WO2019172428A1 - 粒子分離装置 - Google Patents

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WO2019172428A1
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buffer
liquid
sample
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耕児 高田
真義 橋岡
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富山県
日本ゼオン株式会社
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    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0478—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure pistons

Definitions

  • the present invention relates to a particle separator for separating target particles from a liquid containing target particles.
  • CTC circulating tumor cells
  • the image processing type cell sorter is a camera for observing the flow in the cell sorter chip, an image recognition system for distinguishing and recognizing the types of cells in the image taken by the camera, and separating the distinguished cells. Since an essential component is a device that applies external force (voltage, etc.) to cells in order to transfer to a different flow path, there is a problem that it is an expensive and large-sized device that cannot be used easily. .
  • FIG. 2 of Non-Patent Document 2 includes a syringe and a tube for injecting a sample liquid into a microchannel chip (substrate) designed based on the basic structure of the DLD method.
  • a sample liquid injection system having a buffer liquid injection system having a syringe and a tube for injecting a buffer liquid and a tube is shown for experiments.
  • Non-Patent Document 2 since the sample liquid injection system and the buffer liquid injection system are independent from each other, and each is provided with a syringe and a tube, the syringe and buffer into which the sample liquid is injected It is necessary to operate the syringe into which the liquid has been injected by the same amount at the same time (pushing the piston), and if it is performed alone, it is necessary to operate with both hands. If the operation is not performed, the flow rates of the sample liquid and the buffer liquid may be greatly different, and there is a possibility that appropriate separation cannot be performed.
  • the present invention has been made in view of such a point, and an object thereof is to provide a particle separation apparatus that is easy to operate and can appropriately separate particles.
  • a particle separator comprises: A particle separation device for separating target particles from a sample liquid containing target particles, A syringe having a barrel having a discharge port and a piston, and pushing the piston to push the gas in the barrel out of the discharge port; A sample liquid storage member having an inlet and an outlet and into which the sample liquid is injected; A buffer solution containing member having an inlet and a discharge port into which the buffer solution is injected; A first conduit connected to the outlet of the barrel; a second conduit that is bifurcated from the first conduit and connected to the inlet of the sample solution storage member; and the first conduit A branch pipe provided with a third pipe connected to the injection port of the buffer liquid containing member on the other side branched from the path into two branches; A first one-way valve for preventing backflow that is interposed in the middle of the first pipe line, and that the syringe side is opened at a positive pressure and closed at a negative pressure; A sample liquid introduction
  • the pressure in the barrel of the syringe is pushed out by pressing the piston of the syringe, and the internal pressure of the branch pipe is increased.
  • the pressure acts simultaneously on the sample solution containing member containing the sample solution and the buffer solution containing member containing the buffer solution, and the sample solution and the buffer solution are supplied to the corresponding inlets of the DLD microchannel chip.
  • the particle separation apparatus which concerns on the 1st viewpoint of this invention has the 1st one-way valve for backflow prevention in the middle of the 1st pipe line, the piston of a syringe is pressed by hand and the 1st pipe line The syringe is not pushed back even if the hand is released from the piston after increasing the internal pressure on the downstream side (second pipe side, third pipe side) of the first one-way valve.
  • the sample liquid may include non-target particles having a different size from the target particles.
  • the particle separation apparatus according to the first aspect of the present invention can separate target particles even when the sample liquid contains non-target particles having a different size from the target particles.
  • the sample liquid may be a liquid containing cells as the target particles.
  • the sample solution may include circulating tumor cells in the blood as the target particles.
  • the particle separation apparatus according to the first aspect of the present invention can be suitably used for separating cells such as circulating tumor cells in the blood.
  • the second pipe can be attached to and detached from the inlet of the sample liquid storage member
  • the third pipe can be attached to and detached from the inlet of the buffer liquid storage member It can be.
  • the particle separation device is provided so as to penetrate inside and outside the wall portion on the syringe side of the first one-way valve of the first conduit, and the syringe side is at a positive pressure. It can further have a vent hole for inhaling outside air provided with a second one-way valve that is closed and opened at the time of negative pressure. By comprising in this way, it becomes possible to pull back the pressed piston and then press it again without removing the syringe from the particle separation device. Therefore, by pumping (pushing and pulling) the piston, the first pipe line It is possible to sequentially increase the internal pressure on the downstream side (second pipeline side, third pipeline side) of the first one-way valve.
  • the particle separator comprises: A particle separation device for separating target particles from a sample liquid containing target particles, A pressure generating device that includes a chamber having a discharge port and a movable part, and moves the movable part by a certain amount to push a gas in the chamber from the discharge port by a certain amount; A sample liquid storage member having an inlet and an outlet and into which the sample liquid is injected; A buffer solution containing member having an inlet and a discharge port into which the buffer solution is injected; A first pipe connected to the discharge port of the chamber, a second pipe branched from the first pipe and bifurcated to the inlet of the sample liquid storage member; and the first pipe A branch pipe provided with a third pipe connected to the injection port of the buffer liquid containing member on the other side branched from the path into two branches; A first one-way valve for preventing backflow that is interposed in the middle of the first pipe line or in the discharge port of the chamber, and that the pressure
  • a certain amount of gas in the chamber of the pressure generation device is pushed out by moving the movable portion of the pressure generation device by a certain amount.
  • the internal pressure of the branch pipe is increased, and the pressure acts simultaneously on the sample liquid storage member in which the sample liquid is stored and the buffer liquid storage member in which the buffer liquid is stored, and the sample liquid and the buffer liquid are transferred to the DLD microchannel chip.
  • the device can be simplified when driven by power other than human power such as electric power, and the sample solution and the buffer solution can be used without special consideration. Both can be made to flow at an appropriate flow rate, and an appropriate separation can be realized.
  • the particle separation device since the particle separation device according to the second aspect of the present invention has the first one-way valve for preventing backflow in the middle of the first conduit or at the discharge port of the chamber, the movable portion of the pressure generator is fixed by a certain amount. After moving and increasing the internal pressure on the downstream side (second pipeline side, third pipeline side) from the first one-way valve, even if the movable part is stopped, the downstream side (second pipeline side) Since it is easy to hold the internal pressure on the third pipe side), it is not necessary to provide a compressed air tank or the like for holding the pressure, and the apparatus can be simplified.
  • the sample liquid may include non-target particles having a size different from that of the target particles.
  • the particle separation apparatus according to the second aspect of the present invention can separate target particles even when the sample liquid contains non-target particles having a different size from the target particles.
  • the sample liquid may be a liquid containing cells as the target particles.
  • the sample solution may include circulating tumor cells in the blood as the target particles.
  • the particle separation device according to the second aspect of the present invention can be suitably used for separation of cells such as circulating tumor cells in the blood.
  • the second pipe can be attached to and detached from the inlet of the sample liquid storage member
  • the third pipe can be attached to and detached from the inlet of the buffer liquid storage member It can be.
  • the particle separation device is provided so as to penetrate into the wall portion on the pressure generating device side or the wall portion of the chamber from the first one-way valve of the first conduit.
  • the pressure generating device may further include a vent hole for inhaling outside air including a second one-way valve that closes when positive pressure is applied and opens when negative pressure is applied.
  • the downstream side of the first one-way valve of the first pipe (the second pipe side)
  • the internal pressure on the third conduit side) can be increased sequentially. Therefore, even if a chamber having a small volume is used as the pressure generator, a large amount of sample liquid and buffer solution can be smoothly supplied to the DLD microchannel chip, and the pressure generator having a large volume chamber can be supplied. It is possible to appropriately prevent an increase in size and cost of the device accompanying use.
  • FIG. 1 is a front view schematically showing an outline of the overall configuration of a CTC separation device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a plan view showing a schematic configuration of a DLD microchannel chip of the CTC separation device of FIG.
  • FIG. 3 is a diagram showing the principle of particle separation of the DLD microchannel chip shown in FIG.
  • FIG. 4 is a front view schematically showing the outline of the overall configuration of a CTC separation device according to another embodiment of the present invention.
  • a CTC separation device that separates blood circulating tumor cells from the sample liquid using a blood-derived liquid containing blood circulating tumor cells (CTC) as target particles as non-target particles, with reference to the drawings. To do.
  • the present invention is not limited to separating blood circulating tumor cells, but a body fluid (blood) containing cells other than blood circulating tumor cells as target particles and cells different in size from the target particles as non-target particles. It is applicable to those for separating cells related to target particles from lymph fluid, saliva, urine, tears, etc.).
  • the target particles and the non-target particles are not limited to cells, and can be widely applied to particles that separate target particles from a liquid in which two or more kinds of particles having different sizes are dispersed.
