JP5063616B2 - マイクロ流体デバイス - Google Patents
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Description
本発明の態様は、国防総省によって承認された1つ以上のプロジェクト番号W911SR−04−P−0047、NIH(国立衛生研究所)によって承認された許可番号5R01HGO03583−01、HSARPA(国土安全保障先端研究計画局)によって承認された契約番号NBCHC050133、HSARPAによって承認された注文番号TTA−1−0014(契約番号W81XWH−04−9−0012)に基づく政府支援によって実施された。政府は、本発明に特定に権利を有する。
過去10〜20年にわたって、多くの場合生物学的分析法におけるサンプル量の要件を減少させることを目標にして、本質的に異なり、多くの場合は互換性がない設計の多様なマイクロ流体デバイスが開発されてきた。外寸のフォームファクタを管理する規格がない場合、上流および下流の外部インターフェース、並びに内部のマイクロ流体デバイスなどのマイクロ流体経路の長さ、断面形状、および直径の特性は、多くの場合、互いに、および既存の上流の精製デバイスおよび下流の分析デバイスと適合しないことが判明している。
本発明は、上記およびその他の技術的必要性を解決するものである。
図面を含む上記の一般的な説明、および以下の詳細な説明は、単なる例示および説明的なものであり、本発明を制限するものではないことを理解するべきである。本開示では、単数形を使用する場合、特記しない限り複数形を含む。また、「または」を使用する場合、特記しない限り「および/または」を意味する。同様に、一人称または三人称の単数現在の「備える」、「備えている」、一人称または三人称単数現在の「含む」、および「含んでいる」は、制限することを意図するのではない。「要素」または「構成要素」などの用語は、特記しない限り、1つのユニットを備える要素および構成要素、並びに複数のユニットを備える要素または構成要素の両方を含む。本明細書で使用する各段落の見出しは、単に構成上の目的であり、記載されている主題を制限するように解釈しないものとする。本明細書で引用するすべての参考文献、および参考文献の部分は、あらゆる目的で本明細書で引用することにより本明細書に明示的に援用し、こうした参考文献としては、特許、特許出願、論文、書籍および専門書が挙げられるが、これらだけに限らない。援用された参考文献の1つまたは複数が本開示と矛盾する場合、本開示を優先する。
いくつかの実施形態では、サンプル中の標的分析物は、マイクロ流体デバイス内に導入する前に濃縮し、さらに他の処理または分析を行うことができる。いくつかの実施形態では、1つ以上の標的分析物は、マクロスケール容量(たとえば、ミリリットルからリットル容量)を保持し、1つ以上の標的分析物を小さい表面(たとえば、マイクロビード)上に濃縮させることが可能な1つ以上のオフチップ貫流デバイスを使用して濃縮させることができる。いくつかの実施形態では、1つ以上の標的分析物は、マクロスケール容量を保持するオフチップレザバによって供給可能なオンチップ貫流デバイスを使用して濃縮させることができる。いくつかの実施形態では、オンチップとオフチップデバイスとを組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態では、捕捉された標的分析物は、下流での処理または分析に適する容量に選択的に溶離させることができる。図1に示すように、SCPM1は免疫捕捉2、溶解3、核酸精製4のモジュールを含むことが可能であり、ナノバイオプロセッサ5と集積化可能である。いくつかの実施形態では、毒素などの分子を免疫捕捉し、ナノバイオプロセッサ5に直接供給することが可能である(図2)。
いくつかの実施形態では、標的分析物は、濃縮マトリックス140を通してマクロスケールのサンプル量を送るオフチップ貫流デバイス130を使用して濃縮させることができる(図4)。いくつかの実施形態では、濃縮マトリックスは標的分析物を保持し、バルク溶液および干渉化合物はデバイスを通過する。いくつかの実施形態では、干渉化合物または望ましくない化合物がマトリックス140上に保持され、標的分析物はデバイスを通過する。粗濾過(約、20μm)は、サンプルの形状(表面、水、土壌、エアロゾル、生体材料)に応じて、嵩高な不純物および微粒子を除去するために使用し得る。いくつかの実施形態では、オフチップ貫流デバイスは、内部にマトリックスが装填されている底部にフリットの開口部150を含むことができ、溶離用の穿孔(≦1mm)ポートを含むことが可能である(図4)。濃縮マトリックスは、本明細書に記載するように、非親和性培地またはアフィニティー捕捉培地を使用することができる。BPMマイクロ流体デバイスと集積化されたオフチップ貫流デバイスの一例は、図3に示されている。
