JP7412688B2 - 粒子分離装置 - Google Patents
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Description
本発明は、標的粒子を含む液体中から該標的粒子を分離する粒子分離装置に関する。
がんの原発腫瘍組織または転移腫瘍組織から、腫瘍細胞が遊離し、血液中へ浸潤することが知られている。このような腫瘍細胞は、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ：Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ）と呼ばれ、末梢血中の血中循環腫瘍細胞の数を測定することにより、がんの進行状態や治療効果（予後）の把握、あるいは再発・転移の早期発見等を診断する情報となり得るものと期待されている。
末梢血中の血中循環腫瘍細胞の数を測定する方法としては、たとえば特許文献１に記載されるような、細胞試料液中の細胞を蛍光標識抗体で染色したうえで、細胞試料液をセルソーターチップの流路に流し、画像処理型セルソーターを用いて回収すべき血中循環腫瘍細胞とそれ以外の細胞とを分離して、その分離された血中循環腫瘍細胞をカウントする手法が知られている。しかしながら、画像処理型セルソーターは、セルソーターチップ内の流れを観察するためのカメラ、カメラで撮影された画像中の細胞の種類を区別して認識するための画像認識システム、および区別された細胞を分別して異なる流路に移すために細胞に外力（電圧等）を与える装置などを必須の構成要素とするものであるため、高価で大型な装置であり、簡便に使用できるものではないという問題があった。
このようなセルソーター等の複雑な構造の機構を備える装置等を用いることなく、血中循環腫瘍細胞の数を測定するためにより簡便に使用できる方法としては、血中循環腫瘍細胞が血球細胞よりもサイズが大きい傾向があることを利用した、水力学的層流分離の一つである決定論的横置換（ＤＬＤ：Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）法を用いた方法が知られている（たとえば特許文献２、非特許文献１参照）。この分離技術を利用した分離装置として、非特許文献２の図２には、ＤＬＤ法の基本的な構造に基づいて設計されたマイクロ流路チップ（基板）にサンプル液を注入するシリンジおよびチューブを有するサンプル液注入系と、バッファ液を注入するシリンジおよびチューブを有するバッファ液注入系とを備えたものが実験用として図示されている。
しかしながら、非特許文献２に記載の分離装置では、サンプル液注入系とバッファ液注入系とは互いに独立しており、それぞれについてシリンジおよびチューブを設けているため、サンプル液が注入されたシリンジとバッファ液が注入されたシリンジとを同時に同量だけ操作（ピストンを押圧）する必要があり、一人で行う場合には両手で操作する必要がある等、操作が煩雑であるとともに、両者を注意深く均等に操作しないと、サンプル液とバッファ液とで流量が大きく相違してしまう場合があり、適切な分離を行えないおそれがある。
Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，"Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ"，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４，ｐ．９８７－９９０，２００４．
岡野弘聖、外６名、「血中循環腫瘍細胞捕捉のための寸法によるファーストスクリーニング－細胞の硬さの影響－」、２０１４年度精密工学会春季大会学術講演会講演論文集、精密工学会、ｐ．４５３－４５４
本発明は、このような点に鑑みてなされたものであり、操作が簡易で、適切に粒子を分離し得る粒子分離装置を提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明の第１の観点に係る粒子分離装置は、
標的粒子を含むサンプル液から該標的粒子を分離する粒子分離装置であって、
排出口を有するバレルおよびピストンを備え、該ピストンを押圧することにより、該バレル内の気体を該排出口から押し出すシリンジと、
注入口および排出口を有し、前記サンプル液が注入されるサンプル液収容部材と、
注入口および排出口を有し、バッファ液が注入されるバッファ液収容部材と、
前記バレルの排出口に接続された第１管路、該第１管路から二股に分岐した一方であって前記サンプル液収容部材の注入口に接続される第２管路、および該第１管路から二股に分岐した他方であって前記バッファ液収容部材の注入口に接続される第３管路を備える分岐管と、
前記第１管路の途中に介装され、前記シリンジ側が陽圧時に開放し陰圧時に閉塞する逆流防止用の第１一方向弁と、
前記サンプル液収容部材の排出口に接続されるサンプル液導入口、前記バッファ液収容部材の排出口に接続されるバッファ液導入口、前記ピストンを押圧することにより、該サンプル液導入口を介して導入されたサンプル液と該バッファ液導入口を介して導入されたバッファ液とが接しながら並行して流れる複数の微細なピラーが配設されたＤＬＤマイクロ流路構造を備えるＤＬＤ流路部、該ＤＬＤ流路部でサンプル液からバッファ液に移動した標的粒子を含むバッファ液を排出するバッファ液排出口、および該ＤＬＤ流路部で標的粒子がバッファ液に移動した後のサンプル液を排出するサンプル液排出口を備えるＤＬＤマイクロ流路チップと、を有する。
