JP6412954B2 - 鋳型切換え及びタグメンテーションを用いる単一細胞の遺伝子発現の多重分析 - Google Patents
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Description
(政府補助)本発明は、米国公衆衛生局(PHS)による国立衛生研究所(NIH)グラント番号MH098977の下に政府の補助を受けて達成された。当該政府は本発明に一定の権利を有する。
(技術分野)
本発明は、単一細胞の遺伝子発現を多重分析するための方法及び組成物に関する。
組織のmRNAの内容の全て又は部分の直接配列決定がますます用いられている。しかしながら、直接配列決定によって細胞のmRNAの内容を分析する従来の方法は、組織サンプル(典型的には数百万の細胞を含む)から得られるバルクmRNAの分析を基にしている。これは、遺伝子発現がバルクmRNAで分析されるとき単一細胞に存在する機能的情報の多くは失われるか又は曖昧になることを意味する。加えて、動的なプロセス(例えば細胞周期)は集団の平均として観察できるものではない。同様に、複雑な組織(例えば脳)の別個の細胞タイプは、細胞が個々に分析される場合にのみ精査することが可能である。
精査される単一細胞の単離で用いられる適切な細胞表面マーカーはしばしば存在せず、たとえそれらが存在するときでも、単一細胞の数が少なければ遺伝子発現の天然の変動範囲を捕捉するには十分ではない。必要なことは、複数の単一細胞の遺伝子発現を分析するために用いることができるcDNAライブラリーを調製する方法である。
本出願は電子的書式の配列表と一緒に提出される。当該配列表の電子的書式の情報は参照によりその全体が本明細書に含まれる。
したがって、本明細書に提示されるある実施態様は、複数の単一細胞からcDNAライブラリーを調製する方法であって、前記方法は以下の工程を含む:各単一細胞からmRNAを放出させて複数の個々のmRNAサンプルを提供する工程(ここで個々の各mRNAサンプル中のmRNAは単一細胞に由来する);個々の各mRNAサンプル中のmRNAからcDNAの第一の鎖を第一鎖合成プライマーにより合成し、さらに当該cDNAにタグを取り込んで複数のタグ付加cDNAサンプルを提供する工程(ここで各タグ付加cDNAサンプル中のcDNAは単一細胞のmRNAと相補的である)。ある実施態様では、当該タグは、細胞特異的識別因子配列及び固有の分子識別因子(UMI)配列を含む。いくつかの実施態様では、当該タグは、UMI無しで細胞特異的な識別因子配列を含む。前記方法はさらに以下の工程を含む:当該タグ付加cDNAサンプルをプールする工程;場合によって当該プールされたcDNAサンプルを増幅させて二本鎖cDNAを含むcDNAライブラリーを作製する工程;及びタグメンテーション反応を実施して、同時に各cDNAを切断しさらに当該cDNAの各鎖にアダプターを取り込み、それによって複数のタグ付加cDNAフラグメントを作製する工程。いくつかの実施態様では、十分な数の単一細胞が存在し、cDNAの増幅を回避することができる。cDNAの第二の鎖は、鋳型を乗り換えるオリゴヌクレオチドプライマー(TSOプライマー)、続いて対称性ネクステラ(Nextera)を用いて合成される。
いくつかの特徴では、追加配列は、固体支持体での増幅のためにプライマー結合配列を含む。いくつかの特徴では、追加配列は追加インデックス配列を含む。
ある種の実施態様では、前記方法はさらに、増幅されたタグ付加cDNAフラグメントを固体支持体上で増幅する工程を含む。
ある種の実施態様では、前記方法はさらに、固体支持体上の増幅生成物を配列決定する工程を含む。
いくつかの特徴では、タグメンテーション反応は、二本鎖cDNAをトランスポザーゼ混合物と接触させる工程を含む。前記トランスポザーゼ混合物は、第一鎖合成プライマーには見出されないアダプター配列を含む。
いくつかの特徴では、トランスポザーゼ混合物は、本質的に、1つのタイプのアダプター配列をもつトランスポゾームから成る。
ある種の実施態様では、前記方法はさらに、タグ付加cDNAを配列決定する工程を含む。
いくつかの特徴では、配列決定工程は3’タグの集計を含む。
いくつかの特徴では、配列決定工程はトランスクリプトーム全体の分析を含む。
いくつかの特徴では、第一鎖合成はランダムプライマーの混合物を用いて実施され、当該ランダムプライマーはさらにタグを含む。
いくつかの特徴では、当該第一鎖合成プライマーは二本鎖部分を含む。いくつかの実施態様では、二本鎖部分を含む当該第一鎖合成プライマーはさらに一本鎖ループを一方の末端に含む。いくつかの特徴では、当該第一鎖合成プライマーはヘアピンを形成できる領域を含む。
いくつかの特徴では、当該第一鎖合成プライマーはRNA領域を含む。