本明細書で使用する「非アフィニティー捕捉」は、疎水性、親水性、またはイオン性相互作用による培地上での標的分析物の非特異的捕捉を意味する。
本明細書で使用する「アフィニティー捕捉」は、標的分析物に対して実質的に特異的な分子(たとえば、抗体、リガンド、受容体、レクチン、ハプテン、エピトープ、オリゴヌクレオチドなど)を含む培地を使用する標的分析物の捕捉を意味する。いくつかの実施形態では、標的分析物(たとえば、細胞、有機体、胞子、または毒素)の表面エピトープに対する単クローン抗体で修正された磁気ビードをサンプルに添加することができる。いくつかの実施形態では、特異的な有機体、細胞型、亜型、種、核酸、タンパク質などに対する抗体を塗布されたビードの混合物または集合は、順次、または医師の裁量で選択された様々な組み合わせで適用することができる。抗体を塗布されたビードは、標的分析物に結合し、それによって標的分析物を溶液から捕捉することができる。ビードは磁石によって収集することができ、不純物および潜在的な抑制剤を洗浄して除去することができる。
いくつかの実施形態では、BMPマイクロ流体デバイスは、標的分析物を濃縮するために使用することができる。いくつかの実施形態では、標的分析物のオンチップ濃縮は、モジュールの集積化、超微細加工技術の使用、および同一チャンバ内でPCRなどの様々な方法を実施する能力を促進することができる。いくつかの実施形態では、この場合、適切な流量を生成するために、比較的大径のチャネルを使用する必要があり得る。いくつかの実施形態では、免疫アフィニティー捕捉は、サンプル由来の病原性有機体もしくはウイルス、タンパク質、またはその他の標的分析物を濃縮および精製するための迅速かつ特異的な方法を提供する。たとえば、標的分析物を濃縮するため、ビードベースのサンプル調製は、バッチ処理からオンチップ処理に変更することができる。たとえば、抗体が塗布されたビードは、導電学的ビード床充填、および堰ビード補足方法を使用して集積化、超微細加工捕捉チャンバ内に配置することができる(Oleschuk等、2000.Analytical Chemistry 72:585−5909)。
いくつかの実施形態では、標的分析物は、オンチップまたはオフチップで破壊および溶解することができる。破壊または溶解させることが可能な標的分析物の非制限的な例としては、(たとえば、原核、真核、古細菌)、胞子(たとえば、細菌(たとえば、Bacillus anthracis、クロストリジウム)または真菌(たとえば、C.イミチス))、細胞小器官(たとえば、ミトコンドリア、核など)、核酸、染色体、プラスミド、リボソーム、プロテオソーム、ウイルス(疱瘡、インフルエンザ、ウエストナイル、ポリオ、肝炎、およびレトロウイルス)が挙げられる。いくつかの実施形態では、標的分析物は、音波処理によって破壊または溶解させることができる。いくつかの実施形態では、ビード上に捕捉される標的分析物は、マイクロチップ上に導入する前に超音波処理することができる。
いくつかの実施形態では、本発明のシステムは、核酸精製モジュール(NAPM)を含むことができる。NAPMは、その他の物理的形態の溶液またはサンプル、たとえば1つ以上のビード、コロイド、多相(不均質もしくは異質)溶液、またはその他の組成物を収容するように設計することができる。いくつかの実施形態では、NAPは、溶解モジュールからの投入量を収容するように設計することができる。NAPMによって収容される量の範囲は、ミリリットルからピコリットル未満の量にわたる可能性がある。いくつかの実施形態では、NAPの生産量は、BPMマイクロチップまたはその他のマイクロ流体デバイスに供給され、さらに処理または分析を行うことができる。
サンプル中の全核酸は、カオトロピック剤を使用して、核酸を溶液から表面上に押しやるという非特異的な捕捉方法を使用して精製することができる。たとえば、米国特許第6,489,112号は、チオシアン酸塩またはグアニジニウムなどのカオトロピック剤を使用して、核酸をシリカ毛細管の表面上に押しやる定量的ナノスケール「テンプレート捕捉」法について記載している。洗浄後、濃縮および精製された核酸は、緩衝液中に溶離させて、サイクル配列決定などのナノスケールサンプル処理または分析を行うことができる。この方法は、核酸を溶解物から精製するために使用することもできる。
