JP5573335B2 - 磁性体粒子操作デバイス及び磁性体粒子操作方法 - Google Patents
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Description
下記発明は、液滴操作デバイスに向けられる。
(1)
液滴封入媒体中において液滴を搬送するための液滴操作デバイスであって、
前記液滴封入媒体を保持する容器と、
水系液体からなる液滴と、
前記水系液体に不溶性又は難溶性であるゲル状の液滴封入媒体と、
前記水系液体からなる液滴に含まれる磁性体粒子と、
磁場を生じさせることにより前記磁性体粒子と共に液滴を搬送するための磁場印加手段と、
を含む液滴操作デバイス。
上記液滴操作デバイスにおける磁場印加手段は、それ自身が搬送面に略平行に移動できるものであっても良いし、複数が搬送面に略平行に配置したものであっても良い。
(2)
前記ゲル状の液滴封入媒体が、非水溶性又は難水溶性である液体物質に、ヒドロキシ脂肪酸、デキストリン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステルからなる群から選ばれるゲル化剤を混合させて調製されるものである、(1)に記載のデバイス。
前記液滴の搬送経路に別の液滴が配置される、(1)又は(2)に記載のデバイス。
上記方法における別の液滴の態様の例を、図1の(a)においてゲル状態の液滴封入媒体に封入されたPCR反応液からなる液滴、洗浄液からなる液滴、及び核酸抽出液からなる液滴として示す。
(4)
前記液滴の搬送経路に温度勾配が設けられる、(1)〜(3)のいずれかに記載のデバイス。
(5)
液滴封入媒体中において液滴を操作する方法であって、
前記液滴封入媒体が容器中に保持され、
前記液滴が磁性体粒子を含む水系液体からなり、
前記液滴封入媒体が、少なくとも液滴操作開始前においてゲル状態であって、ゲル状態及びゾル状態において前記水系液体に不溶性又は難溶性であるものであり、
前記液滴操作において、磁場印加手段によって磁場を生じさせて前記磁性体粒子と共に前記液滴を搬送する工程を含む、液滴操作方法。
上記方法において、液滴操作開始後において移動している液滴が取り囲む液滴封入媒体は、ゲル状態であっても良いし(例えば図2の(b)又は(e))、ゾル状態であっても良い(例えば図2の(g)又は(h))。
(6)
前記液滴操作開始前において、
非水溶性又は難水溶性である液体物質とのゲル化剤との混合物が収容された容器を用意し、前記混合物に液滴を添加し、その後、前記混合物をゲル化させることによって、前記液滴をゲル状の液滴封入媒体中に封入する、(5)に記載の方法。
前記液滴が、同一容器内でゲル状態又はゾル状態の前記液滴封入媒体中の前記液滴搬送経路に封入された、磁性体粒子を含む別の液滴に対して前記磁場を生じさせ液滴搬送経路上を移動させることによって、前記別の液滴から分離されて生じたものである、(5)又は(6)に記載の方法。
上記方法における液滴分離の態様の一例を、図2の(c)〜(e)に模式的に示す。
前記液滴が、同一容器内でゲル状態の前記液滴封入媒体上に配置された、磁性体粒子を含む別の液滴に対して前記磁場を生じさせることによって、前記別の液滴から分離されて生じたものである、(5)又は(6)に記載の方法。
上記方法における液滴封入媒体上に配置された別の液滴の態様の一例を図1の(a)及び(b)において網掛けで示した液滴として示す。
上記方法における液滴の分離の態様の一例を図2の(a)〜(b)に模式的に示す。
前記液滴が、ゲル状態又はゾル状態の前記液滴封入媒体中を移動することによって、同一容器内で前記液滴封入媒体中の前記液滴搬送経路に封入された別の液滴と合体する、(5)〜(8)のいずれかに記載の方法。
上記方法における液滴の合体の態様の一例を図2の(b)〜(c)、(f)〜(g)に模式的に示す。
前記液滴搬送経路に温度勾配が設けられる、(5)〜(9)のいずれかに記載の方法。
上記方法における温度勾配を生じさせるものの一例として、図1(b)に記載のセラミック板及びその一端に接して備えられたヒーターが挙げられる。
前記液滴封入媒体が、前記温度勾配の高温側におけるゾル相と前記温度勾配の低温側におけるゲル相との両方を同一容器内で呈する、(10)に記載の方法。
上記方法におけるゲル相及びゾル相の共存態様の例を図1(b)及び図2に模式的に示す。図2の(f)において、磁性体粒子を含む移動中の液滴が位置する地点がゾル−ゲル転移点に相当する温度地点であり、当該地点より高温側(ヒーターにより近い側)の搬送面に接する液滴封入媒体はゾル相を呈し、当該地点より低温側(ヒーターからより遠い側)の搬送面に接する液滴封入媒体はゲル相を呈している。
(12)
前記別の液滴が洗浄液からなるものであり、前記合体によって前記磁性体粒子及びその吸着成分が洗浄される、(9)〜(11)のいずれかに記載の方法。
(13)
前記別の液滴に、細胞溶解液及び生体試料を含ませることによって、前記磁性体粒子に前記生体試料由来の核酸を吸着させる、(8)〜(12)のいずれかに記載の方法。
(14)
