WO2005049196A1 - 液体を用いたマイクロチップ装置 - Google Patents

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WO2005049196A1
WO2005049196A1 PCT/JP2004/017341 JP2004017341W WO2005049196A1 WO 2005049196 A1 WO2005049196 A1 WO 2005049196A1 JP 2004017341 W JP2004017341 W JP 2004017341W WO 2005049196 A1 WO2005049196 A1 WO 2005049196A1
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mixing
liquid
microchannel
channel
denaturant
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PCT/JP2004/017341
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Tomoyuki Morita
Akiko Miya
Akira Fukuda
Motohiko Nomi
Katsunori Ichiki
Manabu Tsujimura
Shunsuke Shimizu
Original Assignee
Ebara Corporation
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    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • B01L2400/0421—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic electrophoretic flow
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    • B01L2400/08—Regulating or influencing the flow resistance
    • B01L2400/082—Active control of flow resistance, e.g. flow controllers

Definitions

  • the present invention relates to a micro (micro) fluid device and a micro chemical analyzer. More specifically, the present invention relates to a liquid mixing apparatus and a liquid mixing method for efficiently mixing two or more small liquids (hereinafter, also referred to as “reagent solutions”) in a microchannel. In particular, the present invention relates to, for example, a microreactor for efficiently producing a target reaction product by a chemical reaction between liquids mixed in a microchannel.
  • the present invention relates to a chemical analysis system for separating and analyzing an analyte using a concentration gradient of a denaturant of the analyte. More specifically, the present invention provides a denaturant concentration gradient gel electrophoresis method for separating a double-stranded nucleic acid (hereinafter, also simply referred to as "nucleic acid”) by a difference in base sequence using a concentration gradient of a nucleic acid denaturant (DGGE), a method for forming a denaturant concentration gradient therefor, and a microchip electrophoresis apparatus for performing such DGGE in a microchannel.
  • DGGE nucleic acid denaturant
  • the present invention relates to a microchip electrophoresis apparatus or the like that can efficiently mix the buffers in a microchannel and is useful for DGGE.
  • microchip electrophoresis apparatus One example of a chemical analyzer having a microchannel structure is a microchip electrophoresis apparatus.
  • a microchip electrophoresis apparatus the technical background of the present invention will be described using a microchip electrophoresis apparatus as an example.
  • Electrophoresis is often used as a means for separating, purifying, or analyzing biological macromolecules such as nucleic acids and proteins.
  • electrophoresis a potential is applied to a gel or microchannel (capillary) such as agarose or polyacrylamide filled with an electrolyte solution, and the charged particles are moved therein, and the particles are separated based on a difference in the moving speed.
  • a gel or microchannel capillary
  • the charged particles are moved therein, and the particles are separated based on a difference in the moving speed.
  • the molecular weight length of the molecule
  • separation can be performed based on the difference in the molecular weight (length).
  • DGGE Gas migration
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • a sample nucleic acid containing a target microbial community is extracted and separated by DGGE.
  • the sample analyzed by DGGE is an amplification product amplified with a PCR primer capable of amplifying a sequence portion common to multiple microorganisms in the 16S rRNA gene.
  • the base sequence of the 16S rRNA gene is different! ⁇ enables the separation of nucleic acids derived from the main microorganisms constituting the microbial community on a gel.
  • nucleic acids at the same migration distance can be determined to have the same base sequence, so that differences in the composition of the target microbial community can be determined.
  • a 16S rRNA gene of a specific microorganism is electrophoresed in another lane on the same gel in the same manner. By comparing with the position of the nucleic acid band, it can be determined whether or not the microorganism is present in the target microorganism group.
  • the drawback of DGGE is that it takes time for gel preparation and electrophoresis, so it is suitable for high-throughput (high-speed, large-scale processing) analysis! /
  • the size of the gel is about 20cm X about 20cm X about lmm Therefore, a large thermostat is required and the whole equipment becomes large, and the resolution is inferior to microchip electrophoresis.
  • MicroTAS TAS microchemical analyzer
  • microchip electrophoresis which belongs to the field of Microtas, a microfabrication technology is used to bond another substrate to a substrate on which a small channel with a width and depth of about 10 to 100 m has been formed. Use the microchip that has been made.
  • the molecular weight of DNA or RNA Used for measurement. In the measurement of the molecular weight of DNA or RNA, a channel is filled with a polymer matrix solution such as linear polyacrylamide / hydroxymethylcellulose while the surface of the channel is modified by electrochemistry to suppress electroosmotic flow.
  • the electrophoresis in a microchip electrophoresis apparatus is completed in less than 10 minutes, and the analysis time can be reduced. There are advantages such as low consumption of samples and reagents.
  • Ramsey Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-507516; Patent Document 1 proposes a microchip experimental apparatus for analyzing or synthesizing a chemical substance. .
  • This microchip experimental apparatus is characterized in that the potentials of a plurality of reservoirs are simultaneously controlled in order to carry the target substance from one reservoir filled with the target substance to another reservoir.
  • only double-stranded nucleic acids are separated by differences in molecular weight, and double-stranded nucleic acids are not separated by differences in base sequences.
  • Nap Japanese Translation of PCT Application No. 2001-521622; Patent Document 2 proposes a method for analyzing nucleic acids and a method for analyzing the melting point of nucleic acids in a microfluidic device.
  • a mutation in a nucleic acid sequence is detected using a concentration gradient of a chemical denaturant and an oligonucleotide probe.
  • the mutation whose base sequence is already known cannot be detected and the force cannot be detected, and the mutation whose base sequence is unknown cannot be detected.
  • Beck Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-261986; Patent Document 3 proposes a liquid mixing method and a liquid mixing apparatus using electroosmotic flow on a microchip.
  • a liquid mixing method and apparatus on a micro-mouthed chip are provided, and only reference is made to denaturant concentration gradient and separation of double-stranded nucleic acid.
  • Righetti Japanese Patent Publication No. 10-502738; Patent Document 4
  • Patent Document 4 provides a method for detecting a point mutation in a double-stranded nucleic acid fragment using a viscous polymer on a microchip.
  • it utilizes a time-dependent temperature gradient and requires a special computer program for temperature control separately.
  • Baba JP-A-2003-66003; Patent Document 5 discloses that a water-soluble polymer has a concentration gradient.
  • a microchip electrophoresis apparatus is proposed in which a microchannel is filled as an electrophoresis running solution.
  • the concentration gradient of the water-soluble polymer is realized on the microchip, the molecular weight of the nucleic acid can be measured, but the double-stranded nucleic acid cannot be separated due to the difference in the base sequence.
  • the formation of a concentration gradient of the electrophoresis solution involves a complicated operation when the buffer solutions having different concentrations are sequentially filled.
  • the conventional DGGE requires complicated experimental operations, a long analysis time, is not suitable for high-throughput analysis, requires a large-sized apparatus, and has a large capacity. There were drawbacks such as lower resolution than electrophoresis.
  • the microtus including the microchip electrophoresis apparatus proposed so far has the power to measure the molecular weight of nucleic acids, the power that requires a special computer program for temperature control, etc., and the specific base sequence in advance. It requires the design of an oligonucleotide probe for detection, and it is not possible to separate unknown double-stranded nucleic acid fragments due to differences in base sequence.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Publication No. Hei 10-507516
  • Patent Document 2 Japanese Patent Publication No. 2001-521622
  • Patent Document 3 JP-A-8-261986
  • Patent Document 4 Japanese Patent Publication No. Hei 10-502738
  • Patent Document 5 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-66003
  • Patent Document 6 JP-A-2001-120971
  • the problem that liquids are difficult to mix is a general problem not only in the case of microchip electrophoresis but also in the case of mixing a plurality of liquids in a microchannel.
  • the Reynolds number for the flow in the channel decreases significantly.
  • the Reynolds number is less than 100, the flow in the channel becomes a stable laminar flow, and turbulent diffusion between liquids that immediately merge is unlikely to occur. Therefore, the liquid is mixed substantially only by molecular diffusion at the interface, which prevents rapid mixing. The This tendency is remarkable especially when the flow velocity in the channel is low.
  • a further object of the present invention is to simplify experimental operations performed on a micro-scale, shorten analysis and reaction times, and increase throughput, and furthermore, to reduce the size and accuracy of chips (for example, An object of the present invention is to provide a microchip for analysis (for example, a microchip electrophoresis apparatus) and a microreactor to which a series of liquid mixing techniques discovered by the present inventors have been applied in order to enable high resolution.
  • a microchip for analysis for example, a microchip electrophoresis apparatus
  • a microreactor to which a series of liquid mixing techniques discovered by the present inventors have been applied in order to enable high resolution.
  • the conventional DGGE requires complicated experimental operations, a long analysis time, is not suitable for high-throughput analysis, requires a large-sized device, and has a problem in that There are problems such as lower resolution compared to the analysis at the scale.
  • a further object of the present invention is to provide a microchip for performing DGGE on a microchip.
  • An electrophoresis apparatus and an electrophoresis method are provided.
  • a further object of the present invention is to allow a plurality of buffers containing denaturing agents at different concentrations to be rapidly mixed in a microchannel, particularly in the width direction of the channel, and to be useful for DGGE.
  • An object of the present invention is to provide a microchip electrophoresis apparatus and an electrophoresis method capable of forming an agent concentration gradient.
  • a further object of the present invention is to be particularly useful for DGGE by applying a series of techniques for promoting liquid mixing discovered by the inventor to the mixing of buffers on a micro scale.
  • the present invention provides a microchip electrophoresis apparatus and an electrophoresis method. Means for solving the problem
  • the present invention that achieves the above objects (1) and (2) has at least a structure for introducing a liquid. It comprises two liquid introduction microchannels and a mixing microchannel connected by at least two liquid introduction microchannels, and each liquid introduced from each liquid introduction microchannel is used for mixing.
  • the present invention relates to a liquid mixing device that merges in a microchannel, and has a mixing promoting unit that promotes mixing between the liquids that merge in the mixing microchannel.
  • the first embodiment (embodiment 1-1, embodiment 1-2, embodiment 1-3 and embodiment 1) in which the mixing promoting means is a means for increasing the area of the interface between the liquids. -4), and a second embodiment (embodiment 2-1, embodiment 22 and embodiment 2-3) in which the mixing promoting means is a means for destabilizing the interface between the liquids.
  • Embodiment 11 of the present invention has, as a mixing promoting means, a mechanism for controlling the flow rate (flow rate) of each liquid so as to increase the contact interface between the liquids to be merged in the mixing microchannel.
  • the mixing promoting means of the apparatus of embodiment 11 is one or more liquid introducing means capable of controlling the flow rate of the liquid introduced into the liquid introducing microchannel independently of the other liquid introducing microchannels. .
  • the mixing promoting means is preferably a pump capable of controlling the flow rate of the liquid introducing means, a valve provided in the liquid introducing microchannel, and a combination thereof.
  • the liquid introduction means is provided at a first electrode provided at each introduction portion of the liquid introduction microchannel and at a discharge portion of the mixing microchannel.
  • An electroosmotic flow is generated in each liquid introduction microchannel by applying a voltage between the first and second electrodes.
  • One example of the liquid mixing method used in Embodiment 11 is that two or more liquids are introduced through two or more liquid introduction microchannels, and the liquid introduction microchannels merge at a common point.
  • the flow rate of each liquid introduced into the liquid introduction microchannel is controlled by a pump, and the liquid introduction method is provided in the liquid introduction microchannel. And controlling the flow rate of each liquid by controlling the flow rate of each liquid by controlling the flow rate of each liquid.
  • a first electrode provided at each introduction portion of the liquid introduction microchannel and a discharge electrode of the mixing microchannel are provided.
  • the method includes a step of independently controlling the flow rate introduced from each liquid introduction microchannel.
  • Embodiment 12 of the present invention has a high-speed operation valve provided as at least one of a plurality of liquid introduction microchannels as a mixing promoting means.
  • the high-speed operation valve is a valve body driving unit using a piezo element.
  • Another example of the mode 12 is a means capable of controlling the discharge of a small amount of liquid to the mixing microchannel at a high speed by utilizing the volume expansion of the liquid due to local heating of the channel.
  • the high-speed operation valve is means for driving a valve body capable of opening and closing a minute gap in the liquid introduction microchannel.
  • two or more liquid introduction microchannel forces connected to the mixing microchannel also introduce the liquid, and two of the liquid introduction microchannel forces in the mixing microchannel.
  • the flow rate of the introduced liquid fluctuates by driving the high-speed operation valve provided at least one of the plurality of liquid introduction microchannels to open and close at a high speed.
  • the high-speed operation valve is driven to open and close at a high speed so that the flow rate of the liquid introduced is varied at short time intervals, and the mixing micro-fluid is changed. Increasing the area of the contact interface between the liquids by continuously or intermittently changing the ratio (volume ratio) of the liquid occupying the channels in the direction of the channel width.
  • the open / close cycle of the high-speed operation valve is fixed, and the ratio (Duty ratio) of the valve open time in one open / close cycle is determined. Including the step of making it variable.
  • This liquid mixing method includes a step of providing a high-speed operation valve in at least two or more of the plurality of liquid introduction microchannels, and controlling the opening and closing of the plurality of high-speed operation valves in synchronization.
  • Another example of the liquid mixing method includes a step of synchronously opening and closing a plurality of high-speed operating valves so that the total flow rate of the liquid flowing through the mixing microchannel is constant.
  • the liquid mixing devices of Embodiments 1-1 and 1-2 can be applied to a microchip, and are preferably applied to a microchip electrophoresis device further having a sample introduction part capable of introducing an analyte into a mixing microchannel. be able to.
  • the flow rate control mechanism used in the microchip electrophoresis apparatus forms a concentration gradient of a denaturing agent for separating an analyte not only by facilitating mixing.
  • the flow rates of multiple introduced liquids e.g., liquids containing different concentrations of denaturants
  • the flow rates of multiple introduced liquids can be determined.
  • Aspect 13 of the present invention has, as a mixing promoting means, a mixing chamber formed by making the channel height smaller than the channel width in at least a part of the mixing microchannel.
  • a plurality of my-mouth channels for introducing a liquid to be mixed are vertically stacked and joined to be connected to the mixing chamber.
  • a pre-mixing microchannel in which a plurality of introduction microchannels are merged is provided upstream of the mixing chamber.
  • An example of the liquid mixing method used in Embodiments 1-3 is a step of introducing a liquid to be mixed through a plurality of microchannels, merging the introduced liquids, and introducing the mixed liquid into a mixing chamber, Guide the combined liquid to the mixing chamber where the channel height is smaller than the channel width Including the step of entering.
  • Another example of the liquid mixing method used in the embodiment 13 includes a step of merging the liquids introduced into the microchannels so as to be vertically stacked.
  • liquids introduced into the microchannels are merged, then introduced into one premixing microchannel, and then introduced into the mixing chamber. Process.
  • Aspect 14 of the present invention is a junction where a plurality of branch channels branching from each liquid introduction microchannel are gathered and connected as mixing promotion means, and the plurality of branch channels are connected in a three-dimensional space. It has junctions connected to the mixing microchannels in a staggered configuration.
  • One example of the embodiment 14 has a layer structure formed by laminating a plurality of substrates, and has a layer structure in which a plurality of substrates are superimposed in a substantially converging direction or a substantially branching direction of a branch channel.
  • the channel at the junction has a curved shape.
  • An example of a method of manufacturing the device of Embodiment 14 includes a step of manufacturing the channel of the junction using photolithography technology. Another example of the manufacturing method is to process the cross-sectional shape of the channel at the junction into a curved shape.
  • Another example of the embodiment 14 is a liquid mixing apparatus having a group of liquid introduction microchannels having a plurality of liquid introduction ports for introducing a liquid, and a mixing microchannel connected to these channels. And a liquid mixing device in which the plurality of liquid inlets are provided in a geometric arrangement. Examples of such geometries are straight, circular or elliptical.
  • the liquid introducing microchannels in which the channel width of each liquid introducing microchannel is narrower than the mixing microchannel are assembled to form the mixing microchannel. It is formed.
  • Another example of this embodiment is an apparatus for driving at least a part of a liquid by electroosmotic flow, in which a branched drive electrode is detachably provided so as to correspond to a geometric arrangement of a plurality of liquid inlets. It is a device that is performed.
  • at least a portion of the liquid is driven by pump pressure.
  • the device is a device in which a branched hydraulic pressure introduction pipe is detachably installed so as to correspond to the geometric arrangement of a plurality of liquid introduction ports.
  • each of the liquid introduction microchannel groups has a control means capable of independently controlling the pump pressure and the Z or the electroosmotic flow.
  • the control means controls the number of channels through which liquid is sent out of the group of liquid introduction microchannels into which the same liquid is introduced, thereby mixing the same liquid. The total inflow into the microchannel can be changed.
  • the control means can control a control valve of each liquid introduction microchannel into which the same liquid is introduced.
  • a number of pressure pumps or electroosmotic flow drives smaller than the number of channels in the group of channels upstream thereof. A mechanism is provided.
  • control means can control the on / off of the electrode of each liquid introduction microchannel and the power source independently.
  • the electroosmotic flow drive mechanism includes a switch or relay that turns on and off between the power source and the electrode.
  • Embodiment 2-1 of the present invention is a heater for heating the liquid introduction microchannel and Z or the liquid in the mixing microchannel as the mixing promoting means.
  • the mixing promoting means is a heater for heating the liquid in the mixing microchannel from below.
  • Another example of the embodiment 2-1 includes at least one heater for heating at least one of the plurality of liquid introduction microchannels, and the temperature is increased by heating by the plurality of liquid introduction microchannels. They are connected to the mixing microchannels so that they are stacked vertically in descending order.
  • An example of the liquid mixing method used in the embodiment 2-1 is that a plurality of liquids to be mixed are introduced through a plurality of liquid introduction microchannels, and the plurality of liquids are merged to form a mixing liquid.
  • Another example of this liquid mixing method includes a step of vertically stacking a plurality of liquids, joining them, and introducing the liquids into a mixing mouth channel.
  • Another example of the liquid mixing method includes a step of heating the liquid in the mixing microchannel by a heater.
  • Another example of the liquid mixing method includes a step of heating the liquid in the mixing microchannel downward with a heater.
  • the liquid in at least one of the plurality of liquid introduction microchannels is heated by a heater and the plurality of liquid introduction microchannels are heated. And introducing the liquids into the mixing microchannels such that the liquids are stacked from the bottom in the order of increasing temperature and merged.
  • Embodiment 2-2 of the present invention has, as a mixing promoting means, a mechanical fluctuation means for disturbing an interface formed between the liquids joining in the mixing microchannel.
  • the mechanical fluctuation means is a movable lifting surface, a rotor, or an oscillator mounted near the confluence in the mixing microchannel.
  • the mechanical fluctuation means is a vibrator installed on the wall surface of the mixing microchannel.
  • the mechanical fluctuation means is a vibrator installed outside the wall surface of the mixing microchannel.
  • the movable lift surface is a surface that generates a pressure difference between the upper and lower surfaces by operating to form a vorticity rearward, and is preferably a flap having a wing-shaped cross section, or a simple flap. It may be a flat plate surface.
  • the rotor or the oscillator is driven by a magnetic force.
  • An example of the liquid mixing method used in the embodiment 2-2 is that two or more kinds of liquids are merged at a common point through two or more liquid introduction microchannels. This is a step of introducing and mixing into the mixing microchannel, and in the vicinity of the junction of the liquid introduction microchannel (upstream of the mixing microchannel), the contact interface between the converging liquids is mechanically changed. Disturbing by means.
  • the mechanical fluctuation means is a vibrator installed on the outer wall of the mixing microchannel, or a movable lifting surface, a rotor or a swing provided in the mixing microchannel. I am a child.
  • Another example of the liquid mixing method used in the embodiment 2-2 is a step of introducing a converging liquid into a mixing microchannel so as to maintain a contact interface between the liquids, and introducing the liquid. After the completion of the step, a step of stopping the flow and then destabilizing the contact interface between the liquids by the vibrator is included.
  • An example of this liquid mixing method includes a step of setting the contact interface between the liquids to be unstable by a vibrator placed on the wall surface of the mixing microchannel.
  • a vibrator installed outside the wall of the mixing microchannel propagates vibrations to the liquid in the mixing microchannel and destabilizes the contact interface between the liquids. The step of performing
  • Embodiments 2-3 of the present invention have, as a mixing promoting means, a large number of minute structures arranged in a mixing microchannel.
  • the microstructure is a protrusion or groove that is sufficiently smaller than the channel width of the mixing microphone channel.
  • the mixing promoting means shown in Embodiments 11 to 2-3 can be used alone, or can be used in any combination.
  • Examples of preferable combinations include a first embodiment for increasing the contact interface between liquids by controlling the flow rate, and a second embodiment for destroying the contact interface between liquids that have been increased by the flow control. It is a combination with Particularly preferred combinations include a combination of the flow rate independent control of the embodiment 11 and the heater of the embodiment 2-1.
  • At least one of the first aspects in which the area between the liquids can be increased and the second aspect in which the contact interface between the liquids can be unstable.
  • Aspect (Aspect 2-1 or Mixing can be effectively promoted by combining with at least one of the above-mentioned 2-3).
  • the heater of the embodiment 2-1 can be easily combined with other mixing promoting means.
  • a heater below the mixing chamber of Embodiment 13 or below the junction of the branch channel of Embodiment 14 because the liquid interface to be heated increases.
  • a material having a high thermal conductivity may be used for the microstructure of embodiment 2-3, and this may be heated by a heater.
  • mixing facilitating means can be applied together on one microchip if they are applicable on the same microchip.
  • the increase of the contact interface of the combined liquid by the flow rate control of the embodiment 1-1 or 12 and the increase of the contact interface of the combined liquid based on the channel shape of the embodiment 13 or the embodiment 14 may be simultaneously used.
  • multiple mixing facilitators can be installed on a single channel if applicable in series on the same channel.
  • a means other than a heater for example, a method using a vibrator according to embodiment 2-2 may be used.
  • the liquid mixing apparatus and method of the above embodiments 11 to 2-3 can be used for a microchip electrophoresis apparatus.
  • a liquid introduction microchannel for introducing at least one buffer solution containing a different concentration of a modifying agent, a liquid introduction microchannel, and a liquid introduction microchannel.
  • a mixing microchannel for forming a concentration gradient region by mixing the buffer introduced from the channel, a sample introduction part for introducing a sample containing an analyte into the mixing microchannel, and a mixing microchannel.
  • For at least one liquid confluence at least has at least one mixing promoting means shown in the embodiments 1-1 to 2-3.
  • the liquid mixing apparatus and method of embodiments 11 to 2-3 can be applied alone or in any preferred combination to facilitate mixing of buffers containing denaturants at different concentrations. .
  • liquid mixing means or the flow control means of each of the above embodiments can be used in the following embodiment A or embodiment B. Those combinations can be applied in any mode according to the disclosure of the present specification. The disclosure herein is directed to their preferred combinations and preferences. Also, embodiments of the combination are taught.
  • the present invention which achieves the above objects (3), (4) and (5) relates to an apparatus and a method for separating an analyte utilizing a concentration gradient of a denaturant of the analyte.
  • a preferred embodiment of the present invention relates to a device comprising a microchannel for forming a concentration gradient region of a denaturant of an analyte, wherein the analyte introduced into the concentration gradient region is electrophoresed.
  • the separation apparatus and method of the present invention include "Embodiment A" and "Embodiment B" in which the form of the denaturant concentration gradient is different as described below.
  • a typical analyte is a double-stranded nucleic acid. Double-stranded nucleic acids include double-stranded DNA and double-stranded RNA.
  • a denaturant concentration gradient in which the denaturant concentration changes continuously is formed by mixing buffers containing denaturants at different concentrations.
  • At least two liquid introduction microchannels for introducing buffers containing denaturants at different concentrations, and the at least two liquid introduction microchannels are connected.
  • a microchip electrophoresis apparatus comprising a mixing microchannel, wherein each of the liquid introduction microchannel forces has a concentration gradient of a denaturant by mixing respective buffers introduced at a varying rate in the mixing microchannel. This is the device on which the distribution area is formed.
  • the "two buffers containing denaturants at different concentrations" are a denaturant-containing buffer and a denaturant-free buffer (hereinafter, also simply referred to as "buffer"). .
  • One example of the microchip electrophoresis apparatus of the embodiment A preferably has at least one mixing promoting means for promoting the mixing between the buffer solutions that join in the mixing microchannel.
  • the mixing promoting means used in the embodiment A includes the liquid mixing apparatus of the above embodiments 11 to 2-3 and a combination thereof.
  • One example of the mixing promoting means used in the embodiment A is an independent flow rate control which does not require a special device and is cost-effective, for example, the control of the electroosmotic flow of the embodiment 11 or the pump of the embodiment 11 Independent control means.
  • a concentration gradient of a nucleic acid denaturing agent in an electrophoresis buffer is formed.
  • a concentration gradient region channel (mixing microchannel); and a plurality of reservoirs and channels (liquid introduction microchannels) provided upstream of the concentration gradient region channel for supplying buffer to the concentration gradient region channel.