いくつかの特徴では、当該第一鎖合成プライマーは相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、それによって二本鎖部分を形成する。
さらに本明細書には複数のビーズが提示され、ここで、前記ビーズの各々は複数のオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドの各々は以下を含む:(a)リンカー;(b)増幅プライマー結合部位;(c)場合によって、前記オリゴヌクレオチドの各々について異なる固有の分子識別因子;(d)前記ビーズの1つの上の各オリゴヌクレオチドでは同じであるが、他のビーズでは異なる、ビーズ特異的配列;及び(e)mRNAを捕捉し逆転写を開始する捕捉配列。
いくつかの特徴では、前記捕捉配列はオリゴ-dTを含む。
いくつかの特徴では、各ビーズは他のビーズから隔離された分離された液滴中に存在する。
1つ以上の実施態様の詳細が添付の図面及び下記の説明で示される。他の特色、目的及び利点は当該説明及び図面並びに特許請求の範囲から明白となろう。
これまでのところ、もっとも一般的に用いられる単一細胞RNA-Seqのための方法は、CLONTECHTM SMART-SEQTM技術又はその派生物を土台にしている。要するに、オリゴ(dT)プライマーが第一鎖cDNA合成反応を開始する。逆転写酵素(SMARTSCRIBETM)がmRNAの5’末端に到達するとき、当該酵素のターミナルトランスフェラーゼ活性は、いくつかの付加的な非鋳型ヌクレオチドを当該cDNAの3’末端に付加する。鋳型切換えオリゴ(前記は、この非鋳型ヌクレオチドストレッチと塩基対を形成するように設計されている)がアニールして伸長された鋳型を生じ、RTがオリゴヌクレオチドの末端で複製を継続することを可能する(図1)。
本明細書で提示される方法は、例えばU.S. 2012/0010091の明細書(参照によりその全体が本明細書に含まれる)に記載されたサンプル特異的タグを有するタグ付加cDNAを作製する方法を含むことができる。本明細書で用いられるように、単一細胞タグ付加逆転写及びSTRTという用語は、例えばU.S. 2012/0010091の当該取り込まれた資料に開示されている方法を指す。いくつかの実施態様では、二本鎖cDNAはSTRT方法ではDNaseで分解されない。そのかわりに、二本鎖DNAは、トランスポザーゼ(例えば標準的なネクステラ)でタグメンテーションされる。
続いて二本鎖cDNAは配列決定ライブラリーに変換でき、これは、例えば全トランスクリプトームRNA-SeqのためにNEXTERATM又はTRUSEQTM(Illumina, Inc.)を用いるか、又は酵素分解(例えばDNaseI又はフラグメンターゼ)とその後の5'末端配列決定のためのアダプター連結によって行うことができる。両方法とも賛否両論があり、前者は、ライブラリーの準備中にサンプルバーコードの導入が完了してからのみ多重化することができるが、一方、後者は、バーコードを第一鎖合成工程中に導入することができるのでcDNA合成後に多重化できる。したがって、より高い処理能力及びサンプル当たりのより低いコストでは後者に分がある。しかしながら、両方法により得られる情報は異なる適用を有する。すなわち、前者は全トランスクリプトームの配列決定を可能にし、一方、後者は遺伝子発現レベルを調べるだけである。
いくつかの実施態様では、第一鎖合成は(固定された)オリゴdTプライマー(又は場合によってランダマー或いは前記2つの組み合わせ)により開始され、前記オリゴdTには、サンプルバーコード(BC)、増幅プライマー結合部位、及び場合によって鋳型切換え(TS)プライマー配列が添付される。いくつかの実施態様では、増幅プライマー結合部位は、トランスポザーゼアダプター配列、例えばネクステラアダプター配列V2.A14又はV2.B15である。当該バーコードは、PCR複製物の検出を可能にする分子バーコード(固有の分子識別因子又は“UMI”)の前にあっても後ろにあってもよい。逆転写酵素がmRNAの5’末端に達したとき、鋳型切換えは、上記及びU.S. 2012/0010091の取り込まれた資料に記載されているように生じ、TSプライマー配列の相補物を第一鎖cDNAへ取り込む。サンプルバーコードが第一鎖cDNAに導入されてあるので、種々のサンプルがこの時点でプールされうる。引き続き第一鎖プールは二本鎖にされ、場合によってTSプライマーによりPCR反応で増幅される(図2A)。cDNAの両端が相補性配列を含むという事実のために、ヘアピン構造の形成は、小さなフラグメント(例えばアーティファクトなど)の増幅抑制をもたらすであろう。
