DE112004002254T5 - Mikrofluidikvorrichtung - Google Patents

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DE112004002254T5
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Tomoyuki Morita
Akiko Miya
Akira Fukuda
Motohiko Nomi
Katsunori Ichiki
Manabu Tsujimura
Shunsuke Shimizu
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Ebara Corp
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Abstract

Eine Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung weist zumindest zwei Mikrokanäle zum Einleiten von Flüssigkeiten und einen Vermischungsmikrokanal auf, der mit zumindest zwei Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen verbunden ist, wobei die Flüssigkeiten von den entsprechenden Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen zu dem Vermischungsmikrokanal transportiert werden, wobei die Vorrichtung ferner Mittel zum Fördern der Vermischung der Flüssigkeiten aufweist, die in dem Vermischungsmikrokanal konvergieren.

Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Diese Erfindung bezieht sich auf eine Mikrofluidvorrichtung und eine miniaturisierte chemische Analysevorrichtung. Genauer gesagt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Flüssigkeitsmischungsvorrichtung und ein Flüssigkeitsvermischungsverfahren, um zu verursachen, dass geringe Mengen von zwei oder mehr Flüssigkeiten (die im Folgenden als „Reagenslösungen" bezeichnet werden können) in einem Mikrokanal konvergieren, wodurch sich die Flüssigkeiten mit hoher Effizienz vermischen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf einen Mikroreaktor etc. zum Erzeugen beispielsweise eines erwünschten Reaktorprodukts mit hoher Effizienz durch eine chemische Reaktion zwischen den in dem Mikrokanal vermischten Flüssigkeiten.
  • Ferner bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein chemisches Analysesystem zum Separieren und Analysieren eines Analyts durch Nutzung des Konzentrationsgradienten eines Denaturierungsmittels für den Analyt. Genauer gesagt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Denaturierungasgradienten Gelelektrophorese (DGGE = Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) zum Separieren von Doppelstrangnukleinsäuren (die im Folgenden einfach als „Nukleinsäuren" bezeichnet werden können) gemäß einer Differenz in der Basensequenz unter Verwendung des Konzentrationsgradienten eines Nukleinsäurendenaturierungsmittels, ein Verfahren zum Bilden eines Denaturierungsgradienten für einen derartigen Zweck und einer Mikrochipelektrophoresevorrichtung zum Ausführen einer derartigen DGGE in einem Mikrokanal.
  • Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Mikrochipelektrophoresevorrichtung etc. die effizient Puffer bzw. Pufferlösungen, die das Denaturierungsmittel enthalten, in einem Mikrokanal vermischen kann und auf diese Weise zweckmäßig für die DGGE ist.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Ein Beispiel einer chemischen Analysevorrichtung mit einer Mikrokanalstruktur ist eine Mikrochipelektrophoresevorrichtung. Im Folgenden wird der technische Hintergrund für die vorliegenden Erfindung beschrieben, wobei eine Mikrochipelektrophoresevorrichtung als ein Beispiel genommen wird.
  • Elektrophorese wird oft als ein Mittel zum Separieren, Reinigen oder Analysieren eines Biopolymers, wie beispielsweise einer Nukleinsäure oder Proteins verwendet. Die Elektrophorese ist dafür ausgelegt, ein Potential an ein Agarosegel, Polyacrylamid oder Ähnliches anzulegen oder einen Mikrokanal (kapillar) anzulegen, der mit einer Elektrolytlösung gefüllt wurde, um geladene Partikel darin zu bewegen und Partikel gemäß Unterschieden in der Mobilität zu trennen. Bei der Elektrophorese von Doppelstrangnukleinsäuren ist der Faktor, der die Mobilität beeinflusst nur ein Molekulargewicht (die Länge eines Moleküls). Auf diese Weise können sie basierend auf dem Unterschied in dem Molekulargewicht (Länge) getrennt werden.
  • Als ein Verfahren zum Separieren von Doppelstrangnukleinsäuren basierend auf einer Differenz in der Basensequenz ist die Denaturierungsgradienten Gelelektrophorese (DGGE) bekannt. Die DGGE wird beispielsweise beim Detektieren der Mutation einer Nukleinsäure verwendet, oder beim Detektieren von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNP = Single Nucleotide Polymorphism). In den letzten Jahren wurde die DGGE beispielsweise ebenfalls in der Strukturanalyse einer Mikrobengemeinschaft verwendet, die eine aktive Rolle bei der Behandlung organischen Abwassers und fester Abfälle spielt, wie beispielsweise dem Belebtschlammverfahren, und anaerober Digestionsverfahren, wie beispielsweise der Methanfermentation, oder bei der Bioremediation, die kontaminierte Erde und Grundwasser durch die Verwendung von Mikroorganismen reinigt und wiederherstellt. Bei der Strukturanalyse der Mikrobengemeinschaft wird das 16S rRNA Gen, das eine Sequenz ist, die sämtlichen Mikroorganismen gemein ist, oft genutzt. D.h. Nukleinsäuren werden aus einer Probe extrahiert, die eine zu analysierende Mikrobengemeinschaft enthält, und durch die DGGE getrennt bzw. separiert. Die durch die DGGE zu analysierende Probe ist ein Verstärkungsprodukt, das durch die Verwendung von Startern bzw. Startermolekülen für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR = Polymerase Chain Reaction) verstärkt wird, die einen Sequenzteil des allen Mikroorganismen eigenen 16S rRNA Gens verstärken kann. Durch die DGGE können Nukleinsäuren, die von den Hauptmikroorganismen stammen, die die Mikrobengemeinschaft bilden, auf dem Gel getrennt werden, und zwar basierend auf Unterschieden in der Basensequenz des 16S rRNA Gens. Zwischen einer Vielzahl von Bahnen des gleichen Gels können Nukleinsäuren, die bei der gleichen Trenn- bzw. Wanderungsstrecke gelegen sind, beurteilt werden, ob sie die gleiche Basensequenz besitzen, so dass Unterschiede in der Zusammensetzung der zu analysierenden Mikrobengemeinschaft analysiert werden können. Beispielsweise wird das 16S rRNA Gen eines bestimmten Mikroorganismus in ähnlicher Weise behandelt und elektrophoretisch in einer unterschiedlichen Bahn auf dem gleichen Gel behandelt. Durch den Vergleich des Orts ihres Nukleinsäurebands kann bestimmt werden, ob dieser Mikroorganismus in der Mikrobengemeinschaft von Interesse vorhanden ist.
  • Die DGGE besitzt die folgenden Nachteile: Da die Gelvorbereitung und Elektrophorese Zeit in Anspruch nimmt, ist sie nicht geeignet für eine Analyse mit hoher Durchsatzmenge (Hochgeschwindigkeitsmassenbehandlung). Da die Größe des Gels ungefähr 20cm × ungefähr 20cm × ungefähr 1 mm beträgt, ist eine große thermostatische Kammer erforderlich, was die gesamte Vorrichtung sehr groß dimensioniert macht. Die Auflösung ist verglichen mit der Mikrochipelektrophorese gering.
  • Beim Vorbereiten eines Denaturierungsgradientengels ist darüber hinaus ein komplizierter manueller Ablauf erforderlich und es ist schwierig, einen konstanten Denaturierungsgradienten des Gels vorzusehen. Auf diese Weise ist, wenn die Struktur der Mikrobengemeinschaft durch die DGGE analysiert wird, ein ordentlicher Vergleich der Daten zwischen unterschiedlichen Gels schwierig.
  • In den frühen 1990ern stellte Manz das Konzept einer miniaturisierten chemischen Analysevorrichtung vor, die sämtliche für die chemische Analyse und die biochemische Analyse notwendigen Faktoren auf einem Chip enthält, dem sogenannten Mikrototalanalysensystem (μTAS = micro Total Analysis System). Seither wurden unterschiedliche Typen von μTASs entwickelt.
  • Bei der Mikrochip-Elektrophorese, die zu dem Gebiet der μTAS gehört, wird ein Mikrochip verwendet, der ein Substrat mit durch eine Mikrostrukturherstellungstechnologie darauf gebildeten Mikrokanälen mit einer Breite und Tiefe in der Größenordnung von 10 bis 100 μm aufweist, sowie ein weiteres Substrat, das auf das Substrat gebondet ist. Im Allgemeinen wird dieser Mikrochip bei der Messung des Molekulargewichts von DNA oder RNA verwendet. Bei der Messung des Molekulargewichts von DNA oder RNA werden die Oberflächen der Kanäle chemisch modifiziert, um eine elektroosmotische Strömung zu unterdrücken und in diesem Zustand wird eine Lösung einer polymeren Matrix, wie beispielsweise eines Linearpolyacrylamids oder Hydrxymethylcellulose in die Kanäle gefüllt, um die DNA oder RNA zu trennen. Die herkömmliche Agarosegelelektrophorese erfordert eine Wanderungszeit von 30 Minuten bis 1 Stunde. Eine Mikrochipelektrophoresevorrichtung ist andererseits dadurch vorteilhaft, dass die Wanderung in 10 Minuten oder weniger vollendet wird, wodurch die Analysezeit verkürzt wird, und dass die Mengen einer Probe und einer verbrauchten Reagens gering sind.
  • Mit dem Ziel eine Mikrochipelektrophoresevorrichtung weiter in ein μTAS umzuwandeln, schlägt Ramsey (Inländische Patentveröffentlichung (Japanische Übersetzung der PCT-Anmeldung) Nr. 1998-507516; Patentdokument 1) ein Mikrochiplaborgerät zum Analysieren oder Synthetisieren einer chemischen Substanz vor. Dieses Mikrochiplaborgerät ist durch simultanes Steuern der Potentiale einer Vielzahl von Reservoiren bzw. Speichern gekennzeichnet, um eine Versuchssubstanz von einem mit der Versuchssubstanz gefüllten Speicher zu einem anderen Speicher zu transportieren. In dieser Vorrichtung werden die Doppelstrangnukleinsäuren jedoch lediglich basierend auf einer Differenz im Molekulargewicht getrennt, und Doppelstrangnukleinsäuren werden nicht basierend auf einem Unterschied in der Basensequenz getrennt.
  • Knapp (Inländische Patentanmeldung Nr. 2001-521622; Patentdokument 2) schlägt ein Verfahren zur Analyse von Nukleinsäure und ein Verfahren zu Analyse des Schmelzpunkts von Nukleinsäure in einer Mikrofluid- bzw. Mikrofluidikvorrichtung vor. In diesen Verfahren wird eine Mutation einer Nukleinsäuresequenz durch die Verwendung eines chemischen Denaturierungsmittelkonzentrationsgradienten und einer Oligonukleotidsonde detektiert. Es ist jedoch notwendig, eine Oligonukleotidsonde eindeutig bzw. einzigartig für eine vorgesehene Nukleinsäureprobe aufzubauen. Auf diese Weise kann nur eine Mutation einer bekannten Basensequenz detektiert werden, und eine Mutation einer unbekannten Basensequenz kann nicht detektiert werden.
  • Bek (Japanische Patentabmeldungsoffenlegung Nr. 1996-261986; Patentdokument 3) schlägt ein Flüssigkeitsmischungsverfahren und eine Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung vor, die eine elektroosmotische Strömung auf einem Mikrochip verwendet. In diesem Dokument sind nur das Verfahren und die Vorrichtung zur Flüssigkeitsvermischung auf dem Mikrochip vorgesehen, und es gibt keine Erwähnung eines Denaturierungsmittelkonzentrationsgradienten oder einer Trennung von Doppelstrangnukleinsäuren.
  • Righetti (Inländische Patentveröffentlichung Nr. 1998-502738; Patentdokument 4) sieht ein Verfahren zum Detektieren einer Punktmutation in einem Doppelstrangnukleinsäurefragment durch die Verwendung eines viskosen Polymers auf einem Mikrochip vor. Es wird jedoch ein zeitlicher Temperaturgradient genutzt, und ein speziell zugeschnittenes Computerprogramm für die Temperatursteuerung ist separat erforderlich.
  • Baba (Japanische Patentanmeldungsoffenlegung Nr. 2003-66003; Patentdokument 5) schlägt eine Mikrochipelektrophoresevorrichtung vor, in der eine wasserlösliche Polymerlösung in Mikrokanäle als ein Laufpuffer mit einem Konzentrationsgradienten gefüllt wird. Was jedoch auf einem Mikrochip gebildet wird, ist der Konzentrationsgradient des wasserlöslichen Polymers. Auf diese Weise kann die Messung des Molekulargewichts der Nukleinsäuren vorgenommen werden, aber Doppelstrangnukleinsäuren können nicht basierend auf einem Unter schied in der Basensequenz getrennt werden. Die Bildung eines Polymerkonzentrationsgradienten umfasst insbesondere die komplizierte Aufgabe des sequentiellen Befüllens von Pufferlösungen mit unterschiedlichen Polymerkonzentrationen.
  • Wie oben beschrieben besitzt die herkömmliche DGGE Nachteile, wie beispielsweise einen komplizierten experimentellen Ablauf, eine lange Analysezeit, Unangemessenheit für die Analyse eines hohen Durchlasses, Notwendigkeit einer großen Vorrichtung, sowie eine geringe Auflösung verglichen mit der kapillaren Elektrophorese. Ein weiterer Nachteil ist, dass der Vergleich von Daten zwischen unterschiedlichen Gels beim Analysieren einer Mikrobengemeinschaftsstruktur durch die DGGE schwierig ist. Darüber hinaus betreffen bisher vorgeschlagene μTAS, einschließlich der Mikrochipelektrophoresevorrichtungen, die Messung des Molekulargewichts der Nukleinsäuren oder erfordern separat ein speziell zugeschnittenes Computerprogramm zur Temperatursteuerung etc. oder benötigen das vorherige Aufbauen einer Oligonucleotidsonde zur Detektion einer bestimmten Basensequenz und können keine unbekannten Doppelstrangnukleinsäurefragmente basierend auf einem Unterschied in der Basensequenz trennen.
    • Patentdokument 1: Inländische Patentveröffentlichung Nr. 1998-507516
    • Patentdokument 2: Inländische Patentveröffentlichung Nr. 2001-521622
    • Patentdokument 3: Japanische Patentanmeldungsoffenlegung Nr. 1996-261986
    • Patentdokument 4: Inländische Patentveröffentlichung Nr. 1998-502738
    • Patentdokument 5: Japanische Patentanmeldungsoffenlegung Nr. 2003-66003
    • Patentdokument 6: Japanische Patentanmeldungsoffenlegung Nr. 2001-120971
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • DURCH DIE ERFINDUNG ZU LÖSENDES PROBLEM
  • Das Problem der Schwierigkeit beim Vermischen ist ein allgemeines Problem das nicht nur bei der Mikrochipelektrophorese auftritt, sondern auch beim Vermischen einer Vielzahl von Flüssigkeiten in einem Mikrokanal. Wie zuvor dis kutiert, ist, wenn die Breite und Tiefe des Kanals klein ist, eine Reynoldszahl sehr niedrig, die für die Fließeigenschaften innerhalb des Kanals relevant ist. Wenn die Reynoldszahl 100 oder weniger beträgt, neigt die Strömung in dem Kanal dazu, eine stabile Laminarströmung zu werden, und die Wirbeldiffusion zwischen den Flüssigkeiten, die zusammengelaufen sind, neigt dazu, minimal zwischen den Flüssigkeiten aufzutreten, die zusammengelaufen sind. Auf diese Weise vermischen sich die Flüssigkeiten im Wesentlichen nur bei molekularer Diffusion beim Grenzbereich, und dies behindert eine unverzügliche Vermischung. Insbesondere wenn die Strömungsgeschwindigkeit innerhalb des Kanals gering ist, ist diese Tendenz bemerkbar. Das obige Problem war ein Faktor für die Verhinderung der Vereinfachung des experimentellen Ablaufs, der Verkürzung der Analyse- und Reaktionszeiten, des hohen Durchlasses, der Mikrochipverkleinerung und der hohen Genauigkeit (z.B. der hohen Auflösung) in Mikrochipvorrichtungen als Ganzes, wie beispielsweise analytischen Mikrochips und Mikroreaktoren.
  • Die Verlängerung der Kanäle ist eine Lösung für das oben beschriebene Problem. Beispielsweise ist es in einer Struktur, in der zwei Mikrokanäle zur Einleitung von Flüssigkeiten mit einem Vermischungsmikrokanal verbunden sind, um zwei Flüssigkeiten in einfacher Weise zu vermischen (1 oder 29), vorstellbar, den Vermischungsmikrokanal zu verlängern, um eine ausreichende Vermischung durchzuführen (2 oder 29). In diesem Fall nimmt jedoch der Vermischungsmikrokanal einen großen Bereich in Anspruch, wodurch die Mängel auftreten, dass die Verkleinerung der Vorrichtung schwierig ist, und dass das Durchqueren des Kanals für die Flüssigkeiten Zeit in Anspruch nimmt, wodurch die Analyse- und die Reaktionszeit verlängert wird.
  • Als eine weitere Lösung schlagen Abe et al. eine Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung vor, in der sich ein Kanal von einem Speicher verzweigt, und die verzweigten Kanäle miteinander verbunden sind, um die Vermischung der Flüssigkeiten zu ermöglichen (Japanische Patentanmeldungsoffenlegung Nr. 2001-120971; Patentdokument 6). Gemäß dieses Verfahrens werden jedoch die voranfließende Flüssigkeit und die hinterherfließende Flüssigkeit vermischt. Dies macht es unmöglich, eine quantitative Konzentrationssteuerung in der Art vozu nehmen, dass ein Konzentrationsgefälle bzw. -gradient in der Strömungsrichtung gebildet wird.
    • (1) Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung und ein Flüssigkeitsvermischungsverfahren vorzusehen, welche umgehend winzige Mikromengen an Flüssigkeiten vermischen können, und die eine quantitative Konzentrationssteuerung zulassen.
    • (2) Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, einen analytischen Mikrochip (beispielsweise eine Mikrochipelektrophoresevorrichtung) und einen Mikroreaktor vorzusehen, auf die eine Reihe von Flüssigkeitsvermischungstechniken angewendet wurden, die durch den Erfinder entwickelt wurden, um die Vereinfachung eines experimentellen Ablaufs auf einer Mikroebene, die Verkürzung der Analyse- und Reaktionszeit, einen hohen Durchlass, die Verkleinerung des Mikrochips und eine hohe Genauigkeit (beispielsweise eine hohe Auflösung) zu bewerkstelligen.
  • Wie zuvor erwähnt, werfen herkömmliche DGGE Probleme auf, wie einen komplizierten experimentellen Ablauf, eine lange Analysezeit, eine Unangemessenheit für die Analyse bei hohem Durchlass, die Notwendigkeit einer großen Vorrichtung und eine geringe Auflösung verglichen mit Analysen, die auf einer Mikroebene vorgenommen werden.
    • (3) Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine Mikrochipelektrophoresevorrichtung und ein Elektrophoreseverfahren zum Durchführen einer DGGE auf einem Mikrochip vorzusehen.
  • Um eine DGGE auf einem Mikrochip auszuführen, ist es notwendig, eine Vielzahl von Pufferlösungen zu vermischen, die ein Denaturierungsmittel bei unterschiedlichen Konzentrationen auf einer Mikroebene aufweisen. Beispielsweise ist es notwendig, eine Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung und eine Denaturierungsmittel freie Pufferlösung in einen Mikrokanal einzuleiten, während ihr Mischungsverhältnis kontinuierlich variiert wird, um einen Denaturierungsgra dienten zu bilden. Um einen nützlichen Mikrochip für die DGGE vorzusehen, ist es wichtig, einen präzisen, im höchsten Maße reproduzierbaren Denaturierungsgradienten zu bilden.
  • Wie jedoch zuvor erwähnt, besteht das Problem, dass sich Flüssigkeiten minimal innerhalb eines Mikrokanals vermischen. Zwei Pufferlösungen unterschiedlicher Konzentrationen, die in dem Mikrokanal konvergieren, neigen dazu, eine Laminarströmung zu bilden, ohne sich zu vermischen. Auf diese Weise nimmt es Zeit in Anspruch, einen Konzentrationsgradienten zu erhalten, der in der Breitenrichtung des Kanals gleichmäßig ist, was zu einer Verhinderung für die Verkürzung der Analysezeit führt. Wenn die Vermischung über eine übermäßig lange Zeit hinweg durch die Verwendung eines langen Kanals durchgeführt wird, wie in 2 gezeigt, ist es schwierig, einen vorbestimmten Konzentrationsgradienten unverzüglich zu erhalten. Bei dem in 3 gezeigten Vermischungsverfahren (das in der japanischen Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 2001-120972 beschriebene Verfahren) werden eine Flüssigkeit, die voran strömt, und eine Flüssigkeit, die hinterher strömt, bei einer Vielzahl von Stellen vermischt, so dass eine für die DGGE erforderlicher akkurater Konzentrationsgradient schwierig zu bilden ist. Das herkömmliche Vermischungsverfahren kann, wie hier erwähnt, das Erfordernis nicht erfüllen, dass ein auf der Mikroebene erforderlicher Konzentrationsgradient akkurat gebildet wird. Mit dem herkömmlichen Verfahren ist es außerdem schwierig, die Bildung des Konzentrationsgradienten präzise und frei zu steuern.
    • (4) Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine Mikrochipelektrophoresevorrichtung und ein Elektrophoreseverfahren vorzusehen, die es ermöglichen, dass eine Vielzahl von Pufferlösungen, die ein Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, unverzüglich in einem Mikrokanal vermischt werden, und zwar besonders gleichmäßig in der Breitenrichtung des Kanals, wobei ein für die DGGE nützlicher Denaturierungsgradient gebildet werden kann.
    • (5) Und noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine Mikrochipelektrophoresevorrichtung und ein Elektrophoreseverfahren vorzusehen, die ins besondere für die DGGE nützlich sind, und zwar durch Anwenden einer Reihe von Techniken zur Förderung der Flüssigkeitsvermischung, die durch den Erfinder entwickelt wurden, um Pufferlösungen auf der Mikroebene zu vermischen.
  • MITTEL ZUR LÖSUNG DER PROBLEME
  • [Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung und Flüssigkeitsvermischungsverfahren]
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich für das Erreichen der Ziele (1) und (2) auf eine Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung, die zumindest zwei Mikrokanäle zum Einleiten von Flüssigkeiten aufweist, sowie einen Vermischungsmikrokanal, der mit den zumindest zwei flüssigkeitseinleitenden Mikrokanälen verbunden ist, wobei die Flüssigkeiten von den jeweiligen flüssigkeitseinleitenden Mikrokanälen zu dem Vermischungsmikrokanal transportiert werden, wobei die Vorrichtung ferner Mittel zur Förderung bzw. Verbesserung der Vermischung der Flüssigkeiten aufweist, die in dem Vermischungsmikrokanal konvergieren.
  • Bevorzugte Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung umfassen ein erstes Ausführungsbeispiel (Ausführungsbeispiel 1-1, Ausführungsbeispiel 1-2, Ausführungsbeispiel 1-3, Ausführungsbeispiel 1-4), in dem das Vermischungsförderungsmittel ein Mittel zum Erhöhen des Bereichs der Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten ist, sowie ein zweites Ausführungsbeispiel (Ausführungsbeispiel 2-1, Ausführungsbeispiel 2-2, und Ausführungsbeispiel 2-3), in dem das Vermischungsförderungsmittel ein Mittel ist, um die Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten instabil zu machen.
  • Ausführungsbeispiel 1-1
  • Ausführungsbeispiel 1-1 der vorliegenden Erfindung besitzt als das Vermischungsförderungsmittel einen Mechanismus zum Steuern der Strömungsraten (Strömungsgeschwindigkeiten) der Flüssigkeiten, um die Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten zu erhöhen, die in dem Vermischungskanal konvergieren.
  • Das Vermischungsförderungsmittel der Vorrichtung gemäß dem Ausführungsbeispiel 1-1 weist ein oder mehrere Flüssigkeit einleitende Mittel auf, durch die die Strömungsrate der in einen Flüssigkeit einleitenden Mikrokanal eingeleiteten Flüssigkeit steuert, und zwar unabhängig von der Strömungsrate der Flüssigkeit, die in einen anderen Flüssigkeit einleitenden Mikrokanal eingeleitet wird.
  • In einem Beispiel des Ausführungsbeispiels 1-1 ist das Vermischungsförderungsmittel vorzugsweise derart, dass das Flüssigkeit einleitende Mittel eine Pumpe ist, die in der Lage ist, eine niedrige Fördermenge zu steuern, ein Ventil auf zumindest einem der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle vorgesehen ist, oder eine Kombination aus der Pumpe und dem Ventil.
  • In einem weiteren Beispiel des Ausführungsbeispiels 1-1 weist das Flüssigkeit einleitende Mittel eine erste Elektrode, die bei jedem der Einlässe der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle vorgesehen ist, und eine zweite Elektrode auf, die bei dem Auslass des Vermischungsmikrokanals vorgesehen ist, und eine elektroosmotische Strömung wird in jedem der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle durch Anlegen der Spannung zwischen den ersten und zweiten Elektroden erzeugt.
  • Ein Beispiel des Flüssigkeitsvermischungsverfahrens, das in dem Ausführungsbeispiel 1-1 verwendet wird, umfasst den Schritt des Einleitens von zwei oder mehr Flüssigkeiten durch zwei oder mehr Flüssigkeit einleitende Mikrokanäle zu den Flüssigkeiten in einem Vermischungsmikrokanal, wo die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle bei dem gleichen Punkt konvergieren (einer gemeinsamen Stelle), und den Schritt, durch den die Strömungsrate der Flüssigkeit, die von einem der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle eingeleitet wird, unterschiedlich gemacht wird zu der Strömungsrate der Flüssigkeit, die von einem anderen Flüssigkeit einleitenden Mikrokanal eingeleitet wird, wodurch der Bereich der Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten, die in dem Vermischungsmikrokanal konvergieren, erhöht wird.
  • Ein weiteres Beispiel des in dem Ausführungsbeispiel 1-1 verwendeten Flüssigkeitsvermischungsverfahrens umfasst das Steuern der Strömungsraten der Flüssigkeiten, die in die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle eingeleitet wird, durch Pumpen, das Steuern der Strömungsraten der Flüssigkeiten durch Ventile, die auf den Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen vorgesehen sind, und das Steuern der Strömungsraten der Flüssigkeiten durch Kombinationen von diesen.
  • Noch ein weiteres Beispiel des in dem Ausführungsbeispiel 1-1 verwendeten Flüssigkeitsvermischungsverfahrens umfasst den Schritt des Einleitens der Flüssigkeiten in den Vermischungsmikrokanal durch eine elektroosmotische Strömung, die durch Anlegen eine Spannung zwischen einer ersten Elektrode, die bei jedem der Einlässe der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle vorgesehen ist, und einer zweiten Elektrode, die bei dem Auslass des Vermischungsmikrokanals vorgesehen ist, erzeugt wird, und den Schritt durch den das angelegte Potential gemäß jedem der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle variiert wird, wodurch die Strömungsrate der Flüssigkeit, die von jedem der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle eingeleitet wird, unabhängig gesteuert wird.
  • Ausführungsbeispiel 1-2
  • Ausführungsbeispiel 1-2 der vorliegenden Erfindung besitzt als Vermischungsförderungsmittel ein schnell arbeitendes Ventil, das auf zumindest einem einer Vielzahl von Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen vorgesehen ist.
  • In einem Beispiel des Ausführungsbeispiel 1-2 nutzt das Antriebsmittel des schnell arbeitenden Ventils einen piezoelektrischen Effekt. In einem anderen Beispiel des Ausführungsbeispiels 1-2 ist das schnell arbeitende Ventil derart, dass der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanal lokal erhitzt wird, um das Volumen der Flüssigkeit in dem Flüssigkeit einleitenden Mikrokanal zu expandieren, wodurch der Ausstoß einer sehr geringen Menge an Flüssigkeit in den Flüssigkeitvermischungsmikrokanal mit einer sehr hohen Geschwindigkeit gesteuert werden kann. In noch einem weiteren Beispiel des Ausführungsbeispiels 1-2 ist das schnell arbeitende Ventil ein Mittel zum Antreiben eines Ventilelements, das imstande ist, eine Mikrozwischenraum innerhalb des Flüssigkeit einleitenden Mikrokanal zu öffnen und zu schließen.
  • Ein Beispiel des in dem Ausführungsbeispiel 1-2 verwendeten Flüssigkeitsvermischungsverfahrens umfasst den Schritt des Einleitens von Flüssigkeiten von zwei oder mehr Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen, die mit einem Vermischungsmikrokanal verbunden sind, und des Ermöglichens, dass zwei oder mehr Flüssigkeiten in dem Vermischungsmikrokanal konvergieren, und den Schritt durch den ein schnell arbeitendes Ventil, das auf zumindest irgendeinem einer Vielzahl von Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen vorgesehen ist, mit einer hohen Geschwindigkeit geöffnet und geschlossen wird, um die Strömungsrate der eingeleiteten Flüssigkeit zu variieren.
  • Ein weiteres Beispiel des in dem Ausführungsbeispiel 1-2 verwendeten Flüssigkeitsvermischungsverfahrens umfasst den Schritt des Öffnens und Schließens des schnell arbeitenden Ventils mit einer hohen Geschwindigkeit, um die Strömungsrate der eingeleiteten Flüssigkeit mit kurzen Zeitintervallen zu variieren, so dass das Verhältnis (Volumenverhältnis) der Flüssigkeiten, die das Innere des Vermischungsmikrokanals ausmachen, kontinuierlich oder unterbrochen in Richtung der Kanalbreite verändert wird, wodurch der Bereich der Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten erhöht wird.
  • Noch ein weiteres Beispiel des in dem Ausführungsbeispiel 1-2 verwendeten Flüssigkeitsvermischungsverfahrens umfasst einen Schritt, durch den der Öffnungs- und Schließzyklus des schnell arbeitenden Ventils konstant gemacht wird, und das Verhältnis der Ventilöffnungszeit zu einem Öffnungs- und Schließzyklus (d.h. die relative Einschaltdauer) variabel gemacht wird. Dieses Flüssigkeitsvermischungsverfahren umfasst den Schritt des Vorsehens des schnell arbeitenden Ventils auf zumindest zwei der Vielzahl von Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen, sowie des synchronen Öffnens und Schließens der Vielzahl von schnell arbeitenden Ventilen. Ein weiteres Beispiel dieses Flüssigkeitsvermischungsverfahrens umfasst den Schritt des synchronen Öffnens und Schließens der Vielzahl von schnell arbeitenden Ventilen, und zwar derart, dass die Gesamtströmungsrate der Flüssigkeiten, die in dem Vermischungsmikrokanal strömen, konstant wird.
  • Die Flüssigkeitsvermischungsvorrichtungen der Ausführungsbeispiele 1-1 und 1-2 können auf einen Mikrochip angewendet werden, und können vorzugsweise auf eine Mikrochipelektrophoresevorrichtung angewendet werden, die ferner einen Probenemlass besitzt, durch den ein Analyt in den Vermischungsmikrokanal eingeleitet werden kann.
  • In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist der Strömungsratensteuermechanismus, der in der Mikrochipelektrophoresevorrichtung verwendet wird, nicht nur für die Förderung des Vermischens nützlich, sondern auch für das Bilden eines Denaturierungsgradienten zum Separieren des Analyts. Durch Verwenden des obigen Steuermechanismus (beispielsweise kann das Ausführungsbeispiel 1-1, das Ausführungsbeispiel 1-2, oder eine Kombination von diesen verwendet werden) zum Steuern der Strömungsraten einer Vielzahl von eingeleiteten Flüssigkeiten (beispielsweise Flüssigkeiten, die ein Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten) können bestimmte Flüssigkeiten, die in dem Vermischungsmikrokanal konvergieren, oder eine Konzentrationsverteilung eines Reagens in den konvergierenden Flüssigkeiten (z.B. eine Konzentrationsverteilung des Denaturierungsmittels) in der Strömungsrichtung gebildet werden.
  • Ausführungsbeispiel 1-3
  • Das Ausführungsbeispiel 1-3 der vorliegenden Erfindung besitzt als Vermischungsförderungsmittel ein Vermischungsabteil bzw. -kammer in zumindest einem Teil des Vermischungsmikrokanals, wobei das Vermischungsabteil eine Höhe besitzt, die geringer als seine Breite ist.
  • In einem Beispiel des Ausführungsbeispiels 1-3 sind eine Vielzahl von Mikrokanälen zum Einleiten der zu vermischenden Flüssigkeiten mit dem Vermischungsabschnitt derart verbunden, damit die über- oder untereinander angeordneten Mikrokanäle konvergieren.
  • Ein weiteres Beispiel des Ausführungsbeispiels 1-3 besitzt einen Vorvermischungsmikrokanal, der stromaufwärts des Vermischungsabschnitts gebildet ist, wobei die Vielzahl von Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen in den Vorvermischungsmikrokanal zusammenläuft.
  • Ein Beispiel des in dem Ausführungsbeispiel 1-3 verwendeten Flüssigkeitsvermischungsverfahrens umfasst einen Schritt, in dem die zu vermischenden Flüssigkeiten durch die Vielzahl von Mikrokanälen eingeleitet wird, und die eingeleiteten Flüssigkeiten konvergiert und in das Vermischungsabteil eingeleitet werden, wobei der Schritt der Schritt des Einleitens der konvergierenden Flüssigkeiten in den Vermischungsabschnitt ist, der eine Höhe besitzt, die geringer als sein Breite ist.
  • Ein weiteres Beispiel des in dem Ausführungsbeispiel 1-3 verwendeten Flüssigkeitsvermischungsverfahrens umfasst einen Schritt, in dem die in die Mikrokanäle eingeleiteten Flüssigkeiten veranlasst werden zusammenzulaufen, um über- oder untereinander platziert zu werden.
  • Noch ein weiteres Beispiel des in dem Ausführungsbeispiel 1-3 verwendeten Flüssigkeitsvermischungsverfahrens umfasst einen Schritt, in dem die in die Mikrokanäle eingeleiteten Flüssigkeiten konvergieren und dann in einen Vorvermischungsmikrokanal eingeleitet und dann in das Vermischungsabteil eingeleitet werden.
  • Ausführungsbeispiel 1-4
  • Ausführungsbeispiel 1-4 der vorliegenden Erfindung besitzt als Vermischungsförderungsmittel einen Vermischungsabschnitt, wo eine Vielzahl von Verzweigungen, die von jedem der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle wegführen, dreidimensional mit dem Vermischungsmikrokanal in einer solchen Art und Weise verbunden sind, dass eine Vielzahl von Verzweigungen abwechselnd zu einander verteilt sind.
  • Ein Beispiel des Ausführungsbeispiels 1-4 besitzt eine Schichtstruktur, die durch eine Vielzahl von zusammenlaminierten Substraten gebildet wird, in der die Vielzahl von Substraten ungefähr in der Zusammenlaufrichtung oder ungefähr in der Verzweigungsrichtung der Zweige gestapelt werden. Vorzugsweise besitzt der Vermischungsabschnitt eine kurvenförmige Form.
  • Ein Beispiel eines Herstellungsverfahrens für die Vorrichtung des Ausführungsbeispiels 1-4 umfasst den Schritt der Herstellung der Kanäle bei dem Vermischungsabschnitt durch Verwendung einer Photolithographietechnologie. Ein weiteres Beispiel des Herstellungsverfahrens kann aus der Verarbeitung der Abschnittsform des Kanals bei dem Vermischungsabschnitt in eine kurvenförmige Form bestehen.
  • Ein weiteres Beispiel des Ausführungsbeispiels 1-4 ist eine Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung, die eine Gruppe von Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen mit einer Vielzahl von Flüssigkeitseinlässen zum Einleiten von Flüssigkeiten, und einen Vermischungsmikrokanal aufweist, der mit diesen Kanälen verbunden ist, und wobei die Vielzahl von Flüssigkeitseinlässen geometrisch angeordnet ist (in einer geometrischen Anordnung vorgesehen ist). Ein Beispiel der geometrischen Anordnung ist eine geradlinige Form, eine bogenförmige Form, oder eine elliptische Form.
  • In einem Beispiel des Ausführungsbeispiels 1-4 mit der Vielzahl von Flüssigkeitseinlässen, sammeln sich die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle, von denen jeder eine Breite besitzt, die geringer ist als die Breite des Vermischungsmikrokanals, um den Vermischungsmikrokanal zu bilden. Ein weiteres Beispiel dieses Ausführungsbeispiels ist eine Vorrichtung zum Antreiben von zumindest einigen der Flüssigkeiten durch eine elektroosmotische Strömung, wobei die Vorrichtung verzweigte Antriebselektroden besitzt, die lösbar an dieser in Übereinstimmung mit der geometrischen Anordnung der Vielzahl von Flüssigkeitseinlässen angebracht sind. Noch ein weiteres Beispiel dieses Ausführungsbeispiels ist eine Vorrichtung zum Antreiben von zumindest einigen der Flüssigkeiten durch einen Pumpendruck, wobei die Vorrichtung verzweigte Flüssigkeit einleitende Kanäle aufweist, die lösbar mit der Vielzahl von Flüssigkeitseinlässen verbunden sind, die dreidimensional angeordnet sind.
  • In einem weiteren Beispiel dieses Ausführungsbeispiels 1-4 mit der Vielzahl von Flüssigkeitseinlässen, sind Elektroden, die auf nahezu den gleichen Ebenen wie die Vielzahl von Flüssigkeitseinlässen angeordnet sind, für die Vielzahl von Flüssigkeitseinlässen vorgesehen. In noch einem Beispiel dieses Ausführungsbeispiels ist ein Steuerungsmittel, das imstande ist, den Pumpendruck und/oder die elektroosmotische Strömung unabhängig zu steuern, für jeden der Gruppe von Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen vorhanden. In einem weiteren Beispiel dieses Ausführungsbeispiels steuert das Steuerungsmittel die Anzahl der Kanäle durch die die Flüssigkeitseinspeisung ausgeführt wird, und zwar zwischen den Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen, die die gleiche darin eingeleitete Flüssigkeit aufnehmen, wodurch die Gesamteinströmungsmenge der gleichen Flüssigkeit in den Vermischungsmikrokanal verändert werden kann. In noch einem weiteren Beispiel dieses Ausführungsbeispiels kann das Steuerungsmitel die Steuerung der Ventile für die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle ausführen, durch die die gleiche Flüssigkeit eingeleitet wird. In einem weiteren Beispiel des Ausführungsbeispiels 1-4 mit dem Steuerungsmittel ist eine kleinere Anzahl von Druckpumpen oder elektroosmotische Strömungsantriebsmechanismen als die Anzahl der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle für die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle vorgesehen, durch die die gleiche Flüssigkeit eingeleitet wird, wobei die Pumpen und Antriebsmechanismen stromaufwärts von diesen Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen vorgesehen sind.
  • In einem Beispiel des Ausführungsbeispiels 1-4 mit den bei den Flüssigkeitseinlässen vorgesehenen Antriebselektroden, kann das Steuerungsmittel unabhängig eine An-Aus-Steuerung auf dem Weg von der Antriebskraft zu den Elektroden für die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle ausüben. In einem weiteren Beispiel dieses Ausführungsbeispiels umfasst der elektroosmotische Strömungsantriebsmechanismus Schalter und Relais zum An- und Abschalten der Leistung an die Elektroden.