いくつかの実施形態では、標的核酸は、オフチップハイブリッド化を使用して、オリゴヌクレオチド捕捉配列に選択的に精製することができる。
サンプルは、様々なマイクロ流体デバイス、またはその他の流体システムに直接、または処理後、たとえば本明細書に記載するように捕捉および核酸精製によって導入することができる。いくつかの実施形態では、アフィニティー捕捉工程に由来するビードは、マイクロリットルまたはナノリットル容量などの小量でマイクロチップ内に導入することができる。ビードは、たとえばシリンジポンプまたはピペットデバイスを使用して、マイクロチップ上のレザバ内に揚送することができ、オンマイクロチップポンプは、ビードが捕捉または保持されているマイクロチップの部分の内部にビードを移動させるために使用することができる。
BPMは、一般的に、以下に記載するように機器およびプログラム可能なソフトウェアによって任意に動作することが可能な1つ以上のマイクロ流体デバイスを備える。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、カートリッジ内に保持されたマイクロチップ、ナノチップ、またはピコチップであって、SCPMからサンプルを投入し、流体回路と反応チャンバとの間に液体を送り、試薬を添加し、核酸および毒素などの様々な標的分析物についてアッセイを実行することが可能なものでよい。いくつかの実施形態では、様々なタイプのチップは、MOVバルブ、ポンプ、およびルータをシステム制御要素として使用して、それによって反応時間および順序を制御する個々のバイオプロセッサモジュール内でサンプルを処理することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示するチップはSCPMと集積化することができる。
MOVマイクロバルブ、マイクロポンプ、およびマイクロルータは、2つのガラスマイクロ流体層を、バルブを開閉するポリジメチルシロキサン(PDMS)などの変形可能な膜層、および膜を変形させてバルブを作動させる空気層と結合する。上部ガラス層(図9)内にエッチングされた流体チャネルは不連続であり、バルブシートとして作用するバイアに至る。PDMS膜40は、バルブシートに接して着座し、通常は2つのバイア間の流路を閉鎖する。PDMS膜40の反対側には、エッチングによって形成された空気置換チャンバが、フルスケールの真空源または圧力源に接続されている。超小型オフチップソレノイドを制御することによって、真空または圧力(約1/2気圧)をPDMS膜40に印加すると、可撓性膜の単純な変形によってバルブを開放(50)または閉鎖(60)することができる。
図31は、核酸分析に使用可能な単一バイオプロセッサモジュールの例を示す。この構造では、捕捉されたビードは、IMSおよび核酸精製に由来する精製核酸が結合しており、下方のチャネル350に投入することができる。オンチップMOVポンプ351は、ビードを堰352に移動させ、堰352では、リアルタイムPCR試薬および内部の標準物質を試薬投入部から添加することができるため、核酸は、熱を局所的に印加することによって放出され、μRT−PCRチャンバ353内に揚送することができる。チャンバを囲むバルブは閉鎖して、熱が循環する。
いくつかの実施形態では、マイクロチップは、真空チャック上の固定位置に保持することができる。マイクロチップインターフェースデバイスは、マイクロチップと合体させて、外部の制御要素、たとえば外気、熱循環温度制御要素、温度制御装置、および試薬導入ラインを提供することができる。
いくつかの実施形態では、MINDSシステムは、Sangerサンプルの自動化無人調製および分析を使用して、きわめて低い消費コストで配列決定サンプルを調製および分析することができる。配列決定テンプレートは、各々のビードが、1つのDNA断片に由来するDNAを搬送するバルク乳濁液PCR反応において、剪断染色体またはBAC DNAから開始して、ビード上で調製することができる。分類を行って、断片を含まないビードを除去した後、個々のビードは、浄化およびμCAE分析とともに400チャネルマイクロチップ上に集積化された低用量(たとえば、25nL)のサイクル配列決定反応チャンバに送達することができる。いくつかの実施形態では、ビードは堰によって捕捉され、サイクル配列決定は、順方向および逆方向両方の対合末端読み込みに関して実行され、生成物は、順方向または逆方向の読み込みのいずれかの親和性ゲル捕捉マトリックスを含む二重サンプル浄化チャンバ内に電気泳動することができる。親和性ゲルは、イオンヌクレオチド、および組み込まれていないヌクレオチドを除去するように洗浄することができる。精製されたサイクル配列決定断片は、温度を上昇させることによって親和性マトリックスから溶離させ、折り畳まれたCEチャネル内に注入して、電気泳動分析を行うことができる。この方法は、分子数によって決まる基本的限界に近い規模で配列決定を行うことができるため、試薬の量およびコストをある程度の桁数だけ減少させることができる。