標的粒子を含むサンプル液から該標的粒子を分離する粒子分離装置であって、
排出口を有するバレルおよびピストンを備え、該ピストンを押圧することにより、該バレル内の気体を該排出口から押し出すシリンジと、
注入口および排出口を有し、前記サンプル液が注入されるサンプル液収容部材と、
注入口および排出口を有し、バッファ液が注入されるバッファ液収容部材と、
前記バレルの排出口に接続された第１管路、該第１管路から二股に分岐した一方であって前記サンプル液収容部材の注入口に接続される第２管路、および該第１管路から二股に分岐した他方であって前記バッファ液収容部材の注入口に接続される第３管路を備える分岐管と、
前記第１管路の途中に介装され、前記シリンジ側が陽圧時に開放し陰圧時に閉塞する逆流防止用の第１一方向弁と、
前記サンプル液収容部材の排出口に接続されるサンプル液導入口、前記バッファ液収容部材の排出口に接続されるバッファ液導入口、前記ピストンを押圧することにより、該サンプル液導入口を介して導入されたサンプル液と該バッファ液導入口を介して導入されたバッファ液とが接しながら並行して流れる複数の微細なピラーが配設されたＤＬＤマイクロ流路構造を備えるＤＬＤ流路部、該ＤＬＤ流路部でサンプル液からバッファ液に移動した標的粒子を含むバッファ液を排出するバッファ液排出口、および該ＤＬＤ流路部で標的粒子がバッファ液に移動した後のサンプル液を排出するサンプル液排出口を備えるＤＬＤマイクロ流路チップと、を有する。
本発明の第１の観点に係る粒子分離装置を用いて粒子の分離を行う際には、シリンジのピストンを押圧することにより、シリンジのバレル内の気体が押し出されて分岐管の内圧が高められ、その圧力が、サンプル液が収容されたサンプル液収容部材およびバッファ液が収容されたバッファ液収容部材に同時に作用し、サンプル液およびバッファ液がＤＬＤマイクロ流路チップの対応する導入口に供給される。したがって、単一のシリンジを操作するだけでよいので、片手で操作し得るため、操作が簡易であるとともに、特に注意深く操作しなくても、サンプル液とバッファ液との両者を適切な流量で流すことができ、適切な分離を実現することが可能となる。また、本発明の第１の観点に係る粒子分離装置は、第１管路の途中に逆流防止用の第１一方向弁を有するので、シリンジのピストンを手で押圧して、第１管路の第１一方向弁よりも下流側（第２管路側、第３管路側）の内圧を高めた後に、ピストンから手を離してもシリンジが押し戻されることがない。
本発明の第１の観点に係る粒子分離装置において、前記サンプル液は、前記標的粒子とサイズの異なる非標的粒子を含むことができる。本発明の第１の観点に係る粒子分離装置は、サンプル液が標的粒子とサイズの異なる非標的粒子を含む場合にも、該標的粒子を分離することができる。
本発明の第１の観点に係る粒子分離装置において、前記サンプル液は、前記標的粒子として、細胞を含む液体とすることができる。この場合において、前記サンプル液は、血中循環腫瘍細胞を前記標的粒子として含むものとすることができる。本発明の第１の観点に係る粒子分離装置は、血中循環腫瘍細胞等の細胞の分離に好適に用いることができる。
本発明の第１の観点に係る粒子分離装置において、前記第２管路を前記サンプル液収容部材の注入口に着脱可能とし、前記第３管路を前記バッファ液収容部材の注入口に着脱可能とすることができる。このように構成することにより、サンプル液収容部材の注入口から第２管路を取り外した状態で、サンプル液をサンプル液収容部材に注入した後にサンプル液収容部材の注入口に第２管路を装着し、バッファ液収容部材の注入口から第３管路を取り外した状態で、バッファ液をバッファ液収容部材に注入した後にバッファ液収容部材の注入口に第３管路を装着することができる。
本発明の第１の観点に係る粒子分離装置において、前記第１管路の前記第１一方向弁よりも前記シリンジ側の壁部に内外に貫通するように設けられ、前記シリンジ側が陽圧時に閉塞し陰圧時に開放する第２一方向弁を備える外気吸入用の通気口をさらに有することができる。このように構成することにより、シリンジを粒子分離装置から取り外すことなく、押圧したピストンを引き戻してから再び押圧することが可能となるので、ピストンをポンピング（押し引き）することにより、第１管路の第１一方向弁よりも下流側（第２管路側、第３管路側）の内圧を逐次的に高めることができる。したがって、シリンジとして、バレル断面積が小さい小容量のものを用いても多量のサンプル液およびバッファ液を円滑にＤＬＤマイクロ流路チップに供給することができ、バレル断面積が大きい大容量シリンジの使用に伴う装置の大型化やシリンジ操作性低下を適切に防止することができる。
上記目的を達成するために、本発明の第２の観点に係る粒子分離装置は、
標的粒子を含むサンプル液から該標的粒子を分離する粒子分離装置であって、
排出口を有するチャンバーおよび可動部を備え、該可動部を一定量動かすことにより、該チャンバー内の気体を該排出口から一定量押し出す圧力発生装置と、
注入口および排出口を有し、前記サンプル液が注入されるサンプル液収容部材と、
注入口および排出口を有し、バッファ液が注入されるバッファ液収容部材と、
前記チャンバーの排出口に接続された第１管路、該第１管路から二股に分岐した一方であって前記サンプル液収容部材の注入口に接続される第２管路、および該第１管路から二股に分岐した他方であって前記バッファ液収容部材の注入口に接続される第３管路を備える分岐管と、
