JP5054096B2 - 液滴に基づく生化学 - Google Patents

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Description

１．登録情報
本発明をもたらす研究は、登録番号ＹＹＹのＸＸＸにより少なくとも部分的に支援される。米連邦は、本明細書に記載される本発明において一定の権利を有しうる。
２．関連出願
本出願はまた、２００６年４月１３日出願の「Apparatus and Methods for Droplet-Based Protein Crystallization」というタイトルの関連する米国特許仮出願第６０／７４４，７８０号、２００６年４月１８日出願の「Filler Fluids for Droplet-Based Microfluidics」というタイトルの関連する米国特許仮出願第６０／７４５，０５８号、２００６年４月１８日出願の「Apparatus and Methods for Droplet-Based Protein Crystallization」というタイトルの関連する米国特許仮出願第６０／７４５，０４９号、２００６年４月１８日出願の「Apparatus and Methods for Droplet-Based Blood Chemistry」というタイトルの関連する米国特許仮出願第６０／７４５，０３９号、２００６年４月１８日出願の「Apparatus and Methods for Droplet-Based PCR」というタイトルの関連する米国特許仮出願第６０／７４５，０７３号、２００６年４月１８日出願の「Apparatus and Methods for Droplet-Based Immunoassay」というタイトルの関連する米国特許仮出願第６０／７４５，０５９号、２００６年４月２８日出願の「Apparatus and Method for Manipulating Droplets with a Predetermined Number of Cells」というタイトルの関連する米国特許仮出願第６０／７４５，９１４号、２００６年４月２８日出願の「Apparatus and Methods of Sample Preparation for a Droplet Microactuator」というタイトルの関連する米国特許仮出願第６０／７４５，９５０号、２００６年５月９日出願の「Portable Analyzer Using Droplet-Based Microfluidics」というタイトルの関連する米国特許仮出願第６０／７４６，７９７号、２００６年５月９日出願の「Apparatus and Methods for Droplet-Based Immuno-PCR」というタイトルの関連する米国特許仮出願第６０／７４６，８０１号、２００６年４月１８日出願の「Droplet-Based Multi-Well Plate」というタイトルの関連する米国特許仮出願第６０／７４５，０５４号、２００６年６月３０日出願の「Droplet Microactuator Stamping Platform」というタイトルの関連する米国特許仮出願第６０／８０６，４００号、２００６年６月３０日出願の「Systems and Methods for Droplet Microactuator Operations」というタイトルの関連する米国特許仮出願第６０／８０６，４１２号、および２００６年７月１２日出願の「Method and Apparatus for Droplet-Based Nucleic Acid Amplification」というタイトルの関連する米国特許仮出願第６０／８０７，１０４号、に関連し、参考として組み込まれる。
３．発明の分野
本発明は、液滴マイクロアクチュエータ、ならびに個々の液滴を用いて種々のプロトコルを実行するために液滴マイクロアクチュエータを用いるシステム、装置、および方法に関する。本発明は、たとえば、生化学的分析および／または生物学的分析の性能に関するプロトコルを実行する際に有用である。本発明はまた、液滴に基づくプロトコルを実行するためのシステムおよび方法に関する。
４．発明の背景
生化学的分析および他の分析を迅速に行う機能は、種々の分野において不可欠である。たとえば、感染症の迅速かつ正確な診断は、個別の被検者の疾病の効果的な管理および多剤耐性病原菌および市中感染の公衆衛生問題の改善の両方にとって非常に重要である。
現在のＰＣＲに基づくＤＮＡ増幅方法は、高い試薬コスト、労働集約性および相互汚染に対する感受性を含む複数の欠点を被る。さらに、培養に比べて、ＰＣＲ試験は、複数の種、毒性因子および薬物抵抗マーカーを同時に分析することがあまりできない。病原菌の感度および費用効果的な定量化に欠けることがよくある。当該分野では、これらの分析が、最小の訓練で、試料収集点に適用されることが潜在的に可能であるように、技術の小型化および自動化も行うと同時に、これらの制限を克服する核酸の検出のための改善された装置が必要とされている。
核酸配列は、全ゲノム配列、診断、薬理ゲノム学および法医学などの種々の分野においてますます一般的になりつつある。しかし、配列決定分野は、配列決定装置の高価性によって阻まれている。安価かつハイスループットの検査システムの開発は、遺伝子検査の普及およびそれに関連する多くの利益にとって非常に重要である。したがって、妥当な費用で核酸を迅速かつ確実に配列決定することができる新たな技術的プラットフォームが必要とされている。本明細書に記載される本発明は、安価な、液滴に基づく配列決定システムを提供する。
免疫測定は、臨床診断に関して広く用いられ、米国だけで３０億ドル以上の市場を構成している。免疫測定は、臨床検査室において日常的に用いられる最も感度が高い特定方法の１つである。免疫測定は、抗原とその同種抗体との間の結合における高い親和性および特異性を利用して、試料マトリクスにおける抗原を検出して定量化する。ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着分析法）などの異種免疫測定は、最も感度が高い特定臨床分析方法の１つであり、大きな分類の抗原および抗体の同定のために広く用いられている。たとえば、免疫測定は、中でも心臓マーカー、腫瘍マーカー、薬物、ホルモンおよび感染症の同定のために行われる。
少量の試料消費、より高速の分析および完全な自動化は、いかなる臨床分析機器においても継続的な改善を必要とする３つのかなり望ましい特徴である。最新の研究室免疫測定分析機器は、良好な自動化およびスループットを提供するが、検査ごとに多量の試料（死容積を含む）および非常に長い分析時間を必要とする。これらの分析機器の長い分析時間および大きなサイズは、試料点収集設定において用いるのに実用的ではない。
また、免疫測定性能において相当の変動性があり、技術に起因する大部分において、操作者に依り、２つ以上の研究室が用いられる場合には、同一の研究内であっても、研究ごとの結果を比較することが困難である結果を生じる。操作者依存を排除し、免疫監視分析のために結果を標準化する完全自動化された統合型分析機器は、分析からの結果の解釈を相当改善することになる。
免疫測定の自動化において大幅な進展があったが、これらの分析機器は、法外に高価であり、低いスループットの調査設定において手ごろな価格ではない。自動プレート洗浄機、培養器および集積光学を備えた下端システムは、マイクロタイタープレートに抗体を準備し、プレートの上に試料を投入するなどの免疫測定における複数の主要工程を実行するために、依然として熟練技術者を必要とする。これは、手動操作が繰り返されるために人的エラーが結果として生じ、分析間および分析内の変動の大きな要因である。
また、医薬、環境および生物テロに関連する検出分野などの種々の分野において、試料点収集検査も必要とされている。一例として臨床血液分析用の試料点収集（ＰＯＣ）検査は改善されているが、現在の医療的ケアに関して主要な課題が残っている。理想的には、ＰＯＣ検査は、大きな研究室設備の必要性を回避することによって、臨床医が実時間で診断して救命技術を施すことを可能にする。当該分野では、ＰＯＣで、低容量の試料における血液ガス、代謝産物、電解質、酵素、ＤＮＡ、タンパク質および細胞の同時監視を可能にするラボ・オン・ア・チップが依然として必要とされている。
流体のマイクロ流体制御は、成功するラボ・オン・ア・チップに関する本質的な要件である。マイクロ流体システムは、連続フローおよび離散フローに基づくアーキテクチャに大まかにグループ化されうる。その名前が示すように、連続フローシステムは、チャネル内の液体の連続フローに基づくのに対して、離散フローシステムは、チャネル内またはチャネルレスのいずれかのアーキテクチャにおける流体の液滴を利用する。連続フローシステムの一般的な制限は、液体輸送が永久に固定されたチャネルに物理的に閉じ込められることである。用いられる輸送機構は通常、外部ポンプによって圧力駆動されるか、または高電圧によって動電学的に駆動される。これらの手法は、複雑なチャネリングを伴い、外部弁または電源の形態で大型支持システムを必要とする。これらの制約は、高度の機能の統合化を達成し、常套の連続フローシステム、特に試料点収集において手持ち式デバイスを実現する際に制御することを困難にする。当該分野では、液滴の操作を利用する試料点収集検査システム、特に、単独のチップで複数の検査または複数のタイプの検査を実現することができるシステムが依然として必要とされている。
５．発明の簡単な説明
本発明の一態様は、液滴に基づく洗浄に関する。この態様の一実施形態によれば、低濃度の物質を有する表面と接触する液滴を提供する方法が提供され、該方法は、（ａ）物質の開始濃度および開始量を含み、開始容積を有する液滴と接触する表面を提供すること、（ｂ）工程（ａ）において提供された液滴と洗浄液滴とを合わせ、混合液滴を生成するために１つまたは複数の液滴操作を行うこと、ならびに（ｃ）混合液滴を分割し、（ｉ）開始濃度に対して減少した濃度の物質を有する表面と接触する液滴、および（ｉｉ）表面から分離される液滴、を備える一連の液滴を生成するために、１つまたは複数の液滴操作を行う、ことを備える。
本発明の別の態様は、液滴に基づく表面改質および洗浄に関する。この態様の一実施形態によれば、低濃度の物質を有する表面と接触する液滴を提供する方法が提供され、該方法は、（ａ）物質の開始濃度および開始量を含み、開始容積を有する液滴と接触する表面を含む液滴マイクロアクチュエータを提供すること、（ｂ）工程（ａ）において提供された液滴と洗浄液滴とを合わせ、混合液滴を生成するために１つまたは複数の液滴操作を行うこと、ならびに（ｃ）混合液滴を分割し、（ｉ）開始濃度に対して減少した濃度の物質を有する表面と接触する液滴、および（ｉｉ）表面から分離される液滴、を含む一連の液滴を生じるために１つまたは複数の液滴操作を行うことを備える。別の実施形態によれば、液滴マイクロアクチュエータにおいて表面を改質する方法が提供され、該方法は、表面改質剤を含む液滴を表面と接触させるために１つまたは複数の液滴操作を実行することを含む。さらに別の実施形態によれば、液滴マイクロアクチュエータが提供され、その表面に固定化され、液滴マイクロアクチュエータ上の液滴が表面と接触しうるように配置される試料または試薬を含む。さらに別の実施形態によれば、物質が固定された表面から物質を除去する方法が提供され、該方法は、表面と液滴とを接触させるために１つまたは複数の液滴操作を行うことを含み、該液滴は表面から物質を溶出するための溶液を含む。
本発明のさらに別の態様は、液滴に基づく核酸増幅デバイス、システムおよび方法に関する。この態様の一実施形態によれば、液滴マイクロアクチュエータが提供され、（ａ）液滴操作を行うための電極を備える基材、ならびに（ｂ）液滴マイクロアクチュエータの領域を加熱および／または冷却する１つまたは複数の電極に近接して配置され、液滴が加熱のための領域に電極上で移動されうるように配置される１つまたは複数の温度制御手段を備える。
本発明のさらに他の態様は、液滴に基づく核酸増幅方法および装置に関する。この態様の一実施形態によれば、生物学的試料における核酸を増幅する方法が提供され、該方法は、（ａ）命令を実行することができるプロセッサに電子的に連結されて制御される液滴マイクロアクチュエータであって、（ｉ）標的核酸を潜在的に含む試料、（ｉｉ）液滴操作を行うための電極を含む基材、および（ｉｉｉ）液滴マイクロアクチュエータの領域を加熱および／または冷却するための１つまたは複数の電極に近接して配置され、液滴が加熱のための領域に電極上で移動されうるように配置される１つまたは複数の温度制御手段、を含む液滴マイクロアクチュエータを備えたシステムを提供すること、（ｂ）液滴マイクロアクチュエータにおいて、１つまたは複数の増幅試薬液滴と、１つまたは複数の試料液滴とを組み合わせ、増幅準備の整った液滴を生成するために液滴操作を用いること、ならびに（ｃ）増幅準備の整った液滴に存在するときに、標的核酸の増幅を結果として生じるほど十分に増幅準備の整った液滴に熱サイクルを施すこと、を備える。別の実施形態によれば、液滴マイクロアクチュエータ上で核酸を増幅する方法が提供され、該方法は、基材上の１つまたは複数の加熱領域を介して５０ｎＬを超えない容積を有する増幅準備の整った液滴を反復的に輸送することを含む。さらに別の実施形態によれば、高温で液滴操作を行う方法が提供され、該方法は、（ａ）液滴マイクロアクチュエータを提供すること、（ｂ）加熱された液滴を生成するため、その上の液滴を約２５℃を超える温度まで加熱すること、および（ｃ）加熱された液滴に液滴操作を行うこと、を備える。さらに別の実施形態によれば、蛍光材料を用いて行われる液滴マイクロアクチュエータが提供され、液滴から蛍光信号を検出するための検出領域を備え、検出領域は、光吸収材料、低蛍光材料または非蛍光材料でコーティングされている。
本発明の別の態様は、液滴に基づく診断に関する。この態様の一実施形態によれば、液滴マイクロアクチュエータシステムが提供され、（ａ）液滴操作を行うように構成された液滴マイクロアクチュエータ、および（ｂ）液滴マイクロアクチュエータとの検知関係において構成されるセンサを含み、センサが、液滴マイクロアクチュエータにおける１つまたは複数の液滴からの信号および／または１つまたは複数の液滴の特性を検知することができるようになっている。
本発明のさらに別の態様は、液滴に基づく親和性分析に関する。この態様の一実施形態によれば、試料における標的検体を検出する方法が提供され、該方法は、（ａ）液滴マイクロアクチュエータにおける親和性に基づく分析試薬と標的検体を潜在的に含む試料とを合わせ、検体の存在、不在および／または量を表す信号を生成するために、液滴操作を実行すること、ならびに（ｂ）信号を検出すること、を含み、信号は、試料における検体の存在、不在および／または量に対応する。
本発明のさらに他の態様は、液滴に基づく親和性分析デバイスおよびシステムに関する。この態様の一実施形態によれば、液滴マイクロアクチュエータが提供され、表面に固定化された抗体を備える。別の実施形態によれば、液滴マイクロアクチュエータが提供され、液滴マイクロアクチュエータ上に液滴を含む。液滴は、抗体を含む。
本発明の別の態様は、液滴操作用の充填剤流体に関する。この態様の一実施形態によれば、液滴マイクロアクチュエータが提供され、（ａ）基材の表面で液滴操作を行うように構成された電極を含む第１の基材、（ｂ）第１の基材と第２の基材との間の内部容積を画定するほど十分な距離であって、第１の基材における空間に置かれた液滴を収容するのに十分である距離分、基材の表面から離隔される第２の基材、および（ｃ）内部容積に配置され、電極を用いて液滴で液滴操作を行うことを可能にする様式で電極に対して配置される液滴を、備える。別の実施形態によれば、液滴マイクロアクチュエータが提供され、（ａ）吐出または分配液滴操作を行うための電極、および（ｂ）吐出または分配操作中に１つの液滴中の実質的に全てのビーズを強いて保持するための、液滴に十分に近接する電磁石、を含む基材を備える。さらに別の実施形態によれば、液滴マイクロアクチュエータが提供され、液滴操作を行うための電極を含む基材を含み、基材の少なくとも一部は、液滴操作を行うための電極を含み、第２の基材を欠き、液滴操作が、実質的に平行な基材を欠く基材で行われうるようになっている。さらに別の実施形態によれば、液滴マイクロアクチュエータが提供され、液滴操作を行うための１つまたは複数の電極を含み、１つまたは複数の電極は、電極に位置決めされる液滴との光の伝搬用にその中に開口部を含む。別の実施形態によれば、液滴マイクロアクチュエータが提供され、液滴操作を行うための１つまたは複数の実質的に透明な電極を含み、１つまたは複数の電極は、電極に位置決めされる液滴との光の伝搬用の窓を残すマスクによって部分的に覆われている。さらに別の実施形態によれば、液滴マイクロアクチュエータが提供され、その上に不透明な充填剤流体および透明な液滴を含む。
本発明のさらに別の態様は、液滴に基づく粒子選別に関する。この態様の一実施形態によれば、液滴マイクロアクチュエータが提供され、（ａ）粒子の懸濁液、および（ｂ）粒子を含む液滴を用いた液滴操作を行うために配置された電極、を含む。別の実施形態によれば、液滴マイクロアクチュエータが提供され、液滴において１つの粒子を含む液滴を含む。さらに別の実施形態によれば、粒子を輸送する方法が提供され、この方法は、粒子を含む液滴を提供すること、および液滴マイクロアクチュエータ上に液滴を輸送することを含む。さらに別の実施形態によれば、１つの粒子を含む液滴を提供する方法が提供され、該方法は、（ａ）粒子の懸濁液を含む液滴を提供すること、（ｂ）分配された液滴を提供するため（ａ）の液滴から液滴を分配すること、ならびに（ｃ）分配された液滴が１つの粒子および／または所望の粒子タイプを含むかどうかを決定すること、を含む。
６．定義
本明細書で用いられるとき、以下の用語は、示された意味を有する。
１つまたは複数の電極に関して「活性化する」とは、液滴操作を結果として生じる１つまたは複数の電極の電気状態における変化をもたらすことを意味する。
「親和性」は、別の分子または基材に対する一分子の特定または非特定の分子内の誘引、たとえば、その対応する抗原またはハプテンに対する抗体の誘引を意味する。
「検体」は、試料に存在しうる検出のための標的物質を意味する。具体的な例としては、抗原物質、ハプテン、抗体、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ヌクレオチド、核酸、薬物、イオン、塩、小分子、細胞などが挙げられる。
「抗体」は、エピトープまたはハプテンに対して親和性を有するポリペプチドを意味する。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメントおよび／または特定の結合対の対応するメンバーを結合することが可能な人工分子であってもよい。抗体は、標識化されてもよく、または抗体の直接検出または間接検出および／または定量化を容易にする分子に標識化され、または接合されていてもよい。
液滴マイクロアクチュエータにおけるビーズに関する「ビーズ」は、液滴マイクロアクチュエータ上にある、または液滴マイクロアクチュエータに近接する液滴と相互作用することが可能な任意のビーズまたは粒子を意味する。ビーズは、種々の形状、たとえば、球、略球、卵形、円盤形、立方体および他の３次元形状などのいずれであってもよい。ビーズは、たとえば、液滴マイクロアクチュエータ上で液滴に輸送されてもよく、液滴マイクロアクチュエータ上の液滴を液滴マイクロアクチュエータ上の、および／または液滴マイクロアクチュエータ以外のビーズと接触させることが可能な様式で、液滴マイクロアクチュエータに対して構成されていてもよい。ビーズは、たとえば、樹脂およびポリマーをはじめとする種々の材料を用いて製造されてもよい。ビーズは、たとえば、マイクロビーズ、マイクロ粒子、ナノビーズおよびナノ粒子をはじめとする任意の適切なサイズであってもよい。一部の場合には、ビーズは、磁気応答性である。他の場合には、ビーズは、あまり磁気応性ではない。磁気応答性ビーズの場合には、磁気応答性材料が、ビーズの実質的にすべてまたはビーズの唯一の構成要素を構成してもよい。ビーズの残余は、中でもポリマー材料、コーティングおよび分析試薬の付着を可能にする部分を含んでもよい。適切な磁気応答性ビーズの実施例としては、２００５年１１月２４日公開の「Multiplex flow assays prefereably with magnetic particles as solid phase」というタイトルの米国特許公開第２００５−０２６０６８６号に記載され、その開示内容全体が、磁気応答性材料およびビーズに関する教示のために、参考として本明細書に組み込まれる。
「ｄＮＴＰ」は、デオキシヌクレオチド三リン酸を意味し、ヌクレオチドは、Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵなどの任意のヌクレオチドである。「ｄｄＮＴＰ」は、ジデオキシヌクレオチド三リン酸を意味し、ヌクレオチドは、Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵなどの任意のヌクレオチドである。他に特記のない限り、ｄｄＮＴＰは、ｄＮＴＰと置換することができ、その逆も可能であることは、十分に認識されよう。
「液滴」は、充填剤流体によって少なくとも部分的に制限される、液滴マイクロアクチュエータ上の一定容量の液体を表す。たとえば、液滴は、充填剤流体によって完全に包囲されてもよく、または充填剤流体、および液滴マイクロアクチュエータの１つまたは複数の表面によって制限されてもよい。液滴は、種々の形状をとってもよく、非限定的な実施例としては、略円盤形、弾丸形、切頭球、楕円、球、部分的に圧縮した球、半球、卵形、円筒形および混合または分割などの液滴操作中に形成される種々の形状、または液滴マイクロアクチュエータの１つまたは複数の表面とのそのような形状の接触の結果として形成される種々の形状が挙げられる。
「液滴操作」は、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴の任意の操作を意味する。液滴操作としては、たとえば、液滴マイクロアクチュエータ内への液滴の投入、供給源の液滴からの１つまたは複数の液滴の分配、液滴の２つ以上の液滴への分割、分離または分裂、任意の方向におけるある位置から別の位置への液滴の輸送、２つ以上の液滴の１つの液滴への融合または結合、液滴の希釈、液滴の混合、液滴の攪拌、液滴の変形、液滴の所定の位置での保持、液滴の培養、液滴の加熱、液滴の気化、液滴の冷却、液滴の配置、液滴マイクロアクチュエータからの液滴の輸送、本明細書に記載される他の液滴操作および／または上記の操作の任意の組み合わせが挙げられる。「融合する」「融合」「結合する」「結合」などの用語は、２つ以上の液滴から１つの液滴を作成することを記述するために用いられる。そのような用語は、２つ以上の液滴に関して用いられる場合には、２つ以上の液滴を組み合わせて結果として１つの液滴にするのに十分な液滴操作の任意の組み合わせを用いてもよいことを理解すべきである。たとえば、「液滴Ｂと液滴Ａとの融合」は、静止している液滴Ｂと接触させるように液滴Ａを輸送すること、静止している液滴Ａと接触させるように液滴Ｂを輸送すること、または液滴Ａおよび液滴Ｂを互いに接触するように輸送することによって達成されうる。「分割」「分離」および「分裂」は、結果として生じる液滴のサイズに対して任意の具体的な成果（すなわち、結果として生じる液滴のサイズは、同一であっても異なっていてもよい）または結果として生じる液滴の数（結果として生じる液滴の数は２、３、４、５またはそれより多くてもよい）を暗示することを意図していない。「混合」なる用語は、液滴内の１つまたは複数の構成要素のより均質な分配を結果として生じる液滴を意味する。「投入」液滴操作の実施例としては、マイクロ透析投入、圧力補助投入、ロボット投入、受動的投入およびピペット投入が挙げられる。
「電子的結合」は、２つ以上の構成要素または要素の間の電気的関係またはデータ関係を示すために本明細書において用いられる。したがって、第１の構成要素が、第２の構成要素に電子的に結合されることになっているという事実は、さらなる構成要素が、第１の構成要素と第２の構成要素との間に存在してもよく、第１の構成要素および第２の構成要素と動作可能に関連付けられてもよく、または第１の構成要素および第２の構成要素と連動してもよいという可能性を排除することを意図していない。さらに、電気的に結合される構成要素は、一部の実施形態において、構成要素を介在する無線電信を含んでもよい。
液滴マイクロアクチュエータマップなどのユーザインターフェイスなどに関連して用いられる「強調」は、本明細書において述べるとき、たとえば、色、明るさ、陰影、形状における変化によって、またはシンボル、アイコンまたは他の可視識別子の出現／消失によって、ユーザインターフェイスまたはマップの構成要素が視覚的に区別されうることを意味する。たとえば、ユーザインターフェイスにおける電極の表示にマウスポインタを重ねること、またはユーザインターフェイスにおける電極の表示を選択することにより、電極表示の色を変化させてもよい。音もまた、システムとユーザとの相互作用をさらに容易にするために、強調された項目に付随して生じてもよい。
「入力デバイス」は、情報をコンピュータシステム内またはネットワーク上に入力するためのデバイスおよび方法のすべての可能なタイプを示すために広く用いられる。実施例としては、スタイラスに基づくデバイス、ペンに基づくデバース、キーボードデバイス、キーパッドデバイス、タッチパッドデバイス、タッチスクリーンデバイス、ジョイスティックデバイス、トラックボールデバイス、マウスデバイス、バーコードリーダデバイス、磁気ストリップリーダデバイス、赤外線デバイス、音声認識技術が挙げられる。
「磁気応答性」は、磁界に対する応答性を意味する。磁気応答性材料の実施例としては、常磁性材料、強磁性材料、フェリ磁性材料およびメタ磁性材料が挙げられる。適切な常磁性材料の実施例としては、鉄、ニッケルおよびコバルトのほか、Ｆｅ３Ｏ４、ＢａＦｅ１２Ｏ１９、ＣｏＯ、ＮｉＯ、Ｍｎ２Ｏ３、Ｃｒ２Ｏ３およびＣｏＭｎＰなどの金属酸化物が挙げられる。
「出力デバイス」は、コンピュータシステムからユーザまたは別のシステムに情報またはデータを出力するためのデバイスおよび方法のすべての可能なタイプを示すために広く用いられる。実施例としては、視覚的表示、ＬＥＤ、プリンタ、スピーカ、モデムおよび無線トランシーバが挙げられる。
「プロトコル」は、非限定的に、１つまたは複数の液滴マイクロアクチュエータにおける液滴操作を含む一連の工程を意味する。
ユーザインターフェイス上に表示されたアイコン、フィールドまたは仮想ボタンなどのユーザ相互作用性要素に関して「選択」は、対象物に関連する命令の実行を結果として生じる入力を提供することを意味する。したがって、たとえば、電極表示を指してクリックすることによる液滴マイクロアクチュエータマップ上に表示された電極の表示の選択は、実際の電極を作動するために必要な命令および／または実際の電極の作動を命令する一連の命令にコードの行を追加するために必要な命令の実行を結果として生じてもよい。選択は、マウス、ジョイスティックおよび／またはキーボードなどの種々の入力デバイスのいずれかまたは入力デバイスの組み合わせを用いて達成されてもよい。
抗体または検体中、表面上などの分子の固定化に関する「表面」は、液滴マイクロアクチュエータ上の液滴と相互作用するための機能を保持しながら分子を固定化することができる任意の表面を意味する。たとえば、表面は、液滴マイクロアクチュエータの上部プレートまたは下部プレートにおける表面などの液滴マイクロアクチュエータにおける表面、液滴マイクロアクチュエータの上部プレートまたは下部プレートから延在する表面、液滴マイクロアクチュエータ上の液滴相互作用することを可能にする様式で、液滴マイクロアクチュエータ上に位置決めされる物理的な物における表面、および／または液滴アクチュエータ（たとえば液滴内および／または液滴の外側であるが液滴アクチュエータ内）に位置決めされるビーズであってもよい。
表面の洗浄に関して「洗浄」は、表面と接触状態にある１つまたは複数の物質の量を低減すること、または表面と接触状態にある液滴から表面を露出させることを意味する。物質の量の低減は、部分的であってもよく、実質的に完全であってもよく、または一層完全であってもよい。物質は、種々の物質のいずれであってもよい。実施例としては、さらなる分析のための標的物質、および試料、汚染物質および／または過剰な試薬などの望ましくない物質が挙げられる。表面は、たとえば、液滴マイクロアクチュエータの表面または液滴マイクロアクチュエータ上のビーズの表面であってもよい。一部の実施形態において、洗浄操作は、表面と接触状態にある開始液滴から始まり、液滴は、物質の初期の総量を含む。洗浄操作は、種々の液滴操作を用いて続行してもよい。洗浄操作は、表面と接触状態にある液滴を生じてもよく、液滴は、物質の初期の量未満である物質の総量を有する。別の実施形態において、液滴操作は、液滴の不在下で表面を生じてもよく、表面と接触状態にあるか、または表面に曝される物質の総量は、開始液滴において表面と接触状態にあるか、または表面に曝される物質の初期の量未満である。別の実施形態については、本明細書において他の部分で記載され、さらに別の実施形態は、本開示に鑑みれば直ちに明白となるであろう。
層、領域または基材などの所定の構成要素が、本明細書において、別の構成要素の「上に」配置または形成されると言及されている場合には、その所定の構成要素が、他の構成要素の上に直接的にあってもよく、またはあるいは介在する構成要素（たとえば、１つまたは複数のコーティング、層、中間層、電極または接点）もまた存在してもよい。「上に配置される」および「上に形成される」なる用語は、所定の構成要素が別の構成要素に関してどのように位置決めまたは位置付けられるかを記述するために同義で用いられることをさらに理解されよう。したがって、「上に配置される」および「上に形成される」なる用語は、材料の輸送、堆積または作製の具体的な方法に関連する任意の制限を導入することを意図していない。
任意の形態（たとえば、液滴または連続体、移動または静止している）における液体は、電極、アレイ、マトリックスまたは表面「の上に」「で」または「の上方に」あるものとして記載されている場合には、そのような液体は、電極／アレイ／マトリックス／表面と直接接触状態にあってもよく、または液体と電極／アレイ／マトリックス／表面との間に介在される１つまたは複数の層または膜と接触状態にあってもよい。
液滴が、液滴マイクロアクチュエータの「上」または「上に載せられている」と記載される場合には、液滴は、液滴における液滴操作を行うために液滴マイクロアクチュエータの使用を容易にする様式で液滴マイクロアクチュエータ上に配置されるか、液滴の特性または液滴からの信号の検知を用意に様式で液滴マイクロアクチュエータ上に配置されるか、および／または液滴が液滴マイクロアクチュエータ上で液滴操作に供されていることを理解すべきである。
８．発明の詳細な説明
本発明は、１つまたは複数の液滴に基づく生化学的分析を実行するための方法、デバイスおよびシステムを提供する。たとえば、本発明は、核酸の増幅、核酸の配列の分析、親和性に基づく分析の実行および／または体液の構成要素の分析のための方法、デバイスおよびシステムを提供する。
ある実施形態において、システムのプロトコルは、本発明の検出目的を達成する任意の順序で以下の工程：被検体から試料を抽出する工程；液滴マイクロアクチュエータ上に投入するために試料を処理する工程；試料を液滴マイクロアクチュエータ上に投入する工程；液滴マイクロアクチュエータにおける輸送のために試料の１つまたは複数の試料液滴を分配する工程；液滴マイクロアクチュエータ上に１つまたは複数の試薬を投入する工程；液滴マイクロアクチュエータにおける輸送のために試料の１つまたは複数の試薬液滴を分配する工程；１つまたは複数の試薬液滴を１つまたは複数の試料液滴と接触させ、それによって、試料と試薬との相互作用を実現するように、１つまたは複数の試薬液滴、および／または１つまたは複数の試料液滴を輸送する工程；試料と試薬との相互作用の効果を検出する工程、ならびに；検出工程の結果をユーザに通知する出力を提供する工程；のうちの１つまたは複数の工程を伴ってもよい。本発明の液滴マイクロアクチュエータと共に用いるための生化学的プロトコルの実施例は、次の節において記載される。
８．１ 核酸増幅
本発明は、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴内の核酸の増幅のための方法、デバイスおよびシステムを提供する。１つまたは複数の核酸分子の多数の複製は、液滴内に存在する少数の複製または１つの複製さえからも１つの液滴において作製されうる。本発明の方法は概して、増幅準備の整った液滴を形成するために必要な反応体を結合すること、および、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって標的核酸の増幅を結果として生じるのに十分な温度で液滴に熱サイクルを施すことを伴う。一部の実施形態において、増幅された標的核酸を含む液滴は次に、検出プロセス、標的核酸のさらなる処置のためのプロセスおよび／または（たとえば、８．２節に記載したような）配列決定プロセスなどの次のプロセスに輸送されてもよい。増幅デバイスは、液滴マイクロアクチュエータと、液滴マイクロアクチュエータに適切な試薬が投入される場合に、本発明の方法に影響を及ぼす液滴操作を行うのに十分な構成要素とを含みうる。本発明のシステムは、液滴マイクロアクチュエータと、本発明のプロトコルを実行するために、液滴マイクロアクチュエータの操作のソフトウェア制御を容易にするように設計されたシステム構成要素とを含みうる。
本発明の増幅プロトコルに用いるための具体的な液滴マイクロアクチュエータ１００が図１に示されている。この実施形態において、試料貯槽１０２、ＰＣＲ試薬貯槽１０４およびプライマー設定貯槽１０６などの複数の流体ポートおよび／または貯槽が設けられてもよい。下部温度加熱領域１０８および上部温度加熱領域１１０などの加熱領域もまた、設けられてよい。たとえば、顕微鏡または光電子増倍管（ＰＭＴ）を利用する試料可視化領域１１２もまた、設けられていてもよい。
一実施形態において、本発明は、増幅準備の整った液滴において試料の増幅を行い、続いて、増幅された核酸を捕捉するように構成およびプログラムされた液滴マイクロアクチュエータおよび／またはシステムを提供する。増幅された核酸は、一本鎖核酸が磁気応答性ビーズに結合することを可能にする磁気応答性ビーズとの接触前または接触後に、一本鎖核酸に変性されるように処理されてもよい。たとえば、結合は、たとえば、一本鎖核酸がビオチン化され、表面（たとえば、ビーズまたは液滴マイクロアクチュエータ表面）が、それに共有結合しているストレプトアビジンによってコーティングされるビオチン‐ストレプトアビジンシステムを用いて達成されてもよい。増幅試薬は、洗浄プロトコルを用いて洗い流されてもよい。本発明の種々の他の方法、デバイス、システムおよび他の態様は、次の説明から明白となるであろう。
本発明の重要な態様は、液滴マイクロアクチュエータにおいて核酸増幅試薬および／または試料のそれぞれを用いて、液滴操作を行うことができる能力を必要とすることが認識されよう。たとえば、本発明は：
（１）核酸増幅を行うために、本明細書に記載される試薬および／または試料のうちの任意の１つまたは複数を含む液滴をその上に備える液滴マイクロアクチュエータ、
（２）そのような液滴マイクロアクチュエータを含む本発明のデバイスまたはシステム、
（３）そのような液滴マイクロアクチュエータまたはシステム上で液滴操作を行うか、またはそのような液滴マイクロアクチュエータまたはシステムを利用する液滴を操作する方法および／または
（４）そのような液滴マイクロアクチュエータまたはシステムを利用する、液滴に基づく配列分析プロトコルを行う方法
を備える。
たとえば、液滴操作は、以下：液滴マイクロアクチュエータ内への液滴の投入；供給源の液滴からの１つまたは複数の液滴の分配；液滴の２つ以上の液滴への分割、分離または分裂；任意の方向におけるある位置から別の位置への液滴の輸送；２つ以上の液滴の１つの液滴への融合または結合；液滴の希釈；液滴の混合；液滴の攪拌；液滴の変形；液滴の所定の位置における保持；液滴の培養；液滴の加熱；液滴の気化；液滴の冷却；液滴の配置；液滴マイクロアクチュエータからの液滴の輸送；本明細書に記載される他の液滴操作および／または上述の操作の任意の組み合わせ；のうちの１つまたは複数を含んでよい。本発明の種々の他の方法、デバイス、システムおよび他の態様は、次の説明から明白となるであろう。
８．１．１ 試料および試料調製
本発明の増幅方法は、増幅用の核酸テンプレートを含む試料を利用する。核酸テンプレートとして、たとえば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、バクテリオファージおよび／または人工配列などの任意のタイプであってもよい。核酸テンプレートは、たとえば、全有機体、器官、組織、細胞、細胞小器官（たとえば、葉緑体、ミトコンドリア）、合成核酸供給源などの任意の供給源からであってもよい。さらに、テンプレートは、たとえば、病理学的試料、法医学的試料、考古学的試料などの種々の起源を有してもよい。生物学的標本は、たとえば、全血、リンパ液、血清、血奬、汗、涙、唾液、痰、脳脊髄液（ＣＳＦ）、羊水、精液、膣分泌物、漿液、滑液、心嚢液、腹水、胸膜液、漏出液、浸出液、嚢胞液、胆汁、尿、胃液、腸液、糞便試料およびぬぐい液または洗浄液（たとえば、口腔、鼻咽頭、目、直腸、腸内、膣、表皮など）および／または他の生物学的標本が挙げられうる。
種々の試料処理工程は、核酸テンプレートを調製するために行われうる。一部の場合において、プラスミドまたはバクテリオファージによる増幅などの粗試料で十分である。他の場合において、ゲノムＤＮＡからの大きな断片の増幅など、高度に純化されたテンプレートが好ましい。試料調製工程は、液滴マイクロアクチュエータ内または液滴マイクロアクチュエータ外で行われてよい。
本発明のシステムは、増幅用の核酸テンプレートを含む液滴を調製するために生物学的試料の処理を可能にするように構成およびプログラムされていてもよい。この処理の一部またはすべては、液滴マイクロアクチュエータ内または液滴マイクロアクチュエータ外で、たとえば、生物学的試料から標的有機体を分離するために標的有機体に対する親和性によってそれに結合される試薬を有するビーズを用いて、行われてもよい。液滴マイクロアクチュエータは、液滴マイクロアクチュエータにおける次の操作のためにそれを、１つまたは複数の個々の液滴に分裂させることによって試料を処理してもよい。
標本は、場合によっては、次の液滴操作中に粘性を変化させて低減するように処置されてもよい。たとえば、試料は、アルカリ溶液（たとえば、１０％のＫＯＨ）またはジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはジチオエリトリトール（ＤＴＥ）などの還元剤と混合することによって、液滴マイクロアクチュエータ内または液滴マイクロアクチュエータ外で調製され、試料を液化し、液滴マイクロアクチュエータにおいて液滴操作を容易にするのに十分な流体にすることができる。適切な試料調製技術の他の実施例は、２００６年４月２８日出願の「Apparatus and Methods of Sample Preparation for a Droplet Microactuator」というタイトルの関連する米国特許仮出願第６０／７４５，９５０号に記載されている。
核酸テンプレートを含む液滴は、増幅試薬と結合されて、増幅準備の整った液滴を提供してもよく、たとえば、ＰＣＲ準備の整った液滴を生じるためにＰＣＲ試薬と結合されてもよい。選択された試薬に応じて、増幅準備の整った液滴に等温的な増幅または熱サイクルを施して、対象核酸の増幅を行ってもよい。増幅された生成物は、液滴マイクロアクチュエータにおいて実時間で検出および／または定量化されてもよい。このような様式において、本発明は、オンチップで実時間の定量的増幅を提供し、試料中の標的核酸を検出して定量化する。
試料の約１００％（チャネルまたはポンプのプライミングが必要ではない）を分析のために利用することができるため、非常に少量の試料（たとえば、約１００μＬ未満または約５０μＬ未満または約２５μＬ未満）を分析することができる。多くの検査を、１つの小さな試料を用いて行うことができ、試薬コストを最小限に抑えることができる。
８．１．２ 試薬
本発明の増幅プロトコルにおいて、種々の試薬は、ＰＣＲ準備の整った液滴などの増幅準備の整った液滴を生じるために、核酸テンプレートと結合されてもよい。ＰＣＲ試薬は、典型的には、プライマー、ヌクレオチド、ポリメラーゼおよび緩衝剤を含む。これらの投入試薬は、液滴マイクロアクチュエータに個別に投入される個別の試薬として提供されてよく、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴操作を用いて結合されてよい。さらに、試薬の一部またはすべては、予め混合された形態で、液滴マイクロアクチュエータに投入される試薬混合物として提供されてよい。一実施形態において、たとえば、ＰＣＲ準備の整った液滴などの増幅準備の整った液滴を生じるために、すべての増幅試薬は、試料液滴と結合されればよい１つの液滴に結合されもよい。
８．１．２．１ 緩衝剤
試薬は、典型的には緩衝剤を含む。緩衝剤は、増幅反応を容易にするように選択される。この機能を満たす緩衝剤はいずれも適切である。マグネシウムイオンは、増幅される核酸がＤＮＡである場合に、緩衝剤に含まれることが有用である。
一実施形態において、緩衝剤はＫＣｌ、トリスおよびＭｇＣｌ２を含む。他の適切な緩衝剤は、Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら、「Nucleic Acid Research」１６：１１１４１−１１１５６（１９８８）に記載されている。たとえば、緩衝剤は、約５００ｍＭのＫＣｌ、約１００ｍＭのトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ８．３）および約１５ｍＭのＭｇＣｌ２を含んでよい。別の例において、緩衝剤は、約８３ｍＭの（ＮＨ４）ＳＯ４、約３３５ｍＭのトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、約３３．５ｍＭのＭｇＣｌ２、約５０ｍＭのβ‐メルカプトエタノール、および約３４ｍＭのＥＤＴＡを含んでよい。緩衝剤はまた、プライマーおよび／またはポリメラーゼを含んでよい。
一実施形態において、ＰＣＲは、複数の液滴において連続的にまたは並列に行われてもよく、１つまたは複数の緩衝剤成分の濃度が、（たとえば、一連の液滴において）体系的に変化して、特定の反応用の緩衝剤を改善または最適化する。したがって、たとえば、以下の緩衝剤成分、すなわち、ＫＣｌ、トリス、ＭｇＣｌ２、（ＮＨ４）ＳＯ４、β‐メルカプトエタノール、ＥＤＴＡのうちの任意の１つまたは複数が変化してもよい。一旦、最適な検査緩衝剤条件が特定されると、ＰＣＲは、最適な緩衝剤系を用いて続行することができるか、またはさらなる最適化が、検査緩衝剤系のうちの最適な緩衝剤系の周囲で行われてもよい。
