JP5592355B2 - 液滴アクチュエータ装置、システム、および方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2008年10月28日に出願された「Droplet Thermal Cycling Techniques」という発明の名称の米国特許出願第61/108,880号、2008年11月18日に出願された「Droplet Thermal Cycling Techniques」という発明の名称の米国特許出願第61/115,654号、2009年2月18日に出願された「Droplet Thermal Cycling Techniques」という発明の名称の米国特許出願第61/153,598号、2008年5月13日に出願された「Reducing Droplet Cross−contamination in a Droplet Actuator」という発明の名称の米国特許出願第61/052,885号、2008年9月22日に出願された「Reducing Droplet Cross−contamination in a Droplet Actuator」という発明の名称の米国特許出願第61/098,860号、2009年3月16日に出願された「Reducing Droplet Cross−contamination in a Droplet Actuator」という発明の名称の米国特許出願第61/160,607号、2008年10月7日に出願された「Nucleic Acid Handling on a Droplet Actuator」という発明の名称の米国特許出願第61/103,332号、2008年12月31日に出願された「Sample Preparation and Assay Execution on a Droplet Actuator」という発明の名称の米国特許出願第61/141,820号に対する優先権を主張し、これらの出願の各々の全開示は参照として本明細書に援用される。
本発明は、米国の国立衛生研究所によって与えられたAI065169−01およびAI066590−02のもとで、政府の支援によってなされたものである。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
液滴アクチュエータは、多種多様の液滴操作を実施するために使用される。液滴アクチュエータは、典型的に、液滴操作間隙によって隔てられる2つの基板を備える。基板は、液滴操作を実施するための電極を備える。基板間の液滴操作間隙は、典型的に、液滴操作に供される流体と混ざらない流動性の充填流体で満たされる。液滴操作は、基板の1つまたは両方と結合する電極によって制御される。液滴の成分は、一部の場合において、充填流体中の液滴から出ていくことがある。充填流体からのそのような成分は他の液滴を汚染する場合がある。
本発明は、サンプル中の標的核酸を増幅および/または検出する方法を提供する。その方法は、核酸増幅反応液滴のセットを提供する工程を含んでもよい。各液滴はサンプルの一部を含んでもよい。その方法は、標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の2つ以上のサブセットを処理して、増幅核酸を有する増幅液滴の対応するサブセットを得る工程を含んでもよい。増幅反応液滴の各サブセットは、1つ以上の増幅反応液滴を含んでもよい。増幅反応液滴の各サブセットは、標的核酸を増幅するための異なる条件下で処理されてもよい。その方法は、検出するための増幅液滴を調製する工程を含んでもよい。その方法は、増幅液滴からシグナルを検出する工程を含んでもよい。その方法はまた、増幅液滴および/またはサンプルに存在する増幅核酸の量および/または識別を決定する工程を含んでもよい。核酸増幅反応液滴のセットを提供する工程は、サンプル液滴から核酸増幅液滴のセットを分配する工程を含んでもよい。サンプル液滴は、液滴アクチュエータの液滴操作間隙に提供されてもよく、分配は電極により媒介されてもよい。サンプル液滴は、液滴アクチュエータのリザーバーに提供されてもよい。液滴アクチュエータは、リザーバーから液滴操作間隙内への液体経路を備えてもよい。核酸増幅液滴のセットを分配する工程は、液体経路を通して液滴操作間隙内にサンプル液滴を流動させる工程、および液滴操作間隙中に増幅反応液滴を分配するために電極を使用する工程を含んでもよい。核酸増幅反応液滴のセットを提供する工程は、サンプル液滴を提供する工程と、サンプル液滴を複数のサンプル小液滴に分裂する工程と、各サンプル小液滴と、増幅試薬を含み得る1つ以上の液滴とを混合して、増幅反応液滴を生じる工程とを含んでもよい。本明細書に記載される方法の任意の1つ以上の工程は、電極によって媒介される液滴操作を用いて液滴アクチュエータの液滴操作間隙中で行われてもよい。本明細書に記載される方法の任意の1つ以上の工程は、電極によって媒介される液滴操作を用いて行われてもよい。サンプル液滴、複数の小液滴および1つ以上の液滴は、増幅試薬を含んでもよい。増幅反応液滴は、液滴操作間隙に配置され、少なくとも部分的に流動性の充填流体によって囲まれてもよい。