マイクロ流体サイクル配列決定モジュール(CSM)は、スタンドアロン機能として、およびMINDSシステム用のマイクロチップベースのサンプル調製におけるモジュールとして使用することができる。CSMは、1)流れを制御するためのオンチップバルブおよびポンプを含むサンプル調製マイクロ流体回路を含むマイクロチップ、並びに2)オンチップバルブおよびポンプを介してマイクロチップを作動させるための外部インターフェースを含むことができる。サンプル調製CSMは、200nLのサイクル配列決定容量を有する16チャネルスケールであり、偏位チップ分析は、毛細管(CAE)およびマイクロチップ(μCAE)により行われる。いくつかの実施形態では、外部流体インターフェース、加熱、および空気作動装置を有するマイクロチップインターフェースデバイス(MID)は、400チャネル以上に拡張することができる。
CSMを作動させるための機器の特徴としては、1)CSMマイクロチップベースのカートリッジ内の液体の移動を制御するオンチップ小型ロボットの自動化外部作動、2)温度循環のための外部加熱および冷却の制御、3)サイクル配列決定試薬をチップに送達するためのシリンジポンプの駆動、および4)サンプルをマイクロタイタープレートから投入レザバ内に移動させ、調製されたサイクル配列決定サンプルをマイクロチップ排出レザバからマイクロタイタープレート内に送るためのTecan MiniPrepロボットの制御が挙げられる。これらの4つの要素はすべて、LabRATソフトウェアを介して制御することができる。
いくつかの実施形態では、完全なMINDSシステムは、3つのモジュール、つまりビードライブライリーモジュール、サイクル配列決定モジュール、およびDNA分析モジュールを含むことができる。いくつかの実施形態では、完全なMINDSシステムは、400チャネルのMINDSマイクロチップ上で、ビードベースのライブラリを分析することができ、このマイクロチップは、ハイパーターンを含む折り畳まれたマイクロチャネル上に、25nLの対合末端読み込みサイクル配列決定、対合アフィニティー捕捉浄化、およびμCAEに分離を集積化する。MINDSシステムは、ビードライブラリーの構造に応じて、ショットガン配列決定または再配列決定のための完全自動化システムでよい。いくつかの実施形態では、サイクル配列決定モジュールおよびDNA分析モジュールは集積化することができ、PCRまたは精製プラスミドなどの調製されたサンプルは投入サンプルとして使用することができる。いくつかの実施形態では、PCRまたは他の増幅は、マイクロチップ上で実施することができる。
DNA分析モジュールは、標識されたDNA断片を各々の対合末端読み込みから分離および検出するため、対合末端読み込みおよびμCAEのサンプル浄化を行うことができる。サイクル配列決定は、ベクター内に挿入された固有のアフィニティー捕捉配列を各々有する順方向および逆方向の両方にプライマーを使用することができる。全容量、ナノスケール調製、またはCSMに由来する対合サイクル配列決定サンプルは、放射状構造を有する分析マイクロチップのレザバ内に装填することができる。サンプルは、順方向または逆方向読み込みの何れかに関するアフィニティー捕捉オリゴヌクレオチドを含む2つのサンプル浄化プチャンバ内に動電学的に移動させることができる。サイクル配列決定サンプルは、約20nLの容量に濃縮することができ、イオン、組み込まれていない色素、テンプレート、ヌクレオチド、および酵素は通過して廃棄物中に入る。濃縮および浄化されたサンプルは、温度を上昇させることによって遊離させ、twin Tインジェクタ内に注入して、分離マトリックスが充填されたマイクロチャネル内で分離することができる。放射状チャネルは、環状検出領域に集束し、この領域でマイクロチャネルを走査して検出することができる。
