DE10111520A1

DE10111520A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Aufreinigung von Biomolekülen mit Hilfe magnetischer Partikel

Info

Publication number: DE10111520A1
Application number: DE2001111520
Authority: DE
Inventors: Lothar A Brassard; Rainer Frank; Heinrich Gausepohl; Juergen Oster; Mark Spengler
Original assignee: GAG BIOSCIENCE GmbH; Chemagen Biopolymer Technologie AG; INTAVIS Bioanalytical Instruments AG
Current assignee: GAG BIOSCIENCE GmbH; Chemagen Biopolymer Technologie AG; INTAVIS Bioanalytical Instruments AG
Priority date: 2001-03-09
Filing date: 2001-03-09
Publication date: 2003-01-30
Anticipated expiration: 2021-03-10
Also published as: DE10111520B4

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Aufreinigung von Biomolekülen mit Hilfe magnetischer Partikel. Zunächst wird die Ausgangslösung mit magnetischen Partikeln (magnetic beads, kommerziell erhältlich von verschiedenen Herstellern, z. B. Dynal, Chemagen, Qiagen, Miltenyi Biotec, etc.) versetzt und gemischt. Die magnetischen Partikel sind so vorbereitet, dass sie entweder unmittelbar oder nach Zugabe eines Bindungspuffers selektriv Biomoleküle aus der entstandenen Suspension binden. Die Suspension wird dann in einen Schlauch aufgenommen, der durch ein starkes Magnetfeld führt. Hier werden die Partikel festgehalten und können gewaschen werden. Nach Entfernen des Magnetfeldes sind die Partikel dann wieder suspendierbar. Charakteristisch an dem Verfahren ist die Handhabung in einem Dosiersystem aus Kanüle, Schlauch udn Dosierspritze (Dilutor), wobei die Suspension in einem Schlauch durch das Magnetfeld geführt wird. Die Reinigung der Magnetpartikel mit verschiedenen Waschpuffern erfolgt im Schlauch des Dosiersystems, so dass auch kleinste Volumina ohne Verluste gehandhabt werden können. Die beschriebene Ausführung erlaubt es, mehrere Waschpuffer vor der Aufnahme der Suspension in den Schlauch aufzunehmen und die Partikel zu waschen ohne dafür separate Gefäße mit Waschlösungen anfahren zu müssen.