  • the term “dispersed” as used herein includes not only the case where particles (cells) are suspended alone in the liquid, but also a case where part or all of them are suspended as clusters, This includes not only the case where it is scattered and floating in the liquid but also the case where it is settled to some extent.
  • the target particle size and non-target particle size are about 0.1 to 1000 ⁇ m.
  • the sample liquid only needs to contain target particles to be separated, and non-target particles having a different size from the target particles need not necessarily be contained.
  • exchange of a buffer solution containing a single size particle or a plurality of types of particles having a particle size equal to or larger than a predetermined size (the buffer solution containing particles is used as a sample solution, and the sample solution has a different or identical component to the sample solution.
  • the present invention can also be applied to the case where the particles are transferred to a buffer solution) or the concentration of the particles is concentrated.
  • target particle means a particle to be separated, which means not only a particle to be separated and recovered for use (eg, inspection), but also a particle to be separated (removed) because it is unnecessary. The meaning is also included.
  • a CTC separation device 1 includes a syringe 2 as a pressure generating unit, a pressure distribution unit (branch pipe) 3, a sample solution storage unit (sample solution storage member) 4, and a buffer solution storage.
  • a part (buffer liquid storage member) 5, a separation part (DLD microchannel chip) 6, a sample liquid recovery part 7, and a buffer liquid recovery part 8 are schematically provided.
  • the syringe 2 is a piston syringe including a barrel (outer cylinder) 21 having a discharge port 21 a and a piston 22, and the gas (air) in the barrel 21 is discharged by pressing the piston 22 (sliding in the pushing direction). The gas is sucked out from the discharge port 21a by being pushed out (discharged) from 21a and sliding in the pulling direction.
  • the pressure distribution unit 3 distributes the pressure generated by the syringe 2, and the first distribution line 31 connected to the discharge port 21 a of the barrel 21 of the syringe 2, and the one branched from the first line 31.
  • the second pipe 32 connected to the inlet 41a of the barrel 41 of the sample liquid storage section 4 to be described later and the other branched from the first pipe 31 to the buffer liquid storage section 5 to be described later.
  • a third pipe 33 connected to the inlet 51a of the barrel 51 is provided.
  • the first conduit 31 includes a one-way valve (first one-way valve) 31a, a one-way valve (second one-way valve) 31b, a T-shaped tube connector 31c, a three-way cock 31d, and a tube 31e. Yes.
  • a one-way valve 31 a is interposed in the middle of the first pipe 31, and the one-way valve 31 a has an upstream side (syringe 2 side) on the downstream side (second pipe line 32 side, third pipe line 33. Compared to the side), the backflow prevention valve is provided so as to open at the positive pressure and to close at the negative pressure.
  • a diaphragm type check valve can be used as the one-way valve 31a.
  • a vent for sucking outside air is provided on the syringe 2 side of the one-way valve 31a of the first pipe line 31.
  • the one-way valve (second one-way valve) provided so as to penetrate the wall portion of the first pipe line 31 inward and outward, and the syringe 2 side is closed at the positive pressure and opened at the negative pressure. 31b.
  • a diaphragm type check valve can be used similarly to the one-way valve 31a.
  • the vent is provided with a T-type tube connector 31c having first to third connection ports interposed in the middle of the first conduit 31, that is, the first connection port of the T-type tube connector 31c is a syringe.
  • connection port 2 is connected to the exhaust port 21a of the barrel 21, the second connection port is connected to one connection port of the one-way valve 31a, the third connection port is connected to one connection port of the one-way valve 31b, This is realized by opening the other connection port of the valve 31b to the outside.
  • a three-way stopcock provided with first to third connection ports and a flow path changing lever on the downstream side of the one-way valve 31a of the first pipe line 31 (on the side of the sample liquid container 4 and the buffer liquid container 5). 31d is interposed. More specifically, the first connection port of the three-way stopcock 31d is connected to the connection port on the downstream side of the one-way valve 31a, the tube 31e is connected to the second connection port, and the third connection port is opened to the outside. Yes.
  • the three-way stopcock 31d opens its path only from the first connection port to the second connection port and opens only the route from the first connection port to the third connection port by rotating its lever in a predetermined direction. Alternatively, only the path from the second connection port to the third connection port can be opened.
  • the second conduit 32 includes a tube 32a and an adapter 32b attached to one end of the tube 32a.
  • the adapter 32b of the second conduit 32 is detachably attached to the inlet 41a of the barrel 41 of the sample liquid storage unit 4 described later.
  • the third conduit 33 is composed of a tube 33a and an adapter 33b attached to one end of the tube 33a.
  • the adapter 33b of the third conduit 33 is detachably attached to an inlet 51a of the barrel 51 of the buffer liquid storage unit 5 described later.
  • the downstream end (the opposite side to the three-way cock 31d) of the tube 31e of the first conduit 31 is connected to the first connection port of the Y-type tube connector 34 having the first to third connection ports.
  • the upstream end (the opposite side of the adapter 32b) of the tube 32a of the second conduit 32 is connected to the second connection port of the Y-type tube connector 34, and the upstream of the tube 33a of the third conduit 33.
  • the end (on the side opposite to the adapter 33 b) is connected to the third connection port of the Y-type tube connector 34.
  • the sample liquid storage unit 4 includes a barrel (a member corresponding to an outer cylinder of a syringe) 41, and the barrel 41 has an inlet 41a and an outlet 41b.
  • the barrel 41 accommodates a sample liquid (blood) S containing target particles (blood circulating tumor cells) and non-target particles (blood cells) having a size different from that of the target particles.
  • a solution obtained by diluting blood for example, a solution obtained by diluting blood twice with PBS containing EDTA having a concentration of 4 mM
  • PBS containing EDTA having a concentration of 4 mM
  • the barrel 41 is supported by a stand or the like (not shown) in a state where the longitudinal direction (axial direction) is set to be substantially vertical so that the inlet 41a is located above and the outlet 41b is located below.
  • the sample liquid S is injected with the adapter 32b of the second conduit 32 removed from the inlet 41a of the barrel 41. After the injection, the adapter 32b of the second conduit 32 is airtightly attached to the inlet 41a of the barrel 41.
  • the sample liquid S accommodated in the barrel 41 is discharged from the discharge port 41b when pressure is applied via the second conduit 32.
  • the buffer solution storage unit 5 includes a barrel (a member corresponding to an outer cylinder of a syringe) 51, and the barrel 51 has an inlet 51a and an outlet 51b.
  • the buffer solution B is accommodated.
  • the buffer solution B one or a mixture of isotonic solutions can be used.
  • PBS or PBS containing glycerin can be used.
  • the barrel 51 has a longitudinal direction (axial direction) set substantially vertical so that the injection port 51a is positioned upward and the discharge port 51b is positioned downward. It is supported by.
  • the buffer solution B is injected, for example, in the same amount as the sample solution S with the adapter 33b of the third conduit 33 removed from the inlet 51a of the barrel 51, and after injection, the third conduit is supplied to the inlet 51a of the barrel 51.
  • 33 adapters 33b are attached in an airtight manner.
  • the buffer solution B accommodated in the barrel 51 is discharged from the discharge port 51b when pressure is applied via the third conduit 33.
  • the separation unit 6 includes a DLD microchannel chip 61 and a chip holder (not shown) for preventing leakage.
  • the DLD microchannel chip 61 includes a sample liquid inlet 61a, a buffer liquid inlet 61b, a DLD channel 61c, a sample liquid outlet 61d, and a buffer liquid outlet 61e. It is prepared for.
  • the discharge port 41b of the barrel 41 of the sample solution storage unit 4 is connected to the sample solution introduction port 61a via a tube 41c.
  • a discharge port 51b of the barrel 51 of the buffer solution storage unit 5 is connected to the buffer solution introduction port 61b through a tube 51c.
  • the DLD channel portion 61c has a DLD microchannel structure in which a plurality of fine pillars are arranged.
  • the DLD channel 61c and the channel from the outlet 41b of the barrel 41 of the sample liquid storage unit 4 to the DLD channel 61c (the outlet 41b, the tube 41c, the sample liquid inlet 61a, the DLD flow And a flow path from the discharge port 51b of the barrel 51 of the buffer liquid storage unit 5 to the DLD flow path unit 61c (the discharge port 51b, the tube 51c, and the buffer liquid introduction port 61b).
  • the DLD flow path 61c is preferably filled with a buffer solution (such as PBS or glycerin-containing PBS) in advance.
  • the sample liquid S in the barrel 41 of the sample liquid storage part 4 is passed through the discharge port 41 b, the tube 41 c and the sample liquid introduction port 61 a in the DLD flow path part.