CSMの機能をDNA分析モジュールと結合すると、コアMINDSシステムを形成することができる。上記および図14のCSMマイクロチップの基本ユニット構造は、8’’DNA分析モジュールマイクロチップ上に移植することができる。その結果、100の対合末端読み込み親和性サンプル浄化チャンバおよび分離マイクロチャネルと集積化された対合末端読み込みのための50個の100nLサイクル配列決定サンプル調製チャンバを含むマイクロチップを形成することができる。このシステムのサービスでは、マイクロ流体および小型ロボットオンチップ機能を使用して、マイクロチップを作動および再生させることができる。サンプルを装填するために外部自動化を含む実施形態では、コアMINDSシステムは、現在の方法と比べて実質的に低コストで、1日当たり7M塩基の高品質配列を生成することができる。
(1.E.coliのビードベースの捕捉)
磁気ビードに共役した単クローンまたは多クローン抗体を含む希釈溶液に由来するモデル標的有機体の捕捉は、BPMマイクロデバイス内に導入する濃縮精製物質を提供するために使用することができる。ここで、E.coli株O157に対する抗体と共役したDYNAL(登録商標)ビードの使用について説明する。3シリーズの実験を実施した:(1)希釈されたストックに由来するE.coliを捕捉する、(2)大幅に過剰なバシラス属細菌が存在する状態で、E.coliを捕捉する、(3)Baltimoreエアサンプラのエアロゾルサンプルに由来するE.coliを捕捉する。
(2.単クローン抗体を使用するE.coli捕捉の動作範囲)
捕捉の化学作用について、先ず、管内で250μLの容量で調査し、捕捉および洗浄は、緩衝液中に分散させたモデル有機体を使用して最適化した。図36は、DYNAL(登録商標)ビードに結合した単クローン抗体を使用したE.coliの代表的な捕捉を示す。E.coliO157は、250μLのPBS/Tween中に様々な濃度で含まれる抗E.coli抗体と結合した5μLのビードに添加した。この混合物は、回転混合器で10分間混合した。ビードは、強力な磁石を使用して管の側面に引き寄せ、上清を除去した。ビードは、250μLのPBS/Tween (PBST)を使用して3回洗浄した。洗浄したビードは、250μLのPBST中に再度懸濁させて、捕捉したE.coliをTSAで計算した。
洗浄したビー酢を250μLのPBST中に再懸濁させ、捕捉したE.coliをTSA上で計数した。
ビードベースの捕捉の特異性を決定するため、添加されたセレウス菌(ATCC 11778)細胞が、抗体が塗布されたビードに対するE.coliの結合に与える影響を、標準のアッセイ条件でテストした。E.coliが約104個/mLの懸濁液を様々な力価のセレウス菌と混合し、IMSを実施したが、回収は、選択的にセレウス菌を抑制するレベルで添加されたテトラゾリウムを含むTSA培地上で行った。その結果、細胞混合物の直接平面培養が可能になったが、E.coliのみを複製し、コロニー形成単位(CFU)として定量化できた。
細菌細胞を効率的に捕捉し、精製、および回収できることを実証したので、これを、Spector Industriesから提供されたBaltimoreエアサンプラに由来する液体(BASL)サンプルの90%を含む溶液からのE.coliO157の回収に拡張することにした。BASLは、抗体を媒介とする結合および回収を潜在的に妨げる可能性がある、非常に多様な競合する微生物、花粉、並びにその他の化学物質および生物学的物質を含む。
オフチップの使い捨て貫流デバイスのSPEを評価したが、この貫流デバイスは、最大でリットル台のサンプル量を処理することが可能であり、検体を小さい表面上に結合し、干渉化合物が貫流するのを可能にした。最終的に、標的分析物は濃縮形態で回収され、マイクロチップベースのバイオプロセッサによって下流処理が行われるか、またはSPE物質自体がマイクロチップのための供給原料でよい。
図40は、25,000または45,000CFU/mLの比較的高濃度の細菌含むサンプルを使用して、装填したサンプル中、並びにSPE後の上清および溶離液中の細菌濃度の関数としての細菌アッセイの結果を示す。この範囲では、80〜90%のE.coliがSPEマトリックス中に保持されるが(図41)、少量の細菌は通過し、非常に少量(1%)の細菌は、後流によって回収される。したがって、シリカ上で強力な結合が見られ、生存細胞の溶離は少ない。非常に低い力価、125および250CFU/mLでは、比例してより多くの細胞がカラムを通過し、約20%のみが保持される(データは示さない)。