前記別の液滴が核酸増幅反応液からなるものであり、ゾル状態の前記液滴封入媒体中において、前記合体により生じた反応混合物からなる液滴を、前記温度勾配が設けられた液滴搬送経路上の、核酸合成反応の開始及び維持を達成する温度地点に移動させて前記反応混合物の温度制御をする、(11)〜(13)のいずれかに記載の方法。
上記方法における温度制御の態様の一例としては、図2の(g)〜(h)が挙げられる。
(15)
前記核酸合成反応の開始時において、前記反応混合物からなる液滴及び前記液滴封入媒体のうち少なくとも前記液滴封入媒体に蛍光色素が含まれる、(14)に記載の方法。
上記方法によってもたらされる効果の一つとして、上記核酸合成反応の終了時点まで増幅産物に基づく蛍光の検出が可能であることが挙げられる。
(16)
(1)〜(4)のいずれかに記載のデバイスを作成するための、
前記液滴封入媒体を保持する容器と、
前記ゲル状の液滴封入媒体、又は、前記ゲル状の液滴封入媒体を調製する材料となる非水溶性又は難水溶性の液体物質及びゲル化剤と、
磁性体粒子と、
磁場印加手段と、
を含むキット。
特に、ゲル状態の液滴封入媒体中に封入された磁性体粒子を含む液滴から微量の液滴を磁性体粒子に同伴して分離することが非常に容易である。一方、液滴封入媒体をゾル状態にすれば、封入された磁性体粒子を含む液滴自身の移動も容易である。本発明によると、同一容器内においてゲル状態及びゾル状態の液滴封入媒体を共存させることも容易であるため、液滴の分離及び移動を伴う一連の操作を密閉状態で行うことが非常に容易である。例えば、核酸含有試料を扱う一連の操作に本発明を適用する場合、当該核酸含有試料からの核酸抽出・精製及びPCRを一つの簡易なデバイスで行うことが可能になる。
3 液滴封入媒体
4 容器
41 搬送面
5 加熱源
61 磁場印加手段
8 磁性体粒子
本発明にかかる液滴とは、液滴を形成する液体の内外の圧力差と、液滴を構成する液体の分子間力によって発生する表面張力との釣合いで定まる形状(略球状又はその変形形状)を有する液体塊をいう。
本発明において液滴を形成する液体としては、後述の液滴封入媒体に不溶性又は難溶性である水系液体であれば良く、水、水溶液又は水懸濁液の態様で提供されうる。水系液体の構成成分としては、本発明に適用することができる反応及び処理に供されるいかなるものも含まれる。
処理としては、物質変化を伴うか否かに関わらず、いかなる処理も含まれる。物質変化としても、化学変化及び物理変化を問わない。例えば、前記反応や分析に先立って行われる前処理、分取(分離)処理、溶解処理、混合処理、希釈処理、撹拌処理、温度調節(加熱及び冷却)処理などの処理が挙げられる。
以下に、上記のより具体的な例として挙げた水系液体及びそれが供される反応及び処理について、以下にさらに説明する。
本発明における核酸増幅反応液には、通常核酸増幅反応に用いられる種々の要素に、少なくとも増幅すべき核酸及び磁性体粒子が含まれる。
増幅すべき核酸を含む試料としては、特に限定されず、例えば、動植物組織、体液、排泄物等の生体由来試料、細胞、原虫、真菌、細菌、ウィルス等の核酸包含体を挙げることができる。体液には血液、髄液、唾液、乳が含まれ、排泄物には糞便、尿、汗が含まれ、これらの組合せでもよい。細胞には血液中の白血球、血小板や、口腔細胞その他の粘膜細胞の剥離細胞が含まれ、これらの組合せでもよい。また、核酸を含む試料は、例えば細胞懸濁液、ホモジネート、細胞溶解液との混合液などの態様で調製されてもよい。
なお、本発明においては、核酸を含む試料の一態様や、核酸を含む試料が前処理を経て得られた試料を、核酸を含む液体と記載することがある。
ブロッキング剤の具体例としては、牛血清アルブミン(すなわちBSA)その他のアルブミン、ゼラチン(すなわち変性コラーゲン)、カゼイン及びポリリジンなどのタンパク質や、ペプチド(いずれも天然及び合成を問わない)が挙げられる。
これらの核酸増幅反応に必要な反応液の組成、並びに反応温度は、当業者が適宜選択することができる。
リアルタイム核酸増幅法における検出法としては、下記の方法が挙げられる。
二本鎖DNAに結合することで蛍光を発するインターカレーターは、核酸増幅反応によって合成された二本鎖DNAに結合し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量をモニターすることができる。この方法は、ターゲットに特異的な蛍光標識プローブを設計・合成する必要がなく、簡便にさまざまなターゲットの測定に利用できる。
TaqManプローブは、アニーリングステップで鋳型DNAに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光発光は抑制される。伸長反応ステップでは、TaqDNAポリメラーゼのもつ5´→3´エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたTaqManプローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光が発光される。この蛍光強度を測定することで、増幅産物の生成量をモニターすることができる。
未知濃度のサンプルについても、同じ条件下でPCR反応を行ってCt値を求める。この値と前述した検量線とから、サンプル中の目的のDNA量が測定できることになる。