本発明は、緩衝剤であるか、または緩衝剤成分をその上に備える液滴を含む液滴マイクロアクチュエータ、そのような液滴マイクロアクチュエータを含むシステムおよび／またはデバイス、並びに液滴マイクロアクチュエータにおけるそのような液滴に液滴操作を行うかまたは別の処置を施す方法を含む。したがって、たとえば、本発明は、その上に液滴を含み、液滴が以下の成分：ＫＣｌ、トリス、ＭｇＣｌ２、（ＮＨ４）ＳＯ４、β‐メルカプトエタノール、ＥＤＴＡ；のうちの１つまたは複数を含む液滴マイクロアクチュエータを含む。
さらに、本発明は、その上に液滴を備え、液滴が標的核酸の増幅を容易にするほど十分な濃度で、上述の成分のうちの１つまたは複数を含む液滴マイクロアクチュエータを含む。さらに、本発明は、標的核酸の増幅を容易にするほど十分な濃度でポリメラーゼ、ヌクレオチドおよび／または１つまたは複数のプライマーに加えて、そのような液滴を含む。本発明はまた、液滴マイクロアクチュエータ、デバイスおよび／またはシステムを用いてこの節に記載された液滴のいずれかに液滴操作を行うかまたは別の処置を施す方法を含む。たとえば、液滴操作としては、以下：液滴マイクロアクチュエータ内への液滴の投入；供給源の液滴からの１つまたは複数の液滴の分配；液滴の２つ以上の液滴への分割、分離または分裂；任意の方向におけるある位置から別の位置への液滴の輸送；２つ以上の液滴の１つの液滴への融合または結合；液滴の希釈；液滴の混合；液滴の攪拌；液滴の変形；液滴の所定の位置における保持；液滴の培養；液滴の加熱；液滴の気化；液滴の冷却；液滴の配置；液滴マイクロアクチュエータからの液滴の輸送；本明細書に記載される他の液滴操作および／または上記の操作の任意の組み合わせ；のうちの１つまたは複数が挙げられうる。
８．１．２．２ プライマー
本発明の増幅方法において用いられる試薬は、１つまたは複数のプライマーを含む。典型的な方法において、２つのプライマーが、増幅される核酸テンプレートの領域を画定するために用いられる。プライマーは、典型的には、ほとんど誤りのない効率的な複製を確保するように選択される配列および長さを有する。そのようなプライマーは、約１８〜２４塩基長の範囲にあることがよくある。効果的なプライマーの選択のための他の要件が既知である。適切なプライマー特性の例としては、内部二次構造の欠如、４０〜６０％Ｇ／Ｃ内容物、Ｇ／ＣおよびＡ／Ｔ豊富領域のバランスの取れた分配、およびプライマーダイマーの形成を回避するための３’末端における相補性の欠如が挙げられる。特に必要ではないが、これらの特性のうちの１つまたは複数を備えるプライマーは、本発明の実現において適切に採用されうる。さらに、プライマーに関する溶融温度（Ｔｍ）は、典型的には約５５℃〜約６５℃または約６２℃〜約６５℃のアニーリング温度を可能にするように選択される。増幅設定において用いるのに適した特性を備えたプライマーを特定するのに役立つ、種々の公に入手可能なコンピュータプログラムが存在する。２つのプライマーが用いられる場合には、典型的には、等しい濃度で提供される。増幅される核酸がＲＮＡである場合には、プライマーは、必要ではなくてもよい。
一部の実施形態において、プライマーの縮退混合物が用いられる。たとえば、所定のアミノ酸配列が、複数の可能なコドンによってコードされうるため、混合物は、標的ポリペプチドに関するあらゆるコドンの組み合わせを包含するすべての可能な配列を含んでよい。縮退プライマー混合物は、問題になっている有機体に関してコドンバイアスを特定し、有機体によって共通に用いられるプライマーのみを含むようにすることによって簡略化されてよい。
プライマーは、標的核酸の増幅を容易にする任意の濃度で提供される。濃度は、過度の量のミスプライミング、非特異的生成物の蓄積および／またはプライマーダイマーの形成を回避するほど十分に低くする必要がある。プライマー濃度は、増幅反応の完了前のプライマーの消耗を回避する程度に十分に高くする必要がある。一部の実施形態において、濃度は、約０．１μＭ〜約１μＭまたは約０．１μＭ〜約０．６μＭの範囲にある。
プライマーはまた、標識化されてもよい。たとえば、標識は、ＰＣＲ生成物の検出、位置確認、定量化および／または分離を容易にするように選択されてもよい。たとえば、ビオチン化を用いることにより、ストレプトアビジンを用いた検出および／または精製を容易にして、表面においてビオチン化されたＰＣＲ生成物を捕捉することができる。さらに、ストレプトアビジンは、ビオチン化されたＰＣＲ生成物の捕捉のために磁気応答性ビーズに関連付けられうる。ジゴキシゲニンもまた、ＰＣＲ生成物の検出のために用いられうる。プライマーは、たとえば、それらの５’末端および／または内部で標識化されてもよく、さらに、標識化されたヌクレオチドは、検出、位置確認、定量化および／または分離のためにＰＣＲ生成物に組み込まれてもよい。
本発明は、増幅反応を容易にするほど十分な濃度で標的核酸の増幅のために（たとえば、約０．１μＭ〜約１μＭまたは約０．１μＭ〜約０．６μＭの範囲にある濃度で）標識化されるおよび／または標識化されないプライマーを含む液滴をその上に含む液滴マイクロアクチュエータ、ならびに、そのような液滴マイクロアクチュエータを含むシステムおよび／またはデバイス、ならびに、液滴マイクロアクチュエータにおけるそのような液滴に液滴操作を行うかまたは別の処置を施す方法を含む。別の例として、本発明は、ミスプライミングおよび非特異的生成物の蓄積を低減または排除するほど十分に低い濃度かつ増幅反応の完了前にプライマーの消耗を回避するほど十分に高い濃度で、標識化されるおよび／または標識化されないプライマーを含む液滴をその上に含む液滴マイクロアクチュエータを含む。さらに別の例において、本発明は、約０．１μＭ〜約１μＭまたは約０．１μＭ〜約０．６μＭの範囲にある濃度で標識化されるおよび／または標識化されないプライマーを含む液滴をその上に含む液滴マイクロアクチュエータを含む。さらに、本発明は、標的核酸の増幅を容易にするように選択された濃度で、ポリメラーゼ、ヌクレオチドおよび／または緩衝剤成分に加えて、そのような液滴を含む。さらに、本発明は、液滴マイクロアクチュエータ、デバイスおよび／またはシステムを用いて、この節において記載された液滴のいずれかに液滴操作を行うかまたは別の処置を施す方法を含む。たとえば、液滴操作としては、以下：液滴マイクロアクチュエータ内への液滴の投入；供給源の液滴からの１つまたは複数の液滴の分配；液滴の２つ以上の液滴への分割、分離または分裂；任意の方向におけるある位置から別の位置への液滴の輸送；２つ以上の液滴の１つの液滴への融合または結合；液滴の希釈；液滴の混合；液滴の攪拌；液滴の変形；液滴の所定の位置における保持；液滴の培養；液滴の加熱；液滴の気化；液滴の冷却；液滴の配置；液滴マイクロアクチュエータからの液滴の輸送；本明細書に記載される他の液滴操作および／または上記の操作の任意の組み合わせ；のうちの１つまたは複数が挙げられうる。
８．１．２．３ ヌクレオチド
本発明の増幅方法において用いられる試薬は、ヌクレオチドを含む。ｄＮＴＰの原液は、種々の供給元から市販されている。原液は典型的には、１００〜３００ｍＭの濃度で提供される。原液は液滴マイクロアクチュエータへの導入前および／または液滴マイクロアクチュエータにおいて、１つまたは複数の緩衝剤と原液とを混合するために液滴操作を用いて希釈されうる。ＰＣＲ準備の整った液滴における最終的な濃度は、典型的には約５０μｍｏｌ〜約２００μｍｏｌの範囲にある。４つのｄＮＴＰは、典型的には等モル濃度で提供される。
種々の改質されたヌクレオチドは、本発明の実施において採用されてもよい。例としては、二次構造の解像度を低減し、汚染を防止するように設計されたヌクレオチド、ならびに、放射性標識化ヌクレオチド、非放射性標識化ヌクレオチドおよびランダム変異生成を促進するように設計されたヌクレオチドが挙げられる。たとえば、McPhersonら、「ＰＣＲ」、Taylor and Francis Group、２００６参照のこと（その開示内容全体が、参照によって本明細書に組み込まれる）。
本発明は、増幅反応を容易にするほど十分な濃度で、標的核酸の増幅のためにヌクレオチドを含む液滴をその上に含む液滴マイクロアクチュエータ、ならびに、そのような液滴マイクロアクチュエータを含むシステムおよび／またはデバイス、ならびに、液滴マイクロアクチュエータにおけるそのような液滴に液滴操作を行うかまたは別の処置を施す方法を含む。したがって、たとえば、本発明は、約１００ｍＭ〜約３００ｍＭ（原液濃度）または約５０μｍｏｌ〜約２００μｍｏｌ（操作濃度）の範囲の濃度の１つまたは複数のヌクレオチドを含む液滴をその上に含む液滴マイクロアクチュエータを含む。別の例において、本発明は、１つ、２つ、３つまたは４つのヌクレオチドを含み、それぞれが約１００ｍＭ〜約３００ｍＭまたは約５０μＭ〜約２００μＭの範囲の濃度である液滴をその上に含む液滴マイクロアクチュエータを含む。本発明のシステムは、ヌクレオチド濃度を操作することを含む液滴を提供するために、原液のヌクレオチド濃度を希釈するためのプロトコルを実行するように構成かつプログラムされていてもよい。たとえば、本発明のシステムは、約５０μｍｏｌ〜約２００μｍｏｌの範囲にある操作溶液を提供するために、約１００ｍＭ〜約３００ｍＭの範囲にある原液ヌクレオチド濃度を希釈するためのプロトコルを実行するように構成かつプログラムされていてもよい。さらに、本発明は、標的核酸の増幅を容易にする状態を提供するように選択された濃度で、ポリメラーゼ、プライマーおよび／または緩衝剤成分に加えて、ヌクレオチド含有液滴を含む。さらに、本発明は、液滴マイクロアクチュエータ、デバイスおよび／またはシステムを用いて、この節において記載された液滴のいずれかに液滴操作を行うかまたは別の処置を施す方法を含む。たとえば、液滴操作としては、以下：液滴マイクロアクチュエータ内への液滴の投入；供給源の液滴からの１つまたは複数の液滴の分配；液滴の２つ以上の液滴への分割、分離または分裂；任意の方向におけるある位置から別の位置への液滴の輸送；２つ以上の液滴の１つの液滴への融合または結合；液滴の希釈；液滴の混合；液滴の攪拌；液滴の変形；液滴の所定の位置における保持；液滴の培養；液滴の加熱；液滴の気化；液滴の冷却；液滴の配置；液滴マイクロアクチュエータからの液滴の輸送；本明細書に記載される他の液滴操作および／または上記の操作の任意の組み合わせ；のうちの１つまたは複数が挙げられうる。
８．１．２．４ ＰＣＲポリメラーゼ
種々のＰＣＲポリメラーゼは、本発明の液滴に基づくＰＣＲプロトコルにおいて用いられてもよい。適切なポリメラーゼは、約７５℃で最適な活性を有し、たとえば、９５℃を超える温度で長期培養後、その活性を保持することができるものが多い。有用なポリメラーゼとしては、たとえば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）が挙げられうる。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどの種々の耐熱性ポリメラーゼを用いてもよい。適切な例としては、AmpliTaq（登録商標）、AmpliTaq Gold（登録商標）、AmpliTaq（登録商標）のＳｔｏｆｆｅｌフラグメントなどが挙げられる。校正機能を有する耐熱性ポリメラーゼの例としては、Vent（登録商標）、Tli、Deep Vent（登録商標）、Pfu、Pwo、UlTma（登録商標）、Accuzyme（登録商標）およびＫＯＤ Ｈｉｆｉ ＤＮＡポリメラーゼのほか、上記の種々のｅｘｏバージョンが挙げられる。ポリメラーゼ調製は、場合によっては、ＰＣＲ試薬の濃度を決定または確認するための染料を含んでもよい。一部の場合において、システムは、そのような染料を検出し、測色測定に基づいて試薬濃度を計算するように構成かつプログラムされる。一部の場合において、本発明は、耐熱性ポリメラーゼ（たとえば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）および校正ポリメラーゼ（たとえば、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ）の組み合わせを含む液滴を利用する。
本発明は、増幅反応を容易にするほど十分な濃度で１つまたは複数のポリメラーゼを含む液滴をその上に含む液滴マイクロアクチュエータ、ならびに、そのような液滴マイクロアクチュエータを含むシステムおよび／またはデバイス、並びに、液滴マイクロアクチュエータにおけるそのような液滴に液滴操作を行うかまたは他の処置を施す方法を含む。さらに、本発明は、液滴マイクロアクチュエータ、デバイスおよび／またはシステムを用いて、この節において記載された液滴のいずれかに液滴操作を行うかまたは別の処置を施す方法を含む。たとえば、液滴操作としては、以下：液滴マイクロアクチュエータ内への液滴の投入；供給源の液滴からの１つまたは複数の液滴の分配；液滴の２つ以上の液滴への分割、分離または分裂；任意の方向におけるある位置から別の位置への液滴の輸送；２つ以上の液滴の１つの液滴への融合または結合；液滴の希釈；液滴の混合；液滴の攪拌；液滴の変形、液滴の所定の位置における保持；液滴の培養；液滴の加熱、液滴の気化；液滴の冷却；液滴の配置；液滴マイクロアクチュエータからの液滴の輸送；本明細書に記載される他の液滴操作および／または上記の操作の任意の組み合わせ；のうちの１つまたは複数が挙げられうる。さらに、本発明は、標的核酸の増幅を容易にするほど十分な状態を提供するように選択された濃度で、ヌクレオチド、プライマーおよび／または緩衝剤に加えて、本発明の液滴マイクロアクチュエータにポリメラーゼを入れた液滴を含む。
８．１．２．５ 増幅された生成物の検出
一部の実施形態において、増幅された核酸は、数回の増幅サイクル後に検出される。たとえば、増幅された核酸は、各サイクル中にまたは各サイクル後にまたはある所定数のサイクル後、たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０サイクル後に定量化されてもよい。検出は一般に、液滴操作を用いて、センサが、増幅に相関する物理的、化学的または電気的態様などの液滴の何らかの態様を測定する検出領域に液滴を輸送することを伴う。システムは、所定のレベルの信号が達成されたことが検出によって明らかになるまで、増幅サイクルが、続行されうるようにプログラムされていてもよい。一実施形態において、増幅のための検出方法は、蛍光技術である。
さらに、一部の実施形態において、増幅された核酸を含む液滴は、さらなる処理／検出のために輸送されてよい。たとえば、診断の実施形態において、増幅された核酸を含む液滴は、標的の診断核酸の存在の検出のために輸送されてもよい。標的核酸は、たとえば、寄生虫、バクテリア、菌またはウイルスに関連付けられるＤＮＡまたはＲＮＡなどの病原菌有機体からの核酸を含んでもよい。液滴マイクロアクチュエータは、統合型の携帯可能な診断プラットフォームの構成要素として設けられてもよい。システムは、実時間ＰＣＲによって、感染症のパネルの完全に自動化された高速検出を提供してもよい。システムは、臨床、スタットラボ、診療所または現場で用いられてもよい。
蛍光検出は、増幅された核酸の検出に適している。発光ダイオード（ＬＥＤ）およびレーザダイオードは、小さな物理サイズ、低電力要件および長寿命のために、励起源として適切である。ＬＥＤは、低コストであるために、レーザダイオードは、スペクトル幅が狭く、大量の光を無駄にすることなく、小さなスポットサイズに集束することができるために、魅力的である。
既に述べた試薬に加えて、本発明の核酸増幅プロトコルにおいて有用に用いられる試薬は、蛍光および非蛍光の染料およびプローブなどの種々の検出試薬を含む。たとえば、プロトコルは、ＴａｑＭａｎプローブなどのＴａｑＭａｎ反応に用いるのに適した試薬、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎなどのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ反応に用いるのに適した試薬、分子指標プローブなどの分子指標反応に用いるのに適した試薬、スコルピオンプローブなどのスコルピオン反応に用いるのに適した試薬、蛍光プローブなどの蛍光ＤＮＡ結合染料型反応に用いるのに適した試薬および／またはＬｉｇｈｔＵｐプローブなどのＬｉｇｈｔＵｐプロトコルに用いるのに適した試薬を採用してもよい。
本発明は、増幅反応の検出を容易にするほど十分な濃度で、上述のプローブのうちの任意の１つまたは複数などの１つまたは複数の検出試薬を含む液滴をその上に含む液滴マイクロアクチュエータ、ならびに、そのような液滴マイクロアクチュエータを含むシステムおよび／またはデバイス、および液滴マイクロアクチュエータにおけるそのような液滴に液滴操作を行うかまたは別の処置を施す方法を含む。さらに、本発明は、液滴マイクロアクチュエータ、デバイスおよび／またはシステムを用いて、この節において記載された液滴のいずれかに液滴操作を行うかまたは別の処置を施す方法を含む。たとえば、液滴操作としては、以下：液滴マイクロアクチュエータ内への液滴の投入；供給源の液滴からの１つまたは複数の液滴の分配；液滴の２つ以上の液滴への分割、分離または分裂；任意の方向におけるある位置から別の位置への液滴の輸送；２つ以上の液滴の１つの液滴への融合または結合；液滴の希釈；液滴の混合；液滴の攪拌；液滴の変形；液滴の所定の位置における保持；液滴の培養；液滴の加熱；液滴の気化；液滴の冷却；液滴の配置；液滴マイクロアクチュエータからの液滴の輸送；本明細書に記載される他の液滴操作および／または上記の操作の任意の組み合わせ；のうちの１つまたは複数が挙げられうる。さらに、本発明は、標的核酸の増幅を容易にするほど十分な状態を提供するように選択された濃度で、ヌクレオチド、プライマー、検出プローブおよび／または緩衝剤に加えて、本発明の液滴マイクロアクチュエータにおいてヌクレオチド含有液滴を含む。
さらに、本発明は、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴から信号（たとえば、蛍光信号）を測定することを含む増幅を検出および／または定量化する方法を含む。したがって、たとえば、方法は、化合物に蛍光を発せさせるように選択された波長の光源に対する蛍光染料（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎなど）を潜在的に含む液滴の露光と、結果として生じる蛍光の測定とを採用してもよい。液滴から発せられた蛍光は、増幅反応中に追跡されてよく、たとえば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ化合物を用いて、反応の監視を可能にする。本発明のシステムは、たとえば、そのような蛍光を検出して、対応するグラフまたは他の出力を表示し、実時間でＰＣＲ反応の経過をユーザが追跡可能にするようにプログラムされてもよい。
別の例において、本発明は、標的核酸を潜在的に含む増幅準備の整った液滴において、標的核酸に関する特異性を備えたプローブ（たとえば、ＴａｑＭａｎ型プローブ）を含み、増幅準備の整った液滴に熱サイクルを施し、プローブの分解によって生じた任意の蛍光信号を検出することによって、標的核酸の存在の検出および／または定量化を行う方法であって、蛍光信号が液滴中の標的核酸の存在を表す方法を含む。本発明は、スコルピオンプローブおよび分子指標などの他の標的特異的プローブを用いる対応する方法を含む。
８．１．３ 熱サイクリング
本発明の実施において、ＰＣＲ準備の整った液滴は、標的核酸の増幅を行うために、熱サイクルを施される。一定の核酸の効果的な増幅のために、熱サイクリングの厳密な制御を必要とする場合がある。液滴マイクロアクチュエータにおいて制御された熱サイクリングを提供するように設計された構造の例は、以下の８．８．６節に記載される。典型的には、各熱サイクルは、以下の少なくとも２つの工程を伴う：
（１）液滴中の二本鎖核酸を一本鎖ＤＮＡに変性させるのに十分な温度（典型的には、約９０〜１００℃）まで液滴を加熱する工程；および
（２）プライマーをアニーリングして核酸テンプレート鎖における相補的な配列にすることを可能にする液滴温度（典型的には、約５０〜７５℃）まで下げる工程。
場合によっては、熱サイクルはまた、以下の第３の工程を伴ってもよい：
（３）さらなるヌクレオチドの取り込みによって伸張される核酸の二本鎖セグメントの伸張を容易にするように液滴温度（典型的には、約７０〜７５℃）を調整する工程。
選択された試薬に応じて、さらなるヌクレオチドの取り込みは、プライマーが核酸テンプレート鎖に対するアニーリングを可能にする同一の温度で達成されてもよく、したがって、第３の工程の温度調整を必要としない場合もある。さらなる熱サイクリング工程はまた、本発明の種々のプロトコルに組み込まれてもよい。
本発明は、複数の液滴に並列に熱サイクルを施すことを可能にする。したがって、種々の実施形態において、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００または１０００を超える増幅準備の整った液滴が、１つの液滴マイクロアクチュエータにおいて並列に熱サイクルを施される。一部の実施形態において、これらの液滴における増幅の検出は、実時間で並列に測定される。
一実施形態において、熱サイクリングを受けている各液滴は、センサに近接して位置決めされるか、またはセンサに近接するように輸送され、その結果、増幅に相関する液滴からの信号を実時間で監視することができる。システムは、増幅プロセスの経過を示し、ユーザにとってアクセスしやすい実時間情報を出力してもよい。さらに、システムは、複数の液滴に並列に熱サイクルが施される場合に、そのような出力を可能にするように配置されてもよい。たとえば、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００または１０００を超える増幅準備の整った液滴が、１つの液滴マイクロアクチュエータにおいて並列に熱サイクルを施され、システムは、増幅プロセスの経過を表す実時間情報を出力する。
本発明の方法は、変性、アニーリングおよび／または伸張のために、温度および／または時間を最適化するための温度最適化工程またはプロトコルを含んでもよい。この工程において、１つまたは複数の加熱領域は、複数の加熱工程のうちの１つの工程の温度を変化させるために用いられる。たとえば、方法は、アニーリング温度を最適化するための最適化工程またはプロトコルを含んでもよい。一連の液滴は、変化したアニーリング温度で熱サイクルが施されてよく、続いて検出されて、増幅を定量化し、それによって、検査されたアニーリング温度のいずれが、最適な結果をもたらすかを決定してもよい。次の熱サイクリングは、選択された温度で行われてよい。同様に、一連の液滴は、異なる期間の時間の間、アニーリング温度でサイクルが施され、次に検出され、増幅を定量化し、それによって、検査された時間期間のいずれが、所定の温度で最適な結果をもたらすかを決定してもよい。次の熱サイクリングは、選択された時間期間で行われうる。さらに、そのような最適化プロトコルを連続的または同時に実行して、最適な温度および最適な時間期間の両方を決定することができる。類似のプロトコルが、変性および／または伸張工程に関して温度および／または時間期間を最適化するために行われてもよい。
一実施形態において、熱サイクリングは、液滴マイクロアクチュエータ全体の加熱および冷却によって達成される。この実施形態は一般に、以下の工程を伴う：
（１）（液滴マイクロアクチュエータにおける液滴中に存在する）二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性させるのに十分な温度まで液滴マイクロアクチュエータを加熱する工程；
（２）プライマーをアニーリングして核酸テンプレート鎖における相補的な配列にすることを可能にするのに十分な温度まで液滴マイクロアクチュエータの温度を下げる工程；
（３）任意選択的に、さらなるヌクレオチドの取り込みによって（液滴マイクロアクチュエータにおける液滴中に存在する）核酸の二本鎖セグメントの伸張を容易にするように液滴マイクロアクチュエータの温度を調整する工程。
本発明の熱サイクリングプロトコルは、ＰＣＲ準備の整った液滴の水または他の成分を大きく損失することなく行われうる。さらに、熱サイクリングプロトコルは、液滴の間で著しい二次汚染を生じることなく行われうる。さらに、熱サイクリングは、液滴操作を続けて行うために、液滴マイクロアクチュエータの機能において著しい混乱を生じることなく行われうる。たとえば、液滴操作としては、場合によっては、種々の変性温度、アニーリング温度および／または伸張温度で続けて行われうる。
関連実施形態において、熱サイクリングは、液滴マイクロアクチュエータのセクションまたは領域の加熱および冷却によって達成される。この手法は概して以下の工程を伴う：
（１）（液滴マイクロアクチュエータにおける液滴中に存在する）二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性させるのに十分な温度まで液滴マイクロアクチュエータのセクションまたは領域を加熱する工程；
（２）プライマーをアニーリングして核酸テンプレート鎖における相補的な配列にすることを可能にするのに十分な温度まで液滴マイクロアクチュエータのセクションまたは領域の温度を下げる工程；
（３）任意選択的に、さらなるヌクレオチドの取り込みによって（液滴マイクロアクチュエータにおける液滴中に存在する）核酸の二本鎖セグメントの伸張を容易にするように液滴マイクロアクチュエータのセクションまたは領域の温度を調整する工程。
一実施形態において、この手法は、図２Ａに示されているように、１つの統合型加熱器２０２を備えた液滴マイクロアクチュエータを用いて行われる。
別の実施形態において、液滴マイクロアクチュエータの領域を必要な温度で維持してもよく、液滴を適切な温度領域を経て輸送して、熱サイクリングを達成してもよい。この手法は概して以下の工程を伴う：
（１）液滴中の二本鎖ＤＮＡの変性を一本鎖ＤＮＡにさせるのに適切な温度で維持される液滴マイクロアクチュエータの領域まで増幅準備の整った液滴を輸送する工程；
（２）液的中のプライマーをアニーリングして核酸テンプレート鎖における相補的な配列にすることを可能にするのに十分な温度で維持される液滴マイクロアクチュエータの領域まで増幅準備の整った液滴を輸送する工程；
（３）任意選択的に、さらなるヌクレオチドの取り込みによって核酸の二本鎖セグメントの伸張を容易にするか、または最適化するのに十分温度で維持される液滴マイクロアクチュエータの領域まで増幅準備の整った液滴を輸送する工程。
この実施形態において、熱サイクリングは、ゾーンからゾーンに液滴を移動するために、輸送工程を反復することによって達成される。一実施形態において、液滴マイクロアクチュエータは、必要な温度ごとに唯一の熱ゾーンを含み、熱サイクリングは、適切な熱ゾーンを経て各液滴を回転することによって達成される。別の実施形態において、液滴マイクロアクチュエータは、熱ゾーンのそれぞれのうちの２つ以上のゾーンを含む。さらに別の実施形態において、液滴マイクロアクチュエータは、熱ゾーンの１つまたは複数のうちの２つ以上のゾーンを含む。さらに、液滴マイクロアクチュエータは、２つ、３つまたはそれ以上の熱ゾーンを含んでもよく、そのそれぞれは、異なる指定温度まで加熱されてもよい。一実施形態において、この手法は、図２Ｂに示されているように、複数の統合型加熱器２０４を備えた液滴マイクロアクチュエータを用いて行われる。
さらに、１つまたは複数の加熱器を用いて、液滴マイクロアクチュエータの領域にわたって連続的な熱勾配を確立してもよい。この実施形態において、電極マトリックス、電極経路または一連の電極経路は、必要な熱サイクリング工程を実行するために、適切な温度ゾーンに液滴を位置付けるために採用されてもよい。したがって、熱サイクリングは、目標温度を達成するために、熱勾配内の適切な位置にある電極まで液滴を輸送することによって達成されてもよい。たとえば、種々の変性工程、アニーリング工程および／または伸張工程のいずれかを最適化するために、温度における変動は、熱ゾーン内の液滴の位置を単に変えるだけで実現されてもよい。
熱サイクリングは、変性、アニーリングおよび／または伸張のための目標温度ゾーンを確立するために、種々の加熱様相および／または冷却様相の使用を伴ってもよい。これらの加熱様相および冷却様相は、目標温度ゾーン間の適切な温度傾斜を容易にするように配置されてもよい。傾斜は、特定の加熱様相および／または冷却様相の温度を変更することによって、および／または適切な温度傾斜を備える目標温度ゾーンを実現するように選択される距離で加熱様相および冷却様相を選択することによって、制御されてもよい。液滴マイクロアクチュエータは、潜在的な目標温度ゾーンおよび温度傾斜の所定の集合を形成するように選択された温度範囲および間隔を備えた加熱様相および／または冷却様相を有してもよい。種々の加熱様相および／または冷却様相は、ゾーン間の傾斜を調整するために目標温度ゾーンの間に含まれてもよい。
一実施形態において、液滴マイクロアクチュエータは、一連の独立に調整可能な加熱要素を含む。各加熱要素の温度は、液滴が１つの目標温度ゾーンから次の目標温度ゾーンに送られるときに、適切な加熱傾斜を提供するように調整されてもよい。さらに、適切な温度傾斜を容易にするため、および／または密に位置付けられる加熱要素間の相互作用によって生じる過熱を回避するために、目標温度で加熱要素間の距離を選択してもよい。そのような手法は、それぞれが異なる対象温度ゾーンおよび傾斜分布を必要とする種々のプロトコルによる作用における柔軟性を提供する。たとえば、一連の加熱要素または加熱要素のマトリックスにおいて、目標温度ゾーンは、隣接する加熱要素であってもよく、および／または１つまたは複数の加熱要素によって分離され、より大きな距離分、離されるようになっていてもよい。このように、距離は、種々のプロトコル要件の温度要件を満たるように可変であってもよい。本発明のシステムは、加熱ゾーン間の適切な温度傾斜または最適の温度傾斜によって目標温度ゾーンを確立するために、最適な加熱要素を選択してもよい。
本発明の方法は、熱サイクリングの変性段階、アニーリング段階および／または伸張段階のために、温度および／または時間を最適化するための温度最適化工程またはプロトコルを含んでもよい。一例として、方法は、アニーリング温度を最適化するための最適化工程またはプロトコルを含んでもよい。一連の加熱ゾーンが確立されてもよく、増幅準備の整った液滴が異なるアニーリング温度によってサイクルされ、いずれのアニーリング温度が、最適な結果をもたらすかを決定してもよい。次の熱サイクリングは、最適温度で行われうる。同様に、一連の増幅準備の整った液滴が、アニーリング段階の時間が体系的に変動されるプロトコルを用いてサイクルされ、いずれの時間期間が所定の温度で最適な結果をもたらすかを決定してもよい。次の熱サイクリングは、最適時間期間で行われることができる。さらに、そのようなプロトコルを連続的または同時に実行して、最適な温度および最適な時間期間の両方を決定することができる。類似のプロトコルが、変性工程および／または伸張工程の最適化のために行われてもよい。最適化工程は、連続的または並列に実行されてもよい。
同様に、本発明の方法は、変性、アニーリングおよび／または伸張のために、温度および／または時間を最適化するための複数の独立に加熱される熱ゾーンを用いた温度最適化工程またはプロトコルを含んでもよい。たとえば、一連の加熱ゾーンが確立され、それを経て、増幅準備の整った液滴が輸送されてもよい。ゾーンは、変性、アニーリングおよび／または伸張を促進することを目的とした温度を含んでもよい。特定の液滴設定において、変性ゾーン、アニーリングゾーンおよび／または伸張ゾーンのうちの１つの温度は、一連のＰＣＲ準備の整った液滴に関して体系的に変化されてもよいのに対して、他の２つの温度は、一定のままである。複数の液滴設定は、必要に応じて温度変数のそれぞれが変化されてもよいように試されてよい。複数の液滴設定のうちの１つまたは複数は、連続的におよび／または並列に試されてもよい。加熱ゾーン温度における変動は、たとえば、最適化プロトコルを実行するように予めプログラムされたソフトウェアを介して、および／またはユーザインターフェイスによってユーザによって制御されるソフトウェアを介して、プロセッサによって（たとえば、加熱要素の温度を制御することによって、および／または加熱勾配内の液滴の位置を制御することによって）制御されてもよい。熱サイクルの段階のそれぞれのタイミングは、類似の様式で最適化されてもよい。最適化プロトコルは、連続的におよび／または並列に実行されてもよい。
さらに、本発明は、高温、たとえば、約７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃または１００℃を超える温度で、液滴マイクロアクチュエータにおいてＰＣＲ準備の整った液滴を用いて１つまたは複数の液滴操作を行う方法を含む。たとえば、液滴操作としては、以下：液滴マイクロアクチュエータ内への液滴の投入；供給源の液滴からの１つまたは複数の液滴の分配；液滴の２つ以上の液滴への分割、分離または分裂；任意の方向におけるある位置から別の位置への液滴の輸送；２つ以上の液滴の１つの液滴への融合または結合；液滴の希釈；液滴の混合；液滴の攪拌；液滴の変形；液滴の所定の位置における保持；液滴の培養；液滴の加熱；液滴の気化；液滴の冷却；液滴の配置；液滴マイクロアクチュエータからの液滴の輸送；本明細書に記載される他の液滴操作および／または上記の操作の任意の組み合わせが挙げられうる。またさらに、本発明は、液滴マイクロアクチュエータにおける２つ以上の温度ゾーン間で液滴を輸送することによる液滴を加熱および／または冷却する方法を含む。さらに、本発明は、温度ゾーンが、約４０℃〜約１２０℃の範囲にある場合に、液滴マイクロアクチュエータにおける２つ以上の温度ゾーン間で液滴を輸送することによる液滴を加熱および／または冷却する方法を含む。本発明はまた、温度ゾーンが、約４０℃〜約１２０℃の範囲にあり、対象温度を約７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃または１００℃を超える温度の少なくとも一部を達成する場合に、液滴マイクロアクチュエータにおける２つ以上の温度ゾーン間で液滴を輸送することによる液滴を加熱および／または冷却する方法を含む。
本発明は、生化学反応を行うための試薬、たとえば、核酸増幅プロトコル、親和性に基づく分析プロトコル、配列決定プロトコルおよび生体液の分析のためのプロトコルにおいて用いるために記載された試薬などが投入される１つまたは複数の投入貯槽を有する液滴マイクロアクチュエータまたは液滴マイクロアクチュエータシステムを含む。たとえば、１つまたは複数の貯槽は、緩衝剤、プライマー、ヌクレオチド、ポリメラーゼを提供するための試薬、およびＰＣＲ反応を行うための他の試薬を含んでもよい。一実施形態において、１つまたは複数の貯槽は、ＰＣＲ反応を行うための２つ以上の試薬を含む緩衝剤を含み、試薬は、プライマー、ヌクレオチド、ポリメラーゼおよび他のＰＣＲ試薬から選択される。別の実施形態において、貯槽のうちの１つまたは複数は、ＰＣＲ反応を行うために必要なすべての試薬を含む液滴を含み。その結果、核酸テンプレートを含む試料液滴と結合される場合に、結果が、ＰＣＲ熱サイクリングのために準備の整った液滴であるようになっている。本発明はまた、ＰＣＲ反応を行うための試料によって投入された１つまたは複数の投入貯槽を有する液滴マイクロアクチュエータまたは液滴マイクロアクチュエータシステムを含む。
８．１．４ 増幅プロトコル
本開示に照らして、多くの変形が本発明の範囲内で可能であることは当業者には明白であろう。一般に、プロトコルは、ＰＣＲ試薬およびテンプレートを含む２つ以上の液滴を合わせ、ＰＣＲ準備の整った液滴を生じること、および標的核酸の増幅を容易にするように選択された温度でＰＣＲ準備の整った液滴に熱サイクルを施すことを伴う。
ＰＣＲ増幅用の準備の整った核酸テンプレートを提供するために、上流で、プロトコルは、種々の試料処理工程を伴ってもよい。たとえば、ＰＣＲの前にＲＮＡの逆転写を用いて、増幅用の安定したＤＮＡ核酸テンプレートを提供してもよい。したがって、一実施形態において、本発明は、ＤＮＡ核酸テンプレートを含む液滴を調製する方法を提供し、該方法は、ＲＮＡの液滴に基づく逆転写を行って核酸テンプレートを生じることを含む。
反応調製中のプライマーダイマーの形成を最小限に抑えるために、「ホットスタート」手法を用いることができる。ＰＣＲサイクリングの前にポリメラーゼ活性を制限することによって、非特異的増幅が低減され、目標収率が増大される。ホットスタートＰＣＲに関する一般的な方法は、化学的修飾、ワックスバリア法およびＴａｑを標的とした抗体による阻害を含む。
下流で、プロトコルは、種々の次の工程、たとえば、パイロシーケシング手法を用いた増幅された核酸の配列決定、またはキャピラリ電気泳動法を用いた増幅されたフラグメントの分離を伴ってもよい。
種々の特殊技術もまた、ＰＣＲ処理中に用いられてもよい。たとえば、核酸テンプレートに対して完全に相補的でない配列を備えるプライマーは、液滴に基づくインビトロ突然変異誘発のために用いられることができる。したがって、たとえば、本発明は、方法が、標的核酸の突然変異バージョンの増幅を容易にするのに十分な量で、突然変異誘発のために選択されたＰＣＲ試薬およびプライマーを含む２つ以上の液滴を合わせることを伴う場合には、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴内にインビトロ突然変異誘発を実現する方法を含んでもよい。さらに、標的核酸の突然変異バージョンは、下流処理、たとえば、所望の突然変異を確認するための標的核酸の突然変異バージョンの配列のために輸送されてもよい。
本発明の医療診断態様において、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）などの分子タグまたはビオチン標識化されたｄＵＴＰは、特異配列の検出を可能にするために用いられうる。標識化されたＰＣＲ生成物は、たとえば、ハイブリダイゼーションプローブとして用いられてもよく、または捕捉プローブの使用によって検出されてもよい。
多くのプロトコルにおいて、反応の品質または忠実度を決定するために、１つまたは複数の対照液滴を同時に処理することが望ましい。したがって、たとえば、汚染が生じていないことを保証するために、試料テンプレートのない１つまたは複数のＰＣＲ準備の整った液滴に熱サイクルが施されてよく、試料テンプレートを含む液滴と同様の様式で他の方法で処理されてもよい。対照液滴における増幅された核酸の検出は、汚染を表すことになる。他の対照液滴は、テンプレート材料の周知の量または濃度または蛍光染料の既知の量または濃度を含んでもよい。対照液滴は、実際の試料液滴の処理と同時に、処理前および／または処理後に、試料液滴と同一の液滴マイクロアクチュエータで処理されてもよい。
システムは、各試料または分析に関する反応プロトコルおよび状態の独立のソフトウェアに基づくカスタマイズの可能性を提供する。これは、プラットフォームの拡張性と組み合わせることにより、システムの機能が広範囲の核酸標的を含むように拡張されうることを保証する。
本発明は、増幅試薬において液滴操作を行う方法を含む。たとえば、本発明は、緩衝剤、プライマー、ヌクレオチド、ポリメラーゼおよび／または他のＰＣＲ試薬を含む液滴において１つまたは複数の液滴操作を行う方法を含む。本発明はまた、１つまたは複数のプライマーを含む液滴マイクロアクチュエータにおいて、緩衝剤液滴を用いて、１つまたは複数の液滴操作を行う方法を含む。本発明はまた、１つまたは複数のヌクレオチドを含む液滴マイクロアクチュエータにおいて、緩衝剤液滴を用いて、１つまたは複数の液滴操作を行う方法を含む。本発明はまた、たとえば、ＤＮＡポリメラーゼなどの１つまたは複数のポリメラーゼを含む液滴マイクロアクチュエータにおいて、緩衝剤液滴を用いて、１つまたは複数の液滴操作を行う方法を含む。本発明はまた、複数の逆転写酵素のうちの１つを含む液滴マイクロアクチュエータにおいて、緩衝剤液滴を用いて、１つまたは複数の液滴操作を行う方法を含む。別の実施形態において、本発明は、プライマー、ヌクレオチド、ポリメラーゼおよび他のＰＣＲ試薬を含むカテゴリーから選択される２、３、４またはそれ以上のＰＣＲ試薬を含む液滴マイクロアクチュエータにおいて、緩衝剤液滴を用いて、１つまたは複数の液滴操作を行う方法を含む。さらに、本発明は、標的核酸配列を含む１つまたは複数の緩衝剤、プライマー、ヌクレオチド、ポリメラーゼおよび核酸テンプレートを含むＰＣＲ準備の整った液滴を用いて、１つまたは複数の液滴操作を行う方法を含む。
液滴に基づく増幅プロトコルはまた、ＲＮＡ内容物を分析するために有用である。一部の実施形態において、ＲＮＡは、最初の標的核酸である。２つの緩衝剤システムを用いて、ウイルスルのＲＮＡからｃＤＮＡを作成する逆転写（ＲＴ）工程用の１つの緩衝剤と、ＤＮＡ増幅工程を容易にするように選択される異なる緩衝剤とを提供してもよい。関連実施形態において、単独の緩衝剤方法が用いられ、この方法では、いずれに関しても最適である必要はないが、両方の反応に適合する緩衝剤が提供される。
一実施形態において、液滴に基づくＰＣＲは、液滴マイクロアクチュエータにおいて実行されてよく、たとえば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびサイクリン依存性キナーゼ抑制因子ｐ２１（Ｃｉｐ１）およびｐ２７（Ｋｉｐ１）などの関連癌バイオマーカーに関する遺伝子発現レベルにおける変化を定量化することができる。たとえば、液滴中の細胞は、懸濁されるか、または表面に結合されるかに関係なく溶解されうる。フリードポリ（Ａ）ｍＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）磁気応答性ビーズなどのビーズを用いて、液滴中において捕捉されうる。試薬は、そのｍＲＮＡ ＤＩＲＥＣＴ Ｍｉｃｒｏ ＫｉｔとしてDynal Biotechから入手可能である。液滴の混合または攪拌を用いて、細胞溶解を促進し、ビーズへのポリ（Ａ）ｍＲＮＡの捕捉を強化してもよい。オリゴ（ｄＴ）磁気応答性ビーズからのｍＲＮＡは、ＲＮＡ‐ＤＮＡ二本鎖を熱的に溶融することによって溶出されうる。適切な温度は、鎖の長さに左右される。ビーズは、本明細書の他の場所に記載したように、液滴に基づく洗浄プロトコルを用いて洗浄されうる。ＰＣＲ（たとえば、ｑＲＴ‐ＰＣＲ）は、遺伝子標的用の適切なプライマー（たとえば、ＶＥＧＦ、ｐ２１（Ｃｉｐ１）およびｐ２７（Ｋｉｐ１））によって、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴に基づくプロトコルを用いて行われうる。液滴に基づくＲＮＡ増幅はまた、Ｖａｎ ＧｅｌｄｅｒおよびＥｂｅｒｗｉｎｅ技術を用いて達成されてもよい。