前記第１管路の途中または前記チャンバーの排出口に介装され、前記圧力発生装置側が陽圧時に開放し陰圧時に閉塞する逆流防止用の第１一方向弁と、
前記サンプル液収容部材の排出口に接続されるサンプル液導入口、前記バッファ液収容部材の排出口に接続されるバッファ液導入口、前記圧力発生装置が前記サンプル液収容部の内部および前記バッファ液収容部の内部を昇圧することにより、該サンプル液導入口を介して導入されたサンプル液と該バッファ液導入口を介して導入されたバッファ液とが接しながら並行して流れる複数の微細なピラーが配設されたＤＬＤマイクロ流路構造を備えるＤＬＤ流路部、該ＤＬＤ流路部でサンプル液からバッファ液に移動した標的粒子を含むバッファ液を排出するバッファ液排出口、および該ＤＬＤ流路部で標的粒子がバッファ液に移動した後のサンプル液を排出するサンプル液排出口を備えるＤＬＤマイクロ流路チップと、を有する。
標的粒子を含むサンプル液から該標的粒子を分離する粒子分離装置であって、
排出口を有するチャンバーおよび可動部を備え、該可動部を一定量動かすことにより、該チャンバー内の気体を該排出口から一定量押し出す圧力発生装置と、
注入口および排出口を有し、前記サンプル液が注入されるサンプル液収容部材と、
注入口および排出口を有し、バッファ液が注入されるバッファ液収容部材と、
前記チャンバーの排出口に接続された第１管路、該第１管路から二股に分岐した一方であって前記サンプル液収容部材の注入口に接続される第２管路、および該第１管路から二股に分岐した他方であって前記バッファ液収容部材の注入口に接続される第３管路を備える分岐管と、
前記第１管路の途中または前記チャンバーの排出口に介装され、前記圧力発生装置側が陽圧時に開放し陰圧時に閉塞する逆流防止用の第１一方向弁と、
前記サンプル液収容部材の排出口に接続されるサンプル液導入口、前記バッファ液収容部材の排出口に接続されるバッファ液導入口、前記圧力発生装置が前記サンプル液収容部の内部および前記バッファ液収容部の内部を昇圧することにより、該サンプル液導入口を介して導入されたサンプル液と該バッファ液導入口を介して導入されたバッファ液とが接しながら並行して流れる複数の微細なピラーが配設されたＤＬＤマイクロ流路構造を備えるＤＬＤ流路部、該ＤＬＤ流路部でサンプル液からバッファ液に移動した標的粒子を含むバッファ液を排出するバッファ液排出口、および該ＤＬＤ流路部で標的粒子がバッファ液に移動した後のサンプル液を排出するサンプル液排出口を備えるＤＬＤマイクロ流路チップと、を有する。
本発明の第２の観点に係る粒子分離装置を用いて粒子の分離を行う際には、圧力発生装置の可動部を一定量動かすことにより、圧力発生装置のチャンバー内の気体が一定量押し出されて分岐管の内圧が高められ、その圧力が、サンプル液が収容されたサンプル液収容部材およびバッファ液が収容されたバッファ液収容部材に同時に作用し、サンプル液およびバッファ液がＤＬＤマイクロ流路チップの対応する導入口に供給される。したがって、単一の圧力発生装置を備えるだけでよいので、電力等の人力以外の動力によって駆動する場合には装置を簡素化できるとともに、特段の配慮をしなくても、サンプル液とバッファ液との両者を適切な流量で流すことができ、適切な分離を実現することが可能となる。また、本発明の第２の観点に係る粒子分離装置は、第１管路の途中またはチャンバーの排出口に逆流防止用の第１一方向弁を有するので、圧力発生装置の可動部を一定量動かして、第１一方向弁よりも下流側（第２管路側、第３管路側）の内圧を高めた後に、可動部を止めても第１一方向弁よりも下流側（第２管路側、第３管路側）の内圧を保持しやすくなるので、圧力保持のための圧縮空気タンク等を設ける必要が無く、装置を簡素化できる。
本発明の第２の観点に係る粒子分離装置において、前記サンプル液は、前記標的粒子とサイズの異なる非標的粒子を含むことができる。本発明の第２の観点に係る粒子分離装置は、サンプル液が標的粒子とサイズの異なる非標的粒子を含む場合にも、該標的粒子を分離することができる。
本発明の第２の観点に係る粒子分離装置において、前記サンプル液は、前記標的粒子として、細胞を含む液体とすることができる。この場合において、前記サンプル液は、血中循環腫瘍細胞を前記標的粒子として含むものとすることができる。本発明の第２の観点に係る粒子分離装置は、血中循環腫瘍細胞等の細胞の分離に好適に用いることができる。
本発明の第２の観点に係る粒子分離装置において、前記第２管路を前記サンプル液収容部材の注入口に着脱可能とし、前記第３管路を前記バッファ液収容部材の注入口に着脱可能とすることができる。このように構成することにより、サンプル液収容部材の注入口から第２管路を取り外した状態で、サンプル液をサンプル液収容部材に注入した後にサンプル液収容部材の注入口に第２管路を装着し、バッファ液収容部材の注入口から第３管路を取り外した状態で、バッファ液をバッファ液収容部材に注入した後にバッファ液収容部材の注入口に第３管路を装着することができる。
