KR20160020559A - 생체분자 단리 및 열가공 - Google Patents

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키어런 쿠란
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젠셀 바이오시스템즈 리미티드
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Abstract

샘플 액체, 캡슐화 액체 및 자기 입자를 처리하기 위한 방법, 장치 및 시스템이 개시된다.

Description

생체분자 단리 및 열가공{Biomolecule Isolation and thermal processing}
본 발명은 생체분자 단리 및 열가공에 관한 것이다.
관련 출원
본 출원은 2013년 6월 18일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/836,461의 이익을 주장하며, 이는 본 명세서에 전체가 참고로 포함되어 있다.
배경기술
생체분자의 단리는 임의의 샘플 가공 시스템의 중요한 부분이다. 자동화된 분자 분석 시스템의 개발에 대해, 가장 큰 제한은 샘플의 제조 및 표적 샘플의 정제이다.
모든 생화학 공정에 대해, 샘플 표적의 단리 및 정제는 공정의 성공에 중요하다. 생화학 분석 공정(파이로시퀀싱, 핵산 결찰, 중합효소 연쇄반응, 디지털 PCR, qPCR, 핵산 시퀀싱, 단백질 검출/단백질 풍부화, 유전자 비드 코팅, 희귀 세포 검출 및 세포 풍부화(이들로 제한되지 않음))에서의 제한은 표적의 출발 농도 및 분석에서 사용되는 반응 샘플 내에 존재하는 생화학적 저해제의 수준에 기인한다.
대부분의 생화학 분석의 경우, 초기 샘플로부터 표적을 단리시키고 생화학 저해제를 제거하기 위해 일련의 사전 분석 단계가 샘플에 수행된다. 이들 단계는 통상적으로 노동 집약적이고 표적의 출발 농도를 궁극적으로 감소시킨다.
샘플 정제의 현재의 바람직한 방법은 스핀 컬럼을 사용하게 한다. 그러나, 스핀 컬럼은 다수의 원심분리 단계들을 필요로 하며, 따라서 자동화된 DNA 라이브러리 제조 플랫폼과 통합될 수 없다. 유사하게, 아가로스 겔로부터의 핵산 단편 정제를 위한 정제 기법은 또한 핵산 단리를 달성하기 위한 원심분리 단계들을 필요로 한다.
샘플 정제를 위해 사용되는 한 가지 기법은 상자성(paramagnetic) 비드 기반 정제이다. 이 방법은 개선된 DNA 회수율을 제공할 수 있는 접근 및 특이적 DNA 단편 크기에 선택적으로 결합하기 위해 사용될 수 있는 조정할 수 있는 완충제 조건을 제공한다.
상장성 비드 기반 정제는 고정식 웰 배취(static well batch) 공정이다. 현재의 방법은 비드 혼합물(상자성 비드 및 완충제)을 초기 샘플과 함께 마이크로타이터 플레이트의 웰 내에 피펫팅하는 단계를 수반한다. 용액은 피펫팅되고 나서, 혼합되고, 실온에서 인큐베이션되어 DNA가 비드에 결합되게 한다. 이어서, 마이크로타이터 플레이트는 자기 플레이트 상에 위치된다. 결합된 DNA를 보유하는 비드는 플레이트의 가장자리로 이동하고, 자석에 의해 유지된다. 다음에, 상청액(폐기물을 함유)은 피펫을 사용하여 제거되고, 폐기된다. 이후에 다수의 세척 단계가 이어서 수행되어 비드 펠렛 상에/상에서 존재하는 잔여 폐기물을 제거한다. 에탄올은 비드 펠렛을 함유하는 플레이트에 피펫팅되고 나서, 인큐베이션되고, 이어서 피펫을 사용하여 제거된다. 이 세척 단계는 2 회 반복된다. 이어서, 용리 완충제가 첨가된다. 플레이트는 자기 플레이트로부터 제거되고, 용리 완충제는 피펫 혼합을 통해 혼합된다. 마이크로타이터 플레이트는 자기 플레이트 상에 다시 놓인다. 이어서, 정제된 DNA를 함유하는 용리액은 피펫을 사용하여 회수된다.
상자성 비드 기반 프로토콜은 노동 집약적 공정이며, 필요로 하는 다수의 피펫팅 단계에 기인하여 용이하게 자동화되지 않는다. 다수의 피펫팅 단계들은 또한 큰 초기 샘플 용적 및 최종 샘플 용적을 초래하여, 데이터 지점마다 높은 시약 비용을 초래한다.
한 가지 적용(이 적용에 제한되지 않음)은 차세대 시퀀싱 플랫폼을 위한 개선된 샘플 정제를 위한 것이다. 다수의 차세대 시퀀싱 플랫폼은 구체적 범위의 염기쌍 길이 내의 DNA 단편으로 구성된 DNA 라이브러리를 필요로 한다. 추가적으로, 이들 DNA 단편은 PCR을 사용하여 서열을 증폭시킬 수 있게 하고 라이브러리 단편이 시퀀서 유세포에 어닐링할 수 있도록 특이적 뉴클레오타이드 서열(연결자(adapter))에 태그될 필요가 있다. 서열 특이적 지표는 또한 단일 유세포 내에서 샘플을 다중복합화(multiplexing)할 때, 개개의 샘플을 동정하기 위해 DNA 단편에 첨가될 수 있다. DNA의 태그화(DNA는 단편화되고 연결자로 태그됨), 통상의 연결자 및 지표의 첨가는 2 개의 별개의 생물학적 반응으로 달성된다. 이들 반응 후에, DNA 라이브러리는 세정되어 과량의 뉴클레오타이드, 효소, 프라이머, 염 및 기타 다른 오염물질을 제거한다. 그 결과, DNA를 태그하고, 태그된 DNA를 정제하며, 통상의 연결자 및 지표를 첨가하고, 최종 라이브러리 산물을 정제하기 위해 필요한 작업흐름은 복잡하며, 노동 집약적이다.
WO 2013/041983 A1 DE 101 11 520 A1
본 발명의 목적은 오염물질이 없으며, 용적이 작고, 비용이 낮은 샘플 처리를 달성하는 것이다.
상기 목적은 본 발명의 생체분자 단리 및 가공을 위한 상자성 비드를 이용하기 위한 장치, 시스템 및 방법에 의해 달성된다.
본 명세서에 기재된 시스템 및 방법은 오염물질이 없으며, 용적이 작고, 처리가 고속대량이며, 비용이 낮고, 샘플 농도가 높은 샘플 처리를 달성할 수 있게 한다.
도 1은 연속적 유동 모세관 기반 정제 시스템을 예시하는 다이어그램이다.
도 2는 양방향 유동 모세관 기반 정제 시스템을 예시하는 다이어그램이다.
도 3은 연속적 유동 모세관 기반 정제 시스템에 있어서 자기 세정 단계를 예시하는 다이어그램이다.
도 4는 제어기 프로그래밍으로서 실행될 수 있는 방법을 예시한다.
도 5는 제어기 프로그래밍으로서 실행될 수 있는 방법을 예시한다.
도 6은 제어기 프로그래밍으로서 실행될 수 있는 방법을 예시한다.
도 7은 대조군 프로토콜과 모세관 세정 프로토콜 간의 비슷한 회수율을 입증하는 분광광도법 결과를 나타낸다. 회수/용리된 DNA(액틴-베타 앰플리콘)의 농도는 대조군 비드 기반 정제와 모세관 비드 기반 정제 둘 다에 대해 플롯팅된다.
도 8은 대조군 세정 및 모세관 세정을 위한 Nextera 제품 도말을 나타내는 겔 이미지를 나타낸다.
도 9는 대조군 프로토콜 및 모세관 세정 프로토콜로부터 회수된 Nextera 제품을 나타내는 qPCR 결과를 나타낸다.
도 10은 모세관 내 비드 기반 정제를 이용하는 285 bp 앰플리콘의 회수를 확인하는 겔 결과를 나타낸다. 비정제 산물(레인 102, 103)을 정제 산물(레인 104, 105)과 비교하면, 프라이머 이량체와 같은 비특이적 산물은 성공적으로 제거되었다는 것이 명확하다(레인 101은 사다리임).
도 11은 모세관 오염제거의 qPCR 결과, 즉 재사용 예를 나타낸다.
도 12는 제어기 프로그래밍으로서 실행될 수 있는 방법을 예시한다.
도 13은 제어기 프로그래밍으로서 실행될 수 있는 방법을 예시한다.
도 14는 제어기 프로그래밍으로서 실행될 수 있는 광학 분석에 의한 세포 풍부화 방법을 예시한다.
도 15는 제어기 프로그래밍으로서 실행될 수 있는 세포 풍부화 방법을 예시한다.
도 16은 제어기 프로그래밍으로서 실행될 수 있는 상자성 비드를 기능화하는 방법을 예시한다.
도 17은 제어기 프로그래밍으로서 실행될 수 있는 사용된 상자성 비드를 세정 및 제거하는 방법을 예시한다.
도 18은 제어기 프로그래밍으로서 실행될 수 있는 복합재료 액체 세포 기법과의 상호작용 방법을 예시한다.
도 19는 평행 도관 가열 헤드(parallel conduit heated head)의 도면을 나타낸다.
도 20은 상자성 비드 세정 기기로서 실행될 수 있는 장치를 나타낸다.
본 개시내용은 일부 구현 예에서 도관 내의 생체분자의 단리를 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 도관은 양방향 중 한쪽으로 유동할 수 있고, 제어기에 의해 제어된다.
일 구현 예에서, 도 1a를 참조하면, 상자성 비드 및 샘플(2) 및 비혼화성 유체 완충제(3)를 함유하는 슬러그가 도관(1) 내에서 유동한다. 샘플은 표적 생체분자, 생화학 공정 저해제 및 오염물질을 포함할 수 있다. 도관은, 열이 제어된 구역 내에 위치된 자기장을 생성하기 위한 공급원(4)을, 길이를 따라 하나의 위치에서 가진다. 도 1b를 참조하면, 상자성 비드 및 샘플 슬러그(2) 및 용리 완충제 슬러그(5)는 비혼화성 유체(3)에 의해 분리된다. 상자성 비드 및 샘플 슬러그(2)는 정해진 온도에서 자기장 공급원(4)에 도달하고,그 결과 비드가 자기장 내에서 포획된다. 도 1c를 참조하면, 상자성 비드 및 샘플 슬러그(2)는 도관(1) 내에서 계속 유동하는 반면, 결합된 표적 생체분자(6)를 지니는 상자성 비드는 자기장 공급원에 의해 포획된 채로 남아있다. 도 1d를 참조하면, 용리 완충제(5)는 자기장 공급원에 도달하며, 포획된 상자성 비드를 둘러싼다. 결합된 표적 생체분자는 용리 완충제가 도관(1)을 따라 유동함에 따라 용리 완충제 내로 방출된다. 도 1e를 참조하면, 용리 완충제 및 표적 생체분자(7)는 분배 또는 추가 분석을 위해 도관(1) 내에서 지속된다.
일 구현 예에서, 도 2a를 참조하면, 도관(20) 내 자기장 및 열 공급원(22)에서 상자성 비드(23)로부터 용리 완충제(24) 중의 표적 생체분자의 결합 해제 후에, 유동은 반전된다. 도 2c를 참조하면, 용리 완충제 및 표적 생체분자는 분배를 위해 본래의 흡입 위치로 돌아오도록 자기장 공급원 및 열 구역(22)에 의해 포획된 상자성 비드(23)를 거쳐서 유동으로 되돌아온다.
일 구현 예에서, 용리 완충제 및 표적 생체분자는 적용된 자기장이 없는 활성 열 구역 내 용액 중에서 자기 비드 입자와 함께 유동된다. 입자는 일정시간 동안 보유될 수 있으며, 이어서 자기장은 활성화되고 입자는 고정된다.
일 구현 예에서, 도 3a를 참조하면, 도관(31) 내 제어된 온도에서 자기장 공급원(34)에 의해 포획된 상자성 비드(35)로부터 용리 완충제(36) 중 표적 생체분자의 결합 해제 후에, 비혼화성 유체(33) 다음에 비드 제거 및 세정 슬러그(32)가 이어진다. 도 3b를 참조하면, 비드 제거 및 세정 슬러그(32)가 상자성 비드(35)를 둘러쌈에 따라, 자기장 공급원(34)은 제거된다(물리적으로 또는 오프 상태로 변화됨). 도 3c를 참조하면, 상자성 비드(35)는 제거 및 세정 슬러그(32)에 반응하고, 슬러그(37)로서 도관(31)을 따라 계속 유동한다. 이 비드 제거 및 세정 공정은 도관(31)을 재사용할 수 있게 하며, 샘플의 임의의 교차 오염을 방지한다.