いくつかの実施形態は、アガロースベースの「Bigビード」を使用して、生体材料を捕捉または精製する。市販のβ−ガラクトシダーゼ(Sigma)は、0.1Mのリン酸緩衝液、pH7.5、1mMのMgCl2中に100および10ng/mLの2種類の濃度で溶解させた。これらの2種類の溶液は、50Åの細孔サイズを有する100mgの50μmシリカ粒子を含む「Extract−Clean」 SPEカートリッジ(Alltech)、または500μmの硬化アガロースビードを含む5mlの「Bigビード」カラムに通した。アガロースおよびシリカ由来の培地の両方に関して、酵素溶液(20ml)は、約5mL/分の流量でそれぞれのSPE床を貫流させ、上清を収集して、カートリッジを約1ml/秒の流量の2mLの緩衝液でバックフラッシュした。上清および溶離液は、o−ニトロフェニル−β−ガラクトシド(ONPG)を担体として使用して、酵素活性を分析した。
アガロースBigビードカートリッジが、E.coliの菌株DH5αに選択的に結合して濃縮する能力を評価した。図43は、2,000または4,700CFU/mlの初期細胞濃度で実施されたBigビード捕捉実験から入手した分画中のE.coliDH5αの分布を示す。これらの実験は、104または103CFU/mLで20mLの細菌懸濁液を使用して、0.1Mリン酸緩衝液、pH7.5、1mMのMgCl2中で実施した。このアッセイは、TSAプレート上における成長だった。低力価(2,000CFU/mL)では、>70%の細菌が、貫流する分画中で回収され、バックフラッシュした溶離液中では、1%未満が回収された。高力価(4,730CFU/mL)では、>80%の細菌が貫流する分画中で回収され、溶離液中では5%未満が回収された。したがって、25〜10%の細菌のみが、Bigビードマトリックスに結合した状態を保った。
マイクロ流体デバイスのマイクロ製造は、本質的に、Liu et等、2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(10):5369−5374に記載したように実施した。簡潔に述べるなら、Borofloatガラスウェハを洗浄し、アモルファスシリコンマスクを蒸着し、その後、HMDS層およびフォトレジスト層を接着した。フォトレジストは、マスクを通して紫外線でパターン化され、チャネルパターンは、一般的に、流体ウェハ上のチャネルの場合は40μmの深さまで、および多岐管ウェハの場合は、70μmの深さまで、高濃度HFで化学的にエッチングした。フォトレジストおよびアモルファスシリコンは剥離され、点検孔は、ダイアモンドドリルを有するCNC小型ミルを使用して穿孔した。これらの孔は、4層マイクロチップで反応および検出チャンバとして使用することができる。あるいは、超音波ドリルを使用して、すべての孔を同時に超音波穿孔する。洗浄後、流体用ウェハおよびバイアウエアを位置合わせして熱結合した。多岐管ウェハおよびPDMS膜を追加して、4層マイクロチップを形成した。
このバイオプロセッサモジュールは、上流のエアサンプル収集装置、または他の投入デバイスからサンプルを収容し、保存および再テストのための部分標本を作製し、サンプルを溶解し、サンプルを調製して標識し、単一分子蛍光相関検出器に排出して分析する。バイオプロセッサモジュールは、流体回路を含む使い捨てのプラスチックカートリッジ、およびカートリッジを作動させる機器を備える。
サンプル濃縮モジュール。マクロスケールで開始し、標的有機体の表面エピトープに対する抗体で変性された磁気ビードは、チャンバ内のミリリットル量の空気収集装置210の廃液(または他のマトリックスから生成されたスラリ)に添加される(図8)。ビードは、個々の有機体、サブタイプ、種などに特異的な抗体を塗布された一連のビードの混合物である。問い合わせる有機体の範囲は、試薬の混合物を追加して拡張することができる。ビードは標的有機体を捕捉し、不純物は、洗浄によって、つまり一次元の選択性および特異性を提供することによって除去される。標的有機体を含むビードは、SCPM211内の磁石によって収集される。
EXPARは、オリゴヌクレオチド配列、熱安定性ポリメラーゼ、および切断酵素を使用して、60℃でDNAの短い断片を特異的に増幅させるための高速等温法である。生成物は、蛍光またはMSによって検出される。EXPAR反応は、遺伝子テスト、遺伝子発現測定、分子診断学、生物兵器防衛およびその他の用途のためにNanoBioProcessorにインプリメントされる。