本発明の第２の観点に係る粒子分離装置において、前記第１管路の前記第１一方向弁よりも前記圧力発生装置側の壁部または前記チャンバーの壁部に内外に貫通するように設けられ、前記圧力発生装置側が陽圧時に閉塞し陰圧時に開放する第２一方向弁を備える外気吸入用の通気口をさらに有することができる。このように構成することにより、圧力発生装置を粒子分離装置から取り外すことなく、チャンバー内の可動部に陽圧発生のための動作と反対の動作（すなわち陰圧を発生させる動作）をさせてから、再び可動部に陽圧発生の動作をさせることが可能となるので、陽圧発生のための動作を繰り返すことにより、第１管路の第１一方向弁よりも下流側（第２管路側、第３管路側）の内圧を逐次的に高めることができる。したがって、圧力発生装置として、チャンバーが小容量のものを用いても多量のサンプル液およびバッファ液を円滑にＤＬＤマイクロ流路チップに供給することができ、大容量のチャンバーを備えた圧力発生装置の使用に伴う装置の大型化や高コスト化を適切に防止することができる。
以下、標的粒子および該標的粒子と異なるサイズの非標的粒子が分散したサンプル液から該標的粒子を分離（分画）するための、本発明が適用された粒子分離装置の実施形態として、血球を非標的粒子として、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を標的粒子として含む血液由来の液をサンプル液とし、該サンプル液から血中循環腫瘍細胞を分離するＣＴＣ分離装置について、図面を参照して説明する。
ただし、本発明は、血中循環腫瘍細胞を分離するものに限定されず、血中循環腫瘍細胞以外の細胞を標的粒子として、該標的粒子とサイズの異なる細胞を非標的粒子として含む体液（血液、リンパ液、唾液、尿、涙等を含む）から標的粒子に係る細胞を分離するものに適用可能である。また、標的粒子および非標的粒子としては、細胞にも限定されず、サイズの異なる２種以上の粒子が分散した液体中から標的粒子に係る粒子を分離するものに広く適用可能である。なお、ここでいう「分散」とは、粒子（細胞）が液体中に粒子単体で浮遊している場合のみならず、その一部または全部がクラスターとして浮遊している場合が含まれ、また、液体中に散らばって浮遊している場合のみならず、ある程度沈降している場合も含まれる。対象とする標的粒子および非標的粒子の粒径は、０．１～１０００μｍ程度である。
さらに、本発明において、サンプル液は分離対象である標的粒子を含むものであればよく、該標的粒子とサイズの異なる非標的粒子は、必ずしも含んでいる必要はない。たとえば、単一サイズの粒子または所定のサイズ以上の粒径を有する複数種の粒子を含むバッファ液の交換（粒子を含むバッファ液をサンプル液として、該サンプル液と成分の異なるまたは同一の他のバッファ液に該粒子を移す）を行う場合や粒子の濃度の濃縮を行う場合にも、本発明は適用可能である。また、「標的粒子」とは分離の対象の粒子という意味であり、何らかの利用（たとえば検査）に供するために分離回収したい粒子という意味のみならず、不要なために分離除去したい（取り除きたい）粒子という意味も含まれる。
図１に示すように、本実施形態に係るＣＴＣ分離装置１は、圧力発生装置としてのシリンジ２、圧力分配部（分岐管）３、サンプル液収容部（サンプル液収容部材）４、バッファ液収容部（バッファ液収容部材）５、分離部（ＤＬＤマイクロ流路チップ）６、サンプル液回収部７，およびバッファ液回収部８を概略備えて構成されている。
シリンジ２は、排出口２１ａを有するバレル（外筒）２１およびピストン２２からなるピストンシリンジであり、ピストン２２を押圧（押し込む方向にスライド）することにより、バレル２１内の気体（空気）を排出口２１ａから押し出し（排出し）、引き出す方向にスライドすることにより、排出口２１ａから気体を吸引する。
圧力分配部３は、シリンジ２により発生された圧力を分配するものであり、シリンジ２のバレル２１の排出口２１ａに接続された第１管路３１、第１管路３１から二股に分岐した一方であって後述するサンプル液収容部４のバレル４１の注入口４１ａに接続される第２管路３２、および第１管路３１から二股に分岐した他方であって後述するバッファ液収容部５のバレル５１の注入口５１ａに接続される第３管路３３を備えている。
第１管路３１は、一方向弁（第１一方向弁）３１ａ、一方向弁（第２一方向弁）３１ｂ、Ｔ型チューブコネクタ３１ｃ、三方活栓３１ｄ、およびチューブ３１ｅを備えて構成されている。
第１管路３１の途中には、一方向弁３１ａが介装されており、一方向弁３１ａは、上流側（シリンジ２側）が下流側（第２管路３２側、第３管路３３側）に比して、陽圧時に開放し陰圧時に閉塞するように設けられた逆流防止用の弁である。一方向弁３１ａとしては、ダイヤフラム式チェックバルブを用いることができる。
第１管路３１の一方向弁３１ａよりもシリンジ２側には、外気吸入用の通気口が設けられている。通気口は、第１管路３１の壁部に内外に貫通するように設けられ、シリンジ２側が陽圧時に閉塞し陰圧時に開放するように設けられた一方向弁（第２一方向弁）３１ｂを備えている。一方向弁３１ｂとしては、一方向弁３１ａと同様に、ダイヤフラム式チェックバルブを用いることができる。通気口は、本実施形態では、第１～第３接続口を有するＴ型チューブコネクタ３１ｃを第１管路３１の途中に介装する、すなわち、Ｔ型チューブコネクタ３１ｃの第１接続口をシリンジ２のバレル２１の排気口２１ａに接続し、第２接続口を一方向弁３１ａの一方の接続口に接続し、第３接続口を一方向弁３１ｂの一方の接続口に接続し、一方向弁３１ｂの他方の接続口を外部に開放することにより実現している。