  • a sample introduction unit provided downstream of the concentration gradient region channel for introducing a nucleic acid sample containing a double-stranded nucleic acid into the concentration gradient region channel.
  • each reservoir is filled with a buffer containing a nucleic acid denaturant at different concentrations.
  • the buffer from any reservoir can be concentrated at an appropriate flow rate in the concentration gradient region. It can be supplied into the channel.
  • the supply of the buffer is not limited to the drive by the electroosmotic flow.
  • buffers containing nucleic acid denaturants at different concentrations are merged from the reservoir and the channel of the concentration gradient forming section into the concentration gradient region channel at a varying rate.
  • the nucleic acid denaturing agent concentration gradient can be formed in the concentration gradient region channel by continuously changing the inflow ratio of the buffer having different concentrations introduced into the concentration gradient region channel.
  • a nucleic acid sample can be introduced into this concentration gradient region and subjected to electrophoresis.
  • An example of the device of the embodiment A has a concentration gradient region channel (9), a concentration gradient forming section (2) is provided on the upstream side, and a sample introduction section (3) is provided on the downstream side.
  • An electrophoresis section (4) is provided.
  • the concentration gradient forming section (2) includes a first reservoir (5) filled with a denaturant-containing buffer and a first channel (7) communicating therewith; It includes a second reservoir (6) filled with buffer and a second channel (8) leading to it.
  • the concentration gradient area channel (9) is formed by merging the first channel (7) and the second channel (8).
  • this embodiment includes a first electrode (10) connected to the first reservoir (5), a first power supply (11) connected to the first electrode (10), and a second electrode (10) connected to the second reservoir (6). It further includes a second electrode (12) and a second power supply (13) connected thereto.
  • the electro-osmotic flow generated in each of the buffer containing a denaturing agent and the buffer containing no denaturing agent is controlled.
  • the two liquids can be controlled to mix at varying rates.
  • a denaturing agent concentration gradient region can be formed in the concentration gradient region channel (9) and introduced into the electrophoresis section (4) (each symbol is from Fig. 59 to Fig. 59). 64).
  • a first pump (14) capable of driving the liquid in the first reservoir or the first channel to the concentration gradient forming section, and the second reservoir or the second reservoir. includes a second pump (15) that can drive the liquid in the two channels (see Figures 59-64 for reference numbers).
  • each of the denaturant-containing buffer solution and the buffer solution is controlled by controlling the application of a potential by the first power supply and the second power supply and by controlling each output of the first pump and the second pump. The flow rate can be controlled.
  • the sample introduction section provided in the electrophoresis section has a third reservoir filled with the nucleic acid sample, a fourth channel communicating therewith, and a third reservoir for nucleic acid sample waste liquid. Includes 4 reservoirs and 5th channel leading to it.
  • the fourth channel and the fifth channel intersect and communicate with the concentration gradient area channel, and the third electrode connected to the third reservoir and the third electrode connected to the third reservoir are further connected.
  • a nucleic acid sample can be introduced into the concentration gradient channel by controlling the potentials of the third and fourth power sources and by causing electroosmotic flow and Z or electrophoresis.
  • the supply of the nucleic acid sample is not limited to the driving by the electroosmotic flow.
  • the supply of the nucleic acid sample from the reservoir can be controlled by providing the reservoir and the channel with the pump and the Z or the valve as described in Embodiments 11 and 12.
  • the electrophoresis section (4) includes a fifth waste liquid reservoir provided on the downstream side of the concentration gradient area channel (downstream from the sample introduction section). (24), and a fifth electrode (25) connected to the fifth reservoir (24) and a fifth power supply (26) connected thereto (refer to FIGS. 59 to 64 for reference numerals).
  • the nucleic acid sample introduced from the sample introduction part (3) can be electrophoresed in the concentration gradient region channel (9).
  • An example of the method for separating an analyte used in the embodiment A is that a denaturant-containing buffer solution and a buffer solution are mixed in a channel in a microchip at different ratios to thereby reduce the concentration gradient of the denaturant.
  • This is a method in which a nucleic acid sample containing a double-stranded nucleic acid is formed and introduced into a channel, and the introduced nucleic acid sample is moved by electrophoresis and separated.
  • Another example of the separation method used in the embodiment A has a concentration gradient region channel for forming a concentration gradient of the nucleic acid denaturing agent, and the nucleic acid modifying agent is provided upstream of the concentration gradient region channel.
  • a microchip provided with a plurality of reservoirs and channels for supplying buffer solutions containing different concentrations, and a sample introduction section for introducing a nucleic acid sample containing a double-stranded nucleic acid downstream thereof.
  • the method practiced above comprising applying a potential to each of the buffers in each reservoir and controlling each of the electroosmotic flows generated therein to mix the buffers at varying rates while providing a concentration gradient region channel. And forming a concentration gradient of the nucleic acid denaturing agent in the concentration gradient region channel, and introducing a nucleic acid sample into the concentration gradient region channel and performing electrophoresis.
  • the present applicant has filed an apparatus and a method relating to the above-described embodiment A as Japanese Patent Application No. 2003-392302.
  • the present invention also provides a separation technique that enables easy mass production and highly reproducible analysis without being limited to the conventional method of forming a concentration gradient of DGGE.
  • Embodiment B relates to a separation apparatus and method which do not require mixing buffers containing denaturants at different concentrations.
  • Embodiment B relates to a method for separating an analyte using a concentration gradient of a denaturing agent in which the concentration gradient of the denaturing agent is discontinuous, a method for forming a buffer region array therefor, and a microchip electrophoresis apparatus using the same.
  • Embodiment B includes a step of alternately arranging buffer regions containing denaturants of the analyte at different concentrations in the electrophoresis direction, introducing the analyte into the sequence of the buffer region, and performing electrophoresis.
  • the length (width in the electrophoresis direction) of the buffer region containing the denaturing agent or containing the denaturing agent at a low concentration or in the concentration direction is directed toward the downstream side. Are arranged so that they become smaller gradually.
  • the length of the buffer region containing the denaturant at a high concentration (the width in the electrophoresis direction) in the sequence of the buffer region gradually increases toward the downstream side. Is arranged.
  • an array of buffer regions containing denaturing agents at different concentrations is formed in the microchannel.
  • the first buffer containing the denaturing agent at a predetermined concentration and the second buffer containing the denaturing agent at a different concentration are alternately introduced into the microchannel, whereby the microchannel is introduced into the microchannel.
  • the buffer area containing different concentrations of denaturing agent can be alternately introduced into the microchannel using the means of flow control used in Embodiments 11 and 12 above.
  • the process force for alternately arranging the buffer regions is such that the first buffer is introduced into the first microchannel, and then the second buffer intersecting the first microchannel. Introducing the second buffer into the micro-mouth channel separates the first buffer in the first microchannel at their intersection with the second buffer in the second microchannel And a step of alternately feeding the first buffer solution and the second buffer solution according to the above steps. Through these steps, an alternating arrangement of the first buffer and the second buffer is formed in the first microchannel. In this embodiment, a step of gradually changing the length of the first buffer in the electrophoresis direction by adjusting the feed amount of the first buffer can also be included.
  • An example of an apparatus using the method of Embodiment B is a microchip electrophoresis apparatus, in which a first microchannel for performing electrophoresis and a first buffer solution in the first microchannel are provided. A second buffer solution containing a denaturant at a different concentration from the first buffer solution in the first microchannel, and a double-stranded nucleic acid in the first microchannel. Means for introducing a sample containing the same.
  • Another example of the embodiment B is a method for forming an array of buffer regions containing denaturing agents for double-stranded nucleic acids at different concentrations on a substrate for electrophoresis, wherein the sequence of the buffer regions is The substrate to be formed is held on stage means, and an injection means for injecting a buffer containing denaturant of the double-stranded nucleic acid at different concentrations to the substrate is provided, and the stage means and Z or the injection means are provided.
  • the present invention relates to a method for arranging buffer regions containing denaturants at different concentrations on the substrate by controlling the position and sequentially driving the injection means.
  • a microchip substrate for electrophoresis is held as a substrate, and a denaturing agent is provided in a microchannel of the held microchip substrate. Arrange an array of buffer regions to be included in concentration.
  • a flat plate gel for electrophoresis is held in place of the substrate, and an array of buffer regions containing different concentrations of a denaturant is arranged on the held flat gel.
  • An example of an apparatus for forming a buffer region sequence according to Embodiment B is to form a buffer region sequence containing a denaturant of a double-stranded nucleic acid at a different concentration on a substrate for electrophoresis or on a flat gel.
  • the liquid mixing apparatus and the method according to Embodiments 1-1 to 2-3, wherein the ejection means has a mixing promotion means can be used.
  • the mixing of the buffers containing the denaturant supplied to the injection means at different concentrations is promoted by the appropriate liquid mixing means.
  • the present invention provides a liquid mixing apparatus or method capable of rapidly and uniformly mixing a very small amount of liquid on a microscale.
  • the liquid mixing apparatus or method provided by the present invention can be applied to any existing / developable / z TAS, such as microchemical analyzers and microchemical reactors (microreactors), As a result, it is possible to simplify experimental operations performed on a microscale, shorten analysis time and reaction time, increase throughput, and further reduce the chip size and accuracy (for example, increase resolution). It brings various advantages.
  • the present invention provides an apparatus and method for separating an analyte using a concentration gradient of a denaturant of the analyte, and an apparatus and method for forming a denaturant concentration gradient.
  • the present invention provides a microchip electrophoresis apparatus and an electrophoresis method for performing DGGE on a microchip.
  • This invention is a micro-scale By applying a series of techniques for promoting liquid mixing to the mixing of buffers in a microchannel, a microchip electrophoresis apparatus and an electrophoresis method useful for DGGE are also provided.
  • the concentration gradient of the nucleic acid denaturing agent can be accurately formed, and the formation of the concentration gradient can be freely controlled.
  • rigorous comparisons and examinations between separate data are possible, for example, the structure of a microbial community based on a comparison of nucleic acids (typically a comparison of the base sequences of rRNA genes) in the sample to be analyzed. Analysis provides various advantages, such as making it easier to create a database of collected data.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a known standard microchannel for micromixing.
  • FIG. 2 is a schematic view exemplifying a micro-mixing microphone opening channel in which a mixing micro-channel is elongated in order to obtain a sufficient diffusion distance.
  • FIG. 3 illustrates a microchannel having a liquid dividing groove for promoting mixing.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing the device of aspect 11
  • FIG. 5 is a conceptual diagram showing voltage control according to the present embodiment.
  • FIG. 6 is a schematic view showing a concentration gradient forming device of the present embodiment.
  • FIG. 7 is a conceptual diagram showing pressure control of the present embodiment. (Aspects 1-2)
  • FIG. 8 is a schematic configuration diagram showing a liquid mixing apparatus according to an embodiment 12.
  • FIG. 9 is a perspective view showing a specific configuration of the liquid mixing device of FIG. 8.
  • FIG. 10 is an enlarged perspective view showing a high-speed operation valve of the liquid mixing device of FIG. 8.
  • FIG. 11 is a sectional view showing the high-speed operation valve (when not operating) of FIG. 10.
  • FIG. 12 is a cross-sectional view showing the high-speed operation valve of FIG. 10 (during operation).
  • FIG. 13 is a view for explaining a method of forming a projection used for a high-speed operation valve.
  • FIG. 14 is a view for explaining a step of forming a projection used for a high-speed operation valve.
  • FIG. 15 is a configuration diagram showing another example of the liquid mixing device of the present embodiment.
  • FIG. 16 is a diagram for explaining the effect of mixing according to the present embodiment.
  • FIG. 17 is a configuration diagram showing still another example of the liquid mixing device of the present embodiment.
  • FIG. 18 is a time chart related to control of the liquid mixing apparatus in FIG.
  • FIG. 19 is another time chart related to control of the liquid mixing apparatus in FIG.
  • FIG. 20 is a configuration diagram showing still another example of the liquid mixing device of the present embodiment.
  • FIG. 21 is another time chart relating to the control of the liquid mixing device in FIG. 20.
  • FIG. 22 is a configuration diagram showing still another example of the liquid mixing device of the present embodiment.
  • FIG. 23 is another time chart related to the control of the liquid mixing device in FIG. 22.
  • FIG. 24 is a configuration diagram showing still another example of the liquid mixing device of the present embodiment.
  • FIG. 25 is another time chart related to control of the liquid mixing device in FIG. 24.
  • FIG. 26 is a conceptual diagram showing still another example of the liquid mixing device of the present embodiment.
  • FIG. 27 is a conceptual diagram showing still another example of the liquid mixing apparatus of the present embodiment.
  • Fig. 28 is a view for explaining a problem of the conventional liquid mixing device.
  • FIG. 29 is a view for explaining a problem of the conventional liquid mixing device.
  • FIG. 30 is a view showing an example of a liquid mixing apparatus according to embodiment 1-3.
  • FIG. 31 is a view for explaining a ratio (SZV) of a contact interface area (S) to a channel volume (V) per unit channel length.
  • FIG. 32a Liquid in the mixing chamber when the stacking direction of the introduction microchannel and the height direction of the mixing chamber are perpendicular and the introduction channel and the mixing chamber are directly connected. The state of is shown.
  • FIG. 32b A case where the stacking direction of the introduction microchannels is perpendicular to the height direction of the mixing chamber, and the introduction microchannels and the mixing chamber are connected via the premixing microchannels. 5 shows the state of the liquid in the mixing chamber when the liquid is mixed.
  • Fig. 33 is a diagram showing an example of the liquid mixing device of the present embodiment.
  • FIG. 34a shows the flow of liquid when the premixing microchannel and the mixing chamber are smoothly connected.
  • FIG. 34b shows the flow of liquid when the premixing microchannel and the mixing chamber are smoothly connected.
  • FIG. 36 is a left side view (a) front view (b), right side view (a) and cross-sectional view (d) showing a schematic configuration of the liquid mixing apparatus of modes 1 to 4.
  • FIG. 37 is a diagram showing a layer structure of a liquid mixing apparatus and a bonding step.
  • FIG. 38 is a cross-sectional view showing another layer structure.
  • FIG. 39 is a cross-sectional view showing another configuration of the junction of the liquid mixing device.
  • FIG. 40 is a diagram showing a configuration example of modes 1-4 having a plurality of liquid inlets.
  • FIG. 41 is a diagram showing a configuration example of a branched electrode that can be used in the device of FIG. 40.
  • FIG. 42 is a diagram showing another configuration of the embodiment 14 having a plurality of liquid inlets.
  • FIG. 43 is a view for explaining control means and a method of the liquid mixing apparatus of FIG. 40 or FIG. 42. (Aspect 2-1)
  • Fig. 44 is a diagram showing an example of the liquid mixing device of aspect 2-1.
  • FIG. 45 is a view showing another example of the liquid mixing apparatus of the present embodiment.
  • FIG. 46 is a view showing another example of the liquid mixing apparatus of the present embodiment. (Aspect 2-2)
  • FIG. 47 is a schematic view showing an example of a liquid mixing apparatus according to an embodiment 2-2.
  • FIG. 48 is a schematic view showing another example of the liquid mixing apparatus of the present embodiment.
  • FIG. 49 is a schematic diagram showing still another example of the liquid mixing apparatus of the present embodiment.
  • FIG. 50 is a schematic diagram showing still another example of the liquid mixing apparatus of the present embodiment.
  • FIG. 51 is a schematic view showing a liquid introduction mode in the liquid mixing apparatus of the present embodiment.
  • FIG. 52 is a schematic view showing still another example of the liquid mixing apparatus of the present embodiment.
  • FIG. 53 is a schematic view showing still another example of the liquid mixing apparatus of the present embodiment.
  • Fig. 54 is a schematic configuration diagram showing a liquid mixing apparatus of the present embodiment 2-3.
  • FIG. 55 is a diagram showing an example of a column-shaped microstructure group of the apparatus in FIG. 54.
  • FIG. 56 is a schematic configuration diagram showing the present embodiment having a groove-shaped microstructure group.
  • FIG. 57 is a schematic view showing an example of a groove-shaped microstructure group.
  • FIG. 58 is a schematic view showing another example of the groove-shaped microstructure group.
  • Aspect A A conceptual diagram schematically illustrating an example of a basic configuration of a microchip electrophoresis apparatus of aspect A.
  • FIG. 59c is a conceptual diagram showing yet another example of the basic configuration of aspect A.
  • FIG. 59d is a conceptual diagram showing yet another example of the basic configuration of aspect A.
  • FIG. 60 is a schematic diagram showing a configuration example of a denaturant concentration gradient forming unit for mode A.
  • FIG. 61 is a schematic view showing another example of the denaturant concentration gradient forming unit.
  • FIG. 62 is a schematic view showing an example of a sample introduction part for mode A.
  • FIG. 63 is a schematic view showing an example of an embodiment A.
  • FIG. 64 is a schematic view showing another example of Embodiment A.
  • FIG. 65 is a schematic diagram showing a denaturant concentration gradient forming section of Embodiment A provided with a high-speed valve.
  • FIG. 66 is a schematic view showing another denaturant concentration gradient forming unit provided with a high-speed valve.
  • FIG. 67 is a schematic view showing an example of an embodiment A provided with a high-speed valve.
  • FIG. 68 is a schematic view showing another example of the embodiment A provided with a high-speed valve (Embodiment B).
  • FIG. 69 is a conceptual diagram showing the intermittent denaturant arrangement of the first embodiment according to the embodiment B.
  • FIG. 70 is a conceptual diagram showing an intermittent arrangement of the denaturant in the second mode according to the embodiment B.
  • FIG. 71 is a perspective view showing a schematic configuration of an electrophoresis apparatus including a flat plate gel having intermittent denaturant arrangement.
  • FIG. 72 is a conceptual diagram showing an intermittent arrangement of a denaturant formed in a microchannel.
  • FIG. 73 is a view showing an example of a microchip electrophoresis apparatus according to embodiment B.
  • FIG. 74 is a view showing another example of the microchip electrophoresis apparatus according to embodiment B.
  • FIG. 75 is a view showing another example of the microchip electrophoresis apparatus according to embodiment B.
  • FIG. 76 is a configuration diagram of each substrate constituting the device of FIG. 75.
  • FIG. 77 is a view showing another example of the microchip electrophoresis apparatus according to embodiment B.
  • FIG. 78 is a perspective view showing a schematic configuration of an apparatus for forming a buffer region array for mode B.
  • FIG. 79 is a perspective view showing a schematic configuration of an apparatus suitable for forming a buffer solution region array on a slab gel.
  • FIG. 80 is a conceptual diagram showing an example of a method of forming a buffer region array for mode B.
  • FIG. 82 is a view for explaining the principle of mode B.
  • FIG. 83 schematically shows an apparatus provided with a high-speed operation valve for forming a buffer region array.
  • FIG. 84 schematically shows an example of an injection means for forming a buffer solution region array.
  • microchannel for liquid introduction 131
  • microchannel for mixing 132
  • high-speed actuated valve
  • microchannel for liquid introduction 330a
  • liquid inlet 331
  • microchannel for mixing X
  • branching direction Y
  • microstructure group includes
  • nucleic acid analysis channel microchannel
  • nucleic acid sample introduction channel 903
  • microchip substrate 905
  • detection unit 906
  • denaturant-containing buffer introduction channel 910
  • substrate 911; stage means, 912; Injection means, 914; slab gel.
  • the liquid mixing apparatus of the present invention comprises at least two liquid introduction microchannels for introducing a liquid, and at least two liquid introduction microchannels connected to each other, and a mixing microchannel.
  • a liquid mixing apparatus in which the liquids, which have also been introduced with the liquid introduction microchannel force, merge in the mixing microchannel.
  • mixing promoting means for promoting mixing between the liquids that merge in the mixing microchannel.
  • the mixing promoting means is a means for increasing the area of the interface between the liquids to be mixed.
  • the liquid mixing device of the first embodiment include embodiments 11, 1-2, 1-3 and 14 shown below.
  • the mixing promoting means is means for destabilizing the interface between the liquids to be mixed by thermal, mechanical, Z or structural means.
  • the liquid mixing device according to the second embodiment include embodiments 2-1 2-2 and 2-3 shown below.
  • the mixing promoting means of the apparatus of this embodiment is at least one liquid introducing means capable of controlling the flow rate of the liquid introduced into the liquid introducing microchannel independently of the other liquid introducing microchannels.
  • FIG. 4 shows the device of this embodiment.
  • the device comprises a first reservoir 5 filled with a first reagent solution, a second reservoir 6 filled with a second reagent solution, and a first channel (liquid) leading to the first reservoir 5.
  • Microchannel for introduction 7 the second channel (microchannel for liquid introduction) 8 leading to the second reservoir 6, and the third channel (mixing channel) where the first channel 7 and the second channel 8 are connected.
  • Microchannel 9 and a third reservoir 10 a first reservoir 5 includes a first electrode 11, and a second reservoir 6 includes a second electrode 12.
  • the third reservoir 10 includes a third electrode 13.
  • the first reagent solution and the second reagent solution can be quickly mixed on the third channel 9 at an arbitrary ratio by appropriately varying the voltage VI and the voltage V2. Furthermore, by continuously changing the voltage VI and the voltage V2 as shown by the broken line and the dashed line in FIG. 5 (a), the flow ratio of the first reagent solution to the second reagent solution can be changed continuously. Can be.
  • the fluctuation component is superimposed on the voltage signal as shown by the broken line and the dashed line in FIG. 5 (b)
  • the first and second reagent solutions are sufficiently mixed, and the concentration gradient region of the reagent solution is formed in the third channel 9. It can be formed quickly.
  • the fluctuation component a sine wave, a sawtooth wave, a rectangular wave, and the like, and a combination thereof can be considered. It is also conceivable to shift the phase of the fluctuation component of each channel to promote diffusion and maintain the flow rate.
  • FIG. 6 shows an example of the present embodiment.
  • the first reservoir 5 includes a first electrode 11
  • the second reservoir 6 includes a second electrode 12
  • the third The reservoir 10 includes a third electrode 13.
  • a first pump 14 and a second pump 15 are added to the first reservoir 5 and the second reservoir 6, respectively.
  • the liquid feeding by the electroosmotic flow in Fig. 4 can be assisted, and when the viscosity of the reagent solution is high, the liquid can be sent at a relatively high speed. it can.
  • the solid line in FIG. 7 (b) if an appropriate fluctuation component is given to the liquid sending pressures of the first pump 14 and the second pump 15, the interface formed by the two liquids becomes unstable, Since the area of the interface where the two liquids come into contact is increased or the interface structure can be collapsed, Fast and uniform mixing. Therefore, by appropriately changing the liquid sending pressure of the first pump 14 and the second pump 15, the first reagent solution and the second reagent solution can be quickly supplied at an arbitrary ratio on the third channel 9.
  • the mixing promoting means of the device of the present embodiment is a high-speed operation valve provided in at least one liquid introduction microchannel.
  • FIG. 8 shows a schematic configuration of a channel of the microchip device of the present embodiment
  • FIG. 9 shows a specific configuration of the microchip of the present embodiment.
  • the microchannel of this microchip is composed of two liquid introduction microchannels 130a and 130b and one mixing microchannel 31 where they join.
  • one of the microchannels for liquid introduction is provided with a high-speed operation valve 132.
  • FIG. 9 shows the configuration of the entire microchip.
  • FIG. 10 shows an enlarged view of the high-speed operation valve mechanism
  • FIG. 11 shows a cross section of the high-speed operation valve.
  • each reservoir force of the liquid introduction microchannel is also increased by the syringe pump P when the liquid A and the liquid B are introduced into the liquid introduction microchannels 130a and 130b, respectively. Merge on channel 131.
  • a high-speed operation valve 132 driven by a piezo element is provided in the middle of the liquid introduction microchannel 130a for introducing the liquid A.
  • By opening and closing the high-speed operation valve the introduction of the liquid A from the liquid introduction microchannel 130a to the mixing microchannel 131 is controlled.
  • 132 high-speed operated valves By the control, the inflow amount of the liquid A is varied, and the mixing ratio of the liquid A and the liquid B of the liquid supplied into the mixing microchannel 131 can be controlled.
  • the high-speed operation valve includes a part of the liquid introduction microchannel 130a as shown in Fig. 11 (axial section of the liquid introduction microchannel 30a) and Fig. 12.
  • the part is a valve element 133 made of PDMS (polydimethylsiloxane) film with a thickness of 20 ⁇ m and a width of about 300 ⁇ m.
  • a projection 134 is provided near the valve body in the same channel, and an indenter 135 with a diameter of about 250 ⁇ m is provided to abut against the valve body 133 from the outside.This indenter 135 is driven by a piezo element. ing.
  • the space between the valve element 133 and the projection 134 has a minute gap h of about 10 m.
  • the fine gap h is opened and closed by directly driving the valve element 133 up and down at a high speed by a piezo element operating at a response frequency of 10 kHz or more.
  • Advantageous functions of the high-speed operation valve used in the present embodiment include a high-speed valve opening / closing operation and an operation volume at the time of opening / closing (when the valve element of the valve moves to close the channel). (Corresponding to the volume that can be displaced by the liquid in the channel).