RiboMaker検出システムは、abscription(商標)と呼ばれるRNAポリメラーゼ(RNAP)転写の開始不全をベースとしており、人工プロモータ複合体(APS)、およびRiboLog(商標)と呼ばれるヌクレオチド類似体を使用する。APCは、50〜450個のトリヌクレオチド不全生成物/分/部位を生成するためにRNAPポリメラーゼのための開始部位を提供する。検出は、MS分析、蛍光、化学発光、または当業者が十分に周知している他の方法によって行うことができる。DNAまたはRNA分析では、APCは、標的部位プローブに特異性を提供するフランキング配列を有することができる。異なる質量単位を有するRiboLogは、どの部位が結合しているかを識別することができる。問い合わせる配列の異なる部分に複数のAPSを結合することによって、RiboLogのフィンガープリントは、生物兵器防衛に関する追加の特異性情報を提供することができ、擬陽性および擬警報を排除するのに役立つ可能性がある。タンパク質の場合、APCユニットは、抗体に結合させることができる。RiboMaker検出は、高速で線形であり、PCRと比べて、抑制に対して感受性が低いと主張される。
16チャネルマイクロチップ270の実施形態を図23に示す。バルブおよびポンプの作動ライン271は、垂直に延びており、外部作動ラインを接続可能なマイクロチップの底部上のバイアで終端するように示されている。サイクル配列決定混合物は、シリンジポンプによって左側のチャネル272に供給され、マイクロチップを再生させるための水または緩衝液は、右側のチャネル273に供給される。これらの「サービス」チャネルはともに、16チャネルすべてに供給するように多重化され、流れを制御するためにオンチップポンプまたはバルブ274をそれぞれ有する。このマイクロチップは、ガラス製ウェハおよびPDMS膜から4層デバイスとして構成される。
完全なMINDSシステムを作製するため、コアMINDSシステムからの機器を修正する:1)ビードサービスチャネルが追加され、個々のビードを送達するためのビード分類メソッドとインターフェースされる;2)マイクロチップインターフェースデバイス上の抵抗加熱器構造、および電極リングがマイクロチップに変更される;3)単一ビードが、装填およびと除去を確実に繰り返すように、マイクロチップを修正する。
4層マイクロチップを使用して、オンチップMOVデバイスによる混合を実証した。この混合の実証では、MBI−13マイクロチップ上に製造した3種類の構造、つまりボーラス混合、ルータ混合、および「T」混合を使用した。水およびブリリアントレッドの染料溶液を混合した。
Claims (20)
- 溶液を混合する方法であって、
a)マイクロ流体デバイスを提供する工程であって、該マイクロ流体デバイスは、
(i)第1ポンプおよび第1溶液を備える第1マイクロ流体チャネル;
(ii)第2の対向するポンプおよび第2溶液を備える第2マイクロ流体チャネル;および
(iii)第3マイクロ流体チャネル、
を備え、各ポンプが、入口バルブ、ポンプバルブおよび出口バルブを備え、そして該第1チャネル、第2チャネルおよび第3チャネルが、共通の接合点で交差する、工程;ならびに
b)ポンプ揚送サイクルを実施する工程であって、該ポンプ揚送サイクルが、
(i)該第1ポンプの入り口バルブおよび該第2ポンプの入口バルブを開き、かつ、該出口バルブを閉じる工程;
(ii)該第1ポンプのポンプバルブおよび該第2ポンプのポンプバルブを開く工程であって、該第1溶液および該第2溶液が該第1ポンプのポンプバルブおよび該第2ポンプのポンプバルブ内にポンプ揚送される、工程;
(iii)該第1ポンプの入り口バルブおよび該第2ポンプの入口バルブを閉じ、かつ、該第1ポンプの出口バルブおよび該第2ポンプの出口バルブを開く工程;および
(iv)該第1ポンプのポンプバルブおよび該第2ポンプのポンプバルブを閉じる工程であって、該第1ポンプのポンプバルブおよび該第2ポンプのポンプバルブ内の溶液が層流で該第3チャネル内にポンプ揚送され、該第1ポンプの出口バルブおよび該第2ポンプの出口バルブを開き、かつ、該第1ポンプのポンプバルブおよび該第2ポンプのポンプバルブを閉じることの結果、該溶液の前後運動が生じ、該溶液が混合される、工程、
を包含する、工程、
を包含する、方法。 - 前記構造体がマイクロチップ上に構成されている、請求項1に記載の方法。
- 前記第1チャネルが、前記第1溶液を保持するポートに接続され、そして前記第2チャネルが、前記第2溶液を保持するポートに接続される、請求項1に記載の方法。