  • Ausführungsbeispiel 2-1
  • Ausführungsbeispiel 2-1 der vorliegenden Erfindung besitzt als Vermischungsförderungsmittel eine Erwärmungsvorrichtung zum Erwärmen der Flüssigkeiten innerhalb der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle und/oder des Vermischungsmikrokanals.
  • In einem Beispiel des Ausführungsbeispiels 2-1 ist das Vermischungsförderungsmittel eine Erwärmungsvorrichtung zum Erwärmen der Flüssigkeiten innerhalb des Vermischungsmikrokanals von der Unterseite des Vermischungsmikrokanals aus.
  • Ein weiteres Beispiel des Ausführungsbeispiels 2-1 umfasst zumindest eine Erwärmungsvorrichtung zum Erwärmen von zumindest einem einer Vielzahl von Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen, und die Vielzahl von Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen ist mit dem Vermischungsmikrokanal derart verbunden, dass die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle von unten aus in einer vertikalen Richtung in einer Sequenz gestapelt sind, in der ihre Temperaturen beim Erwärmen durch die Erwärmungsvorrichtung zunehmen.
  • Ein Beispiel des Flüssigkeitsvermischungsverfahrens, das in dem Ausführungsbeispiel 2-1 verwendet wird, umfasst einen Schritt, in dem eine Vielzahl von zu vermischenden Flüssigkeiten durch eine Vielzahl von Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen eingeleitet wird, und die Vielzahl der Flüssigkeiten werden zusammengeführt und in einen Vermischungsmikrokanal eingeleitet, wobei der Schritt ein Schritt des Erwärmens der Flüssigkeiten innerhalb der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle und/oder des Vermischungsmikrokanals durch eine Erwärmungsvorrichtung ist. Ein weiteres Beispiel des Flüssigkeitsvermischungsverfahrens umfasst einen Schritt, in dem eine Vielzahl von Flüssigkeiten zusammengeführt, eine Flüssigkeit über oder unter die andere gesetzt und in einen Vermischungsmikrokanal eingeleitet wird. Noch ein weiteres Beispiel des Flüssigkeitsvermischungsverfahrens umfasst den Schritt des Erwärmens von Flüssigkeiten innerhalb des Vermischungsmikrokanals durch eine Erwärmungsvorrichtung. Noch ein weiteres Beispiel des Flüssigkeitsvermischungsverfahrens umfasst den Schritt des Erwär mens der Flüssigkeiten innerhalb des Vermischungsmikrokanals von unten durch eine Erwärmungsvorrichtung.
  • Ein weiteres Beispiel des in dem Ausführungsbeispiel 2-1 verwendeten Flüssigkeitsvermischungsverfahrens umfasst den Schritt des Erwärmens der Flüssigkeit innerhalb zumindest eines einer Vielzahl von Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen, und des Einleitens der Flüssigkeiten innerhalb der Vielzahl von Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen in den Vermischungsmikrokanal, und zwar derart, dass die Flüssigkeiten gestapelt und von unten in einer vertikalen Richtung in einer Folge abnehmender Temperatur zusammengeführt werden.
  • Ausführungsbeispiel 2-2
  • Ausführungsbeispiel 2-2 der vorliegenden Erfindung umfasst als das Vermischungsförderungsmittel ein mechanisches Vermischungs- und/oder Rührmittel zum Stören der Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten, die in dem Vermischungsmikrokanal konvergieren.
  • In einen Beispiel des Ausführungsbeispiels 2-2 ist das mechanische Vermischungs- und/oder Rührmittel eine Hebeoberfläche, ein Drehkörper oder ein Oszillator, der in oder nahe dem Bereich vorgesehen ist, wo die Flüssigkeiten in dem Vermischungsmikrokanal konvergieren.
  • In einem anderen Beispiel des Ausführungsbeispiels 2-2 ist das mechanische Vermischungs- und/oder Rührmittel ein Vibrationsgerät, das auf der Innenwandoberfläche des Vermischungsmikrokanals vorgesehen ist. In noch einem weiteren Beispiel des Ausführungsbeispiels 2-2 ist das mechanische Vermischungs- und/oder Rührmittel ein Vibrationsgerät, das auf der Außenwandoberfläche des Vermischungsmikrokanals vorgesehen ist. Die Hebeoberfläche bezieht sich auf eine Oberfläche, die, wenn sie in der Strömung betätigt wird, einen Druckunterschied zwischen der oberen Oberfläche und der unteren Oberfläche erzeugt, um eine Wirbelstärke dahinter zu erzeugen. Vorzugsweise kann die Hebeoberfläche eine Klappe mit Flügel- bzw. Tragflächenquerschnitt sein, oder kann eine einfache flache Oberfläche sein.
  • In einem weiteren Beispiel des Ausführungsbeispiels 2-2 wird der Drehkörper oder Oszillator durch eine Magnetkraft angetrieben.
  • Ein Beispiel des in dem Ausführungsbeispiel 2-2 verwendeten Flüssigkeitsvermischungsverfahrens umfasst den Schritt des Vermischens von zwei oder mehr Flüssigkeiten durch Einleiten der Flüssigkeiten durch zwei oder mehr Flüssigkeit einleitende Mikrokanäle in einen Vermischungsmikrokanal, wo die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle bei einer gemeinsamen Stelle konvergieren, wobei der Schritt ein Schritt ist, in dem die Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten, die konvergieren sollen, durch ein mechanisches Vermischungs- und/oder Rührmittel in oder nahe dem Bereich gestört wird, wo die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle konvergieren (d.h. stromaufwärts von dem Vermischungsmikrokanal). In einem weiteren Beispiel dieses Flüssigkeitsvermischungsverfahrens ist das mechanische Vermischungs- und/oder Rührmittel ein Vibrationsgerät, das auf der Außenwand des Vermischungsmikrokanals vorgesehen ist, oder eine Hebeoberfläche, ein Drehkörper oder ein Oszillator, der innerhalb des Vermischungsmikrokanals vorgesehen ist.
  • Ein weiteres Beispiel des in dem Ausführungsbeispiel 2-2 verwendeten Flüssigkeitsvermischungsverfahrens umfasst einen Schritt, in dem Flüssigkeiten, die konvergieren sollen, in den Vermischungsmikrokanal derart eingeleitet werden, dass die Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten beibehalten wird, sowie einen Schritt, in dem nach der Vollendung der Einleitung der Flüssigkeiten, die Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten durch ein Vibrationsgerät instabil gemacht wird, nachdem die Strömung der Flüssigkeiten zum Stillstand gekommen ist. Ein Beispiel dieses Flüssigkeitsvermischungsverfahrens umfasst den Schritt der Instabilmachung der Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten durch ein Vibrationsgerät, das auf der Innenwandoberfläche des Vermischungsmikrokanals vorgesehen ist. Ein weiteres Beispiel dieses Flüssigkeitsvermischungsverfahrens umfasst den Schritt des Übertragens von Vibrationen der Flüssigkeiten innerhalb des Vermischungsmikrokanals durch ein Vibrationsgerät, das auf der Außenwandoberfläche des Vermischungsmikrokanals vorgesehen ist, wodurch die Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten instabil gemacht wird.
  • Ausführungsbeispiel 2-3
  • Ausführungsbeispiel 2-3 der vorliegenden Erfindung besitzt als Vermischungsförderungsmittel eine Anzahl von Nano- bis Mikronstrukturen, die innerhalb des Vermischungsmikrokanals angeordnet sind. In einem Beispiel des Ausführungsbeispiels 2-3 sind die Nano- bis Mikronstrukturen Vorsprünge oder Nuten, die ausreichend kleiner als die Breite des Vermischungsmikrokanals sind.
  • Kombinationen der Ausführungsbeispiele mit den Vermischungsförderungsmitteln
  • Für die Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung können die in den Ausführungsbeispielen 1-1 bis 2-3 gezeigten Vermischungsförderungsmittel alleine oder in irgendwelchen Kombinationen verwendet werden.
  • Ein Beispiel der bevorzugten Kombination ist eine Kombination des ersten Ausführungsbeispiels zum Erhöhen der Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten durch Strömungsratensteuerung, und des zweiten Ausführungsbeispiels zum Zerstören der Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten, die durch die Strömungsratensteuerung erhöht wurde. Besonders bevorzugte Kombinationen umfassen eine Kombination der unabhängigen Strömungsratensteuerung des Ausführungsbeispiels 1-1 und der Erwärmungsvorrichtung des Ausführungsbeispiels 2-1. Die Vermischung wird wirksam verbessert, wenn der Bereich der Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten, die in dem Vermischungsmikrokanal gebildet ist, durch die Strömungsratensteuerung des Ausführungsbeispiels 1-1 erhöht und gleichzeitig die erhöhte Grenzfläche durch die Wärmekonvektion, die durch die Erwärmungsvorrichtung des Ausführungsbeispiels 2-1 erzeugt wird, instabil gemacht wird.
  • In ähnlicher Weise kann die Vermischung wirksam durch eine Kombination von zumindest einem Aspekt des ersten Ausführungsbeispiels (Ausführungsbei spiele 1-1 bis 1-4) verbessert werden, die den Bereich der Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten erhöhen können, und zumindest einem Aspekt des zweiten Ausführungsbeispiels (Ausführungsbeispiele 2-1 bis 2-3), die die Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten instabil machen können.
  • Die Erwärmungsvorrichtung des Ausführungsbeispiels 2-1 kann leicht mit anderen Vermischungsförderungsmitteln kombiniert werden. Beispielsweise ist die Verwendung der Erwärmungsvorrichtung auf der Unterseite des Vermischungsabteils des Ausführungsbeispiels 1-3 oder auf der Unterseite des Vermischungsabschnitts der Verzweigungen des Ausführungsbeispiels 1-4 bevorzugt, da dies den Bereich der Grenzfläche zwischen den zu erwärmenden Flüssigkeiten erhöht. Ein Material mit hoher Wärmeleitfähigkeit kann für die Nano- bis Mikronstrukturen des Ausführungsbeispiels 2-3 verwendet werden, die durch die Erwärmungsvorrichtung erwärmt werden können.
  • Vermischungsförderungsmittel des gleichen Typs können gemeinsam auf einem Mikrochip angewendet werden, wenn sie auf dem gleichen Mikrochip anwendbar sind. Beispielsweise können der Anstieg in der Grenzfläche zwischen den konvergierenden Flüssigkeiten durch die Strömungsratensteuerung der Ausführungsbeispiele 1-1 oder 1-2, und der Anstieg in der Grenzfläche zwischen den konvergierenden Flüssigkeiten, basierend auf der Kanalform des Ausführungsbeispiels 1-3 oder des Ausführungsbeispiels 1-4 simultan verwendet werden. In ähnlicher Weise kann eine Vielzahl von Vermischungsförderungsmitteln auf einem einzelnen Kanal installiert werden, wenn sie in Serie auf den gleichen Kanal angewendet werden können. Im Fall, dass ein temperaturempfindliches Reagens oder Reaktant verwendet wird, ist es zweckmäßig, ein Verfahren zu verwenden, das ein anderes Mittel als eine Erwärmungsvorrichtung, beispielsweise das Vibrationsgerät des Ausführungsbeispiels 2-2, einsetzt.
  • Anwendung der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung und des -verfahrens auf eine Mikrochipelektrophoresevorrichtung
  • Die Flüssigkeitsvermischungsvorrichtungen und -verfahren der vorangehenden Ausführungsbeispiele 1-1 bis 2-3 können in einer Mikrochipelektrophoresevorrichtung verwendet werden.
  • Ein Beispiel der Mikrochipelektrophoresevorrichtung, die die Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung und das -verfahren verwendet, weist Folgendes auf: Flüssigkeit einleitende Mikrokanäle zum Einleiten von Pufferlösungen, die ein Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, einen Vermischungsmikrokanal zum Bilden eines Konzentrationsgradientenbereichs durch das Vermischen der Pufferlösungen, die von den Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle eingeleitet werden, einen Probeneinlass zum Einleiten einer ein Analyt enthaltenden Probe in den Vermischungsmikrokanal, sowie zumindest ein in den Ausführungsbeispielen 1-1 bis 2-3 gezeigtes Vermischungsförderungsmittel für die Konvergenz von Flüssigkeiten innerhalb des Vermischungsmikrokanals. In diesem Ausführungsbeispiel kann die Vermischung von Pufferlösungen, die ein Denaturierungsmittei mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, durch das Anwenden der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtungen und -verfahren der Ausführungsbeispiele 1-1 bis 2-3 einzeln oder in irgendeiner bevorzugten Kombination verbessert werden.
  • Das Flüssigkeitsvermischungsmittel oder das Strömungsratensteuermittel der oben erwähnten jeweiligen Ausführungsbeispiele kann in dem unten beschriebenen Ausführungsbeispiel A oder dem Ausführungsbeispiel B verwendet werden. Kombinationen von diesen sind in irgendwelchen Ausführungsbeispielen gemäß den hierin angeführten Offenbarungen anwendbar. Die Offenbarungen hierin lehren ihre bevorzugten Kombinationen und Ausführungsbeispiele der bevorzugten Kombinationen.
  • [Vorrichtung und Verfahren zum Separieren des Analyts]
  • Die vorliegende Erfindung, die die zuvor erwähnten Ziele (3), (4) und (5) erreicht, bezieht sich auf eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Separieren eines Analyts, welche den Konzentrationsgradienten eines Denaturierungsmittels für das Analyt nutzen. Bevorzugte Ausführungsbeispiele dieser Erfindung beschäftigen sich mit einer Vorrichtung, die einen Mikrokanal zum Bilden eines Denaturierungsgradientenbereichs aufweist, der ein Denaturierungsmittel für ein Analyt enthält, und wobei das Analyt elektrophoretisch behandelt wird, während es in den Denaturierungsgradientenbereich eingeleitet wird. Die Separierungsvorrichtung und das -verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen „Ausführungsbeispiel A" und „Ausführungsbeispiel B", die sich in der Form des Denaturierungsgradienten unterscheiden, wie unten erwähnt. In diesen Ausführungsbeispielen ist ein typisches Analyt eine Doppelstrangnukleinsäure. Die Doppelstrangnukleinsäure umfasst Doppelstrang-DNA und Doppelstrang RNA.
  • Ausführungsbeispiel A
  • In Ausführungsbeispiel A wird ein Denaturierungsgradient, in dem die Konzentration eines Denaturierungsmittels kontinuierlich variiert, durch Vermischen von Pufferlösungen gebildet, die das Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten.
  • Ein Beispiel des Ausführungsbeispiels A ist eine Mikrochipelektrophoresevorrichtung, die zumindest zwei Flüssigkeit einleitende Mikrokanäle zum Einleiten der Pufferlösungen, die ein Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, und einen Vermischungsmikrokanal, mit dem die zumindest zwei Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle verbunden sind, aufweist, wobei ein Denaturierungsgradientenbereich durch Einleiten der Pufferlösungen von den entsprechenden Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen mit variierenden Verhältnissen und Konvergieren der Pufferlösungen in dem Vermischungsmikrokanal gebildet wird.
  • In einem anderen Beispiel des Ausführungsbeispiels A sind die „zwei Pufferlösungen, die das Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten", eine Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung und eine Denaturierungsmittel freie Pufferlösung (kann im Folgenden als eine Pufferlösung bezeichnet werden).
  • Ein Beispiel der Mikrochipelektrophoresevorrichtung des Ausführungsbeispiels A besitzt vorzugsweise zumindest ein Mittel zum Verbessern der Vermi schung der Pufferlösungen, die in dem Vermischungsmikrokanal konvergieren. Das in dem Ausführungsbeispiel A verwendete Vermischungsförderungsmittel umfasst die Flüssigkeitsvermischungsvorrichtungen der Ausführungsbeispiel 1-1 bis 2-3 und Kombinationen von diesen. Ein Beispiel der in dem Ausführungsbeispiel A verwendeten Vermischungsförderungsmittel ist ein unabhängiges Strömungsratensteuerungsmittel, das nicht separat eine spezielle Vorrichtung erfordert, aber das kostenvorteilhaft zum Beispiel ein Steuermittel über eine elektroosmotische Strömung wie in dem Ausführungsbeispiel 1-1 ist, oder eine unabhängige Steuerung durch die Pumpe des Ausführungsbeispiels 1-1.
  • Ein weiteres Beispiel der Vorrichtung des Ausführungsbeispiels A weist Folgendes auf: einen Gradientenbereichskanal (Vermischungsmikrokanal), wo ein Nukleinsäuredenaturierungsgradient in einer elektrophoretischen Pufferlösung gebildet ist; einen Gradientenbildungsteil mit einer Vielzahl von Speichern und Kanälen (Flüssigkeit einleitende Mikrokanäle), die stromaufwärts von dem Gradientenbereichskanal zum Liefern von Pufferlösungen an den Gradientenbereichskanal vorgesehen sind; sowie einen Probeneinleitungsteil, der stromabwärts des Gradientenbereichskanals zum Einleiten einer Nukleinsäureprobe, die Doppelstrangnukleinsäuren enthält, in den Gradientenbereichskanal vorgesehen ist. In diesem Ausführungsbeispiel sind die Speicher mit Pufferlösungen gefüllt, die das Nukeinsäurendenaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten. Beispielsweise wird ein Potential an jede der Pufferlösungen innerhalb der Speicher angelegt, wodurch darin erzeugte elektroosmotische Strömungen gesteuert werden können. Durch Steuern der elektroosmotischen Strömungen können die Pufferlösungen von beliebigen Speichern mit geeigneten Strömungsraten in den Gradientenbereichskanal geliefert werden. Das Liefern der Pufferlösungen ist nicht auf das Antreiben durch elektroosmotische Strömungen beschränkt. Das Liefern der Pufferlösungen von den Speichern kann durch Vorsehen der Speicher und Kanäle mit einer Pumpe und/oder einem Ventil, wie in den Ausführungsbeispielen 1-1 und 1-2 beschrieben, gesteuert werden.
  • Durch Verwenden des obigen Steuerungsmittels für den Flüssigkeitsantrieb können die Pufferlösungen, die das Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, mit variierenden Verhältnissen von den Speichern und Kanälen des Gradientenbildungsbereichs in den Gradientenbereichskanal hinein konvergiert werden. Durch kontinuierliches Verändern des eingehenden Verhältnisses der Pufferlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen, die in den Gradientenbereichskanal eingeleitet werden, kann der Nukleinsäuredenaturierungsgradient innerhalb des Gradientenbereichskanals gebildet werden. Eine Nukleinsäurenprobe kann in diesen Gradientenbereich eingeleitet und dort elektrophoretisch behandelt werden.
  • In einem Beispiel der Vorrichtung des Ausführungsbeispiels A ist ein Gradientenbereichskanal (9) vorgesehen, ein Gradientenbildungsteil (2) ist stromaufwärts von dem Gradientenbereichskanal (9) vorgesehen und eine Elektrophoreseteil (4) mit einem Probeneinleitungsteil (3) ist stromabwärts von dem Gradientenbildungsteil (2) vorgesehen. In diesem Ausführungsbeispiel umfasst darüber hinaus der Gradientenbildungsteil (2) einen ersten Speicher (5), der mit einer Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösung gefüllt ist, und einen ersten Kanal (7), der von dem ersten Speicher (5) wegführt; sowie einen zweiten Speicher (6), der mit einer Nukleinsäuredenaturierungsmittel freien Pufferlösung gefüllt ist, und einen zweiten Kanal (8), der von dem zweiten Speicher (6) wegführt. In diesem Ausführungsbeispiel wird der Gradientenbereichskanal (9) durch die Konvergenz des ersten Kanals (7) und des zweiten Kanals (8) gebildet. Dieses Ausführungsbeispiel umfasst ferner eine erste Elektrode (10), die mit dem ersten Speicher (5) verbunden ist, und eine erste Leistungsquelle (11), die mit der ersten Elektrode (10) verbunden ist, und eine zweite Elektrode (12) die mit dem zweiten Speicher (6) verbunden ist, und eine zweite Leistungsquelle (13), die mit der zweiten Elektrode (12) verbunden ist.
  • In dem obigen Ausführungsbeispiel werden die Potentiale der ersten und zweiten Leistungsquellen (11, 13) gesteuert, wodurch die elektroosmotischen Strömungen, die in der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösung und der Denaturierungsmittel freien Pufferlösung erzeugt werden, gesteuert werden, mit dem Ergebnis, dass die zwei Flüssigkeiten mit variierenden Verhältnissen vermischt werden können. Aufgrund des Vermischens dieser Pufferlösungen mit vari ierenden Verhältnissen, können die Flüssigkeiten in den Elektrophoreseteil (4) eingeleitet werden, wobei der Denaturierungsgradientenbereich innerhalb des Gradientenbereichskanals (9) gebildet wird (für die Bezugszeichen siehe die 59 bis 64).
  • In einem weiteren Beispiel der Vorrichtung des Ausführungsbeispiels A umfasst der Gradientenformungsbereich ferner eine erste Pumpe (14), die imstande ist, die Flüssigkeit innerhalb des ersten Speichers oder ersten Kanals anzutreiben, und eine zweite Pumpe (15), die imstande ist, die Flüssigkeit innerhalb des zweiten Speichers oder zweiten Kanals anzutreiben (für die Bezugszeichen siehe die 59 bis 64). In diesem Ausführungsbeispiel können die Strömungsraten der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösung und der Denaturierungsmittel freien Pufferlösung durch Steuern des Anlegens der Potentiale durch die erste Leistungsquelle und die zweite Leistungsquelle gesteuert werden, sowie durch Steuern der Ausgangsleistung der ersten Pumpe und der zweiten Pumpe.
  • In einem weiteren Beispiel der Vorrichtung des Ausführungsbeispiels A umfasst der Probeneinleitungsteil, der in dem Elektrophoreseteil vorgesehen ist, einen dritten Speicher, der mit einer Nukleinsäureprobe gefüllt ist, und einen vierten Kanal, der von dem dritten Speicher weg führt, sowie einen vierten Speicher für die Nukleinsäureabfallflüssigkeit, sowie einen fünften Kanal, der von dem vierten Speicher weg führt. in diesem Ausführungsbeispiel stehen der vierte Kanal und der fünfte Kanal in Verbindung miteinander, während sie den Gradientenbereichskanal kreuzen, und ferner ist eine dritte Elektrode umfasst, die mit dem dritten Speicher verbunden ist, und eine dritte Leistungsquelle, die mit der dritten Elektrode verbunden ist, sowie eine vierte Elektrode, die mit dem vierten Speicher verbunden ist, und eine vierte Leistungsquelle, die mit der vierten Elektrode verbunden ist. In diesem Ausführungsbeispiel kann die Nukleinsäureprobe in den Gradientenbereichskanal durch Steuern der Potentiale der dritten und vierten Leistungsquellen und durch Erzeugen der elektroosmotischen Strömungen und/oder der Elektrophorese eingeleitet werden. Das Liefern der Nukleinsäureprobe ist nicht auf das Antreiben durch die elektroosmotische Strömung beschränkt. Das Liefern der Nukleinsäureprobe von dem Speicher kann durch Vorsehen der Speicher und der Kanäle mit einer Pumpe und/oder einem Ventil, wie in den Ausführungsbeispielen 1-1 und 1-2 beschrieben, gesteuert werden.
  • In einem weiteren Beispiel der Vorrichtung des Ausführungsbeispiels A umfasst der Elektrophoreseteil (4) einen fünften Speicher (24) für die Abfallflüssigkeit, der stromabwärts von dem Gradientenbereichskanal (stromabwärts von dem Probeneinleitungsteil) vorgesehen ist, eine fünfte Elektrode (25), die mit dem fünften Speicher (24) verbunden ist, und eine fünfte Leistungsquelle (26), die mit der fünften Elektrode (25) verbunden ist (für die Bezugszeichen siehe 59 bis 64). In diesem Ausführungsbeispiel kann die Nukleinsäureprobe, die von dem Probeneinleitungsteil (3) eingeleitet wird, innerhalb des Gradientenbereichskanals (9) elektrophoretisch behandelt werden.
  • Ein Beispiel des Analytseparierungsverfahrens, das in dem Ausführungsbeispiel A verwendet wird, ist ein Verfahren, das Folgendes aufweist: das Vermischen einer Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösung und einer Pufferlösung mit variierenden Verhältnissen in einem Kanal innerhalb eines Mikrochips, um einen Denaturierungsgradienten zu bilden, und das Einleiten einer Nukleinsäureprobe, die Doppelstrangnukleinsäuren enthält, in den Kanal, und das Bewegen und Separieren der eingeleiteten Nukleinsäureprobe durch Elektrophorese.
  • Ein weiteres Beispiel des in dem Ausführungsbeispiel A verwendeten Separierungsverfahrens ist ein Verfahren, das auf einem Mikrochip ausgeführt wird, welches Folgendes aufweist: einen Gradientenbereichskanal zum Bilden des Konzentrationsgradienten eines Nukleinsäuredenaturierungsmittels, eine Vielzahl von Speichern und Kanälen, die stromaufwärts von dem Gradientenbereichskanal vorgesehen sind, um Pufferlösungen zu liefern, die das Nukleinsäuredenaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, und einen Probeneinleitungsteil, der stromabwärts von den Speichern und Kanälen vorgesehen ist, um eine Nukleinsäureprobe einzuleiten, die Doppelstrangnukleinsäuren enthält. Dieses Verfahren umfasst den Schritt des Anlegens von Potentialen an die Pufferlösungen innerhalb der Speicher, und des Steuerns der darin erzeugten elektroosmotischen Strömungen, um die Pufferlösungen in den Gradientenbereichskanal einzuleiten, während sich die einzuleiten, während sich die Pufferlösungen mit variierenden Verhältnissen vermischen, wodurch der Konzentrationsgradient des Nukleinsäuredenaturierungsmittels innerhalb des Gradientenbereichskanals gebildet wird, sowie den Schritt des Einleitens einer Nukleinsäureprobe in den Gradientenbereichskanal für die Elektrophorese.
  • Ausführungsbeispiel B
  • Der Antragsteller reichte die Vorrichtung und das Verfahren, das sich auf das Ausführungsbeispiel A bezieht, als japanische Patentanmeldung Nr. 2003-392302 ein. In der vorliegenden Anmeldung hält der Antragsteller nicht an dem Konzentrationsgradientenbildungsverfahren der herkömmlichen DGGE fest und sieht ebenfalls eine Separationstechnologie vor, die die Massenproduktion erleichtert und die Analyse mit hoher Reproduzierbarkeit ermöglicht.
  • Ausführungsbeispiel B bezieht sich auf eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Separation, die die Notwendigkeit des Vermischens der Pufferlösungen, die ein Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, umgehen. Das Ausführungsbeispiel B bezieht sich auf ein Verfahren zum Separieren eines Analyts, das Gebrauch von einem Denaturierungsgradienten als einem diskontinuierlichen Konzentrationsgradienten eines Denaturierungsmittels macht, und einem Verfahren zum Bilden einer Pufferlösungszonenanordnung zu diesem Zweck, sowie einer Mikrochipelektrophoresevorrichtung zur Verwendung von diesen.
  • Das Ausführungsbeispiel B umfasst einen Schritt, in dem die Pufferlösungszonen, die ein Denaturierungsmittel für ein Analyt mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, abwechselnd in Richtung der Elektrophorese angeordnet sind, und das Analyt in die Anordnung der Pufferlösungszonen zur Elektrophorese eingeleitet wird.
  • In einem Beispiel des Ausführungsbeispiels B sind die Pufferlösungszonen, die das Denaturierungsmittel mit Null- oder geringer Konzentration enthalten, und die zwischen den Pufferlösungszonen angeordnet sind, derart angeordnet, dass ihre Länge (Breite in der Richtung der Elektrophorese) stufenweise stromabwärts in der Richtung der Elektrophorese abnimmt. In einem anderen Beispiel des Ausführungsbeispiels B sind die Pufferlösungszonen, die das Denaturierungsmittel mit hoher Konzentration enthalten, und die zwischen den Pufferlösungszonen angeordnet sind, derart angeordnet, dass ihre Länge (Breite in der Richtung der Elektrophorese) stufenweise stromabwärts in der Richtung der Elektrophorese zunimmt.
  • In einem weiteren Beispiel des Ausführungsbeispiels B ist eine Anordnung von Pufferlösungszonen, die ein Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, in einem Mikrokanal gebildet. In diesem Fall werden eine erste Pufferlösung, die das Denaturierungsmittel mit einer vorbestimmten Konzentration enthält, und eine zweite Pufferlösung, die das Denaturierungsmittel mit einer von der vorbestimmten Konzentration unterschiedlichen Konzentration enthält, abwechselnd in den Mikrokanal eingeleitet, wodurch Pufferlösungszonen, die das Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, abwechselnd in dem Mikrokanal angeordnet sind. In diesem Ausführungsbeispiel werden die in den zuvor erwähnten Ausführungsbeispielen 1-1 und 1-2 verwendeten Mittel zur Strömungsratensteuerung verwendet, wodurch Pufferlösungszonen, die das Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, abwechselnd in den Mikrokanal eingeleitet werden können.
  • In einem weiteren Beispiel des Ausführungsbeispiels B umfasst der Schritt des abwechselnden Anordnens der Pufferlösungszonen den Schritt des Einleitens einer ersten Pufferlösung in einen ersten Mikrokanal und dann des Einleitens einer zweiten Pufferlösung in einen zweiten Mikrokanal, der den ersten Mikrokanal kreuzt, wodurch die erste Pufferlösung innerhalb des ersten Mikrokanals durch die zweite Pufferlösung innerhalb des zweiten Mikrokanals bei ihrem Schnittpunkt geteilt wird, sowie den Schritt des abwechselnden Einspeisens der ersten Pufferlösung und der zweiten Pufferlösung gemäß dem obigen Schritt. Diese Schritte bilden eine abwechselnde Anordnung der ersten Pufferlösung und der zweiten Pufferlösung innerhalb des ersten Mikrokanals. Dieses Ausführungsbeispiel kann den Schritt des schrittweisen Veränderns der Länge der ersten Pufferlösung in Rich tung der Elektrophorese durch Steuern der Menge der eingespeisten ersten Pufferlösung umfassen.
  • Ein Beispiel der Vorrichtung, die das Verfahren des Ausführungsbeispiels B verwendet, ist eine Mikrochipelektrophoresevorrichtung, die einen ersten Mikrokanal zum Ausführen der Elektrophorese, ein Mittel zum Einleiten einer ersten Pufferlösung in den ersten Mikrokanal, ein Mittel zum Einleiten einer zweiten Pufferlösung, die ein Denaturierungsmittel mit einer Konzentration enthält, die sich von der Konzentration der ersten Pufferlösung unterscheidet, in den ersten Mikrokanal, und ein Mittel zum Einleiten einer Probe, die Doppelstrangnukleinsäuren enthält, in den ersten Mikrokanal aufweist.
  • Ein weiteres Beispiel des Ausführungsbeispiels B bezieht sich auf eine Verfahren zum Formen einer Anordnung von Pufferlösungszonen, die ein Denaturierungsmittel für eine Doppelstrangnukleinsäure mit unterschiedlichen Konzentrationen enthält, auf einem Substrat für die Elektrophorese, wobei das Verfahren Folgendes aufweist: Halten des Substrats, auf dem die Anordnung der Pufferlösungszonen geformt werden soll, auf einem (Positionier-)Tischmittel; Vorsehen eines Ausstoßmittels zum Ausstoßen der Pufferlösungen, die das Denaturierungsmittel für die Doppelstrangnukleinsäuren mit unterschiedlichen Konzentrationen enthält, zu dem Substrat; und Steuern der Position des Tischmittels und/oder des Ausstoßmittels und sequenzielles Antreiben des Ausstoßmittels, wodurch Pufferlösungszonen, die das Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, auf dem Substrat angeordnet werden.
  • Ein weiteres Beispiel des Verfahrens zum Formen einer Anordnung von Pufferlösungszonen gemäß Ausführungsbeispiel B weist Folgendes auf: Halten eines Mikrochipsubstrats für die Elektrophorese als das Substrat, und Platzieren einer Anordnung von Pufferlösungszonen, die ein Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, innerhalb des Mikrokanals des gehaltenen Mikrochipsubstrats. Noch ein weiteres Beispiel des Verfahrens weist das Halten eines Plattengels zur Elektrophorese anstelle eines Substrats auf, sowie das Platzieren einer Anordnung von Pufferlösungszonen, die ein Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, auf dem gehaltenen Plattengel.
  • Ein Beispiel der Vorrichtung zum Formen einer Anordnung von Pufferlösungszonen gemäß dem Ausführungsbeispiel B ist eine Vorrichtung zum Bilden einer Anordnung von Pufferlösungszonen, die ein Denaturierungsmittel für eine Doppelstrangnukleinsäure mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, auf einem Substrat oder einem Platengel für die Elektrophorese, wobei die Vorrichtung Folgendes aufweist: ein Tischmittel zum Halten des Substrats oder Plattengels, auf dem die Anordnung der Pufferlösungszonen geformt werden soll; ein Ausstoßmittel zum Ausstoßen der Pufferlösungen, die das Denaturierungsmittel für die Doppelstrangnukleinsäuren mit unterschiedlichen Konzentrationen enthält, zu dem Substrat oder Plattengel hin; und Steuermittel zum Steuern der Position des Tischmittels und/oder Ausstoßmittels und nachfolgendem Antreiben des Ausstoßmittels.
  • In anderen Beispielen der Vorrichtung und des Verfahrens zum Formen einer Anordnung von Pufferlösungszonen gemäß Ausführungsbeispiel B kann das Ausstoßmittel die Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung und das -verfahren des Ausführungsbeispiels 1-1 bis des Ausführungsbeispiels 2-3 nutzen, die das Vermischungsförderungsmittel aufweisen. In diesem Ausführungsbeispiel wird das Vermischen der Pufferlösungen, die ein Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, wobei die Pufferlösungen an das Ausstoßmittelgeliefert werden, durch ein geeignetes Flüssigkeitsvermischungsmittel verbessert.
  • WIRKUNGEN DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung sieht eine Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung order -verfahren vor, die unverzüglich und gleichmäßig winzige Mengen an Flüssigkeiten auf einer Mikroebene vermischen können. Die Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung oder das -verfahren, die durch die vorliegende Erfindung vorgesehen sind, können auf irgendwelche μTASs, beispielsweise mikrochemische Analysatoren oder mikrochemische Reaktoren (Mikroreaktoren) angewendet wer den, die gegenwärtig existieren oder in der Zukunft entwickelt werden. Folglich bringt die vorliegende Erfindung verschiedene Vorteile mit sich, wie beispielsweise die Vereinfachung eines experimentellen Ablaufs, der auf einer Mikroebene ausgeführt wird, die Verkürzung der Analyse- und Reaktionszeiten, einen hohen Durchlass, eine Verkleinerung des Mikrochips und eine hohe Genauigkeit (z.B. hohe Auflösung).
  • In einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Separieren eines Analyts vor, indem sie Gebrauch macht von dem Konzentrationsgradienten eines Denaturierungsmittels für das Analyt, und einer Vorrichtung und eines Verfahrens zum Bilden eines Denaturierungsgradienten. Insbesondere sieht diese Erfindung eine Mikrochipelektrophoresevorrichtung und ein Elektrophoreseverfahren zum Ausführen einer DGGE auf einem Mikrochip vor. Diese Erfindung sieht auch eine Mikrochipelektrophoresevorrichtung und ein Elektrophoreseverfahren vor, die für die DGGE nützlich sind, durch Anwenden einer Reihe von Technologien zum Fördern bzw. Verbessern der Flüssigkeitsvermischung auf einer Mikroebene auf die Vermischung von Pufferlösungen innerhalb eines Mikrokanals.
  • Gemäß der DGGE-Mikrochipelektrophoresevorrichtung und des Elektrophoreseverfahrens der vorliegenden Erfindung kann der Konzentrationsgradient eines Nukleinsäuredenaturierungsmittels exakt gebildet werden und der Konzentrationsgradient kann frei gesteuert werden. Insbesondere ist es möglich, in großen Mengen analytische Chips vorzusehen, die stets den gleichen Denaturierungsgradienten oder Denaturierungsmittelanordnung reproduzieren können. Infolgedessen werden genaue Vergleiche und Studien unterschiedlicher Daten möglich, was verschiedene Vorteile erzeugt, beispielsweise dahingehend, das beim Analysieren der Struktur einer Mikrobengemeinschaft basierend auf einem Vergleich der Nukleinsäuren (typischerweise einem Vergleich der Basensequenzen der rRNA Gene), die in zu analysierenden Proben enthalten sind, gesammelte Daten leicht in einer Datenbasis zusammengetragen werden können.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 Eine schematische Ansicht, die einen allgemein bekannten, Standardmikrovermischungsmikrokanal zeigt.
  • 2 Eine schematische Ansicht, die einen Mikrovermischungsmikrokanal darstellt, der ein verlängerter Vermischungsmikrokanal ist, um eine adäquate Diffusionsentfernung sicherzustellen.
  • 3 Eine Ansicht, die einen Mikrokanal mit Flüssigkeit trennende, dünne Nuten zum Verbessern der Vermischung darstellt (Ausführungsbeispiel 1-1).
  • 4 Eine schematische Ansicht, die eine Vorrichtung des Ausführungsbeispiels 1-1 zeigt.
  • 5 Konzeptionelle Ansichten, die die Spannungssteuerung des vorliegenden Ausführungsbeispiels zeigen.
  • 6 Eine schematische Ansicht, die die Gradientenbildungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels zeigt.
  • 7 Konzeptionelle Ansichten, die die Druckeinspeisungssteuerung des vorliegenden Ausführungsbeispiels zeigen (Ausführungsbeispiel 1-2).
  • 8 Eine schematische Strukturzeichnung, die eine Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des Ausführungsbeispiels 1-2 zeigt.
  • 9 Eine perspektivische Ansicht, die die konkrete Konfiguration der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung der 8 zeigt.
  • 10 Eine perspektivische Ansicht, die auf einer vergrößerten Skala, ein schnell arbeitendes Ventil der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung der 8 zeigt.
  • 11 Eine Schnittansicht, die das schnell arbeitende Ventil (wenn sich dieses nicht in Betrieb befindet) der 10 zeigt.
  • 12 Eine Schnittansicht, die das schnell arbeitende Ventil (wenn sich dieses in Betrieb befindet) der 10 zeigt.
  • 13 Eine Ansicht zur Erläuterung eines Verfahrens zum Erzeugen eines Vorsprungs zur Verwendung in dem schnell arbeitenden Ventil.
  • 14 Eine Ansicht zur Erläuterung der Schritte zum Erzeugen des Vorsprungs zur Verwendung in dem schnell arbeitenden Ventil.
  • 15 Eine Strukturzeichnung, die ein weiteres Beispiel der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels zeigt.
  • 16 Eine Ansicht zur Erläuterung der Wirkung des Vermischens gemäß dem vorliegenden Ausführungsbeispiel.
  • 17 Eine Strukturzeichnung, die noch ein weiteres Beispiel der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels zeigt.
  • 18 Ein Zeitdiagramm, das sich mit der Steuerung der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung der 16 befasst.
  • 19 Ein weiteres Zeitdiagramm, das sich mit der Steuerung der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung der 16 befasst.
  • 20 Eine Strukturzeichnung, die noch ein weiteres Beispiel der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels zeigt.
  • 21 Ein weiteres Zeitdiagramm, das sich mit der Steuerung der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung der 20 befasst.