核酸増幅反応で生じた二本鎖DNAは、DNAの長さ及びその塩基配列により固有のTm値を持つ。つまり、蛍光色素が結合したDNAを含む液滴の温度を徐々に上昇させると、急激に蛍光強度が減少する温度が観測される。蛍光強度の変化量を調べると、その温度ピークは塩基配列と長さによって規定されるTm値とほぼ一致している。このことによって、目的遺伝子ではなく例えばプライマーダイマーが生じて観測されたデータなど(すなわち偽陽性データ)を陽性データから除外することができる。遺伝子検査では、試料中の夾雑物により非特異反応が起こることも多いため、このような偽陽性を排除することは重要である。これにより、生成した増幅産物が、標的遺伝子固有のものであるかどうかの判定を行うこともできる。
核酸の抽出を行うために用いられる核酸抽出用液としては、カオトロピック物質、EDTA、トリス塩酸などを含有する緩衝液が挙げられる。カオトロピック物質としては、グアニジン塩酸塩、グアニジンイソチアン酸塩、ヨウ化カリウム、尿素などが挙げられる。
洗浄用液としては、核酸が磁性体粒子表面に吸着したまま、核酸含有試料に含まれる核酸以外の成分(例えば蛋白質、糖質など)や、核酸抽出など予め行われた他の処理に用いられた試薬その他の成分を融解できる溶液であればよい。具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム等の高塩濃度水溶液、エタノール、イソプロパノール等のアルコール水溶液などが挙げられる。
核酸が吸着した磁性体粒子を洗浄する具体的方法も、当業者が適宜決定することができる。また、核酸が吸着した磁性体粒子の洗浄の回数は、核酸増幅反応の際に不所望の阻害が生じない程度に当業者が適宜選択することができる。また、同様の観点で洗浄工程を省略することも可能である。
洗浄液からなる液滴は、少なくとも洗浄する回数と同じ個数だけ調製することができる。
核酸遊離液としては、水又は低濃度の塩を含む緩衝液を用いることができる。具体的には、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、蒸留水などを用いることができる。
核酸が吸着した磁性体粒子から核酸を遊離させる具体的方法も、当業者が適宜決定することができる。
上記以外のいかなる反応及び処理についても、それぞれの水系液体の組成は、当業者が容易に決定することができる。
封入媒体に完全に封入される液滴の量としては、例えば0.1μL〜10μL程度とすることができる。
本発明の方法においては、磁場の変動による液滴の移動を可能にするため、磁性体粒子を液滴に含ませる。磁性体粒子は、通常その表面に親水性基を有する。また、磁性体粒子は、容器中の液滴封入媒体に好ましくは液滴中に含ませた態様で予め封入されていてもよいし、本発明のデバイスを作成するためのキットとして提供される場合に、当該キットに含まれる容器や液滴封入媒体又はその材料とは別に添付されるアイテムの一つであってもよい。
磁性体粒子が表面に有する親水性基としては、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。
磁性体粒子として市販されているものの例としては、東洋紡から販売されているPlasmid DNA Purification Kit MagExtractor−Plasmid-の構成試薬であるMagnetic Beadsが挙げられる。このようにキットの構成試薬として販売されている場合、磁性体粒子を含む製品原液を純水(例えば10倍量程度)で懸濁させることによって洗浄することが好ましい。この洗浄においては、純粋で懸濁した後、遠心操作によって上清を除去することによって行うことができ、また懸濁及び上清除去を繰り返し行うことができる。洗浄した磁性体粒子は、純水に分散させた状態で本発明に使用することができる。
液滴封入媒体としては、液滴を構成する液体に不溶性又は難溶性である化学的に不活性な物質が用いられる。化学的に不活性な物質とは、液滴の分取(分離)、混合、溶解、希釈、撹拌、加熱、冷却などの種々の操作において液滴を構成する液体に化学的な影響を及ぼさない物質を指す。本発明における液滴封入媒体は、より具体的には、少なくとも液滴操作前においてゲル状態であり、当該ゲル状態である場合、及びゲル−ゾル転移点を越えてゾル状態となった場合の両方においても、液滴を構成する核酸増幅反応液に不溶性又は難溶性である。本発明においては通常、非水溶性又は水難溶性である液体物質にゲル化剤を添加してゲル化され得るものが用いられる。
液滴封入媒体をゲル−ゾル転移点より低い温度に供すると、液滴封入媒体に封入された液滴の移動を許す流動性のない状態(すなわちゲル状態)となる。このことによって、液滴を任意の位置に固定し、これによって、封入された液滴が予期せぬ方向へ移動することを防ぐことができる。さらに、封入された液滴をそのように固定しつつ、液滴の中に含まれる磁性体粒子及びその吸着物(具体的には磁性体表面に吸着した、反応又は処理に供される物質や液体)を容易に移動させることができる。従って、互いに近接した位置に封入液滴を配置する場合であっても、封入液滴同士は混ざり合わないため、磁性体粒子及びその吸着物はそれらの封入液滴間を容易に移動することが可能である。