  • the buffer solution B in the barrel 51 of the buffer solution storage unit 5 is introduced into the DLD flow channel 61c through the discharge port 51b, the tube 51c, and the buffer solution introduction port 61b.
  • the sample liquid introduced via the sample liquid inlet 61a and the buffer liquid introduced via the buffer liquid inlet 61b flow in the DLD flow path 61c in parallel as laminar flows while being in contact with each other.
  • the DLD flow path 61c has a plurality of fine pillars (micro pillars) arranged according to the principle of the deterministic lateral replacement (DLD) method as described in Non-Patent Document 1, for example. .
  • the deterministic lateral replacement method means that when a dispersion liquid of particles flows through a pillar group composed of a plurality of pillars P arranged according to a predetermined rule, This is a separation method that takes advantage of the property that large particles travel obliquely with respect to the direction of the flow as a result of the presence of the pillars preventing the particles from traveling along the direction of the flow.
  • a threshold value determined by the interval G of the pillars P and the shift amount d particles having a diameter smaller than the threshold value and particles having a diameter larger than the threshold value can be separated. .
  • the CTC having a relatively large diameter (for example, about 12 ⁇ m) contained in the sample liquid proceeds obliquely with respect to the flow direction of the sample liquid, and in parallel as a laminar flow while in contact with the sample liquid.
  • the buffer solution containing the CTC that has moved to the flowing buffer solution B and moved from the sample solution to the buffer solution reaches the buffer solution outlet 61e.
  • blood cells having a relatively small diameter (for example, about 8 ⁇ m) contained in the sample liquid proceed along the flow direction of the sample liquid, and the sample liquid after the CTC has moved (separated). At the same time, it reaches the sample liquid outlet 61d.
  • the sample liquid and the buffer liquid are slightly mixed with each other when they flow in parallel as a laminar flow while being in contact with each other. Therefore, the sample liquid discharged from the sample liquid discharge port 61d In some cases, a part of the buffer liquid is included, and the buffer liquid discharged from the buffer liquid discharge port 61e may include a part of the sample liquid.
  • a sample solution recovery container 72 is connected to the sample solution discharge port 61d via a tube 71 of the sample solution recovery unit 7, and the sample solution after the CTC is separated is recovered in the sample solution recovery container 72.
  • a buffer liquid recovery container 82 is connected to the buffer liquid discharge port 61e via a tube 81 of the buffer liquid recovery section 8, and the buffer liquid containing CTC moved (separated) from the sample liquid is stored in the buffer liquid recovery container. 82 is collected.
  • the air in the barrel 21 of the syringe 2 is pushed out by pressing the piston 22 of the syringe 2, and the pressure distributor 3 (first pipe 31, second pipe).
  • the internal pressure of the channel 32 and the third conduit 33) is increased, and the pressure is applied to the barrel 41 of the sample solution storage unit 4 in which the sample solution S is stored and the barrel 51 of the buffer solution storage unit 5 in which the buffer solution B is stored.
  • the sample solution S and the buffer solution B are pumped to the corresponding inlets 61 a and 61 b of the DLD microchannel chip 61 of the separation unit 6.
  • the syringe 2 since the syringe 2 is single, the syringe 2 can be operated with one hand, so that the operation is simple, and both the sample liquid S and the buffer liquid B can be used at the same flow rate without special care. It is possible to appropriately flow to the DLD microchannel chip 61, and it is possible to realize appropriate separation.
  • the piston 22 of the syringe 2 is provided. It is possible to prevent the air pushed out by pushing the air from flowing backward. Therefore, after the piston 22 of the syringe 2 is manually pressed to increase the internal pressure on the downstream side (the second conduit 32 side, the third conduit 33 side) of the one-way valve 31a of the first conduit 31, The hand can be released from 22 as required, and an operation for supplying pressure is easy.
  • the syringe 2 is provided on the syringe 2 side of the first conduit 31 with the T-shaped tube connector 31c and the one-way valve 31b. Since the vent hole is provided, the piston 22 once pressed can be pulled back and pressed again with the syringe 2 connected to the T-shaped tube connector 31c in cooperation with the one-way valve 31a. Yes. Therefore, by pumping the syringe 2 (pushing and pulling the piston 22), the internal pressure on the downstream side of the one-way valve 31a of the first conduit 31 can be sequentially increased.
  • the second conduit 32 in order to inject the sample liquid into the barrel 41 of the sample liquid storage unit 4, can be attached to and detached from the injection port 41 a of the barrel 41, and the buffer liquid is stored in the barrel of the buffer liquid storage unit 5.
  • the third pipe line 33 is made detachable to the injection port 51a of the barrel 51.
  • these are not made detachable or detachable, and these are injected by other means. You may make it obtain.
  • a three-way stopcock is interposed in the middle of each of the second conduit 32 and the third conduit 33, and the route of the three-way stopcock is appropriately switched to inject the sample solution or buffer solution into the corresponding barrels 41 and 51. You may make it do.
  • the barrel 21 of the syringe 2 is drawn so as to be installed in a substantially vertical direction, similarly to the barrel 41 of the sample solution storage unit 4 and the barrel 51 of the buffer solution storage unit 5.
  • the present invention is not limited to this, and a part or all of the first pipeline 31, the second pipeline 32, and the third pipeline 33 are made of a flexible material, and the flexible portion is bent.
  • the syringe 2 side may hang down due to gravity.
  • the syringe 2 is used as a pressure generating device serving as a pressure generating source for flowing the sample solution and the buffer solution to the DLD microchannel chip 61.
  • the syringe 2 includes a chamber having a discharge port and a movable portion. As long as the gas in the chamber is pushed out from the discharge port by moving the movable part by a certain amount, other pressure generators may be used and driven by power other than human power such as electric power. A pressure generator may be used.
  • pressure generating devices include an electric rotary pump having a rotor as a movable part, an electric diaphragm pump having a diaphragm as a movable part, an electric plunger pump having a plunger as a movable part, and an electric motor having a piston as a movable part.
  • a pressure generator including a chamber and a movable part employed in an electric pump such as a piston pump can be exemplified, but the invention is not limited thereto.
  • the syringe 2 in embodiment mentioned above is a pressure generator which has the barrel 21 as a chamber, and has the piston 22 as a movable part which changes the pressure inside the chamber (barrel 21).
  • the one-way valve for preventing backflow is the same as the one-way valve 31 a of the embodiment using the syringe 2 described above. Although it may be provided in the middle, using a pressure generating device in which a one-way valve for preventing a backflow is interposed in advance in a discharge port of the chamber (a route from the chamber to the first conduit 31 in the pressure generating device).
  • the one-way valve may be used as the first one-way valve.
  • the movable part of the pressure generating device is moved by a certain amount, and is located downstream of the first one-way valve (the second pipeline side and the third pipeline side). After increasing the internal pressure, it becomes easier to maintain the internal pressure on the downstream side (second pipeline side, third pipeline side) than the first one-way valve even if the movable part is stopped, and as a result, compressed air for maintaining the pressure Since there is no need to provide a tank or the like, the apparatus can be simplified.
  • the vent for intake of outside air including the second one-way valve may be provided in the wall portion of the first pipe line 31 in the same manner as the one-way valve 31b of the embodiment using the syringe 2 described above.
  • the one-way valve is used as a second one-way valve. May be.
  • the operation of generating a positive pressure can be performed again on the movable part after performing the operation (that is, the operation of generating the negative pressure), the operation of generating the positive pressure is repeated, so 1
  • the internal pressure on the downstream side (the second pipeline side, the third pipeline side) relative to the one-way valve can be successively increased. Therefore, even if a chamber having a small volume is used as the pressure generator, a large amount of sample liquid and buffer solution can be smoothly supplied to the DLD microchannel chip, and the pressure generator having a large volume chamber can be supplied. It is possible to appropriately prevent an increase in size and cost of the device accompanying use.
  • the space on the discharge port side in the chamber and the space on the ventilation port side for inhaling outside air in the chamber are partitioned by a vane or the like from the ventilation port for outside air suction to the chamber. Since the internal gas can be prevented from being discharged, a vent hole for sucking outside air can be provided without the second one-way valve.
  • FIG. 4 shows a CTC separation device having an electric rotary pump 9 as a pressure generating device as another embodiment of the present invention.
  • a one-way valve (not shown) for preventing backflow is interposed at the discharge port of the electric rotary pump 9 (path from the chamber in the electric rotary pump 9 to the first pipe line). ing.