Description

Die Aufreinigung von Biomolekülen mit Hilfe magnetischer Partikel (magnetic beads) ist ein bekanntes Verfahren, für das von mehreren Lieferanten Kits und Protokolle angeboten werden. Die magnetischen Partikel entstehen z. B. durch Einkapselung ferromagnetischer Nanopartikel in Polymerkügelchen von wenigen Mikrometern Durchmesser. Diese Kügelchen können außen mit verschiedenen Affinitätsmolekülen oder anderen geeigneten Oberflächenmodifikationen versehen werden, die dem System die erforderliche Spezifität verleihen. Diese Partikel sind dann geeignet, aus einer Lösung bestimmte Moleküle an ihrer Oberfläche zu binden. In einem typischen Protokoll wird eine Suspension von Magnetpartikeln in die zu trennende Lösung in einem Reagenzröhrchen gegeben. Anschließend wird ein Magnetfeld angelegt, das die Partikel durch Anlagerung an eine Wand des Gefäßes abtrennt. Der Überstand wird verworfen, und die Partikel werden noch mindestens einmal gewaschen. Dazu werden die Partikel nach Wegnehmen des Magnetfeldes in einer frischen Lösung resuspendiert und durch Anlegen des Magnetfeldes erneut abgeschieden. Nach mehreren Waschschritten gibt man einen Puffer zur Ablösung der an die Partikel gebundenen Moleküle zu, resuspendiert die Partikel und trennt sie wiederum über ein Magnetfeld ab. Die Zielmoleküle befinden sich nun in der überstehenden Lösung. Zur Erzeugung des Magnetfeldes werden die Reagenzröhrchen typischerweise in einen Ständer mit starken Magneten gestellt, oder eine Mikrotiterplatte wird auf ein Feld von regelmäßig angeordneten Stabmagneten gestellt (Vorrichtung erhältlich u. A. von Qiagen). Zur besseren Ablösung der gebundenen Moleküle wird die Lösung gegebenenfalls erwärmt. Ein anderes Verfahren benutzt einen Magneten, der in eine Schutzhülle eingeschoben werden kann und dann in die Lösung mit der Suspension der Magnetpartikel getaucht wird (Pick Pen, Bio-Nobile Oy, Finnland). Das Waschen und die Ablösung der Zielmoleküle erfolgt dann nach Übertragung der Partikel in ein anderes Gefäß, in dem die entsprechende Waschlösung bzw. Ablöse-Lösung vorgelegt wird.
Eine automatisierbare Variante zur Isolierung von Biomolekülen mit Hilfe magnetischer Partikel wurde von Tajima und Hideji vorgeschlagen (US-Pat. 6.133.037). Ein darauf basierendes Gerät wird von Precise Systems Science, Tokyo, angeboten. Hier erfolgt die Abscheidung der Magnetpartikel nicht in den vorgelegten Reagenzröhrchen, sondern in den abnehmbaren Spitzen eines Pipettierautomaten. Die Pipettenspitzen haben in etwa die Form langhalsiger Trichter, in denen die Abscheidung der Partikel über einen außen anlegbaren Magneten im Trichterhals geschieht. Die magnetischen Partikel können nach Wegnehmen des Magnetfeldes in andere Vorlagegefäße überführt werden. Die Resuspendierung erfolgt durch wiederholte Aufnahme und Abgabe der Lösung zwischen Pipettenspitze und Vorlagegefäß. Zur Reinigung wird aus weiteren Gefäßen jeweils eine Waschflüssigkeit in die Pipettenspitzen aufgenommen. Die Partikel werden durch Wegnehmen des Magneten und mehrfaches Aufziehen/Abgeben der Flüssigkeit in ein Vorlagegefäß resuspendiert und anschließend wieder in der Pipettenspitze abgeschieden.
Der Nachteil aller Verfahren ist, dass eine relativ große Flüssigkeitsmenge von mindestens etwa 50-200 µl vorhanden sein muss. In Volumina von 20 µl und weniger ist die Technik der Aufreinigung über magnetische Partikel kaum einsetzbar und bisher nicht automatisiert worden. Gerade dieser Volumenbereich ist aber für viele Verfahren mit hoher Nachweisempfindlichkeit und für Hochdurchsatzanwendungen interessant. Die in US-Pat. 6.133.037 vorgeschlagene Verfahrensweise ist für Hochdurchsatzanwendungen wenig geeignet, da die Magnetpartikel für jeden Waschschritt in einem Vorlagegefäß resuspendiert werden. Bei mehreren Waschschritten für eine Reihe einzelner Proben ist daher eine Vielzahl von Vorlagegefäßen erforderlich, was einen erheblichen Platzbedarf auf dem benutzten Gerät und einen hohen Kostenaufwand für die verwendeten Verbrauchsmaterialien zur Folge hat.