일부 구현 예에서, 가열 요소가 자기장 공급원 근처에 위치될 수 있다. 가열 요소는 제어기에 의해 제어될 수 있다. 가열 요소는 트랩핑 부위에 인접하여 위치될 수 있고, 따라서 자기 입자가 고정되거나 혹은 트랩핑 부위에서 슬러그 내에 있고 가열 요소가 활성화될 때, 가열 요소는 자기 입자를 가열할 수 있다. 특정 구현 예에서, 가열 요소는 스트립 히터, 막대 히터, 표면 히터, 카트리지 히터, 방사선원, 가열된 액체 공급원 및 침지 히터를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 가열 요소는 도관에 또는 자기 입자에 열 전달을 초래하는 임의의 기타 다른 구조에 열을 적용하도록 구성될 수 있다. 가열 요소가 활성화될 때, 도관 및/또는 입자는 약 15℃ 내지 약 150℃, 약 25℃ 내지 약 95℃, 또는 약 32℃ 내지 약 68℃의 온도에서 가열될 수 있다. 특정 구현 예에서, 도관 및/또는 입자는 약 25℃, 약 30℃, 약 35℃, 약 40℃, 약 45℃, 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 약 70℃, 약 75℃, 약 80℃, 약 85℃, 약 90℃, 또는 약 95℃의 온도에서 가열된다. 특정 구현 예에서, 도관은 사전 결정된 부위에서 가열됨으로써 열 구역을 정의한다. 특정 구현 예에서, 열 구역 내에 고정된 입자는 도관이 가열된 결과로서 가열된다. 도관 및/또는 입자는 약 1분 내지 약 270분의 일정시간 동안 고온에서 유지될 수 있다. 특정 구현 예에서, 도관 및/또는 입자는 약 1분, 약 2분, 약 3분, 약 4분, 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20　분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 75분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 110분, 약 120분, 약 130분, 약 140분, 약 150분, 약 160분, 약 170분, 약 180분, 약 190분, 약 200분, 또는 약 210분의 일정시간 동안 고온에서 유지될 수 있다. 특정 구현 예에서, 도관 및/또는 입자는 약 1분 내지 약 90분 또는 약 1분 내지 약 60분의 일정시간 동안 고온에서 유지될 수 있다. 특정 구현 예에서, 더 낮은 농도의 샘플(즉, 약 1개의 복제물/㎖ 내지 약 104개의 복제물/㎕의 범위에 있음)에 대해, 도관 및/또는 입자는 고온에서 약 15분 내지 약 270분 또는 약 30분 내지 약 180분의 일정시간 동안 유지될 수 있다. 특정 구현 예에서, 더 낮은 농도의 샘플은 농도가 약 1개의 복제물/㎖ 내지 약 104개의 복제물/㎕, 또는 약 0.01개 복제물/㎕ 내지 약 103개의 복제물/㎕, 또는 약 0.1개의 복제물/㎕ 내지 약 100개의 복제물/㎕, 또는 약 1개의 복제물/㎕ 내지 약 10개의 복제물/㎕인 샘플이다. 특정 구현 예에서, 더 낮은 농도의 샘플은 농도가 약 0.001개의 복제물/㎕, 0.01개의 복제물/㎕, 약 0.05개의 복제물/㎕, 약 0.1개의 복제물/㎕, 약 0.5개의 복제물/㎕, 약 1개의 복제물/㎕, 약 5개의 복제물/㎕, 약 10개의 복제물/㎕, 약 50개의 복제물/㎕, 약 100개의 복제물/㎕, 약 500개의 복제물/㎕, 약 103개의 복제물/㎕, 또는 약 104개의 복제물/㎕인 샘플이다.
대안적으로, 입자를 가열하기보다는 냉각시킬 수 있는 냉각 요소가 자기장 공급원 근처에 위치될 수 있다. 일부 구현 예에서, 가능한 냉각 요소는 열전소자, 냉장 장치, 액체 냉각 장치를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 구현 예에서, 도관은 사전 결정된 부위에서 냉각된다. 특정 구현 예에서, 사전 결정된 부위에 고정된 입자는 도관이 냉각된 결과로서 냉각된다. 특정 구현 예에서, 도관 및/또는 입자는 약 -6℃ 내지 약 60℃의 온도에서 유지될 수 있다. 특정 구현 예에서, 도관 및/또는 입자는 약 -4℃ 내지 약 40℃의 온도에서 유지될 수 있다. 특정 구현 예에서, 도관 및/또는 입자는 약 4℃ 내지 약 28℃의 온도에서 유지될 수 있다. 특정 구현 예에서, 도관 및/또는 입자는 약 -6℃, 약 -4℃, 약 -2℃, 약 0℃, 약 2℃, 약 4℃, 약 6℃, 약 8℃, 약 10℃, 약 12℃, 약 14℃, 약 16℃, 약 18℃, 약 20℃, 약 22℃, 약 24℃, 약 26℃, 약 28℃, 약 30℃, 약 32℃, 약 34℃, 약 36℃, 약 38℃ 또는 약 40℃의 온도에서 유지될 수 있다. 도관 및/또는 입자는 일정 온도에서 약 1분 내지 약 270분의 일정시간 동안 유지될 수 있다. 특정 구현 예에서, 도관 및/또는 입자는 일정 온도에서 약 1분, 약 2분, 약 3분, 약 4분, 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 75분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 110분, 약 120분, 약 130분, 약 140분, 약 150분, 약 160분, 약 170분, 약 180분, 약 190분, 약 200분, 또는 약 210분의 일정시간 동안 유지될 수 있다. 특정 구현 예에서, 도관 및/또는 입자는 일정 온도에서 약 1분 내지 약 90분 또는 약 1 분 내지 약 60분의 일정시간 동안 유지될 수 있다. 특정 구현 예에서, 도관 및/또는 입자는 일정 온도에서 약 15분 내지 약 270분 또는 약 30분 내지 약 180분의 일정시간 동안 유지될 수 있다. 특정 구현 예에서, 더 낮은 농도의 샘플은 농도가 약 1개의 복제물/㎖ 내지 약 104개의 복제물/㎕, 또는 약 0.01개의 복제물/㎕ 내지 약 103 개의 복제물/㎕, 또는 약 0.1개의 복제물/㎕ 내지 약 100개의 복제물/㎕, 또는 약 1개의 복제물/㎕ 내지 약 10개의 복제물/㎕인 샘플이다. 특정 구현 예에서, 더 낮은 농도의 샘플은 농도가 약 0.001개의 복제물/㎕, 0.01개의 복제물/㎕, 약 0.05 개의 복제물/㎕, 약 0.1개의 복제물/㎕, 약 0.5 개의 복제물/㎕, 약 1개의 복제물/㎕, 약 5개의 복제물/㎕, 약 10개의 복제물/㎕, 약 50개의 복제물/㎕, 약 100개의 복제물/㎕, 약 500개의 복제물/㎕, 약 103 개의 복제물/㎕ 또는 약 104개의 복제물/㎕인 샘플이다. 가열 요소가 사용되는 경우이든 또는 냉각 요소가 사용되는 경우이든, 열 제어 구역은 0.5 m2만큼 크거나 혹은 사용되는 도관에 대한 국소 가열, 냉각은, 통상적으로 0.5 mm 직경 또는 임의의 중간 크기만큼 작을 수 있다.
열 구역은 하나의 도관 또는 다수의 도관을 가질 수 있다.
일 구현 예에서, 상기 방법은 모세관, 펌프 및 모세관의 길이를 따른 위치의 국소화된 자기장의 사용을 포함한다. 먼저 완충제, 및 생화학 코팅을 지니는 비드를 포함하는 비드 혼합물의 슬러그, 그리고 표적 생체분자를 모세관 내로 인출한다. 비드는 생화학 코팅을 지니는 자기 비드 또는 상자성 코팅을 지니는 비자기 비드(실리카, 세라믹, 중합체 등)일 수 있다. 이 다음에 비혼화성 유체, 예를 들어 공기 또는 오일의 슬러그가 이어지고, 이어서 에탄올, 공기, 오일 및 용리 완충제의 별개의 슬러그들이 이어진다. 슬러그는 국소화된 자기장을 통과하는 관 내에서 유동하는데, 그 결과 상자성 비드는 자기장 내에 트래핑되는 반면, 비드 혼합물 슬러그의 기타 다른 구성성분은 관을 따라 계속 유동하여 상자성 비드로부터 모든 비결합 분자를 제거한다. 슬러그의 계속적 유동은 다음에 오일 또는 공기 슬러그를 초래하는데, 이는 비드 혼합물 슬러그가 에탄올 슬러그와 혼합되는 것을 방지하기 위한 완충제로서 사용된다. 에탄올 슬러그는 상자성 비드로부터 임의의 잔여 오염물질을 세정한다. 이 세정 단계는 초기 슬러그 픽업 순서의 프로토콜에 따라 반복될 수 있다. 에탄올 슬러그가 통과된 후에, 오일 완충제는 용리 완충제 슬러그 전에 통과하여 에탄올 중 임의의 미량 요소가 관을 따라서 용리 완충제 슬러그와 혼합되는 것을 방지한다. 이어서, 용리 완충제는 상자성 비드를 거쳐서 유동하여, 생체분자 표적을 상자성 비드로부터 용리 완충제 슬러그 내로 방출시킨다. 슬러그는 추가 생물학적 가공 및 분석을 위해 관을 따라서 계속 유동한다.
일 구현 예에서, 도관 및 자기장 공급원은 주위 조건 초과의 제어된 온도에 있다.
일 구현 예에서, 도관 및 자기장 공급원은 주위 조건 미만의 제어된 온도에 있다.
일 구현 예에서, 도관 및 자기장 공급원은 전반적인 공정의 일 양태, 즉 단리 공정의 용리 단계를 위한 영역의 가열을 위해 가열되는 한편, 모든 기타 다른 공정은 주위 온도에서 수행된다.
일 구현 예에서, 제어기는 열 영역의 온도를 제어하기 위해 사용된다.
일 구현 예에서, 상자성 비드를 거친 용리 완충제 슬러그의 통과 후에, 유동 방향은 반전되고, 표적 생체분자를 지니는 용리 완충제는 시스템으로부터 분배된다.
일 구현 예에서, 용리 완충제 슬러그의 통과 후에, 자기장은 제거되고, 뒤 이은 에탄올의 슬러그는 상자성 비드로 되돌아가서 모세관 내에서 유동한다. 이어서, 이 슬러그 다음에 오일 슬러그, 에탄올 슬러그 및 오일 슬러그가 이어져서 모세관을 세정하고 다음 슬러그 반응물의 임의의 오염을 방지한다.
일 구현 예에서, 에탄올 슬러그 다음에는 항상 공기 슬러그가 이어지며; 이는 시스템 내에서 임의의 에탄올의 제거를 보장하는 것을 돕는다. 공기 슬러그는 에탄올을 공기에 증발시킨다.
생체분자의 예는 세포, 핵산, 단백질, 효소, 혈액, 타액 및 유기 물질을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
비드 혼합물은 통상적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 염을 포함하는 완충제 용액 중에서 비드로 구성된다.
비드 크기는 통상적으로 0.1마이크론 내지 500마이크론의 범위 내에 있다.
비드는 자기이거나 또는 자기 코팅이 적용된다.
비드 물질은 자기 코팅이 적용된 중합체, 세라믹 또는 금속일 수 있다.
일 구현 예에서, 비드는 세포 부착을 위해 기능화되어 있다.
일 구현 예에서, 비드는 핵산 부착을 위해 기능화되어 있다.
일 구현 예에서, 비드는 효소, 시약, 프라이머 또는 유기 물질의 부착을 위해 기능화되어 있거나 또는 제한되어 있다.
비혼화성 상을 생성하기 위해 사용되는 오일은 실리콘유, 퍼플루오로카본유 및 퍼플루오로폴리에테르유를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
용리 완충제는 멸균수; 적용분야에 따라서 원하는 범위 내에서 pH를 유지하기 위해 pH 완충제를 첨가한 멸균수를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
도관은 모세관일 수 있다.
도관 물질은 중합체, 세라믹 또는 금속일 수 있다.
도관은 소수성 표면을 가질 수 있다.
도관은 PTFE 물질 모세관과 같은 중합체 모세관일 수 있다.
도관 직경은 통상적으로 10마이크론 내지 10밀리미터의 직경 범위 내에 있다.
일 구현 예에서, 도관은 벽 두께가 적어도 10마이크론 이상이다.
도관의 내부 형상은 원형, 사각형, 타원형, 직사각형인 프로파일일 수 있거나(반드시 이들로 제한되지는 않음), 물결 모양의 표면을 갖거나, 적어도 하나의 편평한 표면을 갖거나, 혹은 표면 강화 특징부를 가진다.
도관 내의 유속은 통상적으로 0.00001㎕/시간 내지 1000㎖/분의 범위 내에 있다.
도관의 외부 형상은 원형, 사각형, 타원형, 직사각형인 프로파일일 수 있거나(반드시이들로 제한되지는 않음), 물결 모양의 표면을 갖거나, 적어도 하나의 편평한 표면을 갖거나, 혹은 표면 강화 특징부를 가진다.
일 구현 예에서, 도관은 기판 상에 에칭된 통로이다.
일 구현 예에서, 도관은 칩 상에 장착된 통로이다.
일 구현 예에서, 도관은 칩 기반 분석 시스템으로 통합된다.
도관 길이를 따라서 적어도 하나 이상의 자기장이 위치된다. 자기장은 영구 자석에 의해 또는 일부 전자기적 방법에 의해 생성될 수 있다.
일 구현 예에서, 자기장은 제어 가능하며, 자기장은 자석의 이동/제거 또는 전자기장의 탈에너지화/중화에 의해 비활성화될 수 있다.
일 구현 예에서, 자기장 공급원은 도관의 원주 둘레로 배열되어 다수의 극을 생성한다.
일 구현 예에서, 자기장 공급원은 도관 길이를 따라 배열되어 다수의 극을 생성한다.
일 구현 예에서, 자기장 및 열 구역은 서로 인접하여 위치된다.
일 구현 예에서, 도관을 따라서 다수의 열 구역이 있다.
일 구현 예에서, 자기장과 열 구역은 도관을 따라서 분리된다.
일 구현 예에서, 도관은 자기장 다음에 열 구역, 그 다음에 다른 자기장이 이어진다.
일 구현 예에서, 시스템을 통한 유동은 정압(positive pressure)에 의해 생성된다.
일 구현 예에서, 시스템을 통한 유동은 부압(negative pressure)에 의해 생성된다.
일 구현 예에서, 상기 방법은 모세관, 펌프 및 모세관의 길이를 따른 위치의 국소화된 자기장의 사용을 포함한다. 비드 혼합물(생화학 코팅을 지니는 비드 및 완충제)의 슬러그가 먼저 모세관 내로 인출된다. 이 다음에 비혼화성 유체, 예를 들어 공기 또는 오일의 슬러그가 이어지고, 다음에, 정제를 위한 샘플의 슬러그가 이어진다. 이것 다음에, 추가적인 비혼화성 슬러그가 인출되고, 에탄올, 공기, 오일 및 용리 완충제의 추가적인 별개의 슬러그들이 인출된다. 슬러그들은 국소화된 자기장을 통과하는 관 내에서 유동하고, 그 결과 상자성 비드는 자기장 내에 트래핑되는 반면, 비드 혼합물 슬러그의 기타 다른 구성성분은 관을 따라 유동한다. 충분한 체류 시간으로 생화학적 공정이 착수될 수 있도록 하는 것을 보장하도록 유동 속도 및 자기장이 제어된다. 유동하는 유체는 도관을 따라서 비드에 생성물을 결합하는 것과 모든 비결합 분자를 상자성 비드로부터 제거하는 것을 계속한다. 슬러그의 계속적 유동은, 수계 슬러그, 예를 들어 이하로 제한되는 것은 아니지만, 비드 혼합물, 에탄올 및 희석 완충제 슬러그의 혼합을 방지하기 위한 완충제로서 사용되는 오일 또는 공기 슬러그를 가져온다. 에탄올 슬러그는 상자성 비드로부터 임의의 잔여 오염물질을 세정한다. 이 세정 단계는 초기 슬러그 픽업 순서의 프로토콜에 따라 반복될 수 있다. 에탄올 슬러그가 통과된 후에, 오일 완충제는 용리 완충제 슬러그 전에 통과하여 에탄올 중 임의의 미량 요소가 관을 따라서 용리 완충제 슬러그와 혼합되는 것을 방지한다. 이어서, 용리 완충제는 상자성 비드를 거쳐서 유동하여 생체분자 표적을 상자성 비드로부터 용리 완충제 슬러그 내로 방출시킨다. 슬러그는 추가 생물학적 가공 및 분석을 위해 관을 따라서 계속 유동한다.