  • tube 5 buffer solution storage part (buffer solution storage member) 51 ... barrel 51a ... inlet 51b ... outlet 51c ... tube 6 ... separation part 61 ... DLD microchannel chip 61a ... sample liquid inlet 61b ... buffer liquid inlet 61c ... DLD channel 61d ... sample liquid outlet 61e ... Buffer solution outlet 7 ... Sample solution recovery part 71 ... Tube 72 ... Sample solution recovery container 8 ... Buffer solution recovery part 81 ... Tube 82 ... Buffer solution recovery container 9 ... Electric rotary pump (pressure generator) B ... Buffer solution P ... Pillar S ... Sample solution

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Abstract

【課題】操作が簡易で、適切に粒子を分離し得る粒子分離装置を提供すること。 【解決手段】シリンジ２と、標的粒子を含むサンプル液Ｓが注入されるバレル４１と、バッファ液Ｂが注入されるバレル５１と、シリンジ２の排出口２１ａに接続された第１管路３１、第１管路３１から二股に分岐した一方であってバレル４１の注入口に接続される第２管路３２、および該第１管路から二股に分岐した他方であってバレル５１の注入口に接続される第３管路３３を備える分岐管３と、第１管路の途中に介装されたシリンジ側が陽圧時に開放し陰圧時に閉塞する逆流防止用の第１一方向弁３１ａと、ＤＬＤマイクロ流路構造を備えるＤＬＤマイクロ流路チップ６とを有する。

Description

粒子分離装置
　本発明は、標的粒子を含む液体中から該標的粒子を分離する粒子分離装置に関する。
　がんの原発腫瘍組織または転移腫瘍組織から、腫瘍細胞が遊離し、血液中へ浸潤することが知られている。このような腫瘍細胞は、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ：Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｅｌｌｓ）と呼ばれ、末梢血中の血中循環腫瘍細胞の数を測定することにより、がんの進行状態や治療効果（予後）の把握、あるいは再発・転移の早期発見等を診断する情報となり得るものと期待されている。
　末梢血中の血中循環腫瘍細胞の数を測定する方法としては、たとえば特許文献１に記載されるような、細胞試料液中の細胞を蛍光標識抗体で染色したうえで、細胞試料液をセルソーターチップの流路に流し、画像処理型セルソーターを用いて回収すべき血中循環腫瘍細胞とそれ以外の細胞とを分離して、その分離された血中循環腫瘍細胞をカウントする手法が知られている。しかしながら、画像処理型セルソーターは、セルソーターチップ内の流れを観察するためのカメラ、カメラで撮影された画像中の細胞の種類を区別して認識するための画像認識システム、および区別された細胞を分別して異なる流路に移すために細胞に外力（電圧等）を与える装置などを必須の構成要素とするものであるため、高価で大型な装置であり、簡便に使用できるものではないという問題があった。
　このようなセルソーター等の複雑な構造の機構を備える装置等を用いることなく、血中循環腫瘍細胞の数を測定するためにより簡便に使用できる方法としては、血中循環腫瘍細胞が血球細胞よりもサイズが大きい傾向があることを利用した、水力学的層流分離の一つである決定論的横置換（ＤＬＤ：Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃ　Ｌａｔｅｒａｌ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）法を用いた方法が知られている（たとえば特許文献２、非特許文献１参照）。この分離技術を利用した分離装置として、非特許文献２の図２には、ＤＬＤ法の基本的な構造に基づいて設計されたマイクロ流路チップ（基板）にサンプル液を注入するシリンジおよびチューブを有するサンプル液注入系と、バッファ液を注入するシリンジおよびチューブを有するバッファ液注入系とを備えたものが実験用として図示されている。
　しかしながら、非特許文献２に記載の分離装置では、サンプル液注入系とバッファ液注入系とは互いに独立しており、それぞれについてシリンジおよびチューブを設けているため、サンプル液が注入されたシリンジとバッファ液が注入されたシリンジとを同時に同量だけ操作（ピストンを押圧）する必要があり、一人で行う場合には両手で操作する必要がある等、操作が煩雑であるとともに、両者を注意深く均等に操作しないと、サンプル液とバッファ液とで流量が大きく相違してしまう場合があり、適切な分離を行えないおそれがある。
国際公開２０１１／１０５５０７号 米国特許第７，７３５，６５２号明細書
Ｈｕａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，"Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｔｈｒｏｕｇｈ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃ　Ｌａｔｅｒａｌ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ"，Ｓｃｉｅｎｃｅ　３０４，ｐ．９８７－９９０，２００４． 岡野弘聖、外６名、「血中循環腫瘍細胞捕捉のための寸法によるファーストスクリーニング－細胞の硬さの影響－」、２０１４年度精密工学会春季大会学術講演会講演論文集、精密工学会、ｐ．４５３－４５４
　本発明は、このような点に鑑みてなされたものであり、操作が簡易で、適切に粒子を分離し得る粒子分離装置を提供することを目的とする。
　上記目的を達成するために、本発明の第１の観点に係る粒子分離装置は、
標的粒子を含むサンプル液から該標的粒子を分離する粒子分離装置であって、
排出口を有するバレルおよびピストンを備え、該ピストンを押圧することにより、該バレル内の気体を該排出口から押し出すシリンジと、
注入口および排出口を有し、前記サンプル液が注入されるサンプル液収容部材と、
注入口および排出口を有し、バッファ液が注入されるバッファ液収容部材と、
前記バレルの排出口に接続された第１管路、該第１管路から二股に分岐した一方であって前記サンプル液収容部材の注入口に接続される第２管路、および該第１管路から二股に分岐した他方であって前記バッファ液収容部材の注入口に接続される第３管路を備える分岐管と、
前記第１管路の途中に介装され、前記シリンジ側が陽圧時に開放し陰圧時に閉塞する逆流防止用の第１一方向弁と、
前記サンプル液収容部材の排出口に接続されるサンプル液導入口、前記バッファ液収容部材の排出口に接続されるバッファ液導入口、前記ピストンを押圧することにより、該サンプル液導入口を介して導入されたサンプル液と該バッファ液導入口を介して導入されたバッファ液とが接しながら並行して流れる複数の微細なピラーが配設されたＤＬＤマイクロ流路構造を備えるＤＬＤ流路部、該ＤＬＤ流路部でサンプル液からバッファ液に移動した標的粒子を含むバッファ液を排出するバッファ液排出口、および該ＤＬＤ流路部で標的粒子がバッファ液に移動した後のサンプル液を排出するサンプル液排出口を備えるＤＬＤマイクロ流路チップと、を有する。
　本発明の第１の観点に係る粒子分離装置を用いて粒子の分離を行う際には、シリンジのピストンを押圧することにより、シリンジのバレル内の気体が押し出されて分岐管の内圧が高められ、その圧力が、サンプル液が収容されたサンプル液収容部材およびバッファ液が収容されたバッファ液収容部材に同時に作用し、サンプル液およびバッファ液がＤＬＤマイクロ流路チップの対応する導入口に供給される。したがって、単一のシリンジを操作するだけでよいので、片手で操作し得るため、操作が簡易であるとともに、特に注意深く操作しなくても、サンプル液とバッファ液との両者を適切な流量で流すことができ、適切な分離を実現することが可能となる。また、本発明の第１の観点に係る粒子分離装置は、第１管路の途中に逆流防止用の第１一方向弁を有するので、シリンジのピストンを手で押圧して、第１管路の第１一方向弁よりも下流側（第２管路側、第３管路側）の内圧を高めた後に、ピストンから手を離してもシリンジが押し戻されることがない。