本発明は、ＤＮＡに関する液滴に基づくローリングサイクル型増幅を提供する。ローリングサイクル手法において、ｄｓＤＮＡを含む緩衝剤液滴は、ｄｓＤＮＡの変性という結果を生じるのに十分な温度（典型的には、約９５℃）まで液滴マイクロアクチュエータにおいて加熱される。培養時間は、場合によっては、約１分〜約１０分の範囲であってもよい。環状化可能なプローブを含む液滴は、変性したＤＮＡを含む液滴と合わせ、環状化可能なプローブをアニーリングして、ポリメラーゼ（たとえば、Ｔ．ｆｌａｖｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ）および適切なリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ ＤＮＡリガーゼ）を有する緩衝剤において効果的な温度（たとえば、約６０℃）で対象ｄｓＤＮＡに結紮する。培養は、場合によっては、約４５分未満であってもよい。結果として生じる液滴は、低下した温度（たとえば、約３１℃）で、ローリングサイクルプライマー、緩衝剤、φ２９ＤＮＡポリメラーゼと合わせる。培養時間は、場合によっては、約２分〜約３０分の範囲にあってもよい。ビオチンは、φ２９ＤＮＡポリメラーゼに組み込まれ、ストレプトアビジンビーズまたは表面に単位複製配列を捕捉し、蛍光プローブによって可視化されてもよい。
本発明は、ＤＮＡに関する液滴に基づく鎖置換増幅（ＳＤＡ）を提供する。この実施形態において、標的の特異増幅プライマーを有するｄｓＤＮＡフラグメントを含む緩衝剤液滴は、ｄｓＤＮＡの変性という結果を生じるのに十分な温度（典型的には、約９５℃）まで液滴マイクロアクチュエータにおいて加熱される。培養時間は、場合によっては、約４分であってもよい。液滴は次に、アニーリングを結果として生じるように、アニーリング温度（たとえば、約３７℃）まで冷却される。アニーリング時間は、場合によっては、約４分未満であってもよい。液滴は、制限エンドヌクレアーゼおよびｅｘｏ（ｍｉｎｕｓ）クレノウポリメラーゼを含む液滴と液滴操作を用いて合わせる。結果として生じる液滴は、ＤＮＡ増幅を結果として生じるのに十分な温度（たとえば、約３７℃）で液滴マイクロアクチュエータにおいて等温的に培養される。培養時間は、場合によっては、約１時間〜約５時間であってもよい。増幅は、たとえば、蛍光プローブまたは鎖特異的分子指標を用いて検出されうる。
本発明は、ＲＮＡに関する液滴に基づく転写仲介増幅またはＮＡＳＢＡを提供する。この実施形態において、標的核酸を含む液滴は、標的を変性するのに十分な温度（典型的は、約９５℃）まで液滴マイクロアクチュエータにおいて加熱される。変性時間は、場合によっては、約４分未満、３分未満または２分未満であってもよい。液滴は次に、適切な温度（たとえば、約４１℃）まで冷却され、液滴操作を用いて添加Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータ‐標的プライマー１および標的プライマー２を含む液滴と合わせる。結果として生じる液滴は、液滴操作を用いて逆転写酵素ＲＮＡｓｅ ＨおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを含む液滴と合わせる。液滴温度は次に、ＲＮＡ単位複製配列の増幅を結果として生じるのに十分な温度まで調整される。増幅時間は、場合によっては、約６０分間、持続してもよい。
本発明の一態様は、核酸の固定化のための基材を有する液滴マイクロアクチュエータである。一態様において、基材は、金の基材である。別の態様は、核酸の固定化のための基材と、基材に核酸を固定化するための試薬とを含む液滴マイクロアクチュエータである。さらに別の態様は、核酸の固定化のための基材と、基材に核酸を固定化するための試薬と、核酸試料とを含む液滴マイクロアクチュエータである。これらの試薬および試料は、たとえば、液滴マイクロアクチュエータにおける貯槽および／または液滴マイクロアクチュエータ以外の貯槽または他の容器（たとえば、カートリッジ）に蓄えられてもよい。さらに別の態様において、本発明は、液滴操作を実行して、核酸試料を含む液滴を基材に接触させ、それによって、基材に核酸試料を堆積することを含む基材における核酸試料の固定化の方法を伴う。
８．１．５ 下流における分析
一部の実施形態において、増幅された標的核酸を含む液滴は、さらなる分析のために下流に輸送されてもよい。たとえば、液滴は、マイクロゲル電気泳動法による分析のために輸送されて、流されてもよい。マイクロゲル電気泳動法は、液滴マイクロアクチュエータ内または液滴マイクロアクチュエータ外で行われてもよい
一実施形態において、２次元マイクロゲル電気泳動法デバイスは、ＭｏｈａｎｔｙらおよびAmerican Electrophoresis Society Annual Meeting(http://aiche.confex.com/aiche/20Q5/techprogram/P30621．ＨＴＭ参照）に記載されたデバイスなどである。
一部の実施形態において、増幅された核酸を含む液滴は、増幅された核酸を適切なベクターに複写するのに十分な試薬を含む液滴と接触する。ベクターは、遺伝子ライブラリーおよび／または細胞内の発現に用いるために選択されてもよい。
８．２ 核酸配列分析
本発明は、液滴マイクロアクチュエータシステムにおける液滴に基づく核酸配列分析のために、中でも、従来技術の手法に必要なますます複雑な混合物に関連する問題を回避する方法、デバイスおよびシステムを提供する。
図３は、核酸配列分析に適した具体的な液滴マイクロアクチュエータ３００を示す。この実施形態において、ＤＮＡ投入貯槽３０２、ＤＮＡ試薬貯槽３０４、プライマー設定貯槽３０６、ヌクレオチド（たとえば、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびｄＴ）貯槽３０８およびパイロシーケシングプライマー貯槽３１０などの複数の流体ポートまたは貯槽が設けられてもよい。洗浄緩衝剤貯槽３１２は、廃棄領域３１４、熱サイクリング領域３１６および画像形成領域３１８が設けられていてもよい。種々の熱サイクリング領域の実施形態は、本明細書において他の場所で記載したような加熱器構造などの種々の加熱器構造を採用してもよい。画像形成領域３１８は、たとえば、光電子増倍管（ＰＭＴ）を利用してもよい。
図４および図５は、本発明の説明に役立つ実施形態の反応工程および液滴操作を示す。核酸試料は、分析のための核酸の十分な濃度を得るために、必要に応じて（液滴マイクロアクチュエータ内または液滴マイクロアクチュエータ外で）増幅されてもよい。核酸試料は、固体支持材上に固定化される場合には、液滴マイクロアクチュエータに導入されてもよい。核酸の一本鎖への変性、プライミング、二本鎖部分への段階的な伸張のための試薬は、液滴マイクロ作動技術を用いて、核酸を固定化するために、輸送されてもよい。反応性生物を含む液滴は、たとえば、さらなる処理、分析および／または廃棄物処理のために、固定化された核酸から外に輸送されてもよいことが重要である。一部の実施形態において、伸張合成反応に関して時間および空間において個別に検出を行ってもよいことが重要である。中でも、この機能は、既存の方法によって生じた一定の分解副生成物の構成を低減または削減する。本発明のさらなる利点は、センサに近接して検出を行うことができ、集光効率、引いては分析の感度を向上することができることである。
本発明は、配列決定プロトコルを行うための試薬が投入される１つまたは複数の投入貯槽を有する液滴マイクロアクチュエータまたは液滴マイクロアクチュエータシステムを含んでもよい。たとえば、１つまたは複数の貯槽は、パイロシーケシングプロトコルを行うための試薬を含んでもよい。本発明はまた、パイロシーケシングプロトコルを行うための試料が投入される１つまたは複数の投入貯槽を有する液滴マイクロアクチュエータまたは液滴マイクロアクチュエータシステムを含んでもよい。
本発明の重要な態様は、液滴マイクロアクチュエータにおいて配列分析試薬および／または試料のそれぞれを用いて液滴操作を行う能力を含むことは十分に認識されよう。たとえば、本発明は：
（１）配列分析を行うための本明細書に記載される試薬および／または試料のうちの任意の１つまたは複数を含む液滴をその上に含む液滴マイクロアクチュエータ；
（２）そのような液滴マイクロアクチュエータを含む本発明のデバイスまたはシステム；
（３）そのような液滴マイクロアクチュエータまたはシステムを利用する液滴に液滴操作を行うかまたは別の処置を施す方法；および／または
（４）そのような液滴マイクロアクチュエータまたはシステムを利用する液滴に基づく配列分析プロトコルを行う方法
を含みうる。
たとえば、液滴操作としては、以下：液滴マイクロアクチュエータ内への液滴の投入；供給源の液滴からの１つまたは複数の液滴の分配；液滴の２つ以上の液滴への分割、分離または分裂；任意の方向におけるある位置から別の位置への液滴の輸送；２つ以上の液滴の１つの液滴への融合または結合；液滴の希釈；液滴の混合；液滴の攪拌；液滴の変形；液滴の所定の位置における保持；液滴の培養；液滴の加熱；液滴の気化；液滴の冷却；液滴の配置；液滴マイクロアクチュエータからの液滴の輸送；本明細書に記載される他の液滴操作および／または上記の操作の任意の組み合わせ；のうちの１つまたは複数が挙げられうる。本発明の種々の他の方法、デバイス、システムおよび他の態様は、次の説明から明白となるであろう。
８．２．１ 試料増幅
核酸配列分析は、典型的には、増幅された核酸検体を含む試料または増幅のための核酸検体を含む試料から始まる。後者の場合には、増幅は、標準的な技術または８．１節に記載したように、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴に基づく増幅を用いて行われうる。増幅は、配列分析プロトコルを行うように用いられた同一の液滴マイクロアクチュエータおよび／または個別の液滴マイクロアクチュエータで行われてもよい。一部の実施形態において、第２の液滴マイクロアクチュエータは、配列分析液滴マイクロアクチュエータと流体連通状態で連結される。
８．２．２ 核酸固定化
図４に示されているように、増幅された核酸試料は、液滴マイクロアクチュエータ内で固定化されてもよく、その結果、試薬液滴が、固定化された核酸と接触してもよい。固定化は、液滴マイクロアクチュエータの表面上、またはポリマー、ポリマー樹脂から構成され、任意に磁気応答性材料を含むビーズなどのマイクロアクチュエータ内の他の表面上であってもよい。
そのような付着のための有用な基材としては、ガラス、金、ポリアクリルアミドゲル、ポリピロール、テフロン（登録商標）および光ファイバが挙げられる。材料は、たとえば、膜、粒子、マトリックスまたはビーズとして提供されてもよい。一実施形態において、基材は、磁気応答性ビーズを含む。液滴マイクロアクチュエータは、磁気応答性ビーズに処置（たとえば、固定化、解放または移動）するために、磁界を生成する磁石または電磁石を含むことができる。たとえば、洗浄工程（８．６節参照）を強化するために、磁界を用いてマイクロアクチュエータ上で磁気応答性ビーズを攪拌して固定化することができる。
種々の技術を用いて、ＤＮＡなどの分子を表面に固定化してもよい。例としては、オリゴヌクレオチドをマイクロアレイの表面に付着させるために用いられる化学反応および固相合成技術において用いられる化学反応が挙げられる。
核酸試料は、チオール化され、金の基材に吸着されてもよい。核酸は、たとえば、Ｂｅｅｂｅらによる「Thiol Labeling of DNA for Attachment to Gold Surfaces」というタイトルの米国特許第５，４７２，８８１号（開示内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる）に記載したように、たとえば、ホスホジエステル部分の非架橋インターヌクレオチド酵素を硫黄で置換することによって、チオール化されてもよい。チオール化される核酸を含む１つまたは複数の液滴は、チオール化される核酸試料が、液滴マイクロアクチュエータにおいて金の表面上に堆積される金の基材まで輸送されうる。チオール化されるＤＮＡを含む液滴は、硫黄と金との間に形成される共有結合のための十分な時間、金の表面と接触される。金の表面を用いて、液滴の表面積を増大させるために、電気作動技術を採用してもよい。
ＤＮＡ試料は、水溶ビオチンエステルまたはビオチニルホスホロアミダイト試薬を用いて５’末端で、ビオチン化されうる。ビオチン化されたＤＮＡは、ストレプトアビジンによってコーティングされた基材上に捕捉されうる。したがって、ビオチン化されたＤＮＡ試料を含む液滴は、ＤＮＡが捕捉されて固定化されるストレプトアビジン表面に接触するように輸送されうる。
基材上に一本鎖ＤＮＡの固定化のための化学反応について、記載されている（Ｓ．Ｔａｉｒａら「Immobilization of single-stranded DNA by self-assembled polymer on gold substrate for a DNA chip」、Biotechnol Bioeng. ２００５ Ｍａｒ ３０；８９（７）：８３５−８）。この手法において、チオクト酸（ＴＡ）は、自己集合によって、金の表面上にポリマーを固定化するために、側鎖において、ポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ）に共有結合される。Ｎ‐ヒドロキシコハク酸イミド‐エステル終端されたプローブ一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡが、ＴＡ‐ＰＡＨによってコーティングされた金の表面上に共有結合によって容易に固定化される。表面は、ポリアクリル酸によって覆われてもよく、ポリアクリル酸は、ＴＡ‐ＰＡＨとイオン錯体を形成し、カチオン電荷を低減する。
図４の工程３に示されているように、二本鎖核酸は、ＮａＯＨ溶液などの変性試薬によって処置され、一本鎖試料を生じる。この工程は、固定化工程後に生じるものとして示される。しかし、固定化前、固定化中または固定化後に、二本鎖核酸試料と接触するように変性試薬を輸送することによって、変性を行ってもよいことは十分に認識されよう。変性はまた、二本鎖錯体を熱的に溶融するために、試料を加熱することによって行われてもよい。
本発明の一態様は、核酸の固定化のための基材を有する液滴マイクロアクチュエータである。別の態様は、核酸の固定化のための基材と、基材に核酸を固定化するための試薬とを含む液滴マイクロアクチュエータである。さらに別の態様は、核酸の固定化のための基材と、基材に核酸を固定化するための試薬と、核酸試料とを含む液滴マイクロアクチュエータである。これらの試薬および試料は、たとえば、液滴マイクロアクチュエータにおける貯槽および／または液滴マイクロアクチュエータ以外の貯槽または他の容器（たとえば、カートリッジ）に蓄えられてもよい。貯槽投入アセンブリの一実施形態において、試薬および／または試料貯槽（たとえば、バイアルまたはシリンジ）は、液滴マイクロアクチュエータ貯槽と流体連通状態に連結されてもよく、その結果、バイアルからの流体は、液滴マイクロアクチュエータ貯槽に流れ込んでもよく、または直接的に押し進められてもよい。本発明のこの態様は、拡張可能であり、貯槽および貯槽投入アセンブリの数は、必要に応じて増大し、所望のプロトコルを行うために必要なだけの数の試薬用のスロットを含んでもよい。試薬／試料貯槽および試薬／試料投入は、８．８．４節および８．８．５．１節においてさらに説明される。
８．２．３ ヌクレオチド取り込みを容易にするポリメラーゼ
図４の工程４および工程５に示されているように、固定化された一本鎖ヌクレオチド試料がプライミングされて、二本鎖セグメントを生じる。プライミングは、たとえば、固定化された試料と接触するプライマーを含む液滴を輸送することによって達成されてもよい。
プライミングされた試料は、ポリメラーゼの存在下でデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）と反応される。この反応は、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）およびポリメラーゼを含む１つまたは複数の液滴を固定化された試料に接触するように輸送することによって達成されてもよい。ｄＮＴＰが、核酸試料の一本鎖部分における第１の塩基に対して相補性である場合には、ポリメラーゼは、触媒作用を及ぼしてＤＮＡ鎖にそれを取り込む。各取り込み事象は、取り込まれたヌクレオチドの量に対応する量のピロリン酸塩（ＰＰｉ）の放出によって達成される。したがって、取り込み事象は、放出されるＰＰｉを測定することによって決定されうる。ｄＮＴＰの添加は典型的には、それぞれ、個別の緩衝剤において１つずつ行われる。各ヌクレオチドが予め選択された順序またはプログラムされた順序で利用可能であるため、ヌクレオチドの取り込みは、各固定化されたテンプレートに沿って連続的に続行される。
種々の天然ポリメラーゼおよび改質ポリメラーゼを用いてもよい。改質ポリメラーゼは、たとえば、添加、挿入または置換による元の配列を含み、プライミングされた試料へのヌクレオチドの取り込みを容易にする能力を保持するポリメラーゼを結果として生じる。ポリメラーゼは、エクソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼであってもよい。ＤＮＡポリメラーゼの大きなフラグメントまたはクレノウフラグメントもまた、用いてもよい。
酵素のＰＰｉ検出反応では妨げないが適切な塩基のペアリングを妨げることなく成長ＤＮＡ鎖にポリメラーゼによって取り込まれうるｄＡＴＰまたはｄｄＡＴＰ類似物を、選択してもよい。適切な類似物の例としては、デオキシＡＴＰまたハジデオキシＡＴＰの［１‐チオ］三リン酸塩（またはα‐チオ三リン酸塩）類似物、たとえば、既知でもあるデオキシアデノシン［１‐チオ］三リン酸またはデオキシアデノシンα‐チオ三リン酸（ｄＡＴＰαＳ）が挙げられる。これらおよび他の類似物は、Ｎｙｒｅｎらによる「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＤＮＡ」というタイトルの米国特許第６，２１０，８９１号に記載され、その開示内容全体は、そのような類似物に関する教示のために参照によって本明細書に組み込まれる。
一本鎖結合タンパク質は、一本鎖試料の折り畳みを削減することによって配列されうる配列の長さまで伸長することを含んでもよい。したがって、たとえば、本発明は、一本鎖結合タンパク質を含む液滴を含む液滴マイクロアクチュエータを含む。液滴は、一本鎖結合タンパク質を含む増幅準備の整った液滴であってもよい。本発明は、一本鎖結合タンパク質を含む液滴において液滴操作を行う方法を含む。
８．２．４ ヌクレオチドの取り込みの検出
特異的な塩基が標的部位で取り込まれたかどうかの決定は、取り込み反応中に放出されるＰＰｉの定量化を伴ってもよい。各ｄＮＴＰがポリメラーゼ反応中に成長する核酸鎖に追加されるため、ＰＰｉが放出される。これらの条件下で放出されたＰＰｉは、たとえば、ルシフェラーゼ‐ルシフェリン反応（さらに以下で説明する）における発光によって酵素的に検出されうる。処理が続くにつれて、相補的な鎖が集められて、ヌクレオチド配列が、信号ピークから決定される。システムは、図５に示されているように、プログラムを生成しうる。
８．２．４．１ ＡＴＰへのＰＰｉの変換
一部の場合において、取り込み事象中に放出されたＰＰｉは、間接的に検出されてもよい。ＰＰｉ定量化は、たとえば、酵素触媒の存在下でＡＰＳから生成されるＡＴＰを定量化することによって達成されてもよい。ＡＴＰスルフリラーゼは、アデノシン５’‐ホスホ硫酸の存在下でＰＰｉをＡＴＰに定量的に変換する。したがって、一実施形態において、ＰＰｉは、ＡＴＰに変換されてよく、ＡＴＰの量は、反応中に取り込まれるｄＮＴＰの量を決定するために測定されうる。
８．２．４．２ ＡＴＰの定量化
一旦、ＰＰｉが、ＡＴＰに変換されると、ＡＴＰは、ｄＮＴＰの取り込みを測定するために定量化されうる。図５に示されているように、ＡＴＰは、オキシルシフェリンへのルシフェリンのルシフェラーゼ仲介変換を推進し、ＡＴＰの量に比例する量の可視光を生成する。ルシフェラーゼ触媒反応において生成される光は、たとえば、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラ、フォトダイオードおよび／または光電子増倍管（ＰＭＴ）によって検出されてもよい。光信号は、取り込まれるヌクレオチドの数に比例している。検出された信号は、ユーザが見ることができる結果に対応するシステム出力に変換されうる。
ＰＰｉの放出を検出するためのルシフェリン‐ルシフェラーゼ反応について記載されている。たとえば、酵素ＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼに基づくＰＰｉ放出の連続監視のための方法は、酵素発光無機ピロリン酸塩検出分析法（Enzymatic Luminometric Inorganic Pyrophyosphate Detection Assay）（「ＥＬＩＤＡ」）と呼ばれ、ＮｙｒｅｎおよびＬｕｎｄｉｎ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５１、５０４−５０９、１９８５、その開示内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている。液滴マイクロアクチュエータにおける液滴中のＰＰｉを検出するために、ＥＬＩＤＡの使用は、本発明の一態様である。しかし、この方法は、たとえば、さらなる耐熱性ルシフェラーゼ（（Ｋａｌｉｙａｍａら、１９９４、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５８、１１７０−１１７１、その開示内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる）の使用によって改変されてもよい。ＰＰｉ検出反応用の適切な検出酵素の例は、ＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼである。
一定の従来技術用途において、アピラーゼなどのヌクレオチド分解酵素は、取り込まれていないｄＮＴＰおよび過剰なＡＴＰを分解するために用いられる。分解が終わると、別のｄＮＴＰが添加される。反応が１つの溶液中で行われるため、配列決定が続くと、廃棄生成物が蓄積され続ける。本発明の重要な態様は、ヌクレオチド分解工程のための要件を回避することである。したがって、本発明の一部の態様において、ヌクレオチド分解工程が含まれてもよいのに対して、他の態様において、本発明のシステムおよび方法は、ヌクレオチド分解工程を特に省略する。したがって、たとえば、分析は、相当量のヌクレオチド分解酵素がない場合、たとえば、相当量のアピラーゼがない場合に実現されてもよい。
さらに、本発明者らは、副生成物の実質的な蓄積がない場合に、取り込み反応／変換反応／検出反応を行うことは、さらに予測可能な結果を生成すると考えている。したがって、たとえば、１つのヌクレオチド連鎖が試料中に存在する場合には、１つのヌクレオチド連鎖の長さが増大するにつれて、取り込みの特定の数を区別することが常套的に困難である。本発明者らは、本発明の反応の清浄性が、より長い１つのヌクレオチド連鎖のためのより高い精度および再現性をもたらすと考えている。したがって、たとえば、本発明者は、本発明の方法が、９０％、９５％、９９％または９９．９％の精度で６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上の核酸を有する１つのヌクレオチド連鎖を正確に検出することができると考えている。
８．２．５ 液滴操作プロトコル
上述したプロトコルに加えて、種々の液滴操作プロトコルを利用して、本発明の配列分析を実行してもよいことは十分に認識されよう。したがって、たとえば、ＡＴＰへの変換は、ｄＮＴＰ取り込み反応と共に、１回の反応で達成されてよく、または、反応は、段階的に、すなわち（１）ＰＰｉを放出するためのｄＮＴＰの取り込み、続いて（２）ＡＴＰへのＰＰｉの変換で行われうる。取り込み工程および変換工程が共に行われる場合には、システムは、必要な試薬（ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、ＡＴＰスルフリラーゼおよびＡＰＳ）を含む１つの液滴を輸送してもよい。したがって、固定化された試料にｄＮＴＰを取り込むため、ＰＰｉを放出するため、ＰＰｉをＡＰＳと反応させて、ＡＴＰを生じるために必要なすべての試薬は、各ヌクレオチド用の１つの供給試薬として液滴マイクロアクチュエータにおける貯槽に含まれてもよい。各ヌクレオチド用の供給試薬は、固定化された試料と連続的に接触してもよく、その結果、反応が行われ、相補的ｄＮＴＰの存在下でＡＴＰを生じてもよい。
取り込み工程および変換工程が個別に行われる場合には、プライマー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、スルフリラーゼおよびＡＰＳは、個別の供給源から個別の試薬液滴として提供されてもよく、本発明の反応を行うために共に融合される。あるいは、これらの試薬の一部またはすべてが、パイロシーケシング試薬液滴として１つの供給源から提供されてもよく、固定化された試料と接触され、本発明の反応を行う。たとえば、ｄＮＴＰおよびポリメラーゼを含む液滴は、固定化された試料と接触してもよく、その結果、優遇している場合には塩基を取り込み、それによってＰＰｉを放出する。ＰＰｉを潜在的に含む液滴は次に、固定化された試料から外に輸送されて、ＡＴＰスルフリラーゼおよびＡＰＳを含む液滴と結合されて、ＡＴＰを生成してもよい。あるいは、ＡＴＰスルフリラーゼおよびＡＰＳを含む液滴は、固定化された試料の存在下でＰＰｉを潜在的に含む液滴と結合され、ＡＴＰを生成してもよい。
さらに、図４は、プライミング工程４および取り込み工程／変換工程５を連続的に生じるものとして示しているが、これらの工程をさらに分離することができ、またはすべてを１つの工程に統合することもできることは十分に認識されよう。言い換えれば、各特定の試薬は、１つまたは複数の液滴において適切な時間で反応に加えられてもよく、または複数の試薬の任意の組み合わせが１つの液滴または一連の液滴において共に提供されてもよい。したがって、一実施形態において、液滴マイクロアクチュエータは、１つまたは複数の液滴を一本鎖試料と接触するように輸送し、１つまたは複数の液滴は共に、共にまたは個別の液滴において提供される以下の試薬（またはそれらの機能的等価物）、すなわち、任意の組み合わせおよび任意の順序のプライマー、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを含み、プライマーが試料とハイブリッド形成して二本鎖部分を形成し、ポリメラーゼが、二本鎖部分に隣接する第１の一本鎖塩基位置での標的部位への任意の相補的なｄＮＴＰの取り込みを触媒し、それにより、ＰＰｉを放出するという結果を生じる。
別の実施形態において、液滴マイクロアクチュエータは、一本鎖試料と接触するように１つまたは複数の液滴を輸送し、１つまたは複数の液滴は共に、以下の試薬（またはそれらの機能的等価物）、すなわち、任意の組み合わせおよび任意の順序のプライマー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、スルフリラーゼおよびＡＰＳを含み、プライマーが試料とハイブリッド形成して二本鎖部分を形成し、ポリメラーゼが、二本鎖部分に隣接する第１の一本鎖塩基位置での標的部位への任意の相補的なｄＮＴＰの取り込みを触媒し、それにより、ＰＰｉを放出し、ＡＴＰスルフリラーゼがＡＰＳの存在下で任意のＰＰｉをＡＴＰに変換するという結果を生じる。塩基取り込みは、放出されるＰＰｉの量を定量化することによって決定される。
ＡＴＰを潜在的に含む液滴は、任意のＡＴＰの検出を容易にするために、液滴マイクロ作動技術を介して、ルシフェラーゼおよびルシフェリンなどの試薬を含む液滴と融合されてもよい。同様に、ルシフェリンを含み、ＡＴＰを潜在的に含む液滴は、任意のＡＴＰの検出のために、液滴マイクロ作動技術を介して、ルシフェラーゼを含む液滴と融合されてもよい。さらに、ルシフェラーゼを含み、ＡＴＰを潜在的に含む液滴は、任意のＡＴＰの検出のために、液滴マイクロ作動技術を介して、ルシフェリンを含む液滴と融合されてもよい。
検出反応用の液滴は、固定化された試料の存在下でまたは固定化された試料とは別に融合されてもよい。たとえば、ルシフェラーゼ／ルシフェリン液滴は、固定化された試料の存在下でＡＴＰを潜在的に含む液滴と融合されてもよい。あるいは、ＡＴＰを潜在的に含む液滴は、固定化された試料から分離され、ルシフェラーゼ／ルシフェリン液滴と融合されてもよい。いずれの場合も、光信号を生成する試薬を含む液滴の融合は、センサに近接して実現され、検出される光の量を最大にしてもよい。
ＡＴＰを潜在的に含む液滴が、固定化された試料から分離され、ルシフェラーゼ液滴と融合される場合には、輸送工程は、蛍光反応における検出のために、ＡＴＰの生成を最大するために、培養工程を含んでもよい。言い換えれば、この培養は、輸送中に達成されてもよく、または蛍光反応の前に培養のために液滴が一時的に蓄えられてもよい。液滴マイクロアクチュエータは、この目的のために、培養ゾーンを含んでもよい。培養ゾーンは、ゾーンにおける温度を制御するために、加熱要素を含んでもよく、含まなくてもよい。培養ゾーンは、液滴マイクロアクチュエータの残りからゾーンを分離する壁を含んでもよく、含まなくてもよい。培養ゾーンは、ゾーンの内外への液滴の輸送を容易にするために、電極のアレイを含んでもよい。ゾーンは、拡張可能であり、培養ゾーン内に数千、数百またはそれ以上の液滴を輸送して、蓄えるための電極を含んでもよい。
本発明の実施において、１つまたは複数の検出試薬は、ポリメラーゼ反応工程から特に排除されてもよく、その結果、任意の信号が、ポリメラーゼ反応中に発せられないようになっていてもよい。たとえば、一実施形態において、検出酵素は、ポリメラーゼ工程のために反応混合物に加えられない。代わりに、ポリメラーゼ工程を行うために用いられる液滴は、固定化された試料とは別に輸送され、次に、任意の結果として生じる反応からの信号を検出するためのセンサの範囲において、検出酵素を含む液滴と融合される。
したがって、ポリメラーゼ反応に関する反応混合物は、少なくとも１つのｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、ＡＰＳおよびＡＴＰスルフリラーゼを含んでもよく、任意選択的に、ルシフェリンを含み、実質的な量のルシフェラーゼが欠けていてもよい。このように、ｄＮＴＰ取り込み反応は、検出反応から分離されてもよい。したがって、検出反応は、たとえば、図５に示されているように、センサの存在下で行われ、検出信号を最大にするようにしてもよい。たとえば、検出信号が光を含む場合には、検出反応は、任意の結果として生じる光生成反応から発せられる光を検出するためのセンサの範囲において、検出反応が終了してもよい。
さらに、検出反応および次の取り込み反応は並列に行われてもよく、それにより、配列決定速度を促進する。同様に、取り込み反応が行われてもよく、前の取り込み反応の生成物が培養されてもよく、前の培養の生成物が、個別の液滴をすべて並列に検出するように施され、それにより、配列決定速度を速める。
従来技術の一定の処理とは異なり、本発明の液滴マイクロアクチュエータ手法は、大量輸送の影響を回避する。試薬は、複数の試料にわたって試薬のフローを必要とすることなく、各試料と直接的に接触させてもよい。磁気応答性ビーズが用いられる場合には、磁気応答性ビーズは、磁界を用いて適所に維持されてもよく、および／または液滴中において場所から場所に輸送されてもよい。試薬は、他の試料と接触することなく、かつ二次汚染を潜在的に生じることなく、試薬供給源から試料に直接的に輸送されてもよい。副生成物の拡散は、充填剤流体における液滴の隔離によって回避される。光の検出を妨げる場合があるビーズ、たとえば、安定ビーズによって充填されるウェルもまた、回避されてもよい。ヌクレオチドの使用の間にアピラーゼを含む洗浄液を用いてもよいが、その使用は、本発明の実施において必要ではなく、一部の実施形態において、特に回避される。
固定化された試料に対する試薬の各新しい集合の使用の間に、たとえば、緩衝溶液によって洗浄されてもよい。種々の表面洗浄プロトコルについては、８．６節に記載される。
８．２．６ 用途
本発明の核酸増幅および配列決定方法、デバイスおよびシステムは、科学的研究、医療診断および獣医診断、薬理ゲノム学、ゲノム配列決定、遺伝子発現プロファイル、配列変異の検出、法医学検査および環境検査などの種々に設定において有用である。本発明の液滴マイクロアクチュエータによって有効な携帯可能なサイズのために、本明細書に記載される用途向けの配列は、所望により、試料点収集で実現されうる。
一実施形態において、本発明は、インフルエンザテストパネルを提供してもよい。この実施形態において、システムは、投入として生物学的試料を受理し、増幅のために標的とするインフルエンザウイルスの核酸を調製するために試料を処理し、本発明のプロトコルを用いて増幅を行い、標的とするインフルエンザウイルスの核酸の存在を検出してもよい。生物学的試料は、たとえば、鼻咽頭のぬぐい液から収集されてもよい。
別の実施形態において、本発明は、呼吸器感染パネルを提供してもよい。この実施形態において、システムは、投入として生物学的試料を受理し、増幅のためにバクテリア、ウイルスおよび／または菌類などの一般的な呼吸器病原菌から核酸を調製するために試料を処理し、本発明のプロトコルを用いて増幅を行い、標的とする呼吸器病原菌の核酸の存在を検出してもよい。呼吸器感染パネルの拡張バージョンにおいて、パネルは、免疫の低下した患者などの非定型感染症用の検査を含んでもよい。生物学的試料は、たとえば、鼻咽頭のぬぐい液によって提供されてもよく、鼻咽頭のぬぐい液から得られてもよい。本発明の呼吸器感染パネルを用いた検出に適した呼吸器病原菌の例としては、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ桿菌、レジオネラ菌、クラミジア、マイコプラズマ；インフルエンザ、ＲＳＶ、コロナウイルス、パラインフルエンザ、アデノウイルス、メタ肺炎ウイルス、ボカウイルス、ハンタウイルスなどのウイルス；ニューモシスティス、アスペルギルス、クリプトコッカスなどの菌類が挙げられる。
たとえば、全ゲノムなどの配列の長い核酸の場合には、試料は、たとえば、制限酵素による消化によって、より小さな重なり合うフラグメント（たとえば、１００〜１０００ｂｐ、２００〜９００ｂｐまたは３００〜８００ｂｐ）に分割されてもよい。より小さなフラグメントは、本発明のシステムおよび方法を用いて分析されてもよい。結果は、集められ、たとえば、配列フラグメントにおける重なりを特定して照合することによって、より長い配列を再構築するために編集されてもよい。フラグメントの分析は、配列決定を促進するために、並列な様式で続行してもよい。精度を向上するために、各テンプレートは、数回配列決定されてもよい。このように、すべての染色体またはすべてのゲノムさえ、正確に配列決定されてもよい。
組織の所定の集合において転写された遺伝子は、細胞または組織から抽出されたｍＲＮＡから決定されうる。ｍＲＮＡは、逆転写酵素を用いてＤＮＡに複製（ｃＤＮＡ）されてもよい。結果として生じるｃＤＮＡは、クローンであってもよく、ｃＤＮＡライブラリーからのクローン末端は、本発明の方法によって配列決定され、ＥＳＴを生成してもよい。ＥＳＴは、ｍＲＮＡから抽出された組織に関する発現プロフィールを提供する。ＲＮＡパターンは、場合によっては、疾病状態と相関されてもよく、診断ツールとして配列決定されてもよい。ＲＮＡウイルスもまた、配列決定されてもよい。
参照配列が対象の領域（たとえば、疾病と関わりあると考えられる遺伝子）に関して得られると、異なる個人または密接に関連する種であることが分かっている配列の変異を既知の配列の小さな部分を選択的に再配列することによって特定することができる。変異は、たとえば、ＳＮＰ、すなわち、サイズの差（挿入／欠損）、コピー数の差（複製）および再配列（逆位、転座）として生じてもよい。
有機体の集団について、たとえば、水、土壌および／または大気の試料から配列決定することができる。たとえば、微生物学についての最新の知識は、疾病の原因となるか、または実験室条件下で単一培養として容易に成長するかのいずれかの個別の種から導出され、したがって、研究しやすい。配列決定は、そのような有機体の組織、構成員、機能性および関係を研究するために用いられうる。したがって、配列および遺伝的多様性の定性分析は、従来の技術を用いて培養することができない有機体から得ることができる。
本発明のシステムおよび方法はまた、ゲノム的に特殊な診断および処置を提供するために、用いられてもよい。たとえば、システムは、多少良好な処置結果に関連付けられる遺伝子型の形質を特定するために用いられてもよい。結果は、処置決定を導くために用いられうる。同様に、本発明のシステムおよび方法は、感染性有機体または遺伝的に損傷を受けた細胞または変質した細胞、たとえば、癌および他の新生物などにおける特定する突然変異を特定するために用いられてよく、この情報は処置決定を導くか、または確認するために用いられうる。感染性有機体としては、たとえば、ウイルス、バクテリア、寄生虫または菌類が挙げられうる。本発明は、たとえば、これらの疾病の原因となる有機体に有効である重要な構成要素であるバクテリアまたはウイルスの薬物耐性種（たとえば、薬物耐性ＨＩＶの新株）の迅速かつ安価な検出のためのシステムおよび方法を提供する。
本発明のシステムおよび方法は、たとえば、特異的疾患において役割を果たす被検者のＤＮＡセグメントまたは特異的疾患の前兆となる可能性があるＤＮＡセグメントを特定するために、遺伝子検査に関して採用されてもよい。たとえば、家族内で、マーカーの１つの形態が、疾病がない血縁者より多く、疾病を有する血縁者において見つかる場合には、関連が実証される可能性がある。そのような方法は、ハンチントン舞踏病、嚢胞性線維症、乳癌および他の疾患において功を奏することが分かっている。したがって、たとえば、本発明のシステムおよび方法は、疾病を有する被検者または疾病を発現しやすい被検者において、（疾病を引き起こすのに十分な遺伝子量で）存在するだけである遺伝子において突然変異を特定するために用いられてもよい。別の実施形態において、本発明のシステムおよび方法は、（１）配列が疾病にかかっている人々に存在するという統計学的に有意な確率があること、および（２）配列が疾病にかかっていない人々には存在しないという統計学的に有意な確率があることに関して、遺伝的変異を特定するために用いられる。同様に、本発明のシステムおよび方法は、陽性の検査結果の人々が疾病になり、陰性の結果の人々が疾病にならないという統計学的に有意な確率があることに関して、遺伝的変異を特定するために用いられる。さらに、本発明のシステムおよび方法は、１つまたは複数のＳＮＰを特定するために、ＤＮＡの部分を配列決定するために用いられてもよい。
本発明のシステムおよび方法は、治験設定において用いられてもよい。たとえば、治験に参加する人からの核酸を配列決定して、有害事象が、治験グループにおける遺伝的変異と比較され、１つまたは複数の有害事象に対する感受性の増大した参加者の部分集合を特定してもよい。問題となる特定の有害事象の重篤度に応じて、関連付けられる遺伝的変異を有する被検者が、たとえば、より密接に見られる可能性があり、さらなる保護治療を受けるか、および／または完全に治験から排除される可能性がある。同様に、有効性は、治験グループにおける遺伝的変異と比較され、陽性の治療成果の可能性が増大した参加者の集合を特定してもよい。標的集団は、陽性の治療成果および／または極度な有害事象の欠如に基づいて、定義することができる。したがって、生成物を標識化することができる。医者は、関連付けられる遺伝的変異に関して患者に試すことができ、治療が薬学的に許容可能である集団の部分集合に対してのみ、生成物を処方することができる。
本発明はまた、法医学的評価にも有用であり、たとえば、そのＤＮＡが犯罪現場に残された証拠と適合する可能性がある潜在的容疑者を特定すること、犯罪の濡れ衣を着せられた人の疑いを晴らすこと、犯罪および大災害の犠牲者を特定すること、父系および他の家族関係を確立すること、野生生物保護局に対する補助として、絶滅危惧種および保護種を特定すること、空気、水、土壌および食物を汚染する恐れがあるバクテリアおよび他の有機体を検出すること、移植プログラムにおいて、臓器提供者と臓器被提供者とを適合させること、種または家畜種の血統を決定すること、キャビアおよびワインなどの消耗品を認証すること、遺伝子組み換え食品を特定することなどにおいて有用である。
用途の他の例としては、創薬プロセスにおいて、遺伝的変異と、たとえば、有効性、副作用プロフィール、薬物動態学および薬力学などの被検体の成果との間の関連付けのための検査を行うこと、被検体の遺伝子プロフィールを分析して、遺伝因子型変異に基づく見込みのある薬物治療を区別すること、被検者が遺伝的疾病の重篤度の監視、処置、回避または緩和のための対策を講じることができるように、疾病に関する傾向をスクリーニングこと、患者集団において薬物の副作用の数を低減するようにスクリーニングすること、遺伝的に特定可能な集団の部分集合において、安全でない薬物の使用を可能にするようにスクリーニングすること、遺伝子治療を監視することなどが挙げられる。
８．３ 親和性に基づく分析
本発明は、液滴に基づく親和性に基づく分析、たとえば、親和性に基づく分析を行うための方法、デバイスおよびシステムを提供する。これらの分析は、検体に関して結合親和性を有する化合物が、液滴操作を用いて、検体または検体を潜在的に含む試料と接触する任意の分析を含む。たとえば、検体に関して結合親和性を有する化合物は、液滴において提供されてよく、液滴マイクロアクチュエータにおける別の液滴に存在する検体または液滴の表面に固定化される検体と接触するように輸送されてもよい。別の例として、検体に関して結合親和性を有する化合物それ自体が、液滴マイクロアクチュエータの表面および／または液滴マイクロアクチュエータに含まれるビーズの表面に固定化されてもよく、検体を含む液滴または検体を潜在的に含む液滴は、固定化された抗体と接触してもよい。
種々の親和性に基づく分析プロトコルは、本発明の範囲内で可能であることは十分に認識されよう。親和性に基づく分析形式の例としては、直接的な親和性に基づく分析、間接的な親和性に基づく分析および競合的な親和性に基づく分析が挙げられる。分析は、対象検体の存在を検出するために採用されてもよく、また、場合によっては、試料に存在する標的検体を定量化するために用いられてもよい。競合分析において、試料抗体および標識化される抗体を含む液滴は表面と接触される。試料抗体は、表面上に吸着される抗原への結合のために、標識化される抗体と競合する。この手法の変形体は、仲介リンカーを介して表面に抗原を結合することを伴う。たとえば、リンカーは、抗体であってもよい。捕捉ブリッジ分析は、溶液中の抗原と、表面に吸着される抗原を結合するために試料抗体を含む液滴を用いる。別の手法は、ビオチン化された抗原およびストレプトアビジンコーティングされた固相を用いることを伴う。別の手法は、固相に固定化された抗原に試料抗体を結合することを伴う。結合された抗体は、イソタイプの特異的な標識化される第２の抗体によって検出されてもよい。過度の抗体は、本発明の液滴プロトコルを用いて洗浄されうる。