  • 22 Eine Strukturzeichnung, die noch ein weiteres Beispiel der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels zeigt.
  • 23 Ein weiteres Zeitdiagramm, das sich mit der Steuerung der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung der 22 befasst.
  • 24 Eine Strukturzeichnung, die noch ein weiteres Beispiel der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels zeigt.
  • 25 Ein weiteres Zeitdiagramm, das sich mit der Steuerung der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung der 24 befasst.
  • 26 Eine konzeptionelle Ansicht, die noch ein weiteres Beispiel der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels zeigt.
  • 27 Eine konzeptionelle Ansicht, die noch ein weiteres Beispiel der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels zeigt.
  • 28 Eine Ansicht zur Erläuterung des Problems einer herkömmlichen Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung.
  • 29 Eine Ansicht zur Erläuterung des Problems der herkömmlichen Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung (Ausführungsbeispiel 1-3).
  • 30 Eine Ansicht, die ein Beispiel der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des Ausführungsbeispiels 1-3 zeigt.
  • 31 Eine Ansicht, die das Verhältnis (S/V) des Bereichs (S) der Grenzfläche zu dem Kanalvolumen (V) pro Kanallängeneinheit darstellt.
  • 32a Eine Ansicht die den Zustand der Flüssigkeiten in einem Vermischungsabteil zeigt, wenn die Stapelungsrichtung einleitender Mikrokanäle und die Höhenrichtung des Vermischungsabteils vertikal zueinander sind, und die einleitenden Mikrokanäle und das Vermischungsabteil direkt miteinander verbunden sind.
  • 32b Eine Ansicht die den Zustand der Flüssigkeiten in einem Vermischungsabteil zeigt, wenn die Stapelungsrichtung einleitender Mikrokanäle und die Höhenrichtung des Vermischungsabteils vertikal zueinander sind, und die einleitenden Mikrokanäle und das Vermischungsabteil über einen Vorvermischungsmikrokanal verbunden sind.
  • 33 Eine Ansicht, die ein Beispiel der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels zeigt.
  • 34a Eine Ansicht, die die Strömung der Flüssigkeiten zeigt, wenn der Vorvermischungsmikrokanal und das Vermischungsabteil mit einer sanften Neigung verbunden sind.
  • 34b Eine Ansicht, die die Strömung der Flüssigkeiten zeigt, wen der Vorvermischungsmikrokanal und das Vermischungsabteil nicht mit einer sanften Neigung verbunden sind.
  • 35 eine Ansicht, die ein weiteres Beispiel der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels zeigt (Ausführungsbeispiel 1-4).
  • 36 Eine linke Seitenansicht (36(a)), eine Vorderansicht (36(b)), eine rechte Seitenansicht (36(c)) und Schnittansichten (36(d)), die die schematische Konfiguration der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des Ausführungsbeispiels 1-4 zeigen.
  • 37 Ansichten, die die Schichtstruktur der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung zeigen, sowie den Schritt der Lamination.
  • 38 Eine Schnittansicht, die eine weitere Schichtstruktur zeigt.
  • 39 eine Schnittansicht, die einen weiteren Aufbau eines Vermischungsabschnitts oder eines konvergierenden Teils der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung zeigt.
  • 40 Ansichten, die Konfigurationsbeispiele des Ausführungsbeispiels 1-4 mit einer Vielzahl von Flüssigkeitseinlässen zeigen.
  • 41 Ansichten die Konfigurationsbeispiele einer verzweigten Elektrode zeigen, die in der Vorrichtung der 40 verwendbar ist.
  • 42 Eine Ansicht, die eine weitere Konfiguration des Ausführungsbeispiels 1-4 mit einer Vielzahl von Flüssigkeitseinlässen zeigt.
  • 43 Eine Ansicht zur Erläuterung des Steuernmittels und des -verfahrens der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung der 40 oder der 42 (Ausführungsbeispiel 2-1).
  • 44 Eine Ansicht, die ein Beispiel der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des Ausführungsbeispiels 2-1 zeigt.
  • 45 Eine Ansicht die ein weiteres Beispiel der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels zeigt.
  • 46 Eine Ansicht die ein weiteres Beispiel der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels zeigt (Ausführungsbeispiel 2-2).
  • 47 Eine schematische Ansicht, die ein Beispiel der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des Ausführungsbeispiels 2-2 zeigt.
  • 48 Eine schematische Ansicht, die ein weiteres Beispiel der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels zeigt.
  • 49 Eine schematische Ansicht, die noch ein weiteres Beispiel der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels zeigt.
  • 50 Eine schematische Ansicht, die noch ein weiteres Beispiel der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels zeigt.
  • 51 Schematische Ansichten, die die Art und Weise des Einleitens der Flüssigkeiten in die Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels zeigen.
  • 52 Schematische Ansichten, die andere Beispiele der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels zeigen.
  • 53 Schematische Ansichten, die noch andere Beispiele der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels zeigen (Ausführungsbeispiel 2-3).
  • 54 Eine schematische Strukturzeichnung, die die Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels 2-3 zeigt.
  • 55 Ansichten, die Beispiele der säulenförmigen Nano- bis Mikronstrukturen der Vorrichtung der 54 zeigen.
  • 56 Eine schematische Strukturzeichnung, die das vorliegende Ausführungsbeispiel mit nutförmigen Nano- bis Mikronstrukturen zeigt.
  • 57 Eine schematische Ansicht, die ein Beispiel der nutförmigen Nano- bis Mikronstrukturen zeigt.
  • 58 Eine schematische Ansicht, die ein weiteres Beispiel der nutförmigen Nano- bis Mikronstrukturen zeigt (Ausführungsbeispiel A).
  • 59a Eine konzeptionelle Ansicht, die schematisch ein Beispiel der Grundkonfiguration einer Mikrochipelektrophoresevorrichtung des Ausführungsbeispiels A zeigt.
  • 59b Eine konzeptionelle Ansicht, die ein weiteres Beispiel der Grundkonfiguration des Ausführungsbeispiels A zeigt.
  • 59c Eine konzeptionelle Ansicht, die noch ein weiteres Beispiel der Grundkonfiguration des Ausführungsbeispiels A zeigt.
  • 59d Eine konzeptionelle Ansicht, die noch ein weiteres Beispiel der Grundkonfiguration des Ausführungsbeispiels A zeigt.
  • 60 Eine schematische Ansicht, die ein Konfigurationsbeispiel eines Denaturierungsgradientenbildungsteils für das Ausführungsbeispiel A zeigt.
  • 61 Eine schematische Ansicht, die ein weiteres Beispiel des Denaturierungsgradientenbildungsteils zeigt.
  • 62 Eine schematische Ansicht, die ein Beispiel eines Probeneinleitungsteils für das Ausführungsbeispiel A zeigt.
  • 63 Eine schematische Ansicht, die ein Beispiel des Ausführungsbeispiels A zeigt.
  • 64 Eine schematische Ansicht, die ein weiteres Beispiel des Ausführungsbeispiels A zeigt.
  • 65 Eine schematische Ansicht, die den Denaturierungsgradientenbildungsteil des Ausführungsbeispiels A, vorgesehen mit einem schnell arbeitenden Ventil, zeigt.
  • 66 Eine schematische Ansicht, die einen weiteren Denaturierungsgradientenbildungsteil, vorgesehen mit einem schnell arbeitenden Ventil, zeigt.
  • 67 Eine schematische Ansicht, die ein Beispiel des Ausführungsbeispiels A, vorgesehen mit dem schnell arbeitenden Ventil, zeigt.
  • 68 Eine schematische Ansicht, die ein weiteres Beispiel des Ausführungsbeispiels A, vorgesehen mit dem schnell arbeitenden Ventil, zeigt (Ausführungsbeispiel B).
  • 69 Eine konzeptionelle Ansicht, die eine unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung einer ersten Form gemäß dem Ausführungsbeispiel B zeigt.
  • 70 Eine konzeptionelle Ansicht, die eine unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung einer zweiten Form gemäß dem Ausführungsbeispiel B zeigt.
  • 71 Eine perspektivische Ansicht, die die schematische Konfiguration einer Elektrophoresevorrichtung zeigt, die ein Plattengel mit der unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung enthält.
  • 72 Eine konzeptionelle Ansicht, die die auf einem Mikrokanal gebildete unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung zeigt.
  • 73 Eine Ansicht, die ein Beispiel einer Mikrochipelektrophoresevorrichtung gemäß Ausführungsbeispiel B zeigt.
  • 74 Eine Ansicht, die ein weiteres Beispiel einer Mikrochipelektrophoresevorrichtung gemäß Ausführungsbeispiel B zeigt.
  • 75 Eine Ansicht, die ein weiteres Beispiel einer Mikrochipelektrophoresevorrichtung gemäß Ausführungsbeispiel B zeigt.
  • 76 Strukturzeichnungen entsprechender Substrate, die die Vorrichtung der 75 konstituieren.
  • 77 Eine Ansicht, die ein weiteres Beispiel der Mikrochipelektrophoresevorrichtung gemäß Ausführungsbeispiel B zeigt.
  • 78 Eine perspektivische Ansicht, die die schematische Konfiguration einer Vorrichtung zeigt, die eine Pufferlösungszonenanordnung für das Ausführungsbeispiel B bildet.
  • 79 Eine perspektivische Ansicht, die die schematische Konfiguration einer Vorrichtung zeigt, die geeignet für das Bilden einer Pufferlösungszonenanordnung auf einem Plattengel ist.
  • 80 Eine konzeptionelle Ansicht, die ein Beispiel eines Verfahrens zum Bilden der Pufferlösungszonenanordnung für das Ausführungsbeispiel B zeigt.
  • 81 Eine konzeptionelle Ansicht, die ein Verfahren zum Anpassen der Länge einer Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszone für das Ausführungsbeispiel B zeigt.
  • 82 Eine Ansicht zur Erläuterung des Prinzips des Ausführungsbeispiels B.
  • 83 Eine Ansicht, die schematisch eine Vorrichtung zeigt, die mit schnell arbeitenden Ventilen zum Bilden der Pufferlösungszonenanordnung angebracht ist.
  • 84 Eine Ansicht, die schematisch ein Ausstoßmittel zum Bilden der Pufferlösungszonenanordnung zeigt.
  • ERLÄUTERUNGEN DER BUCHSTABEN ODER ZEICHEN
  • (Ausführungsbeispiel 1-1; 1 bis 7)
    • 5; erster Speicher, 6; zweiter Speicher, 7; erster Flüssigkeit einleitender Mikrokanal, 8; zweiter Flüssigkeit einleitender Mikrokanal, 9; Vermischungsmikrokanal, 10; dritter Speicher, 11; erste Elektrode, 12; zweite Elektrode, 13; dritte Leistungsquelle, 14; erste Pumpe, 15; zweite Pumpe.
  • (Ausführungsbeispiel 1-2; 8 bis 29)
    • 130; Flüssigkeit einleitender Mikrokanal; 131; Vermischungsmikrokanal, 132; schnell arbeitendes Ventil.
  • (Ausführungsbeispiel 1-3; 30 bis 35)
    • 205; erster Speicher, 206; zweiter Speicher, 207; erster Flüssigkeit einleitender Mikrokanal, 208; zweiter Flüssigkeit einleitender Mikrokanal, 230; Vermischungsabteil, 233; Vermischungsmikrokanal, 234; Vorvermischungsmikrokanal, 235; Verbindungsteil.
  • (Ausführungsbeispiel 1-4; 36 bis 43)
    • 330; Flüssigkeit einleitender Mikrokanal, 330a; Flüssigkeitseinlass, 331; Vermischungsmikrokanal, X; Verzweigungsrichtung, Y; Konvergenzrichtung.
  • (Ausführungsbeispiel 2-1; 44 bis 46)
    • 405; erster Speicher, 406; zweiter Speicher, 407; erster Flüssigkeit einleitender Mikrokanal, 408; zweiter Flüssigkeit einleitender Mikrokanal, 430; Vermischungsabschnitt oder konvergierender Teil, 431, 432, 451, 452; einleitender Mikrokanal, 433, 453; Vermischungsmikrokanal, 435; Erwärmungsvorrichtung, 440, 450; Ver mischungsabschnitt oder konvergierender Teil, 441, 442; einleitender Mikrokanal, 443; Vermischungsmikrokanal, 445, 455; Erwärmungsvorrichtung.
  • (Ausführungsbeispiel 2-2; 47 bis 50)
    • 505; erster Speicher, 506; zweiter Speicher, 507; erster Flüssigkeit einleitender Mikrokanal, 508; zweiter Flüssigkeit einleitender Mikrokanal, 509, 533; Vermischungsmikrokanal, 535, 536; zu vermischende Flüssigkeiten, 510, 537; Vibrationsgerät, 538; Ventil, 511; Hebeoberfläche, 512; Drehkörper, 513; Oszillator.
  • (Ausführungsbeispiel 2-3; 54 bis 58)
    • 707; erster Flüssigkeit einleitender Mikrokanal, 708; zweiter Flüssigkeit einleitender Mikrokanal, 709; Gradientenbereichskanal zur Flüssigkeitsvermischung (Vermischungsmikrokanal), 709a; untere Oberfläche des Gradientenbereichskanals, 709b; obere Oberfläche des Gradientenbereichskanals, 730; Vermischungsabschnitt oder konvergierender Teil, 731; Nano- bis Mikronstrukturen.
  • (Ausführungsbeispiel A; 59 bis 68)
    • 801; Mikrochip, 802; Denaturierungsgradientenbildungsteil, 803; Probeneinleitungsteil, 804; Elektrophoreseteil, 805; erster Speicher, 806; zweiter Speicher, 807; erster Kanal (Flüssigkeit einleitender Mikrokanal), 808; zweiter Kanal (Flüssigkeit einleitender Mikrokanal), 809; Gradientenbereichskanal (Vermischungsmikrokanal), 810; erste Elektrode, 811; erste Leistungsquelle, 812; zweite Elektrode, 813; zweite Leistungsquelle, 814; erste Pumpe, 815; zweite Pumpe, 816; dritter Speicher, 817; vierter Speicher, 818; vierter Kanal, 819; fünfter Kanal, 820; dritte Elektrode, 821; dritte Leistungsquelle, 822; vierte Elektrode, 823; vierte Leistungsquelle, 824; fünfter Speicher, 825; fünfte Elektrode, 826; fünfte Leistungsquelle.
  • (Ausführungsbeispiel B; 69 bis 84)
    • 901; Nukleinsäureanalysekanal (Mikrokanal), 902; Nukleinsäureprobeneinleitungskanal, 903; Mikrochipsubstrat, 905; Detektierteil, 906; Denaturierungsmittel enthaltender Pufferlösungseinleitungskanal, 910; Substrat, 911; Tischmittel, 912; Ausstoßmittel, 914; Plattengel.
  • AUSFÜHRUNGSBEISPIEL DER ERFINDUNG
  • [Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung und -verfahren]
  • Die Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung der vorliegenden Erfindung weist zumindest zwei Flüssigkeit einleitende Mikrokanäle zum Einleiten von Flüssigkeiten, und einen Vermischungsmikrokanal auf, der mit den zumindest zwei Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen verbunden ist, wobei die Flüssigkeiten, die von den entsprechenden Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen eingeleitet werden, in dem Vermischungsmikrokanal konvergieren, wobei die Vorrichtung ferner Vermischungsförderungsmittel zum Verbessern des Vermischens der Flüssigkeiten, die in dem Vermischungsmikrokanal konvergieren, aufweist.
  • In dem ersten Ausführungsbeispiel gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Vermischungsförderungsmittel ein Mittel zum Erhöhen des Bereichs der Grenzfläche zwischen den zu vermischenden Flüssigkeiten. Beispiele der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des ersten Ausführungsbeispiels umfassen die Ausführungsbeispiele 1-1, 1-2, 1-3 und 1-4, die unten beschrieben sind.
  • In dem zweiten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist das Vermischungsförderungsmittel ein Mittel zum Instabilmachen der Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten, die zu vermischen sind, durch thermische, mechanische und/oder strukturelle Mittel. Beispiele der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des zweiten Ausführungsbeispiels umfassen die Ausführungsbeispiele 2-1, 2-2 und 2-3, die unten beschrieben sind.
  • Die entsprechenden Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend beschrieben.
  • Ausführungsbeispiel 1-1 (4 bis 7)
  • Das Vermischungsförderungsmittel der Vorrichtung gemäß dem vorliegenden Ausführungsbeispiel ist zumindest ein Flüssigkeit einleitendes Mittel durch das die Strömungsrate der Flüssigkeit, die in einen Flüssigkeit einleitenden Mikrokanal eingeleitet wird, unabhängig von der Strömungsrate der Flüssigkeit gesteuert wer den kann, die in einen anderen Flüssigkeit einleitenden Mikrokanal eingeleitet wird.
  • 4 zeigt die Vorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels. Diese Vorrichtung umfasst einen ersten Speicher 5, der mit einer ersten Reagenslösung gefüllt ist, einen zweiten Speicher 6, der mit einer zweiten Reagenslösung gefüllt ist, einen ersten Kanal (Flüssigkeit einleitender Mikrokanal) 7, der von dem ersten Speicher 5 weg führt, einen zweiten Kanal (Flüssigkeit einleitender Mikrokanal) 8, der von dem zweiten Speicher 6 weg führt, einen dritten Kanal (Vermischungsmikrokanal) 9, der mit dem ersten Kanal 7 und dem zweiten Kanal 8 verbunden ist, und einen dritten Speicher 10. Der erste Speicher 5 umfasst ferner eine erste Elektrode 11, der zweite Speicher 6 umfasst ferner eine zweite Elektrode 12, und der dritte Speicher 10 umfasst ferner eine dritte Elektrode 13.
  • Wenn eine Spannung V1 zwischen die erste Elektrode 11 und die dritte Elektrode 13 angelegt wird, wird die erste Reagenslösung von dem ersten Speicher 5 in den dritten Kanal 9 durch den ersten Kanal 7 hindurch eingeleitet, und zwar durch eine erzeugte elektroosmotische Strömung. In ähnlicher Weise, wenn eine Spannung V2 zwischen die erste Elektrode 12 und die dritte Elektrode 13 angelegt wird, wird die zweite Reagenslösung von dem zweiten Speicher 6 in den dritten Kanal 9 durch den zweiten Kanal 8 hindurch eingeleitet.
  • Im Allgemeinen wird, wenn zwei Flüssigkeiten in einem Mikrokanal konvergieren, eine Laminarströmung gebildet und eine Grenzfläche zwischen den beiden Flüssigkeiten wird stabil aufrechterhalten. In einem solchen Fall ist es bekannt, dass die Vermischung aufgrund von Diffusion nicht in ausreichender Weise in den Lösungen mit einem geringen Diffusionskoeffizienten auftritt, und diese Flüssigkeiten strömen in einem Vermischungsmikrokanal, wobei sie in zwei Schichten unterteilt sind. Wenn bei dieser Gelegenheit geeignete Spannungsvariationen an die Spannung V1 und die Spannung V2 abgegeben werden, wie durch die durchgezogene Linie in 5(B) gezeigt, wird eine Instabilität an der Grenzfläche zwischen den beiden Flüssigkeiten verursacht, und die Grenzflächenstruktur kann zerstört werden. Auf diese Weise können die beiden Flüssigkeiten mit einer hohen Geschwindigkeit und gleichmäßig vermischt werden. Demgemäß können die erste Reagenslösung und die zweite Reagenslösung mit einem beliebigen Verhältnis in dem dritten Kanal 9 unverzüglich durch das Abgeben variierender Komponenten, soweit erforderlich, an die Spannung V1 und die Spannung V2, vermischt werden. Ferner, wenn die Spannung V1 und die Spannung V2 kontinuierlich verändert werden, wie durch die gestrichelten Linien und die Strichpunktlinien in 5(a) angezeigt, kann das Strömungsratenverhältnis zwischen der ersten Reagenslösung und der zweiten Reagenslösung kontinuierlich verändert werden. Wenn variierende Komponenten auf einer Spannung überlagert werden, wie durch eine gestrichelte Linie und eine Strichpunktlinie in 5(b) angezeigt, werden die ersten und zweiten Reagenslösungen gründlich vermischt und ein Konzentrationsgradientenbereich der Reagenslösungen kann unverzüglich im dritten Kanal 9 gebildet werden. Als die variierenden Komponenten können eine Sinuswelle, eine Sägezahnwelle, eine rechteckige Welle und eine Kombination von diesen ersonnen werden. Darüber hinaus ist es denkbar, die Phasen der Veränderungs- bzw. Varianzkomponenten für die jeweiligen Kanäle zu verschieben, um die Diffusion zu fördern und die Strömungsraten zu behalten.
  • 6 zeigt ein Beispiel des vorliegenden Ausführungsbeispiels. Dieses Beispiel umfasst einen ersten Speicher 5, der mit einer ersten Reagenslösung gefüllt ist, einen zweiten Speicher 6, der mit einer zweiten Reagenslösung gefüllt ist, einen ersten Kanal (Flüssigkeit einleitender Mikrokanal) 7, der von dem ersten Speicher 5 weg führt, einen zweiten Kanal (Flüssigkeit einleitender Mikrokanal) 8, der von dem zweiten Speicher 6 weg führt, einen dritten Kanal (Vermischungsmikrokanal) 9, der mit dem ersten Kanal 7 und dem zweiten Kanal 8 verbunden ist, und einen dritten Speicher 10. Der erste Speicher 5 umfasst ferner eine erste Elektrode 11, der zweite Speicher 6 umfasst ferner eine zweite Elektrode 12, und der dritte Speicher 10 umfasst ferner eine dritte Elektrode 13. Die Anordnung dieses Beispiels besitzt eine erste Pumpe 14 und eine zweite Pumpe 15, die jeweils dem ersten Speicher 5 und dem zweiten Speicher 6 hinzugefügt sind.
  • Die Flüssigkeitseinspeisung durch diese Pumpen kann bei der Flüssigkeitseinspeisung durch die elektroosmotischen Strömungen in 4 mitwirken und ermöglicht die Flüssigkeitseinspeisung mit einer relativ hohen Geschwindigkeit, selbst wenn die Viskosität der Reagenslösungen hoch ist. Wenn in diesem Fall geeignete variierende Komponenten an die Flüssigkeitseinspeisungsdrücke der ersten Pumpe 14 und der zweiten Pumpe 15 übertragen werden, wie durch die durchgezogenen Linien in 7(b) gezeigt, wird eine Instabilität an der Grenzfläche verursacht, die durch die beiden Flüssigkeiten gebildet wird, mit dem Ergebnis, dass der Bereich der Grenzfläche, auf dem sich die beiden Flüssigkeiten kontaktieren, vergrößert werden kann, oder die Struktur der Grenzfläche zerstört werden kann. Auf diese Weise können die beiden Flüssigkeiten mit einer hohen Geschwindigkeit und gleichmäßig vermischt werden. Demgemäß können die erste Reagenslösung und die zweite Reagenslösung unverzüglich mit einem beliebigen Verhältnis in dem dritten Kanal 9 vermischt werden, indem den Flüssigkeitseinspeisungsdrücken der ersten Pumpe 14 und der zweiten Pumpe 15 gegebenenfalls variierende Komponenten gegeben bzw. aufgeprägt werden. Darüber hinaus kann, wenn die Flüssigkeitseinspeisungsdrücke der ersten Pumpe 14 und der zweiten Pumpe 15 kontinuierlich verändert werden, wie durch die gestrichelten Linien und die Strichpunktlinien in 7(a) angezeigt, das Strömungsratenverhältnis zwischen der ersten Reagenslösung und der zweiten Reagenslösung kontinuierlich verändert werden. Wenn die variierenden Komponenten auf den Flüssigkeitseinspeisungsdruck überlagert werden, wie durch eine gestrichelte Linie und eine Strichpunktlinie in 7(b) angezeigt, werden die ersten und zweiten Reagenslösungen gründlich vermischt, so dass ein Konzentrationsgradientenbereich der Reagenslösungen im dritten Kanal 9 gebildet werden kann. Darüber hinaus werden in 6 die Flüssigkeitseinspeisungsdrücke der Pumpe 14 und der Pumpe 15 und die an die Elektrode 11 und die Elektrode 12 angelegten Potentiale simultan gesteuert, wodurch eine Förderung der Diffusion und eine Steuerung des Konzentrationsgradienten effektiver ausgeführt werden kann. Als die variierenden Komponenten können eine Sinuswelle, eine Sägezahnwelle, eine rechteckige Welle und eine Kombination von diesen ersonnen werden. Es ist auch denkbar, die Phasen der variierenden Komponenten für die jeweiligen Kanäle zu verschieben, um die Diffusion zu fördern und die Strömungsraten aufrecht zu erhalten.
  • Ausführungsbeispiel 1-2 (8 bis 22)
  • Das Vermischungsförderungsmittel der Vorrichtung gemäß dem vorliegenden Ausführungsbeispiel ist ein schnell arbeitendes Ventil, das auf zumindest einem der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle vorgesehen ist.
  • 8 zeigt die schematische Konfiguration der Kanäle der Mikrochipvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels, und 9 zeigt die konkrete Konfiguration des Mikrochips des vorliegenden Ausführungsbeispiels. Die Mikrokanäle dieses Mikrochips bestehen aus zwei Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen 130a, 130b und einem Vermischungsmikrokanal 31, in dem die Mikrokanäle 130a und 130b konvergieren. Gemäß dem vorliegenden Ausführungsbeispiel ist ein schnell arbeitendes Ventil 132 auf einem der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen angebracht.
  • 9 zeigt die Konfiguration des gesamten Mikrochips. 10 zeigt auf einer vergrößerten Skala einen schnell arbeitenden Ventilmechanismus, und 11 zeigt den Querschnitt des schnell arbeitenden Ventils. Wie in 9 gezeigt, werden eine Flüssigkeit A und eine Flüssigkeit B durch Spritzenpumpen P unter Druck gesetzt, von den Speichern für die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen 130a, 130b in diese Mikrokanäle 130a, 130b eingeleitet, und in dem einzelnen Vermischungsmikrokanal 131 konvergiert. Das schnell arbeitende Ventil 132, welches durch eine piezoelektrische Vorrichtung angetrieben wird, ist auf halbem Wege zu dem Flüssigkeit einleitenden Mikrokanal 130a für die Einleitung der Flüssigkeit A vorgesehen. Das schnell arbeitende Ventil öffnet und schließt sich, um die Einleitung der Flüssigkeit A von dem Flüssigkeit einleitenden Mikrokanal 130a in den Vermischungsmikrokanal 131 zu steuern. Die Steuerung durch das schnell arbeitende Ventil 132 wendet Variationen auf die Einflussmenge der Flüssigkeit A an, wodurch beispielsweise das Mischungsverhältnis zwischen der Flüssigkeit A und der Flüssigkeit B, die in den Vermischungsmikrokanal 131 geliefert werden, gesteuert wird.
  • Das schnell arbeitende Ventil umfasst einen Teil des Flüssigkeit einleitenden Mikrokanals 130a, wie in 11 (ein Querschnitt in der Axialrichtung des Flüssigkeit einleitenden Mikrokanals 130a) und 12 gezeigt. Dieser Teil ist ein Ventilelement 133, das aus einem Polydimethylsiloxan-(PDMS)-Film hergestellt ist, und eine Dicke von 20μm und eine Breite von 300μm besitzt. In dem gleichen Kanal ist ein Vorsprung 134 in der Nähe des Ventilelements vorgesehen. Ein Indenter bzw. Stempel 135 mit einem Durchmesser in der Größenordnung von 250μm, der das Ventilelement 133 von außen kontaktiert, ist vorgesehen. Dieser Indenter 135 ist angepasst, um durch die piezoelektrische Vorrichtung angetrieben zu werden. Ein Zwischenraum zwischen dem Ventilelement 133 und dem Vorsprung 134 ist ein Mikrospielraum h in der Größenordnung von 10μm. Das Ventilelement 133 wird mit einer hohen Geschwindigkeit aufwärts und abwärts direkt durch die piezoelektrische Vorrichtung angetrieben, die mit einer Ansprechfrequenz von 10 Hz oder mehr anspricht, wodurch dieser Mikrospielraum h geöffnet und geschlossen wird.
  • Die vorteilhaften Funktionen des in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel verwendeten schnell arbeitenden Ventils sind ein Hochgeschwindigkeitsventilöffnungs- und -schließansprechen, und ein geringes Arbeitsvolumen (entsprechend dem Volumen der Flüssigkeit die aus dem Kanal herausgetrieben wird, wenn der Kanal durch die Bewegung des Ventilelements geschlossen wird) während des Öffnens und Schließens. In dieser Verbindung ist es bevorzugt, wie in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel, dass der Vorsprung innerhalb des Kanals eine halbzylindrische Form oder Ähnliches besitzt, so dass das Ventilelement nahezu linear den Vorsprung kontaktiert, und der Hub (h), über den sich hinweg das Ventilelement nach oben und unten bewegt, so gering wie 10μm ist.
  • Ein weiteres schnell arbeitendes Ventil, das in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel verwendbar ist, ist ein Ventil, wie es in einem Tintenstrahldrucker verwendet wird. Beispielsweise kann ein Ventil genutzt werden, welches lokal einen Flüssigkeit einleitenden Mikrokanal durch Wärme erwärmen, um eine Flüssigkeit zu verdampfen, die in dem Flüssigkeit einleitenden Kanal strömt, und ihr Volumen vergrößern kann, wodurch mit hoher Geschwindigkeit der Ausstoß einer konstanten winzigen Strömungsrate von dem Flüssigkeit einleitenden Kanal in einen Vermischungsmikrokanal gesteuert wird.
  • Das Herstellungsverfahren des halbzylindrischen Vorsprungs 134, der in dem schnell arbeitenden Ventil verwendet wird, wird durch Bezugnahme auf die 13 und 14 erläutert. Ein 50μm dicker Filmresist wird auf einem Glassubstrat beschichtet und ein kanalbildendes Muster wird in einem Photolithographieschritt g-line ausgesetzt (ultraviolettes Licht bei einer Wellenlänge von 436 nm), gefolgt von der Entwicklung. Wie in 13 gezeigt, beträgt die Kanalbreite des Flüssigkeit einleitenden Mikrokanals beispielsweise 100μm und ein Linienmuster mit einer Kanalbreite von 100μm wird angewendet, um den Teil senkrecht zu schneiden, wo der halbzylindrische Vorsprung gebildet ist. Wie in 14 gezeigt (Querschnitt genommen entlang der Linie A-A in 13), wird, um das Brückenmuster in die Form eines halbzylindrischen Vorsprungs zu deformieren, das Glassubstrat, das die Resiststrukturbildung durchlaufen hat, in einen thermostatischen Ofen platziert, wo das Glassubstrat für 20 Minuten bei 300°C wärmebehandelt wird. Da sich das Resist bei 250°C oder höher erweicht, deformiert sich seine Kante unter der Oberflächenspannung in eine runde Form, was letztendlich zu einer halbzylindrischen Form führt. Dann wird dieses Substrat einem Trockenätzen-unterzogen. Wenn das Glassubstrat geätzt wird, wird das Resist gleichzeitig geätzt. Infolgedessen kann die Form des Resists unverändert auf das Glassubstrat übertragen werden. Diese Verarbeitung kann unter Verwendung von reaktivem Ionenätzen (RIE = Reactive Ion Etching) ausgeführt werden, jedoch ist ein neutraler Strahlenätzvorgang für eine zufrieden stellende Übertragbarkeit der Form bevorzugt. Auf diese Weise kann eine geeignete Vorsprungsstruktur in dem Flüssigkeit einleitenden Mikrokanal gebildet werden.
  • Der „Hochgeschwindigkeitsöffnungs- und -schließvorgang" des schnell arbeitenden Ventils, das in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel verwendet wird, bezieht sich auf einen Betrieb mit einem Zyklus von ungefähr 10 Hz oder mehr, vorzugsweise 10 Hz bis 20 kHz als Ansprechfrequenz des Ventilelements.
  • Als nächstes wird das Flüssigkeitsvermischungsverfahren des vorliegenden Ausführungsbeispiels mit Bezugnahme auf die 15 bis 21 beschrieben.
  • Wenn die Flüssigkeit A und die Flüssigkeit B in das oben konfigurierte Mikrochip eingeleitet werden sollen, wird das schnell arbeitende Ventil, das auf dem Flüssigkeit einleitenden Mikrokanal für Flüssigkeit A angebracht ist, veranlasst, einen Hochgeschwindigkeitsöffnungs- und -schließvorgang mit konstanten Zyklen auszuführen. Wenn die Variationen auf die Strömungsrate der Flüssigkeit mit kurzen Zeitintervallen angewendet werden, nimmt die Grenzfläche zwischen der Flüssigkeit A und der Flüssigkeit B, die in dem Vermischungsmikrokanal gebildet wird, eine „wellige" Form an, wie sie in dem Vermischungsmikrokanal 31 der 15 dargestellt ist. Die Flüssigkeit A, die hinter dem schnell arbeitenden Ventil eingeleitet wird, kann eine Ausdehnung in der Breitenrichtung des Vermischungsmikrokanals besitzen, die in kurzer Zeit verändert wird. Auf diese Weise erhöht die Flüssigkeit A ihren Kontaktbereich mit der anderen Flüssigkeit B, die in dem Vermischungsmikrokanal konvergieren. Auf diese Weise dehnt sich die Grenzfläche zwischen den beiden Flüssigkeiten aus, was die Diffusion und Vermischung der beiden Flüssigkeiten erleichtert.
  • In der gewohnten Weise ohne die Verwendung eines schnell arbeitenden Ventils wird die Grenzfläche zwischen den beiden Flüssigkeiten nahezu geradlinig in einem Vermischungsmikrokanal gebildet, wie in 28 gezeigt. Beispielsweise sei angenommen, dass eine Einheitslänge in der Strömungsrichtung in einem Kanal mit einer Breie von 200μm genommen, und eine flache Grenzfläche (siehe 28) mit einer welligen Grenzfläche (siehe 15) mit Zyklen von 50μm und einer Breite von 100μm verglichen wird, welche durch die Verwendung des schnell arbeitenden Ventils gebildet wurde. Vorausgesetzt dass die wellige Grenzfläche durch eine Sinuswelle approximiert wird, wird der Oberflächenbereich der welligen Grenzfläche auf das Vierfache der flachen Grenzfläche erhöht.
  • Wie sehr die Vermischungszeit durch die Bildung der Wellen in der Grenzfläche zwischen den beiden Flüssigkeiten verkürzt wird, wird durch ein unten angegebenes Berechnungsmodell gezeigt. In dem Modell der 16, soll die Dauer der Welle L sein. Wenn die Diffusion bis zu ihrer Hälfte voranschreitet, d.h. L/2, wird angenommen, dass die Vermischung vollendet ist, da die Diffusion auf beiden Seiten der Welle beginnend vonstatten geht. Ein Berechnungsmodell für eine ein fache Diffusion, und die Diffusion einer Flüssigkeit betreffend, wird durch die folgende Gleichung beschrieben (D0 = Diffusionskoeffizient [m2/Sek.] (Denaturierungsmittel; 10–10, Wasser; 10–9), t = Zeit [Sek.]):
    Gleichung 1
    Figure 00500001
  • In dem Fall eines Denaturierungsmittels (Diffusionskoeffizient D0 = 10–11) sei beispielsweise angenommen, dass die Dauer L = 2σ derart ausgelegt ist, dass die Vermischung innerhalb von 5 Minuten vollendet ist. Eine Berechnung zu diesem Zweck wird durch die folgende Gleichung dargestellt:
    Gleichung 2
    Figure 00500002
  • Wie oben erwähnt beträgt die Diffusionsentfernung σ 77 [μm]. Dies bedeutet, dass gegeben das Welle-zu-Welle-Intervall von 50 μm, die Vermischung in 5 Minuten vollendet sein kann. Diese Zeit ist für die DGGE-Analyse ausreichend kurz.
  • Die Vorrichtung der 17 kann die Vermischungseffizienz verglichen mit der Vermischungsvorrichtung der 15 weiter erhöhen. Diese Vorrichtung besitzt schnell arbeitende Ventile (Ventil A und Ventil B), die auf zwei Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen für die beiden Flüssigkeiten A und B angebracht sind. Bei spiele eines Betriebszeitdiagramms für das schnell arbeitende Ventil, die für dieses Ausführungsbeispiel bevorzugt sind, sind in den 18 und 19 gezeigt.
  • In der Vorrichtung des zuvor erwähnten Ausführungsbeispiels werden, wie in 18 gezeigt, die Öffnungs- und Schließvorgänge für das Ventil A und das Ventil B synchronisiert, um das Ventil B „geschlossen" zu machen, wenn das Ventil A „offen" ist und umgekehrt das Ventil B „offen" zu machen, wenn das Ventil A „geschlossen" ist. Dadurch kann die Breite der welligen Form, die durch die Flüssigkeit A innerhalb des Vermischungsmikrokanals erzeugt wird, auf die gesamte Breite des Kanals erhöht werden. Darüber hinaus wird die Summe der Strömungsraten der Flüssigkeit A und der Flüssigkeit B stets konstant. Auf diese Weise strömen die Flüssigkeiten innerhalb des Vermischungsmikrokanals mit einer konstanten Strömungsgeschwindigkeit. Folglich können für die Bildung eines Konzentrationsgradienten in dem Vermischungsmikrokanal bevorzugte Steuerungscharakteristika erhalten werden. Das Verfahren zur Bildung eines Konzentrationsgradienten durch die Verwendung des Ausführungsbeispiels 1-2 wird später beschrieben.
  • Mit der Vorrichtung der 17 ist der Oberflächenbereich der Grenzfläche zwischen den beiden Flüssigkeiten zweimal so groß wie in 14, und zwar 8 Mal so groß, wie wenn keine Welle gebildet wird (28). In 18 wird das Öffnen und Schließen der Ventile in einem Vollöffnungs-/Vollschließmodus gesteuert. Das Ventil muss jedoch nicht gesteuert werden, um entweder vollständig geöffnet oder vollständig geschlossen zu sein, sondern kann variabel durch die Verwendung einer piezoelektrischen Vorrichtung und durch Anpassen eines Potentials, das an die piezoelektrische Vorrichtung übertragen wird, gesteuert werden. Beispielsweise kann das Öffnen und Schließen der Ventile gemäß einem in 19 gezeigten Betriebszeitdiagramm ausgeführt werden. Auf alle Fälle ist das Betriebszeitdiagramm nicht auf die oben erwähnten Modi beschränkt, sondern das Öffnen und Schließen der Ventile kann in verschiedenen anderen Modi gesteuert werden.