시스템 내로 인출된 슬러그는, 비드 혼합물; 오일; 용리 완충제; 에탄올; 물; 공기; 샘플; 생화학적 혼합물(시약, 효소 등), 비드 기능화 혼합물; 글루코스; 완충제; 첨가제; 광학적 마커; 형광 마커; 및 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
상기 장치 내에서 사용되는 슬러그 순서는 다음을 포함하며, 이들로 제한되지 않는다:
비드 혼합물과 샘플 - 오일 - 용리 완충제.
비드 혼합물과 샘플 - 오일 - 용리 완충제.
비드 혼합물과 샘플 - 공기 - 오일 - 용리 완충제.
비드 혼합물과 샘플 - 공기 - 에탄올 - 오일 - 용리 완충제.
비드 혼합물과 샘플 - 오일 - 에탄올 - 오일 - 용리 완충제.
비드 혼합물과 샘플 - 공기 - 에탄올 - 공기 - 에탄올 - 공기 - 오일 - 용리 완충제.
비드 혼합물과 샘플 - 오일 - 에탄올 - 오일 - 에탄올 - 공기 - 오일 - 용리 완충제.
비드 혼합물과 샘플 - 오일 - 에탄올 - 오일 - 에탄올 - 공기 - 오일 - 생화학적 혼합물 - 오일 - 용리 완충제.
비드 혼합물 - 오일 - 샘플 - 오일 - 에탄올 - 공기 - 오일 - 생화학적 혼합물 - 오일 - 용리 완충제.
비드 혼합물 - 오일 - 비드 기능화 혼합물 - 오일 - 현탁 완충제.
비드 혼합물 - 오일 - 비드 기능화 혼합물 - 오일 - 샘플 - 오일 - 에탄올 - 공기 - 오일 - 생화학적 혼합물 - 오일 - 용리 완충제.
비드 혼합물과 샘플 - 오일 - 세척 완충제 A - 오일 - 세척 완충제 B - 오일 - 공기 - 용리 완충제.
비드 혼합물과 샘플 - 오일 - 세척 완충제 A - 오일 - 세척 완충제 A - 오일 - 세척 완충제 B - 오일 - 세척 완충제 B - 오일 - 공기 - 용리 완충제.
이들 순서 및 기타 다른 순서는 시스템으로부터 비드를 제거하기 위한 추가 단계(즉, 슬러그 통과)를 포함할 수 있다. 이 단계는 관을 따라서 제어기 및 자기장 내 섭동에 의해 수행될 수 있다.
일 구현 예에서, 광학 검출이 자기장 공급원에서 사용된다.
일 구현 예에서, 광학 검출이 슬러그 분석을 위한 자기장 공급원의 상류에서 사용된다.
일 구현 예에서, 광학 검출이 슬러그 분석을 위한 자기장 공급원의 하류에서 사용된다.
일 구현 예에서, 모세관의 다수의 평행선이 단일 자기장을 지나서 사용된다.
일 구현 예에서, 모세관의 다수의 평행선이 다수의 국소화된 자기장을 지나서 사용된다.
일 구현 예에서, 도관의 적어도 하나 이상의 라인이 펌프와 제어기를 지니는 시스템 내로의 통합을 위해 카세트 내에서 함께 조립된다.
일 구현 예에서, 표적 분자를 지니는 용리 완충제는 추가 생화학적 가공 및 분석을 위해 복합 액체 세포 내로 분배된다.
일 구현 예에서, 일회용 모세관이 사용된다. 이들 관은 각각의 샘플 공정을 위해 대체된다.
일 구현 예에서, 도관은 재사용가능하다.
일 구현 예에서, 도관이 재사용가능한 경우, 시스템의 오염물질을 제거하고 세정하기 위해 시스템 내에서 스팀이 사용된다.
일 구현 예에서, 도관이 재사용가능한 경우, 시스템의 오염물질을 제거하고 세정하기 위해 표백제가 사용된다.
일 구현 예에서, 도관이 재사용가능한 경우, 시스템의 오염물질을 제거하고 세정하기 위해 시스템 내에서 상업적 DNA 분해 효소가 사용된다.
일 구현 예에서, 사용되는 세정제는 표백제, 염기, 세제, 표면 살균제, 약한 세제, 약산 및 살균제일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 구현 예에서, 세척 완충제는 에탄올, 이소프로판올, 비이온성 세제, 비변성 세제, 비이온성 비변성 세제, 트리스아미노메탄(TRIS), 염산(HCl) 및 물일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 구현 예는 상자성 비드 및 샘플 유체 주입구, 비혼화성 유체 주입구, 용리 완충제 주입구, 유체 도관, 자기장 공급원, 액체 처리 시스템, 및 액체 처리 시스템과 자기장 공급원에 작동가능하게 연결된 제어기를 갖는 샘플 처리 시스템을 포함한다. 일부 구현 예에서, 제어기는: (1) (a) 자기장 공급원을 지나서, (b) 상자성 비드 및 결합된 표적 생체분자가 포획되고 (c) 남아있는 샘플 내용물이 자기장 공급원을 지나서 슬러그 내에서 계속 유동하는 경우, 상자성 비드 및 샘플의 슬러그를 인출하는 단계; (2) 비혼화성 유체 슬러그를 인출하는 단계; (3) (a) 자기장 공급원을 지나서, (d) 결합된 표적 생체분자가 자기장 내 상자성 비드로부터 용리 완충제 내로 방출되고 (e) 슬러그는 분배 또는 추가 분석을 위해 도관 내에서 계속 유동하는 경우, 용리 완충제 슬러그를 인출하는 단계를 수행하도록, 프로그래밍될 수 있다. 예시적인 흐름도가 도 4 내지 도 6, 도 12 내지 도 18에 나타내어져 있다.
일부 구현 예에서, 액체 처리 시스템은 도관 및 드라이버를 포함한다. 일부 구현 예에서, 제어기는 도관이 단계 (1) 및 (2)를 수행하게 하고, 이어서 일반적으로 에탄올 슬러그인 세정 프로토콜을 위한 슬러그를 인출하며, 이어서 단계 (3) 및 (4)를 수행하기 위해 드라이버를 작동시키도록 프로그래밍될 수 있다(도 5). 일부 구현 예에서, 제어기는 또한 단계 (5) 후에 그리고 단계 (3) 전에, (6) 도관이 생화학 시약의 슬러그를 인출하는 단계를 수행하게 하기 위해 드라이버를 작동시키도록 프로그래밍될 수 있다. (도 6).
일부 구현 예에서, 자기장 공급원은 고정 자석을 포함한다. 일부 구현 예에서, 제어기는 도관이 단계 (1), (2), (3) 및 (4)를 수행하게 하고 (a) 자기장 공급원을 지나서 슬러그를 인출하게 하기 위해 드라이버를 작동시키도록 프로그래밍될 수 있다(도 12). 일부 구현 예에서, 제어기는 도관이 단계 (1), (2), (5), (6), (3) 및 (4)를 수행하게 하는 한편, 작업 (a)를 수행하게 하기 위해 드라이버를 작동시키도록 프로그래밍될 수 있다(도 13).
일부 구현 예에서, 제어기는 도관이 (7) 상자성 비드의 슬러그를 인출하는 단계, (8) 항체의 슬러그를 인출하는 단계, (9) 생물학적 샘플의 슬러그를 인출하는 단계, 및 이어서 작업 (a) 및 (f) 자기장 공급원에서 광학적 검출을 수행하면서 단계 (3)을 수행한 다음, 이어서 단계 (4)를 수행하게 하기 위해 드라이버를 작동시키도록 프로그래밍될 수 있다(도 14). 일부 구현 예에서, 제어기는 작업 (f)를 수행하지 않을 수 있다(도 15).
일부 구현 예에서, 자기장 공급원은 가변 상태 자기장 공급원을 포함한다.
일부 구현 예에서, 열 구역은 자기장 공급원과 함께 배열된다.
일부 구현 예에서, 열 구역은 자기장 공급원을 둘러싼다.
일부 구현 예에서, 열 구역은 자기장 공급원과 독립적으로 활성화된다.
일부 구현 예에서, 제어기는 도관이 (10) 상자성 비드의 슬러그를 인출하는 단계, 이어서 (11) 작업 (a)를 수행하면서, 상자성 비드 기능화 혼합물의 슬러그를 인출하는 단계를 수행하고, 이어서, (12) 상자성 비드 완충제의 슬러그를 인출하여 제어기로 하여금 자기장 공급원의 상태를 변화시키게 하여 (f) 오프 상태로 자기장 공급원을 지나서 슬러그를 유동시키는 단계를 수행한 후에, (13) 완충제 중의 기능화된 상자성 비드 용적을 분배하는 단계를 수행하게 하기 위해 드라이버를 작동시키도록 프로그래밍될 수 있다(도 16).
일부 구현 예에서, 제어기는 (a)를 수행하면서 단계 (4), (5) 및 (6)을 따르고, (12) 상자성 비드 완충제의 슬러그를 인출하고, 자기장 공급원을 변화시켜 (f)를 수행한 다음, 단계 (5)에 이어서 (6)을 수행한 후에, (14) 완충제 용액에서 사용되는 상자성 비드의 용적을 분배하도록 추가로 프로그래밍된다(도 17).
일부 구현 예에서, 제어기는 (15) 캡슐화 액체 주입구로부터 캡슐화 액체를 인출하는 단계, (16) 인출된 캡슐화 액체를 담체 액체의 유리 표면 상에 방출하여, 안정화 특성에 근접하게 하는 단계를 수행한 후에, 단계 (4)를 수행하도록 추가로 프로그래밍된다. 일부 구현 예에서, 제어기는 단계 (4) 대신 단계 (13) 또는 단계 (14)를 수행하도록 프로그래밍될 수 있다.
모세관 비드 기반 정제는 표준 프로토콜에 비해 다수의 이점을 제공한다. 자동화된 세정 방식은 전달 시간을 없애며, 총 프로토콜 시간을 상당히 감소시킨다. 상기 접근은 또한 DNA 정제 단계의 반복성을 개선시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 미세유체 모세관 접근은 적은 용적의 피펫팅과 연관된 상당한 용적 손실 없이 나노리터의 용적을 세정하게 한다. 이는 극도로 작은 샘플 용적을 가공하게 하고, 시약 소모를 감소시킨다. 표준 정제 프로토콜에서 다른 중요한 인자는 사용자에 의해 유도된 가변성이다. 본 시스템 및 방법은 정제 프로토콜로부터 이 가변성을 제거한다.
적용분야
모세관 세정 및 복합 액체 세포 가공
일 구현 예에서, 표적 생체분자를 지니는 용리 완충제가 상호 비혼화성 담체 유체의 유리 표면 상에 위치된 비혼화성 유체 세포 내로 분배된다. 생성된 복합 유체 세포는 수송되고/수송되거나 병합되고/병합되거나 혼합되고/혼합되거나 그에 대해 수행되는 생화학적 가공을 가질 수 있다.
일 구현 예에서, 표적 생체분자를 지니는 용리 완충제는 기계적 안정화 특성을 지니는 상호 비혼화성 담체 유체의 유리 표면 상에 위치된 비혼화성 유체 세포 내로 분배된다.
일 구현 예에서, 도관 내로 인출되는 유체의 순서는 도관으로부터 상호 비혼화성 담체 유체의 유리 표면 상에 분배 시 복합 액체 세포를 생성한다.
일 구현 예에서, 상자성 비드는 표면의 재기능화를 위해 도관 세정 프로토콜 후에 복합 액체 세포 내로 분배된다.
일 구현 예에서, 가공을 위해 도관 내로 인출된 유체는 복합 액체 세포이다.
일 구현 예에서, 시스템 내로 인출된 복합 액체 세포는 상자성 비드 및 완충제를 가진다.
일 구현 예에서, 시스템 내로 인출된 복합 액체 세포는 초기 샘플을 함유한다.
일 구현 예에서, 시스템 내로 인출된 복합 액체 세포는 표적 생체분자를 방출하기 위해 용리 완충제를 함유한다.
일 구현 예에서, 시스템 내로 인출된 복합 액체 세포는 도관 내 자기장 공급원에서 상자성 비드에 대한 가공을 위해 생화학 혼합물을 함유한다.
일 구현 예에서, 복합 액체 세포 기술은 상자성 비드와 초기 샘플을 병합하기 위해 사용된다. 복합 액체 기술은 오염을 방지하며, 용이한 가공 및/또는 인큐베이션; 및/또는 저장; 및/또는 수송; 및/또는 정제 전 샘플의 혼합을 가능하게 한다.
일 구현 예에서, 다수의 복합 유체 세포가 동시에 생성된다.
본 시스템 및 방법이 적합할 수 있는 복합 액체 세포 시스템의 예는, 예를 들어 본 명세서에 참고로 포함되어 있는 PCT/IE2011/000040에 개시되어 있다.