一方、液滴封入媒体をゲル−ゾル転移点より高い温度に供すると、液滴封入媒体自体が流動性のある状態(すなわちゾル状態)となる。このことによって、当該封入された液滴の移動を可能にすることができる。液滴の容積が磁性体粒子全体に比べて比較的大きい場合であってもそのような液滴全体の移動を可能にすることができる。
このような液滴封入媒体は、後述の温度変化領域に晒されることによって、図1(b)に示すように、同一容器内で流動性のないゲル31の相と流動性のあるゾル32の相との両方の共存状態を簡単に実現することができる。
ゾル−ゲル転移点は、オイルの種類、ゲル化剤の種類、及びゲル化剤の添加量などの条件によって変動しうる。従って、当該各条件は、所望のゾル−ゲル転移点を達成できるよう、当業者によって適宜選択される。
非水溶性又は水難溶性である液体物質としては、25℃における水に対する溶解度が概ね100ppm以下であり、常温(20℃±15℃)において液体状であるオイルが用いられうる。例えば、液体油脂、エステル油、炭化水素油、及びシリコーン油からなる群から1種又は2種以上が組み合わされて用いられうる。
シリコーン油としては、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサンその他のフェニル基含有シリコーン油、メチルハイドロジェンポリシロキサン等が挙げられる。
ゲル化剤としては、ヒドロキシ脂肪酸、デキストリン脂肪酸エステル、及びグリセリン脂肪酸エステルからなる群から選ばれる油ゲル化剤が1種又は2種以上組み合わされて用いられうる。
所望のゲル及びゾル状態の一例として、前述のゾル−ゲル転移点を実現する程度であることが挙げられる。
所望のゲル及びゾル状態の他の一例として、完全に封入された液滴を、好ましく固定することができるゲル状態を実現することができる程度であることが挙げられる。好ましい固定状態としては、少なくとも重力程度の外力により封入液滴が移動しない程度であることが挙げられる。移動しないとは、容器底面における液滴の接触部分の位置がほぼ変化しない程度であることが好ましい。
液滴封入媒体の使用量については、液滴を完全に封入することができる十分量を特に限定することなく決定することができる。本発明においては、従来法(すなわち、核酸増幅反応開始時において、液滴のみに蛍光物質を添加する方法)において増幅産物の十分な検出を不可能にしていた程度の量であっても許容される。
具体的には、液滴の容量の1,000〜50,000倍、或いは20,000〜200,000倍の液滴封入媒体を用いることができる。上記範囲とすることは、液滴を操作性良く搬送することができる点で好ましい。上記範囲を上回ると、PCR開始に適した温度環境を形成させるための時間を多く要し、分析開始までに時間がかかる傾向にある。
また本発明における液滴封入媒体は液滴の封入性に優れるため、以下のような態様も許容される。すなわち、図4(a)に示すように、容器中における液滴1が存在しない領域における充填高さH3が、封入された液滴(容器中に封入されている中で最も容積が大きいもの)の高さH1より低くなる部分が生じる態様も許容される。
蛍光物質は、少なくとも液滴封入媒体に含ませることができる。この態様は、液滴中で核酸増幅反応を行う場合において好ましい。この場合、蛍光物質は、遅くとも核酸増幅反応開始時において、少なくとも液滴封入媒体に含まれるようにする。なお、核酸増幅反応の前処理も同じ液滴封入媒体内の別の液滴内で行われる場合、前処理の段階から当該液滴封入媒体に蛍光物質が含まれていたとしても、蛍光物質が前処理に影響しないことが本発明者によって確認されている。
一方、液滴に含まれる蛍光色素の濃度は、0〜20μMとすることができる。当該濃度範囲の上限は、さらに10μM、5μM、2μM、1μMまたは0.5μMとすることもできる。また、当該濃度範囲の下限は、さらに0.5μM、1μM、2μM、5μM又は10μMとすることもできる。上記範囲とすることは、反応を維持する間に安定して増幅産物の検出を行うことが容易となる点で好ましい。
本発明においては、例えば、液滴封入媒体における蛍光色素の濃度が0.05〜0.1μM、液滴における蛍光色素の濃度が0.5μM〜2μMであることが好ましい場合がある。
容器は、液滴封入媒体を保持することができるものであればよい。また、容器は、その内壁に液滴を移動させる(すなわち液滴が直接触れる)搬送面を有していればよく、その形状は特に限定されるものではない、例えば、図4(a)に示すような搬送面41を有する基板43、或いは図1(b)に示すような基板(セラミック板)43上に接するように設けられた底材42であって搬送面41を有する底材42と、当該搬送面41を取り囲む壁44とを有するものが挙げられる。
本発明におけるデバイスを構成する一部として提供される当該容器は、その大きさを極力小型化することにより、液滴操作用マイクロデバイス又は液滴操作用チップとして提供されることができる。
また、図1(b)に示すように、当該壁44で囲まれた空間を覆う蓋45をさらに有することによって、当該空間を閉鎖することができるものであっても良い。当該蓋45は、その全体又は一部が開閉可能となっていて、核酸増幅反応などの処理を行うための試薬や、試料を含む液滴を容器内に投入できるようになっていてもよい。