  • Die Vorrichtung der 20 kann die Vermischungseffizienz weiter erhöhen. In dieser Vorrichtung sind drei Flüssigkeit einleitende Mikrokanäle 130a, 130b und 130c mit einem Vermischungsmikrokanal 131 verbunden. Eine Flüssigkeit A wird von dem Flüssigkeit einleitenden Mikrokanal 130a, der bei einer Mittelposition gelegen ist, in den Vermischungsmikrokanal 131 eingeleitet. Eine Flüssigkeit B wird von den beiden Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen 130b und 130c, die an beiden Seiten des Flüssigkeit einleitenden Mikrokanals 130a gelegen sind, eingeleitet. Schnell arbeitende Ventile (Ventil 1 und Ventil 2) sind auf den beiden Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen 130b und 130c angebracht. Diese Ventile können geöffnet und geschlossen werden, wie in dem Betriebszeitdiagramm der 21 gezeigt, wodurch eine wellige Grenzfläche, wie sie innerhalb des Vermischungsmikrokanals 131 der 20 gezeigt ist, gebildet werden kann. Die Grenzfläche zwischen den beiden Flüssigkeiten (d.h. der gesamte Oberflächenbereich der Wellen) ist zwei Mal so groß wie der in 15. D.h. ein Grenzflächenoberflächenbereich kann erhalten werden, der 16 Mal so groß ist wie der wenn keine Welle gebildet wird (28), so dass eine sehr hohe Effizienz der Flüssigkeitsvermischung erreicht werden kann. Hier ist die Vermischung von zwei Flüssigkeiten, Flüssigkeit A und Flüssigkeit B, dargestellt. Wenn jedoch einer der zwei Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle 130b und 130c zum Einspeisen der Flüssigkeit B für eine Flüssigkeit C verwendet wird, können drei Flüssigkeiten, d.h. A, B und C vorzugsweise in dem Vermischungsmikrokanal 131 vermischt werden.
  • Als nächstes wird das Verfahren zum Steuern der Flüssigkeitseinleitung durch das vorliegende Ausführungsbeispiel mit Bezugnahme auf die 22 bis 25 beschrieben.
  • In einem Verfahren zum Vermischen einer Flüssigkeit A und einer Flüssigkeit B, so dass ein Konzentrationsgradient in einem Vermischungsmikrokanal gebildet wird, können Flüssigkeiten verwendet werden, die ein Solut (z.B. ein Nukleinsäuredenaturierungsmittel) mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, als die Flüssigkeit A und die Flüssigkeit B verwendet werden. Das Gradientenbildungsverfahren kann für diesen Fall durch die Veränderung des Betriebsverfahrens für den Ventilöffnungs- und -schließvorgang in der zuvor beschriebenen Vorrichtung passend gemacht werden. Ein Beispiel des Vermischungsverfahrens zum Bilden eines Konzentrationsgradienten weist das Festsetzen der Frequenz eines schnell arbeitenden Ventils (d.h. das Konstantmachen des Öffnungs- und Schließ zyklus des Ventils) und die variable Steuerung des Verhältnisses der Zeit, während der das Ventil offen bleibt (nämlich die relative Einschaltdauer) zu einem Zyklus, auf.
  • Beispielsweise werden die Betriebe eines Ventils A und eines Ventils B wie in dem Betriebszeitdiagramm der 23 ausgeführt. In diesem Fall kann die wellige Form der Grenzfläche zwischen den beiden Flüssigkeiten mit unterschiedlichen Konzentrationen erzeugt werden, wobei sich die Größe der welligen Form fortschreitend verändert (wie in einem Vermischungsmikrokanal der 22 dargestellt). Dann wird es zugelassen, dass die Ventile für rund 5 Minuten stillstehen. Dadurch findet eine unverzügliche diffusive Vermischung der beiden Flüssigkeiten über die Grenzfläche statt, so dass eine Mischung mit einem bestimmten Konzentrationsgradienten in dem Vermischungsmikrokanal 31 gebildet werden kann.
  • Ein Beispiel eines für ein Vermischungsverfahren zum Bilden eines Konzentrationsgradienten bevorzugten Betriebszeitdiagramms, wird unter Verwendung von 23 beschrieben. Grundsätzlich, wenn das Ventil A „offen" ist, ist das Ventil B „geschlossen", und wenn das Ventil A „geschlossen" ist, ist das Ventil B „offen". In Übereinstimmung mit, diesen Grundbedingungen wird die Dauer eines Zyklus auf beispielsweise 100 ms (Millisekunden) eingestellt. In dem ersten Zyklus wird das Ventil A für 90 ms „offen" gehalten. In dem nächsten, zweiten Zyklus wird das Ventil A für 80 ms „offen" gehalten. In dem folgenden, dritten Zyklus wird das Ventil A für 70 ms „offen" gehalten. Auf diese Art und Weise wird die Zeit, die das Ventil A in einem Zyklus offen bleibt, schrittweise verkürzt. Infolgedessen wird ein Konzentrationsgradient, in dem die Konzentration schrittweise in einer primär linearen Form in Strömungsrichtung (von der linken Seite zu der rechten Seite in der Zeichnung) zunimmt, in dem Vermischungsmikrokanal erhalten.
  • Die diffusive Vermischung schreitet selbst in dem oben beschriebenen Modus in ausreichender Weise voran. Gemäß der Vorrichtung und dem Verfahren, die in 24 und 25 gezeigt sind, wird die diffusive Vermischung weiter verbessert. In diesem Modus ist eine Zeit T1, in der das Ventil A „offen" ist, feststehend, während eine Zeit T2, in der das Ventil A „geschlossen" ist, variiert wird. T1 wird vorzugsweise eingestellt, um in der Größenordnung der kürzesten Pulsdauer zu liegen, in der das schnell arbeitende Ventil agieren kann. Wenn beispielsweise die Ansprechfrequenz des Ventils 1 kHz beträgt, wird T1 auf 5 ms eingestellt, welches ein Vielfaches der Minimalbetriebszeit von 1 ms ist. Wenn ein Konzentrationsgradient wie in 22 gebildet werden soll, sollte T2 eingestellt werden, um schrittweise länger zu werden. Dadurch ist die Grenzfläche zwischen der Flüssigkeit A und der Flüssigkeit B größer als die in 22. Auf diese Weise schreitet die diffusive Vermischung schneller voran und die Vermischung ist in einer kürzeren Zeit vollendet.
  • Die vorangehende Erklärung zeigt ein Beispiel, in dem die beiden Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle in einem Vermischungsmikrokanal zur Flüssigkeitseinspeisung konvergieren. Es ist jedoch möglich, die Vermischungsbestandteile in Stufen bzw. Schritten zu kombinieren, wodurch eine Mulitplizität von Vermischungen ausgeführt wird, wie in 26 gezeigt. In diesem Fall können die an verschiedenen Stellen eingeleiteten Flüssigkeiten selbstverständlich von unterschiedlichen Arten sein. Wie in 27 gezeigt, können darüber hinaus zahlreiche (zwei oder mehr) Flüssigkeit einleitende Mikrokanäle (vier Flüssigkeit einleitende Mikrokanäle in der Zeichnung) in einem einzelnen Schritt in einem Vermischungskanal eingeleitet werden, um die Vermischung auszuführen.
  • Ausführungsbeispiel 1-3 (30 bis 35)
  • Das Vermischungsförderungsmittel der Vorrichtung gemäß dem vorliegenden Ausführungsbeispiel betrifft die Form eines Vermischungsmikrokanals. Das Vermischungsförderungsmittel ist ein Vermischungsabteil, das durch geringeres Auslegen der Kanalhöhe des Vermischungsmikrokanals als seiner Kanalbreite gebildet wird.
  • Die Vorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels, gezeigt in 30, umfasst zwei Flüssigkeit einleitende Mikrokanäle 207 und 208 zum Einleiten von zu vermischenden Flüssigkeiten, einen Vorvermischungsmikrokanal 234, der sich aus zwei Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen zusammensetzt, die in einer vertikalen Richtung gestapelt und zusammen kombiniert sind, und ein Vermischungs abteil 230, das mit dem Vorvermischungsmikrokanal verbunden ist. Der Vorvermischungsmikrokanal 234 und das Vermischungsabteil 230 bilden einen Vermischungsmikrokanal.
  • In der Vorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels werden die zu vermischenden Flüssigkeiten von den Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen 207 und 208 eingeleitet, in der vertikalen Richtung übereinanderliegend konvergiert, und in den Vorvermischungsmikrokanal 234 eingeleitet, der mit den Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen verbunden ist. Die konvergierenden Flüssigkeiten werden von dort in das Vermischungsabteil 230, das mit dem Vorvermischungsmikrokanal verbunden ist, eingeleitet. In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel, werden die Flüssigkeiten, die durch die engen Kanäle, d.h. die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle und den Vorvermischungsmikrokanal, hindurch gegangen sind, in das Vermischungsabteil 230, das eine flache Form besitzt, eingeleitet. Auf diese Weise wird der Bereich der Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten erhöht, wodurch die Vermischung der mehreren Flüssigkeiten verbessert wird.
  • In der Vorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels können die. Speicher 205, 206 mit den Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen 207, 208 stromaufwärts von den Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen 207, 208 verbunden sein. In diesem Fall werden zwei Arten von Flüssigkeiten an die Speicher 205, 206 geliefert. Die Lieferung der Flüssigkeiten kann durch irgendein allgemein bekanntes Verfahren ausgeführt werden, und kann beispielsweise durch eine mechanische oder elektrische Antriebskraft ausgeführt werden. Konkret kann die Lieferung durch Anpassen der Strömungsraten der Flüssigkeiten durch die Verwendung einer Flüssigkeitseinspeisungspumpe oder einen Ventils ausgeführt werden. Beispielsweise können die Strömungsraten der Flüssigkeiten durch Steuern der elektroosmotischen Strömung durch Anpassen einer Spannung, die zwischen die Speicher angelegt, oder ein Potential das an die Speicher angelegt wird, angepasst werden, oder durch Steuern einer Flüssigkeitseinspeisungspumpe durch Anpassen des Drucks der Flüssigkeitseinspeisung durch Verwendung einer Mikrospritze oder Ähnlichem.
  • In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel sind die zu vermischenden Flüssigkeiten von zwei Arten. Die beiden Arten wirken jedoch nicht beschränkend und die zu vermischenden Flüssigkeiten sind von zwei oder mehr Arten. In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel beträgt jedoch die Zahl der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle zwei, aber sie ist nicht darauf beschränkt, und kann 2 oder mehr betragen.
  • In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel bezieht sich die Kanalhöhe auf eine Kanaldimension in einer Richtung die senkrecht zu einer Flüssigkeitsgrenzfläche ist, die durch den Kontakt einer Vielzahl von Flüssigkeiten gebildet wird. Die Kanalbreite bezieht sich auf eine Kanaldimension in einer Richtung parallel zu der Flüssigkeitsgrenzfläche und senkrecht zu der Strömungsrichtung ist. In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel ist es möglich, den Vorvermischungsmikrokanal 234 derart zu konstruieren, dass seine Kanalbreite 500 μm und seine Kanalhöhe 100 μm beträgt, sowie das Vermischungsabteil 230 derart, dass seine Kanalbreite (an der Stelle der maximalen Kanalbreite) 10 mm und seine Kanalhöhe 5 μm beträgt.
  • Der Vermischungsvorgang der Flüssigkeiten gemäß dem vorliegenden Ausführungsbeispiel wird detaillierter beschrieben. In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel ist zunächst die Strömung der Flüssigkeiten in dem Flüssigkeit einleitenden Mikrokanal und dem Vorvermischungsmikrokanal im Wesentlichen eine Laminarströmung, da die Breiten des Flüssigkeit einleitenden Mikrokanals und des Vorvermischungsmikrokanals gering sind. Diese Tendenz ist bemerkenswerter, wenn die Strömungsraten der Flüssigkeiten, die durch die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle strömen, niedrig sind. Infolgedessen tritt in dem Vorvermischungsmikrokanal die Vermischung nur bei der Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten auf, aber der Bereich der Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten ist so gering, dass die Vermischung der Flüssigkeiten minimal auftritt. Wenn die konvergierenden Flüssigkeiten aus dem Vorvermischungsmikrokanal in das Vermischungsabteil fließen ist andererseits der Bereich der Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten in dem Vermischungsabteil so groß, dass die zu vermischenden Flüssigkeiten, in ausreichender Weise unverzüglich durch die diffusive Vermischung bei der Grenzfläche vermischt werden.
  • Die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle können direkt mit dem Vermischungsabteil verbunden sein oder der Vorvermischungsmikrokanal kann stromaufwärts von dem Vermischungsabteil vorgesehen sein, wie in dem Ausführungsbeispiel der 30. Es ist jedoch bevorzugt, den Vorvermischungsmikrokanal stromaufwärts von dem Vermischungsabteil vorzusehen, wie in dem Ausführungsbeispiel der 30. Dies deshalb weil wenn die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle direkt mit dem Vermischungsabteil ohne das Vorsehen eines Vorvermischungsmikrokanals verbunden sind, die Kanalbreite deutlich zunimmt, was die Strömung behindert. Wenn eine Vorvermischungskammer stromaufwärts von dem Vermischungsabteil vorgesehen wird, wie in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel, wird die Strömung der einströmenden Flüssigkeiten nicht gestört.
  • Die Mischbarkeit bzw. Vermischbarkeit der Flüssigkeiten in dem Vorvermischungsmikrokanal wird hier untersucht werden. Wenn an eine diffusive Vermischung bei der Grenzfläche gedacht wird, hängt die Mischbarkeit der Flüssigkeiten von dem Verhältnis (S/V) des Bereichs (S) der Grenzfläche zu dem Kanalvolumen (V) pro Einheit der Kanallänge ab. Dieses Verhältnis (S/V) kann als 1/H ausgedrückt werden, wenn die Kanalhöhe N verwendet wird (siehe 31, L; Kanallänge, W; Kanalbreite, H; Kanalhöhe). Auf diese Weise kann gesehen werden, dass die Mischbarkeit der Flüssigkeiten ausschließlich von der Kanalhöhe (H) abhängt.
    Gleichung 3 S/V = 1/H
    • S:
    Bereich der Grenzfläche [μm2]
    V:
    Kanalvolumen [μm3]
    H:
    Kanalhöhe [μm]
  • Angenommen beispielsweise dass die Kanalhöhe jeder Flüssigkeit in dem Vorvermischungsmikrokanal 50 μm beträgt und die Kanalhöhe jeder Flüssigkeit in dem Vermischungsabteil 2,5 μm ist. In diesem Fall beträgt das Verhältnis (S/V) des Bereichs (S) der Grenzfläche zu dem Kanalvolumen (V) 1/50 (μm–1) für den Vorvermischungsmikrokanal und 1/2,5 (μm–1) für das Vermischungsabteil. Folglich ist das Vermischen ungefähr 20 Mal leichter in dem Vermischungsabteil als in dem Vorvermischungsmikrokanal.
  • In der Vorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels wird veranlasst, dass die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle in der Höhenrichtung der Kanäle konvergieren. Der Grund dafür ist, dass die Konvergenz in der Höhenrichtung der Kanäle zu einer ausreichend breiten Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten in dem Vermischungsabteil führt, was zu der unverzüglichen Vermischung der Flüssigkeiten führt. Wenn verursacht wird, dass die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle in der Kanalbreitenrichtung konvergieren (32), ist andererseits der Bereich der Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten in Bezug auf das Kanalvolumen gering, was es erschwert, die Flüssigkeiten unverzüglich zu vermischen. Die Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels lässt die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle konvergieren und stapelt sie in der vertikalen Richtung und verbindet sie in diesem Zustand mit dem Vorvermischungsmikrokanal und dem Vermischungsabteil.
  • Als nächstes wird die Vermischungszeit in dem Vermischungsabteil untersucht werden. Im Allgemeinen kann die Diffusion von Flüssigkeiten durch eine Gleichung einer einfachen Diffusion beschrieben werden.
    Gleichung 4
    Figure 00580001
    • D0:
    Diffusionskoeffizient [m2/Sek]
    t:
    Zeit [Sek]
    σ:
    Diffusionsstrecke [m]
  • Diese Gleichung bedeutet, dass wenn zwei Flüssigkeiten mit einem Diffusi onskoeffizienten D0 (m2/Sek) in Kontakt gebracht werden, sie mit bis zu σ (m) in einer Zeit t (Sek) diffundieren und sich miteinander vermischen.
  • Wenn der Diffusionskoeffizient D0 eines Denaturierungsmittels 10–11 beträgt, ist die Diffusionsstrecke σ nach 5 Sekunden 10 μm. Auf diese Weise kann, wenn die Kanalhöhe 20 μm oder weniger beträgt, die Vermischung theoretisch in 5 Sekunden vollendet sein. Eigentlich schreitet die Diffusion einer oberen Flüssigkeit und einer unteren Flüssigkeit von oben und von unten in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel voran. Auf diese Weise kann, sofern die Kanalhöhe des Vermischungsabteils L ist, wenn die Diffusion bis zu einer Hälfte davon, d.h. L/2, abläuft, die Vermischung als nahezu vollendet erachtet werden. Wenn die Vermischung in 5 Sekunden. vollendet sein soll, kann die Kanalhöhe dafür ausgelegt werden, um 10 μm zu betragen. Für den Fall dass eine Mikrochip-DGGE durchgeführt werden soll, ist die Vermischungszeit von 5 Sekunden ausreichend kurz, so dass die Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels als eine für die Mikochip-DGGE bevorzugte Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung angesehen werden kann.
  • Basierend auf den obigen Untersuchungen, kann erkannt werden, dass eine geringe Kanalhöhe zu einer verkürzten Vermischungszeit führen kann. Wenn jedoch die Kanalbreite ähnlich klein wie die Kanalhöhe ist, ist die Strömungsrate zu gering, um zu praktischem Gebrauch in der gewerblichen Wirtschaft gebracht zu werden. Um Flüssigkeiten mit hoher Geschwindigkeit einzuspeisen und die Vermischungszeit zu verkürzen, ist es daher bevorzugt, die Kanalbreite größer zu machen als die Kanalhöhe.
  • 33 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel. Die Vorrichtung dieses Ausführungsbeispiels umfasst zwei Flüssigkeit einleitende Mikrokanäle 207 und 208 zum Einleiten von zu vermischenden Flüssigkeiten, einen Vorvermischungsmikrokanal 234, der sich aus zwei Kanälen zusammensetzt, die in einer vertikalen Rich tung gestapelt und konvergierend gemacht sind, einen Verbindungsteil 235 zum Verbinden des Vorvermischungsmikrokanal und eines Vermischungsabteils, und ein Vermischungsabteil 230, das mit dem Verbindungsteil verbunden ist. In der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels, sind der Vorvermischungsmikrokanal und das Vermischungsabteil gemeinsam durch einen konvergierenden Teil 235 mit einer flachen Neigung verbunden.
  • Es ist bevorzugt, dass der Vorvermischungsmikrokanal und das Vermischungsabteil mit einer flachen Neigung verbunden sind, wie in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel. Der Grund dafür ist, dass wenn der Vorvermischungsmikrokanal und das Vermischungsabteil mit einer sanften Neigung verbunden sind, kein Stagnations- bzw. Stockungsbereich in der Stelle der Konvergenz des Vorvermischungsmikrokanals und des Vermischungsabteils auftritt, und es gibt keine Verwirbelungen der Flüssigkeiten in der Mitte des Kanals. Auf diese Weise wird die Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten nicht gestört, und die Flüssigkeiten können in der Strömungsabfolge vermischt und aus dem Vermischungsabteil entnommen werden (34a). Wenn der Verbindungsteil nicht schrittweise auffächert tritt andererseits ein Stockungsbereich auf, und ein Wirbel tritt dort auf. Infolgedessen verweilen, selbst wenn eine Vielzahl von Flüssigkeiten simultan von den Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen hereingeströmt wird, die Flüssigkeiten in dem Stockungsbereich. Auf diese Weise kommen die Flüssigkeiten, die mit haargenau festgestellter Genauigkeit vermischt werden sollten, bei dem Vermischungsabteil an, wobei eine Flüssigkeit vor der anderen Flüssigkeit antrifft, und sie werden mit einiger Verspätung vermischt. Dies wirft Schwierigkeiten beim Bilden eines präzisen Konzentrationsgradienten (34b) auf. Insbesondere für die Mikrochip-DGGE, für die die Bildung eines exakten Konzentrationsgradienten wünschenswert ist, ist die Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels bevorzugt.
  • In dem Ausführungsbeispiel der 33 ist es möglich, beispielsweise den Vorvermischungsmikrokanal 234 derart auszulegen, dass seine Kanalbreite 500 μm und seine Kanalhöhe 100 μm beträgt, den Verbindungsteil 235 derart, dass seine Kanallänge in der Strömungsrichtung 15 mm beträgt, und das Vermi schungsabteil 230 derart, dass seine Kanalbreite 10 mm und seine Kanalhöhe 5 μm beträgt.
  • 35 zeigt noch ein weiteres Ausführungsbeispiel. Die Vorrichtung dieses Ausführungsbeispiels umfasst zwei Flüssigkeit einleitende Mikrokanäle 207 und 208 zum Einleiten von zu vermischenden Flüssigkeiten, sowie einen Vermischungsmikrokanal (Vermischungsabteil 230), in dem die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle konvergieren. In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel konvergieren die zu vermischenden Flüssigkeiten über die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle 207 und 208 und das Vermischungsabteil 230 ist derart ausgelegt, dass der Bereich der Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten nach der Konvergenz zunimmt.
  • In dem Ausführungsbeispiel der 35 kann beispielsweise das Vermischungsabteil derart ausgelegt sein, dass seine Kanalhöhe 20 μm und seine Kanalbreite 100 μm beträgt. Die Vorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels muss nicht durch Laminieren bzw. Beschichten zweier Substrate erzeugt werden, sondern kann aus Glas durch Trockenätzen erzeugt werden. Im Detail kann die Vorrichtung durch Ausführen von ICP-Ätzen (ICP = Inductively Coupled Plasma) mit der Verwendung eines Ni-Sputterfilms als Maske bzw. Schablone verarbeitet werden.
  • Ausführungsbeispiel 1-4 (36 bis 43)
  • Das Vermischungsförderungsmittel der Vorrichtung gemäß dem vorliegenden Ausführungsbeispiel bezieht sich auf die Form eines Vermischungsabschnitts oder konvergierenden Teils, wo sich die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle mit einem Vorvermischungsmikrokanal verbinden, die Anordnung der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle usw. Im Detail besitzt jeder der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle eine Vielzahl von Verzweigungen, und das Vermischungsförderungsmittel definiert einen Vermischungsabschnitt, wo die Verzweigungen in einem Vorvermischungsmikrokanal konvergieren. Bei dem Vermischungsabschnitt ist die Vielzahl der Verzweigungen dreidimensional mit dem Vorvermischungsmikrokanal in einer solchen Art und Weise verbunden, dass die Verzweigungen abwechselnd zueinander angeordnet sind.
  • Der technische Hintergrund dieses Ausführungsbeispiels wird beschrieben.
  • Das vorliegende Ausführungsbeispiel basiert auf der folgenden Entdeckung: Kanäle sind für zwei oder mehr zu vermischende Flüssigkeiten in Bruchstücke zerlegt, und die in Bruchstücke zerlegten Kanäle sind abwechselnd aufgrund der Konvergenzart in einer ineinander verschachtelten Art und Weise verbunden. Dadurch werden viele Arten von Flüssigkeiten in Schichten angeordnet und innerhalb der Kanäle geströmt. Dieser Ablauf erleichtert es, den Kontaktbereich zwischen den Flüssigkeiten zu erhöhen und die Diffusion zwischen den Flüssigkeiten zu verbessern. Weitere Studien führten zu der Erkenntnis der folgenden Probleme:
    • (1) Wenn die Anzahl der Flüssigkeitseinlässe zu den Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen einer für jede Flüssigkeit ist, ist eine Struktur notwendig, in der der Kanal für jede Flüssigkeit verzweigt wird und die Verzweigungen wieder konvergieren, um das vorliegende Ausführungsbeispiel zu verwirklichen. Die Bildung dieser Struktur in einer Schicht eines zweidimensionalen Chips ist nicht einfach. Diese Struktur erfordert eine geometrische Anordnung, wie beispielsweise eine dreidimensionale Kreuzung. Die Herstellung einer derartigen dreidimensionalen Struktur durch Lithographie und Ätzen erfordert das Ätzen an der Vorder- und Rückseite eines Chips oder die Bildung von Opferschichten, was den Herstellungsprozess kompliziert macht.
    • (2) Bei dem Prozess der Herstellung der Mikrokanäle, die die Breite in der Größenordnung von 100 μm besitzen, durch Lithographie und Ätzen, führen die rechteckigen Ecken bzw. Winkel des Vermischungsabschnitts zu einem Ansteigen des Druckverlusts während der Flüssigkeitseinspeisung.
    • (3) Als ein Verfahren zum Einleiten von Flüssigkeiten ist es möglich, eine Vielzahl von Einlässen gemäß der Anzahl der Verzweigungen vorzusehen, ohne eine Struktur zu übernehmen, in der die Verzweigungen von einem Flüssigkeit einleitenden Mikrokanal weg führen. Gemäß dieser Struktur kann ein Vermischungsmikrokanal in einer Schicht eines zweidimensionalen Chips gebildet werden. In diesem Fall werden jedoch die Mechanismen oder Verfahren zur Flüssigkeitseinleitung stromaufwärts von dem Chip, oder in einer Vorbereitungsstufe, kompliziert.
    • (4) In Verbindung mit einer Vorrichtung mit einer Vielzahl von Einlässen, wie oben beschrieben, wurde bisher kein Verfahren zum freien Steuern des Konzentrationsverhältnisses zwischen vermischten Flüssigkeiten in dem Vermischungsmikrokanal ermittelt. Bei einer Mikrochipelektrophoresevorrichtung zum Ausführen der DGGE erfordert beispielsweise die Bildung eines Nukleinsäuredenaturierungsgradienten mit Genauigkeit und hoher Reproduzierbarkeit, die genaue Steuerung des Konzentrationsgradienten.
  • Das vorliegende Ausführungsbeispiel bezieht sich auf eine Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung, die die oben beschriebenen Probleme löst. Ferner sieht das vorliegende Ausführungsbeispiel eine Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung mit Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen, die mit einer Vielzahl von Einlässen vorgesehen sind, vor, wobei die Vorrichtung imstande ist, unverzüglich Reagenslösungen in einem Mikrokanal zu vermischen und einen Konzentrationsgradienten in einer Strömungsrichtung in zufrieden stellender Weise zu steuern.
  • 36 zeigt die schematische Konfiguration der Vorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels als Seitenansichten (36(a), 36(c)), eine Vorderansicht (36(b)) und als Schnittansichten (36(d)). Diese Vorrichtung ist ein Mikrochip, das zwei Flüssigkeit einleitende Mikrokanäle 330 zum Einleiten von Flüssigkeiten, sowie einen Vermischungsmikrokanal 331 aufweist, mit dem die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle 330 verbunden sind. Flüssigkeiten treten durch die zwei Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle 330 ein (linke Seite in 36), konvergieren im Inneren und vermischen sich in einem Vermischungsmikrokanal 331. Jeder der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle 330 besitzt zwei Verzweigungen 330a, die in eine Kammform zerlegt sind, und diese beiden Verzweigungen sind mit dem Vermischungsmikrokanal 331 von oben und von unten verbunden (diese Verbindungsrichtung wird als eine Konvergenzrichtung Y bezeichnet). In einem Vermischungsabschnitt oder konvergierenden Teil, wo die Verzweigungen mit dem Vermischungsmikrokanal verbunden sind, wie durch einen Querschnitt DD und einen Querschnitt EE in 36(d) ist die Verzweigungsrichtung X der Verzweigungen 330a nahezu senkrecht zu der Konvergenzrichtung Y, wodurch eine kammförmige Anordnung gebildet wird. Diese Verzweigungen 330a werden zusammengeschlossen, um dreidimensional miteinander in Eingriff zu stehen, wodurch sie in einem einzelnen Vermischungsmikrokanal konvergieren. Die Flüssigkeiten, die über den Vermischungsabschnitt dieser Form konvergieren, können unverzüglich und gleichmäßig sogar in dem Mikrokanal vermischt werden.
  • 37 zeigt die schematische Konfiguration der Vorrichtung der 36 durch perspektivische Ansichten etc. Diese Vorrichtung kann durch Laminieren von Substraten, in denen vorbestimmte Kanäle gebildet wurden, hergestellt werden. Dieses Ausführungsbeispiel besitzt eine Struktur mit einem Zwischensubstrat und zwei zusammenlaminierten Substraten. Die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle 330 und ihre Verzweigungen 330a, ebenso wie der Vermischungsmikrokanal 331, sind jeweils auf einem Substrat gebildet. Das Zwischensubstrat hat darauf den Vermischungsmikrokanal 331 geformt (ein Substrat des Querschnitts BB in 36(d)). Die beiden Substrate (Substrate der Querschnitte AA und CC in 36(d)) mit darauf gebildeten Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen werden von oben und von unten mit dem Zwischensubstrat in der Mitte laminiert, und ein Substrat, das als eine Abdeckung dient, wird ferner laminiert. Dieses Verfahren bildet eine Schichtstruktur, wobei die Substrate in der Konvergenzrichtung Y, also in einer Richtung, die nahezu senkrecht zu der Verzweigungsrichtung X ist, gestapelt. Die Vielzahl der Verzweigungen 330a ist auf fast der gleichen Ebene wie der eine Flüssigkeit einleitende Mikrokanal vorgesehen. Derartig konvergierte Verzweigungen können als eine kammförmige Struktur bezeichnet werden.
  • In 38 werden die gleichen Kanalstrukturen wie in der Vorrichtung der 36 in der Verzweigungsrichtung X (einer Richtung nahezu senkrecht zu der Konvergenzrichtung Y) laminiert. In diesem Ausführungsbeispiel wird eine Schichtstruktur, die die Substrate für die sich ergebenden Verzweigungen besitzt, gebildet.
  • 39 stellt ein Merkmal dar, in dem eine kurvenförmige bzw. gekrümmte Form auf die Struktur des Vermischungsabschnitts in den Querschnitten FF und GG der 36 und in 38 angewendet wird. Wie hier zu sehen ist, können die Kanäle bei dem Vermischungsabschnitt als gekrümmt konfiguriert werden. Dadurch kann eine Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung erzeugt werden, bei der ein Druckverlust bei dem Vermischungsabschnitt verringert wird.
  • Das Material für das Substrat kann, wie jeweils angemessen, aus Glas, Quarz, Kunststoffen und Siliconharzen ausgewählt werden. Das zuvor erwähnte Laminat aus vielen Schichten und Strukturen, dessen Vorder- und Rückseite in einer Vielzahl von Schritten verarbeitet wurde, kann durch Lithographie und Ätzen hergestellt werden. Die Vorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels kann jedoch auch durch eine Photolithographietechnologie hergestellt werden und kann derart konstruiert sein, dass ein Druckverlust durch Verarbeiten (Herstellen) der Wandoberfläche jedes Kanals bei dem Vermischungsabschnitt in eine gekrümmte Form (im Allgemeinen eine stromlinienförmige Form) verringert wird.
  • Als nächstes wird ein Ausführungsbeispiel zum effizienten Ausführen der Flüssigkeitseinleitung beschrieben. Dieses Ausführungsbeispiel bezieht sich auf eine Vorrichtung, die Flüssigkeit einleitende Mikrokanäle mit einer Vielzahl von Einlässen aufweist.
  • In der Vorrichtung der 40 sammeln sich Flüssigkeit einleitende Mikrokanäle 330 mit einer Vielzahl von Flüssigkeitseinlässen 330a zum Einleiten von Reagenslösung und sind mit einem Vermischungsmikrokanal 331 verbunden. In dieser Kanalstruktur vom Sammlungstyp ist die Breite der sich ergebenden Raffung der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen 330 die Gleiche wie die Kanalbreite des Vermischungsmikrokanals 331. Eine Gruppe einer Vielzahl von Flüssigkeitseinlässen 330a stimmt mit einer Flüssigkeit einleitenden Mikrokanalgruppe überein, welche die gleiche Flüssigkeit (eine Pufferlösung der gleichen Konzentration oder eine Reagenslösung des gleichen Typs; in 40, eine erste Reagenslösung oder eine zweite Reagenslösung) einspeist. Sie sind in einer regelmäßigen geometrischen Anordnung auf dem Substrat vorgesehen. Beispiele der geometri schen Anordnung sind zweidimensionale Anordnungen, wie beispielsweise geradlinige, bogenförmige Anordnungen wie in 40(a) oder 40(b). Wie in diesen Vorrichtungen sind die geometrischen Anordnungen der Gruppen der Flüssigkeitseinlässe 330a vorzugsweise in Bezug auf den Konvergenzpunkt ähnlich zueinander.
  • In einigen Vorrichtungen des vorliegenden Ausführungsbeispiels sind die Flüssigkeitseinlässe 330a jeweils mit einer Elektrode vorgesehen, und die Flüssigkeit wird durch eine elektroosmotische Strömung angetrieben. In diesem Ausführungsbeispiel kann eine verzweigte Antriebselektrode, wie in 41 vorbereitet werden, und in Übereinstimmung mit einer vorbestimmten geometrischen Anordnung jeder Flüssigkeitseinlassgruppe angebracht werden. 41 zeigt schematisch die Konfiguration der verzweigten Elektrode, die der geradlinigen geometrischen Anordnung entspricht. Durch lösbares Vorsehen einer derartigen verzweigten Elektrode kann die Reagenslösung effizient von einer feststehenden Flüssigkeitseinlassgruppe aus betrieben werden. Beispielsweise wird eine verzweigte Elektrode für eine Vielzahl von Flüssigkeitseinlässen zum Einleiten der gleichen Reagenslösung verwendet, und die Flüssigkeitseinspeisung kann simultan von der Vielzahl der Flüssigkeitseinlässe 330a ausgeführt werden.
  • In der Vorrichtung, die dafür ausgelegt ist, um die Flüssigkeit durch einen Pumpendruck anzutreiben, obwohl nicht dargestellt, ist ein verzweigtes hydraulisches Einleitungsrohr, das mit der geometrischen Anordnung der Flüssigkeitseinlassgruppe für die Flüssigkeit übereinstimmt, derart angebracht, dass der Druck simultan und in gleicher Weise auf alle Flüssigkeitseinlässe angewendet werden kann, und die effiziente Einleitung der Reagenslösung in ähnlicher Weise ausgeführt werden kann. Darüber hinaus ermöglicht es die Anwendung der Vermischungsvorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels auf einen Mikrochip, dass eine Mikrochipvorrichtung ein flaches Profil besitzt. Wie in 42 gezeigt kann eine verzweigte Antriebselektrode, die mit den Positionen der Vielzahl von Flüssigkeitseinlässen 330a übereinstimmt, auf fast der gleichen Ebene wie die Flüssigkeitseinlässe vorgesehen sein.
  • Als nächstes werden Flüssigkeitseinleitungssteuermittel und -verfahren beschrieben, die für das vorliegende Ausführungsbeispiel bevorzugt sind. In dem zuvor erwähnten Ausführungsbeispiel, in dem die gleiche Flüssigkeit durch die Gruppe von Flüssigkeitseinlässen 330a eingeleitet wird, können Pumpen oder elektroosmotische Strömungsantriebsmechanismen stromaufwärts von der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanalgruppe vorgesehen sein. In diesem Fall, wenn die Anzahl der verwendeten Pumpen oder elektroosmotischen Strömungsantriebsmechanismen kleiner ist als die Anzahl der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle zur Einleitung des gleichen Typs an Flüssigkeit ist, kann die Flüssigkeitseinleitung in geeigneter Weise gesteuert werden.
  • 43 zeigt ein Beispiel des Steuermittels zum Antreiben einer elektroosmotischen Strömung. Die gleiche Reagenslösung wird von jedem Flüssigkeit einleitenden Mikrokanal 330 zu einem Vermischungsmikrokanal 331 durch eine elektroosmotische Strömung eingespeist. In den Kanälen, an die eine Leistungsversorgungspotentialdifferenz A-C durch die Schalter angelegt wird, wird die Reagenslösung in Strömungsrichtung eingespeist und in einem geschichteten Zustand gemeinsam mit anderer Reagenslösung zur Vermischung konvergiert. In den Kanälen für die gleiche Reagenslösung wird andererseits eine Leistungslieferpotentialdifferenz B-C durch die Schalter angelegt. In diesen Kanälen kann die Reagenslösung angeordnet werden, um weder in Strömungsrichtung zu strömen, noch rückwärts zu fließen, und zwar durch Einstellen eines geeigneten Potentials B.
  • Durch geeignetes Steuern der AN- und AUS-Positionen dieser vielfachen Schalter kann die effektive Anzahl der Einleitungskanäle zum Einspeisen der gleichen Reagenslösung verändert werden. Infolgedessen kann die Gesamtmenge des Zuflusses der gleichen Reagenslösung in den Vermischungsmikrokanal 331 sukzessive und unabhängig verändert werden. Einfach durch Steuern der Gruppe der Schalter kann die Zuflussmenge jeder Reagenslösung in mehreren Stufen durch eine kleine Anzahl von Energiequellen verändert und die Konzentration der Reagenslösung in dem Vermischungsmikrokanal gesteuert werden. Insbesondere wenn die Gesamtzuflussmenge der beteiligten Reagenslösung sukzessive mit der Strömungsverteilung der Konzentration nach dem Vermischen gesteuert wird, kann sie mit hoher Genauigkeit gesteuert werden.
  • Relais können als die vielfachen Schalter verwendet werden, oder Druckpumpen können anstelle von oder als Unterstützung für die Elektroden vorgesehen sein, um den Druck, der jede Reagenslösung antreibt, zu steuern. Wenn die Druckpumpen vorgesehen sind, können Steuerventile für entsprechende Flüssigkeit einleitende Mikrokanäle vorgesehen sein, und der Antrieb der Steuerventile kann gesteuert werden, um die Strömungsrate jeder Reagenslösung zu variieren.
  • Ausführungsbeispiel 2-1 (44 bis 46)
  • Das Vermischungsförderungsmittel der Vorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels umfasst eine Erwärmungsvorrichtung, die auf einem Flüssigkeit einleitenden Mikrokanal und/oder einem Vermischungsmikrokanal angebracht ist.
  • 44 zeigt die Vorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels. Die Vorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels weist Flüssigkeit einleitende Mikrokanäle 431, 432 zum Einleiten von zu vermischenden Flüssigkeiten, einen Vermischungsmikrokanal 433 mit einem Vermischungsabschnitt oder konvergierenden Teil 430, bei dem die vielfachen Kanäle konvergieren, sowie eine Erwärmungsvorrichtung zum Erwärmen der Flüssigkeiten in dem Vermischungsmikrokanal, auf.
  • In der Vorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels werden die zu vermischenden Flüssigkeiten von den Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen 431, 432 eingeleitet und durch den Vermischungsabschnitt 430 konvergiert. Die konvergenten bzw. zusammenlaufenden Flüssigkeiten werden in den Vermischungsmikrokanal 433, der mit dem Vermischungsabschnitt 430 verbunden ist, eingeleitet und die Flüssigkeiten in dem Vermischungsmikrokanal werden durch die Erwärmungsvorrichtung 435 (z.B. eine Chromstahlerwärmungsvorrichtung oder eine Peltier-Vorrichtung) erwärmt, wodurch die Flüssigkeiten in dem Vermischungsmikrokanal vermischt werden. Gemäß dem vorliegenden Ausführungsbeispiel werden die in dem Vermischungsmikrokanal konvergenten Flüssigkeiten durch die Er wärmungsvorrichtung 435 erwärmt. Infolgedessen wird die Temperatur der Flüssigkeiten in dem Vermischungsmikrokanal erhöht, so dass die Brown'sche Bewegung der Solute in den Flüssigkeiten aktiviert wird. Auf diese Weise wird eine molekulare Diffusion gefördert, um eine unverzügliche Vermischung der Vielzahl von Flüssigkeiten zu ermöglichen. Außerdem fördert die Wärmekonvektion aufgrund der Erwärmung die Vermischung der konvergenten Flüssigkeiten.