자기 입자를 함유하는 샘플 액체 및 비혼화성 캡슐화 액체를 처리하는 일부 방법은, 도관 내 캡슐화 액체를 유동시키는 단계; 샘플 액체가 (a) 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고 (b) 도관 내의 사전 결정된 트래핑 부위에 위치되도록, 도관 내 샘플 액체를 유동시키는 단계; 트래핑 부위에서 자기장을 적용함으로써 트래핑 부위에서 자기 입자를 고정시키는 단계; 및 (a) 용리 액체가 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 샘플 액체가 트래핑 부위로부터 유동되며, (c) 용리 액체는 트래핑 부위로 유동되고, 고정된 자기 입자를 둘러싸도록, 도관 내 용리 액체를 유동시키는 단계를 포함한다. 표적 분자는 자기 입자에 결합될 수 있다. 결합은 샘플 액체의 유동 전에 또는 공정의 기타 다른 시점에 샘플 액체에서 또는 다른 액체 매질에서 일어날 수 있다. 표적 분자, 예를 들어 생체분자는 또한 용리 액체로 입자를 둘러쌈으로써 자기 입자로부터 유리(비결합)될 수 있다. 입자는 공정 동안 동원될 수도 있고 동원되지 않을 수도 있다. 예를 들어, 샘플 액체가 트래핑 부위에 있을 때, 용리 액체가 트래핑 부위에 있을 때, 또는 다른 유체가 트래핑 부위에 있을 때, 입자는 동원될 수 있다. 상기 방법은 또한 용리 액체에서 자기 입자를 동원시키는 단계, 및 자기 입자 및/또는 유리된 표적 분자와 함께 용리 액체를 트래핑 부위로부터 유동시키는 단계를 포함할 수 있다. 용리 액체는 표적 분자와 함께 트래핑 부위로부터 유동될 수 있는 반면, 자기 입자는 고정된 채로 남아있다.
상기 방법은 또한 (a) 세정 유체가 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 세정 유체가 고정된 자기 입자를 둘러싸도록, 도관 내 하나 이상의 세정 유체를 트래핑 부위로 유동시키는 단계를 포함할 수 있다. 자기 입자는 세정 유체에서 동원될 수 있는 반면, 세정 유체는 트래핑 부위에 있다. 세정 유체는 또한 트래핑 부위로부터 떨어져서 도관 내에서 유동될 수 있다. 동원된다면, 자기 입자는 세정 유체와 함께 운반될 수 있다. 대안적으로, 자기 입자는 트래핑 부위에서 세정 유체 중에서 동원되고, 이어서 다시 고정될 수 있다. 이어서, 세정 유체는 트래핑 부위로부터 떨어져서 도관에서 유동될 수 있는 반면, 자기 입자는 트래핑 부위에 남아있다. 제2 세정 유체 또한 도관 내에서 유동될 수 있다.
자기 입자를 함유하는 제1 샘플 액체, 제2 샘플 액체 및 캡슐화 액체(샘플 액체는 둘 다 캡슐화 액체와 비혼화성임)를 처리하기 위한 일부 방법은, 도관 내 캡슐화 액체를 유동시키는 단계; 제1 샘플 액체가 (a) 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 도관 내의 사전 결정된 트래핑 부위에 위치되도록, 도관 내 제1 샘플 액체를 유동시키는 단계; 트래핑 부위에서 자기장을 적용함으로써 트래핑 부위에서 자기 입자를 고정하는 단계; 제1 샘플 액체가 트래핑 부위로부터 유동되는 한편, 자기 입자는 트래핑 부위에 고정된 채로 남아있도록, 도관 내 제1 샘플 액체를 유동시키는 단계; 및 제2 샘플 액체가 (a) 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 고정된 자기 입자를 둘러싸도록, 도관 내에서 제2 샘플 액체를 유동시키는 단계를 포함한다.
제2 샘플 액체가 자기 입자를 둘러쌀 때, 제2 샘플 액체는 자기 입자에 결합하는 표적 분자, 예를 들어 생체분자를 함유할 수 있다. 자기 입자는 제2 샘플 액체에서 고정된 채로 남아있을 수 있거나, 또는 제2 샘플 액체에서 동원될 수 있다. 상기 방법은 또한 제2 샘플 액체를 유동시킨 후에, (a) 용리 액체가 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 제2 샘플 액체가 트래핑 부위로부터 유동되며, (c) 용리 액체가 트래핑 부위로 유동되고 고정된 자기 입자를 둘러싸도록, 도관 내 용리 액체를 유동시키는 단계를 포함할 수 있다. 용리 액체를 유동시키는 단계는 용리 액체로 자기 입자를 둘러쌈으로써 자기 입자로부터 표적 생체분자를 유리시키는 단계를 포함할 수 있다. 자기 입자는 용리 액체 중에서 동원되거나 또는 용리 액체 중에 고정된 채로 남아있을 수 있다.
상기 방법은 또한 세정 유체를 사용하는 단계, 예를 들어 제2 샘플 액체를 유동시킨 후에, (a) 제1 세정 액체가 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 제2 샘플 액체가 트래핑 부위로부터 유동되며, (c) 제1 세정 액체가 트래핑 부위로 유동되고 고정된 자기 입자를 둘러싸도록, 도관 내에서 제1 세정 액체를 유동시키는 단계; 및 제1 세정 액체를 유동시킨 후에, (a) 용리 액체는 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 제1 세정 액체가 트래핑 부위로부터 유동되며, (c) 용리 액체는 트래핑 부위로 유동되고, 고정된 자기 입자를 둘러싸도록, 도관 내 용리 액체를 유동시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 임의의 방법에서, 샘플 액체 및 캡슐화 액체는 개시된 방법 동안 일정 시점에 또는 개시된 방법 전체에 걸쳐 복합 액체 세포를 구성할 수 있다. 유사하게, 임의의 개시된 방법에서, 마커는 표적 분자와 함께 사용될 수 있다. 이와 같은 마커는 트래핑 부위의 광학적 또는 형광 질의(interrogation)에 의해 검출될 수 있다. 임의의 이들 방법에서, 도관은, 예를 들어 모세관일 수 있다.
액체 처리 시스템은 사전 결정된 트래핑 부위를 갖는 도관, 도관 내 위치에 대해 정압, 부압을 적용하거나 또는 어떠한 외부 압력이 없도록 구성된 펌프, 활성화되었을 때 트래핑 부위에서 자기장을 적용하고 활성화되지 않았을 때 자기장을 실질적으로 적용하지 않도록 구성된 자기장 공급원, 및 펌프 및/또는 자기장 공급원을 활성화시킬 수 있도록 펌프와 자기장 공급원에 작동가능하게 부착된 제어기를 포함할 수 있다. 제어기는, 캡슐화 액체가 도관 내에서 유동되도록 펌프를 활성화시키고; 샘플 액체가 (a) 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 도관 내의 트래핑 부위에서 위치되는 방법으로 샘플 액체가 도관 내에서 유동되도록 펌프를 활성화시키며(샘플 액체는 자기 입자를 함유함); 자기 입자가 트래핑 부위에서 고정되도록 자기장 공급원을 활성화시키고; (a) 용리 액체가 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 샘플 액체가 트래핑 부위로부터 유동되며, (c) 용리 액체가 트래핑 부위로 유동되고, 자기 입자를 둘러싸는 방법으로 용리 액체가 도관 내에서 유동되도록 펌프를 활성화시키도록, 프로그래밍될 수 있다. 더 일반적으로는, 제어기는 임의의 개시된 방법을 수행하기 위해 펌프를 활성화시키고 자기장 공급원을 활성화 및/또는 비활성화시키도록 프로그래밍될 수 있다. 도관은, 예를 들어 모세관일 수 있다. 펌프는 도관에 정압 및/또는 부압을 적용하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 펌프는 정압 하에서 일 방향으로 도관 내 유체를 유동시키고, 부압 하에서 다른 방향으로 도관 내 유체를 유동시키도록 구성될 수 있다.
서열화
다수의 차세대 시퀀싱(NGS) 플랫폼은 구체적 범위의 염기쌍 길이 내에서 DNA 단편으로 구성되는 DNA 라이브러리를 필요로 한다. 추가적으로, 서열이 PCR을 사용하여 증폭될 수 있게 하고 라이브러리 단편이 시퀀서 유동 세포로 어닐링될 수 있도록 이들 DNA 단편은 특이적 뉴클레오타이드 서열(연결자)에 태그될 필요가 있다. 서열 특이적 지표는 또한 단일 유동 세포 내에서 샘플을 다중복합화할 때, 개개 샘플을 동정하기 위해 DNA 단편에 첨가될 수 있다. DNA의 태그화(DNA는 단편화되고 연결자를 이용하여 태그됨) 및 통상적인 연결자와 지표의 첨가는 2 개의 별개의 생물학적 반응으로 달성된다. 이들 반응 후에, DNA 라이브러리는 과량의 뉴클레오타이드, 효소, 프라이머, 염 및 기타 다른 오염물질을 제거하기 위해 세정된다. 그 결과, DNA를 태그하고, 태그된 DNA를 정제하며, 통상적인 연결자와 지표를 첨가하고 최종 라이브러리 산물을 정제하기 위해 필요한 작업 흐름은 복잡하며, 노동 집약적이다. 일 구현 예에서, 모세관 기반 세정 시스템이 유전자 시퀀싱에 필요한 샘플 정제 및 DNA 단리 단계를 자동화하기 위해 사용될 수 있다. 본 공정의 완전한 예가 이하에 개시되어 있다.
유전자 시퀀싱 비드 코팅
유전자 시퀀싱 비드 제조는 작은 비드가 적용분야 특이적 화학에서 코팅되게 하는 공정이다. 일 구현 예에서, 유전자 선별에 앞서 비드의 코팅은 비드 혼합물 슬러그의 유동 다음에, 정자기장을 지나서 도관 내에서 비드를 코팅하기 위해 사용된 특이적 프라이머 화학에 의해 달성된다. 이어서, 용리 완충제 슬러그가 통과되는데, 이때 비드 농도는 슬러그 내에서 사용된 용리 완충제의 용적에 의해 제어될 수 있다. 자기장은 제거되며, 기능화된 비드 혼합물은 추가 가공을 위해 도관을 따라서 유동한다.
일 구현 예에서, 도관 내의 유동은 반전될 수 있으며, 기능화된 비드 혼합물은 저장 또는 추가 생화학적 가공을 위해 분배된다.
이들 방법은 현재 전통적 기법을 사용하여 달성할 수 없는 유체의 마이크로리터 이하의 용적을 조작하고 조합하는 편리한 방법을 제공함으로써, 초기 샘플 용적을 감소시키고, 반응 용적을 감소시킴으로써 비드 코팅 효율을 개선시킨다. PCR 및 열 주기 및 유전자 시퀀싱을 사용하는 추가적인 가공은 적용범위 특이적이다.
이 기술의 사용은 상대적으로 작은 이들 표적 용적에 대한 수집 절차를 크게 단순화시킨다. 상기 시스템은 가공에서 생물학적 샘플이 임의의 피펫팅 손실을 초래하지 않으므로 100% 용적 회수를 용이하게 한다. 이들 특성은 생화학 공정의 자동화를 더 용이하게 하는 것을 가능하게 한다.
작은 RNA의 크기 선택
작은 RNA 분자의 시퀀싱은 역전사 후 압도적인 양의 배경 비특이적 산물에 의해 복잡하게 되며, 이의 길이는 작은 표적 분자보다 미미하게 더 작다. 현재, 작은 표적 cDNA 분자(RNA로부터 역전사됨)는 원하는 겔 전기영동 밴드를 절단함으로써 크기가 선택된다. 통상적으로, 겔 슬라이스로부터의 DNA는 추출되고, PCR 반응에 첨가되며, 이어서 스핀 컬럼 기반 접근을 사용하여 세정된다. 작업흐름은 노동 집약적이며, DNA 수율/회수율은 불량하다.
일 구현 예에서, 정제 및 크기 선택은 모세관에서 필요한 시약을 펌핑함으로써 달성된다. 구체적 용적의 DNA 비드 용액, 에탄올, 공기 및 용리 완충제가 도관 내에서 인출되고 유동된다. DNA-비드 용액이 자기장을 통해 유동함에 따라, 비드 및 결합된 DNA는 용액으로부터 제거되어 도관벽에서 펠렛을 형성한다. 후속 에탄올 슬러그가 고정 펠렛을 지나서 유동함에 따라 비드-DNA 펠렛은 세척된다. 이어서, DNA는 비드를 용리시키고, 용리 완충제가 비드 펠렛을 지나서 유동함에 따라 용액 내로 용리된다. 펌프를 뒤집고, NGS 라이브러리 제조 작업흐름의 후속 단계를 위해 정제된 DNA를 함유하는 용리액을 회수한다.
일 구현 예에서, 상자성 비드는 cDNA 산물과 혼합된다. 특이적 완충제 조건을 선택함으로써 자기 비드의 크기 선택 특성을 사용하여(상이한 크기의 DNA는 상이한 완충제 조건을 사용함으로써 결합될 수 있음), 작은 cDNA 분자는 비드에 배타적으로 결합될 수 있는 반면, 남아있는 분자는 용액 중에 남아있고 폐기를 위해 전달된다. 이어서 용리 완충제가 고정된 비드 펠렛을 통과함에 따라 작은 표적 분자가 용리된다.
일 구현 예에서, 크기 선택 공정은 에탄올 슬러그 없이 수행된다.
NGS 시퀀싱을 위한 DNA 라이브러리의 크기 선택
각각의 차세대 시퀀서는 최적의 판독 길이(염기쌍)를 가진다. 라이브러리 구성 동안, DNA는 광범위한 염기쌍 길이 범위를 이용하여 DNA 분자로 단편화된다. 크기 선택은 현재 마이크로타이터 플레이트 상에서 상자성 비드를 사용하여 수행되며, 노동 집약적이고 피펫팅 에러와 사용자 프로토콜 변화로부터의 비효율을 겪는다. 모세관 기반 도관 시스템은 DNA 라이브러리의 크기 선택을 위해 사용될 수 있다.
핵산 정제
모세관 기반 도관 시스템은 PCR 전에 및/또는 후에 샘플의 정제 및/또는 단리를 위해 사용될 수 있다. 상자성 비드는 핵산의 정제 및/또는 단리를 위한 부위로서 사용된다.
상자성 비드는 PCR 후에 과량의 비혼입 데옥시뉴클레오타이드 삼인산염, 염 및 효소를 제거하기 위해 사용될 수 있다. 이들 오염물질의 효율적인 제거는 하류의 적용, 예컨대 유전자형, 생어(Sanger) 및 차세대 시퀀싱에서의 성공을 보장하기 위해 필요하다. 비드 기반 정제는 앰플리콘의 높은 회수율, 오염물질의 효율적인 제거 및 세정의 유연성을 제공한다. 일부 가능한 구현 예 방법의 예가 이하에 제공되어 있다.