基板又は底材であって、搬送面を有するものの材質としては特に限定されないが、液滴の移動の際の移動抵抗を下げるために、搬送面が撥水性であるものが好ましい。そのような性質を与える材質として、例えばポリプロピレン、テフロン(登録商標)、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリカーボネートなどの樹脂素材が挙げられる。一方、基板上に搬送面を有する底材を設けた容器を用いる場合における基板としては、上述の素材のほか、セラミック、ガラス、シリコーン、金属等なども用いられうる。
基板及び底材は、反応容器外部又は反応基板裏面等から液滴の吸光度、蛍光、化学発光、生物発光、屈折率の変化等の測定を行う場合に、光学的な検出などができるようにするために光透過性を有するものであることが好ましい。
また、加温条件が必要となる反応又は処理においても液滴との高い接触角を保つことのできる表面を有するものを用いることが好ましい。具体的には、ポリプロピレン又はポリプロピレンやそれ以上の接触角を有する樹脂を用いることが好ましい。基板表面上における液滴の接触角は、95°〜135°程度(25℃)であることが好ましい。
液滴を移動させる搬送面には、温度変化領域が設けられる。温度変化領域は、搬送面上の液滴搬送経路に沿って連続して温度が変化するように、温度勾配が設けられたものである。温度勾配は、例えば容器の底面又は図1(b)に記載するような容器の底面に接する基板43の一部に加熱源5を接触させ、一定温度で発熱させることによって形成する。これによって、基板表面又は底材表面上に、熱源真上の地点が最も高温であり熱源から離れるに従って温度が下降するといった温度勾配を有した温度変化領域を形成することができる。
また、基板又は底材の素材として樹脂のように熱伝導性が低いものを用いることによっても、同様に温度変化領域内に形成される温度勾配を大きくすることができるため、狭い領域での局所的な温度調節が可能になる。
このように温度勾配を大きくすると、実施する処理に、二種以上の比較的差が大きい温度条件が求められる場合であっても、液滴の移動距離が短くて済む。このことは、効率のよい処理を可能にし、また、反応容器の小型化も可能にする。
液滴を移動させるための磁場の変動をもたらす磁場印加手段や磁場移動機構については特に限定されない。磁場印加手段としては、永久磁石(例えばフェライト磁石やネオジム磁石)や電磁石などの磁力源を用いることができる。磁力源は、容器内に存在する液滴中に分散していた磁性体粒子を搬送面側で凝集させることができる状態で、容器の外側に配置することができる。これによって、磁力源が容器の搬送面を介して磁性体粒子に対して磁場を生じさせ、磁性体粒子群及びそれが含まれる液滴を捕捉することができる。
例えば、図7に示すように、磁力源(例えば磁石61)自体を搬送面41に略平行に機械的移動させることのできる機構62を用いることができる。磁力源61によって容器の底面を介して捕捉された磁性体粒子群8及びそれが含まれる液滴11は、磁力源の移動に追随して搬送面41上を移動することができる。これによって、封入液滴の移動、封入液滴を母液滴とした子液滴の分離、及び封入液滴と封入液滴との合体を可能にする。
例えば、通電制御手段を用いることができる。また例えば、搬送面を介して容器の外側に配置した磁石を、当該搬送面に略垂直方向に移動することができる機構を用いることができる。この磁石を搬送面から遠ざけることによって、磁場を遮断又は減弱することができる。これによって、封入液滴中において磁性体粒子群を分散させ、磁性体粒子に吸着した成分を、封入液滴を構成する液体に十分に晒すことが可能になる。
蛍光検出手段は特に限定されるものではなく、当業者であれば容易に選択可能である。一例を挙げると、図7に示すように、光発生部73、カメラ(CCDカメラ)72、同軸落射系75及びパーソナルコンピューター(PC)71で構成された手段を用い、光発生部73から光ケーブル74によってCCDカメラ72に取り付けた同軸落射系75への入射を行い、同軸落射系75のレンズ群を通して反応容器内4の液滴11への照射を行うことができる。CCDカメラによって検出された電気的シグナルをPCにリアルタイムで送信し、液滴の蛍光強度の変化を追尾することができる。これは、本発明がリアルタイム核酸増幅反応などの変化しうる蛍光強度の検出が行われる反応又は処理が行われる場合に好適である。
リアルタイム核酸増幅反応などの核酸関連反応や核酸関連処理が行われる場合を例に挙げると、例えばSYBR(登録商標) GREEN Iを例に挙げると当該色素は二本鎖DNAに特異的に結合し525nm付近に蛍光を生じるため、CCDカメラは目的波長以外の光をフィルターでカットし、CCD素子受光面で光を検出することができる。
また、核酸増幅反応が行われる場合を例に挙げると、核酸増幅反応に供される液滴の蛍光観測は、DNAポリメラーゼによる伸長反応(通常68〜74℃程度)を行う温度地点に励起光を照射し、当該地点に液滴を停止させた状態で暗室内にて行うことができる。さらに、励起光の照射範囲を、熱変性を行う温度地点からアニーリングを行う温度地点まで拡大すると、液滴を移動させると共に増幅産物の融解曲線を得ることもできる。