核酸増幅反応液滴のセットを提供する工程は、以下の工程を含んでもよい:サンプル液滴を提供する工程;サンプル液滴と、増幅試薬を含み得る1つ以上の液滴とを混合して、増幅準備液滴を生じる工程;および増幅準備液滴を分裂して、増幅反応液滴を生じる工程。サンプル液滴、1つ以上の液滴は、増幅試薬、親増幅反応液滴を含んでもよく、増幅反応液滴は、液滴アクチュエータの液滴操作間隙に配置されてもよく、流動性の充填流体に少なくとも部分的に囲まれてもよい。その方法は、標的核酸がサンプル中に存在する場合、各増幅反応液滴が標的核酸を含むことを確実にするために増幅準備液滴中で十分に増幅された核酸を得るために選択される条件下で増幅準備液滴を処理する工程を含んでもよい。増幅準備液滴を処理する工程は、1〜50サイクル、1〜40サイクル、1〜30サイクル、1〜20サイクル、または1〜10サイクル、または1〜5サイクルについて増幅準備液滴を熱サイクルすることを含んでもよい。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の2つ以上のサブセットを処理する工程は、液滴アクチュエータの液滴操作間隙中の複数の電極経路に沿って液滴を輸送することによって2つ以上の熱領域の間で増幅反応液滴をサイクルする工程を含んでもよい。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の2つ以上のサブセットを処理する工程は、液滴アクチュエータの液滴操作間隙内の共通の電極経路に沿って各サブセットにおける液滴を輸送することによって2つ以上の熱領域の間で2つ以上の増幅反応液滴のサブセットをサイクルする工程を含んでもよい。一部の場合において、1つ以上の電極経路は、2つ以上の熱領域の間に1つ以上のループ経路を規定する。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の2つ以上のサブセットを処理する工程は、電極経路ループの周りに複数の増幅反応液滴を輸送する工程を含んでもよい。その方法は、その所定数のサイクルが完了した場合、各増幅液滴を電極経路ループから除去する工程を含んでもよい。各増幅液滴を電極経路ループから除去する工程は、増幅反応液滴を液滴操作間隙の別の領域に輸送するために電極により媒介される液滴操作を含んでもよい。液滴操作間隙の領域は、まだ検出されていない増幅液滴を保存するために選択される温度を有する温度制御領域を備えてもよい。各増幅液滴を電極経路ループから除去する工程は、各増幅液滴を液滴アクチュエータの液滴操作間隙から除去する工程を含んでもよい。他の場合において、電極経路は、2つ以上の熱領域の間で曲がっている。電極経路上の1つの電極から電極経路上の隣接する電極への輸送時間は、隣接する電極の各対に関して実質的に均一であってもよく、熱領域内の滞留時間は、熱領域に存在する電極経路の各曲がり角の電極の数によって規定されてもよい。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の2つ以上のサブセットを処理する工程は、並行して熱領域の間に増幅反応液滴の2つ以上のサブセットを輸送する工程を含んでもよい。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の2つ以上のサブセットを処理する工程は、増幅反応液滴の2つ以上のサブセットを熱領域内に連続して輸送する工程を含んでもよい。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の2つ以上のサブセットを処理する工程は、増幅反応液滴の第1のサブセットを第1の熱領域内に輸送するが、増幅反応液滴の第2のサブセットを第2の熱領域内に輸送する工程と、増幅反応試薬液滴の第1のサブセットを第2の熱領域に輸送するが、増幅反応試薬の第2のサブセットを第1の熱領域に輸送する工程を含んでもよい。連続して熱サイクルされた増幅反応液滴のサブセットは、共通の電極経路に沿って熱サイクルされてもよい。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の2つ以上のサブセットを処理する工程は、並行して2つ以上のサブセットを増幅させる工程を含んでもよい。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の2つ以上のサブセットを処理する工程は、全ての増幅反応試薬に関して熱的に同時に熱サイクルする工程を含んでもよい。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の2つ以上のサブセットを処理する工程は、全ての増幅反応試薬に関して熱的に同時でなくてもよい熱サイクルする工程を含んでもよい。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の2つ以上のサブセットを処理する工程は、液滴アクチュエータの熱サイクル領域を加熱および冷却することによって行われ得ることを含んでもよい。