단백질 풍부화
단백질 풍부화는 또한 모세관 기반 도관 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 상자성 비드는 표적 단백질을 풍부하게 하는 부위로서 사용된다.
비드는 항체에 높은 친화도를 지니는 매질로 코팅된다. 표적 단백질에 특이적인 항체가 비드에 첨가되어, 비드 표면 상에 위치된 결합 부위에 결합된다. 이어서, 표적 단백질을 함유하는 생물학적 샘플이 첨가되어 항체에 부착된다. 자기장을 적용하는 것은 배경 분자를 함유하는 생물학적 샘플로부터의 분리와 단리를 가능하게 한다. 상청액을 폐기하는 것과 용리 완충제를 첨가하는 것은 정제된 표적 단백질을 산출한다. 비드 기반 단백질 풍부화 접근은 모세관 기반 시스템을 사용하여 달성되어 자동화된 고속대량 방식으로 단백질을 농축시키는 것을 가능하게 한다.
합성 핵산 구조의 구성:
상자성 비드는 핵산 구조(올리고뉴클레오타이드)를 조립하는 것을 보조하기 위해 본 명세서에 약술한 것과 유사한 시스템에서 사용될 수 있다.
자기 비드는 적절한 결합 화학을 노출시킴에 있어서 중요한 거대 표면 대 용적비를 제공한다. 올리고뉴클레오타이드 합성은 원하는 서열이 조립될 때까지 증가되는 사슬의 5'-말단에 뉴클레오타이드 잔기의 단계적 첨가에 의해 수행된다. 단계는 작용기가 결합 전 산 용액에 의해 제거되는 차단 해제(탈트리틸화) 단계를 포함한다. 결합이 도입되고 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트와 결합하여 다음 염기를 구성한다. 이어서, 캐핑이 뒤따라 일어나서 추가 사슬 신장을 방지한다. 이는 보통 아세트산 무수물 및 1-메틸이미다졸로 고체 지지체를 처리함으로써 수행된다. 이어서, 산화가 수행되어 안정성을 증가시킨다.
세포 풍부화 /단리
상자성 비드는 생물학적 샘플로부터 표적 세포를 단리시키고 풍부하게 하기 위해 사용될 수 있다. 이 접근은 컬럼을 이용하는 일 없이 생물학적 샘플로부터 직접적으로 세포를 풍부화시켜서, 높은 세포 생존력 및 수율을 보장한다. 이는 표적 세포가 극도로 희귀한 최소 잔존 질환에서의 종양 세포 분석과 같은 적용분야에서 특히 중요하다.
풍부화는 특이적 세포 마커에 대한 항체로 코팅한 상자성 비드를 생물학적 샘플에 첨가함으로써 달성된다. 표적 세포는 비드에 결합되고 자석을 사용하여 분리된다. 이어서, 배경 세포를 함유하는 상청액은 폐기된다. 이어서, 분석을 위해 표적 세포가 회수될 수 있다. 이 상자성 비드 기반 세포 단리 및 풍부화 접근은 모세관 기반 시스템에서 실행되어 자동화된 세포 풍부화 및 하류 분석을 위한 기타 다른 미세유체 기술과의 통합을 가능하게 할 수 있다.
예시적 구현 예
특정 구현 예에서, 본 발명은 자기 입자를 함유하는 샘플 액체 및 캡슐화 액체를 처리하기 위한 방법에 관한 것이며, 샘플 액체 및 캡슐화 액체는 비혼화성이고, 상기 방법은,
도관 내 캡슐화 액체를 유동시키는 단계;
샘플 액체가 (a) 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 도관 내의 사전 결정된 트래핑 부위에 위치되도록, 도관 내 샘플 액체를 유동시키는 단계;
트래핑 부위에서 자기장을 적용함으로써 트래핑 부위에서 자기 입자를 고정시키는 단계;
트래핑 부위에서 도관을 가열함으로써, 고정된 자기 입자를 가열하는 단계; 및
(a) 용리 액체가 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 샘플 액체가 트래핑 부위로부터 유동되며, (c) 용리 액체가 트래핑 부위로 유동되고, 고정된 자기 입자를 둘러싸도록, 도관 내 용리 액체를 유동시키는 단계;
를 포함한다.
특정 구현 예에서, 본 발명은,
도관 내 샘플 액체를 유동시키기 전에 자기 입자에 표적 생체분자를 결합시키는 단계
를 추가로 포함하며, 여기서 상기 용리 액체를 유동시키는 것은 자기 입자를 용리 액체로 둘러쌈으로써 자기 입자로부터 표적 생체분자를 유리시키는 단계를 추가로 포함하는, 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 용리 액체를 유동시킨 후에 자기장을 제거함으로써 용리 액체 중의 자기 입자를 동원시키는 단계를 추가로 포함하는, 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 동원된 자기 입자를 함유하는 용리 액체를 트래핑 부위로부터 유동시키는 단계를 추가로 포함하는, 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 유리된 표적 생체분자를 함유하는 용리 액체를 트래핑 부위로부터 유동시키는 한편, 자기 입자는 적용된 자기장에 의해 고정된 채로 남아있는 단계를 추가로 포함하는, 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이다.
특정 구현 예에서, 본 발명은,
(a) 세정 유체가 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 제1 세정 유체가 고정된 자기 입자를 둘러싸도록, 도관 내 제1 세정 유체를 트래핑 부위로 유동시키는 단계;
자기장을 제거함으로써 제1 세정 유체 중의 자기 입자를 동원시키는 단계; 및
도관 내 동원된 자기 입자를 함유하는 제1 세정 유체를 트래핑 부위로부터 유동시키는 단계
를 추가로 포함하는, 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 도관 내 제2 세정 유체를 유동시키는 단계를 추가로 포함하는, 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이다.
특정 구현 예에서, 본 발명은,
(a) 세정 유체가 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 제1 세정 유체가 고정된 자기 입자를 둘러싸도록, 도관 내 제1 세정 유체를 트래핑 부위로 유동시키는 단계;
자기장을 제거함으로써 제1 세정 유체 중의 자기 입자를 동원시키는 단계;
자기장을 재적용함으로써 동원된 자기 입자를 고정시키는 단계; 및
도관 내 제1 세정 유체를 트래핑 부위 및 고정된 자기 입자로부터 유동시키는 단계를 추가로 포함하는, 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 도관 내 제2 세정 유체를 유동시키는 단계를 추가로 포함하는, 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 자기 입자를 함유하는 제1 샘플 액체, 제2 샘플 액체 및 캡슐화 액체를 처리하기 위한 방법에 관한 것이며, 샘플 액체는 둘 다 캡슐화 액체와 비혼화성이고, 상기 방법은,
도관 내 캡슐화 액체를 유동시키는 단계;
제1 샘플 액체는 (a) 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 도관 내의 사전 결정된 트래핑 부위에 위치되도록, 도관 내 제1 샘플 액체를 유동시키는 단계;
트래핑 부위에서 자기장을 적용함으로써 트래핑 부위에서 자기 입자를 고정시키는 단계;
트래핑 부위에서 도관을 가열함으로써, 고정된 자기 입자를 가열하는 단계;
제1 샘플 액체가 트래핑 부위로부터 유동되는 한편 자기 입자가 트래핑 부위에서 고정된 채로 남아있도록, 도관 내 제1 샘플 액체를 유동시키는 단계; 및
제2 샘플 액체가 (a) 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 고정된 자기 입자를 둘러싸도록, 도관 내 제2 샘플 액체를 유동시키는 단계
를 포함한다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되, 제2 샘플 액체는 제2 샘플 액체가 고정된 자기 입자를 둘러쌀 때 자기 입자에 결합하는 표적 생체분자를 함유한다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 제2 샘플 액체를 유동시킨 후에, (a) 용리 액체가 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 제2 샘플 액체가 트래핑 부위로부터 유동되며, (c) 용리 액체가 트래핑 부위로 유동되고 고정된 자기 입자를 둘러싸도록, 도관 내 용리 액체를 유동시키는 단계를 추가로 포함하는, 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되, 용리 액체를 유동시키는 단계는 자기 입자를 용리 액체로 둘러쌈으로써 자기 입자로부터 표적 생체분자를 유리시키는 단계를 추가로 포함한다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 용리 액체를 유동시킨 후에 자기장을 제거함으로써 용리 액체 중에서 자기 입자를 동원시키는 단계를 추가로 포함하는, 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이다.
특정 구현 예에서, 본 발명은,
제2 샘플 액체를 유동시킨 후에, (a) 제1 세정 액체가 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 제2 샘플 액체가 트래핑 부위로부터 유동되며, (c) 제1 세정 액체가 트래핑 부위로 유동되고, 고정된 자기 입자를 둘러싸도록, 도관 내 제1 세정 액체를 유동시키는 단계; 및
제1 세정 액체를 유동시킨 후에, (a) 용리 액체가 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 제1 세정 액체가 트래핑 부위로부터 유동되며, (c) 용리 액체가 트래핑 부위로 유동되고, 고정된 자기 입자를 둘러싸도록, 도관 내 용리 액체를 유동시키는 단계
를 추가로 포함하는, 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 제2 샘플 액체를 유동시킨 후에, 자기장을 제거함으로써 제2 샘플 액체 중의 자기 입자를 동원시키는 단계를 추가로 포함하는, 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되, 제2 샘플 액체 및 캡슐화 액체는 복합 액체 세포를 구성한다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되, 트래핑 부위의 광학적 또는 형광 질의에 의해 마커가 존재하는지의 여부를 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되, 도관은 모세관이다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되, 도관은 약 15℃ 내지 약 150℃의 온도에서 가열된다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되, 도관은 약 25℃ 내지 약 95℃의 온도에서 가열된다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되, 도관은 약 32℃ 내지 약 68℃의 온도에서 가열된다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되, 도관은 약 1분 내지 약 270분의 일정시간 동안 가열된다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되, 도관은 약 1 분 내지 약 180분의 일정시간 동안 가열된다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되, 도관은 약 30분 내지 약 180분의 일정시간 동안 가열된다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되, 도관은 약 1 분 내지 약 90분의 일정시간 동안 가열된다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되, 도관은 약 1 분 내지 약 60분의 일정시간 동안 가열된다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되, 도관은 약 30분 내지 약 180분의 일정시간 동안 가열되며; 샘플 액체 중 표적 생체분자의 농도는 약 1개의 복제물/㎖ 내지 약 104개의 복제물/㎕이다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 자기 입자를 함유하는 샘플 액체 및 캡슐화 액체를 처리하는 방법에 관한 것이며, 샘플 액체와 캡슐화 액체는 비혼화성이고, 상기 방법은:
도관 내 캡슐화 액체를 유동시키는 단계;
샘플 액체가 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이도록 도관 내 샘플 액체를 유동시키는 단계;
사전 결정된 부위에서 도관을 가열함으로써, 열 구역을 정의하는 단계;
샘플 액체를 도관을 통해 열 구역으로 유동시키는 단계;
열 구역 내에 자기장을 적용함으로써 열 구역 내 자기 입자를 고정시켜, 트래핑 부위 내에 자기 입자를 고정시키는 단계; 및
(a) 용리 액체가 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 샘플 액체가 트래핑 부위로부터 유동되며, (c) 용리 액체가 트래핑 부위로 유동되고, 고정된 자기 입자를 둘러싸도록, 도관 내 용리 액체를 유동시키는 단계
를 포함한다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되, 도관은 약 15℃ 내지 약 150℃의 온도에서 가열된다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되, 도관은 약 25℃ 내지 약 95℃의 온도에서 가열된다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되, 도관은 약 32℃ 내지 약 68℃의 온도에서 가열된다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되, 도관은 약 1분 내지 약 270분의 일정시간 동안 가열된다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되, 도관은 약 1분 내지 약 180분의 일정시간 동안 가열된다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되, 도관은 약 30분 내지 약 180분의 일정시간 동안 가열된다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되, 도관은 약 1분 내지 약 90분의 일정시간 동안 가열된다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되, 도관은 약 1분 내지 약 60분의 일정시간 동안 가열된다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되,
도관 내 샘플 액체를 유동시키기 전에 표적 생체분자를 자기 입자에 결합시키는 단계
를 추가로 포함한다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 관한 것이되, 도관은 약 30분 내지 약 180분의 일정시간 동안 가열되며; 샘플 액체 중 표적 생체분자의 농도는 약 1개의 복제물/㎖ 내지 약 104개의 복제물/㎕이다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 사전 결정된 트래핑 부위를 갖는 도관, 도관 내 위치에 정압, 부압을 적용하거나 또는 어떠한 외부 압력이 없도록 구성된 펌프, 활성화되었을 때 트래핑 부위에서 자기장을 적용하고 활성화되지 않았을 때 자기장을 실질적으로 적용하지 않도록 구성된 자기장 공급원, 트래핑 부위에서 도관에 열을 적용하도록 구성된 가열 요소 및 펌프 및/또는 자기장 공급원을 활성화시킬 수 있도록 펌프와 자기장 공급원에 작동가능하게 부착된 제어기를 포함하는 액체 처리 시스템에 관한 것이며, 제어기는,
캡슐화 액체가 도관 내에서 유동되도록 펌프를 활성화시키고;
샘플 액체가 (a) 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 도관 내에서 트래핑 부위에 위치되는 방법으로 샘플 액체가 도관 내에서 유동되도록 펌프를 활성화시키며, 상기 샘플 액체는 자기 입자를 함유하고;
자기 입자가 트래핑 부위에서 고정되도록 자기장 공급원을 활성화시키며;
고정된 자기 입자가 가열되도록 가열 요소를 활성화시키고;
(a) 용리 액체가 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 샘플 액체가 트래핑 부위로부터 유동되며, (c) 용리 액체가 트래핑 부위로 유동되고, 자기 입자를 둘러싸는 방법으로 용리 액체가 도관 내에서 유동되도록 펌프를 활성화시키도록 프로그래밍된다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 시스템 중 임의의 하나에 관한 것이되, 도관은 모세관이다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 시스템 중 임의의 하나에 관한 것이되, 캡슐화 액체, 샘플 액체 및 용리 액체는 펌프에 의해 도관에 적용되는 부압에 의해 유동된다.