液滴封入媒体は、液滴が液体封入媒体中に存在できるよう反応容器内に保持される。完全に液滴封入媒体中に存在せしめた液滴を、封入液滴と記載する場合がある。
本発明における液滴操作においては、液滴封入媒体中への液滴の封入(7−1)、封入液滴の移動(7−2)、封入された母液滴から子液滴の分離(7−3)、及び封入液滴同士の合体(7−4)を行うことができる。
当該態様の他の例としては、反応又は処理に供される試料を、反応又は処理開始直前まで隔離しておく場合が挙げられる。当該試料は、当該隔離の間に前処理が行われるものであってよい。例えば、増幅反応に供される核酸が、核酸を含む生体試料として提供される場合が挙げられる。
[7−1−1.液滴の添加による封入法]
液滴の封入は、液滴操作開始前において、容器に収容された液体物質にゲル化剤を溶解させた混合液を調製した後、液滴を形成すべき溶液を滴下などによって添加し、その後、当該混合液を冷却してゲル化させることによって行うことができる。
液滴の封入は、液滴操作開始前において、ゾル状の液滴封入媒体中に液滴を滴下した後、ゾル−ゲル転移点以下の温度に供することによって液滴封入媒体をゲル化させることによって行うこともできる。また、ゲル状態の液滴封入媒体中に穿刺によって水系液体を直接注入することによって行うこともできる。
反応系又は処理系を構築するために必要な要素の一方を含む水系液体を上記方法により搬送経路上に配置し、当該他方を含む水系液体をゲル化した状態の液滴封入媒体上に液滴状態で載せておく場合、以下のようにして両要素を混合させる。
流動性を有しないゲル状の液滴封入媒体上に、液体を液滴状態で載せる際、例えば図1(b)に示すように、液滴封入媒体31の上面の一部に押圧や削去などによりくぼみを設け、そのくぼみに液体2を載せることができる。このようなくぼみを形成することによって、液滴封入媒体31に載せる液体2が不用意に広がることや移動することを防ぐことができる。くぼみの深さD2は特に限定されない。例えば、くぼみの最も深いところが搬送面41に到達しない程度の浅さであることが好ましい。或いは、既に搬送面に接して封入されている液滴の高さに到達しない程度の浅さであってよい。具体的には、くぼみの深さD2は、約1mm前後であれば十分である場合がある。
この態様の具体例として、液滴封入媒体の上に載せられる液滴が、磁性体粒子とともに増幅すべき核酸を含む試料からなる液体であってよい。この場合、子液滴は、磁性体粒子及びそれに吸着した核酸を含む試料からなる液体を含んだ状態で得られる。
沈降した子液滴11bは、既に封入されていた一方の要素を含む液滴14と合体することによって、一方の要素と他方の要素とが混合され、一つの封入液滴11c中に共存することによって、核酸増幅反応又はその前処理に供することができる状態となる。
[7−2−1.ゾル状態の液滴封入媒体中における液滴の移動]
流動性を有するゾル状態の液滴封入媒体中に封入された磁性体粒子含有液滴が、液滴搬送経路を移動する原理は、以下のとおりである。すなわち、図2(g)及び(h)に示すように、磁性体粒子を含む液滴11gは、容器の搬送面41から容器内部の方向へ磁石61を近づけるなどして磁場を生じさせ、磁場を容器の搬送面41に略平行に移動させることによって磁場を変動させると、液滴内で磁性体粒子が移動方向の側に集中し、液滴全体を当該移動方向へ動かそうとする力が働く。本発明で用いられる磁性体粒子表面の親水性により、磁性体粒子が液滴搬送経路を移動する際に、液滴を形成する水に牽引力が伝達し、且つ、基板上の液滴の接触角が十分に大きく、搬送面の表面粗さが十分に小さく、液滴封入媒体の動粘度が十分に低く、磁場の移動の初速度が十分に遅ければ、磁性体粒子が液滴の表面張力に打ち勝って、液滴から飛び出すことなく液滴全体を移動させることができる。
なお、この態様において移動させることができる液滴の容積は、当業者が適宜決定する事ができるが、例えば磁性体粒子を10〜1000μg用いる場合、0.05μL〜5μLとすることができる。
ゲル状態の液滴封入媒体は、ゲル独特の特性を有するため、それ自身は流動性を有しない状態のまま、封入する液滴を移動させることができる。ゲル状態の液滴封入媒体中に封入された磁性体粒子含有液滴は、液滴封入媒体であるゲルの三次構造を崩しながら液滴搬送経路を移動することができる。
このように封入液滴自体を移動させる態様は、封入液滴の液温を変化させる必要がある場合に好ましく用いられる。液滴搬送経路に温度勾配が設けられることによって搬送面が温度変化領域を有する場合、封入液滴を構成する溶液内で行われうる処理に必要な温度地点へ封入液滴自身を移動させることによって、液温を迅速且つ容易に調整することが可能である。
[7−3−1.ゾル状態の液滴封入媒体中における子液滴の分離]
ゾル状態の液滴封入媒体中の上記移動態様の変形態様として、移動する封入液滴が、別の液滴を母液滴として分離された子液滴である態様が挙げられる。
当該別の液滴は、同一容器内で液滴封入媒体中に封入されているものである。この態様においては、封入された当該別の液滴に含まれる磁性体粒子に対して磁場をかけ、搬送経路を移動させることによって、封入された母液滴全体を移動させることなく、磁性体粒子群が引き抜かれて分離される。このとき、分離される磁性体粒子群は、それに吸着した物質及び多少の液滴由来の液体(子液滴)をその周囲に引き連れる。