いくつかの実施態様では、図2A及び3Aに示すように、第一鎖合成はオリゴdTで開始され、前記オリゴdTには、サンプルバーコード(BC)、トランスポザーゼアダプター配列のコピー(“ネクステラV2.A14”)(場合によって分子バーコード(UMI)を有する)、及び鋳型切換え(TS)プライマー配列が添付されてある。cDNA 鎖の3’末端の鋳型切換えは、第一鎖の他方の末端にTSのプライマー配列を取り込む。種々のサンプルのcDNAがこの時点でプールされうる。
したがって、本明細書に提示するある種の実施態様では、全転写物の配列決定を実施するのではなく、3’タグ集計に依拠するデジタル遺伝子発現様式が実施される。本明細書で提示する方法は、第一鎖合成工程で個々の細胞にバーコードを付与する能力を提供する。加えて、安価なオリゴdTプライマー又はランダマーによるcDNA 3’末端のバーコード付与は顕著なコスト削減の利点を提供する。さらにまた、cDNA合成のためのランダマーの使用は、当該方法を3’-タグ集計アッセイに加えて全RNA seqプロトコルにも類似させるので有利である。
第一鎖合成プライマー上のサンプルバーコード及びUMIの順序を変動できることは理解されよう。例えば、いくつかの実施態様では、サンプルバーコード(BC)はUMIに対して3’に配置される。いくつかの実施態様では、サンプルバーコード(BC)はUMIに対して5’に配置される。いくつかの実施態様では、サンプルバーコード(BC)はUMIと直に連続する。いくつかの実施態様では、サンプルバーコード(BC)はUMIから1、2、3、4、5、6、7、8、9、10ヌクレオチド又はそれより大きく離れている。いくつかの実施態様では、サンプルバーコード(BC)は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10ヌクレオチド又はそれより大きくUMIとオーバーラップする。
図7(単一細胞)に示すように、非対称性タグメンテーション(ネクステラバージョンV2B15/V2.A14)と比較してどちらかの対称性タグメンテーション(ネクステラバージョンV2.B15)を用いて遺伝子発現を分析したとき、顕著な数の遺伝子が検出され、さらに他のメトリックが得られた。図8は、ただ1つのトランスポザーゼアダプター(V2.B15)を用いてタグメンテーションを実施するときは2つのトランスポザーゼアダプター(V2.A14及びV2.B15)を用いるタグメンテーションと対比して、転写物のカバー範囲は転写物の3'末端方面にほぼ完全に偏向することを示している。
同様に、いくつかの実施態様では、サンプル及びUMIのバーコード付与は、個々の細胞をビーズとともに隔離することによって実施され、前記ビーズは第一鎖合成のためにUMI及び/又はバーコードタグ付加プライマーを保持する。いくつかの実施態様では、ビーズはエマルジョンの液滴中に隔離される。いくつかの実施態様では、ビーズは、液滴アクチュエーターを用いて隔離及び操作される。図12に示すように、ビーズによるバーコード付与はビーズセットを作製することによって実施でき、各ビーズは固有のセット又はバーコードセットを保持する。
いくつかの実施態様では、本明細書で提供する方法は、全トランスクリプトームの配列決定の実施に利用することができる。そのような実施態様では、第一鎖合成はランダマーによって伸長される。図9Aに示すように、ランダムプライミングは、配列決定可能なフラグメントのウィンドウを、ランダマーがハイブリダイズし第一鎖合成を開始する転写物にわたって任意の場所に拡張する。ランダマーは、サンプルバーコード及び固有の分子識別因子の同じ組み合わせを、他のアダプター及びプライマー結合部位(例えばトランスポゾームアダプター配列及び/又は鋳型切換え(TS)プライマー)に加えて含むことができる。鋳型の乗換え及び第二鎖合成は、オリゴdT開始cDNA合成について上記に記載したように実施することができる。続いて、得られた二本鎖cDNAを上記に記載したようにタグメンテーション反応に付すことができる。オリゴdTと対比されるランダマー使用における相違は、転写物の3’部分ではなくて、当該転写物の完全な(又は実質的に完全な)配列を得ることができるということである。図6に示すように(100pgのRNA)、第一鎖合成のためにどちらかのオリゴdTを用いて遺伝子発現を分析したとき、オリゴdTとランダマーの混合物の使用に比べて顕著な数の遺伝子が検出され、さらに他のメトリックが得られた。