특정 구현 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 시스템 중 임의의 하나에 관한 것이되, 캡슐화 액체, 샘플 액체 및 용리 액체는 펌프에 의해 도관에 적용되는 정압에 의해 유동된다.
실시 예
다음의 실시 예는 특정 구현 예를 예시하지만, 개시한 대상의 범주를 제한하는 것으로 고려하여서는 안 된다.
285 bp 앰플리콘의 정제 및 회수
본 실시 예는 GenCell Biosystems의 모세관 기반 핵산 정제 시스템으로부터의 데이터를 제시한다. 모세관 정제 시스템이 PCR 산물을 정제하고 회수할 수 있다는 것을 입증하기 위해 본 실험을 수행하였다.
PCR을 사용하여 의도된 산물을 증폭시키기 위해 액틴-베타 유전자 상에서 285 bp 단편을 표적화하는 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하였다. 이어서, 이 산물을 모세관 기반 상자성 비드 정제 기기의 성능을 평가하기 위해 사용하였다. 18㎕의 비드 완충제 혼합물(AMPure Xp, Agencourt)을 PCR관 내에서 10㎕의 PCR 산물에 피펫팅하였다. 1.8× 비드 혼합물 농도는 100 bp보다 더 큰 단편이 회수되는 것을 보장한다. 비드-DNA 혼합물을 피펫 혼합하고 나서, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켜 AMPure Xp 프로토콜에 의해 권장되는 바와 같이 비드에 DNA를 결합시켰다. 28㎕ 비드-DNA 용액을 PTFE 모세관(400 마이크론 내부 직경) 내로 흡입하고 나서, 70% 에탄올의 2개의 5㎕ 슬러그, 공기의 10㎕ 슬러그, 폴리디메틸실록산 오일 2.5㎕ 및 용리 완충제(뉴클레아제 유리수) 10㎕를 흡입하였다. DNA-비드 혼합물, 에탄올, 공기, 오일 및 용리 완충제 슬러그의 순서로 주사기 펌프(PHD 2000, Harvard Apparatus)를 사용하여 10㎕/분의 일정한 유속으로 펌핑하였다. 기재한 시약의 순서는 AMPure Xp 프로토콜에 의해 구체화되는 정제 단계를 모방하였다. 비드-DNA 용액이 자석을 통과함에 따라 비드 및 결합된 표적 DNA를 비드-DNA 용액으로부터 모세관의 벽까지 제거하였다. 에탄올 슬러그는 이제 고정된 DNA-비드 펠렛을 거쳐서 통과하여 펠렛을 세척하고 잔여 오염물질을 제거하였다. 이어서, 공기 및 오일 슬러그를 펠렛을 지나서 전달하여, 잔여 에탄올을 제거하였다. 정제 공정의 최종 단계에서, 용리 완충제 슬러그가 비드 펠렛을 통과함에 따라 용리 완충제 슬러그는 비드로부터 용액 내로 표적 DNA를 용리시켰다. 펌프를 뒤집고 나서, 분석을 위해 용리액을 멸균 PCR 관 내에서 회수하였다. 이 실험을 2회 중복해서 수행하였다. 이어서, 겔 전기영동을 사용하여 용리액을 분석하였다.
2개의 용리액 샘플을 비정제 285-bp 액틴-베타 산물과 비교하는 겔 전기영동 결과를 도 10에서 알 수 있다. 도 10을 관찰하면, 기재한 모세관 정제 기법은 385 bp를 성공적으로 회수하였음이 분명하다. 용리 밴드를 비세정 PCR 산물 밴드와 비교하면, 정제 절차가 프라이머 이량체와 같은 비특이적 산물을 제거하였음이 명확하다.
DNA 회수율: 종래 DNA 단리 프로토콜과의 비교
본 실시 예는 종래 비드 기반 정제 프로토콜과 모세관 비드 기반 정제 프로토콜 사이의 회수율을 비교하여 GenCell Biosystems 모세관 핵산 정제 시스템으로부터의 데이터를 제시한다. 이들 실험을 모세관 비드 기반 정제 접근의 성능을 평가하기 위해 사용하였다.
285 bp 액틴-베타 앰플리콘을 정제를 위한 DNA 주형으로서 사용하였다. 실시 예 285 bp 앰플리콘의 정제 및 회수에서 상기 약술한 모세관 비드 기반 정제 프로토콜에 따라서 앰플리콘을 정제하고 회수하였다. 이 실험을 4 회 중복해서 수행하고 나서, 분석을 위해 용리액 샘플을 저장하였다.
별개의 실험에서, 285 bp 앰플리콘을 함유하는 10㎕의 주형 용액을 AMPure Xp 프로토콜에 따라 세정하였다. 18㎕의 AMPure Xp 비드 혼합물을 10㎕의 주형 용액을 함유하는 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 피펫팅하였다. DNA-비드 혼합물을 피펫 혼합하고 나서, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 마이크로타이터 플레이트를 자기 플레이트 상에 두어서 결합된 DNA를 함유하는 비드를 용액으로부터 분리시켰다. 피펫을 사용하여 상청액을 흡입하고 나서, 폐기하였다. 200㎕의 70% 에탄올을 비드 펠렛에 첨가하고 나서, 실온에서 30초 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 에탄올을 피펫을 사용하여 흡입하고 나서, 폐기하였다. 이를 총 2회 세척 동안 반복하였다. 최종 세척 단계 후에, 펠렛을 건조시켜 모든 미량의 에탄올이 제거되는 것을 보장하였다. 10㎕의 용리 완충제(뉴클레아제 유리수)를 웰에 첨가하고 나서, 비드 펠렛에 피펫팅하여 자기 플레이트로부터 제거하고 나서, 비드의 DNA를 용액 내로 용리시켰다. 마이크로타이터 플레이트를 자기 플레이트 상에 두고 나서, 용리액을 새로운 플레이트에 옮겼다. 이 실험을 3회 중복해서 수행하고 나서, 분석을 위해 샘플을 저장하였다.
종래 세정 프로토콜로부터 용리액을 회수하고 나서, UV-vis 분광광도법 측정(NanoDrop 2000, Thermo Scientific)을 사용하여 모세관 세정 접근을 정량화하였다. UV-vis 분광광도법 정량화 결과를 도 7에서 알 수 있다. 도 7에 나타낸 정량화 결과는 모세관 세정 회수율이 종래 프로토콜을 사용하여 달성한 것과 동일하다는 것을 입증한다. 이 결과는 DNA 회수율이 종래 AMPure Xp 프로토콜을 사용하여 달성한 것과 동일하다는 것을 확인한다. 본 명세서에 약술한 모세관 DNA 정제 접근은 성능의 트레이드오프(trade-off) 없이 고도로 자동화된 정제를 제공한다.
DNA 라이브러리 제조
본 실시 예는 모세관 비드 기반 정제가 차세대 시퀀싱을 위한 DNA 라이브러리 제조 프로토콜에 포함될 수 있는 방법을 예시한다. 본 명세서에 제시한 데이터는 DNA 라이브러리 제조 프로토콜 내에서 다양한 생물학적 공정 후에 현재 수행한 정제 단계가 모세관 세정 접근을 사용하여 대체되어 차세대 시퀀서를 위한 DNA 라이브러리 제조에 대한 완전히 자동화된 고속대량 접근을 제공할 수 있다는 것을 입증한다.
본 실시 예에서, Nextera 샘플 분취 키트(Illumina)에서 현재 사용하는 세정 단계 대신 모세관 세정을 실행하였다. 9㎕ 태그화 반응물을 준비하였다. 이 반응물은 대조군 게놈 DNA, 고분자량 완충제, Nextera 효소 혼합물 및 뉴클레아제 유리수를 함유하였다. 이 반응에서, DNA를 단편화하고 나서, 연결자로 태그한다. 태그화 반응물을 준비하고 나서, 55℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 태그화 후에, 권장되는 Zymo DNA 세정 및 농축기 키트(Zymo Research) 대신에 모세관 비드 기반 정제 시스템을 사용하여 샘플을 정제하였다. 9㎕의 태그화된 산물을 16.2㎕의 AMPure Xp 비드 용액에 첨가하고 나서, 피펫 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, DNA-비드 용액을 PTFE 모세관(400 마이크론 내부 직경) 내로 흡입하였다. 이어서, 모세관을 공기 2.5㎕, DNA 결합 완충제의 슬러그 10㎕, 공기의 슬러그 2.5㎕, 에탄올의 슬러그 5㎕ 2개로 장입하고 나서, 공기 슬러그 2.5㎕, 공기 슬러그 10㎕, 오일 슬러그 2.5㎕ 및 용리 완충제(뉴클레아제 유리수)의 슬러그 15㎕에 의해 분리시켰다. 일련의 시약 슬러그를 주사기 펌프(PHD2000, Harvard)를 사용하여 10㎕/분으로 펌핑하였다. 용액이 자석을 통과함에 따라 비드 및 결합된 표적 DNA는 비드-DNA 용액으로부터 모세관의 벽으로 제거되었다. 이어서, DNA-결합 완충제(Zymo 세정 및 농축기 키트, Zymo Research)는 고정된 비드 펠렛을 통과하여 단편화된 표적 DNA(공지된 PCR 저해제)로부터 트랜스포사제 효소를 해리시켰다. 이후에, 에탄올 세척 단계는 비드 DNA 펠렛을 통과하여 잔여 오염물질을 제거하였다. 이어서, 공기 및 오일 슬러그는 펠렛을 통과하여, 잔여 에탄올을 제거하였다. 최종적으로, 용리 완충제가 펠렛을 통과함에 따라 태그화된 DNA는 비드를 용리시켰다. 펌프를 뒤집고 Nextera 라이브러리 제조 프로토콜의 후속 단계를 위해 용리 완충제를 회수하였다.
11㎕의 용리액을 PCR 반응물에 첨가하였다(최종 용적 25㎕). 이어서, Nextera 프로토콜에 의해 구체화된 열 주기 조건에 따라, GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)을 사용하여 제한된 주기 PCR을 수행하였다. PCR 반응물을 72℃로 3분 동안, 95℃로 30초 동안 가열한 다음, 95℃로 10초, 62℃로 30초, 72℃로 3분 동안 가열하는 것을 9주기 수행하였다. PCR 단계 동안, 브릿지 PCR 상용성(compatible) 부위 및 특이적 지표를 태그 DNA의 말단에 첨가한다. 제한된 주기 PCR 단계 후에, DNA 라이브러리 산물을 권장되는 Zymo DNA 세정 및 농축기 키트(Zymo Research) 또는 AMPure Xp 정제 키트 대신에 모세관 비드 기반 세정을 사용하여 정제하였다. 25㎕ PCR 반응물 중 15㎕를 AMPure Xp 비드 용액 25㎕에 첨가하고 나서, 피펫 혼합하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 비드-DNA 용액을 PTFE 모세관(400 마이크론 내부 직경) 내로 흡입하였다. 이어서, 모세관에 공기 2.5㎕, 에탄올의 슬러그 5㎕ 2 개를 장입하고 나서, 공기의 슬러그를 분리시키고, 다음에 공기 슬러그 10㎕, 오일의 슬러그 2.5㎕ 및 용리 완충제(뉴클레아제 유리수)의 슬러그 15㎕를 분리시켰다. 용액이 자석을 통과함에 따라 비드 및 결합된 표적 DNA를 비드-DNA 용액으로부터 모세관의 벽까지 제거하였다. 이후에, 에탄올 세척 단계는 비드-DNA 펠렛을 통과하여 잔여 오염물질을 제거하였다. 이어서, 공기 및 오일 슬러그는 펠렛을 통과하여, 잔여 에탄올을 제거하였다. 최종적으로, 용리 완충제가 펠렛을 통과함에 따라 DNA 라이브러리 서열은 비드를 용리시켰다. 펌프를 뒤집고, 분석을 위해 용리 완충제를 회수하였다. 이 실험을 2 회 중복하여 수행하였다.
회수한 DNA 라이브러리를 겔 전기영동을 사용하여 분석하였다. 겔 전기영동 결과를 도 8에서 알 수 있다. 겔 결과를 검토하면, Nextera 프로토콜로 실행한 2 개의 모세관 세정 단계는 라이브러리 서열을 성공적으로 세정하고 정제하였음이 분명하다. 200 bp보다 큰 DNA 라이브러리 단편에 대응하는 도말 밴드를 도 8에서 볼 수 있는데, 이는 태그화 및 제한된 주기 PCR 후에 산물을 태그화 및 정제한 후 트랜스포사제 효소를 제거시 모세관 비드 기반 세정이 효과적이라는 것을 입증한다. 이는 모세관 비드 기반 세정 시스템이 DNA 라이브러리 제조 프로토콜 내의 종래 정제 단계에 대한 실현가능한 대안이라는 것을 입증한다.
DNA 라이브러리 제조: 종래 DNA 정제 프로토콜과의 비교
본 실시 예는 DNA 라이브러리 제조 프로토콜에서의 사용을 위한 모세관 비드 기반 정제 시스템을 입증한다. DNA 라이브러리 제조 프로토콜을 프로토콜에 따라 그리고 모세관 세정 단계를 이용하여 수행하였다. 이어서, 실험 둘 다로부터의 최종 라이브러리 산물을 비교하여, 종래 세정 단계 대신 모세관 세정 단계의 효능을 확인하였다.
앞의 실시 예 DNA 라이브러리 제조에서 기재한 바와 같이, 태그화 후에 그리고 제한 주기 PCR 후에 모세관 세정 단계를 사용하여 Nextera 라이브러리 제조 프로토콜을 수행하였다. 이를 2 회 중복해서 수행하였고, 최종 라이브러리 산물을 회수하고 나서, 분석을 위해 저장하였다.