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の2つ以上のサブセットを処理する工程は、1回以上、熱サイクルするサイクル数で熱領域における増幅反応液滴の滞留時間を変化させる工程を含んでもよい。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の2つ以上のサブセットを処理する工程は、増幅液滴からシグナルを検出する前に増幅反応液滴の全てのサブセットに関して完了されてもよい。一部の場合において、増幅液滴からシグナルを検出する工程は、第2のセットの液滴について標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の2つ以上のサブセットを処理する前に第1のサブセットの液滴について完了されてもよい。検出するための増幅液滴を調製する工程は、2つ以上の増幅液滴のセットに対して標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の2つ以上のサブセットを処理する前に、液滴アクチュエータの熱サイクル範囲から離れた位置、または熱サイクル領域から離れた位置に2つ以上の増幅液滴のセットを輸送する工程を含んでもよい。増幅液滴は、増幅液滴からシグナルを検出するのに適切な温度を有する熱領域に輸送されてもよい。検出するための増幅液滴を調製する工程は、配置された増幅液滴の各々のそのようなサブセットに対して増幅液滴からシグナルを検出する前に熱サイクル領域から離れた位置に増幅液滴のサブセットを少なくとも配置する工程を含んでもよい。検出するための増幅液滴を調製する工程は、増幅核酸から未結合の検出試薬を分離する工程を含んでもよい。検出するための増幅液滴を調製する工程は、増幅液滴における増幅を実質的に停止する工程を含んでもよい。検出するための増幅液滴を調製する工程は、1つの液滴アクチュエータから別の液滴アクチュエータに増幅液滴を輸送する工程を含んでもよい。増幅液滴における増幅を実質的に停止する工程は、増幅反応を実質的に停止するために液滴温度を調節する工程を含んでもよい。増幅液滴における増幅を実質的に停止する工程は、増幅反応を実質的に停止するために試薬を増幅液滴に添加する工程を含んでもよい。試薬を増幅液滴に添加する工程は、増幅液滴と試薬液滴とを混合する工程を含んでもよく、試薬液滴は、増幅反応を実質的に停止するために選択される試薬を含んでもよい。増幅反応を実質的に停止するために選択される試薬は、ポリメラーゼ活性を妨げること、ポリメラーゼ補因子活性を妨げること、核酸に結合すること、および/または鉄イオンを放出することによって増幅反応を実質的に停止する試薬を含んでもよい。特定の実施形態において、増幅反応液滴は検出試薬を欠く。検出するための増幅液滴を調製する工程は、検出試薬を増幅液滴に添加する工程を含んでもよい。検出試薬を増幅液滴に添加する工程は、各々の増幅液滴と検出試薬を含む液滴とを混合する工程を含んでもよい。検出するための増幅液滴を調製する工程は、各々の増幅液滴と1つ以上の検出試薬を含む液滴とを混合する工程を含んでもよい。増幅液滴からシグナルを検出する工程は、検出試薬によって媒介されるシグナルに基づいて増幅を検出する工程を含んでもよい。増幅液滴からシグナルを検出する工程は、そのような液滴の検出ウィンドウへの輸送後に各々の増幅液滴からシグナルを検出する工程を含んでもよい。増幅液滴からシグナルを検出する工程は、増幅液滴の1つ以上のサブセットのセットを、検出するための検出ウィンドウに輸送する工程を含んでもよい。特定の実施形態において、標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応試薬の2つ以上のサブセットを処理する工程は、液滴アクチュエータの液滴操作間隙内で達成されてもよく、検出するための増幅液滴を調製する工程および/または増幅液滴からシグナルを検出する工程は、液滴操作間隙の外側で達成されてもよい。従って、検出するための増幅液滴を調製する工程は、検出するための液滴操作間隙の外側に1つ以上の増幅液滴を輸送する工程を含んでもよい。一部の場合において、増幅液滴からシグナルを検出する工程は、液滴アクチュエータの液滴操作間隙の外側のリザーバーで行われてもよい。検出するための増幅液滴を調製する工程は、増幅液滴のサブセットを、少ないサイクル数のサブセットで開始する検出ウィンドウに輸送する工程、および高いサイクル数のサブセットまで処理する工程を含んでもよい。増幅液滴からシグナルを検出する工程は、増幅液滴のアレイを走査する工程を含んでもよい。増幅液滴からシグナルを検出する工程は、増幅液滴のアレイを画像化する工程を含んでもよい。特定の実施形態において、標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の2つ以上のサブセットを処理する工程は、複数のサブセットに関して並行して開始し、検出するための増幅液滴を調製する工程は、連続して開始し、各サブセットは以前のサブセットの開始後に開始し、増幅液滴からシグナルを検出する工程は連続して開始し、各サブセットは以前のサブセットの開始後に開始する。一部の場合において、検出するための増幅液滴を調製する工程は連続して開始し、各サブセットは以前のサブセットの開始後に開始する。一部の場合において、増幅液滴からシグナルを検出する工程は連続して開始し、各サブセットは以前のサブセットの完了後に開始する。
