JPWO2017204294A1 - 標的生体分子の特定方法、標的生体分子特定用ビーズ、ビーズのセット、及び標的生体分子特定装置 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2016年5月25日に、日本に出願された特願2016−104290号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
(a)生体分子を含む試料を、複数の標的生体分子の1つと結合し得るリガンドと、前記リガンドの種類毎に特異的な配列を有するビーズ特定用核酸とが固定化された、複数のビーズと接触させる工程と、
(b)前記試料と接触させた前記複数のビーズを、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程と、
(c)前記ビーズが配置された前記反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程と、
(d)前記ビーズが配置された前記反応槽内で、核酸伸長反応を行う工程と、
(e)前記核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程と、
(f)前記プロトン発生量に基づいて、前記各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程と、
(g)前記ビーズが配置された前記反応槽内で、前記ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応を行い、
前記ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量に基づいて、前記ビーズ特定用核酸の配列を前記反応槽毎に特定し、
前記反応槽毎に特定されたビーズ特定用核酸の配列に基づいて、前記反応槽毎に前記リガンドの種類を特定する工程と、を含む
標的生体分子の特定方法である。
(a)生体分子を含む試料を、複数の標的生体分子の1つと結合し得るリガンドと、前記リガンドの種類毎に特異的な配列を有するビーズ特定用核酸とが固定化された、複数のビーズと接触させる工程と、
(b)前記試料と接触させた前記複数のビーズを、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程と、
(c)前記ビーズが配置された前記反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程と、
(d)前記ビーズが配置された前記反応槽内で、核酸伸長反応を行う工程と、
(e)前記核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程と、
(f)前記プロトン発生量に基づいて、前記各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程と、
(g)前記ビーズが配置された前記反応槽内で、前記ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応を行い、
前記ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量に基づいて、前記ビーズ特定用核酸の配列を前記反応槽毎に特定し、
前記反応槽毎に特定されたビーズ特定用核酸の配列に基づいて、前記反応槽毎に前記リガンドの種類を特定する工程と、を有する。
一例として、本実施形態の方法における標的生体分子は、所望の標的核酸配列を有する核酸である。また、標的生体分子と結合し得るリガンドは、当該標的核酸配列にアニーリングし得るプライマー(以下「標的核酸用プライマー」という)である。本実施形態においては、標的生体分子が核酸である場合について説明する。
(a1)核酸を含む試料を、複数の標的核酸配列の1つとアニーリングし得る標的核酸用プライマーと、前記標的核酸用プライマーの種類毎に特異的な配列を有するビーズ特定用核酸とが固定化された、複数のビーズと接触させる工程と、
(b1)前記試料と接触させた前記複数のビーズを、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程と、
(c1)前記ビーズが配置された前記反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程と、
(d1)前記ビーズが配置された前記反応槽内で、核酸伸長反応を行う工程と、
(e1)前記核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程と、
(f1)前記プロトン発生量に基づいて、前記各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程と、
(g1)前記ビーズが配置された前記反応槽内で、前記ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応を行い、