  • the protrusion in the channel is formed in a semi-cylindrical shape or the like so that the valve body comes into contact with the protrusion in a form close to linear contact, and the stroke (h) for the valve body to move up and down is also about 10 m. U, which is preferable to be minute.
  • valve used in an ink jet printer For example, by locally heating the liquid introduction microchannel with heat, the liquid flowing in the liquid introduction channel is vaporized and the volume is expanded, and the liquid introduction channel capillaries are thereby expanded.
  • a valve that can control the discharge of a constant minute flow rate to the mixing microchannel at a high speed may be used.
  • the channel width of the liquid introduction microchannel is, for example, 100 m, and a line pattern having a channel width of 100 m is provided so as to be orthogonal to the portion where the semi-cylindrical projection is formed.
  • Fig. 14 A-A section in Fig.
  • the bridge pattern is To deform into a cylindrical projection, put the resist-patterned glass substrate into a thermostat and heat it at 300 ° C for 20 minutes. This causes the resist to soften above 250 ° C, causing the edge to be rounded and deformed by surface tension, eventually resulting in a semi-cylindrical shape.
  • the substrate is subjected to dry etching. When the glass substrate is etched, the resist is also etched together, so that the resist shape can be directly transferred to the glass substrate.
  • a neutral beam force is preferred in order to obtain good transferability of the force and shape which can be performed even by using RIE (Reactive Ion Etching). In this way, an appropriate projection structure can be formed in the liquid introduction microchannel.
  • the "high-speed opening / closing operation" of the high-speed operation valve used in the present embodiment means an operation having a cycle of about 10 Hz or more, preferably 10 to 20 kHz, as the response frequency of the valve element.
  • the high-speed operation valve installed on the microchannel for introducing the liquid A is opened and closed at a constant cycle and at a high speed.
  • the contact interface between the liquid A and the liquid B formed in the mixing microphone channel is drawn in the mixing microchannel 31 in Fig. 15. It has a "wave" shape that looks like a broken.
  • Liquid A which is introduced through the high-speed valve, accounts for a short proportion of the mixing microchannel in the width direction! ⁇ ⁇ It can be changed continuously over time. Therefore, the contact area of the liquid A with the other liquid B that merges with the mixing microchannel increases. In this way, the contact interface between the two liquids is widened, and diffusion mixing of the two liquids is facilitated.
  • the diffusion distance ⁇ is 77 [m]. This indicates that mixing can be completed in 5 minutes if the interval between the folds is 50 ⁇ m. This time is short enough to perform DGGE analysis.
  • FIG. 17 The mixing efficiency of the apparatus of FIG. 17 can be further improved as compared with the mixing apparatus of FIG.
  • fast-acting valves (valve A and valve B) are installed in each of two liquid introduction microchannels for two liquids A and B.
  • FIGS. 18 and 19 show examples of operation time charts of the high-speed operation valve suitable for this embodiment.
  • valve A and the valve B are synchronized, and when the valve A is “open”, the valve B is closed and the valve B is closed.
  • valve B when valve A is “closed”, valve B is "opened", so that the width of the fold formed by solution A in the mixing microchannel can be extended to the entire width of the channel.
  • the sum of the flow rates of both solution A and solution B is always constant, the liquid flows in the mixing microchannel at a constant flow rate. Control characteristics are obtained.
  • a method for forming a concentration gradient using the embodiment 12 will be described later.
  • the surface area of the two-liquid interface is twice as large as that of FIG. 14, that is, eight times that of the case where no folds are formed (FIG. 28).
  • the valve opening may be variably controlled by using a piezo element that can be controlled only by full-closing or full-opening control, and by adjusting the potential applied to the piezo element.
  • the operation may be performed according to an operation time chart as shown in FIG. In any case, the operation time chart is not limited to the above-described method, and the opening and closing of the valve can be controlled by other various methods.
  • the mixing efficiency can be further improved.
  • three liquid introduction microchannels 130a, 130b, and 130c are connected to the mixing microchannel 131.
  • Solution A is introduced from the liquid introduction microchannel 130a at the center to the mixing microphone channel 131
  • solution B is introduced from the two liquid introduction microchannels 130b and 130c located on both sides of the mixture.
  • High-speed operation valves (valve 1 and valve 2) are installed on these two liquid introduction microchannels 130b and 130c, respectively. These can be opened and closed, for example, as shown in the operation time chart of FIG. 21, whereby a pleated interface as depicted in the mixing microchannel 131 of FIG. 20 can be formed.
  • the contact interface (total surface area of the fold) of the two liquids is twice that of FIG. 15, that is, 16 times that of the case where no folds are formed (FIG. 28). Efficient liquid mixing can be realized.
  • the two liquid mixture of liquid A and liquid B is shown, but if one of the two liquid introduction microchannels 130b and 130c for supplying liquid B is used for liquid C, the mixing microchannel At 131, the three liquids A, B and C can be suitably mixed.
  • a solution containing different concentrations of solutes for example, a nucleic acid denaturant
  • the body can be used.
  • the device described above It is possible by changing the driving method of the opening and closing operation of the lube.
  • One example of a mixing method for forming a concentration gradient is to make the opening / closing cycle of a high-speed operation valve constant and variably control the ratio (Duty ratio) of the time that the valve is open and closed during one cycle. .
  • the pleated shape of the interface between the two liquids having different concentrations is formed while the size thereof is gradually changed. (As depicted in the mixing microchannel of FIG. 22). After that, if the mixture is left for about 5 minutes, a corner between the two liquids and strong diffusion mixing occur through the interface, and a mixed liquid having a certain concentration gradient can be formed in the mixing microchannel 31.
  • valve B is "closed” when valve A is “open”, and valve B is "open” when valve A is “closed.”
  • Set msec milliseconds
  • open valve A for 90 msec
  • open valve A for 80 msec.
  • the valve A is opened for 70 msec. If the opening time of the valve A in one cycle is gradually shortened in this way, the concentration in the mixing microchannel is reduced in the downstream direction ( (From the left side of the drawing to the right side), a concentration gradient that becomes gradually linear in the first order is obtained.
  • T1 is preferably a high-speed operating valve. For example, if the response frequency of the valve is 1 kHz, set T1 to 5 msec, which is several times the minimum operation time of 1 msec, as shown in Figure 22. If a concentration gradient is formed, T2 should be set gradually longer, and the interface between solution A and solution B will increase compared to the case of Fig. 22, so that diffusion mixing will proceed at higher speed. The mixing is completed in a short time.
  • the mixing promoting means of the apparatus of the present embodiment relates to the shape of the mixing microchannel, and is a mixing chamber formed by making the channel height of the mixing microchannel smaller than its channel width.
  • two liquid introduction microchannels 207 and 208 for introducing a liquid to be mixed, and two liquid introduction microchannels are vertically stacked and merged.
  • a mixing chamber 230 connected to another premixing microchannel 234 and a premixing microphone channel.
  • the premixing microchannel 234 and the mixing chamber 230 constitute a mixing microchannel.
  • the liquid to be mixed is introduced from the liquid introduction microchannels 207 and 208, and the liquids to be mixed are vertically stacked and merged and connected to the liquid introduction microchannel.
  • the liquid that has been introduced into the premixing microchannel 234 and merged is introduced into the mixing chamber 230 connected to the premixing microchannel.
  • the liquid that has passed through the narrow channels of the liquid introduction microchannel and the premixing microchannel is introduced into the flat mixing chamber 230, so that the interface area between the liquids increases. This facilitates the mixing of the multiple liquids.
  • reservoirs 205, 206 can be connected upstream of the liquid introduction microchannels 207, 208.
  • two kinds of liquids are supplied to the reservoirs 205, 206.
  • the supply of the liquid can be performed by any known method, for example, by a mechanical or electric driving force. Specifically, it can be performed by adjusting the flow rate by a liquid sending pump-valve.
  • the flow rate of each liquid is controlled by controlling the electroosmotic flow by adjusting the applied voltage or applied potential between the reservoirs, and by controlling the liquid sending pump by adjusting the pressure of the liquid sent by a micro syringe or the like. Can be adjusted.
  • the liquids to be mixed are two types of forces.
  • the body may be of more than one type.
  • the number of liquid introduction microchannels is two, but the number is not limited thereto, and the number of liquid introduction microchannels may be two or more.
  • the channel height means a channel dimension in a direction perpendicular to a liquid contact interface formed by contacting a plurality of liquids, and the channel width is parallel to the liquid contact interface. Means the channel dimension in the direction perpendicular to the direction of flow.
  • the channel width is 500 ⁇ m
  • the channel height is 100 / zm
  • the channel width is 10 mm (at the maximum)
  • the channel height is Can be designed to be 5 m.
  • the flow of the liquid in the liquid introduction microchannel and the premixing microchannel is substantially laminar. This is because the width of the microchannel for liquid introduction and the microchannel for premixing is narrow. This tendency is more remarkable when the flow rate of the liquid flowing through the liquid introduction microchannel is small.
  • the premix microphone channel the force that causes mixing only at the interface between the liquids The mixing area between the liquids is unlikely to occur because the area of the interface between the liquids is small.
  • the interface area between the liquids increases in the mixing chamber, so that the liquid to be mixed is mixed sufficiently quickly by diffusion mixing at the interface. Is done.
  • the liquid introduction microchannel may be directly connected to the mixing chamber, or a premixing microchannel may be provided upstream of the mixing chamber as shown in FIG.
  • a premixing microchannel upstream of the mixing chamber as shown in FIG. This is because, if two microchannels for premixing are connected directly to the mixing chamber from two microchannels for liquid introduction, the channel width will expand rapidly and the flow will be disturbed.
  • the premixing chamber is provided upstream of the mixing chamber as in this embodiment, the flow of the inflowing liquid is not turbulent.
  • the ease of mixing of liquids in the premixing microchannel and the mixing chamber will be examined.
  • the ease of mixing of the liquid is determined by the unit channel. It depends on the ratio (sZv) between the channel volume per unit length (V) and the contact interface area (s).
  • This ratio (SZV) can be expressed as 1ZH according to the channel height (H) (see Fig. 31, L; channel length, W; channel width, H; channel height), It can be seen that the ease of mixing depends only on the channel height (H).
  • the channel volume (the ratio of the V) and the contact interface area (S) (SZV) is 1/50 in microchannel premixing ( ⁇ m "1), 1/2 . 5 ( ⁇ m in the mixing chamber becomes" 1). Therefore, the mixing chamber is about 20 times easier to mix than the premix mic channel!
  • the microchannels for liquid introduction are merged in the height direction of the channels. This is because by merging in the height direction of the channels, the interface between the liquids in the mixing chamber becomes sufficiently large, and the mixing between the liquids is performed quickly. Conversely, when they merge in the channel width direction (Fig. 32), the interfacial area between the liquids becomes smaller than the channel volume, making it difficult to mix the liquids quickly.
  • the liquid introduction microchannels are vertically stacked and merged to be connected to the premixing microchannels and the mixing chamber.
  • the diffusion distance ⁇ after 5 seconds is 10 m.
  • the channel height is 20 m or less, mixing can be completed theoretically in 5 seconds.
  • the diffusion since the diffusion proceeds from both the upper and lower liquids, if the channel height of the mixing chamber is L, the diffusion is considered to be almost complete if the diffusion proceeds to LZ2, which is half of that. Good. If you want to complete the mixing in 5 seconds, you can actually design the channel height to 10 ⁇ m.
  • the liquid mixing apparatus of this embodiment can be regarded as a liquid mixing apparatus suitable for the microchip DGGE.
  • the mixing time can be reduced by reducing the channel height. Power that can be understood
  • the channel width is as small as the channel height, the flow rate that can be flowed becomes small, and the industrial application becomes practical. Not a target. Therefore, it is preferable to make the channel width longer than the channel height in order to feed the solution at high speed and to shorten the mixing time.
  • FIG. 33 shows another embodiment.
  • the apparatus of this embodiment includes two liquid introduction microchannels 207 and 208 for introducing a liquid to be mixed, one premixing microchannel 234 in which the two channels are vertically stacked and joined, It includes a connection part 235 connecting the mixing microchannel and the mixing chamber, and a mixing chamber 230 connected to the connection part.
  • the premixing microchannel and the mixing chamber are connected by a junction 235 having a gentle gradient.
  • the premixing microchannel and the mixing chamber are smoothly connected. This is because if the premixing microchannel and the mixing chamber are smoothly connected, the stagnation occurs at the junction of the premixing microchannel and the mixing chamber. Since no area is generated and the liquid does not swirl in the middle of the channel, the interface between the liquids is not disturbed, and the liquids can be mixed and taken out of the mixing chamber in the flowing order. ( Figure 34a). On the other hand, if the connecting portion is not gradually made to have a widened shape, a stagnation region is generated, and a vortex is generated there.
  • the channel width of the premixing microchannel 234 is 500 ⁇ m
  • the channel height is 100 ⁇ m
  • the length of the connection portion 235 in the channel flow direction is 15 mm.
  • the mixing chamber 230 can be designed to have a channel width of 10 mm and a channel height of 5 ⁇ m.
  • FIG. 35 shows another embodiment.
  • the apparatus of this embodiment includes two liquid introduction microchannels 207 and 208 for introducing a liquid to be mixed, and one mixing microchannel (mixing chamber 230) where the liquid introduction microchannels merge.
  • the force mixing chamber 230 in which the liquids to be mixed are joined via the liquid introduction microchannels 207 and 208 is designed so that the interface area between the liquids after the joining is increased.
  • the channel height of the mixing chamber can be designed to be 20 ⁇ m, and the channel width can be designed to be 100 m.
  • the apparatus of this embodiment can be processed by dry etching of glass, which does not need to be manufactured by bonding two substrates. More specifically, the etching can be performed by performing ICP etching using a Ni sputtering film as a pattern mask.
  • Pattern 1 4 (Fig. 36—Fig. 43)
  • the mixing promoting means of the apparatus relates to the shape of the junction where the liquid introduction microchannel is connected to the mixing microphone channel, the arrangement of the liquid introduction microchannel, and the like.
  • the mixing promoting means is such that the liquid introduction microchannel has a plurality of branch channels, and the branch from the branch channel to the mixing microchannel. And is a junction where the plurality of branch channels are connected to the mixing microchannel in a state of being alternately arranged in a three-dimensional space.
  • the channels are subdivided for each liquid to be mixed, and the liquids are nested and merged so that various types of liquids are arranged in a layer while flowing through the channels, whereby the liquids are brought into contact with each other.
  • a plurality of inlets can be provided according to the number of branch channels without taking a structure for branching.
  • the mixing microchannel can be formed in one layer of the two-dimensional chip.
  • the mechanism and method for introducing the liquid upstream of the chip or at a preliminary stage become complicated.
  • the present embodiment relates to a liquid mixing device that solves the above problem. Further, in this embodiment, a liquid mixing apparatus having a liquid introduction microchannel having a plurality of inlets is used to quickly mix the reagent solution in the microchannel and to improve the concentration gradient in the flow direction. To provide a controllable device.
  • FIG. 36 shows a schematic configuration of the device of the present embodiment in side (a) and (c), front (b), and cross-sectional (d) views.
  • This device is a microchip having two liquid introduction microchannels 330 for introducing a liquid and a mixing microchannel 331 connected to them.
  • the liquid enters through two liquid introduction microchannels 330 (left side in FIG. 36), merges inside, and is mixed by one mixing microchannel 331.
  • Each of the liquid introduction micro-channels 330 has two comb-shaped branch channels 330a, and these two branch channels are connected to the upper and lower mixing micro-channels 331 (this connection direction). Is referred to as a merging direction Y).
  • the branch direction X of the branch channel 330a has a comb shape substantially perpendicular to the merge direction Y, as shown in the cross section DD and the cross section EE in FIG.
  • These branch channels 330a are integrated so as to be mutually meshed in three dimensions, and merge into one mixing microchannel. Liquids that merge via the confluent portion of this form can quickly and evenly mix within the microchannel.
  • FIG. 37 shows a schematic configuration of the apparatus in FIG. 36 in a perspective view or the like.
  • This device can be manufactured by bonding substrates on which predetermined channels and the like are formed.
  • the intermediate substrate has a structure in which two substrates are bonded to each other.
  • the liquid introduction microchannels 330, their branch channels 330a, and the mixing microchannels 331 are each formed on one substrate, and the mixing microchannels 331 are formed (Fig. 36 ( d) Cross section of BB).
  • two substrates ones with cross sections AA and CC in Fig. 36 (d)
  • a substrate serving as a lid is laminated.
  • a layer structure is formed that is superimposed in the merging direction Y, that is, in a direction substantially perpendicular to the branching direction X.
  • the plurality of branch channels 330a are provided on one liquid introduction microchannel substantially on the same plane. It can be said that the branch channel 330a that merges in this way has a comb-like structure.
  • FIG. 38 a channel structure similar to that of the device in FIG. 36 is attached in the branching direction X (that is, a direction substantially perpendicular to the merging direction Y).
  • a layer structure in which a substrate is provided for each branched channel is formed.
  • FIG. 39 illustrates a configuration in which a curved shape is applied to the cross-sections FF and GG of FIG. 36 and the junction structure of FIG. 38.
  • the channel of the junction may be configured in a curved manner. In this way, it is possible to manufacture a liquid mixing device with reduced pressure loss at the junction.
  • a force such as glass, quartz, plastic, or silicon resin can also be appropriately selected.
  • the above-described superposition of a plurality of layers and the multi-stage structure on the front and back sides can be manufactured by lithography and etching.
  • the device of this embodiment can also be manufactured by photolithography technology, and the pressure loss may be reduced more favorably by processing the cross-sectional shape of each channel of the merging portion into a curve (roughly streamlined).
  • This embodiment relates to an apparatus having a liquid introduction microchannel having a plurality of inlets.
  • liquid introduction microchannels 330 having a plurality of liquid introduction ports 330a for introducing a reagent solution are assembled and connected to the mixing microchannel 331.
  • the width formed by the grouping of the liquid introduction microchannels 330 is the same as the channel width of the mixing microchannels 331.
  • a group of the plurality of liquid inlets 330a is used for the same liquid (a buffer solution or a reagent solution of the same concentration, such as the first reagent solution or the second reagent solution in FIG. 40).
  • the microchannel group for liquid introduction to channel 330 are provided in a regular geometric arrangement on the substrate.
  • each geometrical arrangement for each liquid inlet 330a is similar to each other.
  • FIG. 41 schematically shows a configuration of a branch electrode corresponding to a linear geometric arrangement.
  • the reagent solution can be efficiently driven from a certain group of liquid introduction ports.
  • one branch electrode may be used for a plurality of liquid inlets 330a for introducing the same reagent solution, and liquid may be sent from a plurality of liquid inlets 330a simultaneously. It comes out.
  • a branched hydraulic pressure introduction pipe corresponding to the geometrical arrangement of the liquid introduction port group is installed, and The pressure can be simultaneously and equally applied to the liquid introduction ports, and the efficient introduction of the reagent solution can also be performed.
  • the mixing device of this embodiment is applied to a microchip, the microchip device can be made thinner.
  • branched drive electrodes corresponding to the positions of the plurality of liquid inlets 330a can be provided on substantially the same plane as the liquid inlet.
  • a pump or an electroosmotic flow driving mechanism can be provided upstream of the group of liquid introduction microchannels. In this case, even if the number of pumps or electroosmotic flow driving mechanisms used is smaller than the number of liquid introduction microchannels for introducing the same kind of liquid, liquid introduction can be properly controlled.
  • FIG. 43 shows an example of control means for driving the electroosmotic flow.
  • the same reagent solution is fed from each liquid introduction microphone channel 330 toward the mixing microchannel 331 by electroosmotic flow.
  • the reagent solution is fed downstream, and joins and mixes with another reagent solution in a layered manner.
  • the power supply potential difference B-C is given by the switch. In these channels, by setting an appropriate potential B, the reagent solution can be prevented from flowing downstream and not flowing backward.
  • the total inflow amount of the same reagent solution into the mixing microchannel 331 is reduced. Can be varied over time and independently.
  • the switch groups provided for each group of liquid introduction microchannels for sending the same reagent solution that is, for each reagent solution
  • the inflow of each reagent solution can be controlled in multiple steps with a small number of power supplies.
  • the concentration of the reagent solution in the mixing microchannel can be controlled. Especially if the total inflow is controlled over time, The concentration distribution of the reagent solution formed in the flow direction after mixing can be accurately controlled.
  • a relay may be used for the plurality of switches, or a pressure pump may be provided in place of or in addition to the electrodes to control the pressure drive for each reagent solution.
  • a control valve may be provided in each liquid introduction microchannel, and the flow rate of each reagent solution may be changed by controlling the drive of the control valve.
  • the mixing promoting means of the apparatus of this embodiment comprises a liquid introduction microchannel and a heater installed in the Z or mixing microchannel.
  • FIG. 44 shows an apparatus of this embodiment.
  • the apparatus of this embodiment includes a liquid introduction microchannel 431, 432 for introducing a liquid to be mixed, a single mixing microchannel 433 in which a plurality of channels are joined at a junction 430, and a mixing microchannel 433.
  • a heater 435 for heating the liquid in the channel.
  • the liquid to be mixed is introduced from the liquid introduction microchannels 431 and 432, the liquids to be mixed are merged at the junction 430, and the merged liquid is connected to the junction 430.
  • the liquid in the mixing microchannel is heated by the heater 435 (for example, a chrome steel heater and a Peltier element), and the liquid in the mixing microchannel is mixed.
  • the liquid force in the mixing microchannel is heated by the S heater 435, the temperature of the liquid in the mixing microphone channel rises, and the Brownian motion of the solute in the liquid is activated. Therefore, molecular diffusion is promoted, and a plurality of liquids can be rapidly and vigorously mixed. Further, the mixing of the combined liquids is also promoted by heat convection caused by heating.
  • Supply of the liquid can be performed by any known method, for example, by a mechanical or electrical driving force. Specifically, it can be changed by adjusting the flow rate with a liquid sending pump or a valve. For example, the flow rate of each liquid is adjusted by controlling the electroosmotic flow by adjusting the applied voltage or applied potential between the reservoirs, or by controlling the liquid sending pump by adjusting the pressure of the liquid sent by a micro syringe or the like. Can be.
  • the liquids to be mixed are two types of force.
  • the liquid may be of two or more types.
  • the number of the liquid introduction microchannels in the present embodiment is two, the number is not limited thereto, and two or more microchannels can be used.
  • FIG. 45 shows another embodiment.
  • the apparatus of this embodiment includes a liquid introduction microchannel 441, 442, one mixing microchannel 443 in which the liquid introduction microchannels 441, 442 are joined at the junction 40, and a mixing microchannel 443. And a heater 445 mounted below the microchannel 443 for heating.
  • the liquids to be mixed are stacked vertically in the merging section 440 and merged, and the merged liquid is introduced into the mixing microchannel 443 connected to the merging section 440, and The solution in the mixing microchannel 443 is heated by the heater 445 attached below.
  • mixing of the liquid in the mixing microchannel is promoted.
  • the liquid is heated by the combined liquid power heater 445, the temperature of the liquid below the mixing microchannel rises, and thermal convection occurs in the channel 443, so that the diffusion effect due to the convection in the vertical direction is reduced. Promoted and promotes mixing of the combined liquids. In addition, the increase in molecular diffusion due to heating also promotes mixing of the combined liquids.
  • FIG. 46 illustrates yet another embodiment.
  • the apparatus of this embodiment includes a liquid introduction microchannel 451, 452, a liquid introduction microchannel 451, 452 joined at a junction 450, one mixing microchannel 453, and a liquid introduction microchannel 453. And a heater 455 for heating the heater.
  • the solution in the liquid introduction microphone opening channel 452 is heated by the heater unit 455, and the liquid in the channel 451 and the liquid in the heated channel 452 are joined together.
  • the liquid in the channel 452, which has been heated and has a high temperature is placed downward and the lower forces are sequentially stacked and merged, and the merged liquid is introduced into the mixing microchannel 453 connected to the merger 450. It is.
  • the liquids in the liquid introduction microchannel are merged in the vertical direction in the order of high-temperature liquid force.
  • the heater that can be used in this embodiment can be selected from all known heating devices. For example, a chrome steel heater or a Peltier element can be used.
  • the heater may be installed at any position as long as the liquid in the channel can be heated. For example, it can be installed on the channel wall. Also, the number of heaters to be installed may be more than one and may be more than one.
  • the mixing promoting means of the apparatus of this embodiment is mechanical fluctuation means for disturbing the interface between the liquids joining in the mixing microchannel.
  • the first type of mechanical fluctuation means is a vibrator, a movable lift surface, a rotor or a rocker installed near a junction in the mixing microchannel.
  • the second type of mechanical fluctuation means is a vibrator installed not only near the confluence in the mixing microchannel but also on the wall or outside the wall of the mixing microchannel downstream therefrom.
  • FIGS. 47-50 illustrate one embodiment having a first type of mechanical variation means.
  • a vibrator 510 is provided at the junction.