　本発明の第１の観点に係る粒子分離装置において、前記サンプル液は、前記標的粒子とサイズの異なる非標的粒子を含むことができる。本発明の第１の観点に係る粒子分離装置は、サンプル液が標的粒子とサイズの異なる非標的粒子を含む場合にも、該標的粒子を分離することができる。
　本発明の第１の観点に係る粒子分離装置において、前記サンプル液は、前記標的粒子として、細胞を含む液体とすることができる。この場合において、前記サンプル液は、血中循環腫瘍細胞を前記標的粒子として含むものとすることができる。本発明の第１の観点に係る粒子分離装置は、血中循環腫瘍細胞等の細胞の分離に好適に用いることができる。
　本発明の第１の観点に係る粒子分離装置において、前記第２管路を前記サンプル液収容部材の注入口に着脱可能とし、前記第３管路を前記バッファ液収容部材の注入口に着脱可能とすることができる。このように構成することにより、サンプル液収容部材の注入口から第２管路を取り外した状態で、サンプル液をサンプル液収容部材に注入した後にサンプル液収容部材の注入口に第２管路を装着し、バッファ液収容部材の注入口から第３管路を取り外した状態で、バッファ液をバッファ液収容部材に注入した後にバッファ液収容部材の注入口に第３管路を装着することができる。
　本発明の第１の観点に係る粒子分離装置において、前記第１管路の前記第１一方向弁よりも前記シリンジ側の壁部に内外に貫通するように設けられ、前記シリンジ側が陽圧時に閉塞し陰圧時に開放する第２一方向弁を備える外気吸入用の通気口をさらに有することができる。このように構成することにより、シリンジを粒子分離装置から取り外すことなく、押圧したピストンを引き戻してから再び押圧することが可能となるので、ピストンをポンピング（押し引き）することにより、第１管路の第１一方向弁よりも下流側（第２管路側、第３管路側）の内圧を逐次的に高めることができる。したがって、シリンジとして、バレル断面積が小さい小容量のものを用いても多量のサンプル液およびバッファ液を円滑にＤＬＤマイクロ流路チップに供給することができ、バレル断面積が大きい大容量シリンジの使用に伴う装置の大型化やシリンジ操作性低下を適切に防止することができる。
　上記目的を達成するために、本発明の第２の観点に係る粒子分離装置は、
標的粒子を含むサンプル液から該標的粒子を分離する粒子分離装置であって、
排出口を有するチャンバーおよび可動部を備え、該可動部を一定量動かすことにより、該チャンバー内の気体を該排出口から一定量押し出す圧力発生装置と、
注入口および排出口を有し、前記サンプル液が注入されるサンプル液収容部材と、
注入口および排出口を有し、バッファ液が注入されるバッファ液収容部材と、
前記チャンバーの排出口に接続された第１管路、該第１管路から二股に分岐した一方であって前記サンプル液収容部材の注入口に接続される第２管路、および該第１管路から二股に分岐した他方であって前記バッファ液収容部材の注入口に接続される第３管路を備える分岐管と、
前記第１管路の途中または前記チャンバーの排出口に介装され、前記圧力発生部側が陽圧時に開放し陰圧時に閉塞する逆流防止用の第１一方向弁と、
前記サンプル液収容部材の排出口に接続されるサンプル液導入口、前記バッファ液収容部材の排出口に接続されるバッファ液導入口、前記圧力発生装置が前記サンプル液収容部の内部および前記バッファ液収容部の内部を昇圧することにより、該サンプル液導入口を介して導入されたサンプル液と該バッファ液導入口を介して導入されたバッファ液とが接しながら並行して流れる複数の微細なピラーが配設されたＤＬＤマイクロ流路構造を備えるＤＬＤ流路部、該ＤＬＤ流路部でサンプル液からバッファ液に移動した標的粒子を含むバッファ液を排出するバッファ液排出口、および該ＤＬＤ流路部で標的粒子がバッファ液に移動した後のサンプル液を排出するサンプル液排出口を備えるＤＬＤマイクロ流路チップと、を有する。
　本発明の第２の観点に係る粒子分離装置を用いて粒子の分離を行う際には、圧力発生装置の可動部を一定量動かすことにより、圧力発生装置のチャンバー内の気体が一定量押し出されて分岐管の内圧が高められ、その圧力が、サンプル液が収容されたサンプル液収容部材およびバッファ液が収容されたバッファ液収容部材に同時に作用し、サンプル液およびバッファ液がＤＬＤマイクロ流路チップの対応する導入口に供給される。したがって、単一の圧力発生装置を備えるだけでよいので、電力等の人力以外の動力によって駆動する場合には装置を簡素化できるとともに、特段の配慮をしなくても、サンプル液とバッファ液との両者を適切な流量で流すことができ、適切な分離を実現することが可能となる。また、本発明の第２の観点に係る粒子分離装置は、第１管路の途中またはチャンバーの排出口に逆流防止用の第１一方向弁を有するので、圧力発生装置の可動部を一定量動かして、第１一方向弁よりも下流側（第２管路側、第３管路側）の内圧を高めた後に、可動部を止めても第１一方向弁よりも下流側（第２管路側、第３管路側）の内圧を保持しやすくなるので、圧力保持のための圧縮空気タンク等を設ける必要が無く、装置を簡素化できる。
　本発明の第２の観点に係る粒子分離装置において、前記サンプル液は、前記標的粒子とサイズの異なる非標的粒子を含むことができる。本発明の第２の観点に係る粒子分離装置は、サンプル液が標的粒子とサイズの異なる非標的粒子を含む場合にも、該標的粒子を分離することができる。
　本発明の第２の観点に係る粒子分離装置において、前記サンプル液は、前記標的粒子として、細胞を含む液体とすることができる。この場合において、前記サンプル液は、血中循環腫瘍細胞を前記標的粒子として含むものとすることができる。本発明の第２の観点に係る粒子分離装置は、血中循環腫瘍細胞等の細胞の分離に好適に用いることができる。
　本発明の第２の観点に係る粒子分離装置において、前記第２管路を前記サンプル液収容部材の注入口に着脱可能とし、前記第３管路を前記バッファ液収容部材の注入口に着脱可能とすることができる。このように構成することにより、サンプル液収容部材の注入口から第２管路を取り外した状態で、サンプル液をサンプル液収容部材に注入した後にサンプル液収容部材の注入口に第２管路を装着し、バッファ液収容部材の注入口から第３管路を取り外した状態で、バッファ液をバッファ液収容部材に注入した後にバッファ液収容部材の注入口に第３管路を装着することができる。
　本発明の第２の観点に係る粒子分離装置において、前記第１管路の前記第１一方向弁よりも前記圧力発生装置側の壁部または前記チャンバーの壁部に内外に貫通するように設けられ、前記圧力発生装置側が陽圧時に閉塞し陰圧時に開放する第２一方向弁を備える外気吸入用の通気口をさらに有することができる。このように構成することにより、圧力発生装置を粒子分離装置から取り外すことなく、チャンバー内の可動部に陽圧発生のための動作と反対の動作（すなわち陰圧を発生させる動作）をさせてから、再び可動部に陽圧発生の動作をさせることが可能となるので、陽圧発生のための動作を繰り返すことにより、第１管路の第１一方向弁よりも下流側（第２管路側、第３管路側）の内圧を逐次的に高めることができる。したがって、圧力発生装置として、チャンバーが小容量のものを用いても多量のサンプル液およびバッファ液を円滑にＤＬＤマイクロ流路チップに供給することができ、大容量のチャンバーを備えた圧力発生装置の使用に伴う装置の大型化や高コスト化を適切に防止することができる。
図１は、本発明の実施形態に係るＣＴＣ分離装置の全体構成の概略を模式的に示す正面図である。 図２は、図１のＣＴＣ分離装置のＤＬＤマイクロ流路チップの概略構成を示す平面図である。 図３は、図２に示すＤＬＤマイクロ流路チップの粒子分離の原理を示す図である。 図４は、本発明の別の実施形態に係るＣＴＣ分離装置の全体構成の概略を模式的に示す正面図である。
　以下、標的粒子および該標的粒子と異なるサイズの非標的粒子が分散したサンプル液から該標的粒子を分離（分画）するための、本発明が適用された粒子分離装置の実施形態として、血球を非標的粒子として、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を標的粒子として含む血液由来の液をサンプル液とし、該サンプル液から血中循環腫瘍細胞を分離するＣＴＣ分離装置について、図面を参照して説明する。