一方、図2(c)〜(e)に示すように、ゲル状の液滴封入媒体31中に封入された、磁性体粒子を含む母液滴11cからも、液滴封入媒体31が流動性を有しないゲル状態のまま、磁性体粒子及びそれに付随する子液滴11eを分離することができる。この態様は、図2(a)〜(b)に示す、液滴封入媒体31の上に載せられた磁性体粒子を含む母液滴2から磁性体粒子及びそれに付随する子液滴11bを分離する態様と同様の原理による。
磁性体粒子を含む液滴は、同一容器内の別の封入液滴からなる液体に供されることにより、封入液滴同士が合体することができる。当該別の封入液滴を封入している液滴封入媒体は、ゲル状及びゾル状を問わない。液滴同士の合体によって、液滴を構成する成分の混合、溶解、希釈などを行うことができる。
本発明が複数の試薬の混合によって行われる反応に適用される場合を挙げると、当該複数の試薬のうち一方の試薬と磁性体粒子とを含む封入液滴を移動させ、他方の試薬を含む封入液滴と合体させることによって(或いは、搬送面が温度変化領域を有する場合は、さらに当該反応に適した温度地点へ移動させることによって)、反応を遂行することができる。同様に、得られた反応生成物をさらに他の試薬と反応させることもできる。
上述のように、核酸増幅反応及びそれに関わる前処理を含む一連の処理が、完全密閉系で行なわれる。さらに、磁性体粒子を、封入液滴内に含ませて分散させることと、移動のために凝集させることと、ゲル内における各液滴間及び所望の温度地点間を移動させることとによって、これらの処理を簡便に行うことができる。
[実施例1]
核酸含有試料としては、口腔スワブ液及び細胞溶解液の混合液を用いた。口腔スワブ液は、綿棒を用い口腔粘膜細胞を擦過採取し、1mLの蒸留水に懸濁して調製した。口腔スワブ液25μLと、グアニジンチオシアネートを終濃度2Mで含む細胞溶解液とを混合することにより、50μLの混合液を調製した。
洗浄液は、200mM塩化カリウム及び50mMトリス−塩酸(pH8.0)の混合溶液として調製した。
液滴封入材の調製のため、シリコーンオイル(信越シリコーンKF-56)に、12−ヒドロキシステアリン酸(和光純薬)を1%(重量比)となるように添加し、90℃に加熱して、完全にシリコーンオイルと混和させた。混和したオイルを、オイル層の厚さ(充填高さ)が3mmとなるように容器に投入した。その後、オイル温度を約60℃まで下げ、洗浄液20μLの液滴3個、PCR反応液1μL1個を、図1(a)及び(b)に示すようにオイル中に置いた。オイルが室温になるまで放置することによって、オイル全体をゲル化させた。
まず、磁石を垂直に2mm/秒の速度で上方移動させ、セラミック板に近づけることで、図2(a)及び(b)に示すように、磁性シリカ粒子を含んだ細胞溶解液及び口腔スワブ液の混合液から成る液滴から、磁性粒子集合体を下方オイル層中へと分離させた。この混合液に添加されているグアニジンチオシアネートは、口腔スワブに含まれる口腔粘膜細胞を溶解させ、遊離した核酸を磁性粒子の表面に吸着させた。
本実施例で行った上記の一連の操作の過程を表す写真を図3に示す。図3における記号(a)〜(h)及び写真中の要素に付された符号は、それぞれ、図2におけるものに相当する。
反応が終了した液滴をアガロースゲル電気泳動に供し、βアクチン遺伝子からの増幅産物(151塩基)を確認した(図5)。
親水性表面を持つ磁性体粒子として、東洋紡から販売されているPlasmid DNA Purification Kit MagExtractor-Genome-キットの構成試薬であるMagnetic Beads(以下、単に、磁性シリカビーズという)を使用した。上記キット内の磁性シリカビーズは、予め、原液を10倍容量の純水に懸濁させ、500×g、1分間の遠心操作により上清を除去する操作を5回繰り返すことによって洗浄した。そして、磁性シリカビーズを純粋中に懸濁させ、純粋中の磁性シリカビーズの含有量が、同ビーズ乾燥重量換算で100mg(dry)/mLとなるように調整した。
インビトロジェン社製SYBR(登録商標)GREEN Iを、PCR反応溶液からなる液滴に、製品原液の一万倍希釈濃度となるように添加した。また、SYBR(登録商標)GREEN Iを、シリコーンオイルに、製品原液に対し5万倍希釈濃度となるように添加した。
SYBR-Green I、YO PRO-1及びSYTO-13(いずれもInvitrogen社製)の蛍光色素をそれぞれ用い、蛍光色素の液滴側濃度とオイル側濃度とをそれぞれ変えてPCRを行ったことを除いては、上記参考例1と同様の操作を行った。液滴をPCR開始に供する前の蛍光強度と、PCR開始に供した後の蛍光強度との差を表1〜3に表す。表1はSYBR-Green Iを用いた場合、表2はYO PRO-1を用いた場合、及び表3はSYTO-13を用いた場合の結果を示す。
ヒトβ-アクチン遺伝子検出用プライマーの配列は、5’-CATCGAGCACGGCATCGTCACCAA-3’(配列番号3)及び5’-GCGGGCCACTCACCTGGGTCATCT-3’(配列番号4)である。