  • the device comprises a first reservoir 505 filled with a first liquid, a second reservoir 506 filled with a second liquid, and a first channel 507 (a liquid introduction passage) communicating with the first reservoir 505.
  • Microchannel a second channel 508 (microchannel for liquid introduction) leading to the second reservoir 506, and a third channel 509 (mixing channel) connecting the first channel 507 and the second channel 508.
  • the vibrator 510 is connected to a power supply and drive control means (not shown). From the first reservoir 505, a first liquid is introduced through a first channel 507 into a third channel 509, and from a second reservoir 506, a second liquid is introduced through a second channel 507. Introduced on channel 509 of 3.
  • Instability occurs at the interface where the two liquids come into contact with each other, or the area of the interface where the two liquids come into contact with each other increases, or the interface structure collapses due to the vortex (vorticity) generated by the lifting surface, or within the negative pressure region due to vortex fluctuation. Can rapidly and uniformly mix the two liquids.
  • a movable lift surface 511 is provided at the junction.
  • the device comprises a first reservoir 505 filled with a first liquid, a second reservoir 506 filled with a second liquid, a first channel 507 leading to the first reservoir 505, and a second A second lifting channel 508 that includes a second channel 508 that communicates with a reservoir 506 of the second channel 509 and a third channel 509 that connects the first channel 507 and the second channel 508.
  • the movable lift surface 511 is connected to a power supply and drive control means (not shown).
  • the first liquid is introduced into the third channel 509 through the first channel 507, and from the second reservoir 506 the second liquid is introduced through the second channel 507 through the third channel 507. Introduced on channel 509.
  • a variable component is appropriately given at a frequency that induces instability of the interface by the movable lifting surface 511 installed at the junction, the interface formed by the two liquids becomes unstable, and the area of the interface where the two liquids come into contact is large. Or the collapse of the interface structure or the generation of cavitation in the liquid, so that the two liquids can be uniformly mixed at high speed.
  • rotor 512 is provided at the junction.
  • the device comprises a first reservoir 505 filled with a first liquid, a second reservoir 506 filled with a second liquid, a first channel 507 leading to the first reservoir 505, and a second A second channel 508 that communicates with a reservoir 506 of the second channel 508, a third channel 509 that connects the first channel 507 and the second channel 508, and further includes a rotor 512 in the third channel 509.
  • the rotor 512 is connected to a power supply and drive control means (not shown).
  • the first liquid flows through the first channel 507 , Is introduced into the third channel 509, and from the second reservoir 506, the second liquid is introduced into the third channel 509 through the second channel 507.
  • the interface formed by the two liquids becomes unstable, and the area of the interface where the two liquids come into contact Can be widened, or the interface structure can be broken down, or cavitation can be generated in the liquid, so that the two liquids can be uniformly mixed at high speed.
  • an oscillator 513 is provided at the junction.
  • the device comprises a first reservoir 505 filled with a first liquid, a second reservoir 506 filled with a second liquid, a first channel 507 leading to the first reservoir 505, and a second A second channel 508 leading to a reservoir 506 of the first channel 507 and a third channel 509 connecting the first channel 507 and the second channel 508, and further including an oscillator 513 in the third channel 509.
  • the oscillator 513 is connected to a power supply and drive control means (not shown).
  • a first liquid is introduced through a first channel 507 into a third channel 509, and from a second reservoir 506 a second liquid is introduced through a second channel 507 through a third channel 507. Introduced on channel 509.
  • the oscillator 513 or by a plurality of oscillator rows installed in the channel
  • the interface formed by the two liquids becomes unstable, and the interface between the two liquids comes into contact. Since the area can be increased, the interface structure can be collapsed, or cavitation can be generated in the liquid, the two liquids can be uniformly mixed at high speed.
  • the first liquid and the second liquid can be quickly mixed on the third channel 509 at an arbitrary ratio. If the first liquid and the second liquid having different concentrations are used, a concentration gradient region can be formed in the third channel 509 by continuously changing the mixing ratio.
  • FIGS 51-53 show embodiments of the apparatus having a second type of mechanical variation means.
  • This type of device does not have an interface between each liquid in the mixing microchannel and one mixing microchannel in which a plurality of liquid introduction microchannels are joined.
  • a vibrator for stabilizing.
  • a vibrator (preferably a plurality of vibrators) is also provided downstream of the mixing microchannel. It is characterized in that the mixing is promoted after the liquid is introduced into the mixing microchannel. Specifically, after introducing the liquid to be mixed so that the contact interface between the liquids is maintained, the introduction of the liquid is stopped, and then the contact interface between the liquids is destabilized by the vibrator. Mix each liquid. If a concentration gradient is to be formed, the merging is completed so that the volume ratio of the two liquids changes continuously in the flow direction in the mixing microchannel, and then the output and driving time of the oscillator are controlled. Drive the vibrator.
  • the two types of liquids can form various types of geometric patterns in the mixing microchannel by introducing the liquid at different flow rates of the microchannel force for liquid introduction (for example, The flow control according to the above embodiments 11 and 12 can be applied).
  • FIG. 51 shows the forms of two types of liquids formed in the mixing microchannel.
  • the liquids 635 and 636 to be mixed are introduced into the mixing microchannel 633 via the junctions of the plurality of liquid introduction microchannels. As described in the background art, mixing is performed in the microchannel. Since it is difficult to proceed, these liquids tend to maintain the state of maintaining the contact interface. If the ratio of the two liquids is changed and introduced, it can be introduced so that the ratio of the two liquids changes continuously with respect to the length direction of the channel (FIGS.
  • FIG. 52 shows that two types of liquids introduced into the mixing microchannel 633 according to the configuration of FIG. 51 are mixed using a plurality of oscillators arranged along the wall surface of the mixing microchannel 633. , A process in which a concentration gradient is formed. A plurality of transducers are installed along the wall of the mixing microchannel 633. As described above, the liquids 635 and 636 are introduced into the mixing microchannel while maintaining the contact interface (FIGS. 51c and 52a). Next, by driving the vibrator 637, a fluctuation component is appropriately given at a frequency that induces instability of the interface between the liquids 635 and 636, and the interface between the liquids can be destabilized.
  • FIG. 53 illustrates a state where two types of liquids introduced into the mixing microchannel of FIG. 51 are mixed.
  • the liquid 635, 636 force is introduced into the mixing microchannel while maintaining the contact interface as shown in Fig. 51a (Fig. 51a).
  • an oscillator 637 provided at the end of the mixing microchannel appropriately gives a variable component at a frequency that induces instability of the interface, thereby destabilizing the interface between the liquids.
  • the area of the interface between the liquids increases, or the interface between the liquids is broken, or cavitation is generated in the liquid, so that the liquids can be mixed quickly and uniformly.
  • the contact interface between the two liquids is kept stable while changing the volume ratio so that the mixing ratio of the two liquids changes continuously in the flow direction in the channel.
  • a liquid concentration gradient as shown in FIG. 53b can be formed.
  • any known methods and apparatuses can be used.
  • a method of introducing two types of liquid at an arbitrary ratio by controlling the flow rate of a pump a method of changing the ratio of the liquid to be mixed by controlling the opening and closing time of a valve, and an electroosmotic flow driving method ⁇
  • the method and apparatus for introducing the liquid to be mixed are such that, after mixing each liquid, the volume ratio is changed so that the mixing ratio of each liquid is continuous in the length direction of the channel. Connection between
  • any known means and method can be used.
  • piezoelectric element, electrostatic actuator, shape memory effect Examples include a movable element, an electromagnetic actuator, and a method using a polymer electrokinetic material.
  • Two kinds of liquids are used in this embodiment.
  • the present invention is not limited to this, and two or more kinds of liquids may be used.
  • the number of the liquid introduction microchannels in this embodiment is two.
  • the present invention is not limited to this, and may be two or more.
  • the vibrator may be installed at any position as long as the interface of the liquid in the mixing microchannel can be vibrated.
  • it can be installed on the wall of the mixing microchannel (Fig. 52) or at the end of the mixing microchannel (Fig. 53).
  • it can be installed on both sides of the mixing microchannel, or can coexist on both the wall surface and the end of the mixing microchannel.
  • the vibrator may be provided at a position apart from the channel force.
  • the number of transducers to be installed is not limited to one, but may be plural.
  • the mixing promoting means of the apparatus of the present embodiment is a large number of microstructures arranged near the junction in the mixing microchannel.
  • the basic configuration of the device of this embodiment includes two or more liquid introduction microchannels for introducing a liquid and one mixing microchannel formed by connecting them. Many small structures are arranged inside. The liquid that has been joined by the introduction of the microchannel force for liquid introduction is brought into contact with the microstructures in the mixing microchannel to promote mixing.
  • the liquid introduction microchannel is a microchannel for introducing a buffer solution and a buffer containing Z or a denaturant
  • the mixing microchannel is a concentration gradient forming region. Channel.
  • a group of microstructures is provided in the concentration gradient region channel 709 (mixing microchannel) as mixing promoting means.
  • the first channel 707 liquid inlet microphone channel
  • the second channel 708 liquid inlet microchannel
  • This group of microstructures 731 is provided such that structures of minute size form a line at substantially equal intervals in a geometrical arrangement, and preferably, the structures in each line are alternately arranged in view of the flow direction force of the liquid.
  • FIG. 55 shows an embodiment in which an array of columnar structures is provided as the microstructure group 731.
  • This columnar structure group can be configured to have an axis parallel to the contact interface of the mixed liquid and perpendicular to the flow direction, and may be a cylinder as shown in Fig. 55 (a) or a cylinder as shown in Fig. 55 (b). It may be a triangular prism.
  • the shape of the microstructure group 731 is not particularly limited, and when the merged liquid passes, the flow separates from the side wall, and the diffusion action of the separated vortex enables rapid and powerful mixing. If so, any shape is applicable. Further, when a nucleic acid sample flows from the upstream, the flow is entangled with the columnar structure, so that the molecular weight of the nucleic acid can be separated.
  • FIG. 56 shows a mode in which a narrow groove is provided in a regular geometric shape on the wall surface of the microchannel 709 in the vicinity of the downstream of the junction 730 as a group of microstructures 731.
  • a narrow groove is provided in a regular geometric shape on the wall surface of the microchannel 709 in the vicinity of the downstream of the junction 730 as a group of microstructures 731.
  • the group of microstructures 731 having a small groove force may have a mesh shape intersecting the flow direction as shown in Fig. 57, or may have a large number of independent V-shaped grooves as shown in Fig. 58. Good.
  • the microstructure group 731 has the above-described groove arrangement on the lower surface 709a and the upper surface 709b of the microchannel 709.
  • Such a microstructure group 731 can be manufactured by using a microfabrication technique such as a known photolithography technique.
  • the liquid mixing device of the present invention is manufactured by a conventional method for manufacturing microchips, which is well known in the art.
  • the liquid mixing apparatus of the present invention is usually composed of two substrates, but is composed of one substrate. You can also.
  • a microchip is composed of two substrates, a single substrate is formed with a channel with a width and depth of about 10-100 m using microfabrication technology such as photolithography technology. Drill a reservoir hole in the other substrate using mechanical processing such as ultrasonic processing.
  • mechanical processing such as ultrasonic processing.
  • the dimensions (width and depth) of the microchannel are determined based on required specifications and possible processing accuracy. Also, if it is larger than the analyte (eg, double-stranded nucleic acid), it is acceptable up to lmm.
  • the dimension of the “microchannel” applicable to the present invention is generally lnm-1000 / ⁇ , preferably lnm-500 nm, more preferably 10 ⁇ m-100 ⁇ m from the current processing accuracy.
  • the processing of the substrate is performed by dry etching, which can be performed only by wet etching, according to the pattern width and depth, and by using a sand blasting method.
  • the mask is not limited to a photoresist mask, but may be Ni, Cr, or the like. May be used.
  • a microchannel can be formed by patterning a resist mask by photolithography and then performing wet etching with a 10% dilute solution of HF.
  • the portions having different depths in the channel can be formed by performing a patterning step and an etching step a plurality of times with different masks.
  • the material of the substrate can be selected from glass, quartz, Pyrex (registered trademark), plastic, silicon, resin, and metal depending on the application and the production method.
  • the bonding of the glass substrates can be performed by dropping a 1% diluted HF solution on the glass bonding surface, aligning the two, stacking them, and leaving them at 70 kPa for 60 hours.
  • the bonding may be fusion bonding, direct bonding using beam irradiation in a vacuum device, or the like.
  • injection molding, mold transfer, nano-implanting, and nano-stamp can be used to produce a microphone and a chip, and are low-cost, suitable for mass production and disposable.
  • liquid mixing device of the present invention can be applied to any device that needs to mix a small amount of liquid.
  • the present invention can be applied to a microchemical analyzer ( ⁇ TAS) such as a microchip for analysis for chemical analysis or biochemical analysis, and a high-speed mixing of a small amount of liquid in those devices. can do.
  • ⁇ TAS microchemical analyzer
  • microreactors for chemical synthesis can be applied to fine chemicals, which are not possible with conventional beaker reactions, such as suppressing intermediate reactions by adding instantaneous heating and cooling mechanisms.
  • An example of the use of the microreactor is an apparatus for obtaining only a mono-substituted product in a high yield in the Friedel-Craftsila reaction when an aromatic compound and a highly reactive carbon cation are mixed.
  • a conventional reaction in a beaker when trimethoxybenzene and imi-dumcatione are mixed, the substitution ratio of trimethoxybenzene is 80% or less, the yield of the target monosubstituted product is 40% or less, and the by-product Is 30% or more.
  • the substitution ratio of trimethoxybenzene is 90% or more, and the yield of the mono-substituted product is 90% or less. Furthermore, the yield of the di-substituted product is less than 5%, and only the desired reaction product can be selectively produced. As a result, the amount of raw materials and reagents required to obtain the same yield is also reduced.
  • microchip electrophoresis apparatus Another application to which the present invention can be applied is a microchip electrophoresis apparatus. Performing electrophoresis on a microchip requires less sample and reagents; reduces reaction and analysis times; reduces reaction and processing times, improves reaction efficiency and product yield It has a variety of advantages, including low waste volume; suitable for high-throughput analysis.
  • a microchip electrophoresis apparatus useful for DGGE can be provided by using the liquid mixing apparatus and method of the present invention for mixing a buffer solution for forming a denaturant concentration gradient.
  • the denaturant concentration gradient is formed so as to change continuously in the direction of electrophoresis.
  • At least two liquid introduction microchannels for introducing buffers containing denaturants at different concentrations and at least two liquid introduction microchannels are connected. And the buffer solution introduced at a varying rate from each liquid introduction microchannel merges in the mixing microchannel to form the concentration gradient region of the denaturant. Is done.
  • a further preferred embodiment has a mixing promoting means for promoting the mixing between the buffer solutions that join in the mixing microchannel.
  • the above-described embodiments 1-1 to 2-3 and all combinations thereof can be applied to the mixing promoting means.
  • FIGS. 59a, 59b, 59c, and 59d schematically show the basic structure of a microchip electrophoresis apparatus. First, the basic concept of this embodiment will be described with reference to these.
  • FIG. 59a includes a denaturant concentration gradient forming unit 802 and an electric swimming unit 804 on one microchip 801.
  • the denaturant concentration gradient forming section 802 is connected to the concentration gradient area channel 809 of the electrophoresis section 804, and the buffer for swimming containing the denaturant is supplied from the denaturant concentration gradient forming section 802 to the concentration gradient area channel 809. Is done.
  • the electrophoresis section 804 includes a concentration gradient area channel 809 and a sample introduction section 803 connected downstream thereof.
  • buffer solutions containing denaturants at different concentrations are mixed at a varying ratio, and a buffer region having a denaturant concentration gradient obtained in this way is a concentration gradient region.
  • the force on the upstream side of the channel 9 is sequentially introduced into the electrophoresis section 804 on the downstream side.
  • the sample introduction unit 803 is provided in the electrophoresis unit 804.
  • a nucleic acid sample such as purified DNA (hereinafter referred to as a DNA sample) is introduced from the sample introduction section 803 into the concentration gradient region channel 809 of the electrophoresis section 804.
  • a DNA sample is introduced into the denaturant concentration gradient region in the channel 809, the double-stranded DNA in the DNA sample is separated from the nucleotide sequence difference.
  • the microchip electrophoresis apparatus shown in Fig. 59b includes a denaturant concentration gradient forming section 802, a sample introduction section 803, and an electrophoresis section 804 on one microchip 801.
  • the sample introduction section 803 is connected to the concentration gradient area channel 809 so as to cross the concentration gradient area channel 809.
  • a DNA sample can be introduced from outside the area of the electrophoresis section 804 (from a sample introduction channel separate from the concentration gradient area channel 809), and the sample introduction operation is facilitated.
  • the microchip electrophoresis apparatus shown in FIGS. 59c and 59d includes a denaturant concentration gradient forming section 802, a sample introduction section 803, and an electrophoresis section 804 on one microchip 801.
  • the agent concentration gradient forming section 802 includes an electrophoresis section 804, and the denaturing agent concentration gradient forming section 802 also functions as the electrophoresis section 804.
  • the denaturant concentration gradient forming section 802 also serves as the electrophoresis section 804, so that the size of the microchip can be reduced, and the denaturant concentration gradient area formed by the denaturant concentration gradient 802 is moved to the electrophoresis section 804. There is no need.
  • buffer And ⁇ ⁇ a buffer containing a denaturing agent at a different concentration and a buffer containing a denaturing agent (hereinafter, simply referred to as buffer And ⁇ ⁇ in some cases) will be described.
  • one buffer contains or does not contain a denaturing agent!
  • the relative concentration difference of the denaturant between the buffers is not important.
  • a "buffer containing no denaturant” contains a relatively low concentration of a denaturant, and a "buffer containing a denaturant” is more effective than a "buffer containing no denaturant”. Similar effects can be obtained if the denaturant is contained at a significantly higher concentration, and such embodiments are also within the scope of the present invention.
  • Fig. 60 shows a specific configuration of the denaturant concentration gradient forming section 802 in the apparatus of Figs. 59a to 59d.
  • the denaturant concentration gradient forming section 802 in FIG. 60 has a first reservoir 805 filled with a buffer containing a denaturant at a constant concentration, and a second reservoir 805 containing no denaturant and a buffer.
  • a reservoir 806, a first channel 807 (liquid introduction microchannel) leading to a first reservoir 805, a second channel 808 (liquid introduction microchannel) leading to a second reservoir 806, and a first channel 807.
  • a second concentration channel 809 formed by merging the second channel 808.
  • First One reservoir 805 includes a first electrode 810 connected to a first power supply 811.
  • Second reservoir 806 includes a second electrode 812 connected to a second power supply 813.
  • the denaturant concentration gradient forming section 802 when a voltage is applied to each reservoir via the first power supply 811 and the electrode 810 and the second power supply 813 and the electrode 812, the electric power is thereby applied to the channel. Osmotic flow occurs.
  • the denaturant-containing buffer is introduced from the first reservoir 805 into the concentration gradient region channel 809 through the first channel 807 by the electroosmotic flow.
  • buffer from the second reservoir 806 is introduced into channel 809 through second channel 808.
  • the ratio of the inflow of each buffer solution from the channel 807 and the channel 808 can be changed.
  • the denaturant-containing buffer and the buffer can be mixed at an arbitrary ratio at the upstream point of the concentration gradient region channel 809 (the junction of the buffers from the channels 807 and 808).
  • the potentials of the first power supply 811 and the second power supply 813 are continuously changed, and preferably, two buffers which join each other are used.
  • FIG. 61 shows another configuration of the denaturing agent concentration gradient forming section 802.
  • the denaturant concentration gradient forming section 802 in FIG. 61 includes a first reservoir 805 filled with a buffer containing a denaturant, a second reservoir 806 filled with a buffer, and a second reservoir 805 communicating with the first reservoir 805. It includes a first channel 807, a second channel 808 leading to a second laser 806, and a concentration gradient region channel 809 formed by merging the first channel 807 and the second channel 808.
  • the first reservoir 805 includes a first electrode 810 connected to a first power supply 811, and a first pump 814 is connected upstream thereof.
  • the second reservoir 806 includes a second electrode 812 connected to a second power supply 813, and a second pump 815 is connected to an upstream side thereof.
  • the denaturant concentration gradient forming section 802 in FIG. 61 is obtained by attaching a first pump 814 and a second pump 815 to the first reservoir 805 and the second reservoir 806 shown in FIG. 60, respectively. It is a structure.
  • the liquid is supplied via the first pump 814 and the second pump 815. In this case, it is possible to assist the liquid transfer by each electro-osmotic flow, and to introduce the appropriate liquid into the concentration gradient region channel 809 and the denaturant concentration gradient even if the denaturant-containing buffer or the buffer has a high viscosity. There is an advantage that the formation of is ensured.
  • the flow rates of the first pump 814 and the second pump 815 are controlled.
  • a denaturant-containing buffer from the first reservoir 805 is introduced into the channel 809 through the first channel 807, and similarly, a buffer from the second reservoir 806 is passed through the second channel 808. Introduced on channel 809.
  • the denaturant-containing buffer and the buffer can be mixed at an arbitrary ratio at the upstream point of the concentration gradient region channel 809 (the junction of each buffer from the channel 807 and the channel 808).
  • the potentials of the first power supply 811 and the second power supply 813 are continuously changed, preferably, two By changing the ratio between the flow rates of the buffer at a constant rate, the mixing ratio of the buffer containing the denaturant and the buffer is changed continuously.
  • the first pump 814 and the second pump 815 may be connected to the first and second reservoirs, respectively, as shown in FIG. 61! , And may be provided on the first channel 807 and the second channel 808!
  • FIG. 62 shows a specific configuration of the sample introduction section 803 in the apparatus shown in FIGS. 59b and 59d.
  • the sample introduction section 803 shown in FIG. 62 includes a third reservoir 816 filled with a DNA sample, a fourth reservoir 817 for a discharged DNA sample waste liquid, and a fourth reservoir 816 communicating with a third reservoir 816.
  • the fourth channel 818 and the fifth channel 819 are connected alternately with the channel 809, where the fourth channel 818 and the fifth channel 819 communicate.
  • a third electrode 820 is connected to the third reservoir 816, and a third power supply 821 is connected to the third electrode 820.
  • a fourth electrode 822 is connected to the fourth reservoir 817, and a fourth power supply 823 is connected to the fourth electrode 822.
  • the supply of the DNA sample is performed by controlling the potentials of the third power supply 821 and the fourth power supply 823.
  • the DNA sample is stored in the third reservoir 816 by electroosmotic flow and electrophoresis generated by controlling the potential of the third power supply 821 and the fourth power supply 823.
  • a DNA sample is introduced at the intersection of fourth channel 818 and fifth channel 819 on channel 809, and then a voltage is applied across channel 809.
  • a voltage By applying a voltage to the channel 809, only the DNA sample fragment introduced at the intersection with the channels 818 and 819 is introduced into the channel 809. Since there is a concentration gradient of the DNA denaturant in the channel 809, the DNA sample introduced therein can be separated electrophoretically within the concentration gradient.
  • FIG. 63 illustrates one embodiment of the apparatus of FIG. 59b.
  • a fifth reservoir 824 for waste liquid is provided downstream of the channel 809.
  • Fifth reservoir 824 includes fifth electrode 825 connected to fifth power supply 826.
  • a denaturant concentration gradient forming section 802 as described with reference to FIG. 60 and a sample introduction section 803 as described with reference to FIG. 62 are included.
  • the first to fifth power sources may be appropriately shared.
  • a buffer flow having a denaturant concentration gradient formed in the denaturant concentration gradient forming section 2 is introduced into the channel 809, so that the denaturant concentration gradient region is formed in the channel 809.
  • Flow moves.
  • a DNA sample is introduced from the sample introduction part 803 onto this denaturant concentration gradient region.
  • the denaturing agent concentration gradient region introduced into the channel 809 from the upstream moves in the downstream direction by the electroosmotic flow generated in the denaturing agent concentration gradient forming section 802 and the channel 809.
  • the DNA sample introduced into the channel 809 is transported downstream by the electroosmotic flow generated in the denaturant concentration gradient forming section 802 and the channel 809, and electrophoresed by the negative charge of the DNA sample itself. It moves according to the sum of the amount of movement to the upstream.
  • the net shift of the DNA sample is smaller than the shift of the denaturant gradient region in the downstream direction by the amount of upstream electrophoresis caused by the negative charge of the DNA sample itself. If enough time elapses, the DNA sample can reach the denaturant concentration gradient region located upstream. Therefore, depending on the differences in base sequence and denaturant concentration gradient, denaturant concentration gradient gel electrophoresis (DGGE) As a result, they are separated in the moving direction of the channel 809.
  • DGGE denaturant concentration gradient gel electrophoresis
  • the principle of DGGE in this embodiment is based on the nucleation of DNA by a DNA denaturant such as urea or formamide. It utilizes the phenomenon in which hydrogen bonds between nucleotides are broken to neutralize the charge of acid-base, and double-stranded DNA dissociates into single-stranded DNA.