そのような副産物の生成を減少させるか及び/又は最小限にするために、副産物生成の蓋然性を減少させる多様なプライマー設計が本明細書で提示される。例示的な設計は図10に示されるが、ただし本明細書に示すプライマー組成の範囲は当該図面に示す例を超えることは理解されよう。ある実施態様では、プライマーは、ヘアピンを形成し、バーコード、アダプター又は増幅プライマー結合領域の任意の部分に対するランダマーのプライミングを防止又は最小限にする構造を有することができる。プライマー自体で形成される二本鎖部分は、したがってランダマーのハイブリダイゼーションを打倒することができる。いくつかの実施態様では、ヘアピンの二本鎖部分はトランスポザーゼアダプターのモザイク末端(ME)配列を含む。また別に或いは前記に加えて、いくつかの実施態様では二本鎖部分は、モザイク末端配列を超えてトランスポザーゼアダプター配列のいくらか又は全てを含むことができる。いくつかの実施態様では、アダプター配列は短いRNA配列で完全に入れ替えられ、プライマーの長さを減少させ、ランダマーがプライマーとハイブリダイズする潜在能力を最小限にできる。いくつかの実施態様では、当該短いRNA配列の相補物がプライマーの5’末端に又はその近くに提供され、したがってヘアピンの形成を可能にする。いくつかの実施態様では、二本鎖領域が相補的オリゴヌクレオチドをアダプター及び/又はプライマー部分にアニールさせることによって形成され、したがってバーコード、アダプター又は増幅プライマー結合領域の任意の部分に対するランダマーのプライミングを防止又は最小限にし、それによって連結副産物を減少させ又は回避する。
本明細書で用いられるように、“バーコード”又は“BC”という用語は、サンプル又は核酸物質の供給源を識別するために用いることができる核酸タグを指す。したがって、核酸サンプルが複数の供給源に由来する場合、各核酸サンプルの核酸に異なる核酸タグを付すことができ、サンプルの供給源を識別することができる。バーコード(また一般的にインデックス、タグなどと呼ばれる)は当業者には周知である。任意の適切なバーコード又はバーコードセットを、当業界で公知のように又は米国特許8,053,192号及びPCT公開WO05/068656に例示されているように用いることができる(前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる)。単一細胞のバーコード付与は、例えばU.S. 2013/0274117(参照によりその全体が本明細書に含まれる)に記載されているように実施することができる。
2つ以上の供給源に由来する核酸は可変タグ配列を含むことができる。このタグ配列は、長さが100ヌクレオチド(二本鎖分子を指す場合は塩基対)まで、好ましくは長さが1から10ヌクレオチド、もっとも好ましくは長さが4、5又は6ヌクレオチドであることができ、さらにヌクレオチドの組み合わせを含む。例えば、ある実施態様で、タグを形成するために6塩基対が選択されさらに4つの異なるヌクレオチドの順列が用いられるならば、合計4096の核酸アンカー(例えばヘアピン)(その各々が固有の6塩基タグを有する)を作成できる。
本明細書で用いられるように、UMI、固有の識別因子、及び固有の分子識別因子という用語は、複数の核酸分子の各々に付加される固有の核酸配列を指す。例えば、第一鎖cDNA合成中に核酸分子に取り込まれるとき、UMIを用いて、増幅後に配列決定される固有の分子識別因子(UMI)を直接計測することによって、その後の増幅の偏向を修正することができる。UMIの設計、取り込み及び適用は、当業界で公知のように、例えば以下の開示で例示されているように実施することができる:WO 2012/142213;Islam et al. Nat. Methods, 2014, 11:163-166;及びKivioja, T. et al. Nat. Methods (2012) 9: 72-74(前記文献の各々は参照によりその全体が本明細書に含まれる)。
本明細書で用いられるように、“タグメンテーション”という用語は、トランスポゾン末端配列を含むアダプターと複合体を形成したトランスポザーゼ酵素を含むトランスポゾーム複合体によるDNAの改変を指す。タグメンテーションは、DNAのフラグメント化と二重鎖フラグメントの両鎖の5’末端へのアダプターの連結を同時にもたらす。トランスポザーゼ酵素を除去する精製工程の後で、例えばPCR、連結又は当業者に公知の任意の他の適切な方法によって、追加の配列を当該アダプター付加フラグメントの末端に付加することができる。
本発明の方法は、トランスポザーゼ末端配列を受け入れ標的核酸をフラグメントし、転位末端を付加するが非転位末端は付加しない、いずれのトランスポザーゼも用いることができる。“トランスポゾーム”は、少なくとも1つのトランスポザーゼ酵素及びトランスポザーゼ認識部位を含む。“トランスポゾーム”と称される、いくつかのそのような系では、トランスポザーゼは、転移反応を触媒することができるトランスポゾン認識部位と機能的複合体を形成することができる。トランスポザーゼ又はインテグラーゼは、トランスポザーゼ認識部位に結合し、トランスポザーゼ認識部位を時に“タグメンテーション”と称されるプロセスで標的核酸に挿入することができる。いくつかのそのような挿入事象では、トランスポザーゼ認識部位の一方の鎖は標的核酸に移転されうる。