　ただし、本発明は、血中循環腫瘍細胞を分離するものに限定されず、血中循環腫瘍細胞以外の細胞を標的粒子として、該標的粒子とサイズの異なる細胞を非標的粒子として含む体液（血液、リンパ液、唾液、尿、涙等を含む）から標的粒子に係る細胞を分離するものに適用可能である。また、標的粒子および非標的粒子としては、細胞にも限定されず、サイズの異なる２種以上の粒子が分散した液体中から標的粒子に係る粒子を分離するものに広く適用可能である。なお、ここでいう「分散」とは、粒子（細胞）が液体中に粒子単体で浮遊している場合のみならず、その一部または全部がクラスターとして浮遊している場合が含まれ、また、液体中に散らばって浮遊している場合のみならず、ある程度沈降している場合も含まれる。対象とする標的粒子および非標的粒子の粒径は、０．１～１０００μｍ程度である。
　さらに、本発明において、サンプル液は分離対象である標的粒子を含むものであればよく、該標的粒子とサイズの異なる非標的粒子は、必ずしも含んでいる必要はない。たとえば、単一サイズの粒子または所定のサイズ以上の粒径を有する複数種の粒子を含むバッファ液の交換（粒子を含むバッファ液をサンプル液として、該サンプル液と成分の異なるまたは同一の他のバッファ液に該粒子を移す）を行う場合や粒子の濃度の濃縮を行う場合にも、本発明は適用可能である。また、「標的粒子」とは分離の対象の粒子という意味であり、何らかの利用（たとえば検査）に供するために分離回収したい粒子という意味のみならず、不要なために分離除去したい（取り除きたい）粒子という意味も含まれる。
　図１に示すように、本実施形態に係るＣＴＣ分離装置１は、圧力発生部としてのシリンジ２、圧力分配部（分岐管）３、サンプル液収容部（サンプル液収容部材）４、バッファ液収容部（バッファ液収容部材）５、分離部（ＤＬＤマイクロ流路チップ）６、サンプル液回収部７，およびバッファ液回収部８を概略備えて構成されている。
　シリンジ２は、排出口２１ａを有するバレル（外筒）２１およびピストン２２からなるピストンシリンジであり、ピストン２２を押圧（押し込む方向にスライド）することにより、バレル２１内の気体（空気）を排出口２１ａから押し出し（排出し）、引き出す方向にスライドすることにより、排出口２１ａから気体を吸引する。
　圧力分配部３は、シリンジ２により発生された圧力を分配するものであり、シリンジ２のバレル２１の排出口２１ａに接続された第１管路３１、第１管路３１から二股に分岐した一方であって後述するサンプル液収容部４のバレル４１の注入口４１ａに接続される第２管路３２、および第１管路３１から二股に分岐した他方であって後述するバッファ液収容部５のバレル５１の注入口５１ａに接続される第３管路３３を備えている。
　第１管路３１は、一方向弁（第１一方向弁）３１ａ、一方向弁（第２一方向弁）３１ｂ、Ｔ型チューブコネクタ３１ｃ、三方活栓３１ｄ、およびチューブ３１ｅを備えて構成されている。
　第１管路３１の途中には、一方向弁３１ａが介装されており、一方向弁３１ａは、上流側（シリンジ２側）が下流側（第２管路３２側、第３管路３３側）に比して、陽圧時に開放し陰圧時に閉塞するように設けられた逆流防止用の弁である。一方向弁３１ａとしては、ダイヤフラム式チェックバルブを用いることができる。
　第１管路３１の一方向弁３１ａよりもシリンジ２側には、外気吸入用の通気口が設けられている。通気口は、第１管路３１の壁部に内外に貫通するように設けられ、シリンジ２側が陽圧時に閉塞し陰圧時に開放するように設けられた一方向弁（第２一方向弁）３１ｂを備えている。一方向弁３１ｂとしては、一方向弁３１ａと同様に、ダイヤフラム式チェックバルブを用いることができる。通気口は、本実施形態では、第１～第３接続口を有するＴ型チューブコネクタ３１ｃを第１管路３１の途中に介装する、すなわち、Ｔ型チューブコネクタ３１ｃの第１接続口をシリンジ２のバレル２１の排気口２１ａに接続し、第２接続口を一方向弁３１ａの一方の接続口に接続し、第３接続口を一方向弁３１ｂの一方の接続口に接続し、一方向弁３１ｂの他方の接続口を外部に開放することにより実現している。
　第１管路３１の一方向弁３１ａよりも下流側（サンプル液収容部４側、バッファ液収容部５側）には、第１～第３接続口および流路変更用のレバーを備える三方活栓３１ｄが介装されている。より具体的には、三方活栓３１ｄの第１接続口が一方向弁３１ａの下流側の接続口に接続され、第２接続口にチューブ３１ｅが接続され、第３接続口は外部に開放されている。三方活栓３１ｄは、そのレバーを所定の向きに回動させることにより、第１接続口から第２接続口に至る経路のみを開放し、第１接続口から第３接続口に至る経路のみを開放し、または第２接続口から第３接続口に至る経路のみを開放することができる。
　第２管路３２は、チューブ３２ａおよびチューブ３２ａの一端に取り付けられたアダプタ３２ｂから構成されている。第２管路３２のアダプタ３２ｂは、後述するサンプル液収容部４のバレル４１の注入口４１ａに着脱可能に装着される。第３管路３３は、チューブ３３ａおよびチューブ３３ａの一端に取り付けられたアダプタ３３ｂから構成されている。第３管路３３のアダプタ３３ｂは、後述するバッファ液収容部５のバレル５１の注入口５１ａに着脱可能に装着される。
　第１管路３１のチューブ３１ｅの下流側（三方活栓３１ｄと反対側）の端部は、第１～第３接続口を有するＹ型チューブコネクタ３４の第１接続口に接続されている。第２管路３２のチューブ３２ａの上流側（アダプタ３２ｂと反対側）の端部は、Ｙ型チューブコネクタ３４の第２接続口に接続されており、第３管路３３のチューブ３３ａの上流側（アダプタ３３ｂと反対側）の端部は、Ｙ型チューブコネクタ３４の第３接続口に接続されている。
　サンプル液収容部４は、バレル（シリンジの外筒に相当する部材）４１を備え、バレル４１は、注入口４１ａおよび排出口４１ｂを有している。バレル４１には、標的粒子（血中循環腫瘍細胞）および該標的粒子と異なるサイズの非標的粒子（血球）を含むサンプル液（血液）Ｓが収容される。なお、サンプル液Ｓとしては、血液を希釈したもの（たとえば、血液を濃度４ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳで２倍希釈したもの）を用いることができる。
　バレル４１は、注入口４１ａが上方に、排出口４１ｂが下方に位置するように、その長手方向（軸方向）が略鉛直に設定された状態で、不図示のスタンド等に支持されている。サンプル液Ｓは、バレル４１の注入口４１ａから第２管路３２のアダプタ３２ｂを取り外した状態で注入され、注入後にバレル４１の注入口４１ａに第２管路３２のアダプタ３２ｂが気密に装着される。バレル４１内に収容されたサンプル液Ｓは、第２管路３２を介して圧力が作用した場合に、排出口４１ｂから排出される。
　バッファ液収容部５は、バレル（シリンジの外筒に相当する部材）５１を備え、バレル５１は、注入口５１ａおよび排出口５１ｂを有している。バレル５１には、バッファ液Ｂが収容される。バッファ液Ｂとしては、等張液を一種または複数種混合したものを用いることができ、たとえばＰＢＳまたはグリセリン含有ＰＢＳ等を用いることができる。
　バレル５１は、バレル４１と同様に、注入口５１ａが上方に、排出口５１ｂが下方に位置するように、その長手方向（軸方向）が略鉛直に設定された状態で、不図示のスタンド等に支持されている。バッファ液Ｂは、バレル５１の注入口５１ａから第３管路３３のアダプタ３３ｂを取り外した状態で、たとえばサンプル液Ｓと同量だけ注入され、注入後にバレル５１の注入口５１ａに第３管路３３のアダプタ３３ｂが気密に装着される。バレル５１内に収容されたバッファ液Ｂは、第３管路３３を介して圧力が作用した場合に、排出口５１ｂから排出される。
　分離部６は、ＤＬＤマイクロ流路チップ６１および漏れ防止用のチップホルダ（不図示）を備えて構成されている。ＤＬＤマイクロ流路チップ６１は、図２にも示されているように、サンプル液導入口６１ａ、バッファ液導入口６１ｂ、ＤＬＤ流路部６１ｃ、サンプル液排出口６１ｄ、およびバッファ液排出口６１ｅを備えて構成されている。