本明細書で使用する場合、以下の用語は示される意味を有する。
本発明は、液滴アクチュエータ装置、液滴アクチュエータを製造および使用するための技術ならびにシステムを提供する。本発明の実施形態は、液滴操作を実施するのに有用である。本発明の実施形態は、核酸を増幅するための液滴の熱サイクルなどの液滴の熱サイクルを利用するアッセイを実施するのに有用である。本発明の種々の熱サイクルプロトコルは、当該技術分野に対して様々な利点を有する。一部の場合において、そのプロトコルは、加熱器または液滴アクチュエータが熱サイクルされることを必要としない。他の場合において、同時または同じ部位で発生する核酸増幅および検出を必ずしも必要としない。さらに他の場合において、熱サイクルの間の反応に存在すべき検出試薬を必ずしも必要としなくてもよい。例えば、検出試薬は、熱サイクルされた液滴と、検出試薬を含む液滴とを混合することなどによって熱サイクルの後に加えられてもよい。一部の実施形態において、熱サイクルの間に生じる検出を必ずしも必要としない。すなわち、検出は、熱サイクルの完了の際、または熱サイクル後に生じてもよい。さらに他の場合において、測定されるべき1つより多い個々の反応からのシグナルを必ずしも必要としない。さらに、任意の特定の順序で決定されるべき任意の特定の数のサイクルと関連するシグナルを必ずしも必要としなくてもよい。本発明の任意の特定の熱サイクルプロトコルは、これらおよび他の利点のうちの1つ以上を有してもよい。
本発明は、液滴アクチュエータ装置および液滴操作を実施するための方法を提供する。本発明は、液滴アクチュエータ上の液滴と、他の液滴、充填流体、および/または液滴アクチュエータ表面との間の二次汚染ならびにキャリーオーバーを実質的に減少または除去することができる。本発明は、汚染を減少または除去するために使用する液滴アクチュエータ間の清浄を提供することができる。本発明は概して、PCRなどの核酸増幅反応を参照して記載されるが、その方法は、液滴間の二次汚染またはキャリーオーバーが問題となる任意の種類のアッセイに適切であることは理解されるだろう。
図18は、本発明の液滴アクチュエータの一部の電極構成1800を示す。電極構成1800は、液滴アクチュエータの表面で液滴操作を実施するように構成される電極1805を備える。本発明の全ての電極構成と同様である電極構成1800は、より広範囲の電極構成および/またはより広範囲のマイクロ流体ネットワークの一部として提供され得る。液滴アクチュエータは、例えば、単一のサンプル液滴(図示せず)または別の液体源から同一のサブサンプル液滴を分配することによって、一連の同一の反応液滴1820を用いて液滴操作表面で他の液滴操作を分配および実施するために使用されてもよい。液滴操作電極1805は、一連の液滴輸送経路1806を提供するように構成されてもよい。液滴操作電極1805は、反応液滴1820をいくつかの液滴輸送経路1806の1つに輸送するために使用されてもよい。
・経路1:7
・経路2:1,6
・経路3:2,5
・経路4:3,4
図21は、本発明の液滴アクチュエータの電極構成2100を示す。電極構成2100は、供給源(示さず)からの液滴1815が、2以上の温度領域の間の前後で電極経路に沿って輸送できる方法で構成される電極1805を備える電極経路2105を備える。以前の例のように、温度領域は、加熱器またはヒートシンクなどの温度制御素子1810によって規定される。液滴1815は、温度制御素子1810によって規定される温度領域の間で前後に曲がっているか、または巻いている電極経路2105に沿って蛇行する。他の実施形態のように、液滴アクチュエータは、液滴操作を制御するシステムの一部として与えられてもよい。そのシステムは、熱サイクル領域を通して、検出のための位置に液滴を輸送するようにプログラムされてもよい。
図26は、本発明の液滴アクチュエータの電極構成2600を示す。電極構成2600は電極ループ2605を形成するように配置される電極1805を備える。液滴1815は、熱サイクルを行うために熱領域を通ってループ中の電極経路に沿って輸送される。液滴は、ループに侵入し、所定の回数、ループの周りを回ることができ、次いでループから出ていく。入口および出口は、例えば、電極経路(図示せず)にアクセスすることによって、および/または液滴アクチュエータの外部から1つ以上の開口部を通して(例えば上部または底部の基板あるいは液滴アクチュエータ内の任意の他の経路を通して)与えられてもよい。
