ての種類の２次抗体に対して、同じ配列である。シグナル生成用核酸３１０の配列は、特に限定されず、適宜選択することができる。なお、図１０において、３００は、２次抗体３０１にシグナル生成用核酸３１０を結合させた複合体プローブを示す。
　本工程では、一例として、複合体プローブ３００は、核酸伸長反応に必要な他の試薬を添加する前に、反応槽２１に添加される。この場合、一例として、ビーズ１が磁気ビーズであれば、ビーズ１を反応槽２１に固定して、反応槽２１を洗浄することにより、標的タンパク質４００に結合していない複合体プローブ３００を反応槽２１から除去することができる。なお、複合体プローブ３００は、後述する工程（ｄ２）の核酸伸長反応の前であれば、どのようなタイミングで、試料又は反応槽２１に添加してもよい。
　本工程においては、複合体プローブ３００に加えて、さらに、シグナル生成用プライマー３２０を添加する。シグナル生成用プライマー３２０は、複合体プローブ３００の添加後に反応槽２１に添加される。一例として、シグナル生成用プライマー３２０の添加前に、標的タンパク質４００に結合していない複合体プローブ３００は、洗浄により反応槽２１から除去される。シグナル生成用プライマー３２０の反応槽２１への添加は、一例として、他の核酸伸長に必要な試薬と共に行うことができる。
　上記以外の核酸伸長反応に必要な試薬については、第１実施形態の工程（ｃ１）と同じである。
［核酸伸長反応］
　工程（ｄ２）は、ビーズが配置された反応槽内で核酸伸長反応を行う工程である。本工程は、第１実施形態の工程（ｄ１）と同様に行うことができる。なお、本工程では、図１０に示すように、シグナル生成用配列３１２を鋳型とする核酸伸長反応が起こる。第１実施形態と同様に、標的抗原検出用抗体５に標的タンパク質４００が結合していない場合には、核酸伸長反応は起こらない。
［プロトン濃度の検出］
　工程（ｅ２）は、核酸伸長反応の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程である。本工程は、第１実施形態の工程（ｅ１）と同様に行うことができる。
［核酸増幅の有無の判定］
　工程（ｆ２）は、工程（ｅ２）で測定されたプロトン発生量に基づいて、各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程である。本工程は、第１実施形態の工程（ｆ１）と同様に行うことができる。
［各反応槽における標的抗原検出用抗体の特定］
　工程（ｇ２）は、ビーズが配置された前記反応槽内で、ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応を行い、ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量に基づいて、ビーズ特定用核酸の配列を前記反応槽毎に特定し、反応槽毎に特定されたビーズ特定用核酸の配列に基づいて、反応槽毎に標的抗原検出用抗体の種類を特定する工程である。
　本工程も、第１実施形態における標的核酸用プライマー２に替えて、標的抗原検出用抗体５を用いている以外は、第１実施形態と同様に行うことができる。すなわち、第１実施形態と同様に、各反応槽におけるビーズ特定用核酸１０の配列を特定し、該ビーズ特定用核酸１０の配列に基づいて、各反応槽における標的抗原検出用抗体５の種類を特定することができる。
　そして、工程（ｆ２）により判定された各反応槽２１における核酸伸長の有無と、本工程により特定された各反応槽２１内の標的抗原検出用抗体５の種類との照合により、核酸伸長有と判定された反応槽２１内の標的抗原検出用抗体５の種類が特定される。すなわち、タンパク質を含む試料中に含まれる標的タンパク質を特定することができる。
　本実施形態の方法によれば、いずれの種類のビーズ体１００’が、いずれの反応槽２１に配置されるのかが特定されていなくても、標的タンパク質４００が結合した標的抗原検出用抗体５を特定することができる。つまり本実施形態の方法によれば、ビーズ体１００’の種類と反応槽２１の番号との対応関係が特定されていなくても、試料中に含まれていた標的タンパク質を特定することができる。
　本実施形態の方法によれば、ビーズ１を反応槽２１に配置する前に、試料と標的抗原検出用抗体５が固定化されたビーズ１とを接触させることができるため、標的タンパク質に対する標的抗原検出用抗体５の結合を効率よく行うことができる。
　本実施形態の方法によれば、タンパク質を含む試料において、複数の標的タンパク質を効率よく検出することができる。
　本実施形態の方法は、感染症の原因となる病原体抗原の検出・同定や癌などの疾患関連遺伝子の検出・同定、疾患関連遺伝子の発現解析等に利用することができ、感染症や癌などの疾患の診断や治療効果のモニタリング等に有用である。