  • DNA sample contains double-stranded DNA were PCR amplified with one end thereof dissociation hard artificial DNA sequences even at high DNA denaturant concentration to single-stranded DNA of (GC clamp). Electrophoresis of GC-clamped double-stranded DNA in a gel with a DNA denaturant concentration gradient shows that at a certain denaturant concentration, one double-stranded DNA without GC clamp is found.
  • double-stranded DNA Dissociates into strand DNA, and the speed of movement of the double-stranded DNA decreases. Since the concentration of the denaturing agent at which double-stranded DNA dissociates into single-stranded DNA depends on its base sequence, when double-stranded DNAs having different base sequences are electrophoresed on the same concentration gradient region, a difference in migration distance occurs. Thus, double-stranded DNA can be separated based on the difference in base sequence.
  • FIG. 64 illustrates one embodiment of the device of FIG. 59b.
  • the electrophoresis section 804 of FIG. 64 includes a fifth reservoir 824 for waste liquid, and a channel 809 leading to the fifth reservoir 824.
  • Fifth reservoir 824 includes fifth electrode 825 connected to fifth power supply 826.
  • This embodiment includes a denaturant concentration gradient forming section 802 as described with reference to FIG. 61 and a sample introduction section 803 as described with reference to FIG. 62 on the upstream side.
  • the flow (movement) of the buffer having the denaturant concentration gradient formed by the denaturant concentration gradient forming section 802 is introduced into the channel 809, and the denaturant is introduced into the channel 809.
  • a concentration gradient flow occurs.
  • a DNA sample is introduced from the sample introduction section 803 onto this denaturant concentration gradient region.
  • the denaturant concentration gradient region is formed in the channel 809 by driving the first pump 810 and the second pump 815 in addition to the electroosmotic flow caused by the potentials of the first power supply 811 and the second power supply 813. Move downstream.
  • the DNA sample introduced into the channel 809 is moved downstream by the electroosmotic flow due to the potential of the first pump 814, the second pump 815, and the first power supply 811 and the second power supply 813, It moves by the sum of the upstream movement by electrophoresis caused by the negative charge of the sample itself.
  • the net shift of the DNA sample is smaller than the shift of the denaturant concentration gradient region in the downstream direction by the amount of the upstream electrophoresis caused by the negative charge of the DNA sample itself. If enough time elapses, the DNA sample can reach the denaturant concentration gradient region located upstream. Therefore, the GC-clamped double-stranded DNA fragments in the DNA sample were Denaturant gradient gel electrophoresis depending on the base sequence difference and denaturant concentration gradient
  • the channel and the reservoir of the microchip electrophoresis apparatus of this embodiment are filled with a buffer containing a polymer matrix.
  • the polymer matrix that can be used in the present embodiment includes cellulose derivatives such as polyacrylamide, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropinolemethinoresenorelose, hydroxycenorelose, methinoresenorelose, polyethylene oxide, polymethylene glycol, and polypropylene.
  • Polyols such as glycol, polybutyl alcohol, and polybutylpyrrolidone, dextran, pullulan and the like are appropriately selected.
  • the concentration is preferably in the range of 0.01% to 3.0%, depending on the length of the double-stranded DNA.
  • buffers include Tris-acetate buffer ⁇ Tris-borate buffer.
  • the DNA denaturant that can be used in the present embodiment is appropriately selected from urea, formamide, formaldehyde, strong alkalis such as sodium hydroxide and the like. Preference is given to urea and formamide.
  • a buffer containing denaturant containing 7 M urea and 40% formamide is generally used as a buffer containing 100% denaturant, and a buffer containing no denaturant is used at 0%. Use as buffer.
  • the denaturant gradient is 0% -100% or 20% -70% .
  • 35% — 55% is preferred.
  • DNA samples that can be analyzed in this embodiment include biological samples such as human blood and cells, foods, environmental samples such as soil, river water, and seawater, and activated sludge and methane fermentation sludge.
  • biological samples such as human blood and cells, foods, environmental samples such as soil, river water, and seawater, and activated sludge and methane fermentation sludge.
  • Use the extracted double-stranded DNA Predetermined regions of the extracted genomic DNA were amplified by PCR reaction, etc., with an artificial DNA sequence (GC clamp) that is difficult to dissociate into single-stranded DNA even at one end with a high DNA denaturant concentration. Strand DNA can be used.
  • the DNA detection means is selected from fluorescence detection, luminescence detection, absorption detection, electrochemical detection, and the like.
  • fluorescence detection a method of pre-labeling primers in PCR reactions, a method of fluorescently labeling PCR products, and a method of staining PCR products with DNA And a method in which a DNA stain is added to a buffer containing a polymer matrix and stained during electrophoresis.
  • fluorescent labeling substances include fluorescein, rhodamine, Cy3, Cy5, BODIPY FL, TexasRed, Alexa Fluor and the like.
  • DNA stains examples include SYBR Green, Vistra Green, ethidium bromide, YOY II-1, II-1, and thiazole orange.
  • a photomultiplier tube, UV detector, photodiode detector, or the like can be used as the detector.
  • the first channel 807, the second channel through any of the first reservoir 805, the second reservoir 806, the third reservoir 816, the fourth reservoir 817, or the fifth reservoir 824. 808, channel 809, fourth channel 818, and fifth channel 819 are filled with a buffer containing a polymer matrix. If it is not filled by capillary action, it is better to apply pressure with a syringe or the like.
  • the first reservoir 805 is filled with a buffer containing a denaturant
  • the second reservoir 806, the fourth reservoir 817, and the fifth reservoir 824 are filled with a buffer.
  • the third reservoir 816 is filled with the DNA sample.
  • the fourth reservoir 817 and the fifth reservoir 824 may optionally be filled with a denaturant-free buffer. It is preferred that all buffers and DNA samples used contain a polymeric matrix.
  • the buffer filled in the DNA sample, the fourth reservoir 817, and the fifth reservoir 824 may not contain a polymer matrix.
  • the first electrode 810, the second electrode 812, the third electrode 820, the fourth electrode 822, and the fifth electrode 825 are connected to the first reservoir 805, the second reservoir 806, Plug into third reservoir 816, fourth reservoir 817, and fifth reservoir 824, respectively.
  • those electrodes may be formed in advance inside the first reservoir 805, the second reservoir 806, the third reservoir 816, the fourth reservoir 817, and the fifth reservoir 824, respectively. .
  • the fifth electrode 825 is grounded, and a predetermined voltage is applied to the first electrode 810 and the second electrode 811. And a buffer of a predetermined denaturant concentration is introduced into channel 809. At this time, it is preferable to apply a predetermined potential to the third electrode 820 and the fourth electrode 822 so that the buffer does not flow into the fourth channel 818 and the fifth channel 819.
  • the fourth electrode 822 is grounded, and the third electrode 822 is grounded.
  • a predetermined voltage is applied to the first electrode 820, and the DNA sample is introduced into the intersection of the channel 809, the fourth channel 818, and the fifth channel 819.
  • the third electrode 820 is grounded and the fourth electrode 822 is Apply a predetermined voltage. In either case, it is preferable to apply a predetermined potential to the first electrode 810, the second electrode 812, and the fifth electrode 825 so that the DNA sample does not flow into the third channel 809.
  • the fifth electrode 825 is grounded, the voltage applied to the first electrode 810 and the second electrode 812 is continuously changed, and a region having a predetermined denaturant concentration gradient is provided in the channel 809.
  • a DNA sample is introduced onto the channel 809 having the denaturant concentration gradient region.
  • the procedure for changing the potential applied to the first electrode 810 and the second electrode 812 is as follows.
  • the potential of the second electrode 812 is made higher than the potential of the first electrode 810, and The potential of the first electrode 812 is reduced, and the potential of the first electrode 810 is increased.
  • the denaturant concentration gradient region introduced into the channel 809 is formed to be denser as the denaturant concentration is lower at the downstream and higher at the upstream.
  • DNA detection is performed by the DNA detector provided to the channel 9.
  • DNA detection may be performed at any point in channel 9.
  • the microtip must be kept at a constant temperature, preferably between 40 ° C and 70 ° C.
  • Pattern A microchip electrophoresis apparatus with mixing promoting means The mixing promoting means described in each of Embodiments 11 to 2-3 can be applied to the microchip electrophoresis apparatus of Embodiment A described above.
  • the mixing promoting means is used in the microchip electrophoresis apparatus, the microchannels 807 and 808 for introducing a buffer are liquid introduction microchannels, and the channel 809 in the concentration gradient forming area is used for mixing. It is a microchannel and a mixing facilitating means is used for mixing the buffer solution in channel 9.
  • Each reservoir for sending the buffer solution is a liquid inlet or an inlet of the liquid inlet microphone opening channel.
  • the mixing promoting means is also useful for forming a concentration gradient.
  • independent flow rate control means e.g., control of electroosmotic flow by adjusting the applied potential or applied voltage, control of the liquid delivery pump by adjusting the pressure with a microsyringe, or By controlling the valve to control the liquid drive by them secondarily, the ratio of the buffer introduced from the microchannels 807 and 808 can be changed arbitrarily, and at the same time Can be increased. Since an increase in the contact interface promotes mixing due to molecular diffusion between buffers, a uniform concentration gradient can be quickly formed in the channel 809 in the channel width direction. This technology can provide a useful microchip device for DEEG, and can reduce the DEEG analysis time and achieve high throughput.
  • FIG. 65-FIG. 68 show the apparatus of the above-mentioned embodiment A provided with a high-speed valve 832.
  • a fast-acting valve 832 can be provided in the first channel 807.
  • the denaturant concentration gradient forming section 802 when a voltage is applied to each reservoir via the first power supply 811 and the electrode 810 and the second power supply 813 and the electrode 812, the first electro-osmotic flow generates Denaturant-containing buffer from reservoir 805 is introduced into the gradient zone channel 809 through a first channel 807, and denaturant-free buffer from a second reservoir 806 is also introduced into channel 809 through a second channel 7. be introduced.
  • buffer regions (electrophoresis gels) containing denaturing agents at different concentrations are alternately arranged in the electrophoresis direction, and an analyte is introduced into the concentration gradient region to perform electrophoresis.
  • buffer regions containing denaturants at different concentrations are alternately arranged in the microchannel in the electrophoresis direction, and the analyte is introduced into the concentration gradient region. Electrophoresis is performed.
  • the method for separating a double-stranded nucleic acid according to the embodiment B is characterized in that at least two buffer regions containing denaturing agents at different concentrations are alternately arranged in the direction of nucleic acid migration. Nucleic acids are separated by electrophoretically migrating through such discontinuous configurations of denaturant concentrations. This principle will be described with reference to the conventional DGGE method.
  • the principle of DGGE is that, in a gel in which a concentration gradient of nucleic acid denaturants such as urea and formamide is formed, the nucleic acid denaturants neutralize the charge of the nucleobase of the double-stranded nucleic acid to be electrophoresed. This utilizes the phenomenon in which hydrogen bonds between nucleotides are cleaved and double-stranded nucleic acids dissociate into single-stranded nucleic acids.
  • a nucleic acid fragment to be electrophoresed is subjected to PCR amplification by attaching an artificial nucleic acid sequence (GC clamp), which is hardly dissociated into single-stranded nucleic acid even at a high nucleic acid denaturant concentration, at one end thereof, thereby performing double-stranded DNA amplification.
  • GC clamp artificial nucleic acid sequence
  • the double-stranded nucleic acid on the side without the GC clamp is dissociated into single-stranded nucleic acid, and the movement speed is reduced.
  • DGGE takes advantage of the nucleotide sequence dependency of the denaturant concentration required for dissociation of double-stranded nucleic acid.
  • Double-stranded nucleic acids having different base sequences have different denaturant concentrations that are easily dissociated depending on the base sequence. Therefore, when such double-stranded nucleic acids are electrophoresed in a gel having a gradient of denaturant concentration, the dissociation state gradually becomes different on the gradient of denaturant concentration, and their separation is realized.
  • the dependence of the denaturant concentration on the base sequence is considered in association with the difference in the frequency of the action of the denaturant molecules such as urea and formamide in the denaturant on the hydrogen bonding site of the double-stranded nucleic acid.
  • a denaturant molecule in order to partially break the hydrogen bond of a double-stranded nucleic acid having a certain base sequence, a denaturant molecule must act on the hydrogen-bonding site of the double-stranded nucleic acid in that portion at a frequency higher than a certain threshold.
  • the reaction of breaking a hydrogen bond in a certain portion of the double-stranded nucleic acid requires a finite reaction time. Denaturant molecules must act on the hydrogen bonding site for at least a longer time than the reaction time required for it. This finite reaction time is also considered to depend on the nucleotide sequence.
  • the present inventor has focused on a threshold for the reaction frequency of a migrating nucleic acid and a denaturing agent molecule, and has also focused on a threshold for the reaction time thereof, and has proposed a method for separating double-stranded nucleic acids. investigated. As a result, the present inventors have found that double-stranded nucleic acids can be separated by changing the reaction frequency without continuously changing the concentration of the denaturing agent. This separation method is based on the fact that the reaction frequency and reaction time thresholds required to break hydrogen bonds in double-stranded nucleic acids differ depending on the base sequence. And a method for arranging a buffer region included in the above.
  • the “length (distance in the swimming direction)” of the buffer region containing a high concentration of a denaturant and the buffer region containing a low or low concentration of Z or a denaturant changes in the migration direction.
  • each buffer region is arranged so that the frequency of reaction with the denaturing agent molecule or the Z and reaction time (passing time through the buffer region containing a high concentration of denaturing agent) in the electrophoresis direction gradually increase.
  • this embodiment relates to forming a discontinuous arrangement of denaturant concentrations.
  • denaturant concentration structure or “arrangement of buffer regions containing denaturant at different concentrations” used in the present embodiment refers to at least two buffer solutions having different denaturant concentrations. It means a structure in which regions are alternately arranged.
  • buffer region refers to a gel or the like containing a fixed concentration of a buffer. Refers to an electrophoresis matrix.
  • the double-stranded nucleic acid is designed so that the reaction frequency with the denaturing agent molecule gradually increases or the reaction time with the denaturing agent molecule gradually increases according to the moving distance.
  • use is made of an arrangement of denaturant-containing buffer regions and / or denaturant-free buffer regions of varying length in the direction of migration.
  • the time t of the same length
  • the ratio of the time during which the nucleic acid contacts the denaturant-containing buffer within the range of A ⁇ B holds depending on the number of regions of the denaturant-containing buffer that passes through.
  • the ratio of the nucleic acid in contact with the denaturant-containing buffer within the same time t gradually increases depending on the moving distance (moving time).
  • FIG. 69 shows a first embodiment of the intermittent denaturant arrangement.
  • the length of each region of the denaturant-containing buffer is substantially constant in the direction of migration of the nucleic acid, and the length of each region of the denaturant-free buffer is gradually shortened.
  • the interval between denaturant-containing buffers decreases in the direction of nucleic acid migration.
  • the nucleic acid moves over the intermittent denaturant, it passes alternately through denaturant-containing buffers and denaturant-free buffers.
  • the time required for the nucleic acid to pass through each denaturant-containing buffer solution region is set to be sufficiently shorter than the difference in the dissociation reaction time caused by the difference in the base sequence.
  • the nucleic acid goes downstream, it will more often pass through the denaturant-containing buffer within a certain period of time! / (So the reaction frequency will increase), making it easier to dissociate into double strands .
  • a nucleic acid having a base sequence in which the binding of double strands is relatively unstable has a low density of the denaturant-containing buffer region on the intermittent denaturant arrangement, and dissociates at a location (upstream region). Nucleic acids having a base sequence that makes the binding of this strand relatively stable will be dissociated in the denaturant-containing buffer region at a higher density (downstream region).
  • This embodiment utilizes a change in sequence density (a change in passage frequency) in the denaturant-containing buffer region.
  • FIG. 70 shows a second embodiment of the intermittent denaturant arrangement.
  • This embodiment is an intermittent denaturant arrangement in which the length of each region of the buffer containing no denaturant is made substantially constant in the direction of migration of the nucleic acid, and each region of the buffer containing denaturant is gradually lengthened. Also in this embodiment, the time required for the nucleic acid to pass through the appropriate number of denaturant-containing buffer regions is shorter than the difference in the dissociation reaction time caused by the difference in base sequence. The degree of dissociation of the nucleic acid to be electrophoresed varies depending on whether or not the time required to pass through each denaturant-containing buffer region has reached the reaction time required for dissociation of the base sequence.
  • This embodiment utilizes a change in the continuous action (reaction time for one sequence) depending on the length (width in the direction of electrophoresis) of each denaturant-containing buffer region.
  • the time required for the nucleic acid to pass through the denaturant-containing buffer depends on the length of the denaturant-containing buffer and the nucleic acid migration speed. Also, nucleic acids pass through denaturant-containing buffer The frequency of this depends on the length of the buffer and the migration speed of the nucleic acid. Therefore, the length of the buffer region containing the denaturant, the length of the buffer region not containing the denaturant, the migration speed of the nucleic acid, the concentration of the denaturant in the buffer containing the denaturant, the overall length of the intermittent denaturant, etc. By selection, various double-stranded nucleic acids can be appropriately separated based on differences in base sequence.
  • the length and concentration of the denaturant-containing buffer region can be adjusted. For example, if the length of the denaturing agent-containing buffer region is reduced, the time required for the nucleic acid to pass through the denaturing agent-containing buffer region is shortened, and accurate detection becomes possible. If the denaturant concentration in the denaturant-containing buffer region is reduced, accurate detection becomes possible.
  • the length of the denaturant-containing buffer region, the length of the denaturant-free buffer region, nucleic acid migration speed, denaturant concentration of the denaturant-containing buffer, intermittent denaturant The overall length of the arrangement can be adjusted as needed.
  • the length of each region of the buffer containing no denaturant is changed
  • the length of only each region of the buffer containing the denaturant is changed.
  • the present invention is not limited thereto, and the arrangement may be such that the lengths of both the regions of the denaturant-free buffer and the regions of the denaturant-containing buffer are changed.
  • the buffer used in the present embodiment is a buffer containing a polymer matrix as necessary. This is because nucleic acids can be separated by the network structure of the polymer matrix or the interaction between the polymer matrix and the nucleic acid.
  • the polymer matrix that can be used in the present embodiment includes cellulose derivatives such as polyacrylamide, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropinolemethinoresenolerose, hydroxycenorelose, and methinoresenorelose, polyethylene oxide, and polymethylene.
  • cellulose derivatives such as polyacrylamide, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropinolemethinoresenolerose, hydroxycenorelose, and methinoresenorelose, polyethylene oxide, and polymethylene.
  • Polyols such as glycol, polypropylene glycol, polyvinyl alcohol, and polyvinylpyrrolidone; Forces such as tolan and pullulan are also appropriately selected.
  • the concentration is preferably in the range of 0.01% to 3.0%, depending on the length of the double-stranded DNA.
  • This polymer matrix is contained in Tris-acetate buffer / Tris-borate buffer, and used as a buffer. However, it is also possible to form an array of buffer regions by pouring a buffer solution into an existing slab gel. For a gel in which the network structure of the polymer matrix has already been formed, a buffer solution containing no polymer matrix can be used.
  • the modifier used in the present embodiment is intensively selected from urea, formamide, formaldehyde, and a strong alkali such as sodium hydroxide.
  • urea and formamide are used.
  • a buffer containing denaturant containing 7M urea and 40% formamide is generally used as a buffer containing 100% denaturant, and a buffer containing no denaturant is used.
  • Force used as 0% buffer solution Not limited to this.
  • the analyte of the present embodiment is typically an isolated double-stranded nucleic acid (also simply referred to as a nucleic acid or a nucleic acid molecule), and may be any type of nucleic acid as long as it has the property of being dissociated by a denaturing agent.
  • a group of nucleic acid molecules can be used.
  • biological samples such as human blood and cells, foods, environmental samples such as soil, river water and seawater, or predetermined regions of genomic nucleic acids extracted by force such as activated sludge or methane fermentation sludge
  • a double-stranded nucleic acid that has been amplified by attaching an artificial nucleic acid sequence (GC clamp) that is not easily dissociated into single-stranded nucleic acid at one end even when the nucleic acid denaturant concentration is high by PCR reaction or the like.
  • GC clamp artificial nucleic acid sequence
  • the analyte in this embodiment is not necessarily limited to nucleic acids.
  • a biopolymer e.g., protein
  • the nucleic acid separated on the intermittent denaturant arrangement of this embodiment is detected using a detection means.
  • the detection means is selected from fluorescence detection, luminescence detection, absorption detection, electrochemical detection, etc.In the case of fluorescence detection, luminescence detection and absorption detection, photomultiplier tubes, UV detectors, photodetectors A diode detector or the like is used.
  • fluorescence detection a method of labeling the primer of the PCR reaction with fluorescence, a method of labeling the PCR product with fluorescence, There are a method of staining the product with a DNA stain, and a method of including a DNA stain in a buffer containing a polymer matrix and staining during electrophoresis.
  • fluorescent labeling substances include fluorescein, rhodamine, Cy3, Cy5, BODIPY FL, TexasRed, Alexa Fluor or the like.
  • DNA stains include SYBR Green, Vistra Green, ethidium bromide, YOYO-1, TOTO-1, and thiazole orange.
  • an analysis substrate such as a plate gel or a microchip for electrophoresis may be mentioned.
  • slab gel examples include, but are not limited to, polyacrylamide gel containing a buffer solution.
  • Polyacrylamide gels containing a buffer include, for example, an acrylamide solution consisting of atarylamide, N, N methylene bisacrylamide, distilled water, Tris acetate buffer, ammonium persulfate solution, N, N, ⁇ ', ⁇ , -Polymerized by mixing tetramethylethylenediamine and distilled water. All types of slab gels can be made according to routine methods known in the art.
  • the intermittent denaturant arrangement is formed on the slab gel by the buffer solution region forming method suitable for this embodiment.
  • a slab gel is used, for example, as shown in FIG. 71, it is immersed in an electrophoresis tank filled with another buffer, and a lid is provided to prevent evaporation of the buffer and the intermittent arrangement of the denaturing agent.
  • sample holes are provided at regular intervals on the upstream side in the migration direction of the flat gel, and electrodes and a power supply are connected to the migration tank.
  • the support includes not only a flat gel but also any type of analytical substrate as long as it can support the intermittent arrangement of the denaturant.
  • a force such as glass, quartz, plastic, silicon resin, paper, or the like can be selected.
  • the substrate may be formed by laminating a substrate serving as a lid for preventing the intermittent denaturant arrangement from being evaporated, on the substrate on which the intermittent denaturant arrangement is formed. Also, by bending a part of the substrate where the intermittent denaturant arrangement is not formed, this part may be used as a lid.
  • a typical analysis substrate is a microchip.
  • the intermittent denaturant arrangement must be formed in the microchannel, which is the concentration gradient forming area of the microchip. Can do.
  • the denaturant-containing buffer region and the denaturant-free buffer region are alternately arranged in the electrophoresis direction, and the width of each denaturant-free buffer region gradually increases. It is shorter in the migration direction.
  • Microchips typically also have at least two substrate forces.
  • One substrate is formed with a channel with a width and depth of about 10 to 100 m using fine processing technology such as photolithography technology, and the other substrate is processed by mechanical processing such as ultrasonic processing. Drill holes for the reservoir bar using machining.
  • these two substrates are bonded together using an adhesive technique such as fusion bonding by heat, a microchip having a channel and a reservoir at a predetermined position is obtained.
  • the material of the substrate can be appropriately selected from glass, quartz, plastic, silicon resin, and the like.
  • the analysis channel has a fine structure, so that high throughput analysis and miniaturization of the entire apparatus can be realized.
  • the microchip electrophoresis apparatus in Fig. 73 includes a microchannel 901 (hereinafter, referred to as a "nucleic acid analysis channel 901") that is a concentration gradient forming region, and a microchannel 902 for introducing a nucleic acid sample. Supplied as plastic microchip 903. An intermittent denaturant arrangement is formed in the nucleic acid analysis channel 901.
  • This microchip 903 is provided with a plastic substrate 903a on which the above-mentioned channels 901 and 902 are formed, nucleic acid inlets and outlets 902a and 902b for sample introduction, and first and second reservoirs 901a and 901b. It is manufactured by bonding the obtained plastic substrate 3b.
  • the nucleic acid introduction channel 902 is filled with a buffer.
  • the method of introducing a sample into the nucleic acid analysis channel 901 is a method of introducing a double-stranded nucleic acid, which is a sample, into the nucleic acid analysis channel 901 by electrophoresis.
  • a buffer solution containing double-stranded nucleic acid is charged into the nucleic acid inlet 902a, and an electrode (not shown) connected to a DC power supply is inserted into the nucleic acid inlet 902a and the nucleic acid outlet 902b.
  • the nucleic acid sample contains a double-stranded nucleic acid which is hardly dissociated into single-stranded nucleic acid even at a high nucleic acid denaturant concentration at one end, and is amplified by attaching an artificial nucleic acid sequence (GC clamp). Since the double-stranded nucleic acid is negatively charged, the nucleic acid input port is used as a cathode and the nucleic acid output port is used as an anode.