図29は、本発明の液滴アクチュエータの電極構成2900を示す。電極構成2900は熱サイクルの流路の構成を示し、ここで、小液滴は検出のためのより大きな液滴から分裂される。電極経路2900は、熱制御素子110によって規定される熱領域の間の前後に熱サイクル液滴2910を輸送するように構成される電極2907を備える第1の電極経路2905を備える。電極経路2905は、本明細書に記載されるような1つ以上の電極経路ループおよび/または曲がっている流路の電極配置と置き換えられてもよいことは理解されるだろう。電極構成2900はまた、熱サイクル液滴2910から小液滴2912を分配するように構成される電極2917を備える第2の電極経路2915を備える。電極2907は、概して、電極2917より大きく、従って、比較的大きな体積の液滴2910を支持し、その液滴2910から複数の小さな液滴の小液滴2912が分配されてもよい。電極経路Aは、熱サイクルの間の液滴2910が、熱制御素子1810によって規定される熱領域の間に輸送されることを示す。電極経路Bは操作を分配する部分を示し、ここで、液滴2910は、電極経路2915に近接する電極経路2905の電極上に位置する。電極経路2915上の電極2917は活性化され、それによって、液滴2910から細長い延長部の形成を引き起こす。電極経路Cは、電極経路2915上の小液滴2912の形成を引き起こすための1つ以上の中間電極2917の不活性化を示す。小液滴2912は検出に供されてもよく、ここで、小液滴2912は形成され、および/または検出のために離れて輸送されてもよい。
一実施形態において、本発明は一連の検出バッチ熱サイクル技術を与える。このアプローチにおいて、サブサンプル液滴はサンプルから生成され、温度制御領域に配置されてもよい。温度制御素子は、所定の熱サイクルプロトコルに従って温度制御領域において温度をサイクルすることができる。1つの液滴は、所定数のサイクル毎の後に検出されてもよい。このように、例えば一実施形態において、異なる液滴が各サイクルの後に検出される。この方法において、各液滴は一度のみ検出に供される。データは、サンプルに存在する標的物質を定量化するのに適切な曲線を生成するために使用されてもよい。
図33は、電極構成3300が、反応液滴3305を配置するために使用される実施形態を示す。反応液滴3305は、本明細書の特定の他の実施例に示されるように、熱サイクル液滴(例えば増幅準備液滴)であってもよいか、または反応が経時的に生じる一部の他の反応であってもよい。温度制御素子3310は熱サイクルまたは反応液滴3305の温度制御を与えられてもよい。反応クエンチング液滴3315は、反応液滴3305と接触するように輸送されてもよい。反応クエンチング液滴3315は、反応液滴3305において生じる反応をクエンチ、または後でクエンチするための1つ以上の試薬を含んでもよい。一実施形態において、反応液滴3305における反応は実質的に同時に開始され、反応液滴3305は連続して反応クエンチング液滴3315と混合される。クエンチング後、混合された液滴は、反応速度論の曲線の指標を生成するためのさらなるアッセイ工程および/または検出に供されてもよい。別の実施形態において、反応液滴3305における反応は連続して開始され、反応液滴3305は反応クエンチング液滴3315と実質的に同時に混合される。同様に、クエンチング後、混合された液滴は、反応速度論の曲線の指標を生成するためのさらなるアッセイ工程および/または検出に供されてもよい。中間プロセスにおいて、反応は連続して開始され、連続してクエンチされる。
本発明は、液滴アクチュエータが提供され、反応液滴が液滴アクチュエータ上に提供される、関連する実施形態を提供する。反応液滴は、1つ以上の反応が反応液滴内で起こるという特徴がある。例えば、反応としては、化学反応、生化学反応および/または生物学的反応が挙げられる。反応が進行する場合、1つ以上の小液滴は反応液滴から分配される。各々のこのような小液滴は、反応を停止させる方法で処理されてもよい。例えば、小液滴の温度は、反応が停止または実質的に停止する温度に調節されてもよい。別の例として、各々の小液滴は、反応をクエンチする試薬を含む試薬液滴と混合されてもよい。各々の小液滴は異なる時間で親反応の液滴から除去されてもよく、小液滴は、反応の時間経過を示す曲線を生成するためにさらなる解析に供されてもよい。関連した実施形態において、小液滴における反応はクエンチされないが、各々の小液滴は、親反応の液滴から分配された後、迅速に検出に供される。さらに別の実施形態において、親液滴は多数の小液滴に細分されてもよく、小液滴は、各々の小液滴が異なる時間で検出に供される検出プロトコルに供されてもよい。収集したデータは、反応速度論の曲線の指標を生成するために使用されてもよい。一実施形態において、小液滴の分配は、電極、例えばエレクトロウェッティング媒介、誘電泳動現象媒介液滴分配によって媒介される。
種々の特性を有するさらなる様々な実施形態は、本発明の範囲内であり得る。少しの例を以下に示す。
・MRSA/Eva Greenシステム:
標的物:mecA遺伝子の176bpフラグメント(遺伝子1つにつき8〜10のコピー)
サンプル:バッファー中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA) gDNA(ATCC#700699D−5)
・定量実験:
100,000〜1コピーのMRSAゲノム(反応物中に300pg〜3fg gDNA)