＜標的生体分子特定装置＞
［標的核酸配列特定装置の構成例］
　上述した第１実施形態の方法を実現する標的核酸配列特定装置２００の構成の一例について、図７及び図８を参照して説明する。
　図７は、本実施形態における標的核酸配列特定装置２００の構成の一例を示す図である。標的核酸配列特定装置２００は、ビーズ配置用基板２０と、演算装置２１０とを備える。
　ビーズ配置用基板２０は、反応槽２１と、センサ３０とをそれぞれ複数備える。１つの反応槽２１には、１つのビーズ１が配置される。このビーズ１には、上述した標的核酸用プライマー２と、ビーズ特定用核酸１０とが固定化されている。このビーズ特定用核酸１０は、ビーズ１に固定化されている標的核酸用プライマー２の核酸の配列に応じた核酸の配列を有する。つまり、反応槽２１には、標的核酸用プライマー２と、当該標的核酸用プライマー２の核酸の配列に応じた核酸の配列を有するビーズ特定用核酸１０とが固定化されたビーズ１が配置される。標的核酸用プライマー２の核酸の配列と、ビーズ特定用核酸１０の核酸の配列との対応関係は、演算装置２１０が備える核酸配列記憶部２１４に記憶されている。この核酸配列記憶部２１４の構成の具体例について、図８を参照して説明する。
　図８は、本実施形態における核酸配列記憶部２１４の構成の一例を示す図である。核酸配列記憶部２１４には、ビーズＩＤと、ビーズ特定用核酸１０の配列を示す情報と、標的核酸用プライマー２の配列を示す情報とが、互いに対応付けられて記憶されている。ここで、ビーズＩＤとは、ビーズ１の種類、すなわち、ビーズ１に固定化されている標的核酸用プライマー２の配列の種類を識別する情報である。より具体的には、ビーズＩＤ－１００Ａには、特定用配列Ａと、標的核酸用プライマー配列Ａとが対応付けられている。つまり、核酸配列記憶部２１４に記憶されている情報によれば、ビーズ特定用核酸１０の核酸の配列を特定すれば、このビーズ特定用核酸１０の核酸の配列に対応する標的核酸用プライマー２の配列を特定することができる。
　図７に戻り、演算装置２１０は、例えばＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）を備えており、その機能部としての核酸伸長判定部２１１と、ビーズ特定部２１２と、標的核酸配列特定部２１３とを備えている。
　核酸伸長判定部２１１は、センサ３０が検出する反応槽２１毎のプロトンの発生量に基づいて、反応槽２１内における核酸伸長の有無を反応槽２１毎に判定する。具体的には、核酸伸長判定部２１１は、センサ３０の出力電流値と、プロトンの発生量との対応を示す情報を予め有している。核酸伸長判定部２１１は、センサ３０の出力電流値を取得し、取得した出力電流値に基づいて、プロトンの発生量を推定する。核酸伸長判定部２１１は、推定したプロトンの発生量に基づいて、核酸伸長の有無を判定する。ここで、センサ３０は反応槽２１毎に備えられている。核酸伸長判定部２１１は、反応槽２１毎にセンサ３０の出力電流値を取得することにより、核酸伸長の有無を反応槽２１毎に判定する。
　ビーズ特定部２１２は、核酸伸長判定部２１１が判定する核酸伸長の有無に基づいて、ビーズ特定用核酸１０の配列を反応槽２１毎に特定する。ビーズ特定用核酸１０の配列の特定の具体的な手順については、上述の（ビーズ特定用核酸の特定）において詳細に説明したため、ここでの説明を省略する。
　標的核酸配列特定部２１３は、ビーズ特定部２１２が特定するビーズ特定用核酸１０の配列に基づいて、標的核酸用プライマー２の配列を反応槽２１毎に特定する。具体的には、標的核酸配列特定部２１３は、ビーズ特定部２１２が特定したビーズ特定用核酸１０の配列を示す情報を取得する。標的核酸配列特定部２１３は、取得したビーズ特定用核酸１０の配列を示す情報を検索キーにして核酸配列記憶部２１４を検索する。上述したように、核酸配列記憶部２１４には、ビーズ特定用核酸１０の配列を示す情報と、標的核酸用プライマー２の配列を示す情報とが、互いに対応付けられて記憶されている。したがって、標的核酸配列特定部２１３は、ビーズ特定用核酸１０の配列を示す情報を検索キーにした核酸配列記憶部２１４の検索の結果、ビーズ特定用核酸１０の配列を示す情報に対応する標的核酸用プライマー２の配列を示す情報を得る。つまり、標的核酸配列特定部２１３は、ビーズ特定用核酸１０の配列に対応する標的核酸用プライマー２の配列を特定する。標的核酸配列特定部２１３は、反応槽２１毎に上述の手順を繰り返すことにより、反応槽２１毎にビーズ特定用核酸１０の配列に対応する標的核酸用プライマー２の配列を特定する。