  • Die Lieferung der Flüssigkeiten kann durch irgendein allgemein bekanntes Verfahren erfolgen, beispielsweise durch eine mechanische oder elektrische Antriebskraft. Konkret kann die Lieferung der Flüssigkeiten durch Anpassen der Strömungsraten der Flüssigkeiten durch die Verwendung einer Flüssigkeitseinspeisungspumpe oder eines -ventils verändert werden. Beispielsweise können die Strömungsraten der Flüssigkeiten durch die Steuerung einer elektroosmotischen Strömung durch Anpassen einer Spannung, die zwischen die Speicher angelegt wird, oder der Potentiale, die an die Speicher angelegt werden, oder durch die Steuerung einer Flüssigkeitseinspeisungspumpe durch Anpassen des Drucks der Flüssigkeitseinspeisung durch die Verwendung einer Mikrospritze oder Ähnlichem, angepasst werden.
  • In der Vorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels sind die zu vermischenden Flüssigkeiten von zwei Arten. Die zwei Arten sind jedoch nicht beschränkend, und die zu vermischenden Flüssigkeiten können von zwei oder mehr Arten sein. Darüber hinaus beträgt die Anzahl der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel zwei, aber sie ist nicht darauf beschränkt, und kann 2 oder mehr betragen.
  • 45 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel. Die Vorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels weist Flüssigkeit einleitende Mikrokanäle 441, 442, einen Vermischungsmikrokanal 443 mit einem Vermischungsabschnitt oder konvergierenden Teil 40, wo die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle 441 und 442 konvergieren, und eine Erwärmungsvorrichtung 445, die auf der Unterseite des Vermischungsmikrokanal 443 zur Erwärmung des Mikrokanals 443 angebracht ist, auf. Gemäß dem vorliegenden Ausführungsbeispiel werden die zu vermischenden Flüssigkeiten in einem vertikal gestapelten Zustand durch den Vermischungsabschnitt 440 konvergiert. Die konvergenten Flüssigkeiten werden in den Vermischungsmikrokanal 443 eingeleitet, der mit dem Vermischungsabschnitt 440 verbunden ist, und die Flüssigkeiten in dem Vermischungsmikrokanal 443 werden von der Unterseite des Vermischungsmikrokanals 443 durch die auf der Unterseite des Vermischungsmikrokanals 443 angebrachte Erwärmungsvorrichtung 445 erwärmt. Auf diese Weise wird die Vermischung der Flüssigkeiten in dem Vermischungsmikrokanal gefördert. In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel werden die konvergenten Flüssigkeiten durch die Erwärmungsvorrichtung 445 erwärmt. Infolgedessen wird die Temperatur der Flüssigkeit, die in einem niedrigeren Teil des Vermischungsmikrokanals gelegen ist, erhöht, wodurch eine Wärmekonvektion in dem Kanal 443 auftritt. Auf diese Weise wird ein diffusiver Effekt durch die vertikale Konvektion verbessert, so dass die Vermischung der konvergenten Flüssigkeiten gefördert wird. Der Anstieg der molekularen Diffusion durch die Erwärmung verbessert außerdem die Vermischung der konvergenten Flüssigkeiten.
  • 46 zeigt noch ein weiteres Ausführungsbeispiel. Die Vorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels weist Flüssigkeit einleitende Mikrokanäle 451, 452, einen Vermischungsmikrokanal 453 mit einem Vermischungsabschnitt oder konvergierenden Teils 459, bei dem die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle 451 und 452 konvergieren, und eine Erwärmungsvorrichtung 455 zum Erwärmen des Flüssigkeit einleitenden Mikrokanals 452 auf. Gemäß dem vorliegenden Ausführungsbeispiel wird die Lösung in dem Flüssigkeit einleitenden Mikrokanal 452 durch die Erwärmungsvorrichtung 455 erwärmt, und die unerwärmte Flüssigkeit in dem Kanal 451 und die erwärmte Flüssigkeit in dem Kanal 452 werden bei dem Vermischungsabschnitt 450 konvergiert, während sie in vertikaler Richtung gestapelt sind, wobei die erwärmte und hochtemperaturige Flüssigkeit in dem Kanal 452 in der unteren Schicht angeordnet ist. Die konvergenten Flüssigkeiten werden in den Vermischungsmikrokanal 453 eingeleitet, der mit dem Vermischungsabschnitt 450 verbunden ist. Auf diese Weise wird die Vermischung der Flüssigkeiten in dem Vermischungsmikrokanal gefördert. In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel wird die Flüssigkeit, obwohl sie in dem Kanal 452 durch die Erwärmungsvorrichtung 455 erwärmt wird, bei dem Vermischungsabschnitt 450 konvergiert, während sie unter die unerwärmte Flüssigkeit in dem Kanal 451 angeordnet wird. Auf diese Weise neigt die Flüssigkeit, die erwärmt wurde, dazu, sich nach oben zu bewegen, wodurch die Wärmekonvektion in dem Kanal 453 verursacht wird. Infolgedessen wird ein diffusiver Effekt durch vertikale Konvektion gefördert, um die Vermischung der konvergenten Flüssigkeiten zu fördern. Der Anstieg in der molekularen Diffusion durch die Erwärmung fördert zudem die Vermischung der konvergenten Flüssigkeiten.
  • In dem Fall der Erwärmung des Flüssigkeit einleitenden Mikrokanals durch die Erwärmungsvorrichtung wie in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel, werden die Flüssigkeiten in den Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen konvergiert, während sie vertikal gestapelt sind, wobei die hochtemperaturige Flüssigkeit in der unteren Schicht des Stapels angeordnet ist. Die in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel verwendbare Erwärmungsvorrichtung kann aus sämtlichen allgemein bekannten Erwärmungsgeräten ausgewählt werden. Beispielsweise können eine Chromstahlerwärmungsvorrichtung oder eine Peltier-Vorrichtung verwendet werden. Die Anbringungsposition der Erwärmungsvorrichtung kann irgendeine Position sein, die es ermöglicht, dass die Flüssigkeit in dem Kanal erwärmt wird. Beispielsweise kann die Erwärmungsvorrichtung auf der Wandoberfläche des Kanals angebracht werden. Alternativ muss die Zahl der Erwärmungsvorrichtungen nicht eins sein, sondern es können mehrere sein.
  • Ausführungsbeispiel 2-2 (47 bis 53)
  • Das Vermischungsförderungsmittel der Vorrichtung gemäß dem vorliegenden Ausführungsbeispiel ist ein mechanisches Vermischungs- und/oder Rührmittel zum Stören der Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten, die in dem Vermischungsmikrokanal konvergieren. Ein erster Typ des mechanischen Vermischungs- und/oder Rührmittels ist ein Vibrationsgerät, eine sich anhebende bzw. Hebeoberfläche, ein Drehkörper oder ein Oszillator, der in oder nahe dem Bereich angebracht ist, wo die Flüssigkeiten in dem Vermischungsmikrokanal konvergieren. Ein zweiter Typ des mechanischen Vermischungs- und/oder Rührmittels ist ein Vibrationsgerät, das nicht nur in dem Konvergenzbereich in dem Vermischungsmikrokanal angebracht ist, sondern auch auf der Innenwandoberfläche oder der Außenwandoberfläche des Vermischungsmikrokanals in Strömungsrichtung von dem Konvergenzbereich.
  • 47 bis 50 zeigen ein Ausführungsbeispiel, das den ersten Typ des mechanischen Vermischungs- und/oder Rührmittels aufweist. In der Vorrichtung der 47 ist ein Vibrationsgerät 510 bei dem Konvergenzbereich angebracht. Diese Vorrichtung umfasst einen ersten Speicher 505, der mit einer ersten Flüssigkeit gefüllt ist, einen zweiten Speicher 506, der mit einer zweiten Flüssigkeit gefüllt ist, einen ersten Kanal 507 (Flüssigkeit einleitender Mikrokanal), der von dem ersten Speicher 505 weg führt, einen zweiten Kanal 508 (Flüssigkeit einleitender Mikrokanal) der von dem zweiten Speicher 506 weg führt, einen dritten Kanal 509 (Vermischungsmikrokanal), der mit dem ersten Kanal 507 und dem zweiten Kanal 508 verbunden ist, und ein Vibrationsgerät 510, das auf der Wandoberfläche des dritten Kanals 509 angebracht ist. Das Vibrationsgerät 510 ist mit einer Leistungsquelle und einem Antriebssteuermittel (nicht gezeigt) verbunden. Die erste Flüssigkeit wird von dem ersten Speicher 505 in den dritten Kanal 509 durch den ersten Kanal 507 eingeleitet, und die zweite Flüssigkeit wird von dem zweiten Speicher 506 in den dritten Kanal 509 durch den zweiten Kanal 507 eingeleitet.
  • Im Allgemeinen wird, wenn die beiden Flüssigkeiten in einem Mikrokanal konvergieren, eine Laminarströmung gebildet, und eine Grenzfläche in Kontakt mit den beiden Flüssigkeiten wird stabil aufrechterhalten. In einem derartigen Fall ist es bekannt, dass die Vermischung aufgrund von Diffusion nicht in ausreichender Weise stattfindet, und diese Flüssigkeiten strömen, während sie in zwei Schichten unterteilt sind. Wenn bei dieser Gelegenheit der Strömung in dem Vermischungsabschnitt durch das Vibrationsgerät 510 (einem oder mehreren Vibrationsgeräten), das auf der Wandoberfläche des Kanals oder bei einer Stelle sehr dicht an der Außenseite der Wandoberfläche, eine geeignete Schwankung bzw. Fluktuation mitgegeben wird, wird eine Instabilität an der Grenzfläche verursacht, die durch die beiden Flüssigkeiten gebildet wird, oder die Struktur der Grenzfläche kann durch einen Wirbel (Wirbelstärke) zerstört werden, der durch die zuvor erwähnte Hebeoberfläche oder die innerhalb eines Negativdruckbereichs erzeugte Aushöh lung erzeugt wird. Auf diese Weise können die beiden Flüssigkeiten unverzüglich und gleichmäßig vermischt werden.
  • In der Vorrichtung eines weiteren Ausführungsbeispiels, das in 48 gezeigt ist, ist eine Hebeoberfläche 511 bei der Konvergenzstelle angebracht. Diese Vorrichtung umfasst einen ersten Speicher 505, der mit einer ersten Flüssigkeit gefüllt ist, einen zweiten Speicher 506, der mit einer zweiten Flüssigkeit gefüllt ist, einen ersten Kanal 507, der von dem ersten Speicher 505 weg führt, einen zweiten Kanal 508, der von dem zweiten Speicher 506 weg führt, einen dritten Kanal 509, der mit dem ersten Kanal 507 und dem zweiten Kanal 508 verbunden ist, sowie die Hebeoberfläche 511, die an den Konvergenzbereich des dritten Kanals 509 angebracht ist. Die Hebeoberfläche 511 ist mit einer Leistungsquelle und einem Antriebssteuerungsmittel (nicht gezeigt) verbunden. Die erste Flüssigkeit wird von dem ersten Speicher 505 in den dritten Kanal 509 durch den ersten Kanal 507 eingeleitet, und die zweite Flüssigkeit wird von dem zweiten Speicher 506 in den dritten Kanal 509 durch den zweiten Kanal 507 eingeleitet. Wenn bei dieser Gelegenheit variierende Komponenten, soweit erforderlich, durch die Hebeoberfläche 511, die an dem Konvergenzbereich angebracht ist, mit einer Frequenz mitgegeben werden, die eine Instabilität der Grenzfläche hervorruft, wird eine Instabilität an der durch die beiden Flüssigkeiten gebildeten Grenzfläche verursacht, mit dem Ergebnis, dass der Bereich der Grenzfläche, auf dem sich die beiden Flüssigkeiten kontaktieren, erhöht werden kann, oder die Struktur der Grenzfläche kann zerstört werden, oder eine Aushöhlung kann in den Flüssigkeiten erzeugt werden. Auf diese Weise können die beiden Flüssigkeiten mit einer hohen Geschwindigkeit und gleichmäßig vermischt werden.
  • In der Vorrichtung eines weiteren Ausführungsbeispiels, das in 49 gezeigt ist, ist ein Drehkörper bei der Konvergenzstelle angebracht. Diese Vorrichtung umfasst einen ersten Speicher 505, der mit einer ersten Flüssigkeit gefüllt ist, einen zweiten Speicher 506, der mit einer zweiten Flüssigkeit gefüllt ist, einen ersten Kanal 507, der von dem ersten Speicher 505 weg führt, einen zweiten Kanal 508, der von dem zweiten Speicher 506 weg führt, einen dritten Kanal 509, der mit dem ersten Kanal 507 und dem zweiten Kanal 508 verbunden ist, sowie den Drehkörper 512, der innerhalb des dritten Kanals 509 angebracht ist. Der Drehkörper 512 ist mit einer Leistungsquelle und einem Antriebssteuerungsmittel (nicht gezeigt) verbunden. Die erste Flüssigkeit wird von dem ersten Speicher 505 in den dritten Kanal 509 durch den ersten Kanal 507 eingeleitet, und die zweite Flüssigkeit wird von dem zweiten Speicher 506 in den dritten Kanal 509 durch den zweiten Kanal 507 eingeleitet. Wenn bei dieser Gelegenheit variierende Komponenten, soweit erforderlich, durch den Drehkörper 512 (oder eine Reihe von mehreren Drehkörpern), der innerhalb des Kanals 509 angebracht ist, mitgegeben wird, wird eine Instabilität an der durch die beiden Flüssigkeiten gebildeten Grenzfläche verursacht. Infolgedessen kann der Bereich der Grenzfläche, auf dem sich die beiden Flüssigkeiten kontaktieren, erhöht werden, oder die Struktur der Grenzfläche kann zerstört werden, oder eine Aushöhlung kann in den Flüssigkeiten erzeugt werden. Auf diese Weise können die beiden Flüssigkeiten mit einer hohen Geschwindigkeit und gleichmäßig vermischt werden.
  • In der Vorrichtung noch eines weiteren Ausführungsbeispiels, das in 50 gezeigt ist; ist ein Oszillator 513 bei der Konvergenzstelle angebracht. Diese Vorrichtung umfasst einen ersten Speicher 505, der mit einer ersten Flüssigkeit gefüllt ist, einen zweiten Speicher 506, der mit einer zweiten Flüssigkeit gefüllt ist, einen ersten Kanal 507, der von dem ersten Speicher 505 weg führt, einen zweiten Kanal 508, der von dem zweiten Speicher 506 weg führt, einen dritten Kanal 509, der mit dem ersten Kanal 507 und dem zweiten Kanal 508 verbunden ist, sowie den Oszillator 513, der innerhalb des dritten Kanals 509 angebracht ist. Der Oszillator 513 ist mit einer Leistungsquelle und einem Antriebssteuerungsmittel (nicht gezeigt) verbunden. Die erste Flüssigkeit wird von dem ersten Speicher 505 in den dritten Kanal 509 durch den ersten Kanal 507 eingeleitet, und die zweite Flüssigkeit wird von dem zweiten Speicher 506 in den dritten Kanal 509 durch den zweiten Kanal 507 eingeleitet. Wenn bei dieser Gelegenheit variierende Komponenten, soweit erforderlich, durch den Oszillator 513 (oder eine Reihe von mehreren Oszillatoren), der innerhalb des Kanals angebracht ist, mitgegeben wird, wird eine Instabilität an der durch die beiden Flüssigkeiten gebildeten Grenzfläche verursacht. Infolgedessen kann der Bereich der Grenzfläche, auf dem sich die beiden Flüssigkeiten kontaktieren, erhöht werden, oder die Struktur der Grenzfläche kann zer stört werden, oder eine Aushöhlung kann in den Flüssigkeiten erzeugt werden. Auf diese Weise können die beiden Flüssigkeiten mit einer hohen Geschwindigkeit und gleichmäßig vermischt werden.
  • Gemäß jedem der obigen Ausführungsbeispiele können die erste Flüssigkeit und die zweite Flüssigkeit unverzüglich mit einem beliebigen Verhältnis in dem dritten Kanal 509 vermischt werden. Wenn die erste Flüssigkeit und die zweite Flüssigkeit mit unterschiedlichen Konzentrationen verwendet werden, kann ein Konzentrationsgradientenbereich in dem dritten Kanal 509 durch kontinuierliches Verändern des Mischungsverhältnisses gebildet werden.
  • 51 bis 53 zeigen ein Ausführungsbeispiel der Vorrichtung mit dem zweiten Typ des mechanischen Vermischungs- und/oder Rührmittels. Dieser Typ der Vorrichtung umfasst eine Vielzahl von Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen, einen Vermischungsmikrokanal, wo die Vielzahl von Flüssigkeit einleitenden. Mikrokanälen konvergiert, und ein Vibrationsgerät, um die Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten in dem Vermischungsmikrokanal instabil zu machen. Dieses Ausführungsbeispiel ist dadurch gekennzeichnet, dass das Vibrationsgerät (vorzugsweise eine Vielzahl von Vibrationsgeräten) ebenfalls auf einer Strömungsrichtungsseite des Vermischungskanals vorgesehen ist, und eine Förderung der Vermischung nach der Einleitung der Flüssigkeiten in den Vermischungsmikrokanal ausgeführt wird. Konkret werden die zu vermischenden Flüssigkeiten derart eingeleitet, dass die Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten beibehalten wird. Dann wird die Einleitung der Flüssigkeiten angehalten, wonach die Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten durch das obige Vibrationsgerät instabil gemacht wird, um die Flüssigkeiten zu vermischen. Wenn ein Konzentrationsgradient gebildet werden soll, wird die Konvergenz der Flüssigkeiten derart vervollständigt, dass das Volumenverhältnis der beiden Flüssigkeiten kontinuierlich in der Strömungsrichtung des Vermischungsmikrokanals verändert wird. Dann wird die Vibration angetrieben, wobei der Ausgang und die Antriebszeit des Vibrationsgeräts gesteuert werden.
  • Die beiden Flüssigkeiten werden eingeleitet, wobei das Verhältnis zwischen den Strömungsraten von den Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen verändert wird, wodurch verschiedene geometrische Muster innerhalb des Vermischungsmikrokanals gebildet werden können (z.B. kann die Strömungsratensteuerung gemäß den Ausführungsbeispielen 1-1 und 1-2 angewendet werden). 51 zeigt die Formen der beiden Flüssigkeiten, die in dem Vermischungsmikrokanal erzeugt werden. Die zu vermischenden Flüssigkeiten 635, 636 werden von einer Vielzahl von Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen in einen Vermischungsmikrokanal 633 durch einen Konvergenzbereich eingeleitet. Wie in Verbindung mit dem technischen Hintergrund beschrieben, schreitet die Vermischung in dem Mikrokanal minimal voran. Auf diese Weise neigen die Flüssigkeiten dazu, in einem Zustand gehalten zu werden, in dem die Grenzfläche aufrechterhalten wird. Wenn die Flüssigkeiten eingeleitet werden, wobei das Verhältnis zwischen den beiden Flüssigkeiten verändert wird, können die Flüssigkeiten derart eingeleitet werden, dass das Verhältnis zwischen den beiden Flüssigkeiten kontinuierlich in der Längsrichtung des Kanals variiert (51(a) und 51(b)). Alternativ können die Flüssigkeiten derart eingeleitet werden, dass die beiden Flüssigkeiten abwechselnd eingeleitet werden und ihr Verhältnis in der Längsrichtung des Kanals verändert wird (51(c)): Darüber hinaus können die Flüssigkeiten einfach so eingeleitet werden, dass der Kanal in der Längsrichtung durch die beiden Flüssigkeiten zweigeteilt ist (51(d)). Um einen kontinuierlichen Konzentrationsgradienten zu bilden ist es erwünscht, dass die Grenzflächen stabil aufrechterhalten werden, so dass sich das Volumenverhältnis der Flüssigkeiten kontinuierlich in der Längsrichtung des Kanals verändert.
  • 52 zeigt einen Prozess, in dem die beiden Flüssigkeiten, die in einen Vermischungsmikrokanal 633 gemäß der Form der 51 eingeleitet werden, unter Verwendung einer Vielzahl von Vibrationsgeräten, die auf der Wandoberfläche des Vermischungsmikrokanals 633 angebracht sind, vermischt werden, um einen Konzentrationsgradienten zu bilden. Die Vielzahl von Vibrationsgeräten ist entlang der Wandoberfläche des Vermischungsmikrokanals 633 angebracht. Wie oben beschrieben, werden die Flüssigkeiten 635, 636 in den Vermischungsmikrokanal eingeleitet, wobei die Grenzfläche aufrechterhalten wird (51(c), 52(a)). Dann werden die Vibrationsgeräte 637 angetrieben, um variierende Komponenten, soweit erforderlich, mit einer Frequenz weiterzugeben, die die Instabili tät der Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten 635 und 636 hervorruft, wodurch die Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten instabil gemacht werden kann. Beim Antreiben der Vibratoren wird der Bereich der Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten erhöht oder die Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten wird zerstört, oder eine Aushöhlung kann innerhalb der Flüssigkeiten erzeugt werden, wodurch die Flüssigkeiten unverzüglich und gleichmäßig vermischt werden können. Die beiden Flüssigkeiten, die eingeleitet wurden um ein geeignetes Volumenverhältnis aufrechtzuerhalten, werden miteinander in der Längsrichtung des Kanals durch Antreiben des Vibrationsgeräts vermischt. Infolgedessen kann ein Konzentrationsgradient, der in der Strömungsrichtung des Kanals gleichmäßig und kontinuierlich ist, gebildet werden (52(b)).
  • 53 zeigt eine Art und Weise, in welcher zwei Flüssigkeiten, die in den Vermischungsmikrokanal der 51 eingeleitet werden, vermischt werden. Zunächst werden die Flüssigkeiten 635, 636 in den Vermischungsmikrokanal eingeleitet, wobei die Grenzfläche aufrechterhalten wird (51(a)). Dann wird das Vibrationsgerät 637, das an dem Ende des Vermischungsmikrokanals angebracht ist, angetrieben, um die variierenden Komponenten, soweit erforderlich, mit einer Frequenz weiterzugeben, die die Instabilität der Grenzfläche hervorruft, wodurch die Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten instabil gemacht wird. Infolgedessen wird der Bereich der Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten erhöht, oder die Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten zerstört, oder eine Aushöhlung kann innerhalb der Flüssigkeiten erzeugt werden, wodurch die Flüssigkeiten unverzüglich und gleichmäßig vermischt werden können (53(b)). Konkret werden die Flüssigkeiten 635, 636 eingeleitet, wobei ihr Volumenverhältnis verändert wird und zwar so dass die Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten stabil aufrechterhalten wird, damit nach dem Vermischen das Mischungsverhältnis der beiden Flüssigkeiten kontinuierlich in der Strömungsrichtung innerhalb des Kanals verändert wird. Außerdem wird das Vibrationsgerät angetrieben, wobei seine Leistung und die Antriebszeit gesteuert werden, wodurch ein Konzentrationsgradient, wie in 53(b)) gezeigt, gebildet werden kann.
  • Als Verfahren und Vorrichtung zum Einleiten der zu vermischenden Flüssigkeiten können irgendwelche allgemein bekannten Verfahren und Vorrichtungen verwendet werden. Bespiele dafür sind ein Verfahren zum Steuern der Strömungsrate durch eine Pumpe, um zwei Flüssigkeiten mit einem beliebigen Verhältnis einzuleiten, ein Verfahren zum Steuern der Öffnungs- und Schließzeit eines Ventils, um das Verhältnis der zu vermischenden Flüssigkeiten zu verändern, ein Verfahren zum Steuern eines angelegten Potentials in einem elektroosmotischen Strömungsantriebsmodus, um Flüssigkeiten einzuleiten, und das Verfahren von Seki et al. (siehe M. Yamada und M. Seki, Proc. IEEE des 16. Internationalen Symposiums über Mikrolelektromechanische Systeme (MEMS = Micro Electro Mechanical Systems), 2003, S. 347–350, 2003). Das Verfahren und die Vorrichtung zum Einleiten der zu vermischenden Flüssigkeiten sind erwünschter Weise diejenigen, die die Flüssigkeiten derart einleiten können, dass das Volumenverhältnis der Flüssigkeiten verändert wird, und die Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten stabil aufrechterhalten wird, so dass nach dem Vermischen der Flüssigkeiten, das Mischungsverhältnis der Flüssigkeiten in der Längsrichtung des Kanals kontinuierlich wird.
  • Das in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel verwendete Vibrationsgerät und das Verfahren zum Antreiben von diesem können irgendwelche allgemein bekannten Mittel und Verfahren sein. Beispiele dafür sind Verfahren, die eine piezoelektrische Vorrichtung, einen elektrostatischen Betätiger, ein Formgedächtniseffektbewegungselement, einen elektromagnetischen Betätiger, und ein elektrodynamisches Polymermaterial verwenden. Die in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel verwendeten Flüssigkeiten sind von zwei Arten, aber sie sind nicht darauf beschränkt, und sie können von zwei oder mehr Arten sein. Die Anzahl der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle des vorliegenden Ausführungsbeispiels beträgt zwei, aber dies ist nicht beschränkend, und die Anzahl kann zwei oder mehr betragen.
  • Die Anbringungsposition des Vibrationsgeräts kann irgendeine Position sein, die es möglich macht, die Grenzfläche der Flüssigkeiten in dem Vermischungsmikrokanal zu schwingen bzw. zu vibrieren. Beispielsweise können die Vibrationsgeräte auf der Wandoberfläche des Vermischungsmikrokanals angebracht sein (52), oder das Vibrationsgerät kann an dem Ende des Vermischungsmikrokanals angebracht sein (53). Alternativ können die Vibrationsgeräte an beiden Seiten der Wandoberfläche und beiden Enden des Vermischungsmikrokanals angebracht sein. Darüber hinaus kann das Vibrationsgerät bei einer Position entfernt von dem Kanal vorgesehen sein, wenn die Vibration des Vibrationsgeräts auf die Zielflüssigkeiten in dem Kanal in einer solchen Art und Weise übertragen werden kann, dass ein Ultraschallwellenvibrationsgerät einen anderen Körper durch eine Art von Flüssigkeit vibrieren kann. Darüber hinaus ist die Anzahl der angebrachten Vibrationsgeräte nicht auf eines beschränkt, sondern es können mehrere sein.
  • Ausführungsbeispiel 1-2 (54 bis 58)
  • Das Vermischungsförderungsmittel der Vorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels ist eine Anzahl von Nano- bis Mikronstrukturen, die in oder nahe einem Bereich verteilt sind, wo die Flüssigkeiten in dem Vermischungsmikrokanal konvergieren.
  • Die Grundkonfiguration der Vorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels weist zwei oder mehr Flüssigkeit einleitende Mikrokanäle zum Einleiten von Flüssigkeiten, sowie einen Vermischungsmikrokanal, der durch die Verbindung dieser Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle gebildet ist, auf. Viele Nano- bis Mikronstrukturen sind in dem Vermischungsmikrokanal angeordnet. Flüssigkeiten, die von den Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen eingeleitet und konvergiert werden, werden in Kontakt mit der Gruppe von Nano- bis Mikronstrukturen in dem Vermischungsmikrokanal gebracht, und ihre Vermischung wird dadurch verbessert. Wenn eine Mikrochipelektrophoresevorrichtung als ein Beispiel genommen wird, sind die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle Mikrokanäle zum Einleiten von Pufferlösungen und/oder Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungen, und der Vermischungsmikrokanal ist ein Kanal der einen Konzentrationsgradientenbildungsbereich darstellt. Ein Ausführungsbeispiel der Mikrochipelektrophoresevorrichtung wird unten beschrieben.
  • Die Vorrichtung der 54 besitzt Nano- bis Mikronstrukturen, die als ein Vermischungsförderungsmittel in einem Gradientenbereichskanal 709 (Vermischungsmikrokanal) vorgesehen sind. Wie in dieser Zeichnung gezeigt, sind ein erster Kanal 707 (Flüssigkeit einleitender Mikrokanal) und ein zweiter Kanal 708 (Flüssigkeit einleitender Mikrokanal) zum Einleiten von Flüssigkeiten bei einem gemeinsamen Vermischungsabschnitt oder konvergierenden Teil 730 verbunden, und in einem Denaturierungsgradientenbildungsteil 2 mit einem Mikrokanal 709 verbunden. Nano- bis Mikronstrukturen 731, die kleiner als die Kanalbreite des Mikrokanals 709 sind, sind in Strömungsrichtung von und in der Nähe des Vermischungsabschnitts 730 vorgesehen. Diese Nano- bis Mikronstrukturen 731 sind derart vorgesehen, dass winzige Strukturen mit gleicher Beabstandung in einer geometrischen Anordnung vorgesehen sind, und vorzugsweise die Strukturen der entsprechenden Reihen bei einer gestapelten Position so angeordnet sind, dass sie die Strömung der Flüssigkeiten behindern. Die von dem ersten Kanal 707 und dem zweiten Kanal 708 eingeleiteten Flüssigkeiten konvergieren gemeinsam bei dem Vermischungsabschnitt 730 und fließen dann in Schichten. Wenn sie jedoch durch die Nano- bis Mikronstrukturen 731 hindurchgehen, ist ihre Grenzfläche einer diffusiven Einwirkung aufgrund eines Wirbels ausgesetzt. Auf diese Weise werden die beiden Flüssigkeiten in zufrieden stellender Weise vermischt, und fließen dann in dem Kanal 709 nach unten (in der Richtung eines Pfeils).
  • 55 zeigt ein Ausführungsbeispiel mit einer Verteilung von Säulenstrukturen als den Nano- bis Mikronstrukturen 731. Diese säulenartigen Strukturen können so aufgebaut sein, dass sie eine Achse parallel zu der Grenzfläche zwischen den zu vermischenden Flüssigkeiten und senkrecht zu der Strömungsrichtung besitzen. Sie können Zylinder sein, wie in 55(a), oder dreieckige Prismen, wie in 55(b). Die Form der Nano- bis Mikronstrukturen 731 ist nicht beschränkt und irgendeine Form kann angewendet werden, wenn sie die Trennung der Strömung von der Seitenwand während ihres Durchlaufens verursacht und ein unverzügliches Vermischen durch die diffusive Wirkung des getrennten Wirbels ermöglicht. Wenn eine Nukleinsäurenprobe von der stromaufwärtigen Seite strömt, wird ihr Strom mit den säulenartigen Strukturen verschränkt, so dass die Trennung der Nukleinsäuren basierend auf dem Molekulargewicht ausgeführt werden kann.
  • 56 zeigt ein Ausführungsbeispiel, in dem als Nano- bis Mikronstrukturen 731, Nuten oder Hohlräume, die in einer regelmäßigen geometrischen Form angeordnet sind, in der Wandoberfläche des Mikrokanals 709 stromabwärts von einem Vermischungsabschnitt oder konvergierenden Teil 730 vorgesehen sind. Die Flüssigkeiten, die bei dem Vermischungsabschnitt 730 konvergiert sind, bilden den Sekundärstrom in der Breitenrichtung des Kanals entlang jeder Nut oder Hohlraums, wenn sie durch die Nano- bis Mikronstrukturen 731 hindurchgehen. Darüber hinaus tritt ein Abschälungs- bzw. Ablösungswirbel von Kanten der Nuten auf, der eine diffusive Wirkung erzeugt, was eine unverzügliche Vermischung zulässt.
  • Die Nano- bis Mikronstrukturen 731 können eine maschen- bzw. siebförmige Nut sein, die nicht parallel zu der Strömungsrichtung ist, wie in 57, oder viele unverbundene Nute oder Hohlräume, wie in 58. Wie in diesen Zeichnungen gezeigt, besitzen die Nano- bis Mikronstrukturen 731 die oben erwähnte Nutanordnung jeweils auf einer unteren Oberfläche 709a und einer oberen Oberfläche 709b des Mikrokanals 709. Derartige Nano- bis Mikronstrukturen 731 können unter Verwendung einer allgemein bekannten Herstellungstechnologie hergestellt werden, wie beispielsweise einer Photolithographietechnologie.
  • Verfahren zur Herstellung der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung
  • Die Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung der vorliegenden Erfindung wird durch ein gewöhnliches Verfahren zur Mikrochipherstellung, das in dem betroffenen technischen Gebiet gut bekannt ist, hergestellt.
  • Die Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung der vorliegenden Erfindung setzt sich normalerweise aus zwei Substraten zusammen, aber kann sich auch aus einem Substrat zusammensetzen. Wenn ein Mikrochip durch zwei Substrate konstituiert wird, werden Kanäle mit einer Breite und einer Tiefe in der Größenordnung von 10 bis 100 μm in einem Substrat durch die Verwendung einer Mikrostruktur herstellungstechnologie gebildet, wie beispielsweise einer Photolithographietechnik, und Löcher für Speicher werden in einem anderen Substrat durch die Verwendung einer Verarbeitungstechnik, wie beispielsweise eine Ultraschallverarbeitung erzeugt. Wenn diese beiden Substrate durch eine Bondungstechnik, wie beispielsweise einem thermischen Bonden, laminiert werden, wird ein Mikrochip erhalten, der die Kanäle und Speicher bei vorbestimmten Positionen besitzt.
  • Die Abmessungen (Breite und Tiefe) der Mikrokanäle werden basierend auf notwendigen Anforderungen und erreichbarer Verarbeitungsgenauigkeit bestimmt. Wenn sie größer als ein Analyt (z.B. eine Doppelstrangnukleinsäure) sind, besteht eine zulässige Größe von bis zu 1 mm. Die Abmessung des „Mikrokanals", die auf die vorliegende Erfindung anwendbar ist, ist im Allgemeinen 1 nm bis 1.000 μm, vorzugsweise 1 μm bis 500 μm, und noch bevorzugter 10 μm bis 100 μm, angesichts der vorhandenen Verarbeitungsgenauigkeit.
  • Als Verarbeitung des Substrats kann nicht nur Nassätzen, sondern auch Trockenätzen oder Sandstrahlen in Übereinstimmung mit der Musterbreite und -tiefe verwendet werden. Natürlich ist eine Maske nicht auf eine Photoresistmaske beschränkt, und eine Metallmaske. aus Ni oder Cr kann verwendet werden. Beispielsweise kann der Mikrokanal durch Strukturierung der Resistmaske durch eine Photolithographietechnik gebildet werden, sowie dann Ausführen eines Trockenätzens mit einer 10%-Verdünnung von HF. Teile unterschiedlicher Tiefe können in dem Kanal durch Ausführen eines Strukturierungsschritts und eines Ätzschritts eine Vielzahl von Malen unter Verwendung unterschiedlicher Masken gebildet werden.
  • Das Material für das Substrat kann aus Glas, Quartz, Pyrex (eingetragenes Warenzeichen), Kunststoff, Silikon, Harz und Metall je nach Verwendung und Herstellungsverfahren ausgewählt werden. Beispielsweise kann das Schichten bzw. Laminieren von Glassubstraten durch Tröpfeln einer auf 1 % verdünnten HF-Lösung auf die Oberflächen des zu bondenden Glases, ausgerichtetem Überlagern der beiden Substrate, und Zulassen, dass sie sich für 60 Stunden bei einem Druck von 70 kPa befinden, ausgeführt werden. Als Bonden kann thermales Bon den oder direktes Bonden unter Verwendung von Bestrahlung mit einem Strahl innerhalb einer Vakuumvorrichtung verwendet werden.
  • Im Fall von Kunststoff kann Spritzgießen, Formübertragung, Nanoaufdrucken und Nanostanzen für die Erstellung eines Mikrochips verwendet werden. Dieses Material besitzt geringe Kosten und ist geeignet für die Massenproduktion und Wegwerfprodukte.
  • Verwendungen der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung
  • Die Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung der vorliegenden Erfindung kann in irgendeiner Vorrichtung verwendet werden, die die Vermischung einer geringen Menge von Flüssigkeit erfordert. Beispielsweise kann die vorliegende Erfindung für Mikrototalanalysensysteme (μTAS) für chemische Analysen oder biochemische Analysen verwendet werden, wie beispielsweise analytische Mikrochips, und kann eine Hochgeschwindigkeitsvermischung von winzigen Mengen an Flüssigkeiten in diesen Vorrichtungen durchführen. Wenn sie auf Mikroreaktoren für chemische Synthesen, angewendet wird; ermöglicht die vorliegende Erfindung Anwendungen auf feine Chemikalien, was bis dato unerreichbar war, durch eine Reaktion im Becherglas, wie beispielsweise eine Unterdrückung einer Zwischenreaktion durch Hinzufügen eines Soforterwärmungs- und/oder Kühlmechanismus.
  • Ein Beispiel der Verwendung als ein Mikroreaktor ist eine Vorrichtung, die nur ein einfach substituiertes Produkt mit hoher Ausbeute durch die Friedel-Crafts-Reaktion durch Vermischen einer aromatischen Verbindung und Kohlenstoff-Kationen mit hoher Reaktionsaktivität erhält. Bei einer herkömmlichen Reaktion im Becherglas, wenn Trimethoxybenzen und Iminium-Kationen vermischt werden, beträgt die Substitutionsrate des Trimethoxybenzens 80% oder weniger, die Ausbeute des erwünschten einfach substituierten Produkts beträgt 40% oder weniger, und die Ausbeute des zweifach substituierten Produkts als einem Nebenprodukt beträgt 30% oder mehr. Gemäß einem Mikroreaktor, auf den die vorliegende Erfindung angewendet wird, kann andererseits eine hocheffiziente und unverzügliche Vermischung der Reaktionsstoffe erreicht werden. Auf diese Weise beträgt die Trimethoxybenzensubstitutionsrate 90% oder mehr, die Ausbeute des einfach substituierten Produkts beträgt 90% oder mehr, und die Ausbeute des zweifach substituierten Produkts beträgt 5% oder weniger, was bedeutet, dass nur das erwünschte Reaktionsprodukt selektiv hergestellt werden kann. Infolgedessen können die Mengen der erforderlichen Ausgangsstoffe und der Reaktionsreagenzien, um die gleiche Ausbeute zu erhalten, verringert werden.
  • Eine Mikrochipelektrophoresevorrichtung kann als eine weitere Verwendung benannt werden, auf die die vorliegende Erfindung angewendet werden kann. Elektrophorese auf einem Mikrochip besitzt verschiedene Vorteile, so dass eine Probe und ein Reagens, die verwendet werden, in sehr geringen Mengen vorhanden sein können; die Reaktionszeit und die Analysezeit verkürzt werden; die Reaktions- und Prozessbearbeitungszeit verkürzt werden, um die Reaktionseffizienz und die Produktausbeute zu erhöhen; eine Abfall- bzw. Ausscheidungsflüssigkeit gibt es in kleinen Mengen; und die Erfindung ist geeignet für eine Analyse mit hohem Durchsatz. Eine Mikrochipelektrophoresevorrichtung, die für die DGGE nützlich ist, kann vorgesehen werden, insbesondere durch Verwenden der Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung und des -verfahrens der vorliegenden Erfindung zum Vermischen von Pufferlösungen, um einen Denaturierungsgradienten zu bilden.
  • [Vorrichtung und Verfahren zum Separieren eines Analyts]
  • Eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Separieren eines Analyts durch Verwendung einer DGGE wird beschrieben werden.
  • Ausführungsbeispiel A die DGGE betreffend
  • In Ausführungsbeispiel A wird ein Denaturierungsgradient gebildet, der kontinuierlich in Richtung der Elektrophorese verändert wird.
  • Die Mikrochipelektrophoresevorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels weist zumindest zwei Flüssigkeit einleitende Mikrokanäle zum Einleiten von Pufferlösungen, die ein Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen aufweisen, und einen Vermischungsmikrokanal auf, mit dem zumindest zwei Flüssigkeit einleitende Mikrokanäle verbunden sind, und einen Konzentrationsgra dientenbereich des Denaturierungsmittels wird durch die Konvergenz in dem Vermischungsmikrokanal der Pufferlösungen, die mit verschiedenen Verhältnissen von den Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen eingeleitet werden, gebildet.
  • Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel besitzt ein Vermischungsförderungsmittel zum Fördern der Vermischung von Pufferlösungen, die in dem Vermischungsmikrokanal konvergieren. Als dieses Vermischungsförderungsmittel kann jedes der zuvor erwähnten Ausführungsbeispiele 1-1 bis 2-3 und irgendeine Kombination von diesen Ausführungsbeispielen angewendet werden.
  • Mikrochipelektrophoresevorrichtung des Ausführungsbeispiels A
  • 59a, 59b, 59c und 59d zeigen schematisch die Grundstruktur einer Mikrochipelektrophoresevorrichtung. Das Grundkonzept des vorliegenden Ausführungsbeispiels wird mit Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben werden.
  • 59a umfasst einen Denaturierungsgradientenbildungsteil 802 und einen Elektrophoreseteil 804 auf einem Mikrochip 801. Der Denaturierungsgradientenbildungsteil 802 ist mit einem Gradientenbereichskanal 809 des Elektrophoreseteils 804 verbunden, und eine Elektrophoresepufferlösung, die ein Denaturierungsmittel enthält, wird von dem Denaturierungsgradientenbildungsteil 802 an den Gradientenbereichskanal 809 geliefert. Der Elektrophoreseteil 804 umfasst den Gradientenbereichskanal 809 und einen Probeneinleitungsteil 803, der mit einer stromabwärtigen Seite des Gradientenbereichskanals 809 verbunden ist. In allgemeiner Weise werden Pufferlösungen, die das Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, mit variierenden Verhältnissen in dem Gradientenbildungsbereich 802 vermischt. Eine Pufferzone mit dem so erhaltenen Denaturierungsgradienten wird sequentiell von der stromaufwärtigen Seite des Gradientenbereichskanals 809 zu dem Elektrophoreseteil 804 eingeleitet, der auf der stromabwärtigen Seite des Gradientenbereichskanals 809 gelegen ist.
  • Der Probeneinleitungsteil 803 ist in dem Elektrophoreseteil 804 vorgesehen. Eine Nukleinsäurenprobe, wie beispielsweise gereinigte DNA (im Folgenden als eine DNA-Probe bezeichnet) wird von dem Probeneinleitungsteil 803 in den Gradientenbereichskanal 809 des Elektrophoreseteils 804 eingeleitet. Wenn die DNA-Probe in den Denaturierungsgradientenbereich innerhalb des Kanals 809 eingeleitet wird, werden Doppelstrang-DNAs in der DNA-Probe getrennt, und zwar basierend auf einem Unterschied in der Basensequenz.
  • Die Mikrochipelektrophoresevorrichtung der 59b umfasst einen Denaturierungsgradientenbildungsteil 802, einen Probeneinleitungsteil 803, und einen Elektrophoreseteil 804 auf einem Mikrochip 801. In dem Elektrophoreseteil 804 ist der Probeneinleitungsteil 803 mit einem Gradientenbereichskanal 809 verbunden, während er den Gradientenbereichskanal 809 kreuzt. Da der Probeneinleitungsteil 803 mit dem Gradientenbereichskanal 809 in dieser Form verbunden ist, kann eine DNA-Probe von außerhalb des Bereichs des Elektrophoreseteils 804 (d.h. von einem Probeneinleitungskanal getrennt von dem Gradientenbereichskanal 809) eingeleitet werden, was den Ablauf der Probeneinleitung erleichtert.
  • Die Mikrochipelektrophoresevorrichtung der 59c und 59d umfassen jeweils einen Denaturierungsgradientenbildungsteil 802, einen Probeneinleitungsteil 803, und einen Elektrophoreseteil 804 auf einem Mikrochip 801. Der Denaturierungsgradientenbildungsteil 802 umfasst den Elektrophoreseteil 804, und auf diese Weise dient der Denaturierungsgradientenbildungsteil 802 gleichzeitig als Elektrophoreseteil 804. Da der Denaturierungsgradientenbildungsteil 802 gleichzeitig als der Elektrophoreseteil 804 dient, kann der Mikrochip verkleinert werden. Darüber hinaus muss ein Denaturierungsgradientenbereich, der durch den Denaturierungsgradienten 802 gebildet wird, nicht zu dem Elektrophoreseteil 804 bewegt werden.
  • Als nächstes wird jeder konstituierende Teil des oben beschriebenen Ausführungsbeispiels beschrieben.
  • Zur Vereinfachung der Erklärung wird eine Beschreibung eines Ausführungsbeispiels angeboten, das eine Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung und eine Denaturierungsmittel freie Pufferlösung (hierin einfach als ein Puffer bezeichnet) als Pufferlösungen verwendet, die ein Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten.
  • In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel spielt es keine Rolle, ob eine der Pufferlösungen das Denaturierungsmittel enthält oder frei von dem Denaturierungsmittel ist. Was von Bedeutung ist, ist ein relativer Denaturierungsmittelkonzentrationsunterschied zwischen den Pufferlösungen. Beispielsweise wird der gleiche Effekt erhalten, wenn die „Denaturierungsmittel freie Pufferlösung" eine relativ geringe Konzentration des Denaturierungsmittels enthält, und die „Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung" eine signifikant höhere Konzentration des Denaturierungsmittels als die „Denaturierungsmittel freie Pufferlösung" enthält. Ein derartiges Ausführungsbeispiel ist ebenfalls innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung.
  • 60 zeigt die konkrete Konfiguration des Denaturierungsgradientenbildungsteils 802 in den Vorrichtungen der 59a bis 59d. Denaturierungsgradientenbildungsteil 802 der 60 umfasst einen ersten Speicher 805, der mit einer Pufferlösung gefüllt ist, die ein Denaturierungsmittel bei einer konstanten Konzentration enthält, einen zweiten Speicher 806, der mit einer Pufferlösung gefüllt ist, die kein Denaturierungsmittel enthält, einen ersten Kanal 807 (Flüssigkeit einleitender Mikrokanal) der von dem ersten Speicher 805 weg führt, einen zweiten Kanal 808 (Flüssigkeit einleitender Mikrokanal), der von dem zweiten Speicher 806 weg führt, und einen Gradientenbereichskanal 809 (Vermischungsmikrokanal), der durch die Konvergenz des ersten Kanals 807 und des zweiten Kanals 808 gebildet wird. Der erste Speicher 805 umfasst eine erste Elektrode 810, die mit einer ersten Leistungsquelle 811 verbunden ist. Der zweite Speicher 806 umfasst eine zweite Elektrode 812, die mit einer zweiten Leistungsquelle 813 verbunden ist.
  • In dem Denaturierungsgradientenbildungsteil 802 wird eine Spannung an das Innere jedes Speichers über die erste Leistungsquelle 811 und die erste Elektrode 810, sowie die zweite Leistungsquelle 813 und die zweite Elektrode 812 angelegt, wodurch elektroosmotische Strömungen in den Kanälen erzeugt werden. Aufgrund der elektroosmotischen Strömungen wird die Denaturierungsmittel ent haltende Pufferlösung von dem ersten Speicher 805 in den Gradientenbereichskanal 809 durch den ersten Kanal 807 eingeleitet und ihn ähnlicher Weise wird die Pufferlösung von dem zweiten Speicher 806 in den Kanal 809 durch den zweiten Kanal 808 eingeleitet.
  • Durch Steuern des Potentials das an jeweils die erste Leistungsquelle 811 und die zweite Leistungsquelle 813 angelegt wird, kann das Verhältnis der Pufferlösungen, die durch die Kanäle 807 und den Kanal 808 einströmen, verändert werden. Auf diese Art und Weise können die Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung und die Pufferlösung mit einem beliebigen Verhältnis bei einem stromaufwärtigen Punkt des Gradientenbereichskanals 809 (dem Konvergenzpunkt der Pufferlösungen von dem Kanal 807 und dem Kanal 808), vermischt werden. Um einen kontinuierlichen Denaturierungsgradientenbereich in dem Kanal 809 zu bilden, werden die Potentiale der ersten Leistungsquelle 811 und der zweiten Leistungsquelle 813 kontinuierlich verändert oder vorzugsweise das Verhältnis zwischen den Strömungsraten der beiden konvergierenden Pufferlösungen mit einer konstanten Rate verändert, wodurch das Mischungsverhältnis zwischen der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösung und der Pufferlösung kontinuierlich verändert wird.
  • 61 zeigt eine weitere Konfiguration des Denaturierungsgradientenbildungsteils 802. Der Denaturierungsgradientenbildungsteil 802 der 61 umfasst einen ersten Speicher 805, der mit einer Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösung gefüllt ist, einen zweiten Speicher 806, der mit einer Pufferlösung gefüllt ist, einen ersten Kanal 807, der von dem ersten Speicher 805 weg führt, einen zweiten Kanal 808, der von dem zweiten Speicher 806 weg führt, und einen Gradientenbereichskanal 809, der durch die Konvergenz des ersten Kanals 807 und des zweiten Kanals 808 gebildet wird. Der erste Speicher 805 umfasst eine erste Elektrode 810, die mit einer ersten Leistungsquelle 811 verbunden ist, und eine erste Pumpe 814, die mit der stromaufwärtigen Seite des ersten Speichers 805 verbunden ist. Der zweite Speicher 806 umfasst eine zweite Elektrode 812, die mit einer zweiten Leistungsquelle 813 verbunden ist, und eine zweite Pumpe 815, die mit der stromaufwärtigen Seite des zweiten Speichers 806 verbunden ist.
  • Der Denaturierungsgradientenbildungsteil 802 der 61 besitzt eine Struktur, in der die erste Pumpe 814 und die zweite Pumpe 815 hinzugefügt sind, und zwar zu dem ersten Speicher 805 bzw. dem zweiten Speicher 806, wie in 60 gezeigt. Dieses Ausführungsbeispiel ist dadurch vorteilhaft, dass die Flüssigkeitseinspeisung über die erste Pumpe 814 und die zweite Pumpe 815 bei der Flüssigkeitseinspeisung durch die elektroosmotischen Strömungen mithelfen kann, und selbst wenn die Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung und die Pufferlösung hohe Viskositäten besitzen, eine geeignete Flüssigkeitseinleitung in den Gradientenbereichskanal 809 erreicht werden kann, und die Bildung eines Denaturierungsgradienten sichergestellt werden kann.
  • Selbst in dem Denaturierungsgradientenbildungsteil 802 der 61 werden die Strömungsraten von der ersten Pumpe 814 und der zweiten Pumpe 815 zusätzlich zu der Steuerung der Potentiale an die erste Leistungsquelle 811 und die zweite Leistungsquelle 813 gesteuert. Aufgrund dieser Steuerungen wird die Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung von dem ersten Speicher 805 in den Kanal 809 durch den ersten Kanal 807. eingeleitet, und in ähnlicher Weise wird die Pufferlösung von dem zweiten Speicher 806 in den Kanal 809 durch den Kanal 808 eingeleitet. Auf diese Art und Weise können die Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung und die Pufferlösung mit einem beliebigen Verhältnis bei einem stromaufwärtigen Punkt des Gradientenbereichskanals 809 (dem Konvergenzpunkt der Pufferlösungen von dem Kanal 807 und dem Kanal 808), vermischt werden. Um einen kontinuierlichen Denaturierungsgradientenbereich in dem Kanal 809 zu bilden, werden die Potentiale der ersten Leistungsquelle 811 und der zweiten Leistungsquelle 813 kontinuierlich verändert oder vorzugsweise das Verhältnis zwischen den Strömungsraten der beiden konvergierenden Pufferlösungen mit einer konstanten Geschwindigkeit verändert, wodurch das Mischungsverhältnis zwischen der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösung und der Pufferlösung kontinuierlich verändert wird. Die erste Pumpe 814 und die zweite Pumpe 815 können mit dem ersten Speicher bzw. dem zweiten Speicher verbunden sein, wie in 61 gezeigt, oder können auf dem ersten Kanal 807 bzw. dem zweiten Kanal 808 vorgesehen sein.
  • 62 zeigt die konkrete Konfiguration des Probeneinleitungsteils 803 in den Vorrichtungen der 59b und 59d. Der in 62 gezeigte Probeneinleitungsteil 803 umfasst einen dritten Speicher 816, der mit einer DNA-Probe gefüllt ist, einen vierten Speicher 817 für eine abzulassende DNA-Probenausscheidungsflüssigkeit, einen vierten Kanal 818, der von dem dritten Speicher 816 weg führt, und einen fünften Kanal 819, der von dem vierten Speicher 817 weg führt. Der vierte Kanal 818 und der fünfte Kanal 819 sind gemeinsam verbunden, während sie einen Kanal 809 kreuzen, wodurch der vierte Kanal 818 und der fünfte Kanal 819 in Übereinstimmung gebracht werden. Eine dritte Elektrode 820 ist mit dem dritten Speicher 816 verbunden und eine dritte Leistungsquelle 821 ist mit der dritten Elektrode 820 verbunden. Eine vierte Elektrode 822 ist mit dem vierten Speicher 817 verbunden, und eine vierte Leistungsquelle 823 ist mit der vierten Elektrode 822 verbunden.
  • In dem Probeneinleitungsteil 803 werden die Potentiale an die dritte Leistungsquelle 821 und die vierte Leistungsquelle 823 gesteuert, um die DNA-Probe zu liefern. Die DNA-Probe wird von dem dritten Speicher 816 zu dem vierten Speicher 817 durch die Kanäle 818, 819 durch eine elektroosmotische Strömung und eine elektrophoretische Kraft geliefert, die durch Steuerung der Potentiale an die dritte Leistungsquelle 821 und die vierte Leistungsquelle 823 erzeugt werden. Während dieses Prozesses wird die DNA-Probe in die Schnittstelle des vierten Kanals 818 und des fünften Kanals 819 auf dem Kanal 809 eingeleitet. Dann wird eine Spannung zwischen die beiden Enden des Kanals 809 angelegt. Bei Anlegen der Spannung an den Kanal 809 wird nur ein DNA-Probenfragment, das in die Schnittstelle der Kanäle 818 und 819 eingeleitet wird, in den Kanal 809 eingeleitet. Da ein Konzentrationsgradient eines DNA-Denaturierungsmittels in dem Kanal 809 vorhanden ist, kann die dort eingeleitete DNA-Probe elektrophoretisch innerhalb des Konzentrationsgradienten getrennt werden.
  • 63 zeigt ein Ausführungsbeispiel der Vorrichtung der 59b. In einem Elektrophoreseteil 804, ist ein fünfter Speicher 824 für die Ausscheidungsflüssigkeit stromabwärts von dem Kanal 809 vorgesehen. Der fünfte Speicher 824 um fasst eine fünfte Elektrode 825, die mit einer fünften Leistungsquelle 826 verbunden ist. Ein Denaturierungsgradientenbildungsteil 802, wie mit Bezugsnahme auf 60 dargestellt, ist stromaufwärts von dem Kanal 809 enthalten. Auf der stromaufwärtigen Seite des Kanals 809 ist ein Probeneinleitungsteil 803, wie mit Bezugnahme auf 62 dargestellt, enthalten. Die ersten bis fünften Leistungsquellen können je nach Erfordernis geteilt werden.
  • In dem Ausführungsbeispiel der 63 wird eine Pufferströmung mit einem durch den Denaturierungsgradientenbildungsteil 802 gebildeten Denaturierungsgradienten in den Kanal 809 eingeleitet, wodurch eine Strömung (Bewegung) eines Denaturierungsgradientenbereichs in dem Kanal 809 erzeugt wird. Eine DNA-Probe wird von dem Probeneinleitungsteil 803 in den Denaturierungsgradientenbereich eingeleitet. Der Denaturierungsgradientenbereich, der in den Kanal 809 von seiner stromaufwärtigen Seite aus eingebracht wurde, wird durch eine elektroosmotische Strömung, die in dem Denaturierungsgradientenbildungsteil 802 und dem Kanal 809 erzeugt wird, stromabwärts bewegt. Andererseits wird die DNA-Probe, die in den Kanal 809 eingeleitet wurde, durch die Summe des Betrags der stromabwärtigen Bewegung durch die elektroosmotische Strömung, die durch Denaturierungsgradientenbildungsteil 802 und den Kanal 809 erzeugt wird, und den Betrag der stromaufwärtigen Bewegung durch die Elektrophorese bewegt, die durch die negative Ladung der DNA-Probe selbst erzeugt wird. Der Nettobetrag der Bewegung der DNA-Probe ist geringer als der Betrag der stromabwärtigen Bewegung des Denaturierungsgradientenbereichs, und zwar um den Betrag der stromaufwärtigen Elektrophorese aufgrund der negativen Ladung der DNA-Probe selbst. In diesem Fall kann nach dem Ablaufen einer ausreichenden Zeit die DNA-Probe bei dem Denaturierungsgradientenbereich ankommen, der stromaufwärts gelegen ist. Auf diese Weise werden als Ergebnis der Elektrophorese für eine vorbestimmte Zeit, Doppelstrang-DNA-Fragmente mit einem „GC-Clamp" in der DNA-Probe in der Bewegungsrichtung des Kanals 809 durch die Denaturierungsgradientengelelektrophorese (DGGE) gemäß den Unterschieden in der Basensequenz und dem Denaturierungsgradienten separiert.
  • Das Prinzip der DGGE in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel macht Gebrauch von einem Phänomen, in dem die Ladungen der Nukleinsäurebasen durch ein DNA-Denaturierungsmittel, wie beispielsweise Harnstoff und Formamid, neutralisiert werden, um die Wasserstoffbrücken zwischen Nukleotiden zu zerbrechen, wodurch eine Doppelstrang-DNA in Einzelstrang-DNAs aufgespalten wird. Die DNA-Probe umfasst Doppelstrang-DNA, die verstärkt wurde, wobei eine künstliche DNA-Sequenz („GC-Clamp") an einem Ende durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) hinzugefügt wird. Das „GC-Clamp" ist eine Sequenz, die minimal aufspaltbar in Einzelstrang-DNA ist, trotz einer hohen DNA-Denaturierungsmittelkonzentration. Wenn Doppelstrang-DNA mit dem GC-Clamp elektrophoretisch in einem Gel behandelt wird, wo der Konzentrationsgradient des DNA-Denaturierungsmittels gebildet wurde, wird ein Bereich ohne GC-Clamp in Einzelstrang-DNA bei einem bestimmten Denaturierungmittelniveau aufgespaltet, und diese Doppelstrang-DNA besitzt eine geringe Bewegungsgeschwindigkeit. Die Denaturierungsmittelkonzentration, die Doppelstrang-DNA in Einzelstrang-DNA aufspaltet, hängt von ihrer Basensequenz ab. Auf diese Weise tritt, wenn Doppelstrang-DNAs mit unterschiedlichen Basensequenzen elektrophoretisch bei dem gleichen Gradientenbereich behandelt werden, ein Unterschied in der Wanderungsstrecke auf. Auf diese Weise können Doppelstrang-DNAs durch eine Vielzahl von Basensequenzen separiert wird.
  • 64 zeigt ein Ausführungsbeispiel der Vorrichtung der 59b. Ein Elektrophoreseteil 804 der 64 umfasst einen fünften Speicher 824 für eine Ausscheidungsflüssigkeit, und einen Kanal 809, der zu dem fünften Speicher 824 führt. Der fünfte Speicher 824 umfasst eine fünfte Elektrode 825, die mit einer fünften Leistungsquelle 826 verbunden ist. Dieses Ausführungsbeispiel umfasst stromaufwärts von dem fünften Speicher 824, einen Denaturierungsgradientenbildungsteil 802, wie mit Bezugnahme auf 61 dargestellt, und einen Probeneinleitungsteil 803, wie mit Bezugnahme auf 62 dargestellt.
  • In dem Ausführungsbeispiel der 64 wird eine Pufferströmung (Bewegung) mit einem durch den Denaturierungsgradientenbildungsteil 802 gebildeten Denaturierungsgradienten in den Kanal 809 eingeleitet, wodurch eine Strömung des Denaturierungsgradienten in dem Kanal 809 erzeugt wird. Eine DNA-Probe wird von dem Probeneinleitungsteil 803 auf den Denaturierungsgradientenbereich eingeleitet. Der Denaturierungsgradientenbereich wird stromabwärts in dem Kanal 809 durch Antreiben einer ersten Pumpe 810 und einer zweiten Pumpe 815 zusätzlich zu den elektroosmotischen Strömungen durch die Potentiale an eine erste Leistungsquelle 811 und eine zweite Leistungsquelle 813 bewegt. Andererseits wird die in den Kanal 809 eingeleitete DNA-Probe durch die Summe aus der stromabwärtigen Bewegung durch das Einwirken der ersten Pumpe 814 und der zweiten Pumpe 815 und der elektroosmotischen Strömungen durch die Potentiale an die erste Leistungsquelle 811 und die zweite Leistungsquelle 813, und der stromaufwärtigen Bewegung durch die Elektrophorese bewegt, die durch die negative Ladung der DNA-Probe selbst erzeugt wird. Der Nettobetrag der Bewegung der DNA-Probe ist kleiner als der Betrag der stromabwärtigen Bewegung des Denaturierungsgradientenbereichs, und zwar um den Betrag der stromaufwärtigen Elektrophorese aufgrund der negativen Ladung der DNA-Probe selbst. In diesem Fall kann nach dem Ablauf von ausreichend Zeit die DNA-Probe bei dem Denaturierungsgradientenbereich ankommen, der stromaufwärts gelegen ist. Auf diese Weise werden infolge der Elektrophorese für eine vorbestimmte Zeit Doppelstrang-DNA-Fragmente mit einem GC-Clamp in der DNA-Probe in der Bewegungsrichtung des Kanals 9 durch die Denaturierungsgradientengelelektrophorese gemäß Unterschieden in der Basensequenz und in dem Denaturierungsgradienten bewegt.
  • Die Kanäle und Speicher der Mikrochipelektrophoresevorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels sind mit einer Pufferlösung gefüllt, die eine polymere Matrix enthalten. Dies deshalb da DNA durch die Maschenstruktur der polymeren Matrix oder die Interaktion zwischen der polymeren Matrix und der DNA separiert werden kann. Die in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel verwendbare polymere Matrix, kann in geeigneter Weise aus Polyacrylamid, Cellulosederivaten wie beispielsweise Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Hydroxycellulose und Methylcellulose, Polyethylenoxid, Polyolen wie beispielsweise Polymethylenglycol, Polypropylenglycol, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon, Dextran, sowie Pullulan ausgewählt werden. Wenn die polymere Matrix Hydroxye thylcellulose ist, liegt ihre Konzentration vorzugsweise im Bereich von 0,01 % bis 3,0%, abhängig von der Länge der Doppelstrang-DNA. Beispiele derartiger Pufferlösungen sind Tris-Acetat-Pufferlösung und Tris-Borat-Pufferlösung.
  • Das in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel verwendbare DNA-Denaturierungsmittel wird je nach Eignung aus Harnstoff, Formamid, Formaldehyd und starken Alkalis, wie beispielsweise Natriumhydroxid ausgewählt. Bevorzugt sind Harnstoff und Formamid. Wenn Formamid und Harnstoff als ein Denaturierungsmittel verwendet werden, ist es allgemeine Praxis eine Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung, die 7M Harnstoff und 40% Formamid enthält, als eine 100% Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung zu verwenden, und eine Pufferlösung frei von dem Denaturierungsmittel als eine 0% Pufferlösung zu verwenden. Im Allgemeinen, wenn die Elektrophorese bei 60°C ausgeführt wird, liegt ein Denaturierungsgradient in dem Bereich von 0% bis 100% oder 20% bis 70%. In dem Fall der Strukturanalyse einer Mikrobengemeinschaft, die das 16S rRNA Gen verwendet, ist der Bereich von 35% bis 55% bevorzugt.
  • Für eine in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel analysierbare DNA-Probe wird eine Doppelstrang-DNA verwendet, die aus biologischen Proben, wie beispielsweise menschlichem Blut oder Zellen, Nahrungsmitteln, Umweltproben, wie beispielsweise Erde, Flusswasser und Meerwasser, oder Aktivschlamm oder anaerobem Digestions-(Methanfermentations-) Schlamm extrahiert werden. Gebrauch kann von Doppelstrang-DNA gemacht werden, die durch Verstärken eines bestimmten Bereichs einer durch eine PCR-Reaktion oder Ähnlichem extrahierten Genom-DNA gebildet wird, wobei dieser Bereich eine an einem Ende angebrachte künstliche DNA-Sequenz (GC-Clamp) besitzt, die minimal in Einzelstrang-DNA aufspaltbar ist, trotz einer hohen DNA-Denaturierungsmittelkonzentration.
  • Das Mittel zum Detektieren der DNA durch das vorliegende Ausführungsbeispiel wird aus Fluoreszenzdetektion, Lumineszenzdetektion, Absorptionsdetektion und elektrochemischer Detektion ausgewählt. Beispiele der Fluoreszenzdetektion sind vorangehende Fluoreszenzmarkierung von Startern für die PCR-Reaktion, Fluoreszenzmarkierung eines PCR-Produkts, vorangehendes Reaktion, Fluoreszenzmarkierung eines PCR-Produkts, vorangehendes Färben eines PCR-Produkts mit einer DNA-Färbungsreagens, und Hinzufügen einer DNA-Färbungsreagens in eine Polymermatrix enthaltende Pufferlösung zum Färben während der Elektrophorese. Fluoreszenzmarkierungssubstanzen sind Fluoreszein, Rhodamin, Cy3, Cy5, BODIPYL FL, TexasRed, Alexa Fluor etc. Als die DNA-Färbungsreagens sind, SYBR Green, Vista Green, Ethidiumbromid, YOYO-1, TOTO-1 und Thiazolorange verfügbar. Als der Detektor können eine Photomultiplier bzw. Photovervielfacher, ein UV-Detektor oder ein Photodiodendetektor im Fall der Fluoreszenzdetektion, Lumineszentdetektion oder Absorptionsdetektion verwendet werden.
  • In Verbindung mit der Analyse, die die Mikrochipelektrophoresevorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels verwendet, wird ein Beispiel eines Betriebsablaufs mit Bezugnahme auf die 63 beschrieben.
  • Eine Pufferlösung, die eine polymere Matrix enthält, wird in den ersten Kanal 807, den zweiten Kanal 808, den Kanal 809, den vierten Kanal 818 und den fünften Kanal 819 durch den ersten Speicher 805, den zweiten Speicher 806, den dritten Speicher 816, den vierten Speicher 817 oder den fünften Speicher 824 gefüllt. Wenn die Pufferlösung nicht durch Kapillarwirkung bzw. Kapillarität eingefüllt werden kann, ist es empfehlenswert, die Pufferlösung unter Druck durch eine Spritze oder Ähnliches einzufüllen.
  • Nach dem Einfüllen der Pufferlösung wird der erste Speicher 805 mit einer Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösung gefüllt, der zweite Speicher 806, der vierte Speicher 817 und der fünfte Speicher 824 wird mit einer Pufferlösung gefüllt und der dritte Speicher 816 wird mit einer DNA-Probe gefüllt. Der vierte Speicher 817 und der fünfte Speicher 824 können, je nach Umständen, mit einer Pufferlösung gefüllt werden, die kein Denaturierungsmittel enthält. Sämtliche Pufferlösungen und die DNA-Probe, die verwendet werden, enthalten vorzugsweise die polymere Matrix. Die DNA-Probe und die Pufferlösung, die in den vierten Speicher 817 und den fünften Speicher 824 gefüllt werden, können frei von der polymeren Matrix sein.
  • Dann werden die erste Elektrode 810, die zweite Elektrode 812, die dritte Elektrode 820, die vierte Elektrode 822 und die fünfte Elektrode 825 in den ersten Speicher 805, den zweiten Speicher 806, den dritten Speicher 816, den vierten Speicher 817 bzw. den fünften Speicher 824 gesteckt. Diese Elektroden können jedoch im Voraus innerhalb des ersten Speichers 805, des zweiten Speichers 806, des dritten Speichers 816, des vierten Speichers 817 bzw. des fünften Speichers 824 gebildet werden.
  • Dann wird die fünfte Elektrode 825 geerdet und vorbestimmte Potentiale werden an die erste Elektrode 810 und die zweite Elektrode 811 angelegt, um die Pufferlösungen mit vorbestimmten Denaturierungsmittelkonzentrationen in den Kanal 809 einzuleiten. Zu diesem Zeitpunkt ist es bevorzugt, vorbestimmte Potentiale an die dritte Elektrode 820 und die vierte Elektrode 822 abzugeben, so dass die Pufferlösungen nicht innerhalb des vierten Kanals 818 und fünften Kanals 819 strömen.
  • Dann, wenn die Geschwindigkeiten der elektroosmotischen Strömungen, die in dem vierten Kanal 818 und dem fünften Kanal 819 erzeugt werden, größer als die elektrophoretische Geschwindigkeit der Doppelstrang-DNA sind, wird die vierte Elektrode 822 geerdet, und eine vorbestimmte Spannung wird an die dritte Elektrode 820 angelegt, um die DNA-Probe zu der Kreuzung des Kanals 809, des vierten Kanals 818 und des fünften Kanals 819 einzuleiten. Wenn die Geschwindigkeiten der elektroosmotischen Strömungen, die in dem vierten Kanal 818 und dem fünften Kanal 819 erzeugt werden, niedriger als die elektrophoretische Geschwindigkeit der Doppelstrang-DNA ist, wird die dritte Elektrode 820 geerdet, und eine vorbestimmte Spannung wird an die vierte Elektrode 822 angelegt. In beiden Fällen werden vorbestimmte Potentiale vorzugsweise an die erste Elektrode 810, die zweite Elektrode 812 und die fünfte Elektrode 825 abgegeben, so dass die DNA-Probe nicht innerhalb des dritten Kanals 809 fließt.
  • Dann wird die fünfte Elektrode 825 geerdet und die Spannungen, die an die erste Elektrode 810 und die zweite Elektrode 812 angelegt werden, werden konti nuierlich variiert, um einen Bereich mit einem vorbestimmten Denaturierungsgradienten in den Kanal 809 einzuleiten. Gleichzeitig wird bei der Kreuzung dieses Kanals 809, des vierten Kanals 818 und des fünften Kanals 819, die DNA-Probe in den Kanal 809 mit dem oben erwähnten Denaturierungsgradientenbereich eingeleitet. Zu diesem Zeitpunkt ist es bevorzugt, vorbestimmte Potentiale an die dritte Elektrode 820 und die vierte Elektrode 822 abzugeben, so dass die Pufferlösungen nicht in den vierten Kanal 818 und den fünften Kanal 819 strömen. Das Verfahren des Variierens der an die erste Elektrode 810 und die zweite Elektrode 812 angelegten Potentiale dient dazu, das Potential an die zweite Elektrode 812 größer als das Potential an die erste Elektrode 810 zu machen, und dann stufenweise das Potential an die zweite Elektrode 812 zu verringern und das Potential an die erste Elektrode 810 zu erhöhen. Infolgedessen wird der in den Kanal 809 eingeleitete Denaturierungsgradientenbereich derart gebildet, dass eine Denaturierungsmittelkonzentration niedriger zu der stromabwärtigen Seite hin und höher zu der stromaufwärtigen Seite hin ist.
  • Durch das obige Verfahren werden die Doppelstrang-DNAs in der DNA-Probe in dem Denaturierungsgradientenbereich separiert. Während oder nach dieser Separation werden die DNAs durch einen DNA-Detektor detektiert, der an den Kanal 809 geliefert wird. Die DNA-Detektion kann irgendwo in dem Kanal 809 ausgeführt werden. Während der Analyse muss der Mikrochip bei einer konstanten Temperatur gehalten werden, vorzugsweise 40°C bis 70°C.
  • Mikrochipelektrophoresevorrichtung des Ausführungsbeispiels A mit Vermischungsförderungsmittel
  • Das in den Ausführungsbeispielen 1-1 bis 2-3 beschriebene Vermischungsförderungsmittel kann auf die Elektrophoresevorrichtung des Ausführungsbeispiels A angewendet werden. Beim Verwenden des Vermischungsförderungsmittels in der Mikrochipelektrophoresevorrichtung sind die Mikrokanäle 807, 808 zum Einleiten der Pufferlösungen die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle, der Kanal 809 für den Gradientenbildungsbereich ist der Vermischungsmikrokanal, und das Vermischungsförderungsmittel wird für das Vermischen der Pufferlösungen in dem Ka nal 9 verwendet. Die Speicher zum Einspeisen der Pufferlösungen sind die Flüssigkeitseinlässe oder Einleitungsteile für die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle.
  • Das Vermischungsförderungsmittel ist ebenfalls für die Bildung eines Konzentrationsgradienten hilfreich. Beispielsweise macht es die Verwendung des strömungsratenunabhänigen Steuerungsmittels gemäß den Ausführungsbeispielen 1-1 und 1-2 (z.B. Steuerung der elektroosmotischen Strömung durch Anpassen eines angelegten Potentials oder einer angelegten Spannung, Steuerung einer Flüssigkeitseinspeisungspumpe, wie beispielsweise eine Mikrospritze, oder sekundäres Steuern durch ein Ventil für die Flüssigkeit, das durch diese Steuerungsverfahren angetrieben wird) möglich, willkürlich das Verhältnis der Pufferlösungen zu verändern, die von den Mikrokanälen 807, 808 eingeleitet werden, und gleichzeitig die Grenzfläche zwischen den Pufferlösungen zu erhöhen, die konvergieren. Da das Vermischen der Pufferlösungen durch Molekulardiffusion durch die Erhöhung der Grenzfläche verbessert wird, kann ein Konzentrationsgradient, der gleichförmig in Richtung der Kanalbreite ist, schnell in dem Kanal 809 gebildet werden. Diese Technik ermöglicht das Vorsehen einer Mikrochipvorrichtung, die für die DEEG nützlich ist, die Verkürzung der DEEG-Analysezeit und die Realisierung eines hohen Durchlasses.
  • 65 bis 68 zeigen die Vorrichtung des Ausführungsbeispiels A, die mit einem schnell arbeitenden Ventil 832 vorgesehen ist. Wie in diesen Zeichnungen gezeigt kann das schnell arbeitende Ventil 832 beispielsweise auf dem ersten Kanal vorgesehen sein. In dem Denaturierungsgradientenbildungsteil 802 werden Spannungen in die Speicher über die erste Leistungsquelle 811 und die erste Elektrode 810, sowie die zweite Leistungsquelle 813 und die zweite Elektrode 812 angelegt. Die resultierenden elektroosmotischen Strömungen leiten die Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung von dem ersten Speicher 805 in den Gradientenbereichskanal 809 durch den ersten Kanal 807 und leiten in ähnlicher Weise die Denaturierungsmittel freie Pufferlösung von dem zweiten Speicher 806 durch den zweiten Kanal 7 in den Kanal 809. Zu diesem Zeitpunkt wird der Öffnungs- und Schließvorgang des schnell arbeitenden Ventils 832 gesteuert, wodurch das Mischungsverhältnis der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlö sung von dem ersten Speicher 805 zu der konstanten Strömungsrate der Pufferlösung von dem zweiten Speicher 806 gesteuert werden kann. Ein kontinuierlicher Konzentrationsgradient kann durch kontinuierliches Verändern der Öffnungs- und Schließzeit des schnell arbeitenden Ventils 832 gebildet werden.
  • Ausführungsbeispiel B die DGGE betreffend
  • Das DGGE-Verfahren des Ausführungsbeispiels B weist das Anordnen von Pufferlösungszonen (Elektrophoresegel), die ein Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, und zwar abwechselnd in der Richtung der Elektrophorese, und das Einleiten eines Analyts in den sich ergebenden Gradientenbereich für die Elektrophorese, auf.
  • In der Mikrochipelektrophoresevorrichtung des Ausführungsbeispiels B werden Pufferlösungszonen, die ein Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, abwechselnd in einem Mikrokanal in Richtung der Elektrophorese angeordnet, und ein Analyt wird in den resultierenden Gradientenbereich für die Elektrophorese eingeleitet.
  • (1) Prinzip des vorliegenden Ausführungsbeispiels
  • Ein Verfahren zum Separieren von Doppelstrang-Nukleinsäuren durch das Ausführungsbeispiel B ist gekennzeichnet durch abwechselndes Anordnen von zumindest zwei Pufferlösungszonen, die ein Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, in Richtung der Elektrophorese der Nukleinsäuren. Die Nukleinsäuren werden elektrophoretisch in einer diskontinuierlichen Anordnungsstruktur solcher Denaturierungsmittelkonzentrationen bewegt und dadurch separiert. Dieses Prinzip wird durch Bezugnahme auf das herkömmliche DGGE-Verfahren erklärt werden.
  • Das Prinzip der DGGE macht Gebrauch von dem folgenden Phänomen: In einem Gel, in dem ein Konzentrationsgradient eines Nukleinsäuredenaturierungsmittels, wie beispielsweise Harnstoff oder Formamid, gebildet ist, neutralisiert ein derartiges Nukleinsäuredenaturierungsmittel die Ladungen der Nukleinsäurenbasen der Doppelstrang-Nukleinsäuren, die elektrophoretisch behandelt werden, um die Wasserstoffbrücken zwischen Nukleotiden zu trennen, wodurch die Doppelstrang-Nukleinsäuren in Einzelstrang-Nukleinsäuren aufgespalten werden. Konkret wird ein Nukleinsäurefragment, das elektrophoretisch behandelt werden soll, PCR-verstärkt, und zwar unter den Bedingungen, unter denen eine künstliche Nukleinsäuresequenz (GC-Clamp), die mit einem Ende des Fragments verbunden wurde, minimal in eine Einzelstrang-Nukleinsäure trotz einer hohen Konzentration eines Nukleinsäuredenaturierungsmittels aufspaltbar ist. Durch diese PCR-Verstärkung wird das Fragment zu einer Doppelstrang-Nukleinsäure bereitet, und die resultierende Doppelstrang-Nukleinsäure wird elektrophoretisch behandelt. Bei einer bestimmten Denaturierungsmittelkonzentration spaltet sich eine Doppelstrang-Nukleinsäure ohne das GC-Clamp in Einzelstrang-Nukleinsäuren auf, und verlangsamt die Wanderungsgeschwindigkeit. Die Denaturierungsmittelkonzentration, bei der eine Doppelstrang-Nukleinsäure sich in Einzelstrang-Nukleinsäuren aufspaltet, hängt von der Basensequenz der Doppelstrang-Nukleinsäure ab. Auf diese Weise können verschiedene Doppelstrang-Nukleinsäuren gemäß Unterschieden in der Basensequenz separiert werden. D.h. die DGGE nutzt raffiniert die Basensequenzabhängigkeit der Denaturierungsmittelkonzentration, die für die Aufspaltung einer Doppelstrang-Nukleinsäure erforderlich ist. Doppelstrang-Nukleinsäuren mit unterschiedlichen Basensequenzen besitzen Unterschiede bei der Denaturierungsmittelkonzentration, bei der sie gemäß ihrer Basensequenz aufspaltbar werden. Daher treten, wenn diese Doppelstrang-Nukleinsäuren in einem Gel mit einem Gradienten der Denaturierungsmittelkonzentration elektrophoretisch behandelt werden, graduell Unterschiede in dem Abspaltungszustand in dem Denaturierungsgradienten auf, wodurch deren Separierung bewerkstelligt wird.