同じ量のDNAを、660nLの液滴アクチュエータ反応物およびBioRad 50μl反応物(75倍の濃度差)に加えた。
・PCR混合物:
Eva Green色素
白金Taq
・充填流体
ヘキサデカン
・熱プログラム(典型的):
Hotstart:60s@95、
40サイクル:(10s 95C、20s@60C)
・Candida albicans/Taq Manシステム
−標的物:18SリボソームRNA遺伝子の172bpフラグメント(1つのゲノムにつき70〜100コピー)
−サンプル:Candida albicans gDNA(ATCC#10232D−5)
・PCR混合物
−TaqManプローブ(FAM−BHQ)
−Bio−Rad iTaq
・充填流体
−シリコーン油
・熱プログラム
−Hotstart:120s@95C
−40サイクル(15s 95C、60s@60C)
図42における定量は、gDNAのインプット量の生物またはゲノム等価物の数による。
核酸増幅反応をクエンチまたは実質的に停止することが所望される本明細書の種々の実施形態において、増幅反応を停止することが公知である種々の試薬が使用されてもよい。例えば、試薬は、例えばポリメラーゼを変性および/または分解するために結合することによって、ポリメラーゼ活性を妨げることができる。さらなる例を以下の表に与える。
デジタルPCRは、サンプル中の正確な数のテンプレートコピーを測定するのに高度に定量的な方法として報告されている。サンプル液滴は、複数のナノリットルサイズのサブユニットに分配されるか、または分裂されてもよい。ほとんどの娘液滴は、0または1つのコピーを含む(一部はポアソン分布に起因して2つ以上のコピーを有する場合がある)。本発明は、液滴アクチュエータ上でデジタルPCRを実施するための技術を提供する。小さなユニットサイズの電極が好ましい。一実施形態において、電極は約200×200μmの電極である。液滴操作間隙の高さも調節されてもよい。200×200μmの電極を備える約100μmの液滴操作間隙の高さは、約4nLの体積を有する液滴を規定する。多くのこのような液滴は、種々の液滴分配技術を用いて生成されてもよい。一例において、一連の電極は細長い鎖を生成するように活性化され、次いで活性化された電極の散在された群は不活性化され、活性化された電極上でナノリットルのサイズの娘液滴を生じる。従来の分配および輸送技術もまた、一連の娘液滴を形成するために使用されてもよい。液滴アクチュエータ全体は増幅を実施するために熱サイクルされてもよいか、または個々の液滴は、熱サイクルを行うために熱制御領域を通してサイクルされてもよい。液滴は、液滴アクチュエータ表面上に、電圧、化学的または物理的パターニングによって反応全体にわたって所定の位置に維持されてもよい。増幅核酸の存在は液滴中で検出されてもよく、標的核酸の量が決定されてもよい。
液滴アクチュエータベースのPCR(例えば、定量的リアルタイムPCR(QRT−PCR))において、標的核酸は増幅反応のために磁性反応ビーズに固定されてもよい。増幅産物を定量化するために、磁性反応ビーズを含む反応液滴は、液滴操作を用いて液滴アクチュエータ上の検出ウィンドウに輸送されてもよい。一部の例(例えばQRT−PCR)において、増幅産物の検出は、増幅産物の量を定量化するためにSybrGreenなどの蛍光色素を利用してもよい。しかしながら、サンプル液滴内に分散される磁性反応ビーズは、検出装置(例えば蛍光光度計)から蛍光を遮断することによって蛍光色素の検出を妨げる場合がある。
核酸増幅方法は熱サイクルを使用する。すなわち、規定された一連の温度変化によってサンプルおよび増幅試薬を含む液滴を交互に加熱および冷却する。液滴アクチュエータベースの増幅(例えば電極によって媒介される液滴操作などの液滴操作を用いて実施されるPCR)において、温度制御素子(例えばペルチェユニット、加熱ブロック、冷却ユニットなど)が、液滴アクチュエータ表面上、または液滴アクチュエータ間隙内の充填流体の温度を制御するために使用されてもよい。しかしながら、熱サイクルに必要とされる高温は、蛍光増強が、検出法および検出色素として使用されるSybrGreenなどの蛍光色素(すなわち蛍光色素分子)として使用される場合、検出シグナルの損失を生じる場合がある。SYBR(登録商標)Green dyeなどの細胞透過性蛍光色素分子は、疎水性相(例えば油性充填流体)において十分な溶解性を有することができ、水性PCR液滴から充填流体に、特に熱サイクルの間に発生するものなどの高温で分配することができる。
核酸増幅は、反応液滴内に含まれる核酸テンプレート、オリゴヌクレオチドプライマー、試薬および酵素などの多くの異なる反応成分を含むいくつかの工程を必要とする。核酸、タンパク質(すなわち酵素)、および/または色素(例えば蛍光色素)などの増幅液滴のこれらの成分の多くは、基板表面(例えば液滴操作電極)上に吸収され得、および/または液滴アクチュエータの充填流体(例えば油性充填流体)内に分配され得る可能性がある。液滴アクチュエータの基板表面および/または充填流体に対するこれらの重要な成分の損失は、PCR反応の低減した効果および/またはPCR反応の失敗を生じる場合がある。一実施形態において、本発明は、物質がその物質を一緒に使用する前に他の物質に対して「不動態」となる表面安定化技術を提供する。本発明の表面安定化技術は、増幅液滴から液滴アクチュエータの表面までの重要な成分の損失を低減および/または取り除くことができる。