本発明の重要な態様は、液滴マイクロアクチュエータにおける必要な親和性に基づく分析試薬および／または試料のそれぞれを用いて、液滴操作を行う能力を伴うことであることは、十分に認識されよう。たとえば、本発明は：
（１）親和性に基づく分析を行うために、本明細書に記載される試薬および／または試料のうちの任意の１つまたは複数を含む液滴をその上に含む液滴マイクロアクチュエータ；
（２）そのような液滴マイクロアクチュエータを含む本発明のデバイスまたはシステム；
（３）そのような液滴マイクロアクチュエータまたはシステム上で液滴操作を行うか、またはそのような液滴マイクロアクチュエータまたはシステムを利用する液滴に別の処置を施す方法；および／または
（４）そのような液滴マイクロアクチュエータまたはシステムを利用する液滴に基づく親和性に基づく分析を行う方法
を含む。
たとえば、液滴操作としては、以下：液滴マイクロアクチュエータ内への液滴の投入；供給源の液滴からの１つまたは複数の液滴の分配；液滴の２つ以上の液滴への分割、分離または分裂；任意の方向におけるある位置から別の位置への液滴の輸送；２つ以上の液滴の１つの液滴への融合または結合；液滴の希釈；液滴の混合；液滴の攪拌；液滴の変形；液滴の所定の位置における保持；液滴の培養；液滴の加熱；液滴の気化；液滴の冷却；液滴の配置；液滴マイクロアクチュエータからの液滴の輸送；本明細書に記載される他の液滴操作および／または上記の操作の任意の組み合わせ；のうちの１つまたは複数が挙げられうる。本発明の種々の他の方法、デバイス、システムおよび他の態様は、次の説明から明白となるであろう。
８．３．１ 試料および試料調製
本発明は、種々の検体の検出のために有用な液滴に基づく親和性に基づく分析を提供する。たとえば、抗体などの親和性分子に対する特異性と結合することができる任意の検体は、本発明のシステムを用いて、検出するのに適している。単独の試料が、１つまたは複数の標的検体のために分析されてもよい。検体は、たとえば、生物学的検体または人工検体であってもよい。例としては、以下のカテゴリーにおける検体：ヒトによる供給源からの検体、動物源からの検体、植物源からの検体、バクテリア源からの検体、ウイルス源からの検体、胞子源からの検体などが挙げられる。検体としては、たとえば、タンパク質、ペプチド、小分子および種々の生体分子、たとえば、炭水化物、脂質などが挙げられうる。一実施形態において、液滴マイクロアクチュエータ上に固定化された抗体が導入される前に、試料は、固定化された抗体（たとえば、ビーズ上に固定化された抗体）と接触される。
免疫測定を行うために適した具体的な液滴マイクロアクチュエータ６００が図６に示されている。この実施形態は、２つの基材、介在空間を提供するために、実質的に並列な態様で離隔された第１の基材６０１ａおよび第２の基材６０１ｂを採用してもよい。介在空間において、洗浄緩衝剤貯槽６０２、試料貯槽６０４、一次抗体貯槽６０６、二次抗体貯槽６０８および固定化された抗体（たとえば、ビーズ上に固定化された抗体）貯槽６１０などの複数の流体ポートまたは貯槽が提供されてもよい。廃棄領域６１２、ならびに、磁石の磁界と、介在空間に位置する磁気応答性構成要素との間の相互作用を可能にする様式で、位置決めされる磁石６１４が設けられてもよい。この特定の実施形態において、輸送電極６１６は、第１の基材上に設けられる。
８．３．２ サンドイッチ親和性に基づく分析
一実施形態において、本発明は、液滴マイクロアクチュエータにおいて行われる液滴に基づくサンドイッチ親和性に基づく分析を提供する。サンドイッチ親和性に基づく分析を行うための種々のプロトコルは、本発明の範囲内で可能であることは十分に認識されよう。以下の液滴に基づくプロトコルは、図７の図に基づいており、一例としてのみ提供され、本発明の範囲を限定するものを意図しているわけではない。
（１）標的検体に関する特異性を有する抗体（一次）を表面上に固定化する；
（２）過剰な抗体を除去するため、たとえば、液滴に基づく洗浄プロトコルを用いて、固定化された抗体を洗浄する；
（３）固定化された抗体に関する結合親和性を有する標的検体を潜在的に含む試料液滴に固定化された抗体をさらすために、液滴操作を用いる；
（４）試料液滴の非結合構成要素を除去するため、たとえば、液滴に基づく洗浄プロトコルを用いて、固定化された抗体‐標的検体複合体を洗浄する；
（５）レポータ（二次）抗体を含む液滴に、固定化された抗体（それに結合された標的検体を潜在的に含む）をさらす；
（６）たとえば、液滴に基づく洗浄プロトコルを用いて、過剰なレポータ抗体を洗浄する；
（７）任意に、測定可能なパラメータまたは信号を提供するために、さらなる工程を行う；
（８）測定可能なパラメータまたは信号を測定する；
（９）信号を表す出力を提供する。
上述の工程のうちの任意の１つまたは複数は、本明細書に述べるように、液滴マイクロアクチュエータにおいて液滴操作を用いて行われうる。
８．３．２．１ 抗体の固定化
一次抗体は、表面に固定化される。表面は、たとえば、液滴マイクロアクチュエータの表面または磁気応答性ビーズ、非磁気応答性ビーズなどのビーズの表面、またはナノ粒子などの粒子の表面であってもよい。
表面に対する抗体の固定化は、液滴に基づくプロトコルを用いて液滴マイクロアクチュエータで達成されうる。たとえば、表面に対して抗体を固定化するための試薬は、液滴マイクロアクチュエータに導入され、個々の液滴として分配され、堆積用の表面に接触するように輸送されてもよい。問題になっている表面が、１つまたは複数のビーズの表面である場合には、ビーズは、液滴マイクロアクチュエータに導入され、緩衝剤液滴として分配され、液滴マイクロアクチュエータに輸送され、ビーズの表面に液滴を固定化するための試薬を含む１つまたは複数の液滴と融合されてもよい。
あるいは、抗体は、液滴マイクロアクチュエータ外で固定化されてもよい。たとえば、抗体は、液滴マイクロアクチュエータへの導入前に、ビーズに固定化されてもよい。種々のタンパク質コーティング（たとえば、ストレプトアビジン）および抗体コーティングされるビーズは、市販されている。別の実施形態において、抗体は、たとえば、液滴マイクロアクチュエータの製作中、液滴マイクロアクチュエータの表面に固定化されてもよい。
さらに、表面は、抗体の固定化のために調製されてもよい。たとえば、抗体の親和性を有する部分または抗体に結合される結合部分を含む表面が提供されてもよい。結合部分を任意に含む抗体は、表面と接触して、表面上に抗体を固定化してもよい。たとえば、ストレプトアバジンによって予めコーティングされたビーズが、液滴マイクロアクチュエータに導入されてもよい。液滴操作は、ストレプトアバジンによってコーティングされたビーズを含む液滴によって行われてもよく、そのようなビーズ含有液滴をビオチン化された抗体を含む１つまたは複数の液滴と接触させて、それにより、抗体をビーズに結合するために、採用されてもよい。別の例として、液滴マイクロアクチュエータは、液滴マイクロ作動経路におけるストレプトアビジンによってコーティングされた表面を含んでもよく、その結果、液滴操作は、ビオチン化された抗体を含む液滴をストレプトアビジンによってコーティングされた表面に接触させて、それにより、抗体を表面に固定化するために採用されてもよい。さらに別の例において、たとえば、抗体の固定化を可能にするために表面をパターン形成することによって、または抗体またはストレプトアビジンに対して直接的に光反応性の種を結合し、次に、直接描画光システムまたは光学マスクまたは選択的に露光するための他の手段を用いることにより、選択的に抗体を固定化することによって、液滴マイクロアクチュエータの表面上に捕捉抗体を選択的に固定化することができる。
種々の技術は、抗体を表面に結合するのに利用可能である。たとえば、表面は、Ｆｃドメインを介して、抗体分子の結合を可能にするためにタンパク質Ｇによって活性化されてもよく、標的の捕捉のために利用可能な可変領域を残す。抗体は、１，３‐ジアミノプロパン結合ポリスチレンアルデヒド／硫酸塩ラテックスと活性化された抗体との反応によって、ラテックス表面に共有結合されてもよい。界面活性剤のない硫酸塩の白いポリスチレンラテックスビーズは、抗体および接合緩衝剤（３０ｍＭのＮａ２ＣＯ３、７０ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．５）との培養によって、抗体によってコーティングされてもよい。ビオチン化された抗体は、ストレプトアビジンのコーティングされた基材上で捕捉されうる。抗体は、シランまたはチオール化される層などの液滴マイクロアクチュエータの改質表面に共有結合されてもよい。抗体は、（たとえば、組み立て中または、液滴操作を用いて表面に抗体を堆積するために）、シランまたはチオール化される表面によって修飾された表面などの、液滴マイクロアクチュエータの修飾表面に共有結合されてもよい。
８．３．２．２ 固定化された抗体への標的検体の結合
試料液滴は、固定化された抗体と接触され、試料中に存在する任意の標的検体を固定化された抗体に結合することを可能にする。この工程は、液滴操作を用いて、試料液滴を抗体が付着される表面と接触するように輸送して達成されてもよい。たとえば、抗体を含む液滴が液滴マイクロアクチュエータのビーズまたは表面にコーティングされ、抗体が固定化される。別の実施形態において、表面は、ビーズ表面であり、ビーズは、液滴マイクロアクチュエータに導入される前に、試料と接触される。ビーズはまた、液滴マイクロアクチュエータに導入される前に洗浄されてもよい。抗体は、試料液滴からの検体に結合する。結合プロセスは、大量輸送速度を増大することによって促進されてもよい。大量輸送を加速するいくつかの例としては、高速で液滴を輸送し、抗体および標的検体とビーズとの完全な混合を可能にするか、または固定化された抗体の表面を標的検体で補充することが挙げられる。他の手段としては、液滴に電気的に処置を施すことによって、または作動の圧電方法などの複数の外部手段によって、培養される液滴を適所で攪拌することが挙げられる。大量輸送の任意の手段がない場合には、結合事象は、拡散に基づき、より長い時間かかる可能性があり、それにより分析時間が長くなる。固定化された抗体（たとえば、ビーズまたは表面）は、一部の実施形態において、たとえば、８．６節に記載したように、液滴マイクロアクチュエータで洗浄プロトコルを施し、過剰な試料または他の材料を除去してもよい。
８．３．２．３ 標的検体へのレポータ抗体の結合
洗浄（たとえば、ビーズまたは表面）後、検体上の異なるエピトープに対して親和性を有するレポータ抗体を含む液滴は、捕捉された検体を潜在的に有する洗浄された固定化された抗体と接触してもよい。標識化される抗体接合体としては、放射性分子などのレポータ分子に結合される抗体、検出可能な反応（たとえば、色の変化、化学発光、蛍光、化学発光または電気化学）を触媒することができる酵素、化学発光分子または蛍光分子として挙げられる。用いられるレポータに応じて、検体およびレポータ抗体を含む固定化された抗体（たとえば、ビーズまたは他の表面）は次に、たとえば、８．６節に記載のように、洗浄プロトコルを施し、過剰なレポータ抗体を除去してもよい。
８．３．２．４ 測定可能なパラメータの生成および検出
結合されるレポータ抗体は、レポータ抗体によって促進される信号を検出することによって定量化されてよい。たとえば、信号は、放射性、色の変化、発光、蛍光、発光、ラマンスペクトル、光散乱手法、粒子／ビーズ凝集、表面プラズモン共鳴、ラマン分光効果などであってもよい。検出は、検体に結合される抗体の量の検出または結合していない抗体の量の検出によって、直接的であって間接的であってもよい。
信号を生成するためのさらなる反応、たとえば、非蛍光生成物の蛍光生成物への変換を必要とする手法の場合には、さらなる必要な反応物質を含む液滴を抗体‐抗原‐抗体複合体に接触させて、さらなる反応を容易にすることができる。
レポータ抗体の検体への結合が可能になると、洗浄プロトコルを用いて過剰なレポータ抗体を洗い流すことができ、液滴操作を用いて、必要なレポータ反応体を含む液滴を固定化された抗体と接触させることができる。一実施形態において、レポータ抗体は、測定可能なパラメータを生成する反応を触媒することができる酵素（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ））によって標識化される。たとえば、ＨＲＰは、電流または電圧を測定することによって検出されうる電気化学信号を生成するために、過酸化水素を触媒するために用いられうる。結合される抗体の検出は、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄと、基材として過酸化水素とを用いてＨＲＰによって触媒される蛍光反応によって達成されうる。別の例は、ホルマザンを紫色にするために、ＮＢＴのアルカリホスファターゼ媒介変換を採用し、これは、液滴において比色分析によって検出されうる。別の手法において、ルミノールまたはルミゲンによるＰｓ−ａｔｔｏなどの化学発光基材は、ＨＲＰによって触媒され、化学発光信号を生成することができる。適切な検出手法の他の例については、本明細書における他の場所（たとえば、８．３．５節参照）に記載される。
一実施形態において、検出工程は、センサの存在下で、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴において行われ、反応からの信号の捕捉を強化または最大化する。別の実施形態において、反応は、センサから離れて行われ、液滴は、検出目的のために、液滴操作を用いてセンサの存在する場所まで輸送される。
８．３．２．５ 代替のサンドイッチ分析手法
種々の代替手法が可能であることは、十分に認識されよう。たとえば、工程は、上述した順序で行われる必要はなく、たとえば、レポータ抗体は、検体が固定化された抗体に曝される前に、または検体が固定化された抗体に曝されるのと同時に、検体に結合されてもよい。別の手法において、捕捉抗体、検体およびレポータ抗体の結合はすべて、同時に行われてよく、次いで、捕捉部位に提供されて、続いて洗浄されうる。表面増強共鳴ラマン散乱などの一部の手法において、洗浄は必要とされない場合もある。
８．３．３ 競合的な親和性に基づく分析
一実施形態において、本発明は、液滴マイクロアクチュエータにおいて行われる競合的な親和性に基づく分析を提供する。競合的な親和性に基づく分析による検出用の検体は典型的には、サンドイッチ分析によって必要とされる２つの抗体の結合には小さすぎる検体である。種々のプロトコルは、競合的な親和性に基づく分析を行うために本発明の範囲内で可能であることは、十分に認識されよう。以下の液滴に基づくプロトコルは、図８の図に基づいており、一例としてのみ提供され、本発明の範囲を限定することを意図していない：
（１）標的検体に対して特異性を有する抗体を表面に固定化する；
（２）過剰な抗体を除去するため、たとえば、液滴に基づく洗浄プロトコルを用いて固定化された抗体を洗浄する；
（３）標的検体を潜在的に含み、レポータ検体を含む試料液滴を提供する；
（４）レポータ検体が結合部位に関して任意の標的検体と競合するように、固定化された抗体を合わせた標的検体／レポータ抗体液滴に曝す；
（５）結合していない検体およびレポータ検体を除去するため、基材を洗浄する；
（６）任意選択的に、測定可能なパラメータまたは信号を与えるために、さらなる工程を行う；
（７）結合されたレポータ検体を定量化する、ここでレポータ検体の量は、標的検体の量に反比例する。
上述の工程のうちの任意の１つまたは複数は、本明細書に述べるように、液滴マイクロアクチュエータにおいて液滴処置技術を用いて行われうる。工程のそれぞれについては、次の節でさらに詳細に記載される。
８．３．３．１ 抗体の固定化
８．４．１．１節において上述したように、抗体は、固定化されていてもよい。
８．３．３．２ 競合的な結合
標的検体を潜在的に含む試料を含む液滴を、レポータ検体を含む液滴と合わせて、合わせた液滴を、固定化された抗体と接触させる。あるいは、標的検体およびレポータ検体の混合物が、液滴マイクロアクチュエータの投入中に得られる。
レポータ検体は、種々の接合方法のいずれかを用いて、検体にレポータ核酸を結合することによって構成されてもよい。一実施形態において、検体部分は、ビオチンなどの分子によって修飾され、ストレプトアビジンセンサＤＮＡ複合体を固定化するための二次捕捉部位を生成する。検体に対するビオチンの結合は、捕捉抗体に対するその結合を過度に妨げてはならない。ビオチン化された材料は、場合によっては、検査試料からの検体と等しく競合してもよい。レポータ分子に対するビオチン化された検体の結合は、ビオチン化された検体が固定化された抗体によって捕捉される前または後に、起こりうる。
たとえば、一実施形態において、分析は、未知量の未修飾の検体を潜在的に含む試料液滴と、既知量のビオチン化された検体を有する液滴とを混合することによって行われる。ビオチン化された検体を含む液滴を、標的検体を潜在的に含む液滴と合わせる。合わせた液滴は、固定化された抗体と接触し、ビオチン化された検体および標的検体（存在すれば）は、固定化された抗体に対する結合と競合するようになっている。ビオチン化された検体結合の量は、検査液滴における検体の量に反比例する。固定化された抗体（たとえば、ビーズまたは表面）は次に、たとえば、８．６節に記載のように、洗浄プロトコルを施し、過剰なレポータ検体を除去してもよい。
８．３．３．３ レポータ検体の検出
洗浄後、ストレプトアビジン‐ビオチン‐レポータ複合体を有する液滴が、洗浄されるビーズを含む液滴に加えられるか、または固定化された抗体を含む表面と他の方法で接触される。ストレプトアビジン‐ビオチン‐レポータ複合体は、ビーズ上の抗体によって捕捉された任意のビオチン化された検体に結合する。
８．３．３．４ 代替の競合的な分析手法
本明細書に記載される競合的な親和性に基づく分析は、本発明の液滴マイクロアクチュエータにおける実行に適した液滴マイクロアクチュエータプロトコルの一例に過ぎない。種々の代替物が、本発明の範囲内で可能である。たとえば、工程は、所定の順序に限定されていない。遊離抗体を含む液滴を標的検体／レポータ検体を含む１つまたは複数の液滴と合わせることによって固定化される前に、標的検体／レポータ検体に抗体を結合することができ、その後で、抗体が固定化のために、表面と接触させることができる。
レポータ検体は、２つの試薬を含む液滴を合わせることによって、液滴マイクロアクチュエータにおいてレポータ核酸と接合されてよい。レポータ検体を含む液滴を、レポータ核酸を含む液滴と合わせて、レポータ検体が捕捉抗体に曝される前または後に、接合させてもよい。
別の実施形態において、競合的な分析は、次に、抗体を含む液滴とさらに混合される標的検体を含む試料液滴と、酵素によって標識化される検体の既知量を有する液滴とを混合することによって行われる。標識化される検体と標的検体との間の結合部位では、競合が続いて起こる。酵素の活性は、抗体と酵素によって標識化される検体との結合で低減され、試料中の標的検体の濃度を定量化するために、これは、複数の異なるタイプの変換事象、たとえば、吸収によって監視されうる。たとえば、ブドウ糖６‐リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６Ｐ‐ＤＨ）で標識化されるバンコマイシンを含む液滴は、非標識化バンコマイシンを含む試料液滴と混合されてよく、この試料液滴は、バンコマイシン、ブドウ糖６‐リン酸およびニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤ）に対する反応性を示す抗体を含む液滴とさらに混合されうる。Ｇ６Ｐ‐ＤＨの活性は、抗体に対する結合で低減される。Ｇ６Ｐ‐ＤＨは、ＮＡＤ＋をＮＡＤＨに変換し、３４０ｎｍで分光的に測定される吸収変化を生じる。較正が液滴マイクロアクチュエータ内で行われると、各未知の試料におけるバンコマイシンの濃度は、格納された較正曲線および試料の分析において得られた測定吸収度を用いて決定されうる。同一の方法を用いて検出することができる他の検体としては、バルプロ酸、トブラマイシン、ゲンタマイシンおよびカフェインが挙げられる。
８．３．４ 他の親和性に基づく分析プロトコル
本明細書に記載される競合的な親和性に基づく分析は、本発明の液滴マイクロアクチュエータにおける実行に適した液滴マイクロアクチュエータプロトコルの一例に過ぎない。種々の代替物が、本発明の範囲内で可能である。たとえば、本発明の液滴マイクロアクチュエータシステムは、複数の親和性に基づく分析を単独の試料で同時に行うことを可能にするか、または単独の親和性に基づく分析を複数の試料で行うことを可能にするか、またはその組み合わせを可能にする。さらに、親和性に基づく分析は、ＰＣＲおよび／または免疫ＰＣＲなどの他の検査と共に行ってもよい。
種々の代替の分析タイプは、本明細書を踏まえて液滴に基づくプロトコルを用いて実行されてもよい。例としては、免疫沈降分析、免疫放射定量測定法、抗体結合部分および非結合部分の定量がこれらの２つの部分の物理的分離を必要とする異種酵素によって標識化される親和性に基づく分析、非結合部分および抗体結合部分は、機能的に区別されうるために、これらの２つの部分の物理的分離を必要としない同種の（非分離）酵素によって標識化される親和性に基づく分析が挙げられる。免疫沈降分析の場合には、免疫沈降分析を行うための試薬を含む液滴を、免疫沈降分析を行うために、液滴マイクロアクチュエータにおいて合わせる。免疫沈降は、光散乱検出器を用いて検出されてもよい。
これまで記載された手法の大部分は、抗体または検体の固定化を伴うが、固定化は、本発明のすべての液滴に基づく免疫測定において必要というわけではない。たとえば、本発明は、同種の液滴に基づく酵素によって多重化される免疫測定を含み、標識化される抗体は、一次抗体に結合されるときに不活性化される酵素を含む。酵素活性は、検体濃度に略比例している。この手法は一般に、液滴に基づく酵素によって多重化される免疫測定を行うために液滴マイクロアクチュエータにおいて液滴を合わせて、結果として生じる酵素活性を測定することを含む。
別の方法において、抗原／抗体複合体の光散乱特性は、結合事象時に変化し、濁度測定などの液滴マイクロアクチュエータにおける反応液滴における光散乱変化を検出することによって、この変化を監視することができ、捕捉事象の特定および／または定量化を行う。たとえば、液滴マイクロアクチュエータにおけるＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭ（希釈およびポリマーの添加をはじめとする試料調製後）などの免疫グロブリンまたはＡｐｏＡｌ、ＡｐｏＢなどのアポリポタンパク質（希釈およびポリマーまたは界面活性剤の添加をはじめとする試料調製後）を含む生理学的試料液滴を、液滴操作を用いてそれぞれの抗体を含む液滴と合わせることができ、結合事象の発生時に、分光的に監視されうる結合された液滴の濁度における変化を生じる。この技術を用いて測定されうる他の検体のいくつかの例としては、α１‐アンチトリプシン（ＡＡＴ）、トランスフェリン、プレアルブミン、ハプトグロビン、補体Ｃ３および補体Ｃ４が挙げられる。
本発明において用いるのに適した別のクラスの免疫測定としては、凝集分析が挙げられ、液滴形式で行うこともできる。検体を含む液滴は、粒子、たとえば、ラテックス粒子を含む液滴と混合され、粒子に結合される捕捉抗体または抗原と混合される。標的検体が試料中に存在する場合には、ラテックス粒子は、共に凝集し始め、吸収度を測定することによって定量化されうる。
システムは、多重化される親和性に基づく分析を提供する。一実施形態において、システムは、免疫測定を用いて、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはそれ以上の検体を検出する能力を有する。一部の高いスループット設定において、システムは、９６、３８４、１５３６またはそれより大きい数の分析の多重検出を連続的な様式または並列な様式のいずれかで提供する。検体は、たとえば、天然源または非天然源からの検体を含みうる。別の実施形態において、本発明は、親和性に基づく分析プロトコルを実行して、以下のカテゴリー：バクテリア源からの検体、ウイルス源からの検体、胞子源からの検体、タンパク毒素検体および小分子毒素検体のうちの任意の２、３、４または５からなる１つまたは複数の検体を検出する能力を含む。
システムは、１つの標的結果に関する信頼性を増大するために、必要に応じて、分析を繰り返すようにプログラムされてもよい。重要なことに、液滴マイクロアクチュエータシステムが、偽陽性の確率を低減するために、陽性の確認再検査を行うようにプログラムされうる。システムはまた、次のさらなる実験室検査のために液滴マイクロアクチュエータにおける検査試料の格納を可能にするようにプログラムおよび構成されてもよい。
本発明の重要な利点は、較正曲線を迅速かつ正確に生成する液滴マイクロアクチュエータの機能である。液滴マイクロアクチュエータは、対照検体の既知の濃度の溶液の液滴を正確かつ再現可能に分配することができ、緩衝剤液滴とそれらを合わせることによって、そのような液滴を希釈することができ、対照検体の可変濃度を有する一連の対照液滴を提供する。これらの対照液滴は、較正曲線を生成するために、試料液滴と同一のプロトコルによって取得されうる。較正曲線を用いて、試料液滴中の検体の量を決定することができる。
８．３．５ 親和性に基づく分析に関する他の検出手法
種々の検出手法が、本発明の液滴に基づく親和性に基づく分析において用いるのに利用可能である。選択された手法は、液滴に基づく親和性に基づく分析において信号を直接的または間接的に生成することができる。信号は、液滴に接触して位置決めされるか、または液滴に近接して位置決めされるセンサによって検出可能であってもよい。親和性に基づく分析において用いるのに適した信号の例としては、放射性同位体標識、蛍光標識、発光標識、エレクトロルミネセント標識、マイクロ粒子、ナノ粒子、酵素反応、凝集化合物、ラマン活性染料、電気活性標識および導電率に影響する標識から生成される信号が挙げられる。適切な放射性同位体標識の例としては、５７Ｃｏ、３Ｈ、３５Ｐ、３５Ｓおよび１２５Ｉが挙げられる。一実施形態において、放射性同位体標識は、液滴マイクロアクチュエータにおけるシンチレーション近接分析（ＳＰＡ）において用いられる。ＳＰＡは、洗浄工程を必要としない結合事象の検出を可能にする。放射性標識は、たとえば、競合分析における競合的な検体にまたはサンドイッチ分析における二次抗体に取り込まれてもよい。α粒子または弱いβ粒子を発する放射性標識が好ましい。ＳＰＡは、放射性標識に対する曝露で光を発する蛍光体に近接して行われる。たとえば、蛍光体は、ビーズにおいて、抗原または一次抗体が結合される液滴マイクロアクチュエータの表面において、または抗原または一次抗体に結合されるナノ粒子において提供されてもよい。適切な発光標識の例としては、アクリジニウムエステル、ローダミン、ジオキセタン、アクリジニウム、フェナントリジニウムおよび種々のイソルミノール誘導体が挙げられる。適切な蛍光標識の例としては、フルオレセインおよびＥｕ３＋が挙げられる。適切な酵素標識の例としては、適切な基材からの可視生成物、着色生成物、蛍光生成物および／または発光生成物を生成するものが挙げられる。たとえば、適切な酵素としては、ペニシリナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、デアミナーゼおよびアルカリホスファターを挙げられうる。適切なナノ粒子の例としては、金属ナノ粒子が挙げられる。本発明の親和性に基づく分析に適した検出手法に関するさらなる情報は、８．１１節において提供される。
８．３．６ 試料サイズおよび分析速度
デジタルマイクロ流体のプラットフォームにおける実装は、主に、すべての液体処理機能を小型化することによって、機器サイズおよび費用を劇的に削減する。分析は、一部の実施形態において、等しい感度および特異性で現在用いられる試料および試薬容量の１００分の１または１０００分の１未満で行われうる。一実施形態において、システムは典型的には、１μＬ以下または１００ナノリットル以下の液滴容量で試料を用いて親和性に基づく分析を行う。
他の利点としては、分析の小型形式でのより高速の動力学に起因する結果に対する時間の短縮、および多重化に起因するより高いスループットが挙げられる。たとえば、一実施形態において、システムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはそれ以上の検体を約６０分、５０分、４０分、３０分、２０分、１５分、１０分、５分または２分未満で、検出するために、親和性に基づく分析プロトコルを実行する。
８．３．７ 液滴に基づく親和性に基づく分析の適用
上述したように、本発明の親和性に基づく分析は、種々の分子を検出するために有用である。抗体などの親和性分子に対する親和性と結合する任意の分子が、適切な検体である。検体は、たとえば、生物学的検体または人工検体であってもよい。生物学的検体としては、たとえば、植物、動物、微生物およびウイルスからの分子が挙げられうる。人工検体としては、たとえば、産業副生成物、汚染物質および医薬品が挙げられうる。検体としては、特定の生物学的有機体の存在を表す毒素または検体、たとえば、生物テロまたは生物戦争において採用される感染症または毒素が挙げられうる。そのような有機体の例としては、炭疽菌、鳥インフルエンザ、ボツリヌス菌中毒、ハンタウイルス、レジオネラ症、肺ペスト、天然痘、野兎病およびウイルス性出血熱（ＶＨＦ）が挙げられる。他の例としては、癌、慢性感染症（たとえば、ＨＩＶ、マラリア、Ｃ型肝炎、カンジダ血症）を標的とするワクチンの免疫原性、免疫学（たとえば、アレルギー、自己免疫）、内分泌学（甲状腺、非甲状腺）、薬物検査（たとえば、乱用薬物、治療薬）および生物テロ因子（たとえば、炭疽菌、天然痘）の監視に関連する検体が挙げられる。
一実施形態において、免疫測定技術は、バクテリアまたはウイルスなどの生物学的有機体の存在に関する試料を検査するために用いられる。一部の実施形態において、システムは、１つの細胞であってもきわめて高い感度の検出を達成することができる。さらに、一部の実施形態は、ＰＣＲバクテリアの分類または変化を含みうる。
本発明の親和性に基づく分析はまた、化学的脅威、生物学的脅威または爆発性の脅威を検出するのに有用である。たとえば、爆薬に対する抗体を用いて、試料中の微量の爆薬の存在を検出することができる。したがって、本発明はまた、化学的兵器、生物学的兵器または爆発兵器の存在を表す化学的検体または生物学的検体用の領域を選別する方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、１つの液滴において複数の検体を検出する機能を提供する。本発明によるこの結果を達成するための１つの方法は、液滴マイクロアクチュエータにおける空間的に離隔された位置に異なる検体に関する異なる抗体の使用を伴う。たとえば、液滴マイクロアクチュエータは、複数の表面を含んでもよく、それぞれが特定の抗体を含む。液滴が抗体領域にわたって輸送されるとき、１つの試料液滴が一度にまたは連続的にこれらの抗体と接触するように処置されてもよい。本発明の親和性に基づく分析プロトコルは、種々の領域のいずれかにおいて、抗体に結合される検体の存在を検出するために採用されてもよい。同様に、同一の空間領域において異なる検体を同時に検出するために、異なる標識を用いることによって、１つの液滴において複数の検体を検出することができる。別の実施形態において、液滴マイクロアクチュエータは、空間的に離隔されるビーズを含み、各ビーズまたは一連のビーズは、一意の抗体または抗体の集合を有する。試料液滴および／または液滴を含むビーズは、液滴操作を用いて処置され、ビーズのそれぞれまたはビーズの集合と試料液滴を接触させてもよい。
８．４ 免疫ＰＣＲ
本発明は、わずか痕跡程度で入手可能な検体を高感度で検出するための液滴に基づく免疫ＰＣＲ（ｐｉｃｋ）を提供する。本発明は、液滴に基づくプラットフォームにおいて検出器抗体を用いて、親和性に基づく分析の種々の手段を合わせて、標識として核酸鎖を利用する。この核酸鎖は、増幅技術を用いて増幅される（たとえば、８．１節参照）。
本発明の重要な態様は、液滴マイクロアクチュエータにおいて必要なｉＰＣＲ試薬および／または試料のそれぞれを用いて、液滴操作を行うことができる能力を必要とすることが十分に認識されよう。たとえば、本発明は：
（１）ｉＰＣＲプロトコルを行うために、本明細書に記載される試薬および／または試料のうちの任意の１つまたは複数を含む液滴をその上に含む液滴マイクロアクチュエータ；
（２）そのような液滴マイクロアクチュエータを含む本発明のデバイスまたはシステム；
（３）そのような液滴マイクロアクチュエータまたはシステム上で液滴操作を行うか、またはそのような液滴マイクロアクチュエータまたはシステムを利用する液に別の処置を施す方法；および／または
（４）そのような液滴マイクロアクチュエータまたはシステムを利用する液滴に基づく親和性に基づく分析を行う方法
を含む。
たとえば、液滴操作は、以下：液滴マイクロアクチュエータ内への液滴の投入；供給源の液滴からの１つまたは複数の液滴の分配；液滴の２つ以上の液滴への分割、分離または分裂；任意の方向におけるある位置から別の位置への液滴の輸送；２つ以上の液滴の１つの液滴への融合または結合；液滴の希釈；液滴の混合；液滴の攪拌；液滴の変形；液滴の所定の位置における保持；液滴の培養；液滴の加熱；液滴の気化；液滴の冷却；液滴の配置；液滴マイクロアクチュエータからの液滴の輸送；本明細書に記載される他の液滴操作および／または上記の操作の任意の組み合わせ；のうちの１つまたは複数が挙げられうる。本発明の種々の他の方法、デバイス、システムおよび他の態様は、次の説明から明白となるであろう。
８．４．１ サンドイッチｉＰＣＲ
一実施形態において、本発明は、液滴マイクロアクチュエータにおいて行われる液滴に基づくサンドイッチｉＰＣＲを提供する。一般に、サンドイッチｉＰＣＲは：
（１）標的検体に対して特異性を有する抗体を表面上に固定化する；
（２）たとえば、液滴に基づく洗浄プロトコルを用いて、固定化された抗体を洗浄する；
（３）標的検体を潜在的に含む試料液滴に固定化された抗体を曝す；
（４）たとえば、液滴に基づく洗浄プロトコルを用いて、固定化された抗体を洗浄する；
（５）核酸分子に接合される第２の抗体を含む液滴に固定化された抗体（それに結合される標的検体をここでは潜在的に含む）を曝す；
（６）たとえば、液滴に基づく洗浄プロトコルを用いて、固定化された抗体を洗浄する；
（７）捕捉された標的検体の存在および量を決定するため、核酸を増幅して増幅（存在すれば）を検出する
ことを含む。
上述の工程のうちの任意の１つまたは複数は、本明細書に述べるように、液滴マイクロアクチュエータにおいて液滴操作を用いて行われうる。工程のそれぞれは、次の節においてさらに詳細に記載される。
８．４．１．１ 抗体の固体化
一次抗体は、表面に固定化される。表面は、たとえば、液滴マイクロアクチュエータの表面または磁気応答性ビーズなどのビーズの表面であってもよい。表面に対する抗体の固定化は、液滴に基づくプロトコルを用いて液滴マイクロアクチュエータで達成されうる。たとえば、表面に対して抗体を固定化するための試薬は、液滴マイクロアクチュエータに導入され、個々の液滴として分配され、堆積用の表面に接触するように輸送されてもよい。問題になっている表面が、１つまたは複数のビーズの表面である場合には、ビーズは、液滴マイクロアクチュエータに導入され、緩衝剤における液滴として分配され、輸送され、ビーズの表面に液滴を固定化するための試薬を含む１つまたは複数の液滴と融合されてもよい。
種々の技術は、抗体を表面に結合するのに利用可能である。たとえば、表面は、Ｆｃドメインを介して、抗体分子の結合を可能にするためにタンパク質Ｇによって活性化されてもよく、標的捕捉のために利用可能な可変領域を残す。抗体は、１，３‐ジアミノプロパン結合ポリスチレンアルデヒド／硫酸塩ラテックスと活性化された抗体との反応によって、ラテックス表面に共有結合されてもよい。界面活性剤のない硫酸塩の白いポリスチレンラテックスビーズは、抗体および接合緩衝剤（３０ｍＭのＮａ２ＣＯ３、７０ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．５）との培養によって、抗体にコーティングされてもよい。ビオチン化された抗体は、ストレプトアビジンのコーティングされた基材上で捕捉されうる。光指向性の固定化もまた、たとえば、本開示において他の場所に記載したように、行われうる。
８．４．１．２ 固定化された抗体への標的検体の結合
試料液滴は、固定化された抗体と接触され、試料中に存在する任意の標的検体を固定化された抗体に結合することを可能にする。この工程は、抗体が固定化される液滴マイクロアクチュエータの表面と接触するように試料液滴を輸送することによって、達成されてもよい。別の実施形態において、工程は、抗体が固定化されたビーズを含む液滴と試料液滴を融合することによって達成されてもよい。抗体は、試料液滴からの検体に結合する。固定化された抗体（たとえば、ビーズまたは表面）は、たとえば、８．６節に記載のように、洗浄プロトコルに供されてもよい。
８．４．１．３ 標的検体への抗体‐ＮＡの結合
洗浄（たとえば、ビーズまたは表面）後、検体における異なるエピトープに関する親和性を有する抗体‐ＮＡ接合体を含む液滴は、捕捉された検体を潜在的に有する洗浄された固定化された抗体と接触してもよい。抗体‐ＮＡ接合体としては、抗体に結合される核酸分子が挙げられる。核酸分子は、増幅用の核酸テンプレートとして機能する。固定化された抗体（たとえば、ビーズまたは表面）は、たとえば、８．６節に記載のように、洗浄プロトコルに供されてもよい。
８．４．１．４ 核酸の増幅
たとえば、８．１節に記載のように、核酸が増幅される。生成された増幅生成物の量は、たとえば、実時間蛍光検出、電気化学検出および／または電気化学発光検出を用いて測定される。生成されたＰＣＲ生成物の量は、結合された抗体‐ＤＮＡの量と相関し、次いで、試料液滴中に存在する検体の量に依る。
８．４．１．５ 代替の手法
別の実施形態において、これらの工程の順は一般に、光信号または電気信号を結果として生じる親和性に基づく分析が後に続く核酸増幅を行うために逆転される。この順序において、免疫測定は、核酸増幅を監視するために行われる。
８．４．２ 競合的なｉＰＣＲ
一実施形態において、本発明は、液滴マイクロアクチュエータにおいて行われる競合的なｉＰＣＲを提供する。競合的なｉＰＣＲによる検出用の検体は典型的には、サンドイッチ分析によって必要とされる２つの抗体の結合には、小さすぎる検体である。一般に、競合的なｉＰＣＲは、以下を伴う：
（１）標的検体に対して特異性を有する抗体を表面上に固定化する；
（２）標的検体を潜在的に含む試料液滴を、レポータ抗体を含む液滴と合わせる；
（３）レポータ検体が結合部位に関して任意の標的検体と競合するように、固定化された抗体を合わせた標的検体／レポータ検体液滴に曝す；
（４）結合していない検体を除去するため、基材を洗浄する；
（５）結合されたレポータ検体をレポータ核酸に結合する；
（６）結合していないレポータ検体の量を決定するため、レポータ核酸を増幅して増幅の経過を監視する、この場合、結合されたレポータ検体は、試料における標的検体の量に反比例する。
上述の工程のうちの任意の１つまたは複数は、本明細書に述べるように、液滴マイクロアクチュエータにおいて液滴操作技術を用いて行われうる。工程のそれぞれについては、次の節でさらに詳細に記載される。
８．４．２．１ 抗体の固定化
抗体は、８．４．１．１節において上述したように固定化されてもよい。
８．４．２．２ 競合的な結合
標的検体を潜在的に含む試料を含む液滴を、レポータ検体を含む液滴と合わせて、合わせた液滴を、固定化された抗体と接触させる。
レポータ検体は、種々の接合方法のいずれかを用いて、検体にレポータ核酸を結合することによって構成されてもよい。一実施形態において、検体部分は、ビオチンなどの分子によって修飾され、ストレプトアビジン‐ＤＮＡ複合体を固定化するための二次捕捉部位を生成する。検体に対するビオチンの結合は、一次捕捉抗体に対するその結合を過度に妨げてはならない。ビオチン化された材料は、場合によっては、試料からの検体と等しく競合してもよい。レポータ核酸に対するビオチン化された検体の結合は、ビオチン化された検体が固定化された抗体によって捕捉される前または後に、行われうる。
たとえば、一実施形態において、分析は、未知量の未修飾の検体を潜在的に含む試料液滴と、既知量のビオチン化された検体を有する液滴とを混合することによって行われる。ビオチン化された検体を含む液滴は、標的検体を潜在的に含む液滴と合わせる。合わせた液滴を、固定化された抗体と接触させ、ビオチン化された検体および標的検体（存在すれば）は、固定化された抗体に対する結合と競合するようになっている。ビオチン化された検体結合の量は、試料液滴における検体の量に反比例される。
８．４．２．３ 核酸レポータの結合
洗浄後に、ストレプトアビジン‐ビオチン‐レポータ核酸複合体を有する液滴が、洗浄されるビーズまたは表面を含む液滴に加えられる。ストレプトアビジン‐ビオチン‐レポータ核酸複合体は、ビーズ上の抗体によって捕捉された任意のビオチン化された検体に結合する。
８．４．２．４ 核酸の増幅
洗浄後に、固定化されたストレプトアビジン‐ビオチン‐レポータ核酸複合体の量が、レポータ核酸の増幅によって決定される。増幅信号は、元の試料中の検体の量の測定値の逆数である。増幅は、８．１節に記載のように、進行してもよい。生成されて増幅生成物の存在および量は、たとえば、実時間蛍光検出を用いて測定される。表示されたレポータ検体の量は、試料における標的検体の量に比例する。
８．４．２．５ 代替の手法
工程は、所定の順序に限定されていない。たとえば、遊離抗体を含む液滴を標的検体／レポータ検体を含む１つまたは複数の液滴と合わせることによって固定化される前に、標的検体／レポータ検体に抗体を結合することができ、その後で、抗体が固定化のために、表面と接触させることができる。レポータ検体は、２つの試薬を含む液滴を合わせることによって、液滴マイクロアクチュエータにおいてレポータ核酸と接合してもよい。レポータ検体を含む液滴を、レポータ核酸を含む液滴と合わせて、レポータ検体が捕捉抗体に曝される前または後に、接合させてもよい。種々の代替物は、本発明の範囲内で可能である。
８．４．３ 試料および試料調製