第１管路３１の一方向弁３１ａよりも下流側（サンプル液収容部４側、バッファ液収容部５側）には、第１～第３接続口および流路変更用のレバーを備える三方活栓３１ｄが介装されている。より具体的には、三方活栓３１ｄの第１接続口が一方向弁３１ａの下流側の接続口に接続され、第２接続口にチューブ３１ｅが接続され、第３接続口は外部に開放されている。三方活栓３１ｄは、そのレバーを所定の向きに回動させることにより、第１接続口から第２接続口に至る経路のみを開放し、第１接続口から第３接続口に至る経路のみを開放し、または第２接続口から第３接続口に至る経路のみを開放することができる。
第２管路３２は、チューブ３２ａおよびチューブ３２ａの一端に取り付けられたアダプタ３２ｂから構成されている。第２管路３２のアダプタ３２ｂは、後述するサンプル液収容部４のバレル４１の注入口４１ａに着脱可能に装着される。第３管路３３は、チューブ３３ａおよびチューブ３３ａの一端に取り付けられたアダプタ３３ｂから構成されている。第３管路３３のアダプタ３３ｂは、後述するバッファ液収容部５のバレル５１の注入口５１ａに着脱可能に装着される。
第１管路３１のチューブ３１ｅの下流側（三方活栓３１ｄと反対側）の端部は、第１～第３接続口を有するＹ型チューブコネクタ３４の第１接続口に接続されている。第２管路３２のチューブ３２ａの上流側（アダプタ３２ｂと反対側）の端部は、Ｙ型チューブコネクタ３４の第２接続口に接続されており、第３管路３３のチューブ３３ａの上流側（アダプタ３３ｂと反対側）の端部は、Ｙ型チューブコネクタ３４の第３接続口に接続されている。
サンプル液収容部４は、バレル（シリンジの外筒に相当する部材）４１を備え、バレル４１は、注入口４１ａおよび排出口４１ｂを有している。バレル４１には、標的粒子（血中循環腫瘍細胞）および該標的粒子と異なるサイズの非標的粒子（血球）を含むサンプル液（血液）Ｓが収容される。なお、サンプル液Ｓとしては、血液を希釈したもの（たとえば、血液を濃度４ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳで２倍希釈したもの）を用いることができる。
バレル４１は、注入口４１ａが上方に、排出口４１ｂが下方に位置するように、その長手方向（軸方向）が略鉛直に設定された状態で、不図示のスタンド等に支持されている。サンプル液Ｓは、バレル４１の注入口４１ａから第２管路３２のアダプタ３２ｂを取り外した状態で注入され、注入後にバレル４１の注入口４１ａに第２管路３２のアダプタ３２ｂが気密に装着される。バレル４１内に収容されたサンプル液Ｓは、第２管路３２を介して圧力が作用した場合に、排出口４１ｂから排出される。
バッファ液収容部５は、バレル（シリンジの外筒に相当する部材）５１を備え、バレル５１は、注入口５１ａおよび排出口５１ｂを有している。バレル５１には、バッファ液Ｂが収容される。バッファ液Ｂとしては、等張液を一種または複数種混合したものを用いることができ、たとえばＰＢＳまたはグリセリン含有ＰＢＳ等を用いることができる。
バレル５１は、バレル４１と同様に、注入口５１ａが上方に、排出口５１ｂが下方に位置するように、その長手方向（軸方向）が略鉛直に設定された状態で、不図示のスタンド等に支持されている。バッファ液Ｂは、バレル５１の注入口５１ａから第３管路３３のアダプタ３３ｂを取り外した状態で、たとえばサンプル液Ｓと同量だけ注入され、注入後にバレル５１の注入口５１ａに第３管路３３のアダプタ３３ｂが気密に装着される。バレル５１内に収容されたバッファ液Ｂは、第３管路３３を介して圧力が作用した場合に、排出口５１ｂから排出される。
分離部６は、ＤＬＤマイクロ流路チップ６１および漏れ防止用のチップホルダ（不図示）を備えて構成されている。ＤＬＤマイクロ流路チップ６１は、図２にも示されているように、サンプル液導入口６１ａ、バッファ液導入口６１ｂ、ＤＬＤ流路部６１ｃ、サンプル液排出口６１ｄ、およびバッファ液排出口６１ｅを備えて構成されている。
サンプル液導入口６１ａには、チューブ４１ｃを介して、サンプル液収容部４のバレル４１の排出口４１ｂが接続される。バッファ液導入口６１ｂには、チューブ５１ｃを介して、バッファ液収容部５のバレル５１の排出口５１ｂが接続される。ＤＬＤ流路部６１ｃは、複数の微細なピラーが配設されたＤＬＤマイクロ流路構造を備えている。なお、ＤＬＤ流路部６１ｃと、サンプル液収容部４のバレル４１の排出口４１ｂからＤＬＤ流路部６１ｃまでの流路（排出口４１ｂと、チューブ４１ｃと、サンプル液導入口６１ａと、ＤＬＤ流路部６１ｃと、からなる流路）、およびバッファ液収容部５のバレル５１の排出口５１ｂからＤＬＤ流路部６１ｃまでの流路（排出口５１ｂと、チューブ５１ｃと、バッファ液導入口６１ｂと、ＤＬＤ流路部６１ｃと、からなる流路）は、予めバッファ液（ＰＢＳまたはグリセリン含有ＰＢＳ等）で満たしておくことが望ましい。
シリンジ２のピストン２２を押圧することにより供給される圧力により、サンプル液収容部４のバレル４１内のサンプル液Ｓが、排出口４１ｂ、チューブ４１ｃおよびサンプル液導入口６１ａを介してＤＬＤ流路部６１ｃに導入されるとともに、バッファ液収容部５のバレル５１内のバッファ液Ｂが、排出口５１ｂ、チューブ５１ｃおよびバッファ液導入口６１ｂを介してＤＬＤ流路部６１ｃに導入される。
サンプル液導入口６１ａを介して導入されたサンプル液と、バッファ液導入口６１ｂを介して導入されたバッファ液とは、互いに接しながらそれぞれ層流として並行して、ＤＬＤ流路部６１ｃ内を流れる。ＤＬＤ流路部６１ｃは、たとえば非特許文献１に記載されているような決定論的横置換（ＤＬＤ）法の原理にしたがって配設された複数の微細なピラー（マイクロピラー）を有している。