　本実施形態の標的核酸配列特定装置２００によれば、いずれの種類のビーズ１が、いずれの反応槽２１に配置されるのかが特定されていなくても、核酸伸長反応が生じた標的核酸用プライマー２を特定することができる。つまり本実施形態の標的核酸配列特定装置２００によれば、ビーズ１の種類と反応槽２１の番号との対応関係が特定されていなくても、試料中に含まれていた標的核酸配列を特定することができる。
　本実施形態の標的核酸配列特定装置２００は、感染症の原因となる病原体遺伝子の検出・同定や癌などの疾患関連遺伝子の検出・同定、疾患関連遺伝子の発現解析等に利用することができ、感染症や癌などの疾患の診断、治療効果のモニタリング等に有用である。
　なお、本発明の実施形態における標的核酸配列特定装置２００の各処理を実行するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、当該記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することにより、上述した種々の処理を行ってもよい。
　なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものであってもよい。また、「コンピュータシステム」は、ＷＷＷシステムを利用している場合であれば、ホームページ提供環境（あるいは表示環境）も含むものとする。また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、フラッシュメモリ等の書き込み可能な不揮発性メモリ、ＣＤ－ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。
　さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムが送信された場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリ（例えばＤＲＡＭ（Dynamic Random Access Memory））のように、一定時間プログラムを保持しているものも含むものとする。また、上記プログラムは、このプログラムを記憶装置等に格納したコンピュータシステムから、伝送媒体を介して、あるいは、伝送媒体中の伝送波により他のコンピュータシステムに伝送されてもよい。ここで、プログラムを伝送する「伝送媒体」は、インターネット等のネットワーク（通信網）や電話回線等の通信回線（通信線）のように情報を伝送する機能を有する媒体のことをいう。また、上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであっても良い。さらに、前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるもの、いわゆる差分ファイル（差分プログラム）であってもよい。
［標的タンパク質特定装置の構成例］
　上述した第２実施形態の方法を実現する標的タンパク質特定装置の構成は、上述の標的核酸配列特定装置２００において、標的核酸配列特定部２１３に替えて標的タンパク質特定部、核酸配列記憶部２１４に替えて抗原記憶部を備えたものとすることができる。図１１は、本実施形態における抗原記憶部２１５の構成の一例を示す図である。抗原記憶部２１５には、ビーズＩＤと、ビーズ特定用核酸１０の配列を示す情報と、標的抗原検出用抗体５の抗原を示す情報とが、互いに対応付けられて記憶されている。
　本実施形態の標的タンパク質特定装置によれば、いずれの種類のビーズ１が、いずれの反応槽２１に配置されるのかが特定されていなくても、核酸伸長反応が生じた反応槽２１に配置された標的抗原検出用抗体５を特定することができる。つまり本実施形態の標的タンパク質特定装置によれば、ビーズ１の種類と反応槽２１の番号との対応関係が特定されていなくても、試料中に含まれていた標的タンパク質を特定することができる。
　本実施形態の標的タンパク質配列検出装置は、感染症の原因となる病原体抗原の検出・同定や癌などの疾患関連遺伝子の検出・同定、疾患関連遺伝子の発現解析等に利用することができ、感染症や癌などの疾患の診断、治療効果のモニタリング等に有用である。
　以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。
　１　　ビーズ
　２　　標的核酸用プライマー
　３　　標的核酸
　５　　標的抗原検出用抗体
　１０　　ビーズ特定用核酸
　１１　　ビーズ特定用プライマーアニーリング領域
　１２　　ビーズ特定用配列領域
　２０　　ビーズ配置用基板
　２１　　反応槽
　３０　　センサ
　１００，１００’　　ビーズ体
　２００　　標的核酸配列特定装置
　２１１　　核酸伸長判定部
　２１２　　ビーズ特定部
　２１３　　標的核酸配列特定部
　２１４　　核酸配列記憶部
　２１５　　抗原記憶部
　３００　　複合体プローブ
　３０１　　２次抗体