種々の検体は、本発明の液滴に基づくｉＰＣＲプロトコルを用いて検出されてもよい。単独の試料が、１つまたは複数の標的検体のために分析されてもよい。検体は、たとえば、生物学的検体または人工検体であってもよい。たとえば、一実施形態において、検体は、以下のカテゴリー：バクテリア源からの検体、ウイルス源からの検体、胞子源からの検体、タンパク毒素検体および小分子毒素検体から選択される。一実施形態において、標的検体としては、特定の生物学的有機体の存在を表す毒素または検体、たとえば、生物テロまたは生物戦争において採用される感染症または毒素が挙げられうる。そのような有機体の例としては、炭疽菌、鳥インフルエンザ、ボツリヌス菌中毒、ハンタウイルス、レジオネラ症、肺ペスト、天然痘、野兎病およびウイルス性出血熱（ＶＨＦ）が挙げられる。
８．４．４ 免疫ＰＣＲプロトコル
本発明のシステムは、１つの試料で複数の免疫ＰＣＲ検査を同時に行うことを可能にする。さらに、免疫ＰＣＲ検査は、ＰＣＲおよび／または親和性に基づく分析などの他の検査と共に行われてもよい。
システムは、多重化検出を提供する。一実施形態において、システムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはそれ以上の検体を検出する能力を有する。検体は、たとえば、天然源または非天然源からの検体を含みうる。別の実施形態において、本発明は、親和性に基づく分析プロトコルを実行して、以下のカテゴリー：バクテリア源からの検体、ウイルス源からの検体、胞子源からの検体、タンパク毒素検体および小分子毒素検体のうちの任意の２、３、４または５からなる１つまたは複数の検体を検出する能力を含む。
システムは、１つの標的結果に関する信頼性を増大するために、必要に応じて、さらなる検査を実行するようにプログラムされてもよい。重要なことに、液滴マイクロアクチュエータシステムが、偽陽性の確率を低減するために、陽性の確認再検査を行うようにプログラムされうる。システムはまた、次のさらなる実験室検査のために液滴マイクロアクチュエータにおける検査試料の格納を可能にするようにプログラムおよび構成されてもよい。
操作において、システムは、分析を行い、きわめて迅速に結果を提供する。たとえば、一実施形態において、システムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはそれ以上の検体を約６０分、５０分、４０分、３０分、２０分、１５分、１０分未満で検出する能力を有する。別の実施形態において、システムは、以下のカテゴリー：バクテリア源からの検体、ウイルス源からの検体、胞子源からの検体、タンパク毒素検体および小分子毒素検体のうちの任意の２、３、４または５から、１つまたは複数の検体２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはそれ以上の検体を検出する能力を有し、すべての検査は、約６０分、５０分、４０分、３０分、２０分、１５分、１０分未満で完了する。
８．４．５ 応用
本発明によって提供されるｉＰＣＲ分析は、きわめて少量に存在する種々の分子を検出するのに有用である。中でも、システムは、化学的脅威、生物学的脅威または爆発性の脅威の監視に有用である。たとえば、爆薬に対する抗体を用いて、試料中の微量の爆薬の存在を検出することができる。したがって、本発明はまた、化学的兵器、生物学的兵器または爆発兵器の存在を表す化学的検体または生物学的検体用の領域を選別する方法を提供する。
一実施形態において、ｉＰＣＲ技術は、バクテリアまたはウイルスなどの生物学的有機体の存在に関する試料を検査するために用いられる。一部の実施形態において、システムは、１つの有機体の検出であっても達成することができる。さらに、一部の実施形態は、ＰＣＲバクテリアの分類または変化を含みうる。
８．５ 生体液の分析
本発明は、血液、血液および他の生体液の種々の構成要素の分析のための方法、デバイスおよびシステムを提供する。生体液分析機器に関する具体的な設計は、図９および図１７に示されている。
図９は、生体液分析機器９００の一実施形態を示す。この実施形態において、種々のモジュールは、たとえば、代謝産物（たとえば、ブドウ糖、乳酸塩、血中尿素窒素およびクレアチニン）、電解質（たとえば、Ｋ＋、Ｃｌ−、Ｎａ＋）、タンパク質および酵素の検出などの生体液分析を行うために提供されてもよい。これらの種々のモジュールは、電流測定モジュール９０２、電位差測定モジュール９０４、光モジュール９０６および導電性測定モジュール９０８を含んでもよい。
生体液分析機器１７００の別の実施形態が図１７に示されている。この実施形態において、抗体貯槽１７０１（バクテリア抗体、胞子抗体、バクテリアＡＢ‐ＤＮＡ、胞子ＡＢ−ＤＮＡ、タンパク質毒素抗体、小分子抗体、タンパク質ＡＢ‐ＤＮＡ、小分子ＳＢ−Ａ ＤＮＡ用など）、ＰＣＲプライマー貯槽１７０２およびＰＣＲ試薬貯槽１７０３のような複数の流体ポートまたは貯槽が提供されてもよい。試料ポート１７０４、ならびに、試料貯槽１７０５、洗浄溶液領域１７０６および廃棄貯槽１７０７を提供してもよい。提供してもよい他の領域としては、高温領域１７０８、低温領域１７０９および検出器領域１７１０が挙げられる。
本発明の重要な態様が、液滴マイクロアクチュエータにおいて必要な生体液分析試料および試薬のそれぞれを用いて液滴操作を行う能力を伴うことは、十分に認識されよう。たとえば、本発明は：
（１）そのような生体液分析を行うために、本明細書に記載される試薬および／または試料のうちの任意の１つまたは複数を含む液滴をその上に含む液滴マイクロアクチュエータ；
（２）そのような液滴マイクロアクチュエータを含む本発明のデバイスまたはシステム；
（３）そのような液滴マイクロアクチュエータまたはシステム上で液滴操作を行うか、またはそのような液滴マイクロアクチュエータまたはシステムを利用する液滴に別の処置を施す方法；および／または
（４）そのような液滴マイクロアクチュエータまたはシステムを利用する液滴に基づく親和性に基づく分析を行う方法
を含む。
たとえば、液滴操作としては、以下：、液滴マイクロアクチュエータ内への液滴の投入；供給源の液滴からの１つまたは複数の液滴の分配；液滴の２つ以上の液滴への分割、分離または分裂；任意の方向におけるある位置から別の位置への液滴の輸送；２つ以上の液滴の１つの液滴への融合または結合；液滴の希釈；液滴の混合；液滴の攪拌；液滴の変形；液滴の所定の位置における保持；液滴の培養；液滴の加熱；液滴の気化；液滴の冷却；液滴の配置、液滴マイクロアクチュエータからの液滴の輸送；本明細書に記載される他の液滴操作および／または上記の操作の任意の組み合わせ；のうちの１つまたは複数が挙げられうる。本発明の種々の他の方法、デバイス、システムおよび他の態様は、次の説明から明白となるであろう。
８．５．１ 試料および試料調製
本発明の液滴マイクロアクチュエータと共に用いるための適切な試料の例としては、全血、血清および血奬およびその種々の構成要素が挙げられる。静脈血、動脈血、毛細管血を用いることができる。本発明によって有利に分析される試料の例としては、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、唾液、汗、涙、羊水、肋膜液、乳、嚢胞液、滑液、排泄物および精液が挙げられる。
血清および／または血奬は、液滴マイクロアクチュエータにおいて、および／または液滴マイクロアクチュエータに導入される前に、全血から抽出されてもよい。この目的のために提供された投入構造１０００の例が、図１０において提供される。この実施形態において、流体は、貯槽１００２から封止手段１００４を介して、膜１００８と接触している投入室１００６に流れ込む。透過水は、チャネル１０１６を介して圧力を印加する圧力源１０１４によって支援される液滴マイクロアクチュエータ貯槽１０１２に流れ込む透過フローチャネル１０１０を通過する。
デバイスの小さなサイズは、多くの設定において重要な問題である通常検査に必要な試料の容量を劇的に削減する。たとえば、典型的な試料サイズは、一実施形態において、約１ｎＬ〜約１００ｍＬまたは約１０ｎＬ〜約１０ｍＬまたは約１μＬ〜約１０μＬである容量を有する。
８．５．２ 検体
本発明は、１μＬ未満の血液または約０．５μＬの任意の生理学的試料における一連の検査を行うことができる汎用の液滴マイクロアクチュエータシステムを提供する。適切な検査の例としては、代謝産物（たとえば、ブドウ糖、クレアチニン、乳酸塩、血中尿素窒素）、電解質／成分（たとえば、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｃｌ−、Ｐ、Ｍｇ、Ｌｉ、Ｃａ、Ｆｅ）、ガス（たとえば、ｐＨ、ｐＣＯ２、ＮＨ３）、酵素（アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、リパーゼ、クレアチンキナーゼ、クレアチンキナーゼＭＢ）、タンパク質（アルブミン、ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、尿微量アルブミン、尿タンパク、髄液タンパク、血清総タンパク質）およびヘマトクリットが挙げられる。他の検体としては、糖化ヘモグロビン（Ａ１ｃ）、ヘモグロビン、尿酸、トリグリセリド、コレステロール、高比重リポタンパク（ＨＤＬ）および低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）が挙げられる。
８．５．２．１ 代謝産物
本発明は、電気化学検出または光検出に基づく、ブドウ糖、血中尿素窒素、クレアチニンおよび乳酸塩に関する種々の酵素結合分析を行うのに有用である。一部の実施形態において、ブドウ糖、乳酸塩およびクレアチニンは、液滴マイクロアクチュエータにおいて行われる酵素結合分析において、Ｈ２Ｏ２の電流測定検出によって測定される。
一部の実施形態において、本発明は、代謝産物（たとえば、ブドウ糖、乳酸塩、血中尿素窒素、クレアチニン）の電流測定検出および／または電位差測定検出用の電極を備えた電気化学モジュールを含む。
８．５．２．２ 電解質
処理された生物学的試料などの試料中の種々のイオン（たとえば、アンモニア、臭化物、臭化物、カドミウム、カルシウム、塩化物、銅、シアン化物、フッ化物、フルオロホウ酸塩、ヨウ化物、鉛、硝酸塩、過塩素酸塩、カリウム、銀／硫化物、マグネシウム、鉄、リチウム、リン、ナトリウム、界面活性剤、チオシアン酸塩）を定量化するために、液滴マイクロアクチュエータは、イオン選択電極（ＩＳＥ）を含むように改変されてもよい。試料液滴は、所望のイオンの検出のために、ＩＳＥと接触するように輸送されてもよい。さらに、検出前に、標準的な液滴が、較正のためにＩＳＥと接触してもよい。一部の実施形態において、本発明は、電解質（たとえば、Ｋ＋、Ｃｌ−、Ｎａ＋）の電流測定検出、電位差測定検出および／または導電性測定検出のための電極を備えた電気化学モジュールを含む。
ＩＳＥは、電解質を検出するために、液滴マイクロアクチュエータに含まれうる。ＩＳＥは、たとえば、上部基材および／または下部基材の構成要素および／または上部基材および／または下部基材の間の空間または単独基材液滴マイクロアクチュエータに関連付けられる空間に曝される構成要素として含まれうる。ＩＳＥは、輸送電極に統合されうる。ＩＳＥは一般に、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴をＩＳＥと接触させるために液滴操作を用いることができるように配置される。種々の技術は、液滴マイクロアクチュエータにおけるイオン選択電極を構成するように用いられうる。例としては、スクリーン印刷、ならびに、フォトリソグラフィ、エッチングおよびリフトオフが挙げられる。
特定の非限定的な例として、ＫＣｌ塩橋を有する作動電極および参照電極を提供するために、Ａｇ／ＡｇＣｌがスクリーン印刷されてもよい。イオン選択膜の作製のための、ＰＶＣにおける適切なイオノフォアの例としては、Ｎａ＋用のメチルモネンシン、Ｋ＋用のバリノマイシン、Ｃｌ−用の第４級塩化アンモニウムおよびｐＨ用のトリドデシルアミンが挙げられる。イオン選択膜は、マイクロディスペンシングおよび／またはスプレイコーティング（たとえば、熱／超音波印刷）によって構成されうる。
電解質は、任意の生物学的試料において検出されうる。特定の非限定的な例としては、全血、血奬および血清、ならびに本開示の別の箇所で提供される例などが挙げられる。
８．５．２．３ ガス
ガス（たとえば、ｐＣＯ２、ｐＯ２）の存在またはｐＨを定量化するために、種々の特殊な電極を用いてもよい。非限定的な例として、二酸化炭素マイクロプローブが、二酸化炭素の検出および／または定量化のために、本発明の液滴マイクロアクチュエータに組み込まれてもよい。マイクロプローブは、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴をマイクロプローブと接触させるために液滴操作を用いることができるように、配置されてもよい。さらに、検出前に、標準的な液滴が、較正のために液滴操作を用いて、二酸化炭素マイクロプローブと接触してもよい。対応する手法は、酸素の検出および／またはｐＨの決定に適している。一部の実施形態において、液滴マイクロアクチュエータは、血液ガス（たとえば、ｐＣＯ２、ｐＯ２、ｐＨ）の電流測定検出、電位差測定検出および／または導電性測定検出のための電極を含んでもよい。
特定の非限定的な例として、セバリングハウス型ＣＯ２センサは、ＮａＨＣＯ３、ＮａＣｌおよびショ糖結合剤から構成される内部固体電解質に浸漬された金‐キンヒドロン電極から構成されるｐＨ電極を有するように構成されうる。ポリジメチルシロキサンのガス透過膜は、その上に堆積されうる。デジタル調整電子機器（たとえば、高入力インピーダンス増幅器）は、電位差測定電極とインターフェイスをとるために用いられうる。
ガスは、液滴マイクロアクチュエータにおける任意の液滴において検出されうる。特定の非限定的な例としては、全血、血奬および／または血清を含む液滴、ならびに、本開示の別の箇所で提供される生物学的試料などが挙げられる。
８．５．２．４ 酵素
一部の実施形態において、本発明は、肝臓酵素などの酵素の検出のための化学発光分析法を含む。一連の液滴に基づく複数の酵素工程を用いて、ＡＬＴ分析およびＡＳＴ分析は、吸着、発光、蛍光によって、または電気化学的に定量的に測定されうる過酸化水素を生成する最後の工程を削減することができる。
８．５．２．５ 血清タンパク
比色分析は、試料における総タンパクの検出のために利用されてもよい。適切な比色分析法の例としては、ビウレット法、ラウリー法、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）分析、ブラッドフォード分析が挙げられる。ビウレット法は一般に、第二銅イオンを含む液滴と試料液滴を接触させることを伴う。第二銅イオンは、タンパク質で着色錯体を形成する。ラウリー反応手法は、フォリン試薬液滴と結合することによるビウレット反応の増幅に基づく。ラウリー分析法の変形は、アルカリ状態によって、第二銅イオンから生成される第一銅イオンの検出を可能にするために、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）液滴を用いる。ブラッドフォード分析手法は、着色錯体を形成するために、クマシーブルー染料を含む液滴と試料を結合することを伴う。いずれの場合にも、ＬＥＤ／フォトダイオード設備が、たとえば、図２１Ａに示されているように、吸着度を監視するために用いられうる。蛍光および／または化学発光に基づく光検知方法をはじめとする本明細書に記載される技術のほか、本明細書に開示される親和性に基づく分析技術を用いて、任意の試料液滴において総タンパクを検出することができる。総タンパクを決定するための有用な試料の特定の非限定的な例としては、全血、血奬および血清などの生物学的試料、ならびに本開示の別の箇所で提供される試料が挙げられる。
８．５．２．６ ヘマトクリット
種々の技術を用いて、試料液滴中の赤血球を定量化することができる。たとえば、８０５ｎｍで吸収度を測定することにより、ヘモグロビン含量を計算することができる。次に、６５０ｎｍで吸収度を測定することにより、酸素ヘモグロビンを計算することができる。結果は、一連の既知の標準に関する吸収度測定値と試料に関する吸収度測定値を比較することによって得られてもよい。
一部の実施形態において、本発明は、ヘマトクリットの電流測定検出、電位差測定検出および／または導電性測定検出のための電極を備えた電気化学モジュールを含む。液滴マイクロアクチュエータは、ヘマトクリットのＡＣ導電性測定に関する１対の電極を備えた導電性測定細胞を含んでもよい。２基材液滴マイクロアクチュエータの場合には、電極は、一方の基材または両方の基材に位置決めされてもよい。液滴マイクロアクチュエータにおける液滴を電極と接触するように液滴操作を採用することができるように、電極が配置される。
８．５．３ 多検体分析機器
適切な検体の例としては、ブドウ糖、クレアチニン、乳酸塩、ＢＵＮ、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｃｌ−、ｐＨ、ｐＣＯ２、ＡＬＰ、総タンパク質およびヘマトクリットが挙げられる。一実施形態において、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の検体が、１つの液滴マイクロアクチュエータにおいて分析される。好ましくは、これらの検体は、ブドウ糖、クレアチニン、乳酸塩、ＢＵＮ、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｃｌ−、ｐＨ、ｐＣＯ２、ＡＬＰ、総タンパク質およびヘマトクリットから選択される。一実施形態において、ブドウ糖、クレアチニン、乳酸塩、ＢＵＮ、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｃｌ−、ｐＨ、ｐＣＯ２、ＡＬＰ、総タンパク質およびヘマトクリットは、１つの液滴マイクロアクチュエータにおいて分析される。適切な検体の他の例としては、カルシウム、ビリルビン、アルブミン、凝固時間、ＡＬＴおよびＡＳＴが挙げられる。
一部の実施形態の分析において、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の検体が、本発明の液滴マイクロアクチュエータシステムにおいて並列に処理される。すなわち、そのような検体に関する１つまたは複数の処理工程および／または検出工程は、１つの液滴マイクロアクチュエータにおける別の検体に関する１つまたは複数の処理工程および／または検出工程と同時に実行される。液滴マイクロアクチュエータシステムは、同一の検体タイプまたは異なる検体タイプの並列検出のために、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の比色分析を実行してもよい。液滴マイクロアクチュエータシステムは、同一の検体タイプまたは異なる検体タイプの並列検出のために、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の化学発光分析を実行してもよい。液滴マイクロアクチュエータは、同一の検体タイプまたは異なる検体タイプの並列検出のために、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の電流測定分析を実行してもよい。液滴マイクロアクチュエータは、同一の検体タイプまたは異なる検体タイプの並列検出のために、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の電位差測定分析を実行してもよい。液滴マイクロアクチュエータは、同一の検体タイプまたは異なる検体タイプの並列検出のために、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の蛍光分析を実行してもよい。液滴マイクロアクチュエータは、同一の検体タイプまたは異なる検体タイプの並列検出のために、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の導電性測定分析を実行してもよい。液滴マイクロアクチュエータは、プロトコルのそれぞれを実行するための試薬を含む液滴または貯槽を含む。液滴マイクロアクチュエータデバイスおよび／またはシステムは、プロトコルの検出工程を実行するために、必要に応じて、検出構成要素を含む。
さらに、液滴マイクロアクチュエータは、並列に処理される２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の検体を含んでもよく、システムは、これらの検体で１、２、３、４、５、６またはそれ以上の分析プロトコルを実行してもよい。液滴マイクロアクチュエータは、並列に処理される２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の検体を含み、これらの検体で、１、２、３、４、５、６またはそれ以上の分析プロトコルを実行してもよく、分析は、比色分析、化学発光分析、蛍光分析、電流測定分析、電位差測定分析および導電性測定分析から選択されてもよい。液滴マイクロアクチュエータは、プロトコルのそれぞれを実行するための試薬を含む液滴または貯槽を含む。液滴マイクロアクチュエータデバイスおよび／またはシステムは、プロトコルの検出工程を実行するために、必要に応じて、検出構成要素を含む。
さらに、核酸増幅、核酸配列決定、親和性に基づく分析、細胞処理、ビーズ処理および洗浄および検体検出プロトコルに関する種々のプロトコルは、１つの液滴マイクロアクチュエータシステムに容易に統合されてもよい。一実施形態において、１つの液滴マイクロアクチュエータとしては、核酸増幅および核酸配列決定を行うための試薬および検出構成要素が挙げられる。別の実施形態において、１つの液滴マイクロアクチュエータとしては、血液によって運ばれる病原菌をの検出のための核酸増幅を行うための試薬および検出構成要素およびそのような分析タイプおよび本明細書に述べるような分析タイプのうちの１つまたは複数の他の分析を行うための試薬および検出構成要素が挙げられる。別の実施形態において、液滴マイクロアクチュエータとしては、親和性に基づく分析を行うための構成要素および試薬と共に、細胞に処置を施すための構成要素が挙げられる。
簡単に言えば、本発明は、劇的に少ない試料容量を用いてより高いスループットで中央の研修室に基づく化学分析機器の通常操作を行うだけでなく、同一のプラットフォームの上に、血液学、病理学、分子診断法、細胞学、細菌学および血清学を統合することによって、よりよい機能性も提供する液滴マイクロアクチュエータシステムを可能にする。
一実施形態において、本発明は、血液ガス、電解質、酵素、タンパク質および代謝産物を分析するために、光学検出モジュールおよび電気化学検出モジュールを統合した液滴操作モジュールを提供する。
本発明の一実施形態は、独立して最適化された作製処理を分割するために、モジュール設計を採用する。たとえば、すべての電気化学構成要素が基材に作製され、すべてのマイクロ流体電極が別の基材に作製され、すべての電子機器がさらに別の基材に作製されうる。使い捨て可能なサンドイッチ液滴マイクロアクチュエータが、電気化学モジュールと液滴操作モジュールとの間に形成されてよく、データ収集および分析のために、再利用可能な電子モジュールに連結されうる。光検出モジュールは、分析機器において構成されうる。
８．５．４ 生体液分析検出
本明細書に記載される生体液解析は、たとえば、８．１節、８．２節、８．３節、８．４節、８．５節および８．１１節に記載のような種々の検出手法を利用する。
８．６ 表面および表面洗浄プロトコル
本発明の種々のプロトコルは、反応体の固定化のための表面を必要とする。たとえば、表面は、細胞、他のビーズ、マイクロ粒子、ナノ粒子、抗体、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子および／または他の化学構成要素などの液滴の標的構成要素を捕捉して固定化するために用いられてもよい。そのような目的のために用いられる表面としては、たとえば、ビーズ、マイクロ粒子、ナノ粒子、膜、物理的対象物の表面および／または液滴マイクロアクチュエータ表面が挙げられうる。種々のプロトコルは、結合していない材料が１つまたは複数の表面から除去される洗浄工程を必要とする。
捕捉のための１つまたは複数の対象構成要素を含む試料液滴は、液滴操作を用いて、そのような標的の親和性を有する表面と接触されてもよい。本発明の洗浄プロトコルは、表面から試料液滴の結合していない構成要素を除去するために用いられてもよい。たとえば、液滴プロトコルは、１つまたは複数の標的構成要素を含む１つまたは複数の液滴を１つまたは複数の表面と接触させて、１つまたは複数の標的構成要素が１つまたは複数の表面に固定化または捕捉されるようにするために用いられてもよい。洗浄プロトコルは、１つまたは複数の表面から結合していない物質を除去するために実行されてもよい。同様に、液滴プロトコルは、１つまたは複数の標的構成要素を含む１つまたは複数の液滴を１つまたは複数のビーズと接触させて、１つまたは複数の標的構成要素が１つまたは複数のビーズに固定化または捕捉されるようにするために用いられてもよい。洗浄プロトコルは、１つまたは複数のビーズから結合していない物質を分離するために実行されてもよい。
洗浄は一般に、１つまたは複数の洗浄液滴を固定化された表面と接触させることを伴う。洗浄は、表面と接触状態にある間に液滴の攪拌を伴ってもよい。洗浄液滴としては、たとえば、水、脱イオン水、食塩液、酸性溶液、塩基性溶液、洗浄液および／または緩衝剤が挙げられうる。
本発明の洗浄プロトコルは、表面からの結合していない物質のきわめて効率的な除去を結果として生じる。一実施形態において、本発明は、低減した濃度の物質を有する表面と接触状態にある液滴を提供する方法を提供する。この方法は一般に、物質の開始濃度を含み、開始容量を有する液滴と接触状態にある液滴を提供することと、１つまたは複数の液滴操作を行い、液滴を洗浄液滴と融合させて合わせた液滴を生じることと、１つまたは複数の液滴操作を行い、合わせた液滴を分離して、（ｉ）開始濃度に対して低減した濃度および低減した量の物質を有する表面と接触状態にある液滴および（ｉｉ）表面から分離される液滴を含む一連の液滴を生じることとを含みうる。
本発明の方法は、開始濃度に対して低減した量または実質的に低減した量の物質を有する表面と接触状態にある液滴を生じてもよい。結果として生じる液滴は、一部の実施形態において開始容量と略同量を有してもよい。一部の実施形態において、結果として生じる液滴において１つまたは複数の構成要素の所定の最大量が満たされるか、または超えるまで、洗浄工程を繰り返してもよい。所定の量は、開始濃度に対して実質的な低下を示してもよい。一部の場合において、結果として生じる液滴は、構成要素が実質的になくてもよい。たとえば、一部の実施形態において、量の低下は、モル基準で、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％、９９．９９９９９％、９９．９９９９９９％を超えてもよい。
本発明の方法は、開始濃度に対して低減した濃度または実質的に低減した濃度の物質を有する表面と接触状態にある液滴を生じてもよい。結果として生じる液滴は、一部の実施形態において開始容量と略同量を有してもよい。一部の実施形態において、結果として生じる液滴において１つまたは複数の構成要素の所定の最大濃度が満たされるか、または超えるまで、洗浄工程を繰り返してもよい。所定の濃度は、開始濃度に対して実質的な低下を示してもよい。一部の場合において、結果として生じる液滴は、構成要素が実質的になくてもよい。たとえば、一部の実施形態において、濃度の低下は、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％、９９．９９９９９％、９９．９９９９９９％を超えてもよい。
８．６．１ 洗浄ビーズ
ビーズを利用するプロトコルの場合には、ビーズを有する液滴を、液滴操作を用いて、１つまたは複数の洗浄液滴と合わせることができる。次に、ビーズを（たとえば、物理的にまたは磁気的に）保持している間に、融合された液滴を、液滴操作を用いて２つ以上の液滴、すなわち、ビーズを有する１つまたは複数の液滴と、実質的な量のビーズを備えていない１つまたは複数の液滴に分割してもよい。一実施形態において、融合された液滴を、液滴操作を用いて、ビーズを有する１つの液滴および実質的な量のビーズを備えていない１つの液滴に分割する。
一般に、洗浄プロトコルの各実行により、分析の結果に過度の有害な影響を及ぼすことなく、所期の分析を行うために、十分なビーズの保持を結果として生じる。ある実施形態において、融合された液滴の各分割は、ビーズの９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９％以上、９９．９％以上、９９．９９％以上、９９．９９９％以上、９９．９９９９％以上、９９．９９９９９％以上、または９９．９９９９９９％以上の保持を結果として生じる。別の実施形態において、除去される物質における濃度および／または量の所定の削減を達成するための洗浄プロトコルの各実行は、ビーズの９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９％以上、９９．９％以上、９９．９９％以上、９９．９９９％以上、９９．９９９９％以上、９９．９９９９９％以上、または９９．９９９９９９％以上の保持を結果として生じる。さらに別の実施形態において、保持されるビーズの量が計算され、それに応じて、結果が調整される。
一部の実施形態において、ビーズは、ビーズ含有液滴および洗浄液滴を合わせる貯槽において洗浄されてよく、ビーズは（たとえば、磁石、物理的構造、静電力によって）保持され、ビーズのない液滴は、液滴操作を用いて貯槽から分配される。たとえば、ビーズは、希釈および分配方策によって洗浄されてよく、それにより、洗浄緩衝剤が、貯槽に加えられ、内容物を希釈する。磁気応答性ビーズは、磁石を有する貯槽内に局部集中され、溶液の大半は、貯槽から分配され、洗浄の許容可能なレベルに達するまでこのサイクルが繰り返される。
８．６．１．１ 磁気応答性ビーズの洗浄
図１１に示される非限定的な例は、磁界を用いて磁気応答性ビーズを固定化することを伴う。固定化された磁気応答性ビーズは、磁界の低減または削減によって解放されてもよい。磁気応答性ビーズの洗浄は一般に、以下の工程を含みうる：
（１）磁石１１０４に近接して、磁気応答性ビーズ１１０２および結合していない物質１１０３を含む液滴１１０１を位置決めするため、液滴操作を用いる；
（２）洗浄液滴１１０６を、磁気応答性ビーズ１１０２を含む液滴１１０１と合わせるため、液滴操作を用いる；
（３）磁界の印加によって、ビーズ１１０２を固定化する；
（４）ビーズの周囲の液滴の一部またはすべてを除去し、低下した濃度の結合していない標的物質を有するビーズを含む液滴１１０８と、結合していない標的物質を含む液滴１１１０とを生じるために、液滴操作を用いる；
（５）磁界の除去によってビーズ１１０２を放出する；
（６）所定の程度の精製が達成されるまで、工程（２）〜（３）または（２）〜（４）を繰り返す。
このような様式で、汚染物質、副生成物または過剰な試薬などの結合していない物質が、ビーズから分離されうる。各サイクルは、ビーズを含むが、望ましくない物質のレベルは減少した液滴を生成する。工程（５）は、各洗浄サイクルにおいて必要ではない。しかし、固定化されたビーズに捕獲される可能性がある汚染物質を遊離することによって、洗浄を強化するのに有用である可能性がある。工程は、異なる順で行われてもよく、たとえば、工程（２）および工程（３）を逆にしてもよい。洗浄プロトコルにおける工程は、本明細書に述べるように、液滴操作を用いて液滴マイクロアクチュエータで実現されてもよい。
別の実施形態が図１２に示され、上部プレート１２０１、下部プレート１２０２、電極１２０３および磁石１２０４を備えうる。実施形態の工程は一般に、以下を含みうる：
（１）磁石１２０４に近接して、磁気応答性ビーズ１２０７および結合していない材料１２０８を含む液滴１２０６とスラグ１２０５とを合わせるため、液滴操作を用いる；
（２、３）固定化されたビーズ１２０７に関して、ビーズ１２０７にわたって結果として生じる合わせたスラグ１２１０を輸送し、ビーズ１２０７から結合していない材料１２０８を分離するため、液滴操作を用いる；
（４）合わせたスラグ１２１０の一部を分離し、低減した濃度の結合していない標的物質を有するビーズを含む部分１２１２と、結合していない標的物質を含む部分１２１４とを生じるため、液滴操作を用いる；
（５）結合していない材料において、所定の削減が達成されるように、必要に応じて工程（１）〜（４）を繰り返す。
関連手法において、スラグが固定化されたビーズにわたって輸送されるときに、スラグは、さらなる洗浄液滴および／またはスラグを加えることによって連続的に補充されてもよい。処理は、結合していない材料における所望の削減が達成されるまで続行してもよい。
図１３は、別の実施形態を示しており、また、上部プレート１３０１、下部プレート１３０２、電極１３０３および磁石１３０４も備えうる。この実施形態において、スラグ１３０７を移動するのではなく、磁石１３０４が、Ａ１の方向などに移動され、合わせたスラグ１３０７における結合していない材料１３０６からビーズ１３０５を分離する。類似の手法は、分離を達成するために磁石およびスラグの両方を移動することを伴う（図示せず）。さらに別の手法は、複数の磁石を用いてビーズを移動することを伴う（図示せず）。
磁気応答性ビーズが用いられる実施形態において、本発明者は、ビーズの一時的な固定、ビーズ移動および／またはビーズの位置決めに有用な磁界の印加により、ビーズの望ましくない凝集を結果として生じる場合があることを発見した。一実施形態において、ビーズの凝集を防止または低減するために、界面活性剤が含まれる。この目的に適した界面活性剤の例としては、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００が挙げられる。界面活性剤は、ビーズの凝集を低減または削減して、非特異性の吸着を最小限に抑えると同時に液滴から標的検体または試薬の著しい損失を生じない量が、選択されて用いられる必要がある。
ビーズの凝集を削減または低減するための別の手法は、より少数のより大きなビーズの使用を伴う。１つまたは複数の液滴操作中に、液滴に含まうれる任意の数のビーズを用いてもよい。一部の実施形態において、磁気応答性ビーズの数は、１〜数十万の範囲であってもよい。たとえば、一実施形態において、本発明は、液滴当たり１〜１００個の磁気応答性ビーズを利用する。たとえば、本発明は、液滴当たり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、．．．、１００個の磁気応答性ビーズを利用してもよい。一実施形態において、磁気応答性ビーズの数は、１〜１０である。より少数の磁気応答性ビーズを用いることは、より大きなビーズを用いることを可能にする。たとえば、一実施形態において、本発明は、液滴当たり１〜１００個の磁気応答性ビーズを利用し、ビーズは約２５〜約１００ミクロンの平均直径を有する。別の実施形態において、本発明は、液滴当たり１〜１０個の磁気応答性ビーズを利用し、ビーズは約５０〜約１００ミクロンの平均直径を有する。
８．６．１．２ 非磁気応答性ビーズの洗浄
類似の手法が、非磁気応答性または磁気応答性のほとんどないビーズに関して、用いられてもよい。図１４に示されているように、ビーズ１４０１を固定化するために磁界を用いるのではなく、物理的障害１４０２を用いて、ビーズ１４０１の周囲の液滴の一部またはすべての除去を可能にしてもよい。物理的障害１４０２としては、たとえば、膜、古いおよび／または液滴マイクロアクチュエータ（たとえば、上部プレート１４０４および／または下部プレート１４０５）からの突出部が挙げられうる。上部プレート１４０４および／または下部プレート１４０５に取付けられる物理的障害１４０２（突出部または物体）が、採用される場合には、１つまたは複数の隣接する電極１４０６を用いて輸送可能にし、同時に、ビーズ１４０１が、後に続かないようにする。たとえば、上部プレートからの突出部を用いて、液滴輸送用の十分な空間を残すか、および／または１つまたは複数の開口部を有する突出部を用いて、液滴が開口部を通って輸送されると同時に、ビーズが後に続くのを防止するように配置される必要がある。
８．６．２ 液滴マイクロアクチュエータ表面の洗浄
図１５は、液滴マイクロアクチュエータ表面の洗浄のための手法の例を示す。この非限定的な例において、表面１５０１が、上部プレート１５０２の内部に位置付けられる。この手法において、（１）表面構成要素１５０５に対して親和性を有する標的物質１５０４を含む試料液滴１５０３が、（液滴操作を用いて）表面１５０１と接触され、（２）対象物質の一部またはすべてを固定化させる。（３）洗浄液滴１５０６および試料液滴１５０３は、液滴操作を用いて結合され、組み合わされた洗浄試料液滴１５０７を生じる。（４）組み合わされた洗浄試料液滴が次に、液滴操作を用いて分割されて、表面と接触状態にあり、低減した濃度の結合していない標的物質を含む部分１５０８と、結合していない標的物質を含む表面から分離される部分１５０９とを生じる。工程（３）および（４）は、結合していない材料における所望の削減を達成するために、必要に応じて繰り返されてもよい。
８．７ 細胞の処理
本発明の種々のプロトコルは、細胞を含む液滴を利用してもよい。液滴は、細胞の生存の維持および／または細胞培養の成長のための培地を含んでもよい。
一部の場合において、本発明は、所定数の細胞を有する液滴を利用する。たとえば、一部の実施形態において、本発明は、単細胞を含む液滴を利用してもよい。たとえば、単細胞を含む液滴は、クローン的に純粋な細胞個体群の作製および／または特定の刺激に対する単細胞の反応を研究する実験に有用である可能性がある。所定の数の細胞を有する液滴は、細胞懸濁液からの液滴を液滴輸送経路に、または細胞の懸濁液からネットワークに分配することによって、および／または複数の細胞を有する液滴を１つまたは複数の小液滴に分裂させることによって提供されてもよい。懸濁液は、外部源から供給されてもよく、または液滴マイクロアクチュエータ貯槽に蓄えられてもよい。各液滴における細胞の数を決定するために、液滴を分析することができ、さらなる処理のために、予め選択された数の細胞を有する液滴を下流に経路指定することができる。複数の細胞を有する調製された液滴は、それ自体を１つまたは複数の緩衝剤液滴と結合されてもよく、２つ以上の小液滴に分裂させて、単細胞の存在に関して分析されてもよい。
分類決定は、液滴分析に基づいてもよい。たとえば、光透過が、所定の数の細胞を有する液滴を特定するために用いられてもよい。分類決定は、透過光の測定に基づいて行われてもよい。他の実施形態は、自動的画像分析および／または多色蛍光および／または散乱分析を採用してもよい。規格を満たさない液滴は、別の試みのために試料貯槽に再導入されてもよく、廃棄貯槽に輸送されてもよい。
細胞係数の規格を満たす液滴は、液滴マイクロアクチュエータ貯槽に輸送されてもよく、および／または分類および／または濃縮のために輸送されてもよい。濃縮された細胞内容物を有する貯槽を提供する１つの手法が、図１６Ａおよび１６Ｂに示されている。この実施形態において、液滴１６０２は、細胞懸濁液１６０４から分配され、それらの特性に基づいて、液滴マイクロアクチュエータ１６００における貯槽１６０６に輸送される。
他の実施形態において、液滴は、たとえば、中に含まれる細胞の分析のために、個々の液滴として処置を施されてもよい。所定の数の細胞を含む液滴は、本明細書に記載される種々の分析プロトコルに関する投入として用いられてもよい。一部の実施形態において、液滴を輸送するための推進力として重力が用いられない。
１つの特定の実施形態において、腫瘍細胞が、液滴マイクロアクチュエータにおいて隔離されてもよい。細胞は、たとえば、細針吸引（ＦＮＡ）のマイクロリットルから隔離されてもよい。別の実施形態において、血液幹細胞、骨髄、胃腸洗浄および凍結保存融解試料などの試料は、癌細胞に関して分析されうる。
関連細胞の免疫原性捕捉は、抗サイトケラチンビーズなどの抗体ビーズを用いて達成されてよく、液滴マイクロアクチュエータへの導入前に試料から、および／または液滴マイクロアクチュエータにおける液滴から関連細胞を捕捉してもよい。液滴を活発に往復させることによって、または貯槽内で液滴を渦まかせることによって、液滴マイクロアクチュエータにおいて結合を強化してもよく、または培養時間を短縮してもよい。ビーズは、本明細書において他の場所に記載したように、ビーズを隔離して洗浄することができる。液滴マイクロアクチュエータにおいて液滴における標的細胞は、懸濁液に放出されうる。
液滴当たりの均一な細胞数は、本明細書に記載される細胞分配手法を用いてオンチップ貯槽から分配されうる。細胞を有する液滴は、複数のオンチップ貯槽に等分されうる。細胞は、オンチップ貯槽で培養されうる。細胞の生存は、たとえば、蛍光酸化還元指示計としてレザズリンを用いて算定されうる。生細胞は、非蛍光レザズリン染料を赤色の蛍光を発するレソルフィンに変換する。非生細胞は、蛍光を発さない。細胞は、オンチップ貯槽に分配されてよく、細胞からの核酸は、本明細書に述べるような手法を用いて増幅されうる。
８．８ 液滴マイクロアクチュエータアーキテクチャおよび操作
本発明のシステムは一般に、プロセッサによって制御される液滴マイクロアクチュエータを含む。たとえば、プロセッサは、中でも、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴処置を制御するようにプログラムされてもよい。種々の液滴マイクロアクチュエータ構造が可能である。種々の図が、図１、図２、図６、図９および図１７において提供される。本発明の液滴マイクロアクチュエータ内に構成されうる構成要素の例としては、液滴マイクロアクチュエータに投入されうる種々の充填剤流体、充填剤流体、試料および／または試薬を液滴マイクロアクチュエータに導入するための流体投入機構、投入貯槽および／または処理貯槽などの種々の貯槽、液滴分配機構、液滴マイクロアクチュエータおよび液滴マイクロアクチュエータにおける充填剤流体および／または温度を制御するための手段、液滴マイクロアクチュエータにおいて磁気応答性ビーズを操作するための磁界生成構成要素が挙げられる。この節は、液滴マイクロアクチュエータのこれらの態様および他の態様および本発明におけるそれらの使用について記載する。
８．８．１ 液滴マイクロアクチュエータ
システムは、液滴マイクロアクチュエータを利用する。液滴マイクロアクチュエータは、１つまたは複数の液滴操作を行うように配置された１つまたは複数の電極を有する基材を含む。一部の実施形態において、液滴マイクロアクチュエータは、そのような電極の１つまたは複数のアレイ、経路またはネットワークを含む。種々の電気特性が、液滴操作を実行するために採用されてもよい。例としては、エレクトロウェッティングおよび電気泳動が挙げられる。