PCRを実施するのに使用される液滴アクチュエータは、液滴操作間隙によって隔てられる底部基板および上部基板を備えてもよい。表面張力は温度の増加に伴い減少するため、表面張力が非常に低い場合、液滴は、高い温度で分裂または砕け得る。従って、室温で十分に作用することができる間隙の高さの構成は高温で作用しなくてもよい。なぜなら、表面張力は効果的に減少するからである。本発明は、この効果がより大きな間隙を用いることによって埋め合わされてもよいことが発見されている。表面張力(エネルギー)はより大きな間隙について同じであるが、領域はより大きいので、多くの総エネルギーが、砕くために液滴に必要とされる。典型的に、熱サイクルを実施するのに使用される液滴アクチュエータにおける液滴操作間隙の高さは約200μmであってもよい。しかしながら、非常に小さな間隙の高さは、熱サイクル領域の間に液滴を往復させるときなどの液滴操作の間に増幅液滴の分裂を生じる場合がある。PCR液滴の分裂は、標的核酸および試薬成分の損失を生じる場合がある。これらの重要な成分の損失は、増幅反応の実質的に低減した効果および/または増幅反応の失敗を生じる場合がある。
液滴アクチュエータでの液滴ベースの核酸増幅は、熱反応領域と検出器との間で電極によって媒介される液滴操作を用いて増幅準備液滴が往復される、一連の液滴操作を含む。このプロセスが共通の経路または近接する経路に沿う複数の液滴の移動に関する場合、増幅液滴からの残留成分は、1つの液滴から別の液滴に移動する場合があり、一連の液滴操作におけるその後の増幅液滴を汚染する。本発明は、油内の増幅液滴を使用する増幅液滴の間の二次汚染を減少させるための液滴アクチュエータおよび方法を提供する。
液滴アクチュエータベースの核酸増幅の一部の適用において、PCR解析の前にサンプル流体中の検体(例えば細菌、ウイルス、真菌、および/または核酸)を濃縮することが必要な場合がある。例えば、最適な解析を与えるために、サンプル流体の量は非常に多く、および/または検体の濃度は非常に小さくてもよい。
本発明の種々の実施形態において、本発明は核酸サンプルを使用する。核酸サンプルは、標的分子、細胞または生物などの標的物質に直接または間接的に結合される標的核酸または核酸を少なくとも潜在的に含むサンプルである。特定の実施形態において、核酸サンプルはサブサンプルに細分化されてもよい。例えば、サブサンプル液滴はサンプル液滴から液滴操作を用いて分配されてもよい。
増幅を検出するための種々のアプローチが本発明の実施に使用されてもよい。例えば、一実施形態において、各サブサンプル液滴は所定の波長で蛍光強度測定に供される。一実施形態において、検出は増幅反応と同時に達成される。言い換えれば、複数のサブサンプル液滴が増幅される間、各サブサンプル液滴はその所定数のサイクルを達成するため、検出に供されてもよい。1つの液滴が検出に供されている間、他の液滴は増幅され続けてもよい。特定の実施形態において、液滴のグループがほぼ同時に達成され、各n回のサイクル後に、少なくとも1つの液滴が検出に供される。各検出工程の間のサイクルの数は、特定のアッセイに必要なデータに基づいて選択されてもよい。一般に、より正確な定量化は、多数または少数の全増幅サイクルの検出を必要とする。
本明細書に記載され、図48Aおよび48Bに示されるように、加熱バー4800は、十分な熱伝導率のために、アルミニウムバー4802などのアルミニウムから構成されてもよい。2つの抵抗器4804(各々15Ω)は、均一な加熱を与えるように底側の2つの端部に取り付けられる。サーミスタプローブ4806は、加熱器PID制御因子に温度測定を与えるために加熱バーの中央に取り付けられてもよい。加熱バーは、位置決めねじ4810を用いてカートリッジデッキ4808に配置され、下部のスプリング4812によって支持されてもよい。スプリング力は、加熱バー表面と加熱されるPCBカートリッジ4814との間の密な接触を確実にする。スプリングにより留められた加熱バーはカートリッジデッキに接触せず、デッキに移動される望まれない加熱器は最小化される。
当業者によって理解されるように、本発明は、方法、システムまたはコンピュータープログラム製品として具現化されてもよい。従って、本発明の種々の態様は、ハードウェア実施形態、ソフトウェア実施形態(ファームウェア、常駐ソフトウェア、マイクロコードなどを含む)、または「回路」、「モジュール」もしくは「システム」として本明細書においてほぼ全て参照され得るソフトウェアおよびハードウェアの態様を組み合わせた実施形態の形態をとってもよい。さらに、本発明の方法は、媒体において具現化されるコンピューターにより使用可能なプログラムコードを有するコンピューターにより使用可能な記録媒体上でコンピュータープログラム製品の形態をとってもよい。