- 前記第1流体が分析物を含み、そして前記第2流体が試薬を含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)を繰り返す工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記第3チャネルが蛇行領域を備える、請求項1に記載の方法。
- 前記マイクロ流体デバイスが、流体層、変形可能な膜層、および空気層を備え、該デバイス内の各バルブが、該流体層内のバルブシートに対して着座する変形可能な該膜層を備えて、該流体層内のマイクロ流体チャネル間の流体経路を閉じ、そして該空気層は、空気置換チャンバを備え、該空気置換チャンバは、該膜に対向し、そして真空源または圧力源に接続されており、そして該膜層への真空または圧力の適用が該変形可能な膜を変形させ、これによって該バルブを開閉させる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記空気置換チャンバが真空源に接続されており、そして前記膜層への真空の適用が、該変形可能な膜を変形させ、これにより前記バルブを開く、請求項7に記載の方法。
- 前記バルブが前記流体層に通路を備え、該通路は、前記マイクロ流体チャネルに流体接続されており、かつ、前記変形可能な膜層に対する開口部を有する、請求項7に記載の方法。
- 前記流体層および前記空気層がガラス製ウェハを備え、該ガラス製ウェハにチャネルがエッチングされる、請求項7に記載の方法。
- 溶液を混合する方法であって、
a)ルータを備えるマイクロ流体デバイスを提供する工程であって、該マイクロ流体デバイスは、
(i)第1バルブおよび第1流体を含む第1ポート備える第1マイクロ流体チャネル;
(ii)第2バルブおよび気体を含む第2ポートを備える第2マイクロ流体チャネル;
(iii)第3バルブおよび第2溶液を含む第3ポートを備える第3マイクロ流体チャネル;および
(iv)第4バルブを備える第4マイクロ流体チャネル、
(v)反応チャンバ
を備え、該第1チャネル、第2チャネル、第3チャネルおよび第4チャネルが、中心隔壁バルブに接続され、該第4チャネルが、該反応チャンバと接続している、工程;
b)
該第1溶液および第2溶液を該第1ポートおよび第3ポートから該反応チャンバ内にポンプ揚送し、そして、気体を該第2ポートから該反応チャンバ内にポンプ揚送することにより、空気によって分離されるボーラスを形成し、該溶液の混合は、複数のポンプ揚送工程の間の該第2チャネル内への2つの溶液の前後運動によって支援される、工程、
を包含する、方法。 - 前記マイクロ流体デバイスがマイクロチップ上に構成されている、請求項11に記載の方法。
- 前記第1溶液が分析物を含み、そして前記第2溶液が試薬を含む、請求項11に記載の方法。
- 工程(b)を繰り返す工程をさらに包含する、請求項11に記載の方法。
- 前記気体が空気である、請求項11に記載の方法。
- 前記マイクロ流体デバイスが、流体層、変形可能な膜層、および空気層を備え、該デバイス内の各バルブが、該流体層内のバルブシートに対して着座する変形可能な該膜層を備えて、該流体層内のマイクロ流体チャネル間の流体経路を閉じ、そして該空気層は、空気置換チャンバを備え、該空気置換チャンバは、該膜に対向し、そして真空源または圧力源に接続されており、そして該膜層への真空または圧力の適用が該変形可能な膜を変形させ、これによって該バルブを開閉させる、請求項11〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記空気置換チャンバが真空源に接続されており、そして前記膜層への真空の適用が、該変形可能な膜を変形させ、これにより前記バルブを開く、請求項16に記載の方法。
- 前記バルブが前記流体層に通路を備え、該通路は、前記マイクロ流体チャネルに流体接続されており、かつ、前記変形可能な膜層に対する開口部を有する、請求項16に記載の方法。
- 前記流体層および前記空気層がガラス製ウェハを備え、該ガラス製ウェハにチャネルがエッチングされる、請求項16に記載の方法。
- 前記工程b)は、
前記第1溶液および第2溶液を(1)前記第4チャネル内および前記第4バルブを通してポンプ揚送し、該第4バルブを通過する際に該第1溶液および第2溶液が混合され、そして(2)前記第2チャネル内へとポンプ揚送する工程;ならびに
前記気体および前記溶液を該第2チャネルからポンプ揚送する工程であって、該第1溶液および第2溶液がさらに混合されて、ボーラスの液体およびボーラスの気体を生じる、工程、
を包含する、請求項16に記載の方法。
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