一実施形態において、液滴マイクロアクチュエータは、基材に関連付けられる２つ以上の電極を含み、電極の活性化／非活性化を可能にするための手段を含む。たとえば、電極は、一連の手動スイッチおよび／または制御装置によって電子的に連結されて制御されてもよい。したがって、液滴マイクロアクチュエータは、分配、分割、輸送、融合、混合、攪拌などの液滴操作を行うことができる。液滴操作は、一実施形態において、電界を介した作動を用いて達成される。電極は、液滴マイクロアクチュエータへの電気接続を制御するための手段に電子的に連結される。
基本的な液滴マイクロアクチュエータは、電極の経路またはアレイを含む基材を含む。一部の実施形態において、液滴マイクロアクチュエータは、間隙によって離隔される２つの平行な基材と、一方または両方の基材における電極アレイとを含む。基材の一方または両方は、プレートであってもよい。一方または両方の基材は、ＰＣＢ、ガラスおよびまたは半導体材料を基材として用いて作製されてもよい。基材がＰＣＢである場合には、以下の材料、すなわち、Ｍｉｔｓｕｉ ＢＮ−３００、Ａｒｌｏｎ １１Ｎ、Ｎｅｌｃｏ Ｎ４０００−６およびＮ５０００−３０／３２、Ｉｓｏｌａ ＦＲ４０６、特にＩＳ６２０、フルオロポリマー系（背景蛍光が低いため、蛍光検出に適している）、ポリイミド系が、適切な材料の例である。種々の材料はまた、基材の誘電構成要素として用いるのにも適している。例としては、パリレンＣ（特にガラス上）およびパリレンＮなどの蒸着誘電体、Ｔｅｆｌｏｎ ＡＦ、Ｃｙｔｏｐ、Ｔａｉｙｏ ＰＳＲ４０００シリーズ（温度制御を伴う用途の場合には良好な温度特性）およびＰｒｏｂｉｍｅｒ ８１６５（温度制御を伴う用途の場合には良好な温度特性）などの液体の光画像形成可能なハンダマスク（たとえば、ＰＣＢ上）などのハンダマスク、Ｄｕｐｏｎｔ Ｖａｃｒｅｌ系などのドライフィルムのハンダマスク、ポリイミドフィルム（Ｋａｐｔｏｎ）、ポリエチレン、ＦＥＰ、ＰＴＦＥなどのフルオロポリマーなどのフィルム誘電体が挙げられる。基材の一部またはすべてはまた、疎水性コーティングを含む。適切な例としては、Ｔｅｆｌｏｎ ＡＦ、Ｃｙｔｏｐ、Ｆｌｕｏｒｏｐｅｌ系のコーティング、フルオロシランコーティングおよび３Ｍ Ｎｏｖｅｃ電子コーティングが挙げられる。
液滴マイクロアクチュエータが、２つのプレートを含む場合には、液滴は、プレート間の空間に置かれてもよい。液滴の周囲の空間は通常、充填剤流体を含む。液滴マイクロアクチュエータは、種々の流体液滴を用いて液滴操作を行うことができるが、導電性流体が好ましい。
液滴マイクロアクチュエータの表面は典型的には、疎水性コーティングによってコーティングされる。熱サイクリングを伴う用途の場合には、長い熱サイクリング操作中、熱応力に耐える疎水性コーティングを選択する必要がある。適切な耐熱性材料の例としては、自動車業界において用いるために開発され、すぐれた耐熱衝撃性を有するＰｒｏｂｉｍｅｒ（登録商標）８１６５などのハンダマスク、高温および反りに耐性を示すＭｉｔｓｕｉ ＢＮ−３００などのＰＣＢ基板が挙げられる。
液滴輸送は、制御電極の経路またはネットワークに沿って生じる。アレイまたは経路は、外部回路に電極を電気的に連結するための電気接続を含む。アレイまたは経路はまた、一定の電極を共に電気的に連結するための電気接続を含んでもよい。電極は、プロセッサによって外部回路を介して制御される。液滴操作は、電圧を電極に供給することによって行われてもよい。好ましい電圧は、誘電体の厚さに応じて可変であるが、誘電率が２〜１００の範囲であり、厚さが１ｎｍ〜１０ｍｍの範囲である場合には、単位面積当たりの好ましいエネルギーの制限は、約３００マイクロモジュール／平方メートル〜約３０００００マイクロモジュール／平方メートルの範囲である。好ましい作動電圧は、約１ｍＶ〜約５０ｋＶまたは約１Ｖ〜約１０ｋＶまたは約５Ｖ〜約１０００Ｖまたは約１０Ｖ〜約３００Ｖの範囲にある。
典型的には、電極は、電圧継電器を介して始動される。液滴マイクロアクチュエータは、たとえば、電界を用いて、個々の液滴の直接操作によって操作する。たとえば、接地した周囲の電極によって電圧が印加される電極に隣接する液滴は、それ自体を電圧が印加される電極と整列するように輸送する。すなわち、液滴が、その電極の位置に輸送される。一連の連続的な移送は、制御電極の経路またはネットワークに沿って液滴を輸送する。輸送に加えて、液滴の融合、分割、混合および分配をはじめとする他の操作は、電圧作動のパターンを変化させることによって同一の様式で達成されうる。
電極が種々の方式で活性化されうることを留意すべきである。たとえば、電極は、直流電位を印加することによって活性化されうる。同様に、電極は、交流電位を印加することによって活性化されてよく、活性化される電極が、交流電位を有し、非活性の電極が接地電位または他の参照電位を有するようになっている。別の態様において、電位は、電極を繰返し活性化して、次にそれを反転することによって印加されてもよい。交流モードは、出力の極性の間で高速に切り替えるためにソフトウェアを用いることによって実現されうる。
一部の実施形態において、本発明は、２００５年６月２８日公表のＰａｍｕｌａらによる「Apparatus for Manipulating Droplets by Electrowetting-Based Techniques」というタイトルの米国特許第６，９１１，１３２号、２００６年１月３０日出願の「Apparatuses and Methods for Manipulating Droplets on a Printed Circuit Board」というタイトルの米国特許出願第１１／３４３，２８４号、いずれもＳｈｅｎｄｅｒｏｖらによる２００４年８月１０日公表の「Electrostatic Actuators for Microfluidics and Methods for Using Same」というタイトルの米国特許第６，７７３，５６６号および２０００年１月２４日公表の「Actuators for Microfluidics Without Moving Parts」というタイトルの米国特許第６，５６５，７２７号、２００６年１１月１６日公開のＡｄａｃｈｉらによる「Device for transporting liquid and system for analyzing」というタイトルの米国特許公開第２００６０２５４９３３号において、記載された液滴操作構造および技術を採用する。いずれの開示も、液滴操作を行うための構造および技術に関連する教示のために、参照によって本明細書に組み込まれる。
液滴操作は、迅速であってもよく、典型的には、約０．０１ｃｍ／ｓ〜約１００ｃｍ／ｓまたは約０．１ｃｍ／ｓ〜約１０ｃｍ／ｓの範囲の平均直線速度を伴い、さらに好ましくは、約０．５ｃｍ／ｓ〜約１．５ｃｍ／ｓの範囲の平均直線速度を伴う。さらに、液滴は典型的には、約１Ｈｚ〜約１００ＫＨｚ、好ましくは、約１０Ｈｚ〜約１０ＫＨｚ、さらに好ましくは、約２５Ｈｚ〜約１００Ｈｚの範囲の操作周波数で処置されうる。迅速であることに加えて、液滴マイクロアクチュエータを用いた液滴処置はまた、高精度であり、１つの液滴マイクロアクチュエータにおいて複数の液滴を独立かつ同時に処置することができる。
個々の液滴操作は、連続フローアーキテクチャに関する必要性およびそのようなアーキテクチャに付随する種々の欠点を排除する。たとえば、流体がプライミングチャネルまたは充填貯槽において無駄にならないため、試料および試薬のおよそ１００％の利用が可能である。さらに、上述したように、液滴の移動は、きわめて迅速であってもよい。液滴マイクロアクチュエータは、場合によっては、連続フロー構成要素によって補充されてもよく、個々の液滴操作および連続フロー要素を伴うそのような組み合わせの手法は、本発明の範囲内にある。連続フロー構成要素は、制御装置によって制御されてもよい。にもかかわらず、ある他の実施形態において、種々の連続フロー要素は、本発明の液滴マイクロアクチュエータおよび／または本発明の方法において特に回避される。たとえば、ある実施形態において、以下の構成要素、すなわち、マイクロチャネル、固定マイクロチャネル、マイクロチャネルのネットワーク、ポンプ、外部ポンプ、弁、高電圧供給装置、遠心力要素、可動部分のうちの１つまたは複数は、本発明の液滴マイクロアクチュエータおよび／または方法から排除される。
電界を介した作動もまた、他の液滴操作に関する必要性およびそのような技術に付随する種々の欠点を排除する。にもかかわらず、液滴マイクロアクチュエータは、電気（たとえば、静電作動、誘導泳動）、磁気、熱（熱マランゴニ効果、熱毛管）、機械（たとえば、弾性表面波、マイクロポンピング、蠕動運動）、光学（たとえば、光学エレクトロウェッテリング、光学ピンセット）、化学手段（たとえば、化学勾配）などの他の液滴操作技術によって補完または補足されうることは十分に認識されよう。これらの技術が採用される場合には、関連ハードウェアもまた、制御装置に電気的に連結されて制御されてもよい。しかし、他の実施形態において、これらの液滴操作技術のうちの１つまたは複数は、本発明の液滴から特異的に排除される。
液滴マイクロアクチュエータは、かなりコンパクトな形態に製作されてよく、非常に小さな装置を用いて駆動されうる。たとえば、液滴マイクロアクチュエータおよび装置は共に、サイズにおいて数立方インチ程度に小さくてもよい。液滴マイクロアクチュエータは、少量の電力を必要とし、たとえば、バッテリを用いて容易に操作されうる。液滴マイクロアクチュエータは、きわめて小さな液滴を用いて液滴操作を行うことができる。液滴は典型的には、約１ｆＬ〜約１ｍＬの範囲にあり、さらに好ましくは約１００ｐＬ〜約１μＬ、さらに一層好ましくは約１０ｎＬ〜約１μＬの範囲である。
連続フローではなく、オンチップ処理用の個々の液滴の使用は、複数の重要な利点を提供する。試料流体は、チャネルのプライミングまたはポンプに費やす必要がないため、試料流体の本質的にすべてが、分析のために用いられてよく、非常に少ない容量の試料（たとえば、約１００μＬ未満、または約５０μＬ未満または約２５μＬ未満）を分析することができる。同様の利点が試薬の使用にも当てはまり、消費される試薬の容量の削減は、分析の費用の削減という利点を有する。個々の少量の液滴の使用はまた、多数の反応を小さな設置面積（たとえば、平方センチメートル当たり１０個を超える、または平方センチメートル当たり１００個を超える、または平方センチメートル当たり１，０００個を超える、または平方センチメートル当たり１０，０００を超える）で行うことを可能にする。
本発明の種々の構成要素は、液滴マイクロアクチュエータの構成要素として含まれてもよい。実際には、本発明の全体的なシステムは、統合液滴マイクロアクチュエータとして提供されてもよい。一部の実施形態において、液滴マイクロアクチュエータは、種々のセンサと、センサを外部回路に電子的に連結するための手段とを含む。他の実施形態において、液滴マイクロアクチュエータは、加熱器および／または磁界生成要素と、そのような要素を外部回路に連結するための手段とを含む。さらに、貯槽または液滴の形態において本明細書に記載される試薬のうちの任意の１つまたは複数を含む液滴マイクロアクチュエータもまた、本発明の態様である。
チップ上で光検出を行う機能を強化するために、電極に光学窓をパターン形成することができる。電極が透明基材上の不透明な材料に形成される場合には、光が基材を通過可能にするように電極における窓を形成することができる。あるいは、電極材料が透明である場合には、迷光を削減するようにマスクを作製することができる。さらに、開口部は、回折格子としてパターン形成されうる。適応する光学窓もまた、第２のエレクトロウェッティング層を用いて作製されうる。たとえば、透明な液滴と共に、不透明な油（たとえば、黒く染色された油）を用いて、一時的な可動光学窓を作製することができる。
８．８．２ カートリッジ
一部の実施形態において、本発明は、液滴マイクロアクチュエータに連結するためのカートリッジを含む。カートリッジは、本発明の操作には必要ではないが、一部の状況において好都合である場合があることは十分に認識されよう。存在する場合には、カートリッジは、液滴マイクロアクチュエータの経路またはネットワークをプロセッサ、たとえば、本発明の液滴マイクロアクチュエータシステムのプロセッサに電気的に連結するための手段を含んでもよい。この実施形態において、電気接続は、電極‐カートリッジ‐プロセッサであり、３つの間にさらなる要素があってもよい。別の実施形態において、カートリッジは、液滴マイクロアクチュエータに物理的に連結するための手段を含んでもよい。この実施形態において、電気接続は、電極‐プロセッサ‐カートリッジである。あるいは、カートリッジは、電気構成要素を全く欠いていてもよい。
存在する場合には、カートリッジは、１つまたは複数の試薬、たとえば、予め入れられた試薬用の貯槽を含んでもよい。液滴マイクロアクチュエータは、試薬、試料および／または充填剤流体をカートリッジから液滴マイクロアクチュエータに流すために、カートリッジ貯槽と液滴マイクロアクチュエータの内部との間に流体経路が確立されるように構成されてもよい。たとえば、予め投入されたカートリッジ貯槽は、カートリッジの分析機器への連結前、連結中または連結後に、液滴マイクロアクチュエータに分配されてもよい。カートリッジは、密封型、自己充足型および／または使い捨て型のいずれであってもよい。カートリッジは、液滴マイクロアクチュエータを供給してもよく、供給しなくてもよい。そのようなカートリッジは、繰返し可能な分析状態を確保し、感染性材料または危険な材料の安全な取り扱いおよび廃棄を可能にし、および／または作業間の二次汚染を低減するために用いられうる。カートリッジは、たとえば、機械加工されたプラスチック部品を含んでもよい。この部品は、液滴マイクロアクチュエータと組み合わせて固着されて提供されてもよい。
カートリッジ材料は、試薬の分解または汚染を生じることなく、試薬の格納を提供するように選択されてもよい。さらに、高温で確実な操作を提供し、実時間の化学反応に対する適合性を確保するように選択される必要がある。カートリッジ材料は、たとえば、成形プラスチック構成要素を含んでもよい。一部の実施形態において、密封型の使い捨て可能な検査カートリッジは、作業者の安全性を強化し、安全な廃棄を容易にする。
液滴マイクロアクチュエータシステムの種々の構成要素は、カートリッジ上に含まれてもよい。たとえば、存在する場合には、液滴マイクロアクチュエータの内部空間を包囲する上部プレートが、カートリッジの構成要素として提供されてもよい。種々のセンサもまた、カートリッジの構成要素として含まれてもよい。
８．８．３ 充填剤流体
本発明の液滴マイクロアクチュエータは、１つまたは複数の自由界面（すなわち、流体‐流体）を含む。例としては、流体‐流体または流体‐気体の界面が挙げられる。通常、化学反応は、一次（液滴）相において行われ、二次相は、互いから液滴を分離する充填剤流体として機能する。二次相は、たとえば、液体、ゲルおよび／またはガスなどであってもよい。二次相が液体を含む場合には、液体は、液滴マイクロアクチュエータが複数の液滴操作のうちの１つを行うことを可能にするために、一次液相と十分に混和しない。
液滴マイクロアクチュエータは、３相以上を含んでもよいこともまた留意すべきである。たとえば、一実施形態において、液滴マイクロアクチュエータは、水‐油‐空気の３相系に基づいて操作する。関連環境において、液滴マイクロアクチュエータは、シリコンオイルによって包囲される水の液滴を含み、シリコンオイルは、次にフルオロシリコンオイルによって包囲される系などの水‐第１の油‐第２の油の３相系に基づいて操作されてもよい。一般に、３相系は、互いに非混和性であるか、または実質的に非混和性である３つの構成要素を含む。
別の実施形態において、油または別の非混和液体が、エレクトロウェッティングのための液滴封入剤として用いられてもよい。たとえば、液滴は、空気／油界面を通って液滴を移動させることによって、油のシェルに封入されうる。各液滴は次に、空気または第３の非混和液体によって充填された封入液滴の間の空間を用いて、油のそれ自体の局所的な槽を有することになる。他の利点の中でも、この手法は、油相の中に区分けされることによってシステムにおいて液滴間の材料の移送を最小限に抑えると同時に、気化および表面のファウリングに対する油の好都合な特性を保持するために有用である。この手法はまた、エレクトロウェッティング可能な液体と混和しないエレクトロウェッティング可能でない液体のエレクトロウェッティングを容易にするために用いられてもよい。この概念の特定の実施形態において、非混和液体は、（紫外線、熱、水分または化学的に）架橋可能であるように選択されてよく、薬物送達合成用途向けに、固体シェルを有する液体のカプセルを形成する。
さらに、一部の用途において、油および空気中の他のものなどの非混和性液体において、一定の操作を行うことが望ましいか、または必要である可能性がある。本発明は、液滴操作が、空気中および油などの非混和液体充填剤流体中の両方において行われるハイブリッドシステムを含む。たとえば、試料は、油の下で処理されて、ＭＳによる次の分析のために気化用の空気媒体部分に輸送されてもよい。逆に言えば、試料は、空気中で収集され、油の下で液滴によって処理されることが可能である。したがって、液滴マイクロアクチュエータは、充填剤流体によって充填された空間において、液滴マイクロアクチュエータ表面から、大気に通じるか、またはガス性の充填剤流体を含む液滴マイクロアクチュエータに液滴を移動させるための輸送経路を含んでもよい。
充填剤流体は、液滴マイクロアクチュエータが、適した状態下で、１つまたは複数の液滴操作を行うことができる任意の流体であってもよい。ある充填剤流体は、ある状態下で、たとえば、輸送中に、固体またはきわめて粘性の高い流体であってもよく、たとえば、加熱によって、操作用の流体に変換されることを留意すべきである。充填剤流体は、液滴マイクロアクチュエータの操作中に、液体または気体であってもよい。適切な液体充填剤流体の例としては、限定されないが、シリコンオイル、フルオロシリコンオイル、炭化水素（たとえば、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ペンタデカン、ヘキサデカンおよびシクロヘキサンなどのアルカンを含む）、脂肪族および芳香族のアルカン（ドデカン、ヘキサデカンおよびシクロヘキサンなど）、炭化水素油、鉱油、パラフィン油、ハロゲン化油（たとえば、フッ化炭素およびペルフルオロカーボン（たとえば、３Ｍのフロリナートの液体））、同一の分類における上記の油のいずれかの混合物、異なる分類における上記の油のいずれかの混合物が挙げられる。適切なガス充填剤流体の例としては、限定されないが、空気、アルゴン、窒素、二酸化炭素、酸素、湿気、任意の不活性気体が挙げられる。一実施形態において、一次相は、水溶液であり、二次相は、水と比較的非混和性である空気または油である。別の実施形態において、充填剤流体としては、液滴を包囲するプレート間の空気を充填するガスが挙げられる。好ましい充填剤流体は、シリコンオイルなどの低粘性油である。他の適切な流体は、２００５年１１月１４日出願の「Filler- Fluids for Droplet- Based Microfluidics」というタイトルの米国特許出願第６０／７３６，３９９号に記載されており、その開示内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。流体は、液滴の気化を防止するように選択されてもよい。
本発明のプロトコルにおいて用いられる流体の相は、泡の過度な形成、充填剤流体に対する試薬の損失および／または液滴マイクロアクチュエータ表面における試薬の付着などを生じることなく、本発明のプロトコルを容易にするように選択されてもよい。
本発明のある実施形態において、充填剤流体は、本発明のプロトコルにおいて利用される試料、試薬または他の液滴の気化を低減または防止するように選択されてもよい。充填剤流体は、本発明のプロトコルにおいて利用される試料、試薬または他の液滴が、さらに効果的な操作のために、蒸発し、小さくなりすぎなリしないように選択されてもよい。同様に、充填剤流体は、本発明のプロトコルにおいて利用される試料、試薬または他の液滴の蒸発を防止して液滴の所期の使用に過度に悪影響を及ぼす結果として生じる様式で、液滴内の有害に濃縮された種とならないように選択されうる。さらに、液滴容量の維持および／または確実なマイクロ流体の操作および分析結果の確保のために、充填剤流体は、相の境界にわたって、本発明のプロトコルにおいて利用される試料、試薬または他の液滴からの材料の輸送を低減または防止するように選択されてもよい。相の間の混和性は、液滴相の縮小（または膨張）を結果として生じる場合がある。この問題を防止または低減するために、系の１つまたは複数の相は、収縮または膨張を低減するために、別の相の平衡濃度によって飽和されてもよい。したがって、たとえば、充填剤流体は、本発明のプロトコルにおいて利用される試料、試薬または他の液滴用の溶液の平衡濃度によって飽和されてもよく、および／または、本発明のプロトコルにおいて利用される試料、試薬または他の液滴のうちの１つまたは複数が、充填剤流体の平衡濃度によって飽和されてもよい。
一部の実施形態において、液体充填剤流体は、液滴と液滴マイクロアクチュエータ表面との間の接触を最小限に抑えるように選択される。すなわち、液体の膜が、液滴と表面との間に存在してもよく、液滴内の材料が、コーティングされた表面と接触して、付着するのを防止する。この手法は、表面のファウリングおよび液滴輸送に関連する妨害を防止するのに役立つ。たとえば、水の液滴における高濃度のあるタンパク質が、ある疎水性の表面と容易に張り付き、これらの表面の疎水性を台無しするのに対して、２つの表面の間の接触を最小限に抑える油に浸される場合には、同一の液滴は、タンパク質の顕著な付着を生じることなく、同一の表面にわたって移動されうることが観察されている。この手法はまた、第２の液滴によって捕捉される１つの液滴から、材料の堆積によって生じる液滴間の二次汚染を回避するのに役立つ場合もある。類似の実施形態において、液滴操作中に液滴と表面との間の摩擦に似た物理的な相互作用を防止することによって、液滴を潤滑するために、液滴と液滴マイクロアクチュエータ表面との間に膜を用いることができる。
一実施形態において、本発明は、他のガス充填系における液体充填剤流体層の薄いコーティングを提供する。たとえば、本発明は、液滴マイクロアクチュエータ表面に積層された油などの充填剤流体の薄層を含む開放系または閉鎖系を含むマイクロ流体系を提供し、系は、ガスで他の方法で充填される。油は、液滴マイクロアクチュエータ表面を介して液滴マイクロアクチュエータ表面の潤滑および汚染と、液滴の汚染とを提供するほど十分な厚さである。好ましくは、油は、液滴と油相との間で、材料の輸送を最小限に抑えるように選択される。この手法の１つの利点は、液滴マイクロアクチュエータにおけるキャリオーバの低減である。表面は、一部の実施形態において、充填剤流体によってそれをコーティングすることによって処置されると同時に、空気中で機能してもよい。この手法はまた、油の潤滑効果を保持するための手段として、操作を投入すると同時に、バルク充填剤流体において、油の泡の捕獲を回避するのに有用である。
シリコンオイルによるＴｅｆｌｏｎ ＡＦ 表面の処置は、空気中で機能する場合であっても、シリコンオイル充填剤流体の潤滑という利点の一部を提供することができる。この手法は、液滴マイクロアクチュエータを油の潤滑層でプライミングし、次に、空気と交換して、泡を導入することなく、試料を投入することを可能にし、続いて油の再導入によって、試料の蒸発を防止するために用いられうる。したがって、各種の系の利点は、実現されるマイクロ流体処理のタイプに応じて入手可能である。
別の実施形態において、充填剤流体は、プロトコル内の異なる工程で、完全に交換されうる。たとえば、ガス充填剤流体は、試料投入中に、気泡の捕獲を防止するために導入されてよく、次に、液体充填剤流体が、液体の蒸発を防止するようにポンピングされうる。実施される特定の分析工程に応じて、システムの内外に異なるタイプの充填剤流体をポンピングすることができる。
さらに別の実施形態において、１つのシステム内において、複数の充填剤流体を用いることができる。たとえば、液滴マイクロアクチュエータは、個別のガス充填領域および液体充填領域を有するように選択されうる。液滴の操作またはあるタイプの液滴は、異なる充填剤流体領域間で分離されうる。
充填剤流体は、液滴の中または液滴の付近を通過する光の屈折を防止するように、液滴を適合させるために、その屈折率に基づいて選択されてもよい。あるいは、あるタイプの光学測定または光学操作に関してコントラストを提供するように、液滴とは異なる屈折率を有する充填剤流体が選択されてもよい。内部全反射によって、一次液体を光が透過することができるように、充填剤流体は、一次液体より低い屈折率を有するように選択されてもよい。一次相は、たとえば、光学分析を容易にするために、２つの位置の間で光を伝えるために、「光パイプ」として機能することが可能なかなり細長い液滴を含んでもよい。
充填剤流体は、たとえば、本発明のプロトコルおよび充填剤流体において利用される試料、試薬または他の液滴と充填剤流体との間でのコントラストを提供することによって、液滴の直接的または間接的な可視化を容易にするために、その色に基づいて選択されてもよい。この手法は、異なる相の可視化を強化することができ、たとえば、充填剤流体または気泡から液滴を区別することができる。光学用途において、２つの相の差分吸光度を用いて、系を通過する光の色を調節することができる。別の例として、傾向測定が液滴内で行われる用途において、隣接する液滴において生じる反応のクロストークを最小限に抑えるために、油が、光の発光波長を吸収する染料などの分子を含むことが望ましい場合がある。
充填剤流体は、液滴を断熱するか、または液滴以外で加熱を行うことができる特定の熱特性を有するように選択されてもよい。たとえば、本発明の増幅プロトコルにおいて、熱伝導性または低い熱容量の充填剤流体は、温度における迅速な変化を可能にすることが望ましい場合がある。安定温度が必要とされる用途の場合には、断熱性または高い熱容量の充填剤流体を用いて、温度安定性を提供することができる。
充填剤流体は、適切な刺激の付与時に相変化を受けるように選択されてもよい。たとえば、充填剤流体が、熱の印加によって、固体から液体に変化される場合には、ワックス状の充填剤流体（たとえば、パラフィンワックスまたはオクタデカン）を用いることができる。温度を下げることにより、充填剤流体を固体に戻し、液滴が固体マトリックス内に収まるようになっている。固体内の液相のカプセル化は、本発明のプロトコルにおいて利用される試料、試薬または他の液滴の格納および取り扱いを容易にし、液滴マイクロアクチュエータの使用後に、材料の安全かつ好都合な廃棄を可能にする場合がある。充填剤流体は、カートリッジに基づく貯槽において、液滴マイクロアクチュエータにおける固体として蓄えられてよく、そうでない場合には、加熱され、流体が液滴マイクロアクチュエータに流れ込んで充填することを可能にする。または、固体シェル内に液体のカプセルを作成するために、（紫外線、熱、水分または化学的に）架橋可能であるように非混和性充填剤流体を選択することができる。
充填剤流体は、特定のガス浸透性または飽和特性を有するように選択されてもよい。ある用途において、液滴内部で起こる反応が、酵素または他のガスを消費する可能性があり、充填剤流体に含まれるガスまたは充填剤流体によって輸送されることによって、補充される必要がある可能性がある。たとえば、一部のフッ素化油は、そのような用途に関して、有用なガス浸透性特性を有する。あるいは、充填剤流体は、液滴からあるガスを排除するように、たとえば、液滴内の嫌気性状態を維持するように選択されてもよい。充填剤流体は、ある程度の混和性を有するか、または液滴相に区分するように選択されてもよい。普通、液滴と充填剤流体との間の混和性の完全な欠如または実質的に完全な欠如が、所望であるが、一部の用途は、相間のある制限された程度の混和性および相間の特定の分子の分割、たとえば、液体‐液体抽出用途からの利益を得てもよい。充填剤流体中に溶解したガスに問題がある可能性がある一定の用途において、使用前または使用中に、充填剤流体のガス抜きのための手段を提供する必要がある場合がある。たとえば、充填剤流体は、真空下における培養、加熱、散布または遠心分離によってガス抜きされてもよい。
充填剤流体は、液滴相または液滴マイクロアクチュエータ表面に関する特定の表面または界面張力を有するように選択されてもよい。界面活性剤を充填剤流体に加えることにより、液滴と固相との間に存在しうる液体の膜を安定化することができる。適切な界面活性剤の例としては、非イオンの親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）の低い界面活性剤が挙げられる。ＨＬＢは好ましくは、約１０未満または約５未満である。適切な例としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１５（ＨＬＢ＝４．９）、Ｓｐａｎ ８５（ＨＬＢ １．８）、Ｓｐａｎ ６５（２．１）、Ｓｐａｎ ８３（３．７）、Ｓｐａｎ ８０（４．３）、 Ｓｐａｎ ６０（４．７）およびフッ素化界面活性剤が挙げられる。
界面活性剤は好ましくは、（１）界面活性剤のない対応する液滴マイクロアクチュエータと比較した場合、液滴マイクロアクチュエータにおいてより多くの液滴操作を生じるか、または（２）界面活性剤のない対応する液滴マイクロアクチュエータと比較した場合、液滴マイクロアクチュエータにおいて１つまたは複数の液滴操作を可能にするか、または（３）界面活性剤のない対応する液滴マイクロアクチュエータと比較した場合、液滴マイクロアクチュエータにおいて１つまたは複数の液滴操作の信頼性をより高くする量で選択して提供される。関連する例において、界面活性剤は好ましくは、界面活性剤のない対応する液滴マイクロアクチュエータにおいて１つまたは複数の特定の試薬または混合物を含む同一の液滴に関する液滴操作と比較した場合、液滴マイクロアクチュエータにおける１つまたは複数の特定の試薬を含む液滴または混合物に関して、１つまたは複数の液滴操作を可能にするか、またはその信頼性をより高くする量で選択して提供される。別の関連する例において、界面活性剤は好ましくは、界面活性剤のない対応する液滴マイクロアクチュエータにおいて両親媒性分子を含む同一の液滴に関する液滴操作と比較した場合、液滴マイクロアクチュエータにおける両親媒性分子を含む１つまたは複数の液滴を含む液滴に関して、１つまたは複数の液滴操作を可能にするか、またはその信頼性をより高くする量で選択して提供される。
好ましい実施形態において、界面活性剤は、約０．００１〜約１０％ｗ／ｗまたは約０．００１〜約１％ｗ／ｗまたは約０．００１〜約０．１％ｗ／ｗの範囲である量で充填剤流体に加えられる。たとえば、一実施形態において、充填剤流体は、２ｃＳｔシリコンオイルであり、界面活性剤は、約０．００１〜約１０％ｗ／ｗまたは約０．００１〜約１％ｗ／ｗまたは約０．００１〜約０．１％ｗ／ｗの範囲である量のＴｒｉｔｏｎ Ｘ‐１５である。固体‐液体界面張力は、液滴マイクロアクチュエータ表面における充填剤流体の湿潤を制御するため、たとえば、液滴と液滴マイクロアクチュエータ表面との間の充填剤流体の薄膜の形成、厚さまたは挙動を制御するため、または液滴マイクロアクチュエータからの充填または取り出しを行うときに、流体の湿潤挙動を制御するために調整されてもよい。
界面活性剤を含む充填剤流体をドープすることによって、本発明者らは、ｍｇ／Ｌ〜ｍｇ／ｍＬの範囲で３桁以上相溶性タンパク質溶液の濃度を増大することが可能であることを発見した。本発明者らは、新たな充填剤流体を用いて７５ｍｇ／ｍＬのリゾチーム溶液の２５ｎＬ液滴を確実に分配して輸送することができた。たとえば、充填剤流体は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１５などの界面活性剤でドープしたシリコンオイルであってもよい。好ましくは、界面活性剤は、親油性界面活性剤である。一実施形態において、油に０．１％（ｗ／ｗ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ‐１５親油性界面活性剤を加え、高濃度のタンパク質液滴を形成するか、またはオンチップ貯槽から分配することを可能にした。すべての相溶性流体に関する液滴輸送は、高速（典型的には、約３〜１０ｃｍ／秒）および信頼度（＞２５，０００操作）である。一実施形態において、充填剤流体は、液滴マイクロアクチュエータに確実に分配されうるタンパク質の濃度における増大を結果として生じる量で、界面活性剤ドーパントを含む。
充填剤流体は、特定の粘性または揮発性を有するように選択されてもよい。たとえば、低粘性液体（たとえば、０．６５ｃＳｔシリコンオイル）は、液滴の輸送を容易にすると同時に、低揮発性の充填剤流体（たとえば、２、５または１０ｃＳｔシリコンオイル）が、特に高温で行われる核酸増幅用途において、蒸発による充填剤流体の損失を防止することが望ましい場合がある。一部の用途において、充填剤流体の蒸発が望まれる場合があり、したがって、低揮発性のフィルタ流体が選択されてもよい。充填剤流体の粘性は、流体動力に影響を及ぼし、また、液滴マイクロアクチュエータにおける温度は可変であってもよいため、充填剤流体は、温度に依る特定の粘性を有するように選択されてもよい。本発明の核酸増幅プロトコルにおいて、充填剤流体は、熱サイクリングから生じる任意の粘性の変化が、増幅プロトコルを行うために必要な液滴操作を行うことに対して過度に悪影響を及ぼさないように選択される。
充填剤流体は、特定の電気特性を有するように選択されてもよい。たとえば、エレクトロウェッティングを含むある用途は、非導電性の充填剤流体（たとえば、シリコンオイル）の使用を好む。または、誘電体の誘電率は、外部電極からシステムへの電気エネルギーの連結を制御するように選択されうる。ある用途において、非導電性の充填剤流体は、電気絶縁体または誘電体として採用されてよく、液滴は、物理的に接触することなく、電極の直上に浮かぶ。たとえば、エレクトロウェッティングシステムにおいて、液滴と電極との間の充填剤流体（たとえば、シリコンオイル）層を用いて、液滴の静電制御を行うことができる。充填剤流体は、導電率を低減するように脱イオン化されてもよい。
充填剤流体は、液滴相に対して特定の密度を有するように選択されてもよい。２相の間の密度における差を用いて、液滴に作用する浮力の制御または活用することができる。本発明のこの態様において有用な二相系の例としては、水／シリコンオイル、水／フロリナートおよび水／フルオロシリコンオイルが挙げられる。一相に浮力がある場合には、その効果をある相から別の相を介して輸送する手段として、垂直構造において活用することができる。たとえば、液滴が適切な地点で液滴を単に放出し、標的の行き先まで浮かび、または沈降することを可能にすることによって、その貯槽に液滴が分配される場合には、廃棄ウェルまたは収集ウェルは、液滴マイクロアクチュエータの上部または下部に存在してもよい。そのような手法は、液滴マイクロアクチュエータから反応体を除去するのに用いるのに適している場合があり、他の処理において用いられる増幅された核酸を含む流体を除去するのに適している場合がある。密度差もまた、液滴と液滴マイクロアクチュエータ表面との間の接触の制御または処理するための手段として用いられうる。たとえば、上部プレートに通常は接触しない液滴を放出して、その表面に接触させるために、沈降または浮遊させることができる。密度差効果および浮力効果もまた、液滴の移動が検出され、位置、配向または加速における変化に関連付けられる検知用途に活用されうる。
充填剤流体は、液滴マイクロアクチュエータ表面と材料との適合性に関して選択される。たとえば、ある充填剤流体は、たとえば、エッチング、溶解、汚染、吸収を行うことができ、そうでなければ液滴マイクロアクチュエータ材料と不適合性であってもよい。たとえば、フロリナートなどのフッ素化炭化水素は、これらの材料の溶解傾向のために、Ｔｅｆｌｏｎ ＡＦまたはＣｙｔｏｐ表面と不適合性であってもよいのに対して、シリコンオイルは、互いに溶解にするこれらの材料の傾向に起因してＰＤＭＳ表面と不適合性であってもよい。
充填剤流体は、本発明のプロトコルにおいて用いられる試料および試薬との生化学的相溶性のために選択される。
本発明は、液滴マイクロアクチュエータ、カートリッジおよび／またはシステム内の充填剤流体の導入または循環を制御するための手段を含んでもよい。操作の１つのモードにおいて、充填剤流体は、液滴マイクロアクチュエータ操作の起動中に一旦注入される。充填剤流体は、注射器、点滴器、ピペット、毛細管、管または他の手段を用いて外部源から提供されてもよい。あるいは、充填剤流体は、液滴マイクロアクチュエータアセンブリ内部の貯槽またはカートリッジから提供されてもよい。一例として、流体は、液体を液滴マイクロアクチュエータに移送するために穿孔または圧縮される密封袋内に収容されうる。
操作の別のモードにおいて、手段は、液滴マイクロアクチュエータ内に１つまたは複数の充填剤流体の複数の導入または再循環のために設けられうる。二次流体処理システムが、液滴マイクロアクチュエータ内への流体の注入および液滴マイクロアクチュエータ内からの流体の除去のために設けられうる。圧力、重力または熱勾配の使用などの他の手段を用いて、充填剤流体を液滴マイクロアクチュエータ内外に輸送することができる。そのようなシステムは、以下の目的のために用いられうる。
（１）時間の経過による蒸発または漏れによって失われる充填剤流体を補充するため。充填剤流体容量の損失を補うために、充填剤流体のゆっくりかつ安定したフローまたは定期的な注入を採用することができる。
（２）液滴間の汚染を低減するために、継続的にまたは定期的に、「清浄な」充填剤流体を提供するため。充填剤流体は、完全に交換することによって、または汚染物質を除去するように選択されたフィルタまたは吸着材料の床を通して循環することによって、清浄化することができる。
（３）消耗される液滴を輸送するための手段を提供するため。たとえば、分析の最後で、液滴を放出して、充填剤流体と共に外部に流すことを可能にして、液滴マイクロアクチュエータを「押し流す」ための手段を提供する。液滴マイクロアクチュエータをフラッシングすることにより、さらなる分析を行うための調製において液滴マイクロアクチュエータの状態をリセットすることができる。
（４）異なる流体がある工程に関して所望である場合には、充填剤流体を交換するため、たとえば、空気と油とを交換して、液滴の乾燥を可能にするため、またはある油を異なる油に交換するため。
（５）液滴マイクロアクチュエータを通じて循環するために、流体を加熱または冷却することによって、液滴の温度を制御する手段を提供するため。たとえば、ＰＣＲは、熱サイクリングを行うために、液滴マイクロアクチュエータを通じて温度制御された充填剤流体を循環することによって、適切なＰＣＲ試薬（たとえば、プライマー、ヌクレオチドおよびポリメラーゼ）を含む液滴において行われうる。液滴マイクロアクチュエータの内側に最適な温度制御を提供するために、液滴マイクロアクチュエータに出入りする充填剤流体の温度を直接的に測定することができ、充填剤流体の温度および流速を調整することができる。
各液滴に関して充填剤流体の局所領域または充填剤流体の個別のユニットさえも用いることができる。たとえば、水滴は、その水滴に沿って移動する油などの流体の個別のシェルにカプセル化することができる。それぞれのそのような液滴は次に、空気またはフルオロシリコンオイルなどの第３の非混和性液体によって充填したカプセル化された液滴間の空間を有するそれ自体の局所的な流体槽を有する。この手法は、蒸発および表面のファウリングに対して油の好都合な特性を保持すると同時に、油相の中に区分することによって、システムにおいて液滴間の材料の移送を最小限に抑えるために用いることができる。油のシェルは、油界面を通って液滴を移動し、界面に沿って液滴が膨らみを形成するときに、油のユニットを摘み取るだけで形成されうる。
液滴マイクロアクチュエータの異なる領域が異なる流体によって充填されるハイブリッドシステムが実装されうる。たとえば、試料は、油の下で処理され、次に、ＭＳによる次の分析のために蒸発されるように空気部分に輸送されうる。逆に言えば、 試料は、空気中で収集され、次に油の下で処理されうる。
磁気応答性ビーズは、液滴マイクロアクチュエータにおける油相と水相との間で材料を移動するために用いられうる。一般に、水溶性化合物または材料は、液滴内に保持される傾向があり、大量に油‐水のメニスカスを交差することができず、油溶性化合物または材料は、親油性充填剤流体に保持される。材料が磁気応答性ビーズに付着される場合には、油‐水の境界にわたってビーズおよび付着した材料を移動するために、磁界が用いられてもよい。ビーズは、油および水に関して十分な親和性を有し、メニスカスと容易に交差することができるように選択される必要がある。この操作は、材料の乾燥または濃縮のために有用であり、洗浄および／または希釈を容易にするためにも用いられうる。たとえば、磁気応答性ビーズに結合される材料は、１つの液滴から除去され、別の液滴に充填剤流体によって移送されうる。
充填剤流体は、液滴マイクロアクチュエータを通って循環され、作業中および／または作業の汚染を低減することができる。充填剤流体は、液滴マイクロアクチュエータを継続的または定期的に流れることができ、その結果、新たな充填剤流体が、液滴マイクロアクチュエータに常に供給されるようになっている。汚染された油から汚染の除去に加えて、この技術は、作業の最後に、電圧を除去することによって、アレイからの液滴を清浄にするために用いられることが可能である。その結果、油と共に液滴が放出されて液滴マイクロアクチュエータの外部および／または廃棄貯槽内に流れ込む。
８．８．４ 液滴マイクロアクチュエータの投入
液滴マイクロアクチュエータは一般に、１つまたは複数の充填剤流体、試薬および／または試料（たとえば、本明細書において他の箇所、８．１節、８．２節、８．３節、８．４節および／または８．５節に記載のように、プロトコルおよび／または分析を行うための試薬および／または試料）を液滴マイクロアクチュエータに導入するための１つまたは複数の投入ポートを含む。一部の実施形態において、試料または試薬が、従来のロボットを用いて投入ポートを介して投入される。１つの別の実施形態において、試料および試薬の液滴は、液滴マイクロアクチュエータに接続されるときに、毛細管から投入ポートにポンピングされるため、試料および試薬の液滴を液滴マイクロアクチュエータに捕捉して経路指定することを可能にする長い予め入れられたガラスの毛細管における油の栓によって分離される。別の投入技術は、液滴マイクロアクチュエータの中に試薬を予めスタンピングすること、たとえば、高速試薬スタンピングまたは印刷処理を用いて、それらの試薬を乾燥可能にすることを伴う。さらに別の手法は、直接的なプレート対液滴マイクロアクチュエータ界面の使用を伴い、プレートの内容物、たとえば、たとえば、１５３６個または３８４個または９６個のウェルプレートが、ウェルに整列された投入ポートによってその内容物を押すように圧力を用いることによって、液滴マイクロアクチュエータに並列に輸送される。投入ハードウェアは、一部の実施形態において、制御装置に電子的に連結されて制御されてもよい。