決定論的横置換法とは、図３に示すように、所定の規則にしたがって配設された複数のピラーＰからなるピラー群に粒子の分散液を流した際に、小さい粒子は流れの方向に沿って進み、大きい粒子はピラーの存在によって流れの方向に沿う進行を妨げられる結果として、流れの方向に対して斜めに進む性質を利用した分離法である。ピラーＰの間隔Ｇと、シフト量ｄとで決まるしきい値を適宜に設定することにより、該しきい値未満の径の粒子と該しきい値以上の径の粒子とを分離することができる。
ＤＬＤ流路部６１ｃ内において、サンプル液に含まれる比較的に大きい径のＣＴＣ（たとえば１２μｍ程度）は、サンプル液の流れ方向に対して斜めに進み、サンプル液に接しながら層流として並行して流れるバッファ液Ｂに移動し、サンプル液からバッファ液に移動したＣＴＣを含むバッファ液がバッファ液排出口６１ｅに至る。ＤＬＤ流路部６１ｃ内において、サンプル液に含まれる比較的に小さい径の血球（たとえば８μｍ程度）は、サンプル液の流れ方向に沿って進み、ＣＴＣが移動した（分離された）後のサンプル液とともに、サンプル液排出口６１ｄに至る。なお、ＤＬＤ流路部６１ｃ内において、サンプル液とバッファ液とは、互いに接しながら層流として並行して流れる際に、互いに僅かに混入し合うため、サンプル液排出口６１ｄから排出されるサンプル液にはバッファ液の一部が、バッファ液排出口６１ｅから排出されるバッファ液にはサンプル液の一部が含まれる場合がある。
サンプル液排出口６１ｄには、サンプル液回収部７のチューブ７１を介してサンプル液回収容器７２が接続されており、ＣＴＣが分離された後のサンプル液がサンプル液回収容器７２に回収される。バッファ液排出口６１ｅには、バッファ液回収部８のチューブ８１を介してバッファ液回収容器８２が接続されており、サンプル液から移動した（分離された）ＣＴＣを含むバッファ液がバッファ液回収容器８２に回収される。
被験者の血液からＣＴＣの分離を行う際には、シリンジ２のピストン２２を押圧することにより、シリンジ２のバレル２１内の空気が押し出されて圧力分配部３（第１管路３１、第２管路３２および第３管路３３）の内圧が高められ、その圧力がサンプル液Ｓが収容されたサンプル液収容部４のバレル４１およびバッファ液Ｂが収容されたバッファ液収容部５のバレル５１に同時に作用し、サンプル液Ｓおよびバッファ液Ｂが分離部６のＤＬＤマイクロ流路チップ６１の対応する導入口６１ａ，６１ｂに圧送される。したがって、シリンジ２は単一であるから、シリンジ２を片手で操作し得るため、操作が簡易であるとともに、特に注意深く操作しなくても、サンプル液Ｓとバッファ液Ｂとの両者を同じ流量で適切にＤＬＤマイクロ流路チップ６１に流すことができ、適切な分離を実現することができる。
また、本実施形態では、第１管路３１の途中に、シリンジ２側が陽圧時に開放し陰圧時に閉塞する逆流防止用の一方向弁３１ａを介装しているため、シリンジ２のピストン２２を押圧して押し出した空気が逆流することを防止することができる。したがって、シリンジ２のピストン２２を手で押圧して第１管路３１の一方向弁３１ａよりも下流側（第２管路３２側、第３管路３３側）の内圧を高めた後に、ピストン２２から必要に応じて手を離すことができ、圧力を供給するための操作がし易い。
さらに、本実施形態では、一方向弁３１ａに加えて、第１管路３１の一方向弁３１ａよりもシリンジ２側に、Ｔ型チューブコネクタ３１ｃおよび一方向弁３１ｂで構成される外気吸入用の通気口を設けたので、一方向弁３１ａとの協働により、シリンジ２をＴ型チューブコネクタ３１ｃに接続したままの状態で、一旦押圧したピストン２２を引き戻して再び押圧する操作が可能となっている。したがって、シリンジ２をポンピング（ピストン２２を押し引き）することで、第１管路３１の一方向弁３１ａよりも下流側の内圧を逐次的に高めることができる。このため、シリンジ２として、バレル断面積が小さい小容量のものを用いても多量のサンプル液およびバッファ液を円滑にＤＬＤマイクロ流路チップ６１に供給することができ、バレル断面積が大きい大容量シリンジの使用に伴う装置の大型化やシリンジ操作性低下を適切に防止することができる。
なお、本実施形態では、サンプル液をサンプル液収容部４のバレル４１に注入するため、第２管路３２をバレル４１の注入口４１ａに着脱可能とし、バッファ液をバッファ液収容部５のバレル５１に注入するため、第３管路３３をバレル５１の注入口５１ａに着脱可能としているが、これらを着脱可能とせずに、または着脱可能とした上で、他の手段により、これらを注入し得るようにしてもよい。たとえば、第２管路３２および第３管路３３の途中に三方活栓をそれぞれ介装して、該三方活栓の経路を適宜に切り替えて、サンプル液またはバッファ液を対応するバレル４１，５１に注入するようにしてもよい。
また、図１においては、シリンジ２のバレル２１は、サンプル液収容部４のバレル４１およびバッファ液収容部５のバレル５１と同様に、略鉛直方向に沿って立てて設置しているように描かれているが、これに限られることはなく、第１管路３１、第２管路３２および第３管路３３の一部または全部を柔軟な材質で構成して、その柔軟な部分が折れ曲がって、シリンジ２側が重力で垂れ下がるようにしてもよい。