標準的なサンプル調製方法では、各鋳型は挿入物のどちらかの末端にアダプターを含み、さらにDNA又はRNAの改変及び改変反応の所望の生成物の精製の両方においてしばしば多数の工程が要求される。これらの工程は、フローセルへのアダプター付加フラグメントの添加前に溶液中で実施され、前記アダプター付加フラグメントはプライマー伸長反応によって表面に結合される(この反応は、ハイブリダイズされたフラグメントを表面に共有結合的に付着したプライマーの末端にコピーする)。続いて、これらの‘シード’鋳型は、数サイクルの増幅を経てコピーされた鋳型の単一クローン性クラスターを生じる。
いくつかの実施態様では、トランスポゾンによる技術を、例えばNexteraTM DNAサンプル調製キット(Illumina, Inc.)のワークフローに例示されたように、DNAフラグメント化に利用することができる。前記キットでは、ゲノムDNAは操作したトランスポゾームによってフラグメント化でき、前記操作トランスポゾームはインプットDNAのフラグメント化及びタグ付与を同時に達成し(“タグメンテーション”)、それによって、当該フラグメントの末端に固有のアダプター配列を含むフラグメント化核酸分子の集団を作製する。
いくつかの実施態様は以下の使用を含む:高活性Tn5トランスポザーゼ及びTn5型トランスポザーゼ認識部位(Goryshin and Reznikoff, J. Biol. Chem., 273:7367, 1998)、又はMuAトランスポザーゼ並びにR1及びR2末端配列を含むMuトランスポザーゼ認識部位(Mizuuchi, K., Cell, 35:785, 1983;Savilahti, H, et al., EMBO J., 14: 4893, 1995)。高活性Tn5トランスポザーゼと複合体を形成する例示的なトランスポザーゼ認識部位は、例えばEZ-Tn5TMトランスポザーゼ(Epicentre Biotechnologies, Madison, Wis)である。
本明細書で提供されるある種の実施態様に関して用いることができる転移系のさらに多くの例には以下が含まれる:黄色ブドウ球菌Tn552(Colegio et al., J. Bacteriol., 183:2384-8, 2001;Kirby C et al., Mol. Microbiol., 43:173-86, 2002)、Ty1(Devine & Boeke, Nucleic Acids Res., 22:3765-72, 1994及び国際公開WO 95/23875)、トランスポゾンTn7(Craig, N L, Science. 271:1512, 1996;Craig, N L,(論評)Curr Top Microbiol Immunol., 204:27-48, 1996)、Tn/O及びIS10(Kleckner N, et al., Curr Top Microbiol Immunol., 204:49-82, 1996)、マリナートランスポザーゼ(Lampe D J, et al., EMBO J., 15:5470-9, 1996)、Tc1(Plasterk R H, Curr. Topics Microbiol. Immunol., 204:125-43, 1996)、Pエレメント(Gloor, G B, Methods Mol. Biol., 260:97-114, 2004)、Tn3(Ichikawa & Ohtsubo, J Biol. Chem. 265:18829-32, 1990)、細菌挿入配列(Ohtsubo & Sekine, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204:1-26, 1996)、レトロウイルス(Brown, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86:2525-9, 1989)、及び酵母のレトロトランスポゾン(Boeke & Corces, Annu Rev Microbiol. 43:403-34, 1989)。さらに多くの例には以下が含まれる:IS5、Tn10、Tn903、IS911及びトランスポザーゼファミリー酵素の操作版(Zhang et al., PLoS Genet., 5:e1000689. Epub 2009 Oct. 16,2009;Wilson C. et al., J. Microbiol. Methods 71:332-5, 2007).