In dieser Anmeldung wird nun erfindungsgemäß vorgeschlagen, die Suspension mit den magnetischen Partikeln durch einen Schlauch zu fördern, der ein starkes Magnetfeld passiert. Bei geeigneter Auslegung von Durchmesser, Fließgeschwindigkeit und magnetischer Feldstärke werden die magnetischen Partikel beim Durchfluss an der Wand des Schlauches abgeschieden. Der Überstand wird durch Leeren des Schlauches verworfen oder in einer geeigneten Vorlage gesammelt. Die festgehaltenen Partikel lassen sich nun durch Überströmen mit Waschpuffer waschen, oder sie werden nach Wegnehmen des Magnetfeldes abgelöst, innerhalb des Schlauches resuspendiert und noch einmal abgeschieden. Charakteristisch für das vorgeschlagenen Verfahren ist, dass die Magnetpartikel während der gesamten Waschprozedur im Schlauch gehalten werden und sowohl Resuspendierung wie Abscheidung im Schlauch erfolgen. Ganz analog erfolgt die Ablösung der gebundenen Biomoleküle durch eine geeignete Pufferlösung und die Abtrennung der nicht beladenen Magnetpartikel aus der Suspension. Zu- und Abschalten des Magnetfeldes erfolgt durch das Hin- und Herbewegen von mindestens einem Permanentmagneten mit Hilfe eines Klappmechanismus nach Zeichnung 2 oder eines Schiebemechanismus nach Zeichnung 3. Alternativ läßt sich das Magnetfeld durch einen Elektromagneten oder eine stromdurchflossene Erregerspule erzeugen und durch die Schaltung des Stromflusses zu- oder abschalten.
Es ist ein weites Repertoire an bekannten Techniken einsetzbar, wobei die magnetischen Partikel erfindungsgemäß immer aus einem strömenden Medium in einem Magnetfeld an der Wand des Schlauches abgeschieden werden. Die entscheidende Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik besteht darin, dass mehrere oder alle Schritte, wie Abscheiden, Resuspendieren, Waschen mit einem oder mehreren Reagenzien, sowie die Ablösung der Zielmoleküle in dem verwendeten Schlauchsystem stattfinden, ohne dass die Partikelsuspension zwischendurch in ein anderes Vorlagegefäß überführt werden muss.
Der Schlauch lässt sich so gestalten, dass auch die Handhabung kleinster Flüssigkeitsmengen von weniger als 50 µl möglich ist. Gerade bei sehr kleinen Volumina, im Extremfall bis herunter zu weniger als 1 µl, ist ein Transfer zwischen verschiedenen Gefäßen wegen der hohen Verluste zu vermeiden. In der vorliegenden Erfindung wird daher unter anderem vorgeschlagen, möglichst viele der Reinigungsschritte im Schlauch des Dosiersystems durchzuführen. Dazu wird, wie in Zeichnung 1 gezeigt, zunächst eine Reihe von Pufferlösungen in den Schlauch aufgezogen. Zweckmäßigerweise sind die Flüssigkeitssegmente durch Luftblasen voneinander getrennt, um eine Vermischung weitgehend zu vermeiden. Nach Aufnahme der partikelhaltigen Suspension und Abscheiden der Magnetpartikel werden nun die Lösungen im Schlauchsystem der Reihe nach über die Partikel gefördert. Falls erforderlich, werden die Partikel durch Abschalten des Magnetfeldes und Hin- und Herbewegen des jeweiligen Flüssigkeitssegments resuspendiert. Die Resuspendierung ist besonders effektiv, wenn die Phasengrenzfläche zwischen Luftblase und Waschpuffer mehrfach über die abgeschiedenen Partikel bewegt wird. Alternativ kann auch der Magnet mehrfach von der einen Seite des Schlauchs auf die andere bewegt werden, so dass die Partikel unter Einfluss des Magnetfeldes mehrfach über den Querschnitt des Schlauches durch die darin enthaltene Flüssigkeit gezogen werden. Eine weitere Möglichkeit der Resuspendierung besteht darin, die Flüssigkeit mit hoher Geschwindigkeit über die abgeschiedenen Partikel zu fördern, die dann aus dem Magnetfeld herausgerissen werden. Diese Variante ist aber eher dazu geeignet, den Schlauch zwischen der Bearbeitung verschiedener Proben zu reinigen. Es folgt analog die Behandlung mit weiteren Flüssigkeitssegmenten, bis hin zur Ablösung der gewünschten Moleküle von den Magnetpartikeln. Die Lösung mit der Zielsubstanz kann dann partikelfrei in eine beliebige Vorlage abgegeben werden. Bei geeigneter Ausführung des Dosiersystems ist es auch möglich, die partikelfreie Lösung der Zielmoleküle direkt an ein Analysensystem, z. B. ein Photometer, eine Hybridisierungskammer, eine HPLC-Anlage oder ein Massenspektrometer, zu übergeben. Es ist ebenfalls möglich, die Lösung in kleinen Aliquots abzugeben und z. B. eine oder mehrere planare Oberflächen zu beschicken, wie sie in den bekannten Techniken der Mikroarraytechnologie verwendet werden. Die letztgenannte Variante ist vor allem dann interessant, wenn das Verfahren benutzt wird, um bestimmte DNA-Sonden oder PCR-Produkte für die weitere Verwendung in Mikroarrays zu reinigen.