前記ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量に基づいて、前記ビーズ特定用核酸の配列を前記反応槽毎に特定し、
前記反応槽毎に特定されたビーズ特定用核酸の配列に基づいて、前記反応槽毎に前記標的核酸用プライマーの種類を特定する工程と、を含む。
以下、各工程について説明する。
工程(a1)は、核酸を含む試料を、複数の標的核酸配列の1つとアニーリングし得る標的核酸用プライマーと、前記標的核酸用プライマーの種類毎に特異的な配列を有するビーズ特定用核酸とが固定化された、複数のビーズと接触させる工程である。
工程(b1)は、核酸を含む試料と接触させたビーズ体100を、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程である。本実施形態の工程(b1)を、図3を参照して、説明する。図3中、20はビーズ配置用基板であり、21は反応槽である。
工程(c1)は、ビーズが配置された反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程である。
本実施形態においては、核酸伸長反応に必要な試薬として、DNAポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、適切なバッファ等を挙げることができる。一例として、DNAポリメラーゼは、Taqポリメラーゼ等の耐熱性DNAポリメラーゼ、鎖置換型DNAポリメラーゼである。核酸伸長反応に必要な試薬は、後述の工程(d1)で行う核酸伸長反応の方法に応じて、適宜選択することができる。なお、一例として、DNAポリメラーゼなどの一部の試薬は、本工程で添加せず、あらかじめ反応槽21の内壁に結合させておいてもよい。
工程(d1)は、ビーズが配置された反応槽内で核酸伸長反応を行う工程である。核酸伸長反応は、DNAポリメラーゼ等を用いた公知の方法により行うことができる。核酸伸長反応の条件は、用いる方法に応じて、適宜設定することができる。例えば、反応槽21内の温度を55〜70℃程度に維持して、核酸伸長反応を行ってもよい。
工程(e1)は、核酸伸長反応の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程である。
工程(f1)は、工程(e1)で測定されたプロトン発生量に基づいて、各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程である。センサ30による反応槽21内のプロトン発生量の測定に基づいて、反応槽21内での核酸伸長の有無を判定する。反応槽21内でプロトン発生が検出された場合には、核酸伸長が生じたと判定され、反応槽21内のプロトン発生が検出されない場合には、核酸伸長が生じていないと判定される。
工程(g1)は、ビーズが配置された前記反応槽内で、ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応を行い、ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量に基づいて、ビーズ特定用核酸の配列を前記反応槽毎に特定し、反応槽毎に特定されたビーズ特定用核酸の配列に基づいて、反応槽毎に標的核酸用プライマーの種類を特定する工程である。
本実施形態においては、ビーズ1に、標的核酸用プライマー2に加えて、ビーズ特定用核酸10が固定化されている。ビーズ特定用核酸10の配列の種類と標的核酸用プライマー2の標的核酸配列の種類とは、1:1の対応関係を有している。そのため、ビーズ特定用核酸10の配列の種類を特定することにより、標的核酸用プライマー2の配列の種類も特定することができる。
上述したビーズ特定用核酸10の特定手順において、反応槽21の番号と、ビーズ特定用核酸10の配列の種類との対応関係が特定される。
ここで、ビーズ特定用核酸10と標的核酸用プライマー2とは、1:1の対応関係にあるため、上記で特定したビーズ特定用核酸10の種類に基づいて、各反応槽21に配置された標的核酸用プライマー2の配列が特定される。
本実施形態の方法によれば、核酸を含む試料において、複数の標的核酸配列を効率よく検出することができる。
一例として、本実施形態の方法における標的生体分子は、所望のタンパク質である。また、標的生体分子と結合し得るリガンドは、当該タンパク質に結合し得る抗体(以下「標的抗原検出用抗体」という)である。本実施形態においては、標的生体分子がタンパク質である場合について説明する。
(a2)タンパク質を含む試料を、複数の標的タンパク質の1つと結合し得る標的抗原検出用抗体と、当該抗体の種類毎に特異的な配列を有するビーズ特定用核酸とが固定化された、複数のビーズと接触させる工程と、
(b2)前記試料と接触させた前記複数のビーズを、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程と、
(c2)前記ビーズが配置された前記反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程と、
(d2)前記ビーズが配置された前記反応槽内で、核酸伸長反応を行う工程と、