核酸の5’及び/又は3’末端に付加されるアダプターはユニバーサル配列を含むことができる。ユニバーサル配列は、2つ以上の核酸分子に共通の、すなわちそれらと共有するヌクレオチド配列の領域である。場合によって、当該2つ以上の核酸分子はまた配列が相違する領域を有する。したがって、例えば5'アダプターは同一又はユニバーサル核酸配列を有することができ、3'アダプターは同一又はユニバーサル配列を有することができる。複数の核酸分子の異なるメンバーに存在しうるユニバーサル配列は、当該ユニバーサル配列に相補的なただ1つのユニバーサルプライマーを用いて、多数の異なる配列の複製又は増幅を可能にすることができる。本明細書に提示する例で用いられるいくつかのユニバーサルプライマー配列には、V2.A14及びV2.B15 NexteraTM配列が含まれる。しかしながら、任意の適切なアダプター配列を本明細書に提示する方法及び組成物で利用できることは容易に理解されよう。例えば、Tn5モザイク末端配列A14(Tn5MEA)及び/又はTn5モザイク末端配列B15(Tn5MEB)(前記は下記に示すように相補性非転移配列(NTS)を含む)を、本明細書に提供する方法で用いることができる。
Tn5MEA:5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(配列番号:1)
Tn5MEB:5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(配列番号:2)
Tn5NTS:5’-CTGTCTCTTATACACATCT-3’(配列番号:3)
いくつかの実施態様では、サンプルバーコードを保持するプライマーは溶液中に存在できる。加えて或いはまた別に、UMI配列を保持するプライマーが溶液中に存在できる。例えば、固体支持体は1つ以上の小滴であってもよい。したがって、ある種の実施態様では、複数の液滴が存在でき、この場合、複数の液滴の各々が固有のサンプルバーコード及び/又はUMI配列を保持し、その各々は分子に固有である。したがって、いくつかの実施態様で、バーコードは液滴に固有でありUMIは分子に固有であって、UMIは液滴収集物において何度も繰り返されうることは、当業者には理解されよう。いくつかの実施態様では、個々の細胞を識別するために、当該個々の細胞をサンプルバーコード及び/又はUMI配列の固有のセットを有する液滴と接触させる。いくつかの実施態様では、個々の細胞を識別するために、個々の細胞の溶解物をサンプルバーコード及び/又はUMI配列の固有のセットを有する液滴と接触させる。いくつかの実施態様では、個々の細胞由来の精製核酸を識別するために、個々の細胞由来の精製核酸をサンプルバーコード及び/又はUMI配列の固有のセットを有する液滴と接触させる。
液滴を形成及び操作する適切な任意の系を本明細書に提示の実施態様で用いることができ、この場合、複数の液滴中の各液滴はサンプルバーコード及び/又はUMI配列の固有のセットを保持する。例えば、液滴アクチュエーターを用いることができる。
“磁気応答性”は磁場に応答することを意味する。“磁気応答性ビーズ”は磁気応答性材料を含むか、又は磁気応答性材料で構成される。磁気応答性材料の例には、常磁性材料、強磁性材料、フェリ磁性材料、及びメタ磁性材料が含まれる。適切な常磁性材料の例には、鉄、ニッケル、及びコバルトが、酸化金属(例えばFe3O4、BaFe12O19、CoO、NiO、Mn2O3、Cr2O3及びCoMnP)と同様に含まれる。
任意の形態の液体(例えば液滴又は連続体で、移動しているか静止しているかは関係がない)が、電極、アレイ、マトリックス又は表面“上に”、前記“に”、又は前記の“上部に”存在すると記載されているとき、そのような液体は当該電極/アレイ/マトリックス/表面と直接接触しているか、又は当該液体と当該電極/アレイ/マトリックス/表面との間に介在する1つ以上の層又はフィルムと接触しうる。ある実施態様では、充填液は、そのような液体と電極/アレイ/マトリックス/表面との間のフィルムとみなすことができる。
液滴が液滴アクチュエーター“上に”、又は前記に“ローディングされて”存在すると記載されているとき、当該液滴は、液滴アクチュエーターを用いて当該液滴上での1つ以上の液滴操作の実施を容易にする態様で当該液滴アクチュエーター上に配置されていること、当該液滴は、液滴の特性又は液滴のシグナルの検出を容易にする態様で当該液滴アクチュエーター上に配置されていること、及び/又は当該液滴は液滴アクチュエーター上で液滴操作に付されていることは理解されよう。