配列番号2は、合成プライマーである。
Claims (14)
- 水系液体と、
前記水系液体に不溶性又は難溶性であって、前記水系液体を封入するゲル状封入媒体と、
前記水系液体及び前記ゲル状封入媒体を保持する容器と、
前記容器内において移動されるべき磁性体粒子とを有し、
磁場によって、前記容器内で前記磁性体粒子を移動させるための磁性体粒子操作デバイスであって、
前記磁性体粒子が前記水系液体から前記ゲル状封入媒体へと搬送される際、前記磁性体粒子が前記水系液体から分離されると共に、当該水系液体が前記ゲル状封入媒体によって封入及び固定された状態が、前記ゲル状封入媒体自体によって維持される、磁性体粒子操作デバイス。 - 前記磁性体粒子の搬送経路に温度勾配が設けられる、請求項1に記載の磁性体粒子操作デバイス。
- 前記封入媒体が、前記温度勾配の高温側におけるゾル相と前記温度勾配の低温側におけるゲル相との両方を同一容器内で呈する、請求項2に記載の磁性体粒子操作デバイス。
- 水系液体と、
前記水系液体に不溶性又は難溶性であって、前記水系液体を封入する封入媒体と、
前記水系液体及び前記封入媒体を保持する容器と、
前記容器内において移動されるべき磁性体粒子とを有し、
磁場によって、前記容器内で前記磁性体粒子を移動させるための磁性体粒子操作デバイスであって、
前記磁性体粒子が前記水系液体から前記封入媒体へと搬送される際、前記磁性体粒子が前記水系液体から分離されると共に、当該水系液体が前記封入媒体によって封入された状態が維持され、
前記磁性体粒子の搬送経路に温度勾配が設けられ、
前記封入媒体が、前記温度勾配の高温側におけるゾル相と前記温度勾配の低温側におけるゲル相との両方を同一容器内で呈する、磁性体粒子操作デバイス。 - 前記封入媒体が、非水溶性又は難水溶性である液体物質に、ヒドロキシ脂肪酸、デキストリン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステルからなる群から選ばれるゲル化剤を混合させて調製されるものである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の磁性体粒子操作デバイス。
- 前記磁性体粒子の搬送経路に前記封入された水系液体が複数配置される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の磁性体粒子操作デバイス。
- 水系液体及びゲル状封入媒体中において磁性体粒子を操作する方法であって、
前記水系液体及び前記ゲル状封入媒体が容器中に保持され、
前記ゲル状封入媒体が、前記水系液体に不溶性又は難溶性であるものであり、
前記磁性体粒子操作において、磁場によって前記水系液体及び前記ゲル状封入媒体を含む搬送経路上で前記磁性体粒子を搬送する工程を含み、
前記磁性体粒子を搬送する工程において、前記磁性体粒子が前記水系液体から前記ゲル状封入媒体へと搬送される際、前記磁性体粒子が前記水系液体から分離されると共に、当該水系液体が前記ゲル状封入媒体によって封入及び固定された状態が、前記ゲル状封入媒体自体によって維持される、磁性体粒子操作方法。 - 前記搬送経路に温度勾配が設けられる、請求項7に記載の磁性体粒子操作方法。
- 前記封入媒体が、前記温度勾配の高温側におけるゾル相と前記温度勾配の低温側におけるゲル相との両方を同一容器内で呈する、請求項8に記載の磁性体粒子操作方法。
- 水系液体及び封入媒体中において磁性体粒子を操作する方法であって、
前記封入媒体が容器中に保持され、
前記封入媒体が、少なくとも磁性体粒子操作開始前においてゲル状態であって、ゲル状態及びゾル状態において前記水系液体に不溶性又は難溶性であるものであり、
前記磁性体粒子操作において、磁場によって前記水系液体及び前記封入媒体を含む搬送経路上で前記磁性体粒子を搬送する工程を含み、
前記搬送経路に温度勾配が設けられ、
前記封入媒体が、前記温度勾配の高温側におけるゾル相と前記温度勾配の低温側におけるゲル相との両方を同一容器内で呈する、磁性体粒子操作方法。 - 前記磁性体粒子を、同一容器内でゲル状態又はゾル状態の前記封入媒体中の前記搬送経路に封入された複数の水系液体同士の間で移動させる、請求項7〜10のいずれか1項に記載の磁性体粒子操作方法。
- 前記水系液体が洗浄液からなるものであり、前記搬送中に前記磁性体粒子表面の付着成分が洗浄される、請求項7〜11のいずれか1項に記載の磁性体粒子操作方法。
- 前記水系液体に、細胞溶解液及び生体試料を含ませることによって、前記磁性体粒子に前記生体試料由来の核酸を吸着させる、請求項7〜12のいずれか1項に記載の磁性体粒子操作方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の磁性体粒子操作デバイスの製造方法であって、
非水溶性又は難水溶性である液体物質とゲル化剤との混合物が収容された容器を用意し、前記混合物に水系液体を添加し、その後、前記混合物をゲル化させることによって、前記水系液体をゲル状の封入媒体中に封入する工程を含む、磁性体粒子操作デバイスの製造方法。
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