Nextera 라이브러리 제조 프로토콜을 하나의 변경(AMPure Xp 정제 키트를 사용하여 태그 후 세정을 수행함)이 있는 권장 프로토콜에 따라 수행하였다. 앞의 실시 예 DNA 라이브러리 제조에서 기재한 바와 같이 태그화 반응물을 준비하였다. 이어서, AMPure Xp 정제 키트를 사용하여 9㎕ 태그화 반응물을 정제하였다. 태그 산물 9㎕를 마이크로타이터 플레이트의 웰 내 AMPure Xp 비드 용액 16.2㎕에 첨가하고 나서, 피펫 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 마이크로타이터 플레이트를 자기 플레이트에 두어서 결합된 DNA를 함유하는 비드를 용액으로부터 분리시켰다. 피펫을 사용하여 상청액을 흡입하고 폐기하였다. DNA 결합 완충제 200㎕를 비드 펠렛에 첨가하고 나서, 실온에서 60초 동안 인큐베이션시켜 태그 DNA로부터 전위 효소를 해리시켰다. 200㎕의 70% 에탄올을 비드 펠렛에 첨가하고 나서, 실온에서 30초 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 피펫을 사용하여 에탄올을 흡입하고 나서, 폐기하였다. 이를 총 2회의 세척 동안 반복하였다. 최종 세척 단계 후에, 펠렛을 건조시켜 모든 미량의 에탄올이 제거되는 것을 보장하였다. 15㎕의 용리 완충제(뉴클레아제 유리수)를 웰에 첨가하고 나서, 비드 펠렛에 피펫팅하고, 이를 자기 플레이트로부터 제거하여 용리 완충제 중의 비드를 재현탁시키고, 비드의 DNA를 용액 내로 용리시켰다. 마이크로타이터 플레이트를 자기 플레이트 상에서 대체하고, 비드 및 용리액을 분리시키고 나서, 용리액을 PCR 반응물에 옮겼다(최종 용적 25㎕).
실시 예 DNA 라이브러리 제조에서 기재한 바와 같이 제한된 주기 PCR을 수행하였다. PCR 후에, 25㎕ PCR 반응물 중 15㎕를 마이크로타이터 플레이트의 웰 내 25㎕ AMPure Xp 비드 용액에 첨가하였다. DNA-비드 혼합물을 피펫 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 결합 DNA를 함유하는 비드를 용액으로부터 분리시키기 위해 마이크로타이터 플레이트를 자기 플레이트 상에 두었다. 피펫을 사용하여 상청액을 흡입하고 나서, 폐기하였다. 70% 에탄올 200㎕를 비드 펠렛에 첨가하고 나서, 실온에서 30초 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 피펫을 사용하여 에탄올을 흡입하고 나서, 폐기하였다. 이를 총 2회의 세척 동안 반복하였다. 최종 세척 단계 후에, 펠렛을 건조시켜 모든 미량의 에탄올이 제거되는 것을 보장하였다. 15㎕의 용리 완충제(뉴클레아제 유리수)를 웰에 첨가하고 나서, 비드 펠렛에 피펫팅하고, 이를 자기 플레이트로부터 제거하여 용리 완충제 중의 비드를 재현탁시키고, 비드의 DNA를 용액 내로 방출시켰다. 마이크로타이터 플레이트를 자기 플레이트 상에서 대체하여 용액으로부터 비드를 분리시키고, 분석을 위해 최종 라이브러리 산물을 함유하는 용리액을 새로운 플레이트에 옮겼다. 이 실험을 2회 중복해서 수행하였다.
종래 프로토콜을 사용하여 최종 라이브러리 산물을 회수하였고, 포함된 모세관 세정 단계에 의한 프로토콜을 겔 전기영동을 사용하여 분석하였다. 겔 결과를 도 8에서 알 수 있다. 이 겔 결과를 검토하면, 모세관 세정 프로토콜로부터 회수한 산물의 크기 및 도말의 강도가 종래 프로토콜을 사용하여 제조한 라이브러리와 거의 동일하다는 것이 분명하다. 이는 모세관 비드 기반 정제 단계를 프로토콜에 실행하는 것이 종래 프로토콜을 사용하여 얻은 것과 유사한 회수율 및 라이브러리 품질을 산출한다는 것을 입증한다. 모세관 기반 접근은 기타 다른 구성 기법과 통합될 수 있는 노동이 없는 고속대량 접근을 제공하여 완전히 자동화된 DNA 라이브러리 제조 시스템을 제공한다.
낮은 용적의 DNA 라이브러리 제조: 종래 DNA 정제 프로토콜과의 비교
본 실시 예는 낮은 용적 DNA 라이브러리를 제조함에 있어서 모세관 비드 기반 정제 시스템의 효율을 강조한다. DNA 라이브러리 제조 프로토콜을 프로토콜에 따라 그리고 감소된 반응 용적에 대한 모세관 세정 단계를 이용하여 수행하였다. 이어서, 실험 둘 다로부터의 최종 라이브러리 산물을 비교하여, 작은 용적 DNA 라이브러리를 제조할 때의 종래 세정 단계 대신 모세관 세정 단계를 이용하는 것의 이점을 확인하였다.
본 실험의 제1 부분에서, 2.5㎕ 태그화 반응물을 제조하고, 55℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 태그화 후에, 2.5㎕ 태그화 반응물을 4.5㎕ AMPure Xp 비드 용액에 첨가하고 나서, 피펫 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 앞의 실시 예에 기재한 바와 같이 DNA 결합 완충제 단계의 첨가에 의한 AMPure Xp 프로토콜을 사용하여 용액을 정제하였다. 태그한 산물을 1.1㎕의 뉴클레아제 유리수 중에 용리시키고, PCR 반응물에 첨가하였다. 이어서, 2.5㎕의 PCR 반응물을 AMPure Xp 프로토콜에 따라 정제하고 나서, 최종 라이브러리 산물을 4㎕의 뉴클레아제 유리수 중에 용리시키고, 분석을 위해 저장하였다. 이 실험의 제2 부분에서, 앞의 실시 예에 기재한 바와 같이 모세관 세정 단계를 사용하여 동일한 용적을 정제하였다. 접근을 둘 다 2회 중복하여 수행하였다.
최종 DNA 라이브러리 산물을 20㎕ PCR 반응물에 첨가하고 나서, 정량적 PCR(qPCR)을 사용하여 분석하였다. 정방향 및 역방향 프라이머는 DNA 라이브러리 단편의 말단에 첨가한 연결자에 특이적이었고, 이는 시퀀서 준비 단편만이 정량화되는 것을 보장하였다. SYBR 녹색 검출 화학을 사용하였다. KAPA Biosystems에 의해 공급된 표준 물질을 또한 동일한 qPCR 플레이트 상에서 실행하여 회수한 라이브러리 산물의 절대 정량화를 가능하게 하였다. qPCR 플레이트에 KAPA Biosystems Library Quant Kit에 따라 40주기를 실시하였다(ABi StepOne, Life Technologies).
qPCR 결과를 도 9에서 알 수 있다. 모세관 세정을 사용하여 회수한 2 개의 라이브러리는 종래 프로토콜을 사용하여 회수한 라이브러리보다 더 빠른 정량화 주기(Cq) 값을 가진다. Cq는, 형광 신호가 배경 형광 수준을 초과하고 출발 산물의 양과 관련되는 주기 수로서 정의한다. 모세관 세정 산물에 대한 Cq 값은 2.8 및 2.9였다. 종래 방법을 사용하여 세정한 산물에 대한 Cq 값은 3.6 및 4.0이었고, 모세관 세정 산물보다 상당히 더 늦었다. 이는 작은 용적으로부터 DNA 라이브러리를 제조할 때, 모세관 세정이 우수한 회수율을 제공한다는 것을 입증한다. 이는 피펫팅 오류가 상당한 종래 프로토콜에 비해 모세관 접근과 연관된 샘플 손실의 감소에 기인할 수 있다.
모세관 세정과 연관된 우수한 DNA 라이브러리 회수율은 다음 실시 예에서 추가로 뒷받침된다.
모세관 비드 기반 단리를 사용하는 낮은 샘플 용적으로부터의 DNA 회수
본 실시 예는 모세관 세정 접근이 작은 DNA 라이브러리 용적을 조작할 때 우수한 회수율을 가진다는 것을 입증한다. 본 실시 예에서, 모세관 세정을 사용하는 DNA 라이브러리의 회수를 조사하기 위해 다수의 실험을 수행하였다.
종래 프로토콜에 따라 완전한 Nextera 프로토콜을 수행하였다. 최종 DNA 라이브러리 산물을 저장하고 주형으로서 사용하였다. 2.5㎕의 DNA 라이브러리를 4.5㎕의 AMPure Xp 비드 용액에 첨가하고 나서, 피펫 혼합하고 앞의 실시 예에서 약술한 모세관 세정 절차를 실시하였다. 이어서, 회수한 산물을 PCR 반응물에 첨가하였다. 2.5㎕의 주형을 함유하는 양성 대조군을 3 회 중복해서 실행하고 나서, 분석하였다. 회수한 라이브러리 산물 및 양의 대조군을 qPCR 을 이용하여 분석하였다. 양성 대조군 및 용리액 Cq 값은 표 1에 제시되어 있다. 양성 대조군 Cq 값은 임의의 정제 공정 전에 DNA 라이브러리 산물의 시작량을 나타낸다. 2.5㎕의 DNA 라이브러리 산물이 양성 대조군에서 사용되고, 작은 용적의 모세관 세정 공정에 유입되었기 때문에, 둘 다에 대한 Cq 값은 동일하여야 하며, 100%의 회수 효율로 추정된다. 양성 대조군 및 용리액에 대한 Cq 값을 검토하면, 샘플에 모세관 비드 기반 세정을 실시한 후에 모두는 아니지만 대부분의 라이브러리 산물이 회수된다는 것이 분명하다. 용리액 Cq 값은 양성 대조군과 거의 동일한데, 이는 DNA 라이브러리 산물의 효율적인 회수를 입증한다.
본 실시 예는 모세관 세정 접근이 작은 용적으로부터 DNA 라이브러리를 효율적으로 회수할 수 있다는 것을 확인한다.
시험 1 시험 2 시험 3 시험 4
설명 Cq Cq Cq Cq
양성 대조군 1 4.8 5.0 4.5 5.4
양성 대조군 2 5.1 4.9 4.4 5.3
양성 대조군 3 5.0 5.1 4.4 5.2
평균 양성 대조군 4.96 5.0 4.43 5.3
용리액 4.7 4.7 6.0 5.3
모세관의 오염제거-재사용가능성
앞의 실시 예에서 약술한 모세관 세정 절차는 통상적으로 PCR 산물 또는 DNA 라이브러리와 같은 높은 농도의 샘플을 정제한다. 불가피하게도, 비드가 용액 밖으로 분리되고 모세관 벽에서 유지되기 때문에 모세관은 소량의 표적 DNA로 오염된다. 라인을 배치하지 않으면, 이는 샘플 사이에 오염이 생기게 할 것이다. 명확하게, 이는 매우 바람직하지 않다. 본 실시 예는 일련의 세척 단계가 모세관 비드 기반 정제를 수행한 후에 모세관 내에 남아있는 임의의 핵산을 충분히 제거하거나 또는 파괴한다는 것을 입증한다(모세관의 재사용을 가능하게 함).
실시 예 모세관 비드 기반 단리를 사용하는 낮은 샘플 용적으로부터의 DNA 회수에서 약술한 정확한 프로토콜 후에, 모세관 세정 접근을 사용하여 PCR 산물을 정제하였다. 이어서, 9㎕ 모세관 음성 슬러그(뉴클레아제 유리수)를 모세관을 따라 통과시키고 나서, 라인이 오염되었는지 여부를 조사하기 위해 회수하였다. 이후에, 3 분 동안 세정 시약(LookOut DNA Erase, Sigma Aldrich)으로 모세관을 채웠다. 폐기를 위해 세정 시약을 펌핑하고 나서, 라인을 멸균수로 플러싱하였다. 오염제거 후에, 2 개의 멸균 9㎕ 모세관 음성 슬러그를 세척 단계 후의 오염 수준을 조사하기 위해 모세관을 따라 통과시켰다. 회수한 용리액 및 모세관 음성 슬러그를 PCR 반응물에 첨가하였다. 또한, 양성 대조군 및 주형이 아닌 대조군을 제조하였고, qPCR(ABi StepOne, Life Technologies)을 사용하여 분석하였다. qPCR 결과를 도 11에서 알 수 있다. 도 11을 검토하면, 모세관 세정을 수행한 후에 모세관은 직접 상당히 오염된다는 것이 분명하다. 오염제거 단계 후에, 모세관 음성 Cq 값은 주형이 아닌 대조군 Cq 값 내에 속한다. 주형이 아닌 대조군 및 모세관 음성 슬러그에 의해 나타나는 Cq 값은 프라이머 이량체 산물에 대응한다. 모세관 음성 슬러그는 표적 산물에 대해 음성으로 남아있는데, 이는 모세관을 세척한 후의 효과적인 오염제거를 나타낸다.
기재된 세척 단계를 실행하는 것은 각각의 정제/크기 선택 실험 후에 라인을 재사용할 수 있게 한다.
바이러스 RNA 및 DNA 단리: 종래 정제와의 비교.
플라스마를 사용하여 DNA 또는 RNA 바이러스 유사 입자(VLP's)의 단계 희석물을 제조하였다. 상업적 단리 키트 프로토콜(MagMax Viral RNA Isolation Kit, Applied Biosystems)에 따라, 적절한 용적의 용해 완충제/운반체 RNA를 1.5 ㎖ 관 내에서 각각의 플라스마가 섞인 VLP 희석물에 첨가한 다음, 자기 스탠드 상에 두어서 바이러스를 파괴시키고 핵산을 방출시켰다. 자기 비드를 이 혼합물에 첨가하고 나서, 핵산을 비드에 결합시켰다. 프로토콜에 따라 자기 스텐드에 혼합물을 두었다. 비드/핵산 혼합물은 자석에 끌렸고, 상청액이 제거되었다. 비드/핵산 복합체를 세척 완충제 첨가 그리고 자기 스탠드 상에 상기 복합체를 위치시키는 것에 의한 파편 제거의 반복된 단계를 이용하여 추가로 세척하였다. 최종 단계에서, 용리 완충제를 비드/핵산 복합체에 첨가하여 단리된 핵산의 용리 완충제 내로의 방출을 초래하였다. 역전사효소-qPCR(RT-qPCR) 반응의 하류에서 적절한 용리 용적을 사용하였고, 상업적 qPCR 기기 상에서 증폭시켰다.