また、上述した実施形態では、サンプル液およびバッファ液をＤＬＤマイクロ流路チップ６１に流すための圧力発生源となる圧力発生装置としてシリンジ２を用いたが、排出口を有するチャンバーおよび可動部を備え、該可動部を一定量動かすことにより、該チャンバー内の気体を該排出口から一定量押し出すものであれば、他の圧力発生装置を用いてもよく、電力等の人力以外の動力によって駆動する圧力発生装置を用いてもよい。他の圧力発生装置の具体例としては、可動部としてローターを備える電動ロータリーポンプ、可動部としてダイヤフラムを備える電動ダイヤフラムポンプ、可動部としてプランジャーを備える電動プランジャーポンプ、可動部としてピストンを備える電動ピストンポンプ、などの電動ポンプに採用されるチャンバーおよび可動部を備えた圧力発生装置を挙げることができるが、これらに限定されない。なお、上述した実施形態におけるシリンジ２は、チャンバーとしてバレル２１を有し、そのチャンバー（バレル２１）内部の圧力を変化させる可動部としてピストン２２を有する圧力発生装置であると言い得る。
シリンジ２以外の圧力発生装置を用いる場合において、逆流防止用の一方向弁（第１一方向弁）は、上述したシリンジ２を用いる実施形態の一方向弁３１ａと同様に第１管路３１の途中に設けてもよいが、チャンバーの排出口（圧力発生装置におけるチャンバーから第１管路３１に至るまでの経路）に逆流防止用の一方向弁が予め介装された圧力発生装置を用いて、その一方向弁を第１一方向弁として利用してもよい。このような逆流防止用の第１一方向弁を設けることによって、圧力発生装置の可動部を一定量動かして、第１一方向弁よりも下流側（第２管路側、第３管路側）の内圧を高めた後に、可動部を止めても第１一方向弁よりも下流側（第２管路側、第３管路側）の内圧を保持しやすくなり、その結果、圧力保持のための圧縮空気タンク等を設ける必要がなくなるので、装置を簡素化することが可能となる。
また、第２一方向弁を備える外気吸入用の通気口は、上述したシリンジ２を用いる実施形態の一方向弁３１ｂと同様に第１管路３１の壁部に設けてもよいが、圧力発生装置のチャンバー自体の壁部に内外に貫通するように一方向弁を備える外気吸入用の通気口が予め備えられた圧力発生装置を用いて、その一方向弁を第２一方向弁として利用してもよい。このような第２一方向弁を備える外気吸入用の通気口を設けることによって、圧力発生装置を粒子分離装置から取り外すことなく、チャンバー内の可動部に陽圧発生のための動作と反対の動作（すなわち陰圧を発生させる動作）をさせてから、再び可動部に陽圧発生の動作をさせることが可能となるので、陽圧発生のための動作を繰り返すことにより、第１管路の第１一方向弁よりも下流側（第２管路側、第３管路側）の内圧を逐次的に高めることができる。したがって、圧力発生装置として、チャンバーが小容量のものを用いても多量のサンプル液およびバッファ液を円滑にＤＬＤマイクロ流路チップに供給することができ、大容量のチャンバーを備えた圧力発生装置の使用に伴う装置の大型化や高コスト化を適切に防止することが可能となる。なお、電動ロータリーポンプの機構を用いる場合には、ベーン等によりチャンバー内の排出口側の空間とチャンバー内の外気吸入用の通気口側の空間とを仕切って、外気吸入用の通気口からチャンバー内の気体が排出されないようにできるので、第２一方向弁を省略した外気吸入用の通気口を設けることができる。
図４には、本発明の別の実施形態として、圧力発生装置として電動ロータリーポンプ９を有するＣＴＣ分離装置を示す。図４に示す実施形態では、電動ロータリーポンプ９の排出口（電動ロータリーポンプ９内のチャンバーから第１管路に至るまでの経路）に逆流防止用の一方向弁（不図示）が介装されている。
以上説明した実施形態は、本発明の理解を容易にするために記載されたものであって、本発明を限定するために記載されたものではない。したがって、上述した実施形態に開示された各要素は、本発明の技術的範囲に属する全ての設計変更や均等物をも含む趣旨である。
１…ＣＴＣ分離装置（粒子分離装置）
２…シリンジ（圧力発生装置）
２１…バレル（チャンバー）
２１ａ…排出口
２２…ピストン（可動部）
３…圧力分配部（分岐管）
３１…第１管路
３１ａ…一方向弁（第１一方向弁）
３１ｂ…一方向弁（第２一方向弁、通気口）
３１ｃ…Ｔ型チューブコネクタ（通気口）
３１ｄ…三方活栓
３２…第２管路
３２ａ…チューブ
３２ｂ…アダプタ
３３…第３管路
３３ａ…チューブ
３３ｂ…アダプタ
３４…Ｙ型チューブコネクタ
４…サンプル液収容部（サンプル液収容部材）
４１…バレル
４１ａ…注入口
４１ｂ…排出口
４１ｃ…チューブ
５…バッファ液収容部（バッファ液収容部材）
５１…バレル
５１ａ…注入口
５１ｂ…排出口
５１ｃ…チューブ
６…分離部
６１…ＤＬＤマイクロ流路チップ
６１ａ…サンプル液導入口
６１ｂ…バッファ液導入口
６１ｃ…ＤＬＤ流路部
６１ｄ…サンプル液排出口
６１ｅ…バッファ液排出口
７…サンプル液回収部
７１…チューブ
７２…サンプル液回収容器
８…バッファ液回収部
８１…チューブ
８２…バッファ液回収容器
９…電動ロータリーポンプ（圧力発生装置）
Ｂ…バッファ液
Ｐ…ピラー
Ｓ…サンプル液
２…シリンジ（圧力発生装置）
２１…バレル（チャンバー）
２１ａ…排出口
２２…ピストン（可動部）
３…圧力分配部（分岐管）
３１…第１管路
３１ａ…一方向弁（第１一方向弁）
３１ｂ…一方向弁（第２一方向弁、通気口）
３１ｃ…Ｔ型チューブコネクタ（通気口）
３１ｄ…三方活栓
３２…第２管路
３２ａ…チューブ
３２ｂ…アダプタ
３３…第３管路
３３ａ…チューブ
３３ｂ…アダプタ
３４…Ｙ型チューブコネクタ
４…サンプル液収容部（サンプル液収容部材）