(e2)前記核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程と、
(f2)前記プロトン発生量に基づいて、前記各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程と、
(g2)前記ビーズが配置された前記反応槽内で、前記ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応を行い、
前記ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量に基づいて、前記ビーズ特定用核酸の配列を前記反応槽毎に特定し、
前記反応槽毎に特定されたビーズ特定用核酸の配列に基づいて、前記反応槽毎に前記標的抗原検出用抗体の種類を特定する工程と、を含む。
以下、各工程について説明する。
工程(a2)は、タンパク質を含む試料を、複数の標的タンパク質の1つと結合し得る標的抗原検出用抗体と、前記標的抗原検出用抗体の種類毎に特異的な配列を有するビーズ特定用核酸とが固定化された、複数のビーズと接触させる工程である。
本実施形態の工程(b2)は、第1実施形態の工程(b1)と同様に行うことができる。
工程(c2)は、ビーズが配置された反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程である。
工程(d2)は、ビーズが配置された反応槽内で核酸伸長反応を行う工程である。本工程は、第1実施形態の工程(d1)と同様に行うことができる。なお、本工程では、図10に示すように、シグナル生成用配列312を鋳型とする核酸伸長反応が起こる。第1実施形態と同様に、標的抗原検出用抗体5に標的タンパク質400が結合していない場合には、核酸伸長反応は起こらない。
工程(e2)は、核酸伸長反応の各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程である。本工程は、第1実施形態の工程(e1)と同様に行うことができる。
工程(f2)は、工程(e2)で測定されたプロトン発生量に基づいて、各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程である。本工程は、第1実施形態の工程(f1)と同様に行うことができる。
工程(g2)は、ビーズが配置された前記反応槽内で、ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応を行い、ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量に基づいて、ビーズ特定用核酸の配列を前記反応槽毎に特定し、反応槽毎に特定されたビーズ特定用核酸の配列に基づいて、反応槽毎に標的抗原検出用抗体の種類を特定する工程である。
本実施形態の方法によれば、タンパク質を含む試料において、複数の標的タンパク質を効率よく検出することができる。
[標的核酸配列特定装置の構成例]
上述した第1実施形態の方法を実現する標的核酸配列特定装置200の構成の一例について、図7及び図8を参照して説明する。
図7は、本実施形態における標的核酸配列特定装置200の構成の一例を示す図である。標的核酸配列特定装置200は、ビーズ配置用基板20と、演算装置210とを備える。
ビーズ配置用基板20は、反応槽21と、センサ30とをそれぞれ複数備える。1つの反応槽21には、1つのビーズ1が配置される。このビーズ1には、上述した標的核酸用プライマー2と、ビーズ特定用核酸10とが固定化されている。このビーズ特定用核酸10は、ビーズ1に固定化されている標的核酸用プライマー2の核酸の配列に応じた核酸の配列を有する。つまり、反応槽21には、標的核酸用プライマー2と、当該標的核酸用プライマー2の核酸の配列に応じた核酸の配列を有するビーズ特定用核酸10とが固定化されたビーズ1が配置される。標的核酸用プライマー2の核酸の配列と、ビーズ特定用核酸10の核酸の配列との対応関係は、演算装置210が備える核酸配列記憶部214に記憶されている。この核酸配列記憶部214の構成の具体例について、図8を参照して説明する。
核酸伸長判定部211は、センサ30が検出する反応槽21毎のプロトンの発生量に基づいて、反応槽21内における核酸伸長の有無を反応槽21毎に判定する。具体的には、核酸伸長判定部211は、センサ30の出力電流値と、プロトンの発生量との対応を示す情報を予め有している。核酸伸長判定部211は、センサ30の出力電流値を取得し、取得した出力電流値に基づいて、プロトンの発生量を推定する。核酸伸長判定部211は、推定したプロトンの発生量に基づいて、核酸伸長の有無を判定する。ここで、センサ30は反応槽21毎に備えられている。核酸伸長判定部211は、反応槽21毎にセンサ30の出力電流値を取得することにより、核酸伸長の有無を反応槽21毎に判定する。