  • the electrodes used are the nucleic acid inlet and the nucleic acid discharge
  • the mouth may be formed by force, for example, by vapor deposition.
  • an electrode may be inserted into the first reservoir 901a and the second reservoir 902a, and a potential higher than the potential of the nucleic acid inlet 902a and smaller than the potential of the nucleic acid outlet 902b may be applied.
  • the first reservoir side is a cathode and the second reservoir side is an anode.
  • the electrodes may be formed in the L-th reservoir and the second reservoir in advance by, for example, vapor deposition. As described above, by applying a predetermined potential to the electrodes inserted into the first reservoir and the second reservoir, and by applying a predetermined voltage to the electrodes installed at both ends of the analysis substrate. The resulting double-stranded nucleic acid is electrophoresed in the intermittent denaturant configuration. The double-stranded nucleic acids to be electrophoresed are separated based on the base sequence difference on the intermittent denaturant arrangement.
  • the nucleic acid separated by the above operation is detected by the detection unit 905 in or downstream of the nucleic acid analysis channel 901.
  • a detection method that can be used is selected from fluorescence detection, luminescence detection, absorption detection, electrochemical detection, and the like, and is preferably fluorescence detection.
  • fluorescence detection a method of pre-labeling primers for PCR reaction, a method of labeling PCR products with fluorescence, a method of staining PCR products with DNA stain, and a polymer matrix
  • a DNA stain is added to the buffer solution and staining is performed during electrophoresis.
  • the fluorescent labeling substance is as described above, and the detector is also as described above.
  • the analysis substrates 903a and 903b need to be kept at a constant temperature, preferably between 40 ° C and 70 ° C.
  • the microchip used may be made of glass.
  • a microchip made of glass the effect of electroosmotic flow is increased, but it is preferable to modify the channel surface by a known technique to suppress electroosmotic flow. This enables separation of double-stranded nucleic acids by electrophoresis on a glass microchip having the same configuration as a plastic microchip.
  • FIG. 74 shows an embodiment of a glass microchip electrophoresis apparatus. Even in the presence of electroosmotic flow, double-stranded nucleic acid analysis is possible with the configuration shown in FIG. Its basics The structure is the same as that of the microchip of FIG. 5. The difference is that the force nucleic acid introduction channel 2 is provided on the downstream side.
  • a double-stranded nucleic acid serving as a sample is introduced from the nucleic acid introduction channel 2 into the nucleic acid analysis channel 901 having an intermittent denaturant arrangement by an electroosmotic flow.
  • a buffer solution containing double-stranded nucleic acid is charged into the nucleic acid input port 902a, and electrodes connected to a DC power supply are inserted into the nucleic acid input port 902a and the nucleic acid output port 902b.
  • the buffer containing the double-stranded nucleic acid moves through the nucleic acid introduction channel 902 by electroosmotic flow and enters the nucleic acid analysis channel 901. be introduced.
  • the nucleic acid input port side is an anode and the nucleic acid discharge port side is a cathode.
  • the nucleic acid analysis channel 901 may be suppressed.
  • electrodes are inserted into the first reservoir 901a and the second reservoir 901b, and a potential higher than the potential of the nucleic acid outlet 902b, which is lower than the potential of the nucleic acid inlet 902a, is applied.
  • Each electrode may be formed in advance by, for example, vapor deposition.
  • the introduced double-stranded nucleic acid is separated by electrophoresis.
  • the buffer solution area with the intermittent denaturant is transported in the nucleic acid analysis channel 901 by electroosmotic flow. Is done.
  • the double-stranded nucleic acid introduced into the buffer region also moves by electrophoresis.
  • the direction of movement of the intermittent denaturing agent by electroosmotic flow and the direction of movement of nucleic acid by electrophoresis are opposite to each other (opposite directions). Therefore, when using the intermittent denaturant arrangement of FIG.
  • the first reservoir 901a is used as the anode
  • the second reservoir 901b is used as the cathode, whereby the intermittent denaturant arrangement is moved in the direction of the second reservoir 901b,
  • the double-stranded nucleic acids move in the direction of the first reservoir 901a, respectively. Therefore, the double-stranded nucleic acid is electrophoresed on the intermittent arrangement of the denaturant, and separated by a difference in base sequence.
  • the double-stranded nucleic acid separated by the above operation is detected by a detection unit (not shown) in the intermittent denaturant or downstream thereof.
  • FIG. 75 shows another embodiment of a glass microchip electrophoresis apparatus.
  • This apparatus includes a nucleic acid analysis channel 901 (first microchannel) in which an intermittent denaturant arrangement is formed, and a denaturant-containing buffer solution introduction section crossing at one end of the nucleic acid analysis channel 901.
  • the other end of the channel for nucleic acid analysis 901 is provided with a nucleic acid introduction part crossing the other end.
  • the first reservoir 901a is a buffer inlet for the first buffer
  • the second 90 lb reservoir is its outlet.
  • the denaturant-containing buffer introduction section has a denaturant-containing buffer introduction channel 906 (second microchannel) that crosses the nucleic acid analysis channel 901.
  • the denaturant-containing buffer inlet channel 906 has a denaturant-containing buffer inlet 906a for introducing a second buffer and an outlet 906b thereof.
  • a second buffer is guided from the denaturant-containing buffer introduction channel 906.
  • the nucleic acid introduction section has a nucleic acid sample introduction channel 902 that crosses the nucleic acid analysis channel 901.
  • the nucleic acid sample introduction channel 902 has a nucleic acid inlet 902a and an outlet 902b.
  • the apparatus shown in Fig. 75 includes a substrate 903a (see Fig. 76 (a)) on which a channel 901 for nucleic acid analysis, a channel 906 for introducing a denaturing agent-containing buffer, and a channel 902 for introducing a nucleic acid are formed, and the end of each channel.
  • the buffer 903b (see FIG. 76 (b)) on which the buffer inlet and its outlet, the nucleic acid inlet and its outlet, and the buffer containing denaturant-containing buffer and its outlet are formed, for example, by heat It is bonded into one microchip using bonding technology such as fusion bonding.
  • the hole for each reservoir is, for example, a circle having a diameter of about 2 to 10 mm, and is formed by using a known processing technique such as ultrasonic processing.
  • a desired intermittent denaturant arrangement as shown in Fig. 77 can be formed in the nucleic acid analysis channel 901 by the denaturant-containing buffer introducing section.
  • the formation method will be described in detail in the section “(3) Method and Apparatus for Forming Arrangement of Buffer Regions for Mode B” below.
  • a separation step performed after forming the intermittent denaturant arrangement in the nucleic acid analysis channel 1 is shown.
  • the double-stranded nucleic acid is caused to flow in the direction from the nucleic acid inlet 9002a to the nucleic acid outlet 902b, and the double-stranded nucleic acid is transferred to the nucleic acid analysis channel.
  • the method of flowing the double-stranded nucleic acid can be arbitrarily selected from methods that can control the flow direction and the flow time (flow distance). In the case of a black chip, a method in which a DC voltage is applied between the nucleic acid inlet 902a and the nucleic acid outlet 902b to generate an electroosmotic flow is preferable.
  • the buffer solution inlet 901a, its outlet 901b, the buffer containing denaturant-containing buffer 906a, and its outlet For example, a DC voltage may be applied or pressure may be applied to 906b.
  • the introduced double-stranded nucleic acid is transferred through the intermittent denaturing agent in the nucleic acid analysis channel 901. Electrophoresis and separation based on differences in base sequence. Each electrode may be formed in advance on the chip by, for example, vapor deposition. If an electroosmotic flow also occurs simultaneously in the case of a glass microchip or the like, the intermittent denaturant flows in the opposite direction to the double-stranded nucleic acid, that is, in the cathode side due to the electroosmotic flow. In this case, for example, as shown in FIG. 77, it is necessary to form an intermittent denaturant arrangement in the nucleic acid analysis channel 901 so that the length of the buffer gradually decreases in the migration direction of the nucleic acid.
  • the double-stranded nucleic acid in the nucleic acid sample is separated by the above operation, the double-stranded nucleic acid is separated at a predetermined location on the nucleic acid analysis channel 901 by, for example, a detection unit (not shown) downstream thereof. Detect nucleic acids.
  • the microchip must be kept at a constant temperature, preferably between 40 ° C and 70 ° C.
  • usable denaturants, buffers, samples that can be analyzed, detection methods, and the like are the same as those in the above-described apparatus.
  • the buffer containing the denaturant and the buffer are mixed at all! Separation is feasible.
  • a stirring means for mixing the denaturant-containing buffer with the buffer is not required.
  • FIG. 78 illustrates one embodiment of an apparatus for forming a buffer region array.
  • This device is for forming an array of buffer regions containing denaturants of double-stranded nucleic acids at different concentrations on an analysis substrate 910 for electrophoresis, and is a stage for holding the analysis substrate 910.
  • a control means (not shown) for controlling the position of the stage means 911 and Z or the ejecting means 912 and for sequentially driving the ejecting means.
  • the stage means 911 and Z or the injection means 912 have a moving mechanism capable of linearly moving in two-dimensional directions as indicated by arrows in the figure.
  • a substrate 910 such as a microchip having the above-described channel 1 for nucleic acid analysis is held on stage means 911, and a buffer solution containing no denaturant and Z
  • the injection means 912 capable of ejecting the buffer droplet 913 containing a denaturant can be used to control the position of the stage means 911 and Z or the ejection means 912 and to sequentially drive the desired ejection means 912.
  • the droplet 913 of the buffer solution having a predetermined denaturant concentration can be attached from the injection means 912 to an arbitrary position in the nucleic acid analysis channel 901 and an intermittent denaturant arrangement can be formed there. If the thickness of the buffer solution applied in one injection is too thin, apply the same distribution (same denaturing agent region) until the appropriate thickness is reached! ,.
  • the ejection means 912 can be constituted by an ejection mechanism having a droplet ejection head.
  • a buffer can be ejected to a target at an arbitrary timing by applying an electric signal through a control means (not shown).
  • a substrate on which a gel containing a buffer solution is formed in advance is set, and a denaturant concentration different from that of the buffer solution in the gel (at least higher than that of the buffer solution contained in the gel)
  • a single drop ejection head 912 that ejects a (high, concentrated) buffer is used. This is the case, for example, when using a flat gel 914 containing a microchip buffer in which a gel containing a buffer is already filled in a nucleic acid analysis channel (FIG. 79).
  • Fig. 78 As shown in the figure, a plurality of droplet ejection heads 912 and 912 'corresponding to buffer solutions having different concentrations are provided to selectively eject desired droplets.
  • the buffer usually contains a polymer matrix for forming a gel.
  • the droplet ejection mechanism as described above for example, an ejection head for an ink jet printer or the like can be used. By using an appropriate droplet ejection head, it is possible to easily apply a buffer droplet 913 having a diameter smaller than at least the width of the nucleic acid analysis channel 1 on the micro-tip chip substrate 910.
  • a plurality of droplet ejection heads that eject a buffer solution having the same concentration may be connected and used. By doing so, the time required for forming the intermittent modifier arrangement can be shortened.
  • droplet ejection heads that eject buffer solutions of different concentrations may be connected to each other.
  • an ejection head in which a droplet ejection head for a buffer containing a denaturant and a droplet ejection head for a buffer are integrated As a module. If such an injection head module is used, the apparatus can be made compact and the time for forming the intermittent modifier can be shortened.
  • the intermittent denaturant arrangement can be formed more efficiently.
  • a flat gel 914 for electrophoresis is held in place of the microchip substrate 910, and a droplet 913 of a buffer containing a denaturant is ejected to an arbitrary position on the flat gel 914. You can also. In this way, the droplet 913 of the denaturant-containing buffer solution can be driven into an arbitrary place of the flat gel 914, and the intermittent arrangement of the denaturant can be efficiently formed in an arbitrary pattern there.
  • the positioning means (911) and the droplet ejecting means (912) it is possible to easily form the intermittent dispersing agent having an arbitrary pattern, and it is also possible to use any type.
  • the method can be applied to a substrate, and in particular, a large number of intermittent denaturant arrangements having the same pattern can be efficiently and reproducibly formed.
  • a buffer solution (a first buffer solution; a buffer solution containing no denaturing agent) is caused to flow in the direction of the buffer inlet to the outlet.
  • the driving method is as follows: Flow direction and flow time (flow, etc.) such as a method of generating an electroosmotic flow by applying a DC voltage between the fluid and the outlet, and a method of connecting a buffer to the buffer inlet or Z and a pump to the outlet. Distance) can be arbitrarily selected from the methods which can be controlled.
  • the buffer solution is prevented from flowing out from the nucleic acid analysis channel to the nucleic acid introduction channel or the denaturant-containing buffer solution introduction channel.
  • the denaturant-containing buffer inlet it is preferable to apply, for example, a DC voltage or apply pressure to the nucleic acid inlet, the nucleic acid outlet, the denaturant-containing buffer inlet, and the denaturant-containing buffer outlet.
  • the driving method and operation of the denaturant-containing buffer in the denaturant-containing buffer introduction channel are the same as those of the above-described buffer driving method and the like.
  • the buffer solution region is introduced into the nucleic acid analysis channel 901 and is introduced until the buffer solution region passes through the intersection with the channel 906. Then, as shown in FIG. 80, when the denaturant-containing buffer (second buffer) is sent from the channel 6 in the denaturant-containing buffer feed step, the denaturant-containing buffer region from the channel 906 becomes the channel. Cross the 901 buffer area from just beside. Thus, there is one denaturant-containing buffer region that separates the buffer region. Next, in the buffer solution feeding step again, the denaturant-containing buffer solution region located in the channel 901 separates from the channel 906 and moves together with the buffer solution region toward the outlet. In this manner, one independent buffering agent-containing buffer region 901c is formed in the buffer region.
  • an intermittent denaturant arrangement in the nucleic acid analysis channel 901 can be formed.
  • the distance between the denaturant-containing buffer solution region and the denaturant-containing buffer solution region can be arbitrarily adjusted by adjusting the time of the buffer solution feeding step. For example, as shown in FIG. An intermittent denaturant channel in a form in which the interval between the buffer regions becomes shorter as it goes downstream can be formed.
  • the length of the nucleic acid analysis channel, the length of the denaturant-containing buffer, the concentration of the denaturant-containing buffer, the interval, and the like differ depending on the type of double-stranded nucleic acid to be separated. In this case, it may be determined in advance by a preliminary experiment or the like.
  • Fig. 81 shows an example of a method that can reduce the length (width) in the electrophoresis direction of the denaturant-containing buffer region. Indicates. By reducing the length of the denaturing agent-containing buffer region in the direction of electrophoresis, the separation accuracy of double-stranded nucleic acids can be improved.
  • the length in the migration direction of the denaturant-containing buffer region formed by the method in FIG. 80 is substantially equal to the width of the denaturant-containing buffer inlet. Therefore, in order to reduce the length of such a denaturant-containing buffer solution region, the inlet of the denaturant-containing buffer solution may be narrowed. However, when the inlet of the buffer containing the denaturant is narrowed, the flow loss becomes extremely large, so that very large power may be required to flow the buffer containing the denaturant.
  • the auxiliary buffer channel 906 ′ adjacent to the denaturant-containing buffer introduction channel 906 should be connected to the denaturant-containing buffer introduction section. It is good to provide.
  • the auxiliary buffer solution inlet may be provided with a plurality of auxiliary buffer solution channels and inlets so as to sandwich the denaturant-containing buffer solution introduction channel 6, Even if only it is provided.
  • means for controlling the flow rate of the buffer solution from the liquid introduction microchannel as described in Embodiments 11 and 12 forms the above-mentioned intermittent denaturant arrangement. It can be used as a means of doing so.
  • Embodiment B In the apparatus of Embodiment B, it is assumed that buffers having denaturants at different concentrations are not easily mixed by molecular diffusion (as described above, when the diffusion coefficient of a liquid is extremely small, (Mixing may not occur), the flow control means shown in Embodiments 1-1 and 1-2 can be used for alternate supply of a buffer so as to form an intermittent denaturant arrangement.
  • Fig. 83 shows an embodiment in which the high-speed operation valve described in the embodiment 12 is installed.
  • each of the two buffer inlet channels (containing no denaturant!
  • the inlet channel for the buffer and the inlet channel for the buffer containing the denaturant) has a fast acting valve (Valve 1 and Valve 2) is provided.
  • Valve 1 and Valve 2 By controlling the opening and closing times of the valve 1 and the valve 2, an intermittent denaturant arrangement can be formed in the nucleic acid analysis channel 1 as shown in FIG.
  • a mixing promoting means can be used.
  • Fig. 84 schematically shows the injection means 912.
  • Arrows a and b show the input paths for buffers containing denaturants at different concentrations.
  • the injection means 912 can mix two buffers containing denaturing agents at different concentrations, for example, a buffer containing denaturing agent (arrow a) and a buffer containing no denaturing agent (arrow b) at an arbitrary ratio.
  • a built-in mixing device (shown in the figure) is installed.
  • a liquid mixing apparatus having the mixing promoting means of the above-described embodiments 11 to 2-3 can be used as the mixing apparatus in the injection means 912.
  • the mixing device having appropriate mixing promoting means the two buffers indicated by arrows a and a are quickly mixed, so that a buffer containing a denaturant at a desired concentration is continuously prepared. be able to.
  • the denaturant-containing buffer solution mixed and prepared by the mixing device is ejected from the ejection means 912 as a droplet 913 having a desired concentration.
  • the mixing of the buffers can be performed at a high speed.
  • the time to complete can be shortened.
  • the liquid mixing device according to aspect 2-3 is used as the injection means, the device can be made compact.
  • nucleic acid samples containing 16S rRNA gene V3 region fragments obtained from two microorganisms belonging to the genus Sphingomonas were prepared as analytes.
  • Example 2 Using the apparatus of Example 1, two or more types of double-stranded nucleic acids having different nucleotide sequences were separated. For samples containing two or more types of double-stranded nucleic acids, activated sludge enriched and cultured using estradiol as a single carbon source was used. The experimental method is the same as in Example 1.
  • Example 2 As a comparison with Example 1, the same sample was analyzed using a conventional DGGE device. The experiment was performed by the method of Muyzer et al. (Appl. Environ. Microbiol., Mar 1 993, 695-700, Vol 59, No. 3). As the DGGE device, DCode Universal Mutation Detection System (BIORAD) was used.
  • BIORAD DCode Universal Mutation Detection System
  • Example 1 In the experiment, as in Example 1, after culturing the two types of microorganisms in a liquid medium, the cells collected by centrifugation were mixed, and the mixed cells were subjected to nucleic acid separation by the Shii-Dani Benzil method. Extracted. PCR was performed on the extracted nucleic acid using the universal primer described in Example 1 targeting the V3 region of the 16S rRNA gene, and the generated PCR product was used as a final nucleic acid sample. Unlike the universal primer used in Example 1, the universal primer used here was not subjected to fluorescent labeling, and was detected by electrophoresis and double-stranded nucleic acid fluorescent staining with Vistra Green. The presence of the GC clamp region in the forward primer is the same as in Example 1. The concentration gradient of the denaturant concentration gradient gel was 35% -55%.
  • electrophoresis of a nucleic acid sample two bands corresponding to two types of microorganisms were detected.
  • the electrophoresis time was 210 minutes, which includes the time required to prepare a denaturant gradient gel and the time required to stain the gel. It took about 6 hours for analysis.
  • Example 2 As a comparative example of Example 2, the same sample was analyzed using a conventional DGGE device. The experimental apparatus and the experimental method are the same as in Comparative Example 2.