８．８．５ 貯槽
液滴マイクロアクチュエータは、投入貯槽および／または処理貯槽などの種々の貯槽を含む。
８．８．５．１ 投入貯槽
一部の実施形態において、液滴マイクロアクチュエータは、１つまたは複数の投入ポートと流体連通する１つまたは複数の投入貯槽を含み、典型的には、投入ポートと直接的に流体連通している。投入貯槽は、分配液滴（たとえば、試薬液滴または試料液滴）用のバルク源材料（たとえば、試薬または試料）の格納のための貯槽として機能する。したがって、投入貯槽は、たとえば、試料ウェルまたは試薬ウェルと機能してもよい。
投入貯槽は一般に、内部空間および開口部を画定する１つまたは複数のウェル壁を含む。ウェル壁によって画定される内部空間は、液滴マイクロアクチュエータの内部の残りからウェル壁によって少なくとも部分的に隔離される。ウェルは、液滴マイクロアクチュエータの外部から投入貯槽への流体の導入に適したポートに（任意の方向において、たとえば、垂直または横に）隣接していてもよい。ウェル壁における１つまたは複数の開口部は、この内部容積に液滴を分配するために、液滴マイクロアクチュエータの内部容積と流体連通を可能にするように提供されてもよい。開口部は、電極の経路またはネットワークへの液滴マイクロアクチュエータの内部容積に流体が流れ込むか、輸送されることを可能にする場合もある。投入貯槽はまた、流体がポートまたは開口部を介してウェルに導入されるか、またはウェルから除去されるときに、投入貯槽から充填剤流体の変位を可能にするための１つまたは複数のベントを含んでもよい。
投入貯槽はさらに、ウェル壁によって画定される空間に隣接する上部プレートまたは下部プレートまたはこの空間内の上部プレートまたは下部プレートにおいて、１つまたは複数の平面制御電極を含んでもよい。平面電極は、制御装置に電子的に連結されて制御される。好ましい実施形態において、平面電極は、２つ以上の分岐または光線を有し、流体の存在下で液滴分配中に、制御電極の作動により、液滴分配方向に対して略対向する方向に、流体を「引くこと」を作用させるようになっている。一部の場合において、電極の形状は、液滴分配の方向に略対向する方向を有する平均ベクトルを有する多次元ベクトルの引きを結果として生じる。
ウェル壁は、たとえば、上部プレートまたは下部プレートからの突出部によって形成されてもよく、および／または上部プレートまたは下部プレートの表面に壁形成材料の堆積によって形成されてもよい。たとえば、ウェル壁は、表面上に堆積され、パターン形成されるハンダマスク材料またはポリマーガスケット材料から形成されてもよい。一部の実施形態において、連続的または半連続的な試料および試薬のフローの供給源は、投入ポートのうちの１つまたは複数と流体連通するように連結される。
液滴分配は、画定された貯槽から行われてもよいが、一実施形態において、液滴分配は、物理的に画定された貯槽を用いることなく行われてもよいことを留意すべきである。分配は、たとえば、エレクトロウェッティング力または親水性の表面によって、液滴分配中に閉じ込められる供給源の液滴から進められてもよい。
８．８．５．２ 処理貯槽
液滴マイクロアクチュエータはまた、１つまたは複数の処理領域または貯槽を含んでもよい。これらの領域または貯槽は、混合、加熱、培養、冷却、希釈、滴定などの種々の液滴処理工程を実行するための位置として機能する。液滴マイクロアクチュエータは、１つまたは複数の投入ポートから１つまたは複数の処理領域または貯槽に液滴を輸送するのに十分な制御電極の１つまたは複数の経路またはネットワークを含む。一部の場合において、処理領域は、これらの経路またはネットワークの構成要素または部分に過ぎない。他の実施形態において、処理領域は、画定された処理貯槽である。そのような貯槽は、たとえば、上述した投入貯槽と略同様の様式で構造形成されてもよい。しかし、処理貯槽は通常、投入ポートと直接的に流体連通状態ではない。すなわち、制御電極の１つまたは複数の経路またはネットワークに沿った液滴輸送は、処理貯槽に試薬または試料を加えることが必要である。一部の場合において、処理貯槽は、その中に貯槽の経路またはネットワークを含み、処理貯槽内の液滴操作を行うことを可能にする。
８．８．５．３ 液滴操作
液滴マイクロアクチュエータは、液滴に対して種々の液滴操作を行ってもよい。例としては、液滴マイクロアクチュエータ内への液滴の投入、供給源の液滴からの１つまたは複数の液滴の分配、液滴の２つ以上の液滴への分割、分離または分裂、任意の方向におけるある位置から別の位置への液滴の輸送、２つ以上の液滴の１つの液滴への融合または結合、液滴の希釈、液滴の混合、液滴の攪拌、液滴の変形、液滴の所定の位置における保持、液滴の培養、液滴の加熱、液滴の気化、液滴の冷却、液滴の配置、液滴マイクロアクチュエータからの液滴の輸送、本明細書に記載される他の液滴操作および／または上記の操作の任意の組み合わせが挙げられる。
液滴分配は、より大量の流体をより小さい液滴に等分する処理を指す。分配は、流体界面、投入貯槽および処理貯槽で有用に採用される。液滴は、貯槽から流体の「フィンガー」を延在させる流体貯槽に隣接する電極に電圧を印加することによって形成されてもよい。流体前面が、末端電極に達すると、中間電極は、電源を切り、流体を貯槽に戻させると同時に、末端電極に新たに形成された液滴を残す。既に述べたように、バルク流体から分配される液滴の分離を支援するために、貯槽における１つまたは複数の電極はまた、電圧を印加されてもよい。液滴は、固定されている電極の形状に適合するため、すぐれた精度および正確さが得られる。液滴分配は、制御装置によって制御される。一部の実施形態において、本発明は、２００５年６月２８日公表のＰａｍｕｌａらによる「Apparatus for Manipulating Droplets by Electrowetting-Based Techniques」というタイトルの米国特許第６，９１１，１３２号、２００６年１月３０日出願の「Apparatuses and Methods for Manipulating Droplets on a Printed Circuit Board」というタイトルの米国特許出願第１１／３４３，２８４号、いずれもＳｈｅｎｄｅｒｏｖらによる２００４年８月１０日公表の「Electrostatic Actuators for Microfluidics and Methods for Using Same」というタイトルの米国特許第６，７７３，５６６号および２０００年１月２４日公表の「Actuators for Microfluidics Without Moving Parts」というタイトルの米国特許第６，５６５，７２７号に記載された液滴分配構造および／または技術を採用する。いずれの開示も、参照によって本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態において、液滴操作は、エレクトロウェッティング技術によって媒介される。他の実施形態において、液滴操作は、電気泳動技術によって媒介される。さらに他の実施形態において、液滴操作は、エレクトロウェッティング技術および電気泳動技術によって媒介される。
一実施形態において、分離は、エレクトロウェッティングおよび電気泳動の組み合わせを用いて行われてもよい。エレクトロウェッティングマイクロ作動を用いて、電気泳動を行うチャネルを形成し、試料をチャネルに供給するか、または電気泳動分離後にチャネルから試料の部分を捕捉することができる。たとえば、チャネルの形成に関して、エレクトロウェッティングを用いて、後に続く長い薄い形状に分離媒体の液滴を変形（伸ばす）ことができる。一部の場合において、チャネルは、たとえば、紫外線重合を用いて、重合されてもよい。他の場合において、液滴操作を用いることによって、液滴を物理的に閉じ込められたマイクロチャネルに加えるために、チャネルを形成してもよい。関連実施形態において、出口で液滴の目的とする部分を捕捉し、次に、循環方式で、それを入口に戻すことによって、電気泳動チャネルの有効長を増大することができる。同一の原理を用いて、一連の徐々により細かい分離を行うことができる。分離はまた、同一の時間で複数の異なる分離媒体を用いて達成されてもよい。
液滴分割または液滴の分裂は一般に、液滴を２つ以上の小液滴に分離することを伴う。一部の場合において、結果として生じる液滴は、サイズにおいて比較的等しい。
輸送は、任意の方向におけるある位置から別の位置に液滴を移動することを伴う。液滴は、平面または３次元において輸送されてもよい。分配および／または分割などの種々の液滴操作は、別の液滴から液滴に輸送される輸送要素を含んでもよいことは十分に認識されよう。
融合は、２つ以上の液滴を１つの液滴に結合することを伴う。一部の場合において、比較的等しいサイズの液滴が、互いの中に融合される。他の場合において、液滴は、より大きな液滴に融合されてもよく、たとえば、貯槽に存在するより大きな容積で液滴を合わせる。
液滴の混合は、輸送または攪拌などの種々の液滴操作を伴い、液滴内により多くの同種の構成要素の分散を結果として生じる。１つの混合の実施形態において、エレクトロウェッティング電極上に位置決めされた液滴は、電極の活性化および非活性化を行うことによって、迅速かつ循環的に適所で変形され、混合を容易にする液滴内に流体の流れを誘発する。機械的共鳴などの周波数依存性効果が、混合の品質および速度を合わせるために用いられてもよい。混合のために表面における液滴の輸送を必要とする技術に比べて、この手法は、混合のために必要な領域を最小限に抑える。この混合方策は、上部プレートが存在しない場合にも採用することができる。空間節約という利点のために、この方策は、必要とされる電極は唯一であるため、反応ウェルにおいて簡素化された混合を提供することが可能である。
貯槽から試薬または試料は、液滴マイクロアクチュエータにおける他の位置に輸送するために、個々の液滴として分配されてもよい。
本発明は、ビーズを含む液滴を用いた液滴操作を含む。種々のそのような操作は、本明細書の他の箇所に記載されている。一実施形態において、ビーズは、液滴操作と干渉する傾向がある試薬で液滴操作を行うために用いられる。たとえば、あるタンパク質は、液滴マイクロアクチュエータの表面と結合する傾向があり、および／または充填剤流体に区分される傾向がある場合がある。親水性のビーズにおけるそのような化合物の固定化を用いて、化合物を用いる液滴操作を容易にすることができる。化合物は、ビーズに結合されることができ、ビーズは、液滴操作に供される液滴と共に含むことができる。
１つの特定の分配操作において、凝固は、全血から血清を分離するために用いられる。全血は、チップ上に載せられて、凝固剤を含む液滴と合わされる。凝固後、液滴は、試料から分配される。細胞および血小板が適所に捕獲されるため、試料から分配された液体は、血清のみを含む。
８．８．６ 熱制御
本発明の液滴マイクロアクチュエータは、液滴マイクロアクチュエータまたは液滴マイクロアクチュエータの領域の温度を制御するための手段を含んでもよい。中でも、熱制御は、加熱工程または冷却工程を必要とする種々のプロトコルの場合に有用である。例としては、熱サイクリングを必要とする増幅プロトコルおよび培養工程を必要とする種々の分析が挙げられる。
８．８．６．１ 熱制御設計
一般に、熱制御は、３つの方式で提供されてよい：（１）液滴マイクロアクチュエータ全体の熱制御；（２）制御された領域と接触状態にあるか、または制御された領域に近接している加熱器を用いた液滴マイクロアクチュエータの領域の熱制御；ならびに（３）（たとえば、存在する場合には、電極の経路またはアレイを含む基材、および／または液滴マイクロアクチュエータの上部プレートにある基材に）液滴マイクロアクチュエータに統合される加熱器を用いた液滴マイクロアクチュエータの領域の熱制御。上述の手法の組み合わせも可能である。前に記載された２つの手法は、図２に示されている。
統合型加熱器手法において、温度ゾーンが形成され、液滴マイクロアクチュエータ内に直接的に統合された熱制御システムを用いて制御されうる。液滴マイクロアクチュエータに直接的に作製される薄膜加熱要素を通じた熱制御の統合もまた、液滴マイクロアクチュエータにおける増幅反応の速度、スループットおよび品質を最大にするために有用である。液滴は、その小さな熱質量のために、きわめて迅速に熱循環されうる。熱制御は、液滴に近接して加熱要素を位置付けて、加熱器と液滴との間の寄生熱損失を低減することによって強化される。加熱要素は、液滴マイクロアクチュエータの上部プレートおよび／または株プレートに統合されうる。
液滴マイクロアクチュエータへの加熱要素の統合はまた、液滴マイクロアクチュエータ内の複数の個別の熱ゾーンの使用を可能にする。これは、試料調製および熱サイクリングなどの分析における複数の工程を可能にし、液滴マイクロアクチュエータの異なる部分で同時に行われることになっている異なる温度を必要とする。液滴は、増幅反応の熱サイクリング態様を実行するために、異なる固定温度のゾーンの間で、物理的に輸送されうるか、または「往復」されうる。この手法は、熱ゾーン全体の加熱および冷却がもはや速度制限されないため、さらに高速の反応を生じることができる。代わりに、加熱および冷却の速度は、ゾーン間で液滴を輸送するために必要な時間、および、液滴がゾーン内に達したらゾーンの温度に対して平衡を保つために液滴温度に必要な時間によって決定される。いずれも非常に高速であると期待される。さらなる利点は、反応工程が、より大きな操作柔軟性を可能にする「一括処理」ではなく「待ち行列処理」で行われうることである。たとえば、個々の試料は、１つの時点で供給されるのではなく、液滴マイクロアクチュエータに連続的に供給されうる。
液滴は、１つの加熱器を用いて一括モードで熱循環されてもよく、または加熱要素によって形成される別個の温度ゾーンを通って液滴を循環させることによって貫流モードで熱循環されてもよい。一括モードと貫流モードとの間の本質的な違いは、一括モードでは、熱制御が加熱器の温度を変化させることによって行われるのに対し、貫流モードでは、熱サイクリングは、別個の一定の温度ゾーン間で液滴を輸送することによって行われることである。「一括」方法において、液滴マイクロアクチュエータにおける１つの統合型薄膜加熱器が用いられ、加熱器ゾーン内に位置する静的な液滴を熱サイクリングさせた。「貫流」方法において、２つの別個の固定温度ゾーンが液滴マイクロアクチュエータに形成され、熱サイクリングが、２つのゾーンの間での液滴の往復によって行われた。
「一括」の場合には、加熱器自体の熱質量ならびに熱損失を、液滴に直接的に隣接して配置される薄膜加熱器を用いて最小限に抑えてもよい。液滴自体を含む熱質量は小さすぎるため、迅速な温度変化に影響を及ぼしうる。システムへの総エネルギー投入が総熱質量に比べてきわめて小さいことから、受動冷却（充填剤流体における）もまた迅速である。
「貫流」加熱の場合には、温度を安定化させるために役立つことから、より大きな熱質量が望ましく、その設定点に達すると、加熱器の温度は変化しないため、より緩やかな勾配速度が許容可能である。貫流システムは、たとえば、薄膜加熱器より正確かつ簡単に制御される液滴マイクロアクチュエータに対して外部にある蓄熱加熱器を用いて実装されうるが、原則的には、いずれのタイプの加熱器もいずれの方法を実装するために用いることが可能である。
別の実施形態において、温度は、チップを通って液滴の周囲に加熱された充填剤流体を流すか、または再循環することによって制御される。
液滴マイクロアクチュエータの配置は拡張可能であり、その結果、液滴マイクロアクチュエータは、１〜１０、数百以上の加熱ゾーンを含みうる。
８．８．６．２ 加熱器タイプ
加熱器は、導電薄膜を用いて形成されてもよい。適切な薄膜の例としては、Ｐｔ加熱器ワイヤおよび透明なインジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）が挙げられる。ＩＴＯは、実時間の観察に関して液滴の良好な可視化を提供する。温度調整のために遠隔配置された従来の熱電対（ＴＣ）を用いることもできる。一実施形態において、ＰＣＢ基材における微小な金属（たとえば、銅）バイアスが、液体と遠隔ＴＣとの間の密着熱接合を形成するために用いられる。さらに、試料温度は、表面実装サーミスタまたは赤外線センサを用いて銅バイアスを監視することによって決定されうる。サーミスタを用いる１つの利点は、液滴マイクロアクチュエータに直接的にハンダ付けすることができるほど十分に小さいことであり（２×２ｍｍ）、ＩＲを用いる利点は、結び付けを簡単にする非接触方法であることである。銅の熱伝導率は、ＦＲ−４基材より少なくとも７００倍大きい（３５０〜３９０Ｗ／ｍ・Ｋ対０．３〜０．５Ｗ／ｍ・Ｋ）ため、銅バイアスの温度は、液体内の温度を正確に表す。加熱器は、液滴マイクロアクチュエータの下部プレートおよび／または上部プレート（存在する場合には）またはいずれかのプレートの下部表面および／または上部表面に統合されてもよく、いずれかのプレートの構造内に統合されてもよい。
１つの貫流の実施形態において、低減した熱勾配が、加熱器を用いることによって提供されてよく、液滴マイクロアクチュエータにわたって連続的な温度勾配（たとえば、１００〜５０℃）を形成する。連続的な勾配の使用は、加熱器ブロックの縁に沿って見られる急激な温度勾配を克服するための必要性を削減する。制御された温度勾配はまた、任意の数の温度点に関するプロトコルを実装可能にすることによって、デバイスの機能性を著しく強化する。さらに、各反応は、カスタム温度プロトコルによって行われてよく、２つ以上のブロックの温度のみが熱調整される必要がある。液滴は、加熱器の間の適切な位置に輸送され、その位置で対象温度を達成するのに役立つ。液滴が検出スポットにわたって輸送されるときに、液滴の蛍光は、蛍光センサを用いて画像形成されうる。上部目標温度および下部目標温度は、液滴の位置を変化させることによって変更されうる。
一部の実施形態において、液滴上に位置している加熱器は、液滴を覆い隠す可能性があり、したがって、実時間光学測定を妨害する可能性がある。そのような場合には、液滴は、加熱器の直下から光検出に好ましい位置（すなわち、検出スポット）まで輸送されることができる。液滴は、たとえば、蛍光定量化による検出などの液滴マイクロアクチュエータの検出目的のために、加熱器の直下から検出スポットに定期的に輸送されてもよい。液滴は、ある温度ゾーンから別の温度ゾーンに循環している間に、センサに近接するように経路指定されてもよい。
８．８．７ 液滴マイクロアクチュエータの作製
液滴マイクロアクチュエータは、マイクロ液滴マイクロアクチュエータで導電相互接続構造を形成するために一般に用いられる標準的なマイクロ作製技術を用いて、および／またはプリント回路基板（ＰＣＢ）作製技術を用いて構成されうる。適切なＰＣＢ技術としては、２００６年１月３０日出願の「Apparatuses and Methods for Manipulating Droplets on a Printed Circuit Board」というタイトルの米国特許出願第１１／３４３，２８４号に記載された技術が挙げられ、その開示内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。これらの技術は、液滴マイクロアクチュエータをきわめて低費用で大量に製作することを可能にする。低費用の製作は、１回限りの使い捨てとして用いる場合であっても、液滴マイクロアクチュエータの経済的な製造を可能にする。したがって、本発明は、液滴マイクロアクチュエータが本発明のシステムにおいて用いるための使い捨てのカートリッジの構成要素としてユーザに供給される方法を提供する。
設計はまた、ＰＣＢ処理において典型的であるよりはかなり小さな特徴部を製作する機能に関して、従来のマイクロリソグラフィ技術を用いてガラスまたはシリコン上に実装されうる。たとえば、７０μｍの貯槽間隔および３ｆＬの貯槽容量を有する１，５７２，８６４個の貯槽液滴マイクロアクチュエータの場合であっても、最小の必要なリソグラフィック特徴部のサイズは、約０．５μｍであり、半導体業界において現在用いられている従来のマイクロリソグラフィ技術の性能内のウェルである。
８．９ システム
流体投入は、図１８に示されているように、液滴マイクロアクチュエータシステムを用いた達成されてもよい。流体導入プロトコルの工程は、液滴制御システム１８０１を用いて行われてもよい。一連のコンピュータによる実行可能な命令は、投入プロトコルの実行に関する制御装置に投入されうるように書かれてもよい。液滴制御システム１８０１およびプロトコル実行システム１８０２を含む統合型システムを用いてもよい。液滴制御システム１８０１は、流体投入プロトコルに関する液滴操作およびセンサ操作などの液滴マイクロアクチュエータシステム機能を制御することを可能にする。プロトコル実行システム１８０２は、ユーザが、液滴操作および流体投入操作などの液滴マイクロアクチュエータシステム機能を制御するソフトウェアルーチンを実行することを可能にする。本発明はまた、流体投入処理またはプロトコルを行うための方法またはコンピュータによって使用可能な命令を提供する。プラットフォームのプログラム可能な柔軟性により、分析を迅速に最適化することを可能にし、条件付き実行工程を実装することを可能にする。たとえば、特定の検査結果によって誘発される場合には、較正、確認検査またはさらなる制御を実行することができる。一部の実施形態において、システムは、試料調製工程を統合することができる。システムの自動化および／または液滴マイクロアクチュエータ上の操作は、可搬性を強化し、分析をさらに迅速かつわずかな訓練を受けただけの人員によって行うことができ、それにより、人的エラーを削減することを可能にする。
図１８を高レベルでさらに参照すると、本発明のシステムのそれぞれは典型的には、プロセッサまたは制御装置１８０３、液滴マイクロアクチュエータ１８０４、センサまたは検出器１８０５、入力デバイス１８０６、出力デバイス１８０７およびソフトウェアを含む。２００６年６月３０日出願の「Systems and Methods for Droplet Microactuator Operations」というタイトルの関連する米国特許仮出願第６０／８０６，４１２号（その開示内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる）は、本発明の液滴マイクロアクチュエータ態様と共に採用されうる液滴マイクロアクチュエータシステムについて記載している。液滴制御システムは、液滴マイクロアクチュエータシステム機能を制御するために、コンピュータ１８０８で実行可能であり、液滴制御インターフェイスを表示するようにプログラムされる液滴制御ソフトウェアを含む。プロトコル実行システムは、流体投入を行うために液滴マイクロアクチュエータシステム機能を制御するために、一連のコンピュータによって実行可能な命令またはコンピュータによって使用可能な命令の実行を容易にするようにプログラムされるプロトコル実行ソフトウェアを含む。
８．９．１ 制御装置
本発明のシステムは、制御装置１８０３を含んでもよい。制御装置は、ソフトウェア命令の格納、解釈およびまたは実行などの処理性能を提供するように機能する。制御装置は、たとえば、メモリ、マイクロコントローラまたは特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）を備えたデジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）から構成されてもよい。適切なＤＳＰプロセッサの例は、Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｂｌａｃｋｆｉｎ ＤＳＰプロセッサである。
制御装置は、液滴マイクロアクチュエータ、任意のセンサおよび任意の入力デバイスおよび／または出力デバイスなどの本発明の種々のハードウェア構成要素に電子的に連結される。制御装置は、これらのデバイスのデータおよび／または電源の態様を制御するように構成かつプログラムされてもよい。たとえば、液滴マイクロアクチュエータに対して、制御装置は、電極を活性化／非活性化することによって、液滴処置を制御する。本発明のこの態様については、８．８節にさらに記載されている。
制御装置は、さらに、プロセッサ、入力デバイスおよび出力デバイス、データ格納媒体および他の構成要素を含む個別のコンピュータシステムに電子的に連結されてもよい。この配置は、液滴制御システムにおいて特に有用であり、コンピュータシステムは、液滴制御ユーザインターフェイスを操作するようにプログラムされる。この配置において、コンピュータシステムのプロセッサは、ユーザインターフェイスを介して入力を受け入れて、命令を制御装置に伝送し、たとえば、電極の活性化／非活性化、電極、メモリおよび／またはセンサの読み出しなどを行ってもよい。
プロトコル実行システムにおいて、システムを制御するためのソフトウェアは、制御装置に液滴マイクロアクチュエータシステム機能を制御させるために、制御装置に直接読み込まれて、制御装置によって実行されてもよい。この実施形態において、システムは、携帯可能または手持ちシステムとして自立的に実行することができる。
８．９．２ 液滴マイクロアクチュエータ
システムは、８．８節にさらに記載のように、液滴マイクロアクチュエータ１８０４を含んでもよい。液滴マイクロアクチュエータは、プロセッサに電子的に連結され、その結果、プロセッサは、液滴処置操作などの液滴マイクロアクチュエータの種々の操作を制御することができる。
８．９．３ センサ
本発明の種々の実施形態は、センサまたは検出器１８０５を利用する。センサは、反応生成物が位置しうる液滴マイクロアクチュエータ上の位置における蛍光強度または発光強度などの液滴マイクロアクチュエータにおける目的とするパラメータを測定するために、液滴マイクロアクチュエータに連結されるセンサを含んでもよい。センサはまた、液滴マイクロアクチュエータ挿入センサ、蓋ラッチセンサ、周辺温度センサなどのシステムの状態を監視するセンサを含んでもよい。各センサからの出力は、特定のメモリ位置にマッピングされてもよく、プロセッサは、センサからの読み出しを得るために、マッピングされた位置を照会するだけでよい。センサは、液滴マイクロアクチュエータに対して取り付けられるか、および／または液滴マイクロアクチュエータに電子的に連結され、その結果、センサは、電気信号または光信号などの信号を液滴マイクロアクチュエータから検出することができる。センサについては、本明細書において他の箇所（たとえば、８．１１参照）にさらに詳細に記載される。
８．９．４ 入力デバイスおよび出力デバイス
本発明のシステムはまた、種々の入力デバイス１８０６および出力デバイス１８０７を含む。プロトコル実行システムなどのある実施形態において、ある入力デバイスおよび出力デバイスは、人間‐機械インターフェイス（ＨＭＩ）制御装置を用いて制御されてもよい。
８．９．５ ソフトウェア
本発明のシステムのそれぞれは、ソフトウェアを含む。格納媒体に提供されるソフトウェアは、本発明の一態様である。適切な格納媒体の例としては、磁気格納装置、光学格納装置、相変化メモリ、ホログラフィック格納装置、分子メモリ格納装置、バッテリまたはコンデンサに支援されたＳＲＡＭおよびフラッシュメモリ格納装置が挙げられる。ソフトウェアは、メモリおよび／またはプロセッサに読み込まれてもよい。本発明のソフトウェアがメモリおよび／またはプロセッサに存在するシステム、および／または格納媒体もまた、本発明の態様である。
本発明のソフトウェアは、Ｖｉｓｕａｌ Ｃ、Ｊａｖａ（登録商標）および／またはＰｙｔｈｏｎなどの種々のプログラミング言語のいずれで書かれてもよい。システムは、プロセッサによる実行のために高級言語から中間言語に液滴処置および他の命令を翻訳するためのインタプリタを含んでもよい。あるいは、本発明によって書かれたソフトウェアは、コンパイラを用いて機械言語にコンパイルされてもよい。本発明の言語用のソフトウェアインタプリタおよびコンパイラ自体は、本発明の新規な態様である。したがって、インタプリタおよび／またはコンパイラを含むデータ格納装置、メモリおよびプロセッサのすべての形態が、本発明の態様である。
システムは、任意の数の液滴処置を伴う種々のプロトコルを実行するようにプログラムされうる。複数の液滴は、１つの液滴マイクロアクチュエータにおいて独立かつ同時に処置されうる。複数の液滴を並列に独立して処置する性能は、一連の基本的なマイクロ流体の命令として複合プロトコルの実行を可能にする。システムは、拡張可能であり、液滴マイクロアクチュエータ当たり、数十、数百、数千またはそれ以上の並列な液滴処置を制御してもよい。たとえば、いずれの瞬間においても、液滴マイクロアクチュエータにおける最大数までのあらゆる制御電極が、液滴操作において連動されてもよい。
システムは、ユーザがプロトコルの実行に関する命令を入力することを可能にするようにプログラムされうる。既存のプロトコルは、ユーザの要件に基づいて監視かつ調整されてもよい。１つまたは複数の工程の結果が１つまたは複数の次の工程の選択を決定する複合プロトコルを実装することができる。たとえば、ある測定された結果が陽性である液滴は、さらなる処理のために輸送されてもよく、結果が陰性である液滴は、廃棄されてもよい。またはその逆であってもよい。
８．９．６ 可搬性
図１９Ａおよび図１９Ｂを参照すると、一部の実施形態において、分析機器は、手持ち式デバイス１９００などの携帯可能なデバイスとして提供される。図１９Ａは、手持ち式デバイス１９００の外部を示し、図１９Ｂは、液滴マイクロアクチュエータ（図示せず）の挿入のためのスロット１９０２、液滴マイクロアクチュエータから光信号を検出するための光センサ１９０４および蓋ラッチ１９０６を示している。蓋ラッチ１９０６は、蓋が開いているかまたは閉じているかを示すためにシステムに連結されてもよい。携帯可能な分析機器はまた、卓上デバイスであってもよいことを想定している。本発明の液滴マイクロアクチュエータシステムの可搬性は、迅速な診断のために、診療所、手術室、救急処置室、小さな研究室および現場（緊急応答チーム、事故、災害、戦場、生物テロ現場など）における種々の設定において用いられる治療箇所または試料収集点を容易にし、危機的な状況において、迅速なターンアラウンド時間をもたらすことができる。
８．１０ ユーザインターフェイス
液滴制御システムは、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴操作の制御、センサの制御、および、存在する場合には、液滴制御システムに関連付けられる他のハードウェアの制御を行うために、液滴制御インターフェイスを表示するようにプログラムされる液滴制御ソフトウェアを含む。システムはまた、液滴操作および／またはセンサ操作などの液滴マイクロアクチュエータシステム機能を制御するための一連のソフトウェアまたはコンピュータによる使用可能な命令の作成を容易にするソフトウェアを含んでもよい。
図２０に示されているように、システムは、ユーザインターフェイス２０００を含んでもよい。ユーザインターフェイスは、２００６年６月３０日出願の「Systems and Methods for Droplet Microactuator Operations」というタイトルの関連する米国特許仮出願第６０／８０６，４１２号にさらに記載され、その開示内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。ユーザインターフェイスは、液滴マイクロアクチュエータのマップ２００１、好ましくは相互作用マップを表示してもよい。マップは、本発明による流体投入プロトコルを行うために、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴に処置を施すために、液滴マイクロアクチュエータと直接相互作用するように用いられてもよい。
マップは、液滴マイクロアクチュエータ機能および関連ハードウェアを制御するためのサブルーチンを開発して記録するために、プログラミングモードにおいて仮想液滴２０１１に処置を施すための仮想モードにおいて用いられてもよい。
８．１０．１ 液滴制御システムおよびユーザインターフェイス
液滴制御システムは、液滴制御ソフトウェアを含む。液滴制御ソフトウェアは、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴操作の制御、センサの制御、および、存在する場合には、液滴制御システムに関連付けられる他のハードウェアの制御を行うために、液滴制御インターフェイスを表示するようにプログラムされる。液滴制御ソフトウェアは、ユーザがソフトウェアによって駆動されたユーザインターフェイスを介して、液滴マイクロアクチュエータにおいて液滴に処置を施すことを可能にする。上述したように、そのようなインターフェイスの例は、図２０に示されている。中でも、ユーザインターフェイスは、ユーザが液滴マイクロアクチュエータに関する情報を見ることを可能にしてもよい。ユーザインターフェイスはまた、ユーザによる入力を容易にして、液滴マイクロアクチュエータおよび関連付けられたセンサなどの関連付けられたデバイスの機能を制御してもよい。
液滴マイクロアクチュエータにおける液滴操作の制御に対して、ソフトウェアは、プログラムされ、システムは、中でも液滴マイクロアクチュエータにおける制御電極および参照電極を駆動して、液滴操作を行うように構成される。液滴操作は、上記の８．８節にさらに記載され、電圧を選択した電極に印加することによって行われる。ソフトウェアおよびシステムは、電極に関連つけられる継電器の操作を制御することによって、選択した電極の作動を制御するようにプロセッサにソフトウェアを読み込むことを可能にするように構成されてもよい。
図２０に示されているように、ユーザインターフェイス２０００は、出力デバイスに表示され、液滴マイクロアクチュエータ設計のグラフィカル表示またはマップ２００１を示すようにプログラムされてもよい。マップ２００１は、制御電極および／または貯槽のそれぞれの位置を画定するマトリックスまたは他の構造に基づいてもよい。マップの構成要素は、外観、たとえば、形状、色、明るさ、シンボル、アイコンなどによって区別されてもよい。たとえば、図２０に表示されるマップにおいて、非活性化された液滴処置電極２００２は、第１の色（灰色など）で示され、活性化された液滴処置電極および貯槽２００３は、第２の色（赤色など）で示され、非活性化された貯槽２００４は、第３の色（青色など）で示される。
簡単な実施形態において、マトリックスは、各電極および／または貯槽に関して列および行を特定する制御ファイルにおいて定義される。制御ファイルが取り込まれると、システムは、マトリックス定義において読み出し、ユーザインターフェイスにおけるマトリックスの対応するマップを表示する。
インターフェイスは、マップの構成要素に関する情報を表示してもよく、マップはまた、制御ファイルに格納されてもよい。一実施形態において、ユーザがマウスポインタを重ねるか、選択するかまたは他の電子的な特定を行うと、システムは、構成要素に関する情報を表する。表示される情報としては、たとえば、以下の情報の一部またはすべてを含みうる：
・たとえば、液滴操作電極、試薬貯槽、試料貯槽など構成要素タイプ；
・たとえば、電極の列挙、接地、ピン配列数など電気接続性情報；
・たとえば、多角形の電極配置における隣接関係；
・ユーザインターフェイスにおいてマップをレンダリングするための代表的な幾何学的形状；
・設計の注記および／または他の注釈；
・部品番号；
・列および／または行の位置。
システムはまた、各電極の活性化の履歴を記録してもよく、その結果、ユーザは、電極が活性化された回数を追跡してもよい。履歴情報は、たとえば、電極の上にマウスポインタを重ねるか、または電極を選択することによって表示されてもよい。システムは、すべての電極に関して同時に表示されうるユーザ命令履歴情報から入力を受け入れるようにプログラムされてもよい。
ユーザとの相互作用を容易にするために、マウスポインタを重ねた電極または選択された電極２００２または他の構成要素もまた、液滴マイクロアクチュエータマップ上で電極または他の構成要素を強調させてもよい。この機能は、実際に選択して液滴マイクロアクチュエータ構成要素を活性化する前に、液滴マイクロアクチュエータ操作を直接的に制御しているユーザが、液滴マイクロアクチュエータ構成要素上にマウスポインタを重ねることによって各電位工程に関する情報を検索することを可能にする。システムはまた、ユーザが２つの間を区別することができるように、マウスポインタを重ねた電極および選択された電極を異なる方法で強調するようにプログラムされてもよい。
システムは、ユーザが操作モードを選択すること、たとえば、液滴マイクロアクチュエータを制御するためのプログラムを書くことができる仮想またはプログラミングモードと、液滴が液滴マイクロアクチュエータにて直接的に制御される操作モードとの間で選択することを可能にするための手段２００７を含んでもよい。
システムは、ユーザが表示のために液滴マイクロアクチュエータ設計を選択することを可能にするための手段２０１２を含んでもよい。あるいは、液滴マイクロアクチュエータ設計を特定するデータは、システムに液滴マイクロアクチュエータアセンブリまたはカートリッジを連結する際に、システムによってアクセス可能な液滴マイクロアクチュエータアセンブリまたはカートリッジの構成要素として含まれてもよい。
一部の設計において、２つ以上の電極が、同一の電気出力に連結されてもよいことを留意すべきである。そのような設計を用いて、液滴マイクロアクチュエータの設計を簡略化することができる。そのような設計において、共通集合から１つの電極を選択するか、または１つの電極の上にマウスポインタを重ねることによって、集合におけるすべての電極の選択、強調および活性化という結果を生じてもよい。
したがって、一実施形態において、システムは、ユーザがマイクロアクチュエータマップ２００１において非活性化された電極２００２を選択する場合に、システムが、電極を活性化するようにプログラムされる。たとえば、システムは、マップにおける電極の表示をクリックすることによって、液滴マイクロアクチュエータにおける対応する実際の電極に電圧を印加させ、それにより、選択された電極を活性化するようにプログラムされて構成されてもよい。このように、ユーザは、インターフェイスを用いて、液滴マイクロアクチュエータにおいて液滴に直接処置を施すことができる。
液滴制御システムは、ユーザが、一連の隣接する電極を順次クリックすることによって、液滴を輸送することを可能にしてもよい。同様に、システムは、液滴マイクロアクチュエータマップにおいて、仮想オンスクリーン液滴２０１１を選択して、所望の位置の仮想電極に液滴をドラッグすることによって、ユーザが液滴を輸送することを可能にしてもよい。さらに、システムは、液滴マイクロアクチュエータマップにおいて、仮想オンスクリーン液滴２００１を選択して、所望の位置の仮想電極をクリックすることによって、ユーザが液滴を輸送することを可能にしてもよい。他の液滴マイクロアクチュエータ構成要素も同様に、ユーザインターフェイスによって制御されてもよい。
システムは、液滴マイクロアクチュエータ構成要素に電子的に連結される電気制御線２００５の表示を表示するようにプログラムされてもよく、その結果、ユーザが、構成要素上にマウスポインタを重ねるか、および／または構成要素を選択すると、システムは、構成要素にマップされる結果として作動される電気信号を強調する。
液滴マイクロアクチュエータは、たとえば、顕微鏡および映像捕捉デバイスを用いて、視覚的に監視されてもよい。ユーザインターフェイスは、映像捕捉デバイスから液滴マイクロアクチュエータの実時間画像を表示するようにプログラムされてもよい。さらに、液滴マイクロアクチュエータマップは、実時間液滴マイクロアクチュエータ画像上に重ねられてもよく、その結果、ユーザがユーザインターフェイスを介して液滴マイクロアクチュエータと相互作用するときに、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴操作を可視化することができる。
同様に、システムは、システムによって制御されている液滴マイクロアクチュエータにおける液滴の実際の挙動を表示する液滴マイクロアクチュエータマップにおいて仮想の液滴２０１１を表示するようにプログラムされてもよく、および／またはシステムは、液滴マイクロアクチュエータがシステムによって直接制御されないとしても、液滴マイクロアクチュエータにおける予測された挙動を表示する液滴マイクロアクチュエータマップにおいて仮想の液滴２０１１を表示するようにプログラムされてもよい。
システムはまた、「反転出力」２００６操作を行うようにプログラムされてもよい。典型的な操作において、液滴は接地電圧／接地線に常に接続される。「反転出力」操作において、液滴が高電圧にあり、電極が接地電位に設定することによって活性化されるように信号が反転される。言い換えれば、「反転出力」操作は、信号の極性を切り替える。
システムはまた、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴操作の制御ならびに液滴マイクロアクチュエータおよび関連ハードウェアの他の機能の制御のための一連のソフトウェアまたはコンピュータによる使用可能な命令の作成を容易にしてもよい。ソフトウェア命令は、たとえば、試料の処理および分析ならびに分析の結果の出力を行うプロトコルを実行するための命令を含んでもよい。システムは、実際の液滴マイクロアクチュエータと相互作用することなく、センサ構成要素などの液滴マイクロアクチュエータ機能および関連構成要素を制御するためのプログラムを書くことを容易にしてもよい。
システムは、たとえば、ユーザが液滴マイクロアクチュエータによる実行のための一連の命令に関してプログラムの作成を可能にするための手段を含みうる。適切な命令の例としては、以下のものが挙げられる：
・活性化される電極を特定するための「オン」；
・工程が実行される速度、たとえば、電極の活性化／非活性化のタイミングを設定するための「頻度」；
・所定の期間、命令を中止することを可能にするための「待機」；
・プログラムにおいて工程をループするための「ループ」；
・出力に印加される電圧を設定するための「電圧」。
命令は、液滴処置を施し、システムの他の態様を制御するために必要な命令を含むバイトコード言語として提供されうる。システムによって準備された命令は、アセンブリ言語に記録され、バイトコードに組み込まれうる。バイトコードは、本発明のシステム、たとえば、実行用のプロトコル実行システムに取り込まれうる。システムは、たとえば、プログラム実行システムにおいて、実行のための言語を解釈するためのソフトウェアインタプリタを含んでもよい。
好ましい実施形態において、システムは、サブルーチンから命令を追加、挿入、更新、改変または消去することができる一連のボタンまたはアイコン２００８を表示する。ボタンまたはアイコンは、適切であれば、命令に関連付けられるパラメータのエントリのためのフィールド２００９が付随してもよい。たとえば、「追加」ボタンをクリックすることによって、サブルーチンの終わりにコマンドを追加することができる。「挿入」ボタンをクリックすることによって、サブルーチン内にコマンドを挿入することができる。「改変」ボタンをクリックすることによって、サブルーチンに存在するコマンドを修正することができる。「消去」ボタンをクリックすることによって、コマンドを消去することができる。さらに、ディスプレイフィールド２０１０は、編集可能であってもよく、表示コード用、入力コード用および／または編集コード用に含まれてもよい。