　３１０　　シグナル生成用核酸
　３１１　　プライマーアニーリング領域
　３１２　　シグナル生成用配列
　３２０　　シグナル生成用プライマー
　４００　　標的タンパク質

Claims (10)

  1. 　標的生体分子の特定方法であって、
    　（ａ）生体分子を含む試料を、複数の標的生体分子の１つと結合し得るリガンドと前記リガンドの種類毎に特異的な配列を有するビーズ特定用核酸とが固定化された、複数のビーズと接触させる工程と、
    　（ｂ）前記試料と接触させた前記複数のビーズを、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程と、
    　（ｃ）前記ビーズが配置された前記反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程と、
    　（ｄ）前記ビーズが配置された前記反応槽内で、核酸伸長反応を行う工程と、
    　（ｅ）前記核酸伸長反応中の前記各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程と、
    　（ｆ）前記プロトン発生量に基づいて、前記各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程と、
    　（ｇ）前記ビーズが配置された前記反応槽内で、前記ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応を行い、
    　前記ビーズ特定用核酸を鋳型とした前記核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量に基づいて、前記ビーズ特定用核酸の配列を前記反応槽毎に特定し、
    　前記反応槽毎に特定された前記ビーズ特定用核酸の配列に基づいて、前記反応槽毎に前記リガンドの種類を特定する工程と、を含む
    　標的生体分子の特定方法。
  2. 　前記標的生体分子が核酸であり、前記リガンドが前記標的生体分子である核酸とアニーリングし得るプライマーである、請求項１に記載の標的生体分子の特定方法。
  3. 　前記標的生体分子がタンパク質であり、前記リガンドが前記標的生体分子であるタンパク質と結合し得る抗体である、請求項１に記載の標的生体分子の特定方法。
  4. 　前記ビーズ特定用核酸が、ビーズ特定用プライマーアニーリング領域とビーズ特定用配列領域とを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の標的生体分子の特定方法。
  5. 　前記ビーズ特定用配列領域が、アデニン（Ａ）連続配列、グアニン（Ｇ）連続配列、シトシン（Ｃ）連続配列若しくはチミン（Ｔ）連続配列、又はこれらの連続配列の組み合わせを含む、請求項４に記載の標的生体分子の特定方法。
  6. 　前記工程（ｄ）の核酸伸長反応が、ＰＣＲ法又は等温増幅法により行われる、請求項１～５のいずれか一項に記載の標的生体分子の特定方法。
  7. 　前記工程（ｅ）のプロトン発生量の測定が、ＩＳＦＥＴにより行われる、請求項１～６のいずれか一項に記載の標的生体分子の特定方法。
  8. 　標的生体分子に結合し得るリガンドと、前記リガンドの種類毎に特異的な配列を有するビーズ特定用核酸とが固定化された、標的生体分子特定用ビーズ。
  9. 　標的生体分子に結合し得るリガンドと、前記リガンドの種類毎に特異的な配列を有するビーズ特定用核酸とが固定化された、標的生体分子特定用ビーズを複数含む、標的生体分子を特定するためのビーズのセット。
  10. 　複数の標的生体分子の１つと結合し得るリガンドと、前記リガンドの種類毎に特異的な配列を有するビーズ特定用核酸とがそれぞれ固定化された複数のビーズが、当該ビーズ毎に配置される反応槽と、
    　前記ビーズが配置された前記反応槽内での核酸伸長反応によって生じるプロトンを前記反応槽毎に検出する検出部と、
    　前記検出部が検出する前記反応槽毎のプロトンの発生量に基づいて、前記反応槽内における核酸伸長の有無を前記反応槽毎に判定する核酸伸長判定部と、
    　前記ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応について前記核酸伸長判定部が判定する核酸伸長の有無に基づいて、前記ビーズ特定用核酸の配列を前記反応槽毎に特定するビーズ特定部と、
    　前記ビーズ特定部が特定する前記ビーズ特定用核酸の配列に基づいて、前記リガンドの種類を前記反応槽毎に特定する標的生体分子特定部と、
    　を備える標的生体分子特定装置。
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