Das beschriebene Verfahren läßt sich manuell anwenden, ist aber vor allem für die Automatisierung der Prozedur geeignet: Wenn der Schlauch die Verbindung einer Kanüle mit dem Dosiersystem eines Pipettierroboters darstellt, lassen sich die bekannten Techniken der automatischen Handhabung von Flüssigkeiten um die in-line-Anreicherung von magnetischen Partikeln mit den zugehörigen Protokollen zur Isolation von Zielmolekülen erweitern. Das Dosiersystem eines Pipettierroboters besteht typischerweise aus den miteinander verbundenen Elementen Kanüle-Transferschlauch-Ventil-Dilutorspritze. Charakteristisch ist, dass typischerweise das gesamte, hydraulische System mit Flüssigkeit gefüllt ist, wobei auch mehrere, verschiedene Flüssigkeiten enthalten sein können. In diesem Fall werden die einzelnen Flüssigkeitssegmente in der Regel durch Luftblasen voneinander getrennt. Die fast vollständige Füllung gewährleistet eine hohe Dosiergenauigkeit und präzise Führung der Flüssigkeitssäule. Bei hinreichender Steifigkeit des verwendeten Schlauches, z. B. bei Ausführung als Kapillarrohr aus steifem Polymer, Glas, fused silica oder Metall, kann auf eine separate Kanüle verzichtet werden. Das üblicherweise zwischen Transferschlauch und Dosierspritze eingebaute Ventil erlaubt die Aufnahme von mindestens einem Lösungsmittel über einen anderen Weg als das offene Ende des Dosierschlauches. Bei geeigneter Ausführung lassen sich mehrere oder alle erforderlichen Waschlösungen von dieser Seite aufnehmen und entgegen der ursprünglichen Aufnahmerichtung der partikelbeladenen Suspension über die abgeschiedenen Partikel fördern. Denkbar ist auch der Anschluß eines von der Dosierspritze unabhängigen Pumpsystems, mit dem eine oder mehrere Lösungen auch als Gemisch mit ansteigender oder fallender Konzentration geliefert werden können. Damit ist dann eine Reinigung der Partikel nach den bekannten Verfahren der Chromatographie möglich. Alle diese Verfahren sind nachträglich auf viele der gängigen Pipettierroboter nachrüstbar.
Für Anwendungen, die einen höheren Durchsatz erfordern, läßt sich das beschriebene System leicht durch eine parallele Anordnung von mehreren Schläuchen und Dosiervorrichtungen erweitern.
Neben der Ablösung der Biomoleküle durch geeignete Puffer gibt es im Fall der Aufreinigung von DNA oder RNA über sequenzspezifische Hybridisierung noch die Möglichkeit, diese Bindung durch Hitzedenaturierung aufzuheben. Das ist mit dem beschriebenen Verfahren besonders elegant zu lösen, indem der verwendete Dosierschlauch durch eine Heizvorrichtung geführt wird, die den Puffer im Durchlauf aufheizt. Die Temperatur lässt sich sowohl über eine Messung und nachfolgende Regelung einstellen als auch über ein geeignetes Verhältnis von zugeführter Heizleistung und Durchflußrate. In einer geeigneten Anordnung führt der Schlauch durch ein Heizsystem, das eine bekannte Heizleistung überträgt. Im einfachsten Fall wird der Schlauch in einem bestimmten Abschnitt um einen Lastwiderstand gewickelt, dessen Temperatur auf einen bekannten Wert eingestellt wird. Die Temperatur der Flüssigkeit im Schlauch wird dann durch die Dosiergeschwindigkeit bestimmt, und es kann ein Zusammenhang zwischen Temperatur und Flußrate hergestellt werden. Durch geeignete Isolierung des Schlauches läßt sich sicherstellen, dass der Puffer mit einer bekannten Temperatur an den abgeschiedenen Magnetpartikeln ankommt. Alternativ läßt sich der Bereich des Schlauches, in dem die Partikel abschieden werden, auch direkt auf eine definierte Temperatur aufheizen. Weiterhin ist es möglich, die resuspendierten Partikel in die geheizte Zone zu fördern und anschließend die Partikel im Magnetfeld zurückzuhalten, während die Lösung mit den Zielmolekülen abgegeben wird. Mit der Beheizung der Pufferlösungen lassen sich temperaturabhängige Bindungen der Zielmoleküle auf dem Träger gezielt aufheben. Bei geeignet hohen Unterschieden in der Stabilität der Bindungen ist sogar eine Diskriminierung der gebundenen Moleküle möglich. Eine solche Diskriminierung der Bindung durch Temperaturerhöhung gehört zu den Standardtechniken der DNA-Hybridisierung, und beispielhafte Temperaturverläufe der Bindung sind in der Literatur als Schmelzkurven beschrieben. Legende zu Zeichnungen 1-4 1 Kanüle mit Ansaugöffnung
2 Suspension Magnetpartikel
3 abgeschiedene Partikel
4 Magnet
4a Magnet angelegt, Magnetfeld aktiv
4b Magnet weggeklappt, Magnetfeld inaktiv
5 Luftblase
6 Waschlösung 1
7 Waschlösung 2
8 Waschlösung 3, Dilutorflüssigkeit
9 weitere Lösung
10 Ventil
11 Dosierspritze (Dilutor)#
12 parallele Kanäle 1-n
13 Magnete, starr verbunden
14 Schiebemechanismus für verbundene Magnete
15 Heizelement