システムは、液滴マイクロアクチュエータマップにおけるサブルーチンのシミュレートされた実行を表示してもよく、選択されたコマンドシリーズの影響の視覚表示をユーザに出力する。言い換えれば、シミュレートされた実行モードにおいて、ソフトウェアは、サブルーチンの工程を実行するが、電気信号を液滴マイクロアクチュエータに送信しない。好ましいシミュレーションモードにおいて、シミュレートされた液滴がスクリーン上に表示され、プログラムの実際の効果をユーザに示す。このように、ユーザは、液滴マイクロアクチュエータとの相互作用を必要とすることなく、サブルーチンのトラブルを容易に解決することができる。
８．１０．２ プロトコル実行システムおよびユーザインターフェイス
本発明は、プロトコル実行システムを提供する。プロトコル実行システムは、流体の投入、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴操作および／または液滴マイクロアクチュエータおよび関連ハードウェアの他の機能の制御のための一連のソフトウェア命令の実行を容易にするようにプログラムされるプロトコル実行システムを含む。プロトコル実行システムは、自立システム、典型的には、携帯可能なシステムまたは手持ち式システムでプロトコルを実行するための能力を提供する。
プロトコル実行システムは、液滴マイクロアクチュエータおよび任意の関連付けられた構成要素を制御するように構成される。予めプログラムされた命令は、システムおよび任意の関連付けられた構成要素を制御する制御装置に読み込まれてもよい。プロトコル実行システムは、ユーザがプロセッサに入力を提供し、プロセッサから出力を得ることを可能にするための種々の構成要素を含んでもよい。人間‐機械インターフェイスは、ＨＭＩボードを用いて容易にされてもよい。ＨＭＩボードは通常、制御装置と、プロセッサと入力デバイスおよび出力デバイスとを電子的に連結するためのバスおよびポートなどの種々の電子構成要素とを含む。
８．１１ センサ
液滴マイクロアクチュエータおよびシステムは、物理特性、化学特性および電気特性などの液滴特性を測定するためのセンサを含む。一部の実施形態において、センサは、液滴および／または液滴からの信号と相互作用するように配置される検知要素と、センサから測定可能な信号への出力を変換する変換要素と、信号をプロセッサに送信するための手段とを含む。プロセッサは、信号をユーザに認識可能な出力に変換してもよい。
センサ要素は、液滴マイクロアクチュエータの構成要素であってもよく、たとえば、上部プレートまたは下部プレートに取付けられてもよく、上部プレートと下部プレートとの間の液滴マイクロアクチュエータの内部空間に位置決めされてもよく、または液滴マイクロアクチュエータの一体構成要素として、たとえば、上部プレートまたは下部プレートの一体構成要素として作製されてもよい。別の実施形態において、センサ要素は、液滴マイクロアクチュエータに対して外側にあってもよいが、液滴マイクロアクチュエータからの信号、たとえば、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴からの信号をセンサが受信することができるようにする様式で、システム内に配置されてもよい。たとえば、光子を検知するためのセンサ要素は、液滴マイクロアクチュエータにおいて液滴から光子を受信するように配置されてもよい。システムが、液滴から光子を伝送することができる上部プレートを有する場合には、センサは、光子を検知するために上部プレートに近接して配置されてもよい。システムが、液滴から光子を伝送することができない上部プレートを有する場合には、上部プレートには、光子を伝送することができる窓が備えられてもよく、センサは、光子を検知するための窓に近接して配置されてもよい。
センサ構造の具体例が図２１Ａ〜図２１Ｄに提供されており、センサは、下部プレート２１０２、上部プレート２１０４および電極２１０６に関連して設けられてもよい。図２１Ａは、吸収度を監視するために、ＬＥＤ２１０８およびフォトダイオード２１１０を含む構成の使用を含んでもよい光センサを示す。図２１Ｂは、光電子増倍管（ＰＭＴ）２１１２の使用を含んでもよい発光センサを示す。図２１Ｃは、電流が流れていない状態下で電位の測定に基づいて典型的に機能する電位差測定センサ２１１４を示す。図２１Ｄは、電位が２つの電極の間に印加される場合に、電流の生成によって典型的に機能する電位差測定センサ２１１６を示す。
本開示において他の箇所で記載したように、液滴マイクロアクチュエータは、ユーザによってシステムに連結されうる別個の構成要素として供給されてもよいことを留意することが重要である。センサが液滴マイクロアクチュエータに対して外部にある場合には、それらのセンサは、一部の実施形態において、液滴マイクロアクチュエータシステムへの連結の際に、検知要素が液滴マイクロアクチュエータからの信号を検出するように適切に整列されるように整列されてもよい。たとえば、検知工程が、液滴プロトコルの過程で実現される場合には、光子センサが、液滴マイクロアクチュエータにおける適切な窓および／または適切な位置と整列される。
種々の実施形態において、液滴マイクロアクチュエータおよび／またはシステムは、検知の１つまたは複数のタイプの実装を可能にするセンサ構成要素を備えるように構成されてもよい。
適切な検知タイプの例としては、物理的検知、電気化学的検知および光学検知が挙げられる。
８．１１．１ 物理的手法
本発明の液滴マイクロアクチュエータおよび／またはシステムは、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴の特性を検知するように配置された１つまたは複数の物理センサを含んでもよい。物理センサの例としては、温度および液滴サイズ（たとえば、液滴の設置面積を温度測定することによる）が挙げられる。
８．１１．２ 電気化学的手法
本発明の液滴マイクロアクチュエータシステムは、種々の光検出手法を利用する。本発明の液滴マイクロアクチュエータおよび／またはシステムは、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴の特性を検知するように配置された１つまたは複数の電気化学センサを含んでもよい。適切な電気化学検知タイプの例としては、電位差測定センサ、電流測定センサ、電解電量センサおよび導電性測定センサが挙げられる。センサの種々の構成要素（たとえば、電極、対電極、参照電極など）は、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴と接触可能にするように配置された同一の基材または別個の基材に設けられてもよい。たとえば、液滴マイクロアクチュエータが２つの実質的に平行な基材を含む実施形態において、センサアセンブリの種々の構成要素は、基材の一方または両方に含まれてもよい。一部の実施形態において、電気回路が、測定可能な電圧に信号を増幅するために用いられてもよい。これらの手法の種々の態様については、次の節に記載される。
８．１１．２．１ 電流測定センサ
液滴マイクロアクチュエータデバイスまたはシステムは、電流測定センサと、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴を電源およびセンサに接触するように輸送するために配置された電源とを含み、液滴を流れる電流の検出を可能にすることができる。
８．１１．２．２ 電位差測定センサ
液滴マイクロアクチュエータデバイスまたはシステムは、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴を電位差測定参照電極に接触するように輸送するために配置された電位差測定参照電極を含み、液滴の平衡電極電位の測定を可能にすることができる。
８．１１．３ 光学手法
本発明の液滴マイクロアクチュエータシステムは、種々の光検出手法を利用する。
本発明の液滴マイクロアクチュエータおよび／またはシステムは、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴の特性を検知するように配置された１つまたは複数の光センサを含んでもよい。光検知の例としては、吸光度、化学発光および蛍光が挙げられる。光センサは、一部の場合において、たとえば、蛍光の励起または吸光度測定のための適切な光源を付随してもよい。これらのセンサは、液滴マイクロアクチュエータに取付けられる構成要素として、または液滴マイクロアクチュエータの一体の部分として、たとえば、半導体作製技術を用いて設けられてもよい。
光センサは、光信号を指向するように結成された種々の光学素子を含んでもよく、光画像を分析するための種々の画像プロセッサに連結されてもよい。たとえば、液滴サイズは、液滴の画像を処理することによって検出されてもよい。同様に、液滴サイズは、液滴の熱設置面積を測定することによって画定されてもよい。電気センサはまた、たとえば、液滴設置面積のインピーダンスを測定することによって、液滴サイズを測定するために用いてもよい。
一部の場合において、液滴マイクロアクチュエータの表面は、光検知を強化するように改変されてもよい。たとえば、反射表面仕上げを備えた電極が、液滴の光学測定を容易にするために用いられてもよい。反射電極の使用により、吸光度測定のために経路長を増大し、また、反射分光法と適合可能である。ＰＣＢなどの自動蛍光基材の場合には、非蛍光コーティングによる液滴マイクロアクチュエータ表面のコーティングは、非蛍光検出ゾーンを提供するために用いられうる。
これらの手法の種々の態様については、次の節に記載される。
８．１１．３．１ 光センサ
液滴マイクロアクチュエータデバイスまたはシステムは、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴を光源および光センサに近接するように輸送可能にするように配置される光源および光センサを含む吸光度検出構成要素を含んでもよく、その結果、液滴を通過する光またはエネルギーが、光センサによって検出されうる。
液滴マイクロアクチュエータデバイスまたはシステムは、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴を光センサまたは光子センサに近接するように輸送可能にするように配置される光センサ（フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管など）または光子センサ（光子計数光電子増倍管など）を含む化学発光検出構成要素を含んでもよく、その結果、液滴中の化学種によって発せられる光子が、光センサまたは光子センサによって検出されうる。
８．１１．３．２ 蛍光センサ
液滴マイクロアクチュエータデバイスまたはシステムは、必要に応じて、適切なフィルタを備えた光励起源と、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴を光励起源および光センサまたは光子センサに近接するように輸送可能にするように配置される、必要に応じて適切なフィルタおよびダイクロイックミラーを備えた光センサ（フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管など）または光子センサ（光子計数光電子増倍管など）とを含む蛍光検出構成要素を含んでもよく、その結果、液滴中の蛍光種によって発せられる光子が、光センサまたは光子センサによって検出されうる。
８．１１．３．３ 表面プラズモン共鳴
別の実施形態において、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検知が、抗体と任意の標的検体との間の相互作用を検出するために採用される。ＳＰＲ検知は、そのような相互作用を検出して定量化するのに有用である。典型的には、反応体対（すなわち、抗体または検体）において、一方の反応体が、ガラス基材上のＳＰＲ活性金表面上に固定化される。反応体は、液滴に基づく手法を用いて固定化されてもよく、液滴は、その上に反応体を堆積するために、金表面と接触するように輸送される。他の反応体を含む液滴は、固定化された反応体と接触するように輸送されてもよく、それにより、固定化された反応体に他の反応体を結合することを可能にする。
光（たとえば、可視光または近赤外光）が、ガラス基材を通って、表面プラズモン共鳴状態に近い角度および波長で金表面上に指向される場合には、金の光反射率は、金表面または金上の薄いコーティングにおける生体分子の存在によって非常に敏感に変化する。光応答は、金表面付近の伝導電子の効率的で集合的な励起を伴うという事実のために、かなり敏感である可能性がある。溶液相反応体と固定化された反応体との間の結合程度は、この反射率の変化を監視することによって観察されて定量化されてもよい。本発明はまた、その上に金表面と、金表面と液滴とを接触させるのに十分な液滴処置の実行を可能にするように配置される電極の経路またはネットワークとを含む液滴マイクロアクチュエータを含む。さらに、本発明は、そのような液滴マイクロアクチュエータを含み、表面プラズモン共鳴状態に近い角度および波長で、金表面に光を指向することができる光源をさらに含むシステムを含む。同様に、本発明は、そのような液滴マイクロアクチュエータを含み、金表面の反射率における変化を検出するための手段をさらに含むシステムを含む。さらに、本発明は、ＳＰＲプロトコルの一部またはすべてを行うほど十分な試薬をその上に投入した液滴マイクロアクチュエータデバイスおよび／またはシステムを含む。
８．１１．３．４ ラマン分光法
一実施形態において、液滴マイクロアクチュエータおよび／またはシステムは、ラマン分光検出機能を含む。一般に、この機能は、ラマン信号生成光源、ラマン信号検出表面およびラマン分光計を含む。
ラマン信号生成光源は、たとえば、単色光であってもよく、たとえば、可視波長範囲における励起を有する光源であってもよい。光源は、液滴マイクロアクチュエータにおけるラマン信号検出表面を照射するように配置される。表面は、たとえば、液滴マイクロアクチュエータの表面および／または液滴マイクロアクチュエータにおける粒子の表面であってもよい。たとえば、表面は、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴内の粒子の表面であってもよい。液滴マイクロアクチュエータは、ラマン信号検出方法を採用する種々のプロトコルを実行するために、そのような粒子を含む液滴を用いて、液滴操作を行う機能を有してもよい。
ラマン信号検出表面は、ラマン散乱に適した任意の表面を含んでもよい。例としては、金または銀の表面が挙げられる。表面は、粗くてよい。液滴マイクロアクチュエータは、一部の場合において、異なるラマンレポータ分子によって標識化される表面を含む複数の金属表面（たとえば、液滴マイクロアクチュエータ、ビーズ、粒子、ナノ粒子などの表面）を含んでもよい。表面に結合された抗体または検体は、ラマンレポータ分子の特性ラマンスペクトルによって特定されてもよい。ラマン検出表面は、たとえば、電極、電極上のコーティングまたは任意のチップ表面における層であってもよい。操作において、液滴は、ラマン検出表面上に液滴操作を用いて位置決めされ、レーザビームによって照射される。照射された表面からの散乱光は、分光計によって収集される。別の実施形態において、ラマン検出表面は、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴内の粒子であってもよい。粒子は、たとえば、銀または金のナノ粒子などのナノ粒子であってもよい。たとえば、銀ナノ粒子は、単分散コロイド懸濁液として調製されてよく、液滴操作を用いて液滴マイクロアクチュエータにおいて処置を施されうる。一部の実施形態において、粒子は、たとえば、塩化ナトリウムまたは硝酸ナトリウムなどの無機塩類、硝酸または塩酸などの酸、またはポリ−Ｌ−リジンなどの有機アミンなどの凝集添加物を用いてクラスタに凝集されてもよい。これらの凝集添加物は、たとえば、液滴操作を用いて試料および粒子を含む液滴と合わせてよく、凝集添加物を含む液滴を粒子および試料を含む液滴と合わせる。ラマン分光領域に関連付けられる液滴マイクロアクチュエータの表面は、背景蛍光信号を最小限に抑えるように選択される。
ラマン分光計は、試薬液滴から発せられたラマン散乱光を検出するために配置される。ラマン分光計は、液滴マイクロアクチュエータにおける試料液滴から発せられるラマン散乱光を検出可能にする様式で、液滴マイクロアクチュエータに対して外部に配置される液滴マイクロアクチュエータと一体であってもよい。
操作において、その上にラマン検出表面を有する液滴マイクロアクチュエータが提供される。検体は、液滴操作を用いてラマン検出表面に結び付けられる。表面は、ラマン信号生成光源によって照射される。検体の正体および／または量を決定するために、予想された信号と相関されるラマン散乱光信号が検出される。
別の実施形態において、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）が、抗体と標的検体との間の相互作用を検出するために採用される。一般に、この方法は、検体、特異結合部材、ラマン活性標識を含み、液滴マイクロアクチュエータのビーズまたは表面などの表面と接触状態にあり、表面増強ラマン散乱を誘発することができる試料液滴における検体媒介結合事象を監視することを伴う。試料液滴は、検出可能なラマンスペクトルを発するために、検査混合物においてラマン活性標識を生じるのに十分な放射で照射される。検出された表面増強ラマン散乱スペクトルにおける差は、検査混合物に存在する検体の量に依る。試料液滴における検体の存在および／または量は、ラマン散乱スペクトルを監視することによって決定されてもよい。本発明は、ＳＥＲＳプロトコルの一部またはすべてを行うほど十分な試薬をその上に投入した液滴マイクロアクチュエータデバイスおよび／またはシステムを含む。
関連実施形態において、本発明は、液滴マイクロアクチュエータにおける検体媒介配位子結合事象を監視することによって、試料液滴中の検体の存在または量を決定するための方法を提供する。この方法は概して、ラマン活性標識に結合される抗体と検体を反応させることを含む。反応は、液滴マイクロアクチュエータにおいて液滴を用いて行われ、存在する場合には、検体に対する抗体の特異結合を可能にする状態下で行われ、試料液滴における第１の複合体を生じる。第１の複合体を順次または同時に、表面増強ラマン散乱を誘発することができ、検体に対して特異的な抗体をその上に接着する表面と接触させ、第２の複合体を形成する。第２の複合体は、複合体においてラマン活性標識を生じるのに十分な放射を用いて照射され、検出可能なラマンスペクトルを生成する。表面増強ラマン散乱スペクトルにおける差は、検査混合物に存在する検体の存在および／または量を表す。
種々の表面は、本発明の液滴に基づくＳＥＲＳプロトコルに適していてもよい。例としては、粗面化した金属電極、凝集体、膜、形態学的に異なる金属島、パーコレーション閾値付近の半連続膜および真空蒸着ナノ構造金属膜が挙げられる。したがって、本発明は、ＳＥＲＳ基材を含む液滴マイクロアクチュエータを含む。液滴マイクロアクチュエータは、液滴がＳＥＲＳ基材と接触するように電極の経路またはネットワークに沿って輸送されてもよいように適切に配置される。
本発明のＤＮＡ検出方法において、ラマン標識が用いられてもよい。標識は、一意のプローブ配列に共有結合的に付着される非配列特異的挿入剤または特異的標識であってもよい。負に帯電する標識は、クエン酸表面層と銀のナノビーズのように、負に帯電した表面と標識との結び付きを容易にするために、スペルミンなどの電荷中和剤の使用を必要とする場合がある。凝集剤もまた、信号を改善するために用いられてもよい。スペルミンもまた、凝集剤として機能しうる。
８．１１．３．５ 複数センサの可能性
好ましいセンサは、吸光度、蛍光、化学発光を検出するためのセンサ、ならびに電位差測定センサ、電流測定センサおよび導電性測定センサである。本発明の液滴マイクロアクチュエータデバイスおよび／またはシステムは、これらの検出性能のうちの１つまたは複数を含む。一実施形態において、液滴マイクロアクチュエータは、１つの液滴マイクロアクチュエータにおけるこれらの検出方法のうちの２つ以上を容易にするための構成要素を含む。別の実施形態において、液滴マイクロアクチュエータは、１つの検出モジュールを含むが、システムは、モジュールを用いて２つ以上の検査を行うようにプログラムされる。この実施形態において、検査を必要とする処理済みの試料液滴は、検査用の所定の位置の順次移動される。したがって、１つのセンサが用いられる場合、複数の試料が検出スポットにおいて多重化されてもよい。
８．１１．４ センサ電子機器
検出性能は、センサ基板の１つまたは複数の構成要素として提供されてもよい。センサ基板は、１つまたは複数のセンサを含んでもよい。センサ基板は、液滴から受信された信号の調整または増幅のために、増幅器、Ａ／Ｄ変換器、読み出し回路などのさらなる電子回路を含んでもよい。センサ基板は、システムの可動構成要素のためのモータの制御などの検出プロトコルの液滴マイクロアクチュエータ構成要素以外の制御要素または他の要素を含んでもよい。
一実施形態において、センサ基板は、液滴操作表面に近接する位置の内外に磁界源を移動し、それにより、液滴マイクロアクチュエータに磁界を印加したり液滴マイクロアクチュエータから磁界を除去したりするサーボモータを制御するためのサーボモータ制御装置を含む。この実施形態は、磁気応答性材料に処置を施すのに有用である。センサ基板はまた、限定されないが、プロセッサに基板のセンサ構成要素または制御構成要素を電子的に連結するために必要な要素をはじめとする電源要素および通信要素も含んでもよい。
光検出位置は、光検出を容易にする専用コーティング、電極設計または他の特徴部を含んでもよい。たとえば、検出スポットは、光学測定用の背景表面としてその操作を容易にする専用パッドおよび／またはコーティングを含んでもよい。
核酸増幅用途などのある実施形態において、好ましい光検出方法は、蛍光の定量化である。そのような実施形態において、検出スポットは、マイクロアクチュエータ基材またはマイクロアクチュエータ基材上に配置されたコーティングに存在する背景蛍光を遮蔽するように選択されてもよい。たとえば、一実施形態において、マイクロアクチュエータは、プリント回路基板基材から構成され、検出スポットは、センサから基材の背景蛍光を遮蔽する金パッドから構成され、それにより、パッド上に位置決めされる液滴の蛍光測定を容易にする。パッドは、基材上に直接的に配置されるか、または基材上に配置される介在層に配置される金属層に形成されてもよい。
好ましくは、パッドが形成される金属層が、著しい背景蛍光を呈する任意の層の一番上に配置される必要がある。一実施形態において、パッドは、液滴を制御するための電極と同一の金属層に形成されるプリント回路基板基材上に直接的に配置される。この実施形態において、誘電材料（背景蛍光を呈してもよい）は、金属層上に配置されてもよく、検出パッドから選択的に除去されるが、制御電極からは除去されない。
したがって、背景蛍光の低い検出スポットは、検出パッドの上の蛍光材料の選択的除去およびパッドの下に位置する蛍光材料の光学的遮蔽の組み合わせによって達成されてもよい。パッドは好ましくは、他の液滴マイクロアクチュエータ機能との干渉を最小限に抑えるように設計される。上述した実施形態において、パッドは、制御電極と同一の金属層であるが、制御電極と箱別に電気的に別個であるように形成されてもよい。したがって、パッドは、
８．１１．５ 検出手法
本発明は、液滴の信号または属性を検知／検出するための種々の手法を提供する。これらの手法の多くは、本明細書において他の箇所に記載される。本節は、種々の設定に有用であると考えられるさらなる手法を記載する。
本発明の液滴マイクロアクチュエータ手法の利点としては、特定の分析にて反応工程を分断する能力が上げられる。多くの生化学的分析は、色、光または他の検出可能な量を生成するための共通の最終反応を用いる。本発明の液滴に基づくプロトコルは、検出点における最終反応試薬を含む液滴と分析液滴とを合わせるために用いられうる。反応工程の１つが速度限界である場合に、検出工程の分断は、個別に最適化することを可能にし、時間における工程の分離は、より大きな柔軟性を提供する。たとえば、化学発光分析は典型的には、塩基のｐＨでよりよい結果を有する。酸のｐＨ分析で最適である分析の場合には、反応は、酸のｐＨで最初に完了することができ、反応の光生成態様が塩基のｐＨで行われうる。
本発明の液滴マイクロアクチュエータは、速度力学的反応の研究において有用である。試料液滴は、反応が起こっている貯槽から定期的に分配されることができる。液滴は次に、反応の時間経過を決定するように個別に分析されうる。液滴は、実時間で分析されてよく、または後の分析のための別の試薬と混合されてよい。エレクトロウェッティングはまた、高速反応力学の研究のために液滴を迅速に混合するために用いられうる。
液滴の粘性における変化は、液滴の内部の化学反応の状態を分析するための手段として測定されうる。たとえば、凝固剤が、血液の液滴に加えられてよく、続いて液滴の輸送および液滴の輸送の容易さを監視する。より大きな凝固度は、凝固度の尺度として用いられるときに、検出されうる液滴の輸送をさらに困難にする。
好ましいセンサとしては、吸光度、蛍光および化学発光などの光信号を検知するための光センサ、および、電位差測定特性、電流測定特性、導電性測定特性などの電気化学特性を検知するための電気化学センサが挙げられる。したがって、本発明の液滴マイクロアクチュエータシステムは、これらの特性のうちの１つまたは複数の検出を容易にするように配置される構成要素を含む。一実施形態において、これらの特性のうちの２つ以上は、１つの液滴マイクロアクチュエータにおける１つまたは複数の液滴で検出されるか、または１つの液滴マイクロアクチュエータシステムを用いて他の方法で達成される。別の実施形態において、液滴マイクロアクチュエータは、特定のタイプの１つのセンサを含み、システムは、センサを用いて２つ以上の検査を行うようにプログラムされる。この実施形態において、検査を必要とする処理済みの試料液滴は、検査用の所定の位置の順次移動される。すなわち、検出を可能にするために必要なセンサに十分に近接するように移動される。したがって、複数の試料は、１つのセンサによる検出のための検出スポットにわたって多重化されてもよい。複数のセンサタイプが、この手法を用いて１つの液滴マイクロアクチュエータに供給されてもよい。
液滴マイクロアクチュエータシステムは、一実施形態において、検出のために液滴マイクロアクチュエータに対して外部にある位置に液滴または試料を置くように構成されてもよい。たとえば、検体を含む（または潜在的に含む）液滴は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析用の基材に置かれうる。
液滴は、複数の反応を同時に監視することができるようにするために、適切なセンサに近接する共通の検出点を通り過ぎて循環によって輸送されうる。たとえば、液滴マイクロアクチュエータは、貫流ＰＣＲ反応チャンバにおいて、高温ゾーンおよび低温ゾーンを接続する２つ以上の「トラック」を含むことができる。１つの検出器はトラックの交差場所に配置される。液滴輸送量は、液滴に検出スポットを順次通過させるようにタイミングを調整することができる。
本発明の液滴マイクロアクチュエータにおける本発明の液滴に基づくプロトコルにおける実行に適した分析の例としては、吸光度分析、蛍光分析、生物発光分析および化学発光分析などの光学分析、ならびに電位差測定分析、電流測定分析および導電性測定分析などの電気化学分析が挙げられる。たとえば、上述の分析タイプのうちの１つまたは複数の種々の組み合わせを用いて、タンパク質、酵素、核酸、代謝産物、電解質、ガス（たとえば、血液ガス）およびヘマトクリットなどの１つまたは複数の検体の特定および／または定量化を行うことができる。本発明のシステムは、１つの液滴マイクロアクチュエータでこれらの分析タイプの種々の組み合わせを行うようにプログラムされてもよい。
一実施形態において、１つの液滴マイクロアクチュエータまたはシステムは、２、３、４、５、６またはそれ以上の異なる種類の分析に関する検出性能を含む。たとえば、液滴マイクロアクチュエータシステムの液滴マイクロアクチュエータデバイス、システムおよび／または他の構成要素は、電流測定、電位差測定、導電率測定、吸光度、化学発光、蛍光および／または温度用の構成要素などの１つまたは複数の検出構成要素を個別にまたは共に含んでもよい。さらに、液滴マイクロアクチュエータシステムは、同一または複数の試料または試料タイプにおける２、３、４、５、６またはそれ以上の異なる種類の分析を行うための分析プロトコルを実行するようにプログラムされてもよい。
液滴マイクロアクチュエータ内で、液滴処置構成要素および検出構成要素は、一部の実施形態において、個別の基材に提供することによって分断されてもよい。同様に、種々の検出構成要素は、液滴マイクロアクチュエータデバイスまたはシステムの一部として提供されてもよいが、液滴マイクロアクチュエータから分離されてもよい。したがって、たとえば、センサは、液滴マイクロアクチュエータが結合されるカートリッジ上に設けられてもよい。液滴マイクロアクチュエータがカートリッジに連結される場合に、適切な構成要素が検出を可能にするために整列されるように連結は配置される。したがって、たとえば、光子センサは、窓または他の透明な基材に整列されてもよく、その結果、液滴マイクロアクチュエータはカートリッジに適切に取付けられる場合に、液滴マイクロアクチュエータにおいて液滴から発せられる光子が、光子センサによる検出のために窓または基材を通過してもよい。同様に、光源が、液滴マイクロアクチュエータにおける液滴において分子の蛍光を生じるために必要である場合には、光源は、液滴マイクロアクチュエータデバイスまたはシステムのカートリッジまたは他の構成要素に取付けられ、整列されてもよく、その結果、光源は、所望の蛍光を生成するために、液滴に達成することができる。
一実施形態において、液滴マイクロアクチュエータは、電気化学反応を行うための電極を含む。電極は、電極と接触する液滴の電気化学測定を可能にするために、エレクトロウェッティング基材上にパターン形成されうる。二基材液滴マイクロアクチュエータにおいて、電気化学反応を行うための電極は、いずれかの基材または両方の基材に形成されうる。一部の実施形態において、輸送電極および電気化学測定電極は、異なる基材に設けられる。電極は、イオン選択分析を行うための膜を含んでもよい。
８．１２ 他の方法
本発明は、検討事項の代わりに、卓上システムの構成要素が顧客に提案または提供される方法を含む。一実施形態において、顧客に提案または提供される構成要素は、ＰＣを含まない。本発明のソフトウェアは、ユーザに格納媒体で提供されてもよく、またはインターネットなどのネットワークを介したダウンロードで利用可能であってもよい。ユーザは、システムの他の構成要素を獲得し、その構成要素をＰＣに連結し、ＰＣ上にソフトウェアを読み込み、それによって本発明のシステムを組み立ててもよい。
本発明は、卓上システムが、プロトコルを実行するためのコードを生成するように用いられる方法を含む。コードは、検討事項の代わりに顧客に提案または提供される携帯可能なシステムまたは手持ち式システムなどの個別のシステムにアップロードされる。ユーザは、プロトコルを実行するためのシステムを用いてもよい。
本発明はまた、プログラミングおよび／またはシステム制御が、電話システムまたはインターネットなどのネットワークを介して遠隔的に達成される方法を含む。したがって、たとえば、システムは、ユーザに販売されてもよく、プログラマは、インターネットを介して表示されるユーザインターフェイスを介してシステムに接続して、システムを制御し、システムを用いてプログラムを作成し、システムにプログラムを読み込み、および／またはシステムでプログラムを修正してもよい。別の例として、本発明は、リモートユーザがネットワークを介して液滴マイクロアクチュエータにアクセスし、システムにおいて１つまたは複数の液滴処置を行う処理を含む。
８．１３ キット
本発明のさらなる態様は、本発明の方法を行うための試薬、試料収集デバイスおよび／または液滴マイクロアクチュエータまたはカートリッジを含むキットである。
８．１４ 見解の結論
実施形態の上述の詳細な説明は、本発明の特定の実施形態を示す添付図面について言及する。異なる構造および操作を有する他の実施形態は、本発明の範囲を逸脱しない。
当業者には明白であるように、本発明は、方法、システムまたはコンピュータプログラム製品として具体化されてもよい。したがって、本発明は、完全にハードウェアの実施形態、完全にソフトウェアの実施形態（ファームウェア、常駐ソフトウェア、マイクロコードなどを含む）または本明細書ではすべて「回路」「モジュール」または「システム」と呼ばれうるソフトウェアの態様およびハードウェアの態様を組み合わせている実施形態の形態をとってもよい。さらに、本発明は、媒体において具体化されたコンピュータによって使用可能なプログラムコードを有するコンピュータによって使用可能な格納媒体上のコンピュータプログラム製品の形態をとってもよい。
任意の適切なコンピュータによって使用可能な媒体を利用してもよい。コンピュータによって使用可能な媒体またはコンピュータ可読媒体としては、電気、磁気、光、電磁気、赤外線または半導体システム、装置、デバイスまたは伝搬媒体が挙げられうるが、これに限定されない。コンピュータ可読媒体のさらに特定の例（非包括的なリスト）としては、以下：１つまたは複数のワイヤを有する電気接続、携帯可能なコンピュータディスケット、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、消去可能プログラム可能な読出し専用メモリ（ＥＰＲＯＭまたはフラッシュメモリ）、光ファイバ、形態可能なコンパクトディスク読み出し専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）、光格納デバイス、インターネットまたはイントラネットなどを支援する媒体などの伝送媒体、または磁気格納デバイスの一部またはすべてが挙げられる。プログラムは、たとえば、紙または他の媒体の光学走査を介して電子的に捕捉されることができ、次に、コンパイル、解釈または必要に応じて、適切な様式で他の方法で処理され、続いてコンピュータメモリに格納されることができるため、コンピュータによって使用可能な媒体またはコンピュータ可読媒体は、プログラムが印刷される紙または別の適切な媒体であってもよいことを留意されたい。本文書に照らして、コンピュータによって使用可能な媒体またはコンピュータ可読媒体は、命令実行システム、装置またはデバイスによって、または命令実行システム、装置またはデバイスと接続して用いるためのプログラムを収容、格納、通信、伝搬または輸送することができる任意の媒体であってもよい。
本発明の操作を実行するためのコンピュータプログラムコードは、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｓｍａｌｌｔａｌｋ、Ｃ＋＋などのオブジェクト指向プログラミング言語で書かれてもよい。しかし、本発明の操作を実行するためのコンピュータプログラムコードはまた、「Ｃ」プログラミング言語または類似のプログラミング言語などの従来の手続き型プログラミング言語で書かれてもよい。プログラムコードは、ユーザのコンピュータ上で完全に実行されてもよく、ユーザのコンピュータ上で部分的に実行されてもよく、自立型ソフトウェアパッケージとして、部分的にユーザのコンピュータ上で、部分的にリモートコンピュータ上で実行されてもよく、またはリモートコンピュータまたはサーバ上で完全に実行されてもよい。後者のシナリオにおいて、リモートコンピュータは、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）またはワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）を通じてユーザのコンピュータに接続されてもよく、または接続は、外部コンピュータ（たとえば、インターネットサービスプロバイダを用いてインターネットを通じて）で行われてもよい。
本発明は、本発明の実施形態による方法、装置（システム）およびコンピュータプログラム製品のフローチャート図および／またはブロック図を参照して記載される。フローチャート図および／またはブロック図の各ブロックおよびフローチャート図および／またはブロック図におけるブロックの組み合わせは、コンピュータプログラム命令によって実装されうることが理解されよう。これらのコンピュータプログラム命令は、機械を製作するために、汎用コンピュータ、専用のコンピュータまたは他のプログラム可能なデータ処理装置のプロセッサに提供されてもよく、その結果、コンピュータまたは他のプログラム可能なデータ処理装置のプロセッサを介して実行する命令は、フローチャートおよび／またはブロック図の１つまたは複数のブロックに指定された機能／行為を実装するための手段を作成する。
これらのコンピュータプログラム命令はまた、コンピュータまたは他のプログラム可能なデータ処理装置を指向して、特定の様式で機能するようにすることができるコンピュータ可読メモリに格納されてもよく、その結果、コンピュータ可読メモリに格納された命令は、フローチャートおよび／またはブロック図の１つまたは複数のブロックに指定された機能／行為を実装するための命令手段を含む製作物品を製作する。
コンピュータプログラム命令はまた、コンピュータまたは他のプログラム可能なデータ処理装置に読み込まれて、コンピュータに実装される処理を行うために、コンピュータまたは他のプログラム可能なデータ処理装置で一連の操作工程を行わせてもよく、その結果、コンピュータまたは他のプログラム可能なデータ処理装置で実行する命令は、フローチャートおよび／またはブロック図の１つまたは複数のブロックに指定された機能／行為を実装するための工程を提供する。
本明細書は、読者の便宜のために、節に分割している。見出しは、本発明の範囲を限定するものと考えるべきではない。
本発明の種々の詳細は、本発明の範囲を逸脱することなく変更してもよいことは理解されよう。さらに、本発明は、記載される特許請求の範囲によって定義されるため、上述の説明は、例示に過ぎず、限定するためではない。
本発明の実施形態による増幅プロトコルに用いるための液滴マイクロアクチュエータの上部平面図である。 本発明の種々の実施形態による、単独の統合型加熱器を有する液滴マイクロアクチュエータの上部平面図である。 本発明の種々の実施形態による、複数の統合型加熱器を有する液滴マイクロアクチュエータの上部平面図である。 本発明の実施形態による核酸配列分析に用いるための液滴マイクロアクチュエータの上部平面図である。 本発明による具体的実施形態の反応工程および液滴操作を示す図である。 本発明による具体的実施形態の反応工程および液滴操作を示す図である。 本発明の実施形態による免疫測定を行うのに用いるための液滴マイクロアクチュエータの斜視図である。 本発明の実施形態による液滴マイクロアクチュエータで実施される液滴に基づくサンドイッチ親和性に基づく分析を行うための工程を示す図である。 本発明の実施形態による液滴マイクロアクチュエータで実施される競合的親和性に基づく分析を行うための工程を示す図である。 本発明の実施形態による生体液分析機器の斜視図である。 本発明の実施形態による液滴マイクロアクチュエータ投入構造の側面輪郭図である。 本発明の種々の実施形態による磁界を用いた磁気応答性ビーズの固定化および解放のための工程を示す図である。 本発明の種々の実施形態による磁界を用いた磁気応答性ビーズの固定化および解放のための工程を示す図である。 本発明の種々の実施形態による磁界を用いた磁気応答性ビーズの固定化および解放のための工程を示す図である。 本発明の実施形態による物理的障害を用いた磁気応答性ビーズの固定化および解放のための工程を示す図である。 本発明の実施形態による液滴マイクロアクチュエータ表面を洗浄するための工程を示す図である。 本発明の実施形態による液滴を輸送するための液滴マイクロアクチュエータの側面輪郭図である。 本発明の実施形態による液滴を輸送するための液滴マイクロアクチュエータの上部平面図である。 本発明の実施形態による生体液分析機器の斜視図である。 本発明の実施形態による液滴マイクロアクチュエータシステムの図である。 本発明の実施形態による携帯可能な手持ち式分析機器の図である。 本発明の実施形態による携帯可能な手持ち式分析機器の図である。 本発明の実施形態による液滴制御システムのユーザインターフェイスの図である。 図２１Ａ〜図２１Ｄは、本発明の種々の実施形態による種々の液滴マイクロアクチュエータセンサ要素構成を示す側面輪郭図である。

Claims (4)

  1. 液滴マイクロアクチュエータ上の液滴に含まれる一若しくは複数の磁気応答性のビーズの表面に接触し、低濃度の非結合の物質を有する液滴を提供する方法であって、該方法は、
    （ａ）前記非結合の物質の開始濃度及び開始量を備え開始容量を有する液滴に接触する前記一若しくは複数の磁気応答性のビーズの表面を備える液滴マイクロアクチュエータを設け、
    （ｂ）洗浄液滴と工程（ａ）にて提供された液滴とを混合して混合液滴を生成するため一若しくは複数の液滴操作を行い、
    （ｃ）前記一若しくは複数の磁気応答性のビーズを磁界にさらすことにより、前記一若しくは複数の磁気応答性のビーズを固定することを備え、
    前記一若しくは複数の磁気応答性のビーズを固定しつつ、前記方法は、
    （ｄ）混合液滴を分割し、（ｉ）開始濃度に対して低濃度の非結合の物質を有する一若しくは複数の磁気応答性のビーズの前記表面と接触する液滴、及び（ｉｉ）一若しくは複数の磁気応答性のビーズの前記表面から分離された液滴、を備えた一連の液滴を生成するため一若しくは複数のエレクトロウェッティングを介した液滴操作を行うことをさらに備える方法。
  2. 請求項１に記載の工程（ｄ）に続いて、一若しくは複数のビーズを離す、又は再懸濁することをさらに備える、請求項１記載の方法。
  3. 工程（ｃ）は、磁界を生じさせる手段に近接する磁気応答性のビーズを備えた液滴を一若しくは複数の電極に近接して配置することを備え、ここで、磁界の強度及び近さは、洗浄プロトコルの実行中、磁気応答性ビーズを固定するのに十分なものである、請求項１記載の方法。
  4. 工程（ｄ）は、（ａ）実質的に全てのビーズを備え、開始濃度に対して低濃度の物質を有する液滴、及び（ｂ）前記ビーズが実質的にない液滴、を備えた一連の液滴を生成する、請求項１記載の方法。
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