  • Der Erfinder berücksichtigte, dass die Basesequenzabhängigkeit der Aufspaltungsdenaturierungsmittelkonzentration durch Unterschiede in einer Frequenz verursacht wurden, mit der die Denaturierungsmoleküle in dem Denaturierungsmittel, wie beispielsweise Harnstoff und Formamid, auf die Wasserstoffbrückenstellen der Doppelstrang-Nukleinsäuren wirken. Dies kann wie folgt erklärt werden: Um die Wasserstoffbrücken einer Doppelstrang-Nukleinsäure mit einer bestimmten Basensequenz teilweise aufzubrechen, ist es erforderlich zu verursachen, dass die Denaturierungsmoleküle auf die Wasserstoffbrückenstelle dass die Denaturierungsmoleküle auf die Wasserstoffbrückenstelle der Doppelstrang-Nukleinsäure an diesem Teil mit einer Frequenz einwirken, die einer bestimmten Schwelle entspricht oder höher liegt. Eine begrenzte Reaktionszeit ist für die Reaktion notwendig, die die Wasserstoffbrücke bei einem bestimmten Teil der Doppelstrang-Nukleinsäure bricht. Das Denaturierungsmolekül muss auf seine Wasserstoffbrückenstelle mindestens für eine längere Zeit als die erforderliche Reaktionszeit einwirken. Diese begrenzte Reaktionszeit wird ebenfalls als abhängig von der Basensequenz angesehen.
  • Basierend auf dem oben beschriebenen Konzept prüfte der Erfinder das Verfahren zum Separieren von Doppelstrang-Nukleinsäuren, wobei besonders die Schwelle bzw. der Grenzwert der Reaktionszeit zusätzlich zu dem Grenzwert der Frequenz der Reaktion zwischen der wandernden Nukleinsäure und dem Denaturierungsmolekül beachtet wurde. Infolgedessen fand der Erfinder heraus, dass die Doppelstrang-Nukleinsäuren durch Verändern der Reaktionsfrequenz, ohne kontinuierliches Variieren der Konzentration des Denaturierungsmittels separiert werden konnten. Das vorliegende Separationsverfahren bezieht sich auf ein Verfahren, welches die Tatsache nutzt, dass die Grenzwerte der Reaktionsfrequenz und der Reaktionszeit, die für das Aufbrechen der Wasserstoffbrücken der Nukleinsäuren notwendig sind, gemäß der Basensequenz unterscheiden, und welches das Anordnen von Pufferlösungszonen, die ein Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, in Richtung der Elektrophorese, aufweist. Konkret werden die „Längen" (Entfernungen in Richtung der Elektrophorese) der Pufferlösungszonen, die ein Denaturierungsmittel mit einer hohen Konzentration enthalten, und/oder der Pufferlösungszonen, die kein Denaturierungsmittel oder ein Denaturierungsmittel mit einer geringen Konzentration enthalten, in Richtung der Elektrophorese verändert, und diese Pufferlösungszonen werden derart angeordnet, dass die Reaktionsfrequenz und/oder Reaktionszeit (die Durchlaufszeit durch die Pufferlösungszonen, die das Denaturierungsmittel mit einer hohen Konzentration enthalten) für die Reaktion mit den Denaturierungsmolekülen stufenweise in Richtung der Elektrophorese erhöht wird. Wenn die Doppelstrang-Nukleinsäuren auf den so angeordneten Pufferlösungszonen elektrophoretisch behandelt wer den, können sie gemäß den Unterschieden in der Basensequenz separiert werden.
  • In dem Ausführungsbeispiel B, muss ein Gradient, in dem die Denaturierungsmittelkonzentration kontinuierlich variiert, nicht in jeder Pufferlösungszone gebildet werden. Der Schritt, der gemacht werden muss, ist das Bilden eines Gradienten einer zweidimensionalen Verteilung der Pufferlösungszonen, die eine vorbestimmte Konzentration des Denaturierungsmittels enthalten, so dass die Verteilung des Denaturierungsmittels dichter zu einer stromabwärtigen Seite hin in Richtung der Elektrophorese wird.
  • Wie oben beschrieben, bezieht sich das vorliegende Ausführungsbeispiel auf die Bildung einer diskontinuierlichen Anordnungsstruktur der Denaturierungsmittelkonzentration.
  • Die in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel verwendete Formulierung „diskontinuierliche Anordnungsstruktur der Denaturierungsmittelkonzentration" oder „Anordnung der Pufferlösungszonen, die das Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten" bezeichnen eine Struktur, in der zumindest zwei Pufferlösungszonen mit unterschiedlichen Konzentrationen des Denaturierungsmittels abwechselnd angeordnet sind.
  • Der Ausdruck „Pufferlösungszonen", der in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel verwendet wird, bezeichnet eine Elektrophoresematrix, wie beispielsweise ein Gel, das eine bestimmte Konzentration an Pufferlösung enthält.
  • Im Folgenden wird eine abwechselnde Anordnung der Pufferlösungszonen, die ein Denaturierungsmittel enthalten, und der Pufferlösungszonen, die kein Denaturierungsmittel enthalten, (im Folgenden als „unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung" bezeichnet) für eine vereinfachte Erklärung beschrieben. Es ist jedoch von keiner Bedeutung, ob jede Pufferlösungszone das Denaturierungsmittel enthält oder frei von dem Denaturierungsmittel ist. Was von Bedeutung ist, ist ein relativer Konzentrationsunterschied in dem Denaturierungsmittel. Beispiels weise könnte der gleiche Effekt erhalten werden, wenn „die Denaturierungsmittel freie Zone" eine relativ geringe Konzentration des Denaturierungsmittels enthält, und die „Denaturierungsmittel enthaltende Zone" eine signifikant höhere Konzentration des Denaturierungsmittels enthält als die „Denaturierungsmittel freie Zone". Dieses Ausführungsbeispiel liegt ebenfalls innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung.
  • Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel ist derart ausgelegt, dass während sich eine Doppelstrang-Nukleinsäure über eine längere Entfernung bewegt, die Frequenz seiner Reaktion mit einem Denaturierungsmolekül stufenweise zunimmt, oder sich die Zeit seiner Reaktion mit dem Denaturierungsmolekül stufenweise verlängert. Dieses bevorzugte Ausführungsbeispiel verwendet eine Anordnung von Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszonen und/oder Denaturierungsmittel freien Pufferlösungszonen von schrittweise verändernder Länge in Richtung der Elektrophorese.
  • Das Separationsprinzip der oben beschriebenen Anordnung der Pufferlösungszonen kann wie folgt beschrieben werden: Das Ausführungsbeispiel der 69 (das erste Ausführungsbeispiel das weiter unten beschrieben wird) wird als ein Beispiel zum Zweck der Erläuterung genommen. Wenn sich, wie in 82 gezeigt, der Abstand zwischen den Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszonen in Richtung der Elektrophorese verkürzt, besitzt jede Nukleinsäure, die über dieses Anordnungsmuster hinweg wandert, ein geringes Verhältnis A der Zeit ihres Kontakts mit der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszone zu der Zeit t in einem Bereich einer geringen Wanderungsstrecke (einem stromaufwärtigen Bereich). In einem Bereich einer großen Wanderungsstrecke (einem stromabwärtigen Bereich) besitzt die Nukleinsäure ein hohes Verhältnis B der Zeit ihres Kontakts mit der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszone zu der gleichen Zeit t. D.h. wenn es keinen signifikanten Unterschied im Grad der Nukleinsäurenwanderung zwischen dem stromaufwärtigen Bereich und dem stromabwärtigen Bereich gibt, und wenn die Zeit Δt des Durchlaufs durch jeden Bereich der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszonen gleich ist, dann hängt das Verhältnis der Zeit des Kontakts der Nukleinsäure mit der Denaturie rungsmittel enthaltenden Pufferlösungszone innerhalb der gleichen Zeitspanne t von der Anzahl der Zonen der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungen ab, die von der Nukleinsäure durchlaufen wurden, so dass die Beziehung A < B hält. Wie hier bemerkt, nimmt abhängig von der Wanderungsstrecke (Wanderungszeit), das Verhältnis der Zeit des Kontakts der Nukleinsäure mit der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösung zu der gleichen Zeit t (d.h. die Reaktionsfrequenz) schrittweise zu. Während das Verhältnis der Kontaktzeit schrittweise zunimmt, dissoziieren die Doppelstrang-Nukleinsäuren, wenn unterschiedliche Reaktionsgrenzwerte gemäß Unterschieden in der Basensequenz überschritten werden. Infolgedessen besitzen sie spezifische Wanderungsausmaße (Wanderungsentfernungen). Auf diese Weise erlangt die Verwendung einer unterbrochenen Anordnung von Denaturierungsmittel enthaltenden Zonen den gleichen Separationseffekt, wie er durch die Verwendung eines kontinuierlich gebildeten Denaturierungsgradienten erlangt wird.
  • 69 zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel der unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung. Dieses Ausführungsbeispiel ist eine unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung, in der die Längen der entsprechenden Zonen einer Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösung nahezu konstant in Richtung der Elektrophorese der Nukleinsäuren sind, und entsprechende Zonen einer Denaturierungsmittel freien Pufferlösung stufenweise verkürzt werden. D.h, der Abstand zwischen den Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungen (die Länge der Pufferlösungszonen, die kein Denaturierungsmittel enthalten) verengt sich in Richtung der Elektrophorese der Nukleinsäuren. Wenn die Nukleinsäuren in der unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung in diesem Ausführungsbeispiel wandern, gehen sie abwechselnd durch die Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung und die Denaturierungsmittel freie Pufferlösung hindurch. Die Zeit die für die Nukleinsäuren erforderlich ist, um durch die Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösungszone hindurchzugehen ist dafür ausgelegt, um ausreichend kürzer zu sein als der Unterschied zwischen den Dissoziationsreaktionszeiten aufgrund des Unterschieds in der Basensequenz. Während die Nukleinsäure stromabwärts wandert, nimmt die Frequenz ihrer Passage durch die Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungen während einer bestimmten Zeitperiode zu (und zwar nimmt die Reaktionsfrequenz zu), und auf diese Weise wird die Nukleinsäure dissoziierbar. Folglich dissoziiert eine Nukleinsäure mit einer Basensequenz, in der die Kopplung eines Doppelstrangs relativ instabil ist, an einer Stelle, wo die Dichte der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszonen auf der unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung gering ist (d.h. stromaufwärtiger Bereich). Andererseits dissoziiert eine Nukleinsäure mit einer Basensequenz, in der die Kopplung eines Doppelstrangs relativ stabil ist, an einer Stelle, wo die Dichte der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszonen höher ist (d.h. stromabwärtiger Bereich). Dieses Ausführungsbeispiel nutzt Veränderungen in der Anordnungsdichte (Veränderungen in der Frequenz des Durchlaufs) der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszonen.
  • 70 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel der unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung. Dieses Ausführungsbeispiel ist eine unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung, in der die Längen der entsprechenden Zonen einer Denaturierungsmittel freien Pufferlösung nahezu konstant in Richtung der Elektrophorese der Nukleinsäuren sind, und entsprechende Zonen einer Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösung stufenweise verlängert werden. In diesem Ausführungsbeispiel ist ebenfalls die Zeit, die für die Nukleinsäuren erforderlich ist, um durch eine geeignete Anzahl von Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszonen hindurchzugehen, kürzer als der Unterschied zwischen den Dissoziationsreaktionszeiten aufgrund des Unterschieds in der Basensequenz. Die Nukleinsäuren, die elektrophoretisch behandelt werden sollen, besitzen unterschiedliche Dissoziationsgrade, abhängig davon, ob die Zeit ihres Durchlaufs durch jede Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösungszone die Reaktionszeit erreicht hat, die für die Dissoziation der Basensequenz erforderlich ist. Während die Nukleinsäuren stromabwärts wandern, wird die Zeit ihres Durchlaufs durch die Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösungszone länger und auf diese Weise wird der Doppelstrang dissoziierbar. Folglich, wenn der Doppelstrang der Nukleinsäure instabil ist, dissoziiert er im stromaufwärtigen Bereich auf der unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung, wenn der Doppelstrang jedoch stabil ist, dissoziiert er im stromabwärtigen Bereich. Dieses Ausführungsbeispiel nutzt Veränderungen in der beständigen Einwirkung (Reaktionszeit in einer einzelnen Anord nung), abhängig von der Länge jeder Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszone (Länge in Richtung der Elektrophorese).
  • Die für eine Nukleinsäure erforderliche Zeit, um durch eine Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung hindurch zu gehen, wird durch die Länge der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösung und die Wanderungsgeschwindigkeit der Nukleinsäure bestimmt. Die Frequenz des Durchlaufs einer Nukleinsäure durch eine Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung wird durch die Länge der Pufferlösung und die Wanderungsgeschwindigkeit der Nukleinsäure bestimmt. Auf diese Weise können verschiedene Doppelstrang-Nukleinsäuren in geeigneter Weise gemäß Unterschieden in der Basensequenz separiert werden, und zwar durch geeignetes Wählen der Länge der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszone, der Länge der Denaturierungsmittel freien Pufferlösungszone, der Wanderungsgeschwindigkeiten der Nukleinsäuren, der Denaturierungsmittelkonzentrationen der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungen, und der Gesamtlänge der unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung. Diese Parameter unterscheiden sich gemäß den Arten der zu analysierenden Nukleinsäuren, und die erforderliche Genauigkeit der Separation. Diese können durch vorläufige Experimente, die im Voraus ausgeführt werden, bestimmt werden. Beispielsweise kann die Länge und die Konzentration der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszone angepasst werden, um die Separation der Doppelstrang-Nukleinsäuren anzupassen. Wenn die Länge der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszone kurz ist, ist beispielsweise die Zeit, die die Nukleinsäuren durch die Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösungszone hindurchgehen, kurz, und auf diese Weise wird eine Detektion mit hoher Genauigkeit erreicht. Wenn die Denaturierungsmittelkonzentration der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszone gering ist, wird die Detektion mit hoher Genauigkeit möglich. Um die Separationsgenauigkeit zu steuern, wie oben erwähnt, können die Länge der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszone, die Länge der Denaturierungsmittel freien Pufferlösungszone, die Wanderungsgeschwindigkeit der Nukleinsäuren, die Denaturierungsmittelkonzentrationen der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungen, und die Gesamtlänge der unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung, je nach Erfordernis, angepasst werden.
  • In dem ersten Ausführungsbeispiel der unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung wird nur die Länge jeder Zone der Denaturierungsmittel freien Pufferlösung verändert. In dem zweiten Ausführungsbeispiel wird nur die Länge jeder Zone der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungen verändert. Diese Merkmale sind nicht begrenzend und die Länge jeder Zone der Denaturierungsmittel freien Pufferlösung und die Länge jeder Zone der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösung können beide verändert werden.
  • Die Ausführung des vorliegenden Ausführungsbeispiels auf einem Mikrochip ist dadurch vorteilhaft, dass kein Erfordernis für einen Vermischungsvorgang für Pufferlösungen bei einem Punkt stromaufwärts von dem Gradientenbildungsbereich besteht (die Vermischung auf einem analytischen Chip ist erforderlich in dem Fall des Bildens eines kontinuierlichen Gradienten eines Denaturierungsmittels wie in dem Ausführungsbeispiel A). Ein weiterer Vorteil ist kein Bedarf für Mittel zum Fördern der Vermischung auf einem derartigen analytischen Chip.
  • Die in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel verwendete Pufferlösung ist eine Pufferlösung, die, wo erforderlich, eine polymere Matrix enthält. Dies deshalb da Nukleinsäuren durch die Maschenstruktur der polymeren Matrix oder die Interaktion zwischen der polymeren Matrix und den Nukleinsäuren separiert werden können.
  • Die in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel verwendbare polymere Matrix kann in geeigneter Weise aus Polyacrylamid, Cellulosederivaten wie beispielsweise Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Hydroxycellulose und Methylcellulose, Polyethylenoxid, Polyolen wie beispielsweise Polymethylenpglycol, Polypropylenglycol, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon, Dextran, sowie Pullulan ausgewählt werden. Wenn die polymere Matrix Hydroxyethylcellulose ist, hängt ihre Konzentration von der Länge der Doppelstrang-Nukleinsäure ab, und liegt vorzugsweise im Bereich von 0,01 % bis 3,0%. Diese polymere Matrix wird in Tris-Acetat-Pufferlösung und Tris-Borat-Pufferlösung beinhaltet und wird als eine Pufferlösung verwendet. Die Pufferlösung kann jedoch in ein vorhandenes Platt engel getrieben werden, um eine Anordnung von Pufferlösungszonen zu bilden. Für ein Gel, das eine Maschenstruktur der polymeren Matrix bereits gebildet hat, kann eine Pufferlösung verwendet werden, die keine polymere Matrix besitzt.
  • Das in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel verwendete Denaturierungsmittel wird aus Harnstoff, Formamid, Formaldehyd und starken Alkalis, wie beispielsweise Natriumhydroxid ausgewählt. Bevorzugt sind Harnstoff und Formamid. Wenn Formamid und Harnstoff als ein Denaturierungsmittel verwendet werden, ist es allgemeine Praxis eine Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung, die 7M Harnstoff und 40% Formamid enthält, als eine 100% Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung zu verwenden, und eine Pufferlösung frei von dem Denaturierungsmittel als eine 0% Pufferlösung zu verwenden. Diese Praxis ist jedoch nicht beschränkend. In dem Ausführungsbeispiel B, wie es zuvor beschrieben wurde, reicht es, dass eine Anordnung von Pufferlösungszonen mit einem signifikanten Denaturierungsmittelkonzentrationsunterschied gebildet werden kann.
  • Ein repräsentatives Beispiel des Analyts in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel ist eine isolierte Doppelstrang-Nukleinsäure (kann einfach als eine Nukleinsäure oder ein Nukleinsäuremolekül bezeichnet werden), und irgendeine Art von Nukleinsäuremolekül kann verwendet werden, solange es durch das Denaturierungsmittel dissoziierbar ist. Typischerweise wird eine Doppelstrang-Nukleinsäure verwendet, die durch Verstärken eines bestimmten Bereichs einer Genomnukleinsäure (extrahiert aus biologischen Proben, wie beispielsweise menschlichem Blut oder Zellen, Nahrungsmitteln, Umweltproben, wie beispielsweise Erde, Flusswasser und Meerwasser, oder Aktivschlamm oder Methanfermentationsschlamm) durch eine PCR-Reaktion oder Ähnlichem gebildet ist, wobei dieser Bereich eine an einem Ende angebrachte künstliche Nukleinsäuresequenz (GC-Clamp) besitzt, die in minimaler Weise in eine Einzelstrang-Nukleinsäure dissoziiert, trotz einer hohen Nukleinsäuredenaturierungsmittelkonzentration. Das Analyt des vorliegenden Ausführungsbeispiels ist nicht notwendigerweise auf eine Nukleinsäure beschränkt. Wenn beispielsweise ein derartiges Biopolymer (z.B. Protein) elektrophoretisch durch Auswählen einer Pufferlösung, eines Denaturie rungsmittels und Separationsbedingungen, die geeignet sind, behandelt wird kann, kann das Biopolymer in dem Analyt des vorliegenden Ausführungsbeispiels umfasst sein.
  • Die Nukleinsäure, die auf der unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung des vorliegenden Ausführungsbeispiels separiert wird, wird durch ein Detektionsmittel detektiert. Das Detektionsmittel wird aus Fluoreszenzdetektion, Lumineszenzdetektion, Absorptionsdetektion und elektrochemischer Detektion ausgewählt. Als der Detektor wird ein Photomultiplier bzw. Photovervielfacher, ein UV-Detektor oder ein Photodiodendetektor im Fall der Fluoreszenzdetektion, Lumineszentdetektion oder Absorptionsdetektion verwendet. Beispiele der Fluoreszenzdetektion sind vorangehende Fluoreszenzmarkierung von Startern für die PCR-Reaktion, Fluoreszenzmarkierung eines PCR-Produkts, vorangehendes Färben eines PCR-Produkts mit einer DNA-Färbungsagens, und Hinzufügen einer DNA-Färbungsagens in eine Polymermatrix enthaltende Pufferlösung zum Färben während der Elektrophorese. Fluoreszenzmarkierungssubstanzen sind Fluoreszein, Rhodamin, Cy3, Cy5, BODIPYL FL, TexasRed, Alexa Fluor etc. Als die DNA-Färbungsagens sind, SYBR Green, Vistra Green, Ethidiumbromid, YOYO-1, TOTO-1 und Thiazolorange verfügbar.
  • (2) Separationsverfahren und -vorrichtung des vorliegenden Ausführungsbeispiels
  • Als Träger zum Ausführen der Nukleinsäureseparation des vorliegenden Ausführungsbeispiels wird ein analytisches Substrat, wie beispielsweise ein Plattengel, oder ein Elektrophoresemikrochip genannt.
  • Das in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel verwendbare Plattengel umfasst beispielsweise ein Polyacrylamidgel, das eine Pufferlösung enthält, dies ist aber nicht beschränkend. Das Polyacrylamidgel, das die Pufferlösung enthält, wird beispielsweise durch Vermischen einer Acrylamidlösung, die Acrylamid enthält, N,N-Methylen-Bisacrylamid und destilliertem Wasser, Tris-Acetat-Pufferlösung, Ammoniumpersulfatlösung, N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin und destilliertem Wasser, gefolgt von einem Polymerisieren der Mischung, gebildet. Irgendein Typ von Plattengel kann in Übereinstimmung mit dem bestehenden Verfahren, das in dem betroffenen technischen Gebiet bekannt ist, zubereitet werden.
  • Auf dem Plattengel wird die unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung durch das Verfahren zur Bildung von Pufferlösungszonen gebildet, das für das vorliegende Ausführungsbeispiel bevorzugt ist: Wenn das Plattengel verwendet wird, wird es beispielsweise in eine Elektrophoresezelle getaucht, die mit einer anderen Pufferlösung gefüllt ist, wie in 71 gezeigt, und eine Abdeckung wird auf die Zelle platziert, um die Verdunstung der Pufferlösung und der unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung zu verhindern. Wie in dem gewöhnlichen Elektrophoreseverfahren, sind Probenlöcher mit gleicher Beabstandung auf einer stromaufwärtigen Seite in Richtung der Elektrophorese auf dem Plattengel vorgesehen, und eine Elektrode und eine Leistungsquelle sind mit der Elektrophoresezelle verbunden, obwohl Details nicht gezeigt sind.
  • Der Träger umfasst nicht nur das Plattengel, sondern auch irgendeinen Typ eines analytischen Substrats, solange dieses die unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung tragen kann. Das Material für das Substrat kann beispielsweise aus Glas, Quarz, Kunststoffen, Siliconharzen und Papier ausgewählt werden. Das Substrat kann beispielsweise auch durch Laminieren eines Substrats, welches als eine Abdeckung zur Verhinderung der Verdunstung der unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung dient, auf das Substrat hergestellt werden, auf dem die unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung gebildet wurde. Darüber hinaus kann ein Teil des Substrats, auf dem die unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung gebildet wurde, gebogen werden, um als eine Abdeckung verwendet zu werden.
  • Ein typisches analytisches Substrat ist ein Mikrochip. Wie in 72 kann eine unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung in einem Mikrokanal gebildet werden, der ein Gradientenbildungsteil des Mikrochips ist. In dieser unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung des Mikrokanals sind Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösungszonen und Denaturierungsmittel freie Pufferlösungszonen abwechselnd in Richtung der Elektrophorese angeordnet, und die Breiten der Denaturierungsmittel freien Pufferlösungszonen werden zunehmend in Richtung der Elektrophorese verringert.
  • Der Mikrochip besteht üblicherweise aus zumindest zwei Substraten. Die Kanäle mit einer Breite und einer Tiefe in der Größenordnung von 10 bis 100 μm werden in einem Substrat durch die Verwendung einer Mikrostrukturherstellungstechnologie, wie beispielsweise einer Photolithographietechnologie gebildet, und Löcher für die Speicher werden in einem weiteren Substrat durch die Verwendung einer Verarbeitungstechnik, wie beispielsweise eine Ultraschallverarbeitung erzeugt. Wenn diese beiden Substrate durch eine Bondungstechnik, wie beispielsweise einem Schmelzbonden durch Wärme, laminiert werden, wird ein Mikrochip erhalten, der die Kanäle und Speicher bei vorbestimmten Positionen besitzt. Das Material für das Substrat kann, je nach Eignung, aus Glas, Quarz, Kunststoffen und Silikonharzen ausgewählt werden. Bei dem Mikrochip besitzen die analytischen Kanäle Mikrostrukturen, so dass eine Analyse mit hohem Durchlass und eine Verkleinerung der gesamten Vorrichtung realisiert werden kann.
  • Als nächstes wird die Mikrochipelektrophoresevorrichtung des Ausführungsbeispiels B beschrieben.
  • Die Mikrochipelektrophoresevorrichtung der 73 wird als ein Kunststoffmikrochip 903 einschließlich eines Mikrokanals 901, der ein Gradientenbildungsteil (im Folgenden als „Nukleinsäureanalysekanal 901" bezeichnet), und eines Mikrokanals 902 zum Einleiten einer Nukleinsäureprobe vorgesehen. Eine unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung ist in dem Nukleinsäureanalysekanal 901 gebildet. Der Mikrochip wird durch Lamination eines Kunststoffsubstrats 903a, das darauf gebildet die obigen Kanäle 901, 902 besitzt, und eines Kunststoffsubstrats 3b mit einem Nukleinsäureinlass 902a für die Probeneinleitung, einem Nukleinsäureauslass 902b, einem ersten Speicher 901a und einem zweiten Speicher 901b vorgesehen.
  • Ein Beispiel des Ablaufs für das Verfahren zum Separieren von Doppelstrang-Nukleinsäuren durch einen Unterschied in der Basensequenz unter Ver wendung des Mikrochips der 73 wird unten gezeigt. Eine Pufferlösung wird in den Nukleinsäureeinleitungskanal 902 eingefüllt. Das Verfahren zum Einleiten einer Probe in den Nukleinsäureanalysekanal 901 ist ein Verfahren durch welches Doppelstrang-Nukleinsäuren als eine Probe in den Nukleinsäureanalysekanal 901 durch die Elektrophorese eingeleitet werden. Eine Pufferlösung, die Doppelstrang-Nukleinsäuren enthält, wird in den Nukleinsäureeinlass 902a platziert, und Elektroden (nicht gezeigt), die mit Gleichstromleistungsquellen verbunden sind, werden in den Nukleinsäureeinlass 902a und den Nukleinsäureauslass 902b eingesteckt. Die Nukleinsäureprobe umfasst eine Doppelstrang-Nukleinsäure, die verstärkt wurde, wobei eine künstliche Doppelstrang-Nukleinsäuresequenz (GC-Clamp) an einem Ende der Nukleinsäure angebracht ist, wobei die künstliche Nukleinsäuresequenz in minimaler Weise in eine Einzelstrang-Nukleinsäure dissoziiert, trotz einer hohen Nukleinsäuredenaturierungsmittelkonzentration. Da die Doppelstrang-Nukleinsäuren negativ geladen wurden; wird die Nukleinsäureeinlassseite kathodisch, und die Nukleinsäureauslassseite anodisch gemacht. Die verwendeten Elektroden können im Voraus bei dem Nukleinsäureeinlass und dem Nukleinsäureauslass beispielsweise durch Vakuumablagerung oder Plattieren gebildet werden. Wenn die Doppelstrang-Nukleinsäuren eingeleitet werden, sollte die Diffusion der Probe zu dem Nukleinsäureanalysekanal 1 hin, ratsamer Weise unterdrückt werden. Zu diesem Zweck ist es empfehlenswert, die Elektroden in den ersten Speicher 901a und den zweiten Speicher 902a zu stecken, und Potentiale anzulegen, die höher als das Potential des Nukleinsäureeinlasses 902a und niedriger als das Potential des Nukleinsäureauslasses 902b sind.
  • Dann werden die Elektroden (nicht gezeigt), die mit Gleichstromleistungsquellen verbunden sind, an beiden Enden des Nukleinsäureanalysekanals 901 angebracht. Da die Doppelstrang-Nukleinsäuren negativ geladen wurden, wird die Seite des ersten Speichers kathodisch gemacht und die Seite des zweiten Speichers wird anodisch gemacht. Die Elektroden können im Voraus bei dem ersten Speicher und dem zweiten Speicher beispielsweise durch Vakuumablagerung oder Plattieren gebildet werden. Die wie oben eingeleiteten Doppelstrang-Nukleinsäuren werden in der unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung elektrophoretisch behandelt, und zwar durch Anlegen vorbestimmter Potentiale an die Elektroden, die in den ersten Speicher und den zweiten Speicher gesteckt werden, und durch Anlegen einer vorbestimmten Spannung zwischen die Elektroden, die an beiden Enden des analytischen Substrats angebracht sind. Die elektrophoretisch behandelten Doppelstrang-Nukleinsäuren werden in der unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung gemäß einem Unterschied in der Basensequenz separiert.
  • Die durch den oben erwähnten Ablauf separierten Nukleinsäuren werden innerhalb des Nukleinsäureanalysekanal 901 oder eines Detektionsteils 905, der stromabwärts von diesem Kanal gelegen ist, detektiert. Das verwendbare Detektionsverfahren wird, wie zuvor erklärt, aus der Fluoreszenzdetektion, der Lumineszenzdetektion, der Absorptionsdetektion und der elektrochemischen Detektion ausgewählt. Das bevorzugte Verfahren ist die die Fluoreszenzdetektion. Beispiele der Fluoreszenzdetektion sind vorangehende Fluoreszenzmarkierung von Startern für die PCR-Reaktion, Fluoreszenzmarkierung eines PCR-Produkts, vorangehendes Färben eines PCR-Produkts mit einer DNA-Färbungsagens, und Hinzufügen einer DNA-Färbungsagens in eine Polymermatrix enthaltende Pufferlösung zum Färben während der Elektrophorese. Fluoreszenzmarkierungssubstanzen sind die zuvor erwähnten, und der Detektor ist ebenfalls wie zuvor beschrieben. Während der Analyse müssen die analytischen Substrate 903a, 903b bei einer konstanten Temperatur von vorzugsweise 40°C bis 70°C gehalten werden.
  • Der verwendete Mikrochip kann aus Glas bestehen. Da der Glasmikrochip den Effekt einer elektroosmotischen Strömung erhöht, sollte die Oberfläche des Kanals wünschenswerter Weise durch eine allgemein bekannte Technik zur Unterdrückung der elektroosmotischen Strömung modifiziert werden. Durch diese Behandlung können Doppelstrang-Nukleinsäuren durch die Elektrophorese auf dem Glasmikrochip der gleichen Konfiguration wie der eines Kunststoffmikrochips separiert werden.
  • 74 zeigt ein Ausführungsbeispiel einer Glasmikrochipelektrophoresevorrichtung. Selbst bei dem Vorhandensein einer elektroosmotischen Strömung kann die Analyse der Doppelstrang-Nukleinsäuren durch eine Konfiguration, wie sie in 74 gezeigt ist, vorgenommen werden. Die Grundstruktur dieser Vorrichtung ist die Gleiche wie die des Mikrochips der 5, aber unterscheidet sich dadurch dass der Nukleinsäureeinleitungskanal 2 auf der stromabwärtigen Seite vorgesehen ist.
  • Zunächst werden Doppelstrang-Nukleinsäuren, die als eine Probe dienen, von dem Nukleinsäureeinleitungskanal 2 in einen Nukleinsäureanalysekanal 901 mit einer unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung durch die Wirkung einer elektroosmotischen Strömung eingeleitet. Eine Pufferlösung, die Doppelstrang-Nukleinsäuren enthält, wird in einem Nukleinsäureeinlass 902a angeordnet, und Elektroden, die mit Gleichstromleistungsquellen verbunden sind, werden in den Nukleinsäureeinlass 902a und einen Nukleinsäureauslass 902b eingeführt. Eine vorbestimmte Spannung wird zwischen den Nukleinsäureeinlass und den Nukleinsäureauslass angelegt, wodurch die Pufferlösung, die die Doppelstrang-Nukleinsäuren enthält, durch den Nukleinsäureeinleitungskanal 902 durch die elektroosmotische Strömung bewegt wird, und in den Nukleinsäureanalysekanal 901 eingeleitet wird. Um die elektroosmotische Strömung zu nutzen, wird die Nukleinsäureeinlassseite anodisch gemacht und die Nukleinsäureauslassseite wird kathodisch gemacht. Wenn die Doppelstrang-Nukleinsäuren eingeleitet werden, sollte ihre Diffusion zu dem Nukleinsäureanalysekanal 901 hin ratsamer Weise unterdrückt werden. Zu diesem Zweck ist es empfehlenswert, die Elektroden in einen ersten Speicher 901a und einen zweiten Speicher 901b zu stecken, und Potentiale anzulegen, die niedriger als das Potential des Nukleinsäureeinlasses 902a und höher als das Potential des Nukleinsäureauslasses 902b sind. Die Elektroden können im Voraus beispielsweise durch Vakuumabscheidung bzw. Vakuumaufdampfen oder Plattieren gebildet werden.
  • Dann werden die eingeleiteten Doppelstrang-Nukleinsäuren für die Separation elektrophoretisch behandelt. Eine vorbestimmte Spannung wird an die Elektroden angelegt, die in den ersten Speicher 901a und den zweiten Speicher 901b gesteckt sind, wodurch Pufferlösungszonen der unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung innerhalb des Nukleinsäureanalysekanals 901 durch eine elektroosmotische Strömung transportiert werden. Die in die Pufferlösungszonen eingeleiteten Doppelstrang-Nukleinsäuren wandern ebenfalls bei der geleiteten Doppelstrang-Nukleinsäuren wandern ebenfalls bei der Elektrophorese. Im Allgemeinen sind die Bewegungsrichtung der unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung durch die elektroosmotische Strömung und die Bewegungsrichtung der Nukleinsäuren durch die Elektrophorese entgegengesetzt zueinander (einander entgegengesetzte Richtungen). Auf diese Weise wird, wenn die unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung der 74 verwendet werden soll, der erste Speicher 901a anodisch gemacht, und der zweite Speicher 901b wird kathodisch gemacht. Dadurch bewegt sich die unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung zu dem zweiten Speicher 901b hin, während sich die Doppelstrang-Nukleinsäuren zu dem ersten Speicher 901a hin bewegen. Auf diese Weise werden die Doppelstrang-Nukleinsäuren in der unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung elektrophoretisch behandelt und gemäß einem Unterschied in der Basensequenz separiert.
  • Die durch das oben beschriebene Verfahren separierten Doppelstrang-Nukleinsäuren werden innerhalb der unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung oder bei einem Detektionsteil (nicht gezeigt), der stromabwärts dieser Anordnung gelegen ist, detektiert.
  • 75 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel der Glasmikrochipelektrophoresevorrichtung. Diese Vorrichtung weist einen Nukleinsäureanalysekanal 901 (erster Mikrokanal), wo eine unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung gebildet werden soll, einen Einleitungsteil für eine Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung, der den Nukleinsäureanalysekanal 901 an einer Endseite dieses Kanals schneidet, sowie einen Nukleinsäureeinleitungsteil auf, der den Nukleinsäureanalysekanal 901 auf der anderen Endseite dieses Kanals schneidet. Ein erster Speicher 901a dient als ein Pufferlösungseinlass für eine erste Pufferlösung, und ein zweiter Speicher 901b dient als ein Auslass für diese Pufferlösung.
  • Der Einlassteil für die Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung besitzt einen Einleitungskanal 906 für die Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung (zweiter Mikrokanal), der den Nukleinsäureanalysekanal 901 kreuzt. Der Einleitungskanal 906 für die Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung besitzt ei nen Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösungseinlass 906a für das Einleiten einer zweiten Pufferlösung, und einen Auslass 906b für diese Pufferlösung. Die zweite Pufferlösung wird durch den Einleitungskanal 906 für die Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung eingeleitet.
  • Der Nukleinsäureeinleitungsteil besitzt einen Nukleinsäureprobeneinleitungskanal 902, der den Nukleinsäureanalysekanal 901 kreuzt. Der Nukleinsäureprobeneinleitungskanal 902 besitzt einen Nukleinsäureeinlass 902a und einen Auslass 902b für diese Probe.
  • Die Vorrichtung der 75 ist ein Mikrochip, der beispielsweise durch Laminieren eines Substrats 903a (siehe 76(a)) und eines Substrats 903b (siehe 76(b)) durch eine Bondungstechnik, wie beispielsweise Schmelzbonden durch Wärme, erzeugt wird, wobei das Substrat 903a darauf gebildet den Nukleinsäureanalysekanal 901, den Einleitungskanal 906 für die Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung und den Nukleinsäureeinleitungskanal 902 besitzt, und das Substrat 903b auf sich den Pufferlösungseinlass und den Auslass dafür, den Nukleinsäureeinlass und den Auslass dafür, und den Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungseinlass und den Auslass dafür bei den entsprechenden Kanalenden aufweist. Die Löcher für die entsprechenden Speicher sind beispielsweise kreisförmige Löcher mit einem Durchmesser von 2 bis 10 mm und sie sind beispielsweise durch eine gut bekannte Verarbeitungstechnik, wie beispielsweise Ultraschallverarbeiten, gebildet.
  • In der Vorrichtung der obigen Konfiguration kann eine gewünschte unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung, wie sie in 77 gezeigt ist, in dem Nukleinsäureanalysekanal 901 durch den Einleitungsteil für die Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung gebildet werden. Das Verfahren zum Bilden von diesem wird später im Detail in dem Absatz „(3) Verfahren und Vorrichtung zum Bilden der Pufferlösungszonen für das Ausführungsbeispiel B" beschrieben. Hier wird die Mikrochipelektrophoresevorrichtung der 75 verwendet, und ein Separationsschritt, der nach dem Bilden einer unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung in dem Nukleinsäureanalysekanal 1 ausgeführt wird, wird gezeigt werden.
  • Nachdem eine gewünschte unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung in dem Nukleinsäureanalysekanal 901 gebildet wurde, werden die Doppelstrang-Nukleinsäuren von dem Nukleinsäureeinlass 902a zu dem Nukleinsäureauslass 902b geströmt, um die Doppelstrang-Nukleinsäuren in den Nukleinsäureanalysekanal 901 einzuleiten. Das Verfahren zum Strömen der Doppelstrang-Nukleinsäuren kann beliebig aus den Verfahren ausgewählt werden, die imstande sind, die Strömungsrichtung und die Strömungszeit (Strömungsentfernung) zu steuern. In dem Fall eines Glasmikrochips ist es bevorzugt, ein Verfahren auszuführen, in dem eine Gleichstromspannung zwischen den Nukleinsäureeinlass 902a und den Nukleinsäureauslass 902b angelegt wird, um eine elektroosmotische Strömung zu erzeugen. Damit eine Überschussprobe nicht in den Nukleinsäureanalysekanal 901 während eines Doppelstrang-Nukleinsäureeinleitungsschritts abläuft, ist es empfehlenswert, beispielsweise eine Gleichstromspannung anzulegen oder einen Druck auf den Pufferlösungseinlass 901a, den Auslass 901b dafür, den Einlass 906a für die Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung und den Auslass 906b dafür auszuüben.