４１…バレル
４１ａ…注入口
４１ｂ…排出口
４１ｃ…チューブ
５…バッファ液収容部（バッファ液収容部材）
５１…バレル
５１ａ…注入口
５１ｂ…排出口
５１ｃ…チューブ
６…分離部
６１…ＤＬＤマイクロ流路チップ
６１ａ…サンプル液導入口
６１ｂ…バッファ液導入口
６１ｃ…ＤＬＤ流路部
６１ｄ…サンプル液排出口
６１ｅ…バッファ液排出口
７…サンプル液回収部
７１…チューブ
７２…サンプル液回収容器
８…バッファ液回収部
８１…チューブ
８２…バッファ液回収容器
９…電動ロータリーポンプ（圧力発生装置）
Ｂ…バッファ液
Ｐ…ピラー
Ｓ…サンプル液
Claims (10)
- 標的粒子と、前記標的粒子とサイズの異なる非標的粒子を含むサンプル液から該標的粒子を分離する粒子分離装置であって、
排出口を有するバレルおよびピストンを備え、該ピストンを押圧することにより、該バレル内の気体を該排出口から押し出すシリンジと、
注入口および排出口を有し、前記サンプル液が注入されるサンプル液収容部材と、
注入口および排出口を有し、バッファ液が注入されるバッファ液収容部材と、
前記バレルの排出口に接続された第１管路、該第１管路から二股に分岐した一方であって前記サンプル液収容部材の注入口に接続される第２管路、および該第１管路から二股に分岐した他方であって前記バッファ液収容部材の注入口に接続される第３管路を備える分岐管と、
前記第１管路の途中に介装され、前記シリンジ側が陽圧時に開放し陰圧時に閉塞する逆流防止用の第１一方向弁と、
前記サンプル液収容部材の排出口に接続されるサンプル液導入口、前記バッファ液収容部材の排出口に接続されるバッファ液導入口、前記ピストンを押圧することにより、該サンプル液導入口を介して導入されたサンプル液と該バッファ液導入口を介して導入されたバッファ液とが接しながら並行して流れる複数の微細なピラーが配設されたＤＬＤマイクロ流路構造を備えるＤＬＤ流路部、該ＤＬＤ流路部でサンプル液からバッファ液に移動した標的粒子を含むバッファ液を排出するバッファ液排出口、および該ＤＬＤ流路部で標的粒子がバッファ液に移動した後のサンプル液を排出するサンプル液排出口を備えるＤＬＤマイクロ流路チップと、を有する粒子分離装置。 - 前記標的粒子は、細胞である請求項１に記載の粒子分離装置。
- 前記サンプル液は、血中循環腫瘍細胞を前記標的粒子として含む請求項２に記載の粒子分離装置。
- 前記第２管路は前記サンプル液収容部材の注入口に着脱可能であり、前記第３管路は前記バッファ液収容部材の注入口に着脱可能である請求項１～３のいずれかに記載の粒子分離装置。
- 前記第１管路の前記第１一方向弁よりも前記シリンジ側の壁部に内外に貫通するように設けられ、前記シリンジ側が陽圧時に閉塞し陰圧時に開放する第２一方向弁を備える外気吸入用の通気口をさらに有する請求項１～４のいずれかに記載の粒子分離装置。
- 標的粒子と、前記標的粒子とサイズの異なる非標的粒子を含むサンプル液から該標的粒子を分離する粒子分離装置であって、
標的粒子を含むサンプル液から該標的粒子を分離する粒子分離装置であって、
排出口を有するチャンバーおよび可動部を備え、該可動部を一定量動かすことにより、該チャンバー内の気体を該排出口から一定量押し出す圧力発生装置と、
注入口および排出口を有し、前記サンプル液が注入されるサンプル液収容部材と、
注入口および排出口を有し、バッファ液が注入されるバッファ液収容部材と、
前記チャンバーの排出口に接続された第１管路、該第１管路から二股に分岐した一方であって前記サンプル液収容部材の注入口に接続される第２管路、および該第１管路から二股に分岐した他方であって前記バッファ液収容部材の注入口に接続される第３管路を備える分岐管と、
前記第１管路の途中または前記チャンバーの排出口に介装され、前記圧力発生装置側が陽圧時に開放し陰圧時に閉塞する逆流防止用の第１一方向弁と、
前記サンプル液収容部材の排出口に接続されるサンプル液導入口、前記バッファ液収容部材の排出口に接続されるバッファ液導入口、前記圧力発生装置が前記サンプル液収容部材の内部および前記バッファ液収容部材の内部を昇圧することにより、該サンプル液導入口を介して導入されたサンプル液と該バッファ液導入口を介して導入されたバッファ液とが接しながら並行して流れる複数の微細なピラーが配設されたＤＬＤマイクロ流路構造を備えるＤＬＤ流路部、該ＤＬＤ流路部でサンプル液からバッファ液に移動した標的粒子を含むバッファ液を排出するバッファ液排出口、および該ＤＬＤ流路部で標的粒子がバッファ液に移動した後のサンプル液を排出するサンプル液排出口を備えるＤＬＤマイクロ流路チップと、を有する粒子分離装置。 - 前記標的粒子は、細胞である請求項６に記載の粒子分離装置。
- 前記サンプル液は、血中循環腫瘍細胞を前記標的粒子として含む請求項７に記載の粒子分離装置。
- 前記第２管路は前記サンプル液収容部材の注入口に着脱可能であり、前記第３管路は前記バッファ液収容部材の注入口に着脱可能である請求項６～８のいずれかに記載の粒子分離装置。
- 前記第１管路の前記第１一方向弁よりも前記圧力発生装置側の壁部または前記チャンバーの壁部に内外に貫通するように設けられ、前記圧力発生装置側が陽圧時に閉塞し陰圧時に開放する第２一方向弁を備える外気吸入用の通気口をさらに有する請求項６～９のいずれかに記載の粒子分離装置。
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