Claims

1. Verfahren und Vorrichtung zur Aufreinigung von Biomolekülen mit Hilfe von magnetischen Partikeln, dadurch gekennzeichnet, dass die partikelbeladene Suspension in einem Schlauch oder Rohr durch ein Magnetfeld geführt wird, welches die Partikel an der Wand des Schlauches oder Rohrs abscheidet und festhält, und dass weiterhin über ein an den Schlauch angeschlossenes Dosier- oder Pumpsystem mindestens eine Waschlösung über die abgeschiedenen Partikel gepumpt werden kann, ohne dass dazu ein neues Vorratsgefäß angefahren werden muss.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vielzahl von Schläuchen in paralleler Anordnung an einem oder mehreren Magneten vorbeigeführt werden und die beschriebenen Vorgänge in allen Schläuchen parallel ablaufen.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Magnetfeld durch Heran- bzw. Wegführen von mindestens einem Permanentmagneten an einen oder mehrere Schläuche zu- bzw. abgeschaltet wird.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Magnetfeld durch einen geeigneten, schaltbaren Elektromagneten bzw. eine stromdurchflossene Erregerspule erzeugt wird.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Magnete durch einen Klappmechanismus nach Zeichnung 2 an einen oder mehrere Schläuche herangeführt werden.

6. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Magnete durch einen Schiebemechanismus nach Zeichnung 3 an einen oder mehrere Schläuche herangeführt werden.

7. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass der Schlauch aus einem Polymer, wie PTFE, PCTFE, PFA, FEP, PEEK, Polypropylen, PVC, Polyurethan oder Silicon besteht.

8. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass als Schlauch eine fused-silica-Kapillare oder ein Kapillarrohr aus Glas oder Quarz verwendet wird, oder dass als Schlauch ein dünnwandiges Edelstahlrohr verwendet wird.

9. Vorrichtung nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass der Schlauch, das Rohr oder die Kapillare an ein manuelles Dosiersystem, z. B. an eine von Hand betätigte Dosierspritze, angeschlossen ist.

10. Vorrichtung nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass der Schlauch, das Rohr oder die Kapillare an ein automatisches Dosiersystem, z. B. die Dosierspritze eines Pipettierroboters, angeschlossen ist und gegebenenfalls zwischen Schlauch und Dosierspritze ein Ventil zur Aufnahme weiterer Lösungen oder die Zuführung eines weiteren Pumpsystems angeordnet ist.

11. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der zum Waschen der Magnetpartikel notwendigen Lösungen vor Aufnahme der Partikel in den Schlauch des Dosiersystems aufgezogen wird.

12. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die zum Waschen der Magnetpartikel notwendigen Lösungen im Schlauch des Dosiersystems durch Luftblasen getrennt bereitgestellt werden.

13. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 1-11, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der zum Waschen der Magnetpartikel notwendigen Lösungen über ein geeignetes Pumpsystem entgegengesetzt zur Aufnahmerichtung der Magnetpartikel gefördert werden kann und zum Waschen der Partikel zur Verfügung steht.

14. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 1-11, dadurch gekennzeichnet, dass die abgeschiedenen Partikel durch eine erhöhte Flussrate aus dem Magnetfeld herausbefördert werden.

15. Vorrichtung nach Anspruch 1-14, dadurch gekennzeichnet, dass der Schlauch, das Rohr oder die Kapillare eine beheizbare Zone aufweisen, durch die das Medium auf eine höhere Temperatur gebracht werden kann.

16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur der Flüssigkeit in dem Schlauch bei Zuführung einer definierten Heizleistung über die Dosiergeschwindigkeit eingestellt wird.

17. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die beheizbare Zone der Bereich ist, in dem die Partikel durch das Magnetfeld angeschieden werden.

18. Pipettierroboter mit einer Vorrichtung nach Anspruch 1-14 und gegebenenfalls Anspruch 15-17, dadurch gekennzeichnet, dass geeignete, magnetische Partikel aus einem Vorrat in eine Vorlage mehrerer Gefäße in der Anordnung einer Mikrotiterplatte pipettiert werden, die Partikel aus der Suspension beschreibungsgemäß isoliert und gewaschen werden und anschließend die Partikel oder die abgelösten Moleküle in eine zweite Anordnung von Gefäßen transferiert werden.

19. Pipettierroboter nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Ablösung der Zielmoleküle von den magnetischen Partikeln durch Aufheizen der Waschflüssigkeit erfolgt, insbesondere für die Affinitätsreinigung von DNA oder RNA über sequenzspezifische Hybridisierung an DNA, RNA, PNA oder andere Polynucleotide.

20. Pipettierroboter nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Ablösung der Zielmoleküle von den magnetischen Partikeln durch Überspülen mit Lösungsmittelgemischen aus einem von der Dosierspritze unabhängigen Pumpsystem erfolgt.

21. Pipettierroboter nach Anspruch 18-20, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung der abgelösten Zielmoleküle unmittelbar an ein anderes Analysensystem übergeben wird.

22. Pipettierroboter nach Anspruch 18-20, dadurch gekennzeichnet, dass Aliquots der Lösung der abgelösten Zielmoleküle unmittelbar auf einen oder mehrere planare Träger abgesetzt werden.

23. Pipettierroboter nach Anspruch 18-22, dadurch gekennzeichnet, dass die Prozedur mit mehreren Kanülen und angeschlossenen Dosiersystemen parallel durchgeführt wird.