　サンプル液導入口６１ａには、チューブ４１ｃを介して、サンプル液収容部４のバレル４１の排出口４１ｂが接続される。バッファ液導入口６１ｂには、チューブ５１ｃを介して、バッファ液収容部５のバレル５１の排出口５１ｂが接続される。ＤＬＤ流路部６１ｃは、複数の微細なピラーが配設されたＤＬＤマイクロ流路構造を備えている。なお、ＤＬＤ流路部６１ｃと、サンプル液収容部４のバレル４１の排出口４１ｂからＤＬＤ流路部６１ｃまでの流路（排出口４１ｂと、チューブ４１ｃと、サンプル液導入口６１ａと、ＤＬＤ流路部６１ｃと、からなる流路）、およびバッファ液収容部５のバレル５１の排出口５１ｂからＤＬＤ流路部６１ｃまでの流路（排出口５１ｂと、チューブ５１ｃと、バッファ液導入口６１ｂと、ＤＬＤ流路部６１ｃと、からなる流路）は、予めバッファ液（ＰＢＳまたはグリセリン含有ＰＢＳ等）で満たしておくことが望ましい。
　シリンジ２のピストン２２を押圧することにより供給される圧力により、サンプル液収容部４のバレル４１内のサンプル液Ｓが、排出口４１ｂ、チューブ４１ｃおよびサンプル液導入口６１ａを介してＤＬＤ流路部６１ｃに導入されるとともに、バッファ液収容部５のバレル５１内のバッファ液Ｂが、排出口５１ｂ、チューブ５１ｃおよびバッファ液導入口６１ｂを介してＤＬＤ流路部６１ｃに導入される。
　サンプル液導入口６１ａを介して導入されたサンプル液と、バッファ液導入口６１ｂを介して導入されたバッファ液とは、互いに接しながらそれぞれ層流として並行して、ＤＬＤ流路部６１ｃ内を流れる。ＤＬＤ流路部６１ｃは、たとえば非特許文献１に記載されているような決定論的横置換（ＤＬＤ）法の原理にしたがって配設された複数の微細なピラー（マイクロピラー）を有している。
　決定論的横置換法とは、図３に示すように、所定の規則にしたがって配設された複数のピラーＰからなるピラー群に粒子の分散液を流した際に、小さい粒子は流れの方向に沿って進み、大きい粒子はピラーの存在によって流れの方向に沿う進行を妨げられる結果として、流れの方向に対して斜めに進む性質を利用した分離法である。ピラーＰの間隔Ｇと、シフト量ｄとで決まるしきい値を適宜に設定することにより、該しきい値未満の径の粒子と該しきい値以上の径の粒子とを分離することができる。
　ＤＬＤ流路部６１ｃ内において、サンプル液に含まれる比較的に大きい径のＣＴＣ（たとえば１２μｍ程度）は、サンプル液の流れ方向に対して斜めに進み、サンプル液に接しながら層流として並行して流れるバッファ液Ｂに移動し、サンプル液からバッファ液に移動したＣＴＣを含むバッファ液がバッファ液排出口６１ｅに至る。ＤＬＤ流路部６１ｃ内において、サンプル液に含まれる比較的に小さい径の血球（たとえば８μｍ程度）は、サンプル液の流れ方向に沿って進み、ＣＴＣが移動した（分離された）後のサンプル液とともに、サンプル液排出口６１ｄに至る。なお、ＤＬＤ流路部６１ｃ内において、サンプル液とバッファ液とは、互いに接しながら層流として並行して流れる際に、互いに僅かに混入し合うため、サンプル液排出口６１ｄから排出されるサンプル液にはバッファ液の一部が、バッファ液排出口６１ｅから排出されるバッファ液にはサンプル液の一部が含まれる場合がある。
　サンプル液排出口６１ｄには、サンプル液回収部７のチューブ７１を介してサンプル液回収容器７２が接続されており、ＣＴＣが分離された後のサンプル液がサンプル液回収容器７２に回収される。バッファ液排出口６１ｅには、バッファ液回収部８のチューブ８１を介してバッファ液回収容器８２が接続されており、サンプル液から移動した（分離された）ＣＴＣを含むバッファ液がバッファ液回収容器８２に回収される。
　被験者の血液からＣＴＣの分離を行う際には、シリンジ２のピストン２２を押圧することにより、シリンジ２のバレル２１内の空気が押し出されて圧力分配部３（第１管路３１、第２管路３２および第３管路３３）の内圧が高められ、その圧力がサンプル液Ｓが収容されたサンプル液収容部４のバレル４１およびバッファ液Ｂが収容されたバッファ液収容部５のバレル５１に同時に作用し、サンプル液Ｓおよびバッファ液Ｂが分離部６のＤＬＤマイクロ流路チップ６１の対応する導入口６１ａ，６１ｂに圧送される。したがって、シリンジ２は単一であるから、シリンジ２を片手で操作し得るため、操作が簡易であるとともに、特に注意深く操作しなくても、サンプル液Ｓとバッファ液Ｂとの両者を同じ流量で適切にＤＬＤマイクロ流路チップ６１に流すことができ、適切な分離を実現することができる。
　また、本実施形態では、第１管路３１の途中に、シリンジ２側が陽圧時に開放し陰圧時に閉塞する逆流防止用の一方向弁３１ａを介装しているため、シリンジ２のピストン２２を押圧して押し出した空気が逆流することを防止することができる。したがって、シリンジ２のピストン２２を手で押圧して第１管路３１の一方向弁３１ａよりも下流側（第２管路３２側、第３管路３３側）の内圧を高めた後に、ピストン２２から必要に応じて手を離すことができ、圧力を供給するための操作がし易い。
　さらに、本実施形態では、一方向弁３１ａに加えて、第１管路３１の一方向弁３１ａよりもシリンジ２側に、Ｔ型チューブコネクタ３１ｃおよび一方向弁３１ｂで構成される外気吸入用の通気口を設けたので、一方向弁３１ａとの協働により、シリンジ２をＴ型チューブコネクタ３１ｃに接続したままの状態で、一旦押圧したピストン２２を引き戻して再び押圧する操作が可能となっている。したがって、シリンジ２をポンピング（ピストン２２を押し引き）することで、第１管路３１の一方向弁３１ａよりも下流側の内圧を逐次的に高めることができる。このため、シリンジ２として、バレル断面積が小さい小容量のものを用いても多量のサンプル液およびバッファ液を円滑にＤＬＤマイクロ流路チップ６１に供給することができ、バレル断面積が大きい大容量シリンジの使用に伴う装置の大型化やシリンジ操作性低下を適切に防止することができる。
　なお、本実施形態では、サンプル液をサンプル液収容部４のバレル４１に注入するため、第２管路３２をバレル４１の注入口４１ａに着脱可能とし、バッファ液をバッファ液収容部５のバレル５１に注入するため、第３管路３３をバレル５１の注入口５１ａに着脱可能としているが、これらを着脱可能とせずに、または着脱可能とした上で、他の手段により、これらを注入し得るようにしてもよい。たとえば、第２管路３２および第３管路３３の途中に三方活栓をそれぞれ介装して、該三方活栓の経路を適宜に切り替えて、サンプル液またはバッファ液を対応するバレル４１，５１に注入するようにしてもよい。
　また、図１においては、シリンジ２のバレル２１は、サンプル液収容部４のバレル４１およびバッファ液収容部５のバレル５１と同様に、略鉛直方向に沿って立てて設置しているように描かれているが、これに限られることはなく、第１管路３１、第２管路３２および第３管路３３の一部または全部を柔軟な材質で構成して、その柔軟な部分が折れ曲がって、シリンジ２側が重力で垂れ下がるようにしてもよい。
　また、上述した実施形態では、サンプル液およびバッファ液をＤＬＤマイクロ流路チップ６１に流すための圧力発生源となる圧力発生装置としてシリンジ２を用いたが、排出口を有するチャンバーおよび可動部を備え、該可動部を一定量動かすことにより、該チャンバー内の気体を該排出口から一定量押し出すものであれば、他の圧力発生装置を用いてもよく、電力等の人力以外の動力によって駆動する圧力発生装置を用いてもよい。他の圧力発生装置の具体例としては、可動部としてローターを備える電動ロータリーポンプ、可動部としてダイヤフラムを備える電動ダイヤフラムポンプ、可動部としてプランジャーを備える電動プランジャーポンプ、可動部としてピストンを備える電動ピストンポンプ、などの電動ポンプに採用されるチャンバーおよび可動部を備えた圧力発生装置を挙げることができるが、これらに限定されない。なお、上述した実施形態におけるシリンジ２は、チャンバーとしてバレル２１を有し、そのチャンバー（バレル２１）内部の圧力を変化させる可動部としてピストン２２を有する圧力発生装置であると言い得る。
　シリンジ２以外の圧力発生装置を用いる場合において、逆流防止用の一方向弁（第１一方向弁）は、上述したシリンジ２を用いる実施形態の一方向弁３１ａと同様に第１管路３１の途中に設けてもよいが、チャンバーの排出口（圧力発生装置におけるチャンバーから第１管路３１に至るまでの経路）に逆流防止用の一方向弁が予め介装された圧力発生装置を用いて、その一方向弁を第１一方向弁として利用してもよい。このような逆流防止用の第１一方向弁を設けることによって、圧力発生装置の可動部を一定量動かして、第１一方向弁よりも下流側（第２管路側、第３管路側）の内圧を高めた後に、可動部を止めても第１一方向弁よりも下流側（第２管路側、第３管路側）の内圧を保持しやすくなり、その結果、圧力保持のための圧縮空気タンク等を設ける必要がなくなるので、装置を簡素化することが可能となる。