上述した第2実施形態の方法を実現する標的タンパク質特定装置の構成は、上述の標的核酸配列特定装置200において、標的核酸配列特定部213に替えて標的タンパク質特定部、核酸配列記憶部214に替えて抗原記憶部を備えたものとすることができる。図11は、本実施形態における抗原記憶部215の構成の一例を示す図である。抗原記憶部215には、ビーズIDと、ビーズ特定用核酸10の配列を示す情報と、標的抗原検出用抗体5の抗原を示す情報とが、互いに対応付けられて記憶されている。
2 標的核酸用プライマー
3 標的核酸
5 標的抗原検出用抗体
10 ビーズ特定用核酸
11 ビーズ特定用プライマーアニーリング領域
12 ビーズ特定用配列領域
20 ビーズ配置用基板
21 反応槽
30 センサ
100,100’ ビーズ体
200 標的核酸配列特定装置
211 核酸伸長判定部
212 ビーズ特定部
213 標的核酸配列特定部
214 核酸配列記憶部
215 抗原記憶部
300 複合体プローブ
301 2次抗体
310 シグナル生成用核酸
311 プライマーアニーリング領域
312 シグナル生成用配列
320 シグナル生成用プライマー
400 標的タンパク質
Claims (10)
- 標的生体分子の特定方法であって、
(a)生体分子を含む試料を、複数の標的生体分子の1つと結合し得るリガンドと前記リガンドの種類毎に特異的な配列を有するビーズ特定用核酸とが固定化された、複数のビーズと接触させる工程と、
(b)前記試料と接触させた前記複数のビーズを、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する工程と、
(c)前記ビーズが配置された前記反応槽に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程と、
(d)前記ビーズが配置された前記反応槽内で、核酸伸長反応を行う工程と、
(e)前記核酸伸長反応中の前記各反応槽におけるプロトン発生量を測定する工程と、
(f)前記プロトン発生量に基づいて、前記各反応槽内における核酸伸長の有無を判定する工程と、
(g)前記ビーズが配置された前記反応槽内で、前記ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応を行い、
前記ビーズ特定用核酸を鋳型とした前記核酸伸長反応中の各反応槽におけるプロトン発生量に基づいて、前記ビーズ特定用核酸の配列を前記反応槽毎に特定し、
前記反応槽毎に特定された前記ビーズ特定用核酸の配列に基づいて、前記反応槽毎に前記リガンドの種類を特定する工程と、を含む
標的生体分子の特定方法。 - 前記標的生体分子が核酸であり、前記リガンドが前記標的生体分子である核酸とアニーリングし得るプライマーである、請求項1に記載の標的生体分子の特定方法。
- 前記標的生体分子がタンパク質であり、前記リガンドが前記標的生体分子であるタンパク質と結合し得る抗体である、請求項1に記載の標的生体分子の特定方法。
- 前記ビーズ特定用核酸が、ビーズ特定用プライマーアニーリング領域とビーズ特定用配列領域とを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の標的生体分子の特定方法。
- 前記ビーズ特定用配列領域が、アデニン(A)連続配列、グアニン(G)連続配列、シトシン(C)連続配列若しくはチミン(T)連続配列、又はこれらの連続配列の組み合わせを含む、請求項4に記載の標的生体分子の特定方法。
- 前記工程(d)の核酸伸長反応が、PCR法又は等温増幅法により行われる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の標的生体分子の特定方法。
- 前記工程(e)のプロトン発生量の測定が、ISFETにより行われる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の標的生体分子の特定方法。
- 標的生体分子に結合し得るリガンドと、前記リガンドの種類毎に特異的な配列を有するビーズ特定用核酸とが固定化された、標的生体分子特定用ビーズ。
- 標的生体分子に結合し得るリガンドと、前記リガンドの種類毎に特異的な配列を有するビーズ特定用核酸とが固定化された、標的生体分子特定用ビーズを複数含む、標的生体分子を特定するためのビーズのセット。
- 複数の標的生体分子の1つと結合し得るリガンドと、前記リガンドの種類毎に特異的な配列を有するビーズ特定用核酸とがそれぞれ固定化された複数のビーズが、当該ビーズ毎に配置される反応槽と、
前記ビーズが配置された前記反応槽内での核酸伸長反応によって生じるプロトンを前記反応槽毎に検出する検出部と、
前記検出部が検出する前記反応槽毎のプロトンの発生量に基づいて、前記反応槽内における核酸伸長の有無を前記反応槽毎に判定する核酸伸長判定部と、
前記ビーズ特定用核酸を鋳型とした核酸伸長反応について前記核酸伸長判定部が判定する核酸伸長の有無に基づいて、前記ビーズ特定用核酸の配列を前記反応槽毎に特定するビーズ特定部と、
前記ビーズ特定部が特定する前記ビーズ特定用核酸の配列に基づいて、前記リガンドの種類を前記反応槽毎に特定する標的生体分子特定部と、
を備える標的生体分子特定装置。
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