  • Dann werden die Elektroden in den Pufferlösungseinlass 901a und den Auslass 901b eingeführt, und eine vorbestimmte Gleichstromspannung wird dazwischen angelegt. Infolgedessen werden die eingeleiteten Doppelstrang-Nukleinsäuren in der unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung in dem Nukleinsäureanalysekanal 901 elektrophoretisch behandelt und gemäß einem Unterschied in der Basensequenz separiert. Die Elektroden können im Voraus auf dem Chip gebildet werden, beispielsweise durch Vakuumablagerung oder Plattieren. Wenn simultan eine elektroosmotische Strömung in dem Fall eines Glasmikrochips oder Ähnlichem auftritt, strömt die unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung in einer Richtung entgegengesetzt zu der Richtung der Elektrophorese der Doppelstrang-Nukleinsäuren, und zwar strömt sie zu der Kathode unter der Wirkung der elektroosmotischen Strömung hin. In diesem Fall ist es notwendig, die unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung in dem Nukleinsäureanalysekanal 901 derart zu bilden, dass sich die Längen der Pufferlösungen progressive in der Richtung der Elektrophorese der Nukleinsäuren verkürzen, wie beispielsweise in der 77 gezeigt.
  • Nachdem die Doppelstrang-Nukleinsäuren in der Nukleinsäureprobe durch das oben erwähnte Verfahren getrennt wurden, werden die Doppelstrang-Nukleinsäuren bei einer vorbestimmten Position in dem Nukleinsäureanalysekanal 901, beispielsweise bei einem Detektionsteil (nicht gezeigt), der stromabwärts von dem Nukleinsäureanalysekanal 901 gelegen ist, detektiert. Während der Analyse muss der Mikrochip auf einer konstanten Temperatur von vorzugsweise 40°C bis 70°C gehalten werden. Das verwendbare Denaturierungsmittel und die Pufferlösung, die analysierbare Probe und das Detektionsverfahren sind ebenfalls die gleichen wie die für die zuvor erwähnte Vorrichtung.
  • (3) Verfahren und Vorrichtung zum Bilden der Anordnung der Pufferlösungszonen für das Ausführungsbeispiel B
  • Bei der herkömmlichen DGGE war es erforderlich, die Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung mit einem kontinuierlichen Konzentrationsgradienten vorzusehen. In dem in der Mikrochipelektrophoresevorrichtung verwendeten Mikrokanal bestand jedoch das Erfordernis für ausreichend Zeit zum Vermischen der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösung und der Pufferlösung, oder es bestand das Erfordernis eines Mechanismus zum effizienten Vermischen der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösung und der Pufferlösung.
  • Gemäß der Erfindung des Ausführungsbeispiels B werden die Nukleinsäure in der in dem Mikrokanal gebildeten unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung elektrophoretisch behandelt. Auf diese Weise kann eine Nukleinsäureseparation erreicht werden, selbst wenn die Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung und die Pufferlösung überhaupt nicht vermischt werden. Es besteht kein besonderes Erfordernis von Rührmitteln zum Vermischen der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösung und der Pufferlösung.
  • Ein erwünschtes Verfahren und Vorrichtung zum Bilden einer Anordnung von Pufferlösungszonen, die in dem Separationsverfahren des Ausführungsbeispiels B verwendet werden können, werden vorgesehen werden.
  • 78 zeigt ein Ausführungsbeispiel für eine Vorrichtung zum Bilden einer Pufferlösungszonenanordnung. Diese Vorrichtung ist eine Vorrichtung zum Bilden einer Anordnung von Pufferlösungszonen, die ein Denaturierungsmittel für Doppelstrang-Nukleinsäuren mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, und zwar auf einem analytischen Substrat 910 für die Elektrophorese. Diese Vorrichtung weist Tischmittel 911 zum Halten des analytischen Substrats 910, Ausstoßmittel 912 zum Ausstoßen von Tröpfchen 913 der Pufferlösungen, die ein Denaturierungsmittel für Doppelstrang-Nukleinsäuren mit unterschiedlichen Konzentrationen (z.B. Tröpfchen von sowohl einer Denaturierungsmittel freien Pufferlösung als auch einer Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösung) zu einem Substrat 910 hin, und Steuermittel (nicht gezeigt) für die Positionssteuerung des Tischmittels 911 und/oder des Ausstoßmittels 912 und zum sequentiellen Antreiben des Ausstoßmittels auf. Das Tischmittel 911 und/oder das Ausstoßmittel 912 besitzen oder besitzt einen Bewegungsmechanismus, der es ermöglicht, dass diese Mittel sich geradlinig relativ zueinander in einer zweidimensionalen Richtung bewegen, wie in der Zeichnung durch Pfeile gezeigt.
  • In der Vorrichtung der 78 wird das Substrat 910, das den oben erwähnten Nukleinsäureanalysekanal 1 besitzt, wie beispielsweise ein Mikrochip, auf dem Tischmittel 911 gehalten. Das Ausstoßmittel 912, das imstande ist, die Tröpfchen 913 der Pufferlösung, die kein Denaturierungsmittel enthält und/oder der Pufferlösung die Denaturierungsmittel enthält auszustoßen, wird für das Substrat 910 verwendet. Ebenfalls können das Tischmittel 911 und/oder das Ausstoßmittel 912 positionsgesteuert werden, und das erwünschte Ausstoßmittel 912 kann sequentiell angetrieben werden. In dieser Art und Weise können die Tröpfchen 913 der Pufferlösung einer vorbestimmten Denaturierungsmittelkonzentration von dem Ausstoßmittel 912 auf eine beliebige Position in dem Nukleinsäureanalysekanal 901 abgeschieden werden, wodurch dort eine unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung gebildet werden kann. Wenn die Dicke der Pufferlösung, die durch einen einzelnen Ausstoß beschichtet ist, zu gering ist, können Schichten exakt der gleichen Verteilung (des gleichen Denaturierungsmittelbereichs) zu einer geeigneten Dicke gestapelt werden.
  • Das obige Ausstoßmittel 912 kann detaillierter aus einem Ausstoßmechanismus mit einem Tröpfchenausstoßkopf konstituiert sein. Beispielsweise kann die Pufferlösung bei einem Ziel mit einem beliebigen Timing durch Anlegen eines elektrischen Signals über Steuermittel (nicht gezeigt) ausgestoßen werden.
  • Die einfachste Art und Weise besteht darin, ein Substrat vorzusehen, in dem ein Gel, das eine Pufferlösung enthält, gebildet wurde, und einen Tröpfchenausstoßkopf 912 für das Ausstoßen einer Pufferlösung mit einer Denaturierungsmittelkonzentration unterschiedlich von der Konzentration der Pufferlösung in dem Gel (d.h. einer Konzentration, die zumindest höher als die in dem Gel enthaltene Pufferlösung ist) zu verwenden. Dies ist ein Fall, wo beispielsweise ein Mikrochip, der bereits mit einem Gel, das eine Pufferlösung enthält, in dem Nukleinsäureanalysekanal gefüllt ist, oder ein Flachgel 914, das eine Pufferlösung enthält, verwendet wird. (79).
  • Wenn ein Nukleinsäureanalysekanal oder ein Glassubstrat ohne ein Gel verwendet wird, kann andererseits eine Vielzahl von Tröpfchenausstoßköpfen 912, 912', die Pufferlösungen unterschiedlicher Konzentrationen entsprechen, vorgesehen werden, wie in 78 gezeigt, und die erwünschten Tröpfchen können selektiv ausgestoßen werden. In diesem Fall wird eine polymere Matrix zum Bilden eines Gels gewöhnlicher Weise in der Pufferlösung untergebracht.
  • Als der oben beschriebene Tröpfchenausstoßmechanismus kann beispielsweise ein Ausstoßkopf für einen Tintenstrahldrucker verwendet werden. Durch Verwenden eines geeigneten Tröpfchenausstoßkopfs können Pufferlösungströpfchen 913, die zumindest einen kleineren Durchmesser als die Breite des Nukleinsäureanalysekanals 1 auf dem Mikrochipsubstrat 910 besitzen, in einfacher Weise beschichtet werden.
  • Als der obige Tröpfchenausstoßmechanismus können eine Vielzahl von Tröpfchenausstoßköpfen zum Ausstoßen einer Pufferlösung der gleichen Konzentration miteinander verbunden und verwendet werden. Dadurch kann die Bildungszeit einer unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung verkürzt werden. Es können ebenfalls Tröpfchenausstoßköpfe zum Ausstoßen von Pufferlösungen unterschiedlicher Konzentrationen miteinander verbunden werden. Zum Beispiel können Tröpfchenausstoßköpfe für eine Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung und Tröpfchenausstoßköpfe für eine Pufferlösung integral kombiniert werden, um ein Ausstoßkopfmodul aufzubauen. Die Verwendung eines derartigen Ausstoßkopfmoduls kann die Vorrichtung kompakt machen und die Bildungszeit der unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung verkürzen. Darüber hinaus wird eine Vielzahl derartiger Tröpfchenausstoßkopfmodule vorgesehen und verwendet, wodurch eine unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung mit noch höherer Effizienz bzw. Wirkungsgrad gebildet werden kann.
  • Außerdem kann, wie in 79 gezeigt, ein Plattengel 914 für die Elektrophorese anstelle des Mikrochipsubstrats 910 bereitgehalten werden, und die Tröpfchen 913 einer Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösung können bei einer beliebigen Position auf dem Plattengel 914 ausgestoßen werden. Auf diese Art und Weise können die Tröpfchen 913 der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösung zu einem beliebigen Platz auf dem Plattengel 914 getrieben bzw. geführt werden, wodurch eine unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung in effizienter Weise in einem beliebigen Muster an der Stelle gebildet werden kann.
  • Wie oben beschrieben, kann eine unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung mit einem beliebigen Muster in einfacher Weise durch Einsetzen eines Positionierungsmittels (911) und eines Tröpfchenausstoßmittels (912) gebildet werden. Zusätzlich können diese Mittel auf irgendeine Art von Substrat angewendet werden, und ihre Verwendung macht es möglich, eine unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung des gleichen Musters mit hoher Effizienz, mit zufriedenstellender Reproduzierbarkeit und in hohem Umfang zu bilden.
  • Als nächstes wird ein weiteres Verfahren zum Bilden einer unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung in einem Mikrokanal mit Bezugnahme auf die 80 und die 81 beschrieben.
  • Zunächst wird eine Pufferlösung (erste Pufferlösung; eine Pufferlösung die kein Denaturierungsmittel enthält) von einem Pufferlösungseinlass zu einem Auslass hin durch einen Pufferlösungseinspeisungsschritt geströmt. Das Verfahren des Antreibens der Pufferlösung kann beliebig aus den Verfahren ausgewählt werden, die imstande sind, die Strömungsrichtung und Strömungszeit (Strömungsentfernung) zu steuern, wie beispielsweise ein Verfahren zum Anlegen einer Gleichstromspannung zwischen dem Pufferlösungseinlass und dem Auslass, um eine elektroosmotische Strömung zu erzeugen, sowie ein Verfahren zum Verbinden einer Pumpe oder von Pumpen mit dem Pufferlösungseinlass und/oder dem Auslass, um die Pufferlösung strömen zu lassen. Während des Pufferlösungseinspeisungsschritts sollte Acht darauf gegeben werden, dass die Pufferlösung nicht aus dem Nukleinsäureanalysekanal zu dem Nukleinsäureeinleitungskanal oder dem Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungseinleitungskanal abfließt. Zu diesem Zweck ist es bevorzugt, beispielsweise eine Direktstromspannung an den Nukleinsäureeinlass, den Nukleinsäureauslass und den Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungsauslass anzulegen oder einen Druck auf diese auszuüben. Das Verfahren und der Ablauf zum Antreiben der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösung in dem Einleitungskanal für die Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung sind die gleichen wie das oben erwähnte Verfahren zum Antreiben der Pufferlösung usw.
  • In dem Pufferlösungseinspeisungsschritt wird eine Pufferlösungszone in den Nukleinsäureanalysekanal 901 eingeleitet, und die Pufferlösungszone wird bis zu einem Punkt eingeleitet, der hinter der Kreuzung des Nukleinsäureanalysekanals 901 und des Kanals 906 liegt. Dann wird, wie in 80 gezeigt, eine Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung (zweite Pufferlösung) durch den Kanal 906 durch einen Einspeisungsschritt für die Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung eingespeist. Infolgedessen kreuzt eine Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösungszone von dem Kanal 906 die Pufferlösungszone des Kanals 901 in senkrechter Weise. Auf diese Art und Weise wird eine Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösungszone, die die Pufferlösungszone teilt, gebildet. Dann wird in einem Pufferlösungsrückführungsschritt der Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösungszonenteil, der in dem Kanal 901 gelegen ist, von dem Kanal 906 separiert, und zu dem Auslass gemeinsam mit der Pufferlösungszone bewegt. Auf diese Weise wird eine unabhängige einzelne Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösungszone 901c in der Pufferlösungszone gebildet.
  • Wie oben beschrieben werden der Pufferlösungseinspeisungsschritt und der Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösungseinspeisungsschritt abwechselnd wiederholt, wodurch eine unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung in dem Nukleinsäureanalysekanal 901 gebildet werden kann. Der Abstand zwischen der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszone und der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszone kann beliebig durch Anpassen der Zeit des Pufferlösungseinspeisungsschritts angepasst werden. Beispielsweise kann ein unterbrochener Denaturierungsmittelanordnungskanal einer Form gebildet werden, in der der Abstand zwischen den Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszonen kleiner zu der stromabwärtigen Seite hin wird, wie in 69 gezeigt.
  • Die Länge des Nukleinsäureanalysekanals, die Länge der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösung, die Konzentration der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösung, und der Abstand zwischen den Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungen unterscheidet sich gemäß den Arten von Doppelstrang-Nukleinsäuren, die separiert werden sollen. Folglich sollten sie durch vorausgehende Experimente etc., welche im Voraus durchgeführt werden, bestimmt werden.
  • 81 zeigt ein Beispiel eines Verfahrens, welches die Länge (Breite) in Richtung der Elektrophorese einer Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszone verringern kann. Durch Verringern der Länge der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszone in Richtung der Elektrophorese kann die Genauigkeit der Separation von Doppelstrang-Nukleinsäuren erhöht werden. Die Länge der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszone in Richtung der Elektrophorese, die durch das Verfahren der 80 gebildet wird, ist nahezu gleich der Länge des Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungseinlasses. Um die Länge einer derartigen Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszone zu verringern, reicht es aus, den Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungseinlass zu verengen. Das Verengen des Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungseinlasses verursacht jedoch eine deutliche Zunahme beim Strömungsverlust. Auf diese Weise kann eine sehr große Leistung erforderlich sein, um die Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung strömen zu lassen.
  • Um das obige Problem zu vermeiden, ist es empfehlenswert, einen Hilfspufferlösungskanal 906' benachbart zu dem Einleitungskanal 906 für die Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung, wie in 81 gezeigt, vorzusehen. Durch das derartige Erhöhen des Zustroms einer Hilfspufferlösung von den Einlässen 906c, 906d der Hilfspufferlösungskanäle 906', kann die Zustrombreite der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösung verringert werden, die Länge der Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungszone kann schrittweise in Richtung der Elektrophorese verkürzt, und simultan ein Anstieg im Zustromverlust verhindert werden. Eine Vielzahl von Hilfspufferlösungskanälen und Einlässen kann vorgesehen werden, um den Denaturierungsmittel enthaltenden Pufferlösungseinleitungskanal 6, wie in 81 gezeigt, sandwichartig zu umgeben, oder nur ein Hilfspufferlösungskanal und nur ein Einlass können neben dem Pufferlösungseinleitungskanal 6 vorgesehen sein.
  • Vorrichtung zum Bilden einer Anordnung von Pufferlösungszonen des Ausführungsbeispiels B mit einem Strömungsratensteuerungsmittel
  • In der Vorrichtung des Ausführungsbeispiels B kann das Mittel zum Steuern der Strömungsraten der Pufferlösungen von den Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen, wie in den Ausführungsbeispielen 1-1 und 1-2 beschrieben (z.B. Steuerung einer elektroosmotischen Strömung durch Anpassen einer angelegten Spannung oder eines angelegten Potentials, Steuerung einer Flüssigkeitseinspeisungspumpe durch Anpassen des Drucks der Flüssigkeitseinspeisung durch die Verwendung einer Mikrospritze oder Ähnlichem, oder Steuerung eines Ventils zum zweit rangigen Anpassen der Flüssigkeitseinspeisung durch diese), als ein Mittel zum Bilden der oben beschriebenen unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung verwendet werden.
  • In der Vorrichtung des Ausführungsbeispiels B kann unter der Annahme, dass Pufferlösungen mit einem Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen minimal mischbar durch molekulare Diffusion sind (wie zuvor beschrieben kann die Vermischung nicht auftreten, wenn der Diffusionskoeffizient der Flüssigkeit extrem gering ist), das in den Ausführungsbeispielen 1-1 und 1-2 gezeigte Strömungsratensteuerungsmittel für das abwechselnde Liefern von Puffern verwendet werden, um eine unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung zu bilden.
  • 83 zeigt ein Ausführungsbeispiel, das mit schnell arbeitenden Ventilen angebracht ist, die in dem Ausführungsbeispiel 1-2 beschrieben sind. In diesem Ausführungsbeispiel ist jeder der beiden Pufferlösungseinleitungskanäle (ein Einleitungskanal für eine Pufferlösung die kein Denaturierungsmittel enthält und ein Einleitungskanal für eine Pufferlösung die ein Denaturierungsmittel enthält) mit einem schnell arbeitenden Ventil (Ventil 1 und Ventil 2) vorgesehen. Durch Steuern der Öffnungs- und Schließzeit des Ventils 1 und des Ventils 2 kann eine unterbrochene Denaturierungsmittelanordnung in einem Nukleinsäureanalysekanal 1 gebildet werden, wie in 83 gezeigt.
  • Mikrochipelektrophoresevorrichtung des Ausführungsbeispiels A mit einem Vermischungsförderungsmittel
  • In den Vorrichtungen zum Bilden einer unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung, die in den 78 und 79 gezeigt sind, können Vermischungsförderungsmittel verwendet werden.
  • 84 zeigt schematisch ein Ausstoßmittel 912. Ein Pfeil a und ein Pfeil b stellen Eingabepfade für die Pufferlösungen, die ein Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, dar. Das Ausstoßmittel 912 beinhaltet eine Vermischungsvorrichtung (nicht gezeigt), die zwei Pufferlösungen, die ein Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, beispielsweise eine Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung (Pfeil a) und eine Denaturierungsmittel freie Pufferlösung (Pfeil b) mit einem beliebigen Verhältnis vermischen kann.
  • Als die Vermischungsvorrichtung in dem Ausstoßmittel 912 kann eine Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung mit dem Vermischungsförderungsmittel der zuvor erwähnten Ausführungsbeispiels 1-1 bis 2-3 verwendet werden. Gemäß der Vermischungsvorrichtung mit einem geeigneten Vermischungsförderungsmittel wird die Vermischung der beiden Pufferlösungen, angezeigt durch den Pfeil a und den Pfeil b, unverzüglich ausgeführt. Auf diese Weise kann eine Pufferlösung, die das Denaturierungsmittel mit der erwünschten Konzentration enthält, kontinuierlich zubereitet werden.
  • Eine durch Vermischung mittels der Vermischungsvorrichtung zubereitete Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösung wird von dem Ausstoßmittel 912 als Tröpfchen 913 der gewünschten Konzentration ausgestoßen. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel wird es möglich, kontinuierlich Denaturierungsmittel enthaltende Pufferlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen zu liefern. Auf diese Weise wird es überflüssig, einen Einsatz bzw. eine Patrone zum Liefern von Pufferlösungen unterschiedlicher Konzentrationen zu ersetzen. Noch besteht der Bedarf ein Ausstoßmittel eines Patronentyps zu verwenden. Noch ist es notwendig eine Vielzahl von Ausstoßmitteln anzubringen. Gemäß einem Ausführungsbeispiel, das diesen Typ eines Ausstoßmittels aufweist, können eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Bilden einer unterbrochenen Denaturierungsmittelanordnung, die geeignet für Massenproduktion einiger Arten geeignet ist, vorgesehen werden.
  • Wenn die Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des Ausführungsbeispiels 2-2 als Vermischungsförderungsmittel in der Ausstoßvorrichtung 912 verwendet wird, kann beispielsweise die Vermischung der Pufferlösungen mit einer hohen Geschwindigkeit durchgeführt werden. Auf diese Weise kann die Zeit vom Empfang der Information über die Vermischungskonzentration bis zur Vollendung der Vermischung verkürzt werden. Wenn die Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung des Ausführungsbeispiels 2-3 als das Ausstoßmittel verwendet wird, wird darüber hinaus die Vorrichtung kompakt gemacht.
  • [Beispiele]
  • Beispiel 1
  • Zwei Doppelstrang-Nukleinsäuren mit unterschiedlichen Basensequenzen wurden durch die Verwendung einer Mikrochipelektrophoresevorrichtung, wie sie in jedem der zuvor erwähnten Ausführungsbeispiele beschrieben ist, separiert. Eine Nukleinsäurenprobe, die einen V3-Bereich des 16S rRNA Gens enthält, das von zwei Mikroorganismen der Gattung Sphingomonas erhalten wurde, wurde als ein Analyt vorbereitet.
  • In den Experimenten wurden zwei Mikroorganismen in flüssigen Medien gezüchtet und dann durch Zentrifugation gesammelt. Die Zellen wurden vermischt und die Nukleinsäuren wurden aus den vermischten Zellen extrahiert, und zwar durch die Verwendung von Benzylchlorid. Die extrahierten Nukleinsäuren wurden PCR unter Verwendung universeller Starter (vorwärts;. 5'-CGCCCGCCGC GCGCGGCGGG CGGGGCGGGG GCACGGGGGG CCTACGGGAG GCAGCAG-3' (Sequenz Nr. 1), rückwärts; 5'-ATTACCGCGG CTGCTGG-3' (Sequenz Nr. 2)) ausgesetzt, wobei auf den V3-Bereich des 16S rRNA Gens gezielt wurde. Das resultierende PCR-Produkt wurde als eine endgültige Nukleinsäureprobe verwendet. Die universellen Starter wurden bei dem 5'-Anschluss FITC-markiert. Der vorwärtige Starter wurde mit einem GC-Clamp-Bereich vorgesehen.
  • Ein Mikrochip mit Kanälen mit einer Breite von 100 μm und einer Tiefe von 25 μm, der in einem Pyrex- (eingetragenes Warenzeichen) Glas (7 cm × 3,5 cm) durch eine Photolithographietechnologie gebildet wurde, wurde in den Experimenten verwendet. Dieser Mikrochip wurde auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop angebracht und durch einen Photovervielfacher detektiert. Harnstoff und Formamid wurden als ein Denaturierungsmittel verwendet.
  • Als ein Ergebnis der Experimente wurden zwei Spitzen, die den beiden Mikroorganismen entsprechen, detektiert. Die Analyse wurde in einer kurzen Zeit von 30 Minuten vollendet, wodurch bestätigt wurde, dass eine Hochgeschwindigkeitsanalyse möglich war.
  • Beispiel 2
  • Zwei oder mehr Doppelstrang-Nukleinsäuren mit unterschiedlichen Basensequenzen wurden durch die Verwendung der Vorrichtung des Beispiels 1 separiert. Anreicherungskulturen aus Aktivschlamm mit Estradiol als einer einzigen Kohlenstoffquelle wurden für eine Probe verwendet, die zwei oder mehr Doppelstrang-Nukleinsäuren enthält. Das experimentelle Verfahren war das Gleiche wie das des Beispiels 1.
  • As ein Ergebnis der Experimente wurde eine Vielzahl von Spitzen, die den vielen Mikroorganismen entsprechen, detektiert. Auf diese Weise wurde bestätigt, dass die Separation von zwei oder mehr Doppelstrang-Nukleinsäuren mit unterschiedlicher Basensequenz möglich war.
  • Vergleichsbeispiel 1
  • Als eine Kontrolle für Beispiel 1 wurde die gleiche Probe unter Verwendung einer herkömmlichen DGGE-Vorrichtung analysiert. Die ausgeführten Experimente basierten auf dem Verfahren von Muyzer et al. (Appl. Environ. Microbiol., März 1993, S. 695–700, Ausgabe 59, Nr. 3). Die verwendete DGGE-Vorrichtung war ein DCode Universal Mutation Detection System (BIORAD).
  • Bei den Experimenten wurde der gleiche Ablauf wie in Beispiel 1 durchgeführt. D.h. zwei Mikroorganismen wurden in flüssigen Medien gezüchtet und dann durch Zentrifugieren geerntet. Die erhaltenen Zellen wurden vermischt und die Nukleinsäuren wurden aus den vermischten Zellen durch das Benzylchloridverfahren extrahiert. Die extrahierten Nukleinsäurezellen wurden einer PCR unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen universellen Starter ausgesetzt, wobei die universellen Starter auf den V3-Bereich des 16S rRNA Gens abzielten. Das resultierende PCR-Produkt wurde als eine endgültige Nukleinsäureprobe verwen det. Die universellen Starter wurden nicht fluoreszenzmarkiert, im Gegensatz zu Beispiel 1. Die Doppelstrang-Nukleinsäuren wurden durch Fluoreszenzfärben mit Vistra Green nach der Elektrophorese detektiert. Ein GC-Clamp war in dem vorwärtigen Starter wie in Beispiel 1 vorhanden. Der Konzentrationsgradient eines Denaturierungsgradientengels betrug 35%–55%.
  • Bei der Elektrophorese der Nukleinsäureprobe wurden zwei Bänder, die den beiden Mikroorganismen entsprechen, detektiert. Jedoch betrug die Zeit der Elektrophorese 210 Minuten, und die Analyse erforderte eine Zeit in der Größenordnung von 6 Stunden, einschließlich der Zeit der Vorbereitung des Denaturierungsgradientengels und der Gelfärbungszeit.
  • Vergleichsbeispiel 2
  • Als eine Kontrolle für Beispiel 2 wurde die gleiche Probe unter Verwendung einer herkömmlichen DGGE-Vorrichtung analysiert. Die Ausrüstung und das Verfahren für die Experimente waren die gleichen wie in dem Vergleichsbeispiel 2.
  • Als ein Ergebnis der Experimente wurde eine Vielzahl von Spitzen, die den vielen Mikroorganismen entsprechen, detektiert. Jedoch, wie in dem Vergleichsbeispiel 1, betrug die Zeit der Elektrophorese 210 Minuten und die Analyse erforderte eine Zeit in der Größenordnung von 6 Stunden, einschließlich der Zeit der Vorbereitung des Denaturierungsgradientengels und der Gelfärbungszeit. Ferner waren komplizierte manuelle Arbeiten, wie beispielsweise die Vorbereitung des Denaturierungsgradientengels und das Färben des Gels notwendig.
  • In den obigen Beispielen ermöglichte es die Verwendung der Vorrichtung des Ausführungsbeispiels A und des Ausführungsbeispiels B, dass die Doppelstrang-Nukleinsäuren gemäß dem Unterschied in der Basensequenz durch die DGGE auf einem Mikrochip separiert und analysiert werden konnten.
  • Durch Anwenden eines Vermischungsförderungsverfahrens und einer – vorrichtung, wie in den Ausführungsbeispielen 1-1 bis 2-3 beschrieben, auf eine Mikrochipvorrichtung für die DGGE wurde erfolgreich erreicht, einen Konzentrationsgradienten unverzüglich zu bilden und eine Separation und Analyse in kurzer Zeit auszuführen.
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Mikrochipvorrichtung, die Flüssigkeiten verwendet. Genauer gesagt, sieht die Erfindung eine Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung vor, die zumindest zwei Mikrokanäle zum Einleiten von Flüssigkeiten und einen Vermischungsmikrokanal aufweist, der mit den zumindest zwei Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen verbunden ist, wobei die Flüssigkeiten von den entsprechenden Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen zu dem Vermischungsmikrokanal transportiert werden, wobei die Vorrichtung ferner Mittel zur Förderung der Vermischung der Flüssigkeiten aufweist, die in dem Vermischungsmikrokanal konvergieren. Die Erfindung sieht ebenfalls eine Elektrophoresevorrichtung und eine Mikrochipelektrophoresevorrichtung für die Denaturierungsgradientengelelektrophorese vor.

Claims (38)

  1. Eine Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung weist zumindest zwei Mikrokanäle zum Einleiten von Flüssigkeiten und einen Vermischungsmikrokanal auf, der mit zumindest zwei Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen verbunden ist, wobei die Flüssigkeiten von den entsprechenden Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen zu dem Vermischungsmikrokanal transportiert werden, wobei die Vorrichtung ferner Mittel zum Fördern der Vermischung der Flüssigkeiten aufweist, die in dem Vermischungsmikrokanal konvergieren.
  2. Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei das Vermischungsförderungsmittel eines zur Erhöhung eines Bereichs einer Grenzfläche zwischen den zu vermischenden Flüssigkeiten ist.
  3. Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei das Vermischungsförderungsmittel eines zur Instabilmachung einer Grenzfläche zwischen den zu vermischenden Flüssigkeiten ist.
  4. Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung gemäß Anspruch 2, wobei das Vermischungsförderungsmittel zumindest ein Flüssigkeit einleitendes Mittel aufweist, durch welches die Strömungsrate der Flüssigkeit, die in einen Flüssigkeit einleitenden Mikrokanal eingeleitet wird, unabhängig von der Strömungsrate der Flüssigkeit gesteuert werden kann, die in einen weiteren Flüssigkeit einleitenden Mikrokanal eingeleitet wird.
  5. Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung gemäß Anspruch 4, wobei das Flüssigkeit einleitende Mittel eine Pumpe ist, die imstande ist, eine Strömungsrate zu kontrollieren.
  6. Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung gemäß Anspruch 4, wobei das Flüssigkeit einleitende Mittel ein Ventil ist, das auf zumindest einem der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle vorgesehen ist.
  7. Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung gemäß Anspruch 4, wobei das Flüssigkeit einleitende Mittel eine erste Elektrode, die bei jedem der Einlässe der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle vorgesehen ist, und eine zweite Elektrode, die bei dem Auslass des Vermischungsmikrokanals vorgesehen ist, aufweist, und wobei eine elektroosmotische Strömung in jedem der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle und dem Flüssigkeitsvermischungsmikrokanal durch Anlegen einer Spannung zwischen die ersten und zweiten Elektrode erzeugt wird.
  8. Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung gemäß Anspruch 2, wobei das Vermischungsförderungsmittel ein schnell arbeitendes Ventil aufweist, das auf zumindest einem der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle vorgesehen ist.
  9. Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung gemäß Anspruch 8, wobei das Antriebsmittel des schnell arbeitenden Ventils einen piezoelektrischen Effekt nutzt.
  10. Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung gemäß Anspruch 8, wobei das schnell arbeitende Ventil derart ist, dass der Flüssigkeit einleitende Mikrokanal lokal erhitzt wird, um das Volumen der Flüssigkeit in dem Flüssigkeit einleitenden Mikrokanal zu expandieren, wodurch das Ausstoßen einer geringen Menge an Flüssigkeit in den Flüssigkeit einleitenden Mikrokanal mit hoher Geschwindigkeit gesteuert wird.
  11. Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung gemäß Anspruch 2, wobei das Vermischungsförderungsmittel ein Vermischungsabteil aufweist, dessen Höhe geringer ist als seine Breite.
  12. Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung gemäß Anspruch 11, wobei das Vermischungsabteil mit den Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen in einer solchen Weise verbunden ist, dass ein Mikrokanal über- oder untereinander platziert wird.
  13. Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung gemäß Anspruch 11, die ferner zumindest einen Vorvermischungsmikrokanal aufweist, der stromaufwärts von dem Vermischungsabteil gebildet ist, wobei die Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle in den Vorvermischungsmikrokanal konvergieren.
  14. Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung gemäß Anspruch 2, wobei das Vermischungsförderungsmittel einen Vermischungsabschnitt aufweist, wo eine Vielzahl von Verzweigungen, die von jedem der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle weg führen, dreidimensional mit dem Vermischungsmikrokanal in einer solchen Weise verbunden sind, dass eine Vielzahl von Verzweigungen abwechselnd zueinander verteilt sind.
  15. Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung gemäß Anspruch 14, wobei die dreidimensionale Verbindung der Verzweigungen durch Stapeln einer Vielzahl von Substraten in der Konvergenzrichtung der Verzweigungen gebildet wird.
  16. Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung gemäß Anspruch 3, wobei das Vermischungsförderungsmittel eine Erwärmungsvorrichtung aufweist, die auf zumindest einem der Flüssigkeit einleitenden Mikrokanäle und/oder dem Vermischungsmikrokanal vorgesehen ist.
  17. Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung gemäß Anspruch 16, wobei die Erwärmungsvorrichtung auf der Unterseite des Vermischungsmikrokanals vorgesehen ist.
  18. Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung gemäß Anspruch 3, wobei das Vermischungsförderungsmittel ein mechanisches Vermischungs- und/oder Rührmittel zum Stören der Grenzfläche zwischen den Flüssigkeiten aufweist, die in dem Vermischungsmikrokanal konvergieren.
  19. Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung gemäß Anspruch 18, wobei das mechanische Vermischungs- und/oder Rührmittel eine Hebeoberfläche, ein Drehkörper oder ein Oszillator ist, der in oder nahe einem Bereich vorgesehen ist, wo die Flüssigkeiten in dem Vermischungsmikrokanal konvergieren.
  20. Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung gemäß Anspruch 18, wobei das mechanische Vermischungs- und/oder Rührmittel ein Vibrationsgerät ist, das auf der Innenwandoberfläche des Vermischungsmikrokanals vorgesehen ist.
  21. Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung gemäß Anspruch 18, wobei das mechanische Vermischungs- und/oder Rührmittel ein Vibrationsgerät ist, das auf der Außenwandoberfläche des Vermischungsmikrokanals vorgesehen ist.
  22. Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung gemäß Anspruch 3, wobei das Vermischungsförderungsmittel eine Anzahl von Nano- bis Mikronstrukturen aufweist, die in oder nahe einem Bereich verteilt sind, wo die Flüssigkeiten in dem Vermischungsmikrokanal konvergieren.
  23. Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung gemäß Anspruch 22, wobei die Nano- bis Mikronstrukturen Vorsprünge oder Nute sind, die in ausreichender Weise kleiner als die Breite des Vermischungsmikrokanals sind.
  24. Eine Mikrochipelektrophoresevorrichtung zum Separieren eines Analyts, welche einen Mikrokanal aufweist, wo ein Denaturierungsgradientenbereich, der ein Denaturierungsmittel für das Analyt enthält, gebildet wird, wobei das Analyt elektrophoretisch behandelt wird, während es in den Denaturierungsgradientenbereich eingeleitet wird.
  25. Mikrochipelektrophoresevorrichtung gemäß Anspruch 24, wobei das Analyt eine Doppelstrangnukleinsäure ist.
  26. Mikrochipelektrophoresevorrichtung gemäß Anspruch 24, die zumindest zwei Flüssigkeit einleitende Mikrokanäle zum Einleiten von Pufferlösungen, die das Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, und einen Vermischungsmikrokanal aufweist, der mit zumindest zwei Flüs sigkeit einleitenden Mikrokanälen verbunden ist, wobei der Denaturierungsgradientenbereich durch Einleiten der Pufferlösungen von den entsprechenden Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen mit variierenden Verhältnissen und durch Vermischen der Pufferlösungen in dem Vermischungsmikrokanal gebildet wird.
  27. Mikrochipelektrophoresevorrichtung gemäß Anspruch 26, die ferner Mittel zum Fördern der Vermischung der Pufferlösungen aufweist, die in dem Vermischungsmikrokanal konvergieren.
  28. Mikrochipelektrophoresevorrichtung gemäß Anspruch 26, die die Flüssigkeitsvermischungsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23 aufweist.
  29. Ein Verfahren zum Separieren eines Analyts, welches das Einleiten von Pufferlösungen, die ein Denaturierungsmittel für das Analyt mit unterschiedlichen Konzentrationen enthält, mit variierenden Verhältnissen von zumindest zwei Flüssigkeit einleitenden Mikrokanälen in einen Vermischungsmikrokanal aufweist, um einen Denaturierungsgradientenbereich in dem Vermischungsmikrokanal zu bilden, sowie das Einleiten des Analyts in den Denaturierungsgradientenbereich zur Elektrophorese des Analyts.
  30. Mikrochipelektrophoresevorrichtung gemäß Anspruch 24, wobei der Denaturierungsgradientenbereich als Pufferlösungszonen gebildet ist, die das Denaturierungsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, und die abwechselnd in Richtung der Elektrophorese angeordnet sind.
  31. Mikrochipelektrophoresevorrichtung gemäß Anspruch 30, wobei das Analyt eine Doppelstrangnukleinsäure ist.
  32. Mikrochipelektrophoresevorrichtung gemäß Anspruch 30, wobei die Pufferlösungszonen, die das Denaturierungsmittel mit null oder geringer Konzentration enthalten, derart angeordnet sind, dass ihre Länge stufenweise in Richtung der Elektrophorese abnimmt.
  33. Mikrochipelektrophoresevorrichtung gemäß Anspruch 30, wobei die Pufferlösungen, die das Denaturierungsmittel mit keiner oder geringer Konzentration enthalten, derart angeordnet sind, dass ihre Länge stufenweise stromabwärts der Richtung der Elektrophorese zunimmt
  34. Ein Verfahren zum Separieren eines Analyts, welches das Anordnen von Pufferlösungen, die ein Denaturierungsmittel für ein Analyt mit unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, in einem Mikrokanal, und zwar abwechselnd in der Richtung der Elektrophorese, um einen Denaturierungsgradientenbereich zu bilden, und das Einleiten des Analyts in den Denaturierungsgradientenbereich zur Elektrophorese des Analyts, aufweist.
  35. Ein Verfahren zum Separieren eines Analyts, welches das Anordnen von Pufferlösungen, die ein Denaturierungsmittel für ein Analyt mit verschiedenen Konzentrationen, und zwar abwechselnd in der Richtung der Elektrophorese, und das Einleiten des Analyts in die Abfolge der Pufferlösungen zur Elektrophorese des Analyts aufweist.
  36. Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei das Analyt eine Doppelstrangnukleinsäure ist.
  37. Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei die Pufferlösungszonen, die das Denaturierungsmittel mit keiner oder geringer Konzentration enthalten, derart angeordnet sind, dass ihre Länge stufenweise stromabwärts der Richtung der Elektrophorese abnimmt.
  38. Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei Pufferlösungen, die das Denaturierungsmittel mit hoher Konzentration enthalten, derart angeordnet sind, dass ihre Länge stufenweise stromabwärts der Richtung der Elektrophorese zunimmt.
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