上述の実施形態の詳細な説明は、本発明の特定の実施形態を例示する添付の図面を参照する。異なる構造および操作を有する他の実施形態も本発明の範囲から逸脱しない。用語「本発明」などは、本明細書に記載される本出願人の発明の多くの代替の工程または実施形態の特定の具体例に対する参照とともに使用され、その使用が存在してもしなくても、本出願人の発明の範囲または特許請求の範囲を限定することを意図しない。本明細書は、読み手のみの簡便さのためにセクションに分けられる。見出しは本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。その定義は本発明の詳細の一部と意図される。本発明の様々な詳細は、本発明の範囲から逸脱せずに変更されてもよいことは理解されるだろう。さらに、上述の詳細は例示のみの目的のためであり、限定を目的とせず、本発明は添付の特許請求の範囲によって定義される。
Claims (13)
- 解析するためのサンプルを調製する方法であって、前記方法は、
(a)(i)液滴操作基板と、(ii)前記液滴操作基板の液滴操作表面上で液滴操作を実施するように配置される電極と、(iii)前記液滴操作表面とカバーとの間に液滴操作間隙を形成するために、前記液滴操作表面に隣接し、前記液滴操作表面から離間している、カバーを含む上部の基板と、(iv)前記上部の基板に結合され、1つ以上の標的検体および/または1つ以上の標的検体を含む物質に対する親和性を有する磁性反応ビーズを含むリザーバーと、(v)前記リザーバーから前記液滴操作間隙に延在する液体経路と、(vi)前記液滴操作基板に結合され、磁性反応ビーズを引き付けるのに十分な磁場を生成するように構成される磁場源と、を備える液滴アクチュエータを提供する工程と、
(b)前記リザーバー内にサンプル流体を供給する工程であって、前記サンプルは、前記標的検体および/または物質のうちの1つ以上を潜在的に含む工程と、
(c)前記液体経路を通して前記液滴操作間隙内に前記磁性ビーズを含むサンプル流体を流動させる工程と、
(d)前記磁性反応ビーズを磁場で凝集させる工程と、
(e)前記磁場を除去するか、または前記磁場から前記ビーズを除去して、磁性ビーズを含む前記液滴操作間隙内にサンプル液滴を生じさせる工程と、
を含む、方法。 - 前記液滴アクチュエータは、前記液滴操作基板に結合され、前記液体経路を通して前記液滴操作間隙に侵入する流体を受容するように配置されるリザーバー電極を備え、前記磁場源は、前記液体経路に対して前記リザーバー電極の反対側に配置される、請求項1に記載の方法。
- 前記液滴アクチュエータは、前記リザーバー内のサンプル流体に音波エネルギーを与えるように配置される超音波処理器を備え、前記リザーバー内の前記サンプルを超音波処理する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- (a)1つ以上の標的検体を含む検体および/または物質は、細胞を含み、前記ビーズは前記細胞に対して親和性を有し、
(b)前記方法は、請求項1に記載の工程(e)によって生成される磁性ビーズを含む前記液滴操作間隙内の前記サンプル液滴と、細胞溶解試薬を含む溶解液滴とを混合する工程をさらに含み、
前記磁場を再印加して、前記磁性ビーズを固定化させる工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記磁性ビーズから離れた位置に液滴を輸送する工程をさらに含む、請求項4に記載の方法。
- 前記磁性ビーズから離れた位置に前記サンプル液滴の一部を輸送する工程をさらに含む、請求項4に記載の方法。
- 離れた位置に輸送された前記液滴または前記サンプル液滴の一部と、前記1つ以上の標的検体に対する親和性を有するビーズを含む液滴とを混合する工程をさらに含む、請求項5または6に記載の方法。
- 前記1つ以上の標的検体に対する親和性を有する前記ビーズを洗浄するために洗浄プロトコルを実施して、実質的に精製された標的検体を含むビーズを含む液滴を生じる工程をさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 前記実質的に精製された標的検体を含む前記ビーズを含む前記液滴を用いて解析プロトコルを実施する工程をさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 前記解析プロトコルを実施する工程は、前記液滴操作間隙内で達成される、請求項9に記載の方法。
- 前記実質的に精製された標的検体を含むビーズを含む前記液滴は、前記解析プロトコルを実施する前に、前記液滴操作間隙から除去される、請求項9に記載の方法。
- 前記解析プロトコルの結果の出力の指標を提供する工程をさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 前記実質的に精製された標的検体を含むビーズを含む液滴を、前記液滴操作間隙から除去する工程をさらに含む、請求項8に記載の方法。
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