플라즈마를 사용하여 DNA 또는 RNA 바이러스 유사 입자의 단계 희석물을 제조하였고, 상업적 키트 프로토콜에서 권장된 용적을 본 발명의 환경에 적합하게 감소시켰다. 도관을 사용하여 정제 헤드로 단계 희석 VLP가 섞인 플라스마와 사전혼합한 용해 완충제를 흡입하였다. 비드 완충제와 용해 샘플의 혼합을 도관 내에서 수행하였다. 샘플의 플러그, 용해 완충제 및 비드를 자기 공급원을 지나서 유동시켰고, 비드 및 결합된 핵산을 트래핑시켰다. 세척 완충제를 흡입하고 나서, 자기 비드에 토글 고정시키고(toggled), 이 과정 후에 가스 플러그를 자기 비드에서 걷어내서 비드 영역으로부터 세척 완충제의 제거를 보장하였다. 자기 공급원 및 도관을 가열하였고, 적절한 용적의 용리 완충제를 흡입하고 나서, 자기 비드를 거쳐서 유지시켰다. 자석을 제거하고 나서, 용리 완충제와 비드를 열 영역 내에서 토글 고정시켰다. 자석을 위치에 다시 두어서 용리 완충제로부터 비드를 제거하고, 추가 가공을 위해 용리액을 분배하였다.
표 2는 정제 방법 둘 다(표준 자기 스탠드 단리 대 GenCell 단리 장치)로부터의 결과를 비교한다. 이들 결과는 RNA VLP 단리에 대한 것이다. 벤치 상의 표준 자기 스탠드를 사용하면, RT-qPCR 증폭은 RNA VLP의 103 투입을 달성하지 못하였고, 185 투입 복제물과 동일하였다(100% 단리 회수로 추정). GenCell 단리 기기에 반해, 35 투입 복제물과 동일하고, 또한 100% 단리 회수로 추정되는 RNA VLP의 103 투입에 대해 증폭을 달성하였다. 이는 도관 형식으로 자기 비드를 사용하는 GenCell 단리 기기 상의 단리가 자기 스탠드를 이용한 벤치 상의 표준 단리보다 더 낮은 검출 한계를 산출하였다는 것을 입증한다.
표준 자기 스탠드 GenCell 단리 장치
VLP 농도 용적 바이러스 복제수 용적 바이러스 복제물의 수
10 5 입력 샘플 200 20000 50 5000
용리된 샘플 30 20000 10 5000
RTqPCR 27.8 18533 7 3500
103 입력 샘플 200 200 50 50
용리된 샘플 30 200 10 50
RTqPCR 27.8 185 7 7
정의
본 개시내용에서 용어 "슬러그"의 사용은 용어 플러그와 상호호환가능하며, 도관 내에서 유동하는 별개의 용적의 유체를 나타낸다.

Claims (31)

  1. 자기 입자를 함유하는 샘플 액체 및 캡슐화 액체를 처리하는 방법으로서,
    상기 샘플 액체와 캡슐화 액체는 비혼화성이고, 상기 방법은,
    도관 내 상기 캡슐화 액체를 유동시키는 단계;
    상기 샘플 액체가 (a) 상기 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 상기 도관 내의 사전 결정된 트래핑 부위에 위치되도록, 상기 도관 내 상기 샘플 액체를 유동시키는 단계;
    상기 트래핑 부위에서 자기장을 적용함으로써 상기 트래핑 부위에서 상기 자기 입자를 고정시키는 단계;
    상기 트래핑 부위에서 상기 도관을 가열함으로써, 상기 고정시킨 자기 입자를 가열하는 단계; 및
    (a) 용리 액체가 상기 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 상기 샘플 액체가 상기 트래핑 부위로부터 유동되며, (c) 상기 용리 액체가 상기 트래핑 부위로 유동되고 상기 고정된 자기 입자를 둘러싸도록, 상기 도관 내 용리 액체를 유동시키는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 도관 내 상기 샘플 액체를 유동시키기 전에 표적 생체분자를 상기 자기 입자에 결합시키는 단계
    를 추가로 포함하되;
    상기 용리 액체를 유동시키는 단계는 상기 용리 액체로 상기 자기 입자를 둘러쌈으로써 상기 자기 입자로부터 상기 표적 생체분자를 유리시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 용리 액체를 유동시킨 후에 상기 자기장을 제거함으로써 상기 용리 액체 중의 상기 자기 입자를 동원시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 동원된 자기 입자를 함유하는 상기 용리 액체를 상기 트래핑 부위로부터 유동시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제2항에 있어서, 유리된 표적 생체분자를 함유하는 상기 용리 액체를 상기 트래핑 부위로부터 유동시키는 한편, 자기 입자는 적용된 자기장에 의해 고정된 채로 남아있는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    (a) 제1 세정 유체가 상기 캡슐화 유체에 의해 둘러싸이고, (b) 상기 제1 세정 유체는 상기 고정된 자기 입자를 둘러싸도록, 상기 트래핑 부위로 상기 도관 내 제1 세정 유체를 유동시키는 단계;
    상기 자기장을 제거함으로써 상기 제1 세정 유체 중의 상기 자기 입자를 동원시키는 단계; 및
    상기 도관 내 동원된 자기 입자를 함유하는 상기 제1 세정 유체를 상기 트래핑 부위로부터 유동시키는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 도관 내 제2 세정 유체를 유동시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  8. 제5항에 있어서,
    (a) 제1 세정 유체가 상기 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 상기 제1 세정 유체가 상기 고정된 자기 입자에 의해 둘러싸이도록, 상기 트래핑 부위로 상기 도관 내 제1 세정 유체를 유동시키는 단계;
    상기 자기장을 제거함으로써 상기 제1 세정 유체 중의 상기 자기 입자를 동원시키는 단계;
    상기 자기장을 다시 적용시킴으로써 상기 동원된 자기 입자를 고정시키는 단계; 및
    상기 트래핑 부위 및 상기 고정된 자기 입자로부터 상기 도관 내 상기 제1 세정 유체를 유동시키는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 도관 내 제2 세정 유체를 유동시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  10. 자기 입자를 함유하는 제1 샘플 액체, 제2 샘플 액체 및 캡슐화 액체를 처리하는 방법으로서, 샘플 액체는 둘 다 캡슐화 액체와 비혼화성이고, 상기 방법은
    도관 내 상기 캡슐화 액체를 유동시키는 단계;
    상기 제1 샘플 액체가 (a) 상기 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 도관 내의 사전 결정된 트래핑 부위에 위치되도록, 상기 도관 내 제1 샘플 액체를 유동시키는 단계;
    상기 트래핑 부위에서 자기장을 적용함으로써 상기 트래핑 부위에서 자기 입자를 고정시키는 단계;
    상기 트래핑 부위에서 상기 도관을 가열함으로써, 상기 고정시킨 자기 입자를 가열하는 단계;
    상기 제1 샘플 액체가 상기 트래핑 부위로부터 유동되는 한편, 상기 자기 입자가 상기 트래핑 부위에 고정된 채로 남아있도록, 상기 도관 내 상기 제1 샘플 액체를 유동시키는 단계; 및
    상기 제2 샘플 액체가 (a) 상기 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 상기 고정된 자기 입자를 둘러싸도록, 상기 도관 내 상기 제2 샘플 액체를 유동시키는 단계
    를 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 제2 샘플 액체는, 상기 제2 샘플 액체가 상기 고정된 자기 입자를 둘러쌀 때 상기 자기 입자에 결합되는 표적 생체 분자를 함유하는, 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 제2 샘플 액체를 유동시킨 후에, (a) 용리 액체가 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 상기 제2 샘플 액체가 상기 트래핑 부위로부터 유동되며, (c) 상기 용리 액체가 상기 트래핑 부위로 유동되고 상기 고정된 자기 입자를 둘러싸도록, 상기 도관 내 용리 액체를 유동시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 용리 액체를 유동시키는 단계는 상기 자기 입자를 상기 용리 액체로 둘러쌈으로써 상기 표적 생체 분자를 상기 자기 입자로부터 유리시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 용리 액체를 유동시킨 후에 상기 자기장을 제거함으로써 상기 용리 액체 중의 상기 자기 입자를 동원시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 제2 샘플 액체를 유동시킨 후에, (a) 제1 세정 액체가 상기 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 상기 제2 샘플 액체가 상기 트래핑 부위로부터 유동되며, (c) 상기 제1 세정 액체가 상기 트래핑 부위로 유동되고, 상기 고정된 자기 입자를 둘러싸도록, 상기 도관 내 제1 세정 액체를 유동시키는 단계; 및
    상기 제1 세정 액체를 유동시킨 후에, (a) 용리 액체가 상기 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 상기 제1 세정 액체가 상기 트래핑 부위로부터 유동되며, (c) 상기 용리 액체는 상기 트래핑 부위로 유동되고, 상기 고정된 자기 입자를 둘러싸도록, 상기 도관 내 용리 액체를 유동시키는 단계;
    를 추가로 포함하는, 방법.
  16. 제10항에 있어서, 상기 제2 샘플 액체를 유동시킨 후에 상기 자기장을 제거함으로써 상기 제2 샘플 액체 중의 상기 자기 입자를 동원시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제10항에 있어서, 상기 제2 샘플 액체 및 상기 캡슐화 액체는 복합 액체 세포를 구성하는, 방법.
  18. 제11항에 있어서, 상기 트래핑 부위의 광학적 또는 형광 질의(interrogation)에 의해 마커가 존재하는지 여부를 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 도관은 모세관인, 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 도관은 약 15 내지 약 150, 또는 약 25 내지 약 95, 또는 약 32 내지 약 68의 온도에서 가열되는, 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 도관은 약 1 분 내지 약 270분, 또는 약 1 분 내지 약 180분, 약 30분 내지 약 180분, 또는 약 1 분 내지 약 90분, 또는 약 1 분 내지 약 60분의 일정시간 동안 가열되는, 방법.
  22. 제2항에 있어서, 상기 도관은 약 30분 내지 약 180분의 일정시간 동안 가열되며; 상기 샘플 액체 중의 표적 생체분자의 농도는 약 1개의 복제물/㎖ 내지 약 104 개의 복제물/㎕인, 방법.
  23. 자기 입자를 함유하는 샘플 액체 및 캡슐화 액체를 처리하는 방법으로서, 상기 샘플 액체와 캡슐화 액체는 비혼화성이며, 상기 방법은
    도관 내 상기 캡슐화 액체를 유동시키는 단계;
    상기 샘플 액체가 상기 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이도록, 상기 도관 내 상기 샘플 액체를 유동시키는 단계;
    사전 결정된 부위에서 상기 도관을 가열함으로써, 열 구역을 정의하는 단계;
    상기 샘플 액체를 상기 도관을 통해 열 구역으로 유동시키는 단계;
    상기 열 구역 내에 자기장을 적용함으로써 상기 열 구역 내 자기 입자를 고정시켜, 트래핑 부위 내에 자기 입자를 고정시키는 단계; 및
    (a) 용리 액체가 상기 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 상기 샘플 액체는 상기 트래핑 부위로부터 유동되며, (c) 상기 용리 액체는 상기 트래핑 부위로 유동되고, 상기 고정된 자기 입자를 둘러싸도록, 상기 도관 내 용리 액체를 유동시키는 단계
    를 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 도관은 약 15 내지 약 150, 또는 약 25 내지 약 95, 또는 약 32 내지 약 68의 온도에서 가열되는, 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 도관은 약 1 분 내지 약 270분, 또는 약 1 분 내지 약 180분, 약 30분 내지 약 180분, 또는 약 1 분 내지 약 90분, 또는 약 1 분 내지 약 60분의 일정시간 동안 가열되는, 방법.
  26. 제23항에 있어서,
    상기 도관 내 샘플 액체를 유동시키기 전에 표적 생체분자를 상기 자기 입자에 결합시키는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 도관은 약 30분 내지 약 180분의 일정시간 동안 가열되고; 상기 샘플 액체 중의 표적 생체분자의 농도는 약 1개의 복제물/㎖ 내지 약 104 개의 복제물/㎕인, 방법.
  28. 사전 결정된 트래핑 부위를 갖는 도관, 상기 도관 내 위치에 정압, 부압을 적용하거나 또는 어떠한 외부 압력이 없도록 구성된 펌프, 활성화되었을 때 상기 트래핑 부위에서 자기장을 적용하고 활성화되지 않았을 때 자기장을 실질적으로 적용하지 않도록 구성된 자기장 공급원, 상기 트래핑 부위에서 상기 도관에 열을 적용하도록 구성된 가열 요소 및 펌프 및/또는 자기장 공급원을 활성화시킬 수 있도록 펌프와 자기장 공급원에 작동가능하게 부착된 제어기 포함하는 액체 처리 시스템으로서, 상기 제어기는:
    캡슐화 액체가 상기 도관 내에서 유동되도록 상기 펌프를 활성화시키고;
    샘플 액체가 (a) 상기 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 상기 도관 내에서 상기 트래핑 부위에 위치되는 방법으로 샘플 액체가 도관 내에서 유동되도록 펌프를 활성화시키며, 상기 샘플 액체는 자기 입자를 함유하고;
    상기 자기 입자가 상기 트래핑 부위에서 고정되도록 상기 자기장 공급원을 활성화시키며;
    상기 고정된 자기 입자가 가열되도록 상기 가열 요소를 활성화시키고;
    용리 액체가 (a) 상기 용리 액체가 상기 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 상기 샘플 액체가 상기 트래핑 부위로부터 유동되며, (c) 상기 용리 액체가 상기 트래핑 부위로 유동되고, 상기 자기 입자를 둘러싸는 방법으로 상기 도관 내에서 유동되도록, 펌프를 활성시키도록 프로그래밍되는, 액체 처리 시스템.
  29. 제28항에 있어서, 상기 도관은 모세관인, 시스템.
  30. 제28항에 있어서, 상기 캡슐화 액체, 샘플 액체 및 용리 액체는 상기 펌프에 의해 상기 도관에 적용되는 부압에 의해 유동되는, 시스템.
  31. 제28항에 있어서, 상기 캡슐화 액체, 샘플 액체 및 용리 액체는 상기 펌프에 의해 상기 도관에 적용되는 정압에 의해 유동되는, 시스템.
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