Abstract

　本発明は、液体を用いたマイクロチップ装置に関する。より詳しくは本発明は、液体を導入するための少なくとも２つの液体導入用マイクロチャンネル、および該少なくとも２つの液体導入用マイクロチャンネルが接続している混合用マイクロチャンネルを含んでなり、各液体導入用マイクロチャンネルから導入された各液体が前記混合用マイクロチャンネル内で合流する液体混合装置であって、前記混合用マイクロチャンネル内で合流する液体間の混合を促進するための混合促進手段を有する液体混合装置を提供する。また本発明は、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法のための電気泳動装置およびマイクロチップ電気泳動装置を提供する。

Description

明 細 書
液体を用いたマイクロチップ装置
技術分野
[0001] 本発明は、マイクロ (微小)流体装置およびマイクロ化学分析装置に関する。より詳 しくは、マイクロチャンネル内で微少量の 2つ以上の液体（以下"試薬溶液"とも ヽぅ） を合流させて効率よく混合するための液体混合装置及び液体混合方法に関する。と りわけ本発明は、マイクロチャンネル内で混合される液体間での化学反応により、例 えば、目的の反応生成物を効率よく生産するためのマイクロリアクター等に関する。
[0002] さらに本発明は、分析対象物の変性剤の濃度勾配を利用して分析対象物を分離- 分析するための化学分析システムに関する。より詳しくは、本発明は、核酸変性剤の 濃度勾配を利用して 2本鎖核酸 (以下単に"核酸"ともいう）を塩基配列の違いにより 分離するための変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法 (DGGE)、そのための変性剤濃 度勾配の形成方法、そのような DGGEをマイクロチャンネル内で行うためのマイクロ チップ電気泳動装置等に関する。
[0003] 特に本発明は、マイクロチャンネル内で前記緩衝剤同士を効率的に混合することが でき、 DGGEに有用なマイクロチップ電気泳動装置等に関する。
背景技術
[0004] マイクロチャンネル構造を持つ化学分析装置の一例は、マイクロチップ電気泳動装 置である。以下では、マイクロチップ電気泳動装置を例にとって本発明の技術背景を 説明する。
[0005] 核酸やタンパク質などの生体高分子を分離'精製あるいは分析する手段として、電 気泳動がしばしば用いられる。電気泳動は、電解質溶液を充填したァガロースやポリ アクリルアミドなどのゲルやマイクロチャンネル（キヤピラリー）に電位を力け、その中で 荷電粒子を移動させ、移動速度の違いにより粒子を分離するものである。 2本鎖核酸 を電気泳動する場合は、移動速度に影響を与える要因は分子量 (分子の長さ）のみ であるので、分子量 (長さ）の差によって分離することができる。
[0006] 2本鎖核酸を塩基配列の違いにより分離する方法として、変性剤濃度勾配ゲル電 気泳動（DGGE)が知られている。 DGGEは、核酸の変異検出や一塩基多型（SNP )の検出などに利用されている。また近年、活性汚泥法やメタン発酵のような有機性 排水 ·廃棄物処理プロセスにお 、てまたは微生物を用いて汚染土壌 ·地下水を浄ィ匕 修復するバイオレメディエーシヨンなどにおいて活躍する微生物群集の構造解析な どに DGGEが利用されている。この微生物群集の構造解析では、全微生物が共通し て持っている配列である 16S rRNA遺伝子がしばしば利用される。すなわち、対象 とする微生物群集を含む試料力 核酸を抽出して DGGEで分離する。 DGGEで分 析される試料は、 16S rRNA遺伝子のうち複数の微生物に共通する配列部分を増 幅できる PCR用プライマーで増幅した増幅産物である。 DGGEでは、 16S rRNA 遺伝子の塩基配列の違！ヽにより微生物群集を構成する主な微生物に由来する核酸 をゲル上で分離できる。同一ゲル上の複数のレーン間においては、同一泳動距離に ある核酸は同一の塩基配列を持つと判断できるため、対象とした微生物群集の構成 の違いを判断できる。例えば、同一ゲル上の別のレーンに特定の微生物の 16S rR NA遺伝子を同様に操作して泳動する。その核酸バンドの位置と比較することにより、 その微生物が対象とする微生物群に存在するか否かを判定することもできる。
[0007] DGGEの欠点は、ゲル作製や電気泳動に時間を要すため、高スループット（高速 大量処理）の解析には向かな!/、こと、ゲルの寸法が約 20cm X約 20cm X約 lmmと 大き 、ため大型の恒温槽を必要とし装置全体が大型になること、マイクロチップ電気 泳動と比較すると分解能が劣ることなどである。
[0008] さらに、変性剤濃度勾配ゲルを作製する際には、手作業の煩雑な操作を要し、ゲ ルの変性剤濃度勾配を一定にすることが困難である。このため、 DGGEにより微生物 群集構造を解析する場合、別々のゲル間でのデータの適正な比較は困難である。
[0009] 一方、 1990年代の初めに、マンツが化学分析、生化学分析に必要な全ての要素 を 1枚のチップ上に組み込む微小化学分析装置、いわゆるマイクロタス TAS)の 概念を提唱して以降、様々なタイプのマイクロタスが開発されてきた。
[0010] マイクロタスの一分野に属するマイクロチップ電気泳動では、微細加工技術により、 幅、深さともに 10— 100 m程度の微小なチャンネルを形成させた基板上に、もう 1 枚の基板を接着させたマイクロチップを用いる。一般的には、 DNAや RNAの分子量 測定に利用される。 DNAや RNAの分子量測定では、チャンネル表面をィヒ学修飾し 、電気浸透流を抑えた状態で、直鎖のポリアクリルアミドゃヒドロキシメチルセルロース などの高分子マトリックス溶液をチャンネル内に充填し、 DNAや RNAの分離を行う。 従来のァガロースゲル電気泳動力 30分一 1時間の泳動時間を要するのに対して、 マイクロチップ電気泳動装置は 10分以下で泳動が終わり、分析時間の短縮ができる 。試料、試薬の消費量が少ないなどの利点がある。
[0011] マイクロチップ電気泳動装置のさらなるマイクロタス化を目指し、ラムゼー（特表平 1 0-507516号公報;特許文献 1)は、化学物質を分析または合成するマイクロチップ 実験装置を提案している。このマイクロチップ実験装置は、対象物質が充填されたリ ザ一バーから他のリザーバーに向けて対象物質を運ぶために、複数のリザーバーの 電位を同時に制御することを特徴としている。しかし、この中では、 2本鎖核酸を分子 量の違いにより分離しているにすぎず、 2本鎖核酸を塩基配列の違いにより分離して いない。
[0012] ナップ (特表 2001— 521622号公報;特許文献 2)は、ミクロ流体工学的デバイスに おける核酸分析方法と核酸の融点分析方法を提案している。この中で、化学変性剤 の濃度勾配とオリゴヌクレオチドプローブを利用して、核酸配列の変異を検出して 、 る。しかし、あらかじめ目的の核酸試料に対して、固有のオリゴヌクレオチドプローブ を設計する必要があるため、塩基配列が既に知られている変異し力検出できず、塩 基配列が未知の変異は検出できない。
[0013] ベック（特開平 8— 261986号公報；特許文献 3)は、マイクロチップ上で、電気浸透 流を用いた液体混合方法と液体混合装置を提案している。しかし、この中ではマイク 口チップ上での液体混合方法と装置を提供して 、るにすぎず、変性剤濃度勾配や 2 本鎖核酸の分離には言及して 、な 、。
[0014] リゲッティ (特表平 10-502738号公報;特許文献 4)は、マイクロチップ上で、粘性 ポリマーを利用した 2本鎖核酸断片中の点変異を検出する方法を提供している。しか し、経時的な温度勾配を利用しており、別途温度制御のための専用コンピュータプロ グラムを必要とする。
[0015] 馬場 (特開 2003— 66003号公報;特許文献 5)は、水溶性高分子が濃度勾配をつ けられマイクロチャンネル内に泳動液として充填されて 、るマイクロチップ電気泳動 装置を提案している。しかし、マイクロチップ上で実現するのは水溶性高分子の濃度 勾配であるため、核酸の分子量測定は可能であるが、 2本鎖核酸を塩基配列の違い により分離することはできない。特にその泳動液の濃度勾配形成には、濃度の異なる 緩衝液を順に充填して ヽくと ヽぅ煩雑な作業を伴う。
[0016] 以上説明したように、従来の DGGEには、実験操作が煩雑なこと、分析時間が長い こと、高スループットの分析には向かないこと、大型の装置を必要とすること、キヤビラ リー電気泳動に比較すると分解能が劣ることなどの欠点があった。また、 DGGEによ り微生物群集構造を解析するような場合、別々のゲル間でのデータの比較が困難で あるという欠点があった。さらに、これまで提案されているマイクロチップ電気泳動装 置を含むマイクロタスは、核酸の分子量測定である力 別途温度制御等のための専 用コンピュータプログラムを必要とする力、あらかじめ特定の塩基配列を検出するた めのオリゴヌクレオチドプローブの設計を必要とし、未知の 2本鎖核酸断片を塩基配 列の違いにより分離することができな 、。
特許文献 1：特表平 10- 507516号公報
特許文献 2 :特表 2001— 521622号公報
特許文献 3：特開平 8—261986号公報
特許文献 4：特表平 10- 502738号公報
特許文献 5：特開 2003— 66003号公報
特許文献 6：特開 2001—120971号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0017] 液体が混合しにくいという問題は、マイクロチップ電気泳動の場合のみならず、マイ クロチャンネル内で複数の液体を混合する場合の一般的な問題である。既に述べた ようにチャンネルの幅や深さが小さくなると、チャンネル内の流動に関するレイノルズ 数が非常に小さくなる。レイノルズ数が 100以下になると、チャンネル内の流動は安 定な層流となりやすぐ合流した液体間に乱流拡散が生じにくい。したがって、実質 的には界面での分子拡散によってしか液体が混合されず、これが迅速な混合を妨げ る。特にチャンネル内の流速が遅い場合、この傾向は顕著である。前記の問題は、 分析用マイクロチップやマイクロリアクターなどのマイクロチップ装置全般において、 実験操作の簡略化、分析および反応時間の短縮化、高スループット化、マイクロチッ プの小型化、高精度化 (例えば、高分解能化)を妨げる要因となっていた。
[0018] 前記の問題の解決策としてチャンネルを長くする方法がある。例えば、 2つの液体 導入用マイクロチャンネルを 1つの混合用マイクロチャンネルに接続して単純に 2液 を混合する構造（図 1又は図 29)において、混合用マイクロチャンネルを長くして十分 な混合を行うことが考えられる（図 2又は図 29)。しかし、この場合、混合用マイクロチ ヤンネルが大きな面積を占有するため装置の小型化が困難になること、および液体 がチャンネルを通過するのに時間を要するため分析時間や反応時間が長くなるとい う欠点がある。
[0019] 別の解決策として、阿部らは、リザーバー力 のチャンネルを分岐させ、分岐したチ ヤンネルを交互に連結することにより、液体を混合しやすくした液混合装置を提案し ている（特開 2001— 120971 ;特許文献 6)。しかし、この方法では、前方を流れる液 体と後方を流れる液体とが混合されるため、流れ方向に濃度勾配を形成させるような 定量的な濃度制御を行うことができな 、。
(1)本発明の目的は、マイクロスケールで微少量の液体を迅速に混合できかつ定量 的な濃度制御が可能である液体混合装置および液体混合方法を提供することであ る。
(2)本発明の更なる目的は、マイクロスケールで行われる実験操作の簡略化、分析 および反応時間の短縮化、並びに高スループット化、さらにはチップの小型化、高精 度化 (例えば、高分解能化)を可能にするために、本発明者により見出された一連の 液体混合技術を適用した分析用マイクロチップ (例えば、マイクロチップ電気泳動装 置）およびマイクロリアクターを提供することである。
[0020] 既に述べたように、従来の DGGEには、実験操作が煩雑なこと、分析時間が長いこ と、高スループットの分析には向力ないこと、大型の装置を必要とすること、マイクロス ケールでの分析と比較して分解能が劣るなどの問題がある。
(3)本発明の更なる目的は、マイクロチップ上で DGGEを行うためのマイクロチップ 電気泳動装置および電気泳動法を提供することである。
[0021] DGGEをマイクロチップ上で行うには、変性剤を異なる濃度で含有する複数の緩衝 液をマイクロスケールで混合することが必要とされる。例えば、変性剤含有緩衝液と 変性剤を含有しない緩衝液とをそれらの混合比を連続的に変化させながら 1つのマ イク口チャンネル内に導入し、その混合比の変化による変性剤濃度勾配を形成するこ とが必要である。有用な DGGE用マイクロチップを提供するには、正確で再現性の 高 、変性剤濃度勾配を形成することが重要である。
[0022] しかしながら、既に述べた通りマイクロチャンネル内では液体同士が混合しにくいと V、う問題がある。マイクロチャンネル内で合流した濃度の異なる 2つの緩衝液も混ざり 合わずに層状の流れを形成する傾向があるため、チャンネルの幅方向に均一である 濃度勾配を得るのに時間がかかり、結果的に分析時間の短縮ィ匕が妨げられる。図 2 のように長いチャンネルを使用して時間をかけて混合を行うなら、迅速に所定の濃度 勾配を得ることは難しい。また、図 3に示される混合方法 (特開 2001— 120971号に 記載されて!ヽる）では、複数の箇所で前方を流れる液体と後方を流れる液体が混合 されるため、 DGGEに必要とされる正確な濃度勾配を形成することは難しい。このよう に従来の混合方法では、マイクロスケールで要求される濃度勾配を正確に形成する という要求を満足できるものではなぐ濃度勾配の形成を精密かつ自在に制御するこ とも困難である。
(4)本発明の更なる目的は、変性剤を異なる濃度で含有する複数の緩衝液をマイク 口チャンネル内で迅速に、特にチャンネルの幅方向での均一な混合ができ、 DGGE に有用な変性剤濃度勾配を形成できるマイクロチップ電気泳動装置および電気泳動 法を提供することである。
(5)本発明の更なる目的は、本発明者により見出された液体混合の促進のための一 連の技術をマイクロスケールでの緩衝液同士の混合に適用することにより、 DGGEに 特に有用なマイクロチップ電気泳動装置および電気泳動法を提供することである。 課題を解決するための手段
[0023] [液体混合装置および液体混合方法]
前記の目的（1)および (2)を達成する本発明は、液体を導入するための少なくとも 2つの液体導入用マイクロチャンネル、および少なくとも 2つの液体導入用マイクロチ ヤンネルが接続して ヽる混合用マイクロチャンネルを含んでなり、各液体導入用マイ クロチャンネルカゝら導入された各液体が混合用マイクロチャンネル内で合流する液体 混合装置であって、前記混合用マイクロチャンネル内で合流する液体間の混合を促 進するための混合促進手段を有する液体混合装置に関する。
[0024] 本発明の好ましい態様には、混合促進手段が液体間の界面の面積を増加する手 段である第 1の態様 (態様 1 - 1、態様 1 - 2、態様 1 - 3および態様 1 - 4)、および混合 促進手段が液体間の界面を不安定化する手段である第 2の態様 (態様 2 - 1、態様 2 2および態様 2— 3)が含まれる。
[0025] 餱様 1—1
本発明の態様 1 1は、混合促進手段として、混合用マイクロチャンネル内で合流す る液体間の接触界面を増やすように各液体の流量 (流速)を制御する機構を有する。
[0026] 態様 1 1の装置の混合促進手段は、液体導入用マイクロチャンネルに導入する液 体の流量を他の液体導入用マイクロチャンネルと独立して制御できる 1つ以上の液 体導入手段である。
[0027] 態様 1 1の一例では、混合促進手段は、好ましくは、前記液体導入手段が流量を 制御できるポンプ、液体導入用マイクロチャンネルに設けられたバルブ、およびそれ らの組合せである。
[0028] 態様 1 1の別の例では、前記液体導入手段は、液体導入用マイクロチャンネルの 各導入部に設けられた第 1の電極と、前記混合用マイクロチャンネルの排出部に設 けられた第 2の電極とから構成され、第 1と第 2の電極間に電圧を印加することにより、 各液体導入用マイクロチャンネルに電気浸透流を生じさせる。
[0029] 態様 1 1に使用される液体混合方法の一例は、 2つ以上の液体導入用マイクロチ ヤンネルを通じて 2つ以上の液体を導入し、各液体導入用マイクロチャンネルが共通 地点で合流して ヽる混合用マイクロチャンネル中に液体を導入して混合する工程で あって、液体導入用マイクロチャンネルから導入される液体の流量を、他の液体導入 用マイクロチャンネルからの流量と異なる流量とすることにより、混合用マイクロチャン ネル内で合流した液体間に形成される接触界面の面積を増加させる工程を含む。 [0030] 態様 1 - 1に使用される液体混合方法の別の例では、液体導入用マイクロチャンネ ルに導入される各液体の流量をポンプにより制御すること、液体導入用マイクロチヤ ンネルに設けられたバルブにより各液体の流量を制御すること、およびそれらの組合 せにより各液体の流量を制御することを含む。
[0031] 態様 1 - 1に使用される液体混合方法の別の例では、液体導入用マイクロチャンネ ルの各導入部に設けられた第 1の電極と、混合用マイクロチャンネルの排出部に設け られた第 2の電極との間に電圧を印加することによって生じた電気浸透流により混合 用マイクロチャンネル内へ液体を導入する工程であって、付与される電位を液体導 入用マイクロチャンネル毎に変えることにより、各液体導入用マイクロチャンネル中か ら導入される流量を独立して制御する工程を含む。
[0032] 體 1—2
本発明の態様 1 2は、混合促進手段として、複数の液体導入用マイクロチャンネル の少なくとも ヽずれか 1つに設けられた高速作動バルブを有する。
[0033] 態様 1 2の一例では、高速作動バルブはピエゾ素子を用いた弁体駆動手段である 。態様 1 2の別の例では、チャンネルの局所的加熱による液体の体積膨張を利用し て、混合用マイクロチャンネルへの微小流量の液体の吐出を高速で制御可能な手段 である。態様 1—2の別の例では、高速作動バルブは、液体導入用マイクロチャンネル 内で微細空隙を開閉可能な弁体を駆動する手段である。
[0034] 態様 1 2に使用される液体混合方法の一例では、混合用マイクロチャンネルに接 続される 2つ以上の液体導入用マイクロチャンネル力もそれぞれ液体を導入し、混合 用マイクロチャンネル内で 2つ以上の液体を合流させる工程であって、複数の液体導 入用マイクロチャンネルの少なくともいずれ力 1つに設けられた高速作動バルブを高 速で開閉駆動することにより、導入される液体の流量に変動を与える工程を含む。
[0035] 態様 1 2に使用される液体混合方法の別の例では、高速作動バルブを高速で開 閉駆動することにより導入される液体の流量に短い時間間隔で変動を与えて、混合 用マイクロチャンネル内を占める液体の割合（体積比）をチャンネル幅の方向で連続 的又は断続的に変化させることにより、液体間の接触界面の面積を増加させる工程 を含む。 [0036] 態様 1 2に使用される液体混合方法の別の例では、高速作動バルブの開閉周期 を一定とし、開閉周期の 1周期のうち、バルブが開いている時間の割合 (Duty比）を 可変にする工程を含む。この液体混合方法では、複数の液体導入用マイクロチャン ネルの少なくとも 2つ以上に高速作動バルブを各々設け、複数の高速作動バルブを 同期させて開閉制御する工程を含む。この液体混合方法の別の例では、混合用マイ クロチャンネルに流れる液の総流量が一定になるように、複数の高速作動バルブを 同期させて開閉制御する工程を含む。
[0037] 態様 1—1および 1—2の液体混合装置はマイクロチップに適用でき、好ましくは分析 対象物を混合用マイクロチャンネルに導入できる試料導入部を更に有するマイクロチ ップ電気泳動装置に適用することができる。
[0038] 本発明の別の側面において、マイクロチップ電気泳動装置に使用される流量の制 御機構は、混合を促進することだけでなぐ分析対象物を分離するための変性剤の 濃度勾配を形成することに役立つ。上記の制御機構 (例えば、態様 1 1、 1 2およ びそれらの組合せを使用できる）を使用して、導入される複数の液体 (例えば、変性 剤を異なる濃度で含有する液体)の流量を制御することによって、混合用マイクロチ ヤンネル内で合流する特定の液体又は合流する液体内の試薬の濃度分布 (例えば、 変性剤の濃度分布)を流れ方向に形成することができる。
[0039] 體 1—3
本発明の態様 1 3は、混合促進手段として、混合用マイクロチャンネルの少なくとも 一部に、そのチャンネル高さをそのチャンネル幅よりも小さくすることにより形成された 混合室を有する。
[0040] 態様 1 3の一例では、混合対象の液体を導入する複数のマイ口チャンネルが上下 方向に積層して合流されて混合室に接続される。
[0041] 態様 1 3の別の例では、混合室の上流に、複数の導入用マイクロチャンネルを合 流させた予混合用（pre-mixing)マイクロチャンネルを有する。
[0042] 態様 1 - 3に使用される液体混合方法の一例は、混合対象の液体を複数のマイクロ チャンネルを介して導入し、導入された液体を合流させ混合室へ導入させる工程で あって、それら合流液体を、チャンネル高さがチャンネル幅よりも小さい混合室へ導 入する工程を含む。
[0043] 態様 1 3に使用される液体混合方法の別の例では、マイクロチャンネルに導入さ れた液体を上下方向に積層するように合流する工程を含む。
[0044] 態様 1 3に使用される液体混合方法の別の例では、マイクロチャンネルに導入さ れた液体を、合流後、 1つの予混合用のマイクロチャンネルへ導入させた後に混合室 へ導入する工程を含む。
[0045] 餱様 1 4
本発明の態様 1 4は、混合促進手段として、各液体導入用マイクロチャンネルから 分岐する複数の分岐チャンネルが集合して接続する合流部であって、複数の分岐チ ヤンネル同士が 3次元空間上で互い違いに配置される形態で混合用マイクロチャン ネルに接続する合流部を有する。
[0046] 態様 1 4の一例では、複数の基板を張り合わせて形成される層構造であって、複 数の基板が分岐チャンネルのほぼ合流方向またはほぼ分岐方向で重ね合わされた 層構造を有する。好ましくは、合流部のチャンネルは曲線的な形状である。
[0047] 態様 1 4の装置の製法の一例は、合流部のチャンネルをフォトリソグラフィー技術 を使用して製作する工程を含む。その製法の別の例は、合流部のチャンネルの断面 形状を曲線的な形状に加工するとよい。
[0048] 態様 1 4の別の例は、液体を導入するための複数の液体導入口を有する一群の 液体導入用マイクロチャンネルおよびこれらチャンネルが接続する混合用マイクロチ ヤンネルを有する液体混合装置であって、前記複数の液体導入口が幾何学的配置 で設けられている液体混合装置に関する。その幾何学的配置の例は、直線状、円弧 状、又は楕円状である。
[0049] 複数の液体導入口を有する態様 1 4の一例では、各液体導入用マイクロチャンネ ルのチャンネル幅が混合用マイクロチャンネルよりも狭い液体導入用マイクロチャン ネルが集合して混合用マイクロチャンネルが形成される。この態様の別の例は、液体 の少なくとも一部を電気浸透流により駆動する装置であって、複数の液体導入口の 幾何学的配置に対応するように分岐状の駆動電極が着脱自在に設置される装置で ある。この態様のまた別の例では、液体の少なくとも一部をポンプ圧力により駆動する 装置であって、複数の液体導入口の幾何学的配置に対応するように分岐状の液圧 導入管が着脱自在に設置される装置である。
[0050] 複数の液体導入口を有する態様 1 4の別の例では、複数の液体導入口に対しこ れとほぼ同一平面上で配置される駆動電極が設けられる。この態様の別の例では、 液体導入用マイクロチャンネル群のそれぞれにポンプ圧力及び Z又は電気浸透流 を独立して制御可能な制御手段を有する。この態様のまた別の例では、その制御手 段は、同一の液体が導入される液体導入用マイクロチャンネル群の中で、送液が行 われるチャンネル数を制御することによって同一の液体の混合用マイクロチャンネル への総流入量を変更可能とする。この態様のまた別の例では、前記制御手段は、同 一の液体が導入される各液体導入用マイクロチャンネルの制御バルブを制御可能と する。前記制御手段を有する態様 1 4の別の例では、同一の液体が導入される液体 導入用マイクロチャンネル群に対し、その上流にチャンネル群のチャンネル数よりも 少ない数の圧力ポンプ又は電気浸透流駆動機構が設けられる。
[0051] 液体導入口に駆動電極が設けられる態様 1 4の一例では、前記制御手段は、各 液体導入用マイクロチャンネルの電極と電源との間を独立にオンオフ制御可能であ る。この態様の別の例では、その電気浸透流駆動機構は、前記電源と電極との間を オンオフするスィッチ又はリレーを含む。
[0052] 餱様 2—1
本発明の態様 2 - 1は、混合促進手段として、液体導入用マイクロチャンネルおよび Zまたは混合用マイクロチャンネル内の液体を加熱するためのヒータである。
[0053] 態様 2— 1の一例では、混合促進手段が、混合用マイクロチャンネル内の液体を下 側から加熱するためのヒータである。
[0054] 態様 2— 1の別の例では、複数の液体導入用マイクロチャンネルの少なくとも 1つを 加熱するための少なくとも 1つのヒータを含み、複数の液体導入用マイクロチャンネル 力 ヒータによる加熱によって温度が高くなる順番で垂直方向に下力 積層するよう に混合用マイクロチャンネルに接続される。
[0055] 態様 2 - 1に使用される液体混合方法の一例は、複数の混合対象の液体を複数の 液体導入用マイクロチャンネルを介して導入し、複数の液体を合流させて混合用マイ クロチャンネルへ導入する工程であって、ヒータにより液体導入用マイクロチャンネル および Zまたは混合用マイクロチャンネル内の液体を加熱する工程を含む。この液 体混合方法の別の例では、複数の液体を上下方向に積層して合流させ、混合用マ イク口チャンネルへ導入する工程を含む。この液体混合方法のまた別の例では、ヒー タにより混合用マイクロチャンネル内の液体を加熱する工程を含む。この液体混合方 法の別の例では、ヒータにより混合用マイクロチャンネル内の液体を下側力 加熱す る工程を含む。
[0056] 態様 2 - 1に使用される液体混合方法の別の例では、複数の液体導入用マイクロチ ヤンネルの少なくとも 1つのチャンネル内の液体をヒータにより加熱し、複数の液体導 入用マイクロチャンネル内の液体を、温度が高い順に下から上へ積層して合流させ るように混合用マイクロチャンネルへ導入する工程を含む。
[0057] 體 2— 2
本発明の態様 2— 2は、混合促進手段として、混合用マイクロチャンネルで合流する 液体間に形成された界面を乱すための機械的変動手段を有する。
[0058] 態様 2— 2の一例では、機械的変動手段が、混合用マイクロチャンネル内の合流部 付近に設置された可動揚力面 (lifting surface) ,回転子または揺動子である。
[0059] 態様 2— 2の別の例では、機械的変動手段が、混合用マイクロチャンネルの壁面に 設置された振動子である。態様 2-2のまた別の例では、機械的変動手段が、混合用 マイクロチャンネルの壁面外に設置された振動子である。ここで、可動揚力面とは、 動作することによって上下面に圧力差を生じ、後方へ渦度を形成する面のことであり 、好ましくは、断面が翼型形状をしたフラップでもよいし、単純な平板面であってもよ い。