いくつかの実施態様では、サンプルバーコードを保持するプライマーを固体支持体に固定することができる。加えて或いはまた別に、UMI配列を保持するプライマーを固体支持体に固定できる。例えば、固体支持体は1つ以上のビーズでありうる。したがって、ある種の実施態様では、複数のビーズが存在し、当該複数のビーズの各々は、固有のサンプルバーコード及び/又はUMI配列を保持できる。いくつかの実施態様では、個々の細胞をサンプルバーコード及びUMI配列の固有のセットを有する1つ以上のビーズと接触させて、個々の細胞が識別される。いくつかの実施態様では、個々の細胞の溶解物をサンプルバーコード及びUMI配列の固有のセットを有する1つ以上のビーズと接触させて、個々の細胞溶解物が識別される。いくつかの実施態様では、個々の細胞の精製核酸をサンプルバーコード及びUMI配列の固有のセットを有する1つ以上のビーズと接触させて、個々の細胞の精製核酸が識別される。ビーズは、当業界で公知である任意の適切な態様で、上記に記載の液滴アクチュエーターを用いて操作できる。
本明細書の“固体表面”、“固体支持体”及び他の文法的等価物は、本明細書に記載のプライマー、バーコード及び配列の添付に適切な、又は適切であるように改変できる任意の材料を指す。当業者には理解されるところであるが、可能な基材の数は非常に多い。可能な基材には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない:ガラス又は改変若しくは官能化ガラス、プラスチック(アクリル、ポリスチレン及びスチレンと他の物質のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロンTMなどを含む)、多糖類、ナイロン又はニトロセルロース、セラミクス、樹脂、シリカ又はシリカ系物質(シリコン及び改変シリコンを含む)、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、光ファイバー束、及び他の多様なポリマー。いくつかの実施態様のための特に有用な固体支持体及び固体表面はフローセル装置内に配置される。例示的フローセルは下記でさらに詳細に示される。
いくつかの実施態様では、固体支持体は、ウェル又は表面の凹部のアレイを含む。前記は、多様な技術(フォトリソグラフィー、スタンプ技術、鋳造技術及び微細エッチング技術を含むが、ただしこれらに限定されない)を用い、当業界で一般的に知られているように製作できる。当業者には理解されるところであるが、用いられる技術はアレイ基板の組成及び形状に左右されるであろう。
いくつかの実施態様では、固体支持体又はその表面は非平面的、例えばチューブ又は容器の内側又は外側表面である。いくつかの実施態様では、固体支持体は微小球又はビーズを含む。本明細書の“微小球”又は“ビーズ”又は“粒子”又はその文法的等価物は、小さな別々の粒子を意味する。適切なビーズ組成には、プラスチック、セラミクス、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリルポリマー、常磁性材料、トリアゾール、カーボングラファイト、二酸化チタン、ラテックス又は架橋デキストラン、例えばセファロース、セルロース、ナイロン、架橋ミセル及びテフロンの他に、固体支持体について本明細書で概略した任意の他の材料が含まれ(ただし前記に限定されない)、いずれも用いることができる。以下の文献は有益な手引書である:“Microsphere Detection Guide”(Bangs Laboratories, Fishers Ind.)。ある種の実施態様では、微小球は磁性微小球又はビーズである。
ビーズは球体である必要はなく、不規則粒子を用いてもよい。また別に或いは前記に加えて、ビーズは多孔性でもよい。ビーズのサイズはナノメートル(すなわち100nm)からミリメートル(すなわち1mm)の範囲であり、約0.2ミクロンから約200ミクロンのビーズが好ましく、約0.5から約5ミクロンが特に好ましいが、ただしいくつかの実施態様では、これらのサイズより小さい又は大きいビーズも用いることができる。
本出願を通して、多様な刊行物、特許及び/又は特許出願を参照した。これら刊行物の開示は参照によりその全体が本出願に含まれる。