　また、第２一方向弁を備える外気吸入用の通気口は、上述したシリンジ２を用いる実施形態の一方向弁３１ｂと同様に第１管路３１の壁部に設けてもよいが、圧力発生装置のチャンバー自体の壁部に内外に貫通するように一方向弁を備える外気吸入用の通気口が予め備えられた圧力発生装置を用いて、その一方向弁を第２一方向弁として利用してもよい。このような第２一方向弁を備える外気吸入用の通気口を設けることによって、圧力発生装置を粒子分離装置から取り外すことなく、チャンバー内の可動部に陽圧発生のための動作と反対の動作（すなわち陰圧を発生させる動作）をさせてから、再び可動部に陽圧発生の動作をさせることが可能となるので、陽圧発生のための動作を繰り返すことにより、第１管路の第１一方向弁よりも下流側（第２管路側、第３管路側）の内圧を逐次的に高めることができる。したがって、圧力発生装置として、チャンバーが小容量のものを用いても多量のサンプル液およびバッファ液を円滑にＤＬＤマイクロ流路チップに供給することができ、大容量のチャンバーを備えた圧力発生装置の使用に伴う装置の大型化や高コスト化を適切に防止することが可能となる。なお、電動ロータリーポンプの機構を用いる場合には、ベーン等によりチャンバー内の排出口側の空間とチャンバー内の外気吸入用の通気口側の空間とを仕切って、外気吸入用の通気口からチャンバー内の気体が排出されないようにできるので、第２一方向弁を省略した外気吸入用の通気口を設けることができる。
　図４には、本発明の別の実施形態として、圧力発生装置として電動ロータリーポンプ９を有するＣＴＣ分離装置を示す。図４に示す実施形態では、電動ロータリーポンプ９の排出口（電動ロータリーポンプ９内のチャンバーから第１管路に至るまでの経路）に逆流防止用の一方向弁（不図示）が介装されている。
　以上説明した実施形態は、本発明の理解を容易にするために記載されたものであって、本発明を限定するために記載されたものではない。したがって、上述した実施形態に開示された各要素は、本発明の技術的範囲に属する全ての設計変更や均等物をも含む趣旨である。
１…ＣＴＣ分離装置（粒子分離装置）
２…シリンジ（圧力発生装置）
　２１…バレル（チャンバー）
　　２１ａ…排出口
　２２…ピストン（可動部）
３…圧力分配部（分岐管）
　３１…第１管路
　　３１ａ…一方向弁（第１一方向弁）
　　３１ｂ…一方向弁（第２一方向弁、通気口）
　　３１ｃ…Ｔ型チューブコネクタ（通気口）
　　３１ｄ…三方活栓
　３２…第２管路
　　３２ａ…チューブ
　　３２ｂ…アダプタ
　３３…第３管路
　　３３ａ…チューブ
　　３３ｂ…アダプタ
　３４…Ｙ型チューブコネクタ
４…サンプル液収容部（サンプル液収容部材）
　４１…バレル
　　４１ａ…注入口
　　４１ｂ…排出口
　　４１ｃ…チューブ
５…バッファ液収容部（バッファ液収容部材）
　５１…バレル
　　５１ａ…注入口
　　５１ｂ…排出口
　　５１ｃ…チューブ
６…分離部
　６１…ＤＬＤマイクロ流路チップ
　　６１ａ…サンプル液導入口
　　６１ｂ…バッファ液導入口
　　６１ｃ…ＤＬＤ流路部
　　６１ｄ…サンプル液排出口
　　６１ｅ…バッファ液排出口
７…サンプル液回収部
　７１…チューブ
　７２…サンプル液回収容器
８…バッファ液回収部
　８１…チューブ
　８２…バッファ液回収容器
９…電動ロータリーポンプ（圧力発生装置）
Ｂ…バッファ液
Ｐ…ピラー
Ｓ…サンプル液

Claims (12)

  1. 　標的粒子を含むサンプル液から該標的粒子を分離する粒子分離装置であって、
    排出口を有するバレルおよびピストンを備え、該ピストンを押圧することにより、該バレル内の気体を該排出口から押し出すシリンジと、
    注入口および排出口を有し、前記サンプル液が注入されるサンプル液収容部材と、
    注入口および排出口を有し、バッファ液が注入されるバッファ液収容部材と、
    前記バレルの排出口に接続された第１管路、該第１管路から二股に分岐した一方であって前記サンプル液収容部材の注入口に接続される第２管路、および該第１管路から二股に分岐した他方であって前記バッファ液収容部材の注入口に接続される第３管路を備える分岐管と、
    前記第１管路の途中に介装され、前記シリンジ側が陽圧時に開放し陰圧時に閉塞する逆流防止用の第１一方向弁と、
    前記サンプル液収容部材の排出口に接続されるサンプル液導入口、前記バッファ液収容部材の排出口に接続されるバッファ液導入口、前記ピストンを押圧することにより、該サンプル液導入口を介して導入されたサンプル液と該バッファ液導入口を介して導入されたバッファ液とが接しながら並行して流れる複数の微細なピラーが配設されたＤＬＤマイクロ流路構造を備えるＤＬＤ流路部、該ＤＬＤ流路部でサンプル液からバッファ液に移動した標的粒子を含むバッファ液を排出するバッファ液排出口、および該ＤＬＤ流路部で標的粒子がバッファ液に移動した後のサンプル液を排出するサンプル液排出口を備えるＤＬＤマイクロ流路チップと、を有する粒子分離装置。
  2. 　前記サンプル液は、前記標的粒子とサイズの異なる非標的粒子を含む請求項１に記載の粒子分離装置。
  3. 　前記標的粒子は、細胞である請求項１または２に記載の粒子分離装置。
  4. 　前記サンプル液は、血中循環腫瘍細胞を前記標的粒子として含む請求項３に記載の粒子分離装置。
  5. 　前記第２管路は前記サンプル液収容部材の注入口に着脱可能であり、前記第３管路は前記バッファ液収容部材の注入口に着脱可能である請求項１～４のいずれかに記載の粒子分離装置。
  6. 　前記第１管路の前記第１一方向弁よりも前記シリンジ側の壁部に内外に貫通するように設けられ、前記シリンジ側が陽圧時に閉塞し陰圧時に開放する第２一方向弁を備える外気吸入用の通気口をさらに有する請求項１～５のいずれかに記載の粒子分離装置。
  7. 　標的粒子を含むサンプル液から該標的粒子を分離する粒子分離装置であって、
    排出口を有するチャンバーおよび可動部を備え、該可動部を一定量動かすことにより、該チャンバー内の気体を該排出口から一定量押し出す圧力発生装置と、
    注入口および排出口を有し、前記サンプル液が注入されるサンプル液収容部材と、
    注入口および排出口を有し、バッファ液が注入されるバッファ液収容部材と、
    前記チャンバーの排出口に接続された第１管路、該第１管路から二股に分岐した一方であって前記サンプル液収容部材の注入口に接続される第２管路、および該第１管路から二股に分岐した他方であって前記バッファ液収容部材の注入口に接続される第３管路を備える分岐管と、
    前記第１管路の途中または前記チャンバーの排出口に介装され、前記圧力発生部側が陽圧時に開放し陰圧時に閉塞する逆流防止用の第１一方向弁と、
    前記サンプル液収容部材の排出口に接続されるサンプル液導入口、前記バッファ液収容部材の排出口に接続されるバッファ液導入口、前記圧力発生装置が前記サンプル液収容部の内部および前記バッファ液収容部の内部を昇圧することにより、該サンプル液導入口を介して導入されたサンプル液と該バッファ液導入口を介して導入されたバッファ液とが接しながら並行して流れる複数の微細なピラーが配設されたＤＬＤマイクロ流路構造を備えるＤＬＤ流路部、該ＤＬＤ流路部でサンプル液からバッファ液に移動した標的粒子を含むバッファ液を排出するバッファ液排出口、および該ＤＬＤ流路部で標的粒子がバッファ液に移動した後のサンプル液を排出するサンプル液排出口を備えるＤＬＤマイクロ流路チップと、を有する粒子分離装置。
  8. 　前記サンプル液は、前記標的粒子とサイズの異なる非標的粒子を含む請求項７に記載の粒子分離装置。
  9. 　前記標的粒子は、細胞である請求項７または８に記載の粒子分離装置。
  10. 　前記サンプル液は、血中循環腫瘍細胞を前記標的粒子として含む請求項９に記載の粒子分離装置。
  11. 　前記第２管路は前記サンプル液収容部材の注入口に着脱可能であり、前記第３管路は前記バッファ液収容部材の注入口に着脱可能である請求項７～１０のいずれかに記載の粒子分離装置。
  12. 　前記第１管路の前記第１一方向弁よりも前記圧力発生装置側の壁部または前記チャンバーの壁部に内外に貫通するように設けられ、前記圧力発生装置側が陽圧時に閉塞し陰圧時に開放する第２一方向弁を備える外気吸入用の通気口をさらに有する請求項７～１１のいずれかに記載の粒子分離装置。
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