本明細書では用語は無制限であることが意図され、列挙したエレメントだけでなく任意の追加エレメントも包含される。
多数の実施態様を記載したが、それにもかかわらず、多様な改変を実施することができることは理解されよう。したがって、他の実施態様も以下の特許請求の範囲内である。
Claims (19)
- 以下の工程を含む、複数の単一細胞からcDNAライブラリーを調製する方法:
各単一細胞からmRNAを放出させて複数の個々のmRNAサンプルを提供する工程(個々の各mRNAサンプル中のmRNAは単一細胞に由来する);
個々の各mRNAサンプル中のmRNAからcDNAの第一の鎖を第一鎖合成プライマーにより合成し、さらに当該cDNAにタグを取り込んで複数のタグ付加cDNAサンプルを提供する工程(ここで各タグ付加cDNAサンプル中のcDNAは単一細胞のmRNAと相補的であり、当該タグは細胞特異的な識別因子配列及び固有の分子識別因子(UMI)配列を含む);
前記複数の単一細胞からの当該タグ付加cDNAサンプルをプールする工程;
場合によって、当該プールしたcDNAサンプルを増幅して二本鎖cDNAを含むcDNAライブラリーを作製する工程;及び
前記プールしたタグ付加cDNAサンプルにタグメンテーション反応を実施して、同時に各cDNAを切断しさらに当該cDNAの各鎖にアダプターを取り込み、それによって前記複数の単一細胞からcDNAライブラリーを作製する工程。 - さらにタグ付加cDNAフラグメントを増幅して増幅されたタグ付加cDNAフラグメントを作製する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 増幅工程が増幅生成物の5’末端に追加配列を付加する工程を含む、請求項2に記載の方法。
- 追加配列が固体支持体上の増幅のためにプライマー結合配列を含む、請求項3に記載の方法。
- さらに当該増幅されたタグ付加cDNAフラグメントを固体支持体上で増幅する工程を含む、請求項4に記載の方法。
- さらに固体支持体上の増幅生成物を配列決定する工程を含む、請求項5に記載の方法。
- タグメンテーション反応が、二本鎖cDNAをトランスポザーゼ混合物と接触させる工程を含み、前記トランスポザーゼ混合物は第一鎖合成プライマーには見出されないアダプター配列を含む、請求項1に記載の方法。
- トランスポザーゼ混合物が、本質的に、1つのタイプのアダプター配列をもつトランスポゾームから成る、請求項7に記載の方法。
- さらにタグ付加cDNAを配列決定する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 配列決定工程が3’タグを集計する工程を含む、請求項9に記載の方法。
- 配列決定工程が全トランスクリプトームの分析を含む、請求項9に記載の方法。
- 第一鎖合成がランダムプライマーの混合物を用いて実施され、当該ランダムプライマーがさらにタグを含む、請求項1に記載の方法。
- 第一鎖合成プライマーが二本鎖部分を含む、請求項12に記載の方法。
- 第一鎖合成プライマーが、一本鎖の第一鎖合成プライマーと比較して連結副産物を減少させる、請求項13に記載の方法。
- 第一鎖合成プライマーがヘアピンを形成できる領域を含む、請求項13に記載の方法。
- 第一鎖合成プライマーがRNA領域を含む、請求項13に記載の方法。
- 第一鎖合成プライマーが相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、それによって二本鎖部分を形成する、請求項13に記載の方法。
- 複数のビーズであって、前記ビーズの各々が複数のオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドの各々が、
(a)リンカー、
(b)増幅プライマー結合部位、
(c)前記オリゴヌクレオチドの各々について異なる固有の分子識別因子を含むタグ、および、前記ビーズの1つの上の各オリゴヌクレオチドでは同じであるが、他のビーズでは異なる、ビーズ特異的配列、及び、
(d)mRNAを捕捉し逆転写を開始する捕捉配列としてのオリゴ-dT、
をビーズから(a)から(d)の順番で含む、前記複数のビーズ。 - 各ビーズが他のビーズから隔離された別々の液滴中に存在する、請求項18に記載の複数のビーズ。
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