[0060] 態様 2— 2の別の例では、回転子または揺動子が磁力により駆動される。
[0061] 態様 2— 2に使用される液体混合方法の一例は、 2つ以上の液体導入用マイクロチ ヤンネルを通じて 2種類以上の液体を前記液体導入用マイクロチャンネルが共通地 点で合流して ヽる混合用マイクロチャンネル内に導入して混合する工程であって、液 体導入用マイクロチャンネルの合流部付近 (混合用マイクロチャンネルの上流部）に おいて、合流する液体間の接触界面を機械的変動手段によって乱す工程を含む。こ の液体混合方法の別の例では、機械的変動手段が、混合用マイクロチャンネルの外 壁に設置された振動子、あるいは混合用マイクロチャンネル内に設けられた可動揚 力面、回転子又は揺動子である。
[0062] 態様 2 - 2に使用される液体混合方法の別の例は、合流する液体を混合用マイクロ チャンネル内に各液間の接触界面を保持するように導入する工程、および液体の導 入の完了後、流動を静止してから、振動子によって各液間の接触界面を不安定化す る工程を含む。この液体混合方法の一例では、混合用マイクロチャンネルの壁面に 設置されて!ヽる振動子によって各液間の接触界面を不安定ィ匕する工程を含む。この 液体混合方法の別の例では、混合用マイクロチャンネルの壁面外に設置されて 、る 振動子によって、振動を混合用マイクロチャンネル内の液体に伝播させ、各液間の 接触界面を不安定化する工程を含む。
[0063] 體 2— 3
本発明の態様 2— 3は、混合促進手段として、混合用マイクロチャンネル内に多数配 列された微小な構造物を有する。態様 2 - 3の一例では、微小構造物が混合用マイク 口チャンネルのチャンネル幅よりも充分に小さな突起または溝である。
[0064] 混合 谁丰段 有する能様の鉬.合せ
本発明の液体混合装置および方法には、態様 1 1から 2— 3に示される混合促進 手段を単独で使用することもできるし、それらをあらゆる組合せで使用することもでき る。
[0065] 好ましい組合せの一例には、流量制御により液体間の接触界面を増加するための 第 1の態様と、流量制御により増力!]した液体間の接触界面を破壊するための第 2の 態様との組合せである。特に好ましい組合せには、態様 1 1の流量独立制御と、態 様 2— 1のヒータとの組合せが含まれる。態様 1—1による流量制御によって混合用マイ クロチャンネルで形成される液体間の接触界面の面積が増加すると同時に、増加し た接触界面が態様 2— 1のヒータによる熱対流で不安定ィ匕すれば、混合が効果的に 促進される。
[0066] 同様に、液体間の面積を増やすことができる第 1の態様 (態様 1 1から 1 4)の少な くとも 1つと、液体間の接触界面を不安定ィ匕することができる第 2の態様 (態様 2— 1か ら 2— 3)の少なくとも 1つとの組合せにより、混合を効果的に促進することができる。
[0067] 態様 2— 1のヒータは、他の混合促進手段と組み合わせることが容易である。例えば 、態様 1 3の混合室の下側または態様 1 4の分岐チャンネルの合流部の下側にヒ ータを使用すれば、加熱される液体界面が増えるので好ましい。態様 2— 3の微小細 構造体に熱伝導率の高い材料を使用して、これをヒータにより加熱してもよい。
[0068] 同じタイプの混合促進手段であっても、それらが同じマイクロチップ上に適用可能 であるなら、 1つのマイクロチップ上に一緒に適用することができる。例えば、態様 1— 1または 1 2の流量制御による合流液体の接触界面の増加と、態様 1 3または態様 1 4のチャンネル形状に基づく合流液体の接触界面の増加とを同時に使用してもよ い。同様に、同一のチャンネル上に直列に適用可能であれば、 1つのチャンネル上 に複数の混合促進手段を設置することができる。なお、温度感受性の試薬や反応体 を使用する場合は、ヒータ以外の手段、例えば、態様 2— 2の振動子による方法を使 用するとよい。
[0069] 液 ^昆 よび のマイクロチップ雷気 への；商 ffl
上記の態様 1 1から 2 - 3の液体混合装置および方法は、マイクロチップ電気泳動 装置に使用することができる。
[0070] 液体混合装置および方法を使用するマイクロチップ電気泳動装置の一例では、変 性剤を異なる濃度で含有する少なくとも 1つの緩衝液を各々導入するための液体導 入マイクロチャンネル、各液体導入マイクロチャンネルから導入された緩衝液の混合 による濃度勾配領域を形成するための混合用マイクロチャンネル、混合用マイクロチ ヤンネルに分析対象物を含有する試料を導入するための試料導入部、および混合 用マイクロチャンネル内での液体合流のための態様 1—1から 2— 3までに示される少 なくとも 1つの混合促進手段を有する。この態様では、態様 1 1から 2— 3の液体混合 装置および方法を単独でまたはあらゆる好ま 、組合せで適用することにより、変性 剤を異なる濃度で含有する緩衝液同士の混合を促進することができる。
[0071] 上記の各態様の液体混合手段または流量制御手段は、下記の態様 Aまたは態様 Bに使用することができる。それらの組合せは、本明細書の開示に従ってあらゆる態 様において適用可能である。本明細書の開示は、それらの好ましい組合せおよび好 ま 、組合せの実施の態様を教示する。
[0072] [分析対象物の分離装置および方法]
前記の目的（3) (4)および (5)を達成する本発明は、分析対象物の変性剤の濃度 勾配を利用する分析対象物の分離装置および方法に関する。この発明の好ましい 態様は、分析対象物の変性剤の濃度勾配領域を形成するためのマイクロチャンネル を含んでなり、濃度勾配領域に導入された分析対象物が電気泳動される装置に関 する。本発明の分離装置および方法には、下記の通り、変性剤濃度勾配の形態が異 なる"態様 A"および"態様 B"がある。これら態様において、典型的な分析対象物は 2 本鎖核酸である。 2本鎖核酸には、 2本鎖 DNAと 2本鎖 RNAなどがある。
[0073] 體 A
態様 Aでは、異なる濃度で変性剤を含有する緩衝液を混合することにより、変性剤 濃度が連続的に変化する変性剤濃度勾配を形成する。
[0074] 態様 Aの一例は、変性剤を異なる濃度で含有する緩衝液を導入するための少なく とも 2つの液体導入用マイクロチャンネル、および該少なくとも 2つの液体導入用マイ クロチャンネルが接続している混合用マイクロチャンネルを含んでなるマイクロチップ 電気泳動装置であって、各液体導入用マイクロチャンネル力 変動する割合で導入 される各緩衝液が混合用マイクロチャンネル内で合流することにより変性剤の濃度勾 配領域が形成される装置である。
[0075] 態様 Aの別の例では、 "異なる濃度で変性剤を含有する 2つの緩衝液"が、変性剤 含有緩衝液と変性剤不含有緩衝液 (以下単に緩衝液とも 、う）である。
[0076] 態様 Aのマイクロチップ電気泳動装置の一例では、好ましくは、混合用マイクロチヤ ンネル内で合流する緩衝液間の混合を促進するための少なくとも 1つの混合促進手 段を有する。態様 Aに使用される混合促進手段には、上記の態様 1 1から 2— 3の液 体混合装置およびそれらの組合せが含まれる。態様 Aに使用される混合促進手段の 一例は、別途特別な装置を必要とせず、コスト面で有利である流量独立制御、例え ば、態様 1 1の電気浸透流の制御または態様 1 1のポンプによる独立制御手段で ある。
[0077] 態様 Aの装置の別の例は、泳動用緩衝液中の核酸変性剤の濃度勾配が形成され る濃度勾配領域チャンネル (混合用マイクロチャンネル）と;濃度勾配領域チャンネル の上流側に設けられ、濃度勾配領域チャンネルに緩衝液を供給するための複数のリ ザ一バー及びチャンネル (液体導入用マイクロチャンネル)を有する濃度勾配形成部 と;濃度勾配領域チャンネルの下流側に設けられ、濃度勾配領域チャンネルに 2本 鎖核酸を含む核酸試料を導入するための試料導入部とを有する。この態様では、各 リザーバー内に核酸変性剤を異なる濃度で含有する緩衝液が充填される。例えば、 リザーバー内の緩衝液の各々に電位を与えることによりそれらに生じる各電気浸透流 を制御することができ、電気浸透流の制御により任意のリザーバーからの緩衝液を適 切な流量で濃度勾配領域チャンネル内へ供給することができる。緩衝液の供給は電 気浸透流による駆動に限られない。前記リザーバー及びチャンネルに態様 1 1およ び 1 2において説明したようなポンプおよび Zまたはバルブを設けることにより各リザ 一バーから緩衝液の供給を制御することができる。
[0078] 上記液体駆動のための制御手段を使用して、濃度勾配形成部のリザーバー及び チャンネルから核酸変性剤を異なる濃度で含有する緩衝液を濃度勾配領域チャンネ ル内へ変動する割合で合流させることができる。濃度勾配領域チャンネル内に導入 される異なる濃度の緩衝液の流入割合を連続的に変化させることにより、濃度勾配 領域チャンネル内に核酸変性剤濃度勾配を形成することができる。この濃度勾配領 域に核酸試料を導入して電気泳動することができる。
[0079] 態様 Aの装置の一例では、濃度勾配領域チャンネル (9)を有し、その上流側に濃 度勾配形成部（2)が設けられ、その下流側に試料導入部（3)を有する電気泳動部（ 4)が設けられる。さらにこの態様では、濃度勾配形成部（2)には、変性剤含有緩衝 液が充填される第 1のリザーバー（5)とこれに通じる第 1のチャンネル (7)と;核酸変 性剤不含有緩衝液が充填される第 2のリザーバー（6)とこれに通じる第 2のチャンネ ル (8)とを含む。この態様では、第 1のチャンネル（7)と第 2のチャンネル (8)とが合流 することにより濃度勾配領域チャンネル (9)が形成される。さらにこの態様は、第 1のリ ザ一バー（5)に接続する第 1の電極（10)とこれに接続する第 1の電源（11)、及び第 2のリザーバー（6)に接続する第 2の電極（12)とこれに接続する第 2の電源（13)をさ らに含む。 [0080] 前記の態様では、第 1及び第 2の電源（11, 13)の各電位を制御することにより、変 性剤含有緩衝液と変性剤不含有緩衝液の各々に生じる電気浸透流を制御して 2種 の液体を変動する割合で混合することができる。それら緩衝液の変動する割合の混 合によって濃度勾配領域チャンネル (9)内に変性剤濃度勾配領域を形成しながら電 気泳動部 (4)へ導入することができる（各符号は図 59から図 64を参照)。
[0081] 態様 Aの装置の別の例では、さらに濃度勾配形成部に第 1のリザーバー又は第 1の チャンネル内の液体を駆動可能な第 1のポンプ（14)、及び第 2のリザーバー又は第 2のチャンネル内の液体を駆動可能な第 2のポンプ（15)を含む (各符号は図 59から 図 64を参照)。この態様では、第 1の電源と第 2の電源による電位の付与を制御する ことおよび第 1のポンプと第 2のポンプの各出力を制御することにより、変性剤含有緩 衝液及び緩衝液の各流量を制御することができる。
[0082] 態様 Aの装置の別の例では、電気泳動部に設けられる試料導入部に、核酸試料が 充填される第 3のリザーバーとこれに通じる第 4のチャンネル、及び核酸試料廃液用 の第 4のリザーバーとこれに通じる第 5のチャンネルを含む。この態様では、第 4のチ ヤンネルと第 5のチャンネルとが濃度勾配領域チャンネルと交差して連通しており、さ らに第 3のリザーバーに接続する第 3の電極とこれに接続する第 3の電源、及び第 4 のリザーバーに接続する第 4の電極とこれに接続する第 4の電源を含む。この態様で は、第 3及び第 4の電源の各電位を制御することおよび電気浸透流および Zまたは 電気泳動を生じさせることによって、核酸試料を濃度勾配領域チャンネルに導入する ことができる。核酸試料の供給は電気浸透流による駆動に限られない。前記リザーバ 一及びチャンネルに態様 1 1および 1 2において説明したようなポンプおよび Zま たはバルブを設けることによりリザーバーからの核酸試料の供給を制御することがで きる。
[0083] 態様 Aの装置の別の例では、電気泳動部 (4)には、濃度勾配領域チャンネル上の 下流側 (試料導入部よりも下流側）に設けられた廃液用の第 5のリザーバー（24)、及 び第 5のリザーバー（24)に接続する第 5の電極 (25)とこれに接続する第 5の電源 (2 6)を含む (各符号は図 59から図 64を参照)。この態様では、試料導入部（3)から導 入された核酸試料を濃度勾配領域チャンネル (9)内で電気泳動することができる。 [0084] 態様 Aに使用される分析対象物の分離方法の一例は、マイクロチップ内のチャンネ ルに変性剤含有緩衝液と緩衝液とを割合を変えて混合することにより変性剤の濃度 勾配を形成し、チャンネル内に 2本鎖核酸を含む核酸試料を導入し、導入された核 酸試料を電気泳動により移動させ、分離する方法である。
[0085] 態様 Aに使用される分離方法の別の例では、核酸変性剤の濃度勾配を形成するた めの濃度勾配領域チャンネルを有し、濃度勾配領域チャンネルの上流側に核酸変 性剤を異なる濃度で含有する緩衝液の各々を供給するための複数のリザーバー及 びチャンネルが設けられ、その下流側に 2本鎖核酸を含む核酸試料を導入するため の試料導入部が設けられたマイクロチップ上で実施される方法であって、各リザーバ 一内の緩衝液の各々に電位を与えると共にそれらに生じる各電気浸透流を制御して それら緩衝剤を変動する割合で混合させつつ濃度勾配領域チャンネル内に導入し、 濃度勾配領域チャンネル内に核酸変性剤の濃度勾配を形成する工程、および濃度 勾配領域チャンネル内に核酸試料を導入して電気泳動する工程を含む。
[0086] 餱様 B
本出願人は、上記の態様 Aに関する装置および方法を特願 2003— 392302号とし て出願した。しかし、本願では、従来の DGGEの濃度勾配形成方法にとらわれず、さ らに大量生産が容易で再現性の高い分析を可能にする分離技術をも提供する。
[0087] 態様 Bでは、異なる濃度で変性剤を含有する緩衝液同士を混合する必要のない分 離装置および方法に関する。態様 Bでは、変性剤の濃度勾配が不連続である変性 剤濃度勾配を利用する分析対象物の分離方法、そのための緩衝液領域配列の形成 方法、及びそれらを用いたマイクロチップ電気泳動装置に関する。
[0088] 態様 Bは、分析対象物の変性剤を異なる濃度で含む緩衝液領域を泳動方向に交 互に配置し、緩衝液領域の配列に分析対象物を導入して電気泳動する工程を含む
[0089] 態様 Bの一例では、緩衝液領域の配列のうち、変性剤を含まな ヽ又は低!、濃度で 含む緩衝液領域の各々の長さ（泳動方向の幅）が下流側に向力つて漸次小さくなる ように配列される。態様 Bの別の例では、緩衝液領域の配列のうち、変性剤を高い濃 度で含む緩衝液領域の長さ (泳動方向の幅）が下流側に向力つて漸次大きくなるよう に配列される。
[0090] 態様 Bの別の例では、変性剤を異なる濃度で含む緩衝液領域の配列がマイクロチ ヤンネル内に形成される。この場合、マイクロチャンネル内に、所定の濃度で変性剤 を含む第 1の緩衝液とこれとは異なる濃度で変性剤を含む第 2の緩衝液とを交互に 導入することにより、マイクロチャンネル内に変性剤を異なる濃度で含む緩衝液領域 を交互に配列する。この態様では、上記の態様 1 1および 1 2に使用される流量制 御の手段を使用して、マイクロチャンネル内に変性剤を異なる濃度で含む緩衝液領 域を交互に導入することができる。
[0091] 態様 Bの別の例では、緩衝液領域を交互に配列する工程力 第 1のマイクロチャン ネル内に第 1の緩衝液を導入してから、第 1のマイクロチャンネルと交差する第 2のマ イク口チャンネルに第 2の緩衝液を導入することにより、第 1のマイクロチャンネル内の 第 1の緩衝液が第 2のマイクロチャンネル内の第 2の緩衝液によりそれらの交差部で 分断する工程、および前記工程に従って第 1の緩衝液と第 2の緩衝液とを交互に送り 込む工程を含む。これらの工程により、第 1のマイクロチャンネル内に第 1の緩衝液と 第 2の緩衝液の交互配列を形成する。この態様では、第 1の緩衝液の送り量を調節 することにより、第 1の緩衝液の泳動方向の長さを漸次変化させる工程を含むこともで きる。
[0092] 態様 Bの方法を使用する装置の一例は、マイクロチップ電気泳動装置であって、電 気泳動を行うための第 1のマイクロチャンネルと、第 1のマイクロチャンネル内に第 1の 緩衝液を導入する手段と、第 1のマイクロチャンネル内に第 1の緩衝液とは異なる濃 度で変性剤を含む第 2の緩衝液を導入する手段と、第 1のマイクロチャンネルに 2本 鎖核酸を含む試料を導入する手段とを有する。
[0093] 態様 Bの別の例は、 2本鎖核酸の変性剤を異なる濃度で含む緩衝液領域の配列を 電気泳動用の基板に形成するための方法であって、緩衝液領域の配列を形成すベ き基板をステージ手段に保持し、基板に対して 2本鎖核酸の変性剤を異なる濃度で 含む緩衝液を射出するための射出手段を設け、前記ステージ手段及び Z又は前記 射出手段を位置制御すると共に射出手段を逐次駆動することによって、前記基板に 変性剤を異なる濃度で含む緩衝液領域を配列する方法に関する。 [0094] 態様 Bによる緩衝液領域配列形成のための方法の別の例では、基板として電気泳 動用のマイクロチップ基板を保持し、保持されたマイクロチップ基板のマイクロチャン ネル内に変性剤を異なる濃度で含む緩衝液領域の配列を配置する。また別の例で は、前記基板の代わりに電気泳動用の平板ゲルを保持し、保持された平板ゲルに変 性剤を異なる濃度で含む緩衝液領域の配列を配置する。
[0095] 態様 Bによる緩衝液領域配列形成のための装置の一例は、 2本鎖核酸の変性剤を 異なる濃度で含む緩衝液領域の配列を電気泳動用の基板上又は平板ゲルに形成 するための装置であって、緩衝液領域の配列を形成すべき基板又は平板ゲルを保 持するためのステージ手段と、基板又は平板ゲルに対して 2本鎖核酸の変性剤を異 なる濃度を含む緩衝液を射出するための射出手段と、前記ステージ手段及び Z又 は前記射出手段を位置制御すると共に射出手段を逐次駆動するための制御手段と を有する。
[0096] 態様 Bによる緩衝液領域配列形成のための装置および方法の別の例では、前記射 出手段が、混合促進手段を有する態様 1 - 1から態様 2 - 3の液体混合装置および方 法を利用できる。この態様では、前記射出手段に供給された変性剤を異なる濃度で 含む緩衝液同士の混合が適切な液体混合手段により促進される。
発明の効果
[0097] 本発明は、マイクロスケールで微少量の液体を迅速かつ均一に混合することのでき る液体混合装置または方法を提供する。本発明により提供される液体混合装置また は方法は、現存するまたは今後開発されるであろうあらゆる/ z TAS、例えばマイクロ 化学分析装置やマイクロ化学反応装置 (マイクロリアクター）に適用することができ、 その結果、マイクロスケールで行われる実験操作の簡略化、分析時間および反応時 間の短縮化、並びに高スループット化、さらにはチップの小型化、高精度化 (例えば 、高分解能化)が可能となるなど、様々な利点をもたらす。
[0098] 本発明は、他の側面において、分析対象物の変性剤の濃度勾配を利用して分析 対象物を分離するための装置および方法、並びに変性剤濃度勾配の形成装置およ び方法を提供する。特にこの発明は、マイクロチップ上で DGGEを行うためのマイク 口チップ電気泳動装置および電気泳動法を提供する。この発明は、マイクロスケール で液体混合を促進するための一連の技術をマイクロチャンネル内での緩衝液同士の 混合に適用することにより、 DGGEに有用なマイクロチップ電気泳動装置および電気 泳動法をも提供する。
[0099] 本発明による DGGEマイクロチップ電気泳動装置およびその電気泳動法によれば 、核酸変性剤の濃度勾配を正確に形成でき、かつ濃度勾配の形成を自在に制御す ることができる。特に、常に同じ変性剤濃度勾配または配列を再現できる分析用チッ プを大量に提供することが可能である。その結果、別々のデータ間での厳密な比較 および検討が可能となり、例えば、分析される試料に含まれる核酸の比較 (典型的に は rRNA遺伝子の塩基配列の比較）に基づく微生物群集の構造を解析する場合、 採取データのデータベース化が容易となるなど、様々な利点をもたらす。
図面の簡単な説明
[0100] [図 1]公知の標準的なマイクロ混合用マイクロチャンネルを示す概略図である。
[図 2]拡散距離を十分取るため混合用マイクロチャンネルを長くしたマイクロ混合用マ イク口チャンネルを例示する概略図である。
[図 3]混合を促進するための液体分割細溝を有するマイクロチャンネルを例示する。 ( 態様 1 1)
[図 4]態様 1 1の装置を示す概略図である。
[図 5]本態様の電圧制御を示す概念図である。
[図 6]本態様の濃度勾配形成装置を示す概略図である。
[図 7]本態様の送圧制御を示す概念図である。（態様 1 - 2)
[図 8]態様 1 2の液体混合装置を示す概略構成図である。
[図 9]図 8の液体混合装置の具体的構成を示す斜視図である。
[図 10]図 8の液体混合装置の高速作動バルブを拡大して示す斜視図である。
[図 11]図 10の高速作動バルブ (未作動時)を示す断面図である。
[図 12]図 10の高速作動バルブ (作動時)を示す断面図である。
[図 13]高速作動バルブに使用する突起の作成方法を説明するための図である。
[図 14]高速作動バルブに使用する突起の作成工程を説明するための図である。
[図 15]本態様の液体混合装置の他の例を示す構成図である。 圆 16]本態様による混合の効果を説明するための図である。
圆 17]本態様の液体混合装置のさらに他の例を示す構成図である。
[図 18]図 16の液体混合装置の制御に関するタイムチャートである。
[図 19]図 16の液体混合装置の制御に関する他のタイムチャートである。
[図 20]本態様の液体混合装置のさらに他の例を示す構成図である。
[図 21]図 20の液体混合装置の制御に関する他のタイムチャートである。
圆 22]本態様の液体混合装置のさらに他の例を示す構成図である。
[図 23]図 22の液体混合装置の制御に関する他のタイムチャートである。
[図 24]本態様の液体混合装置のさらに他の例を示す構成図である。
[図 25]図 24の液体混合装置の制御に関する他のタイムチャートである。
圆 26]本態様の液体混合装置のさらに他の例を示す概念図である。
圆 27]本態様の液体混合装置のさらにまた他の例を示す概念図である。
圆 28]従来の液体混合装置の問題点を説明するための図である。
圆 29]従来の液体混合装置の問題点を説明するための図である。（態様 1-3) 圆 30]態様 1-3の液体混合装置の一例を示す図である。
[図 31]単位チャンネル長あたりのチャンネル体積 (V)に対する接触界面面積 (S)の 比（SZV)について説明する図である。
[図 32a]導入用マイクロチャンネルの積層方向と混合室の高さ方向とが垂直である場 合であって、導入用チャンネルと混合室とが直接接続されている場合の、混合室に おける液体の状態を示す。
[図 32b]導入用マイクロチャンネルの積層方向と混合室の高さ方向とが垂直である場 合であって、導入用マイクロチャンネルと混合室とが予混合用マイクロチャンネルを 介して接続されて 、る場合の、混合室における液体の状態を示す。
圆 33]本態様の液体混合装置の一例を示す図である。
[図 34a]予混合用マイクロチャンネルと混合室とがなだらかに連結されている場合の 液体の流れを示す。
[図 34b]予混合用マイクロチャンネルと混合室とがなだらかに連結されて ヽな 、場合 の液体の流れを示す。 圆 35]本態様の液体混合装置の別の例を示す。（態様 1-4)
[図 36]態様 1 - 4の液体混合装置の概略構成を示す左側面図 (a)正面図 (b)、右側 面図（a)および断面図（d)である。
圆 37]液体混合装置の層構造と張り合わせ工程を示す図である。
[図 38]他の層構造にっ 、て示す断面図である。
[図 39]液体混合装置の合流部について他の構成を示す断面図である。
[図 40]複数の液体導入口を有する態様 1 - 4の構成例を示す図である。
[図 41]図 40の装置に使用できる分岐状電極の構成例を示す図である。
[図 42]複数の液体導入口を有する態様 1 4の他の構成を示す図である。
圆 43]図 40又は図 42の液体混合装置の制御手段および方法を説明するための図 である。（態様 2 - 1)
圆 44]態様 2-1の液体混合装置の一例を示す図である。
圆 45]本態様の液体混合装置の他の例を示す図である。
圆 46]本態様の液体混合装置の他の例を示す図である。（態様 2-2)
圆 47]態様 2-2の液体混合装置の一例を示す概略図である。
圆 48]本態様の液体混合装置の別の例を示す概略図である。
[図 49]本態様の液体混合装置の更に別の例を示す概略図である。
[図 50]本態様の液体混合装置の更に別の例を示す概略図である。
圆 51]本態様の液体混合装置における液体の導入形態を示す模式図である。 圆 52]本態様の液体混合装置の更に別の例を示す概略図である。
圆 53]本態様の液体混合装置の更に別の例を示す概略図である。（態様 2-3) 圆 54]本態様 2-3の液体混合装置を示す概略構成図である。
[図 55]図 54の装置の柱形状の微小構造物群の例を示す図である。
[図 56]溝形状の微小構造物群を有する本態様を示す概略構成図である。
圆 57]溝形状の微小構造物群の例を示す模式図である。
圆 58]溝形状の微小構造物群の他の例を示す模式図である。（態様 A) 圆 59a]態様 Aのマイクロチップ電気泳動装置の基本構成の一例を模式的に示す概 念図である。 圆 59b]態様 Aの基本構成の他の例を示す概念図である。
[図 59c]態様 Aの基本構成の更に他の例を示す概念図である。
[図 59d]態様 Aの基本構成の更に他の例を示す概念図である。
圆 60]態様 Aのための変性剤濃度勾配形成部の構成例を示す模式図である。
圆 61]変性剤濃度勾配形成部の別の例を示す模式図である。
[図 62]態様 Aのための試料導入部の例を示す模式図である。
圆 63]態様 Aの一例を示す模式図である。
[図 64]態様 Aの他の例を示す模式図である。
圆 65]高速バルブを設けた態様 Aの変性剤濃度勾配形成部を示す模式図である。 圆 66]高速バルブを設けた別の変性剤濃度勾配形成部を示す模式図である。 圆 67]高速バルブを設けた態様 Aの一例を示す模式模式図である
圆 68]高速バルブを設けた態様 Aの他の例を示す模式図である (態様 B) 圆 69]態様 Bによる第 1の形態の変性剤間欠配置を示す概念図である。
圆 70]態様 Bによる第 2の形態の変性剤間欠配置を示す概念図である。
圆 71]変性剤間欠配置を有する平板ゲルを含む泳動装置の概略構成を示す斜視図 である。
[図 72]マイクロチャンネルに形成される変性剤間欠配置を示す概念図である。
[図 73]態様 Bによるマイクロチップ電気泳動装置の一例を示す図である。
[図 74]態様 Bによるマイクロチップ電気泳動装置の別の例を示す図である。
[図 75]態様 Bによるマイクロチップ電気泳動装置の別の例を示す図である。
[図 76]図 75の装置を構成する各基板の構成図である。
[図 77]態様 Bによるマイクロチップ電気泳動装置の別の例を示す図である。
圆 78]態様 Bのための緩衝液領域配列を形成する装置の概略構成を示す斜視図で ある。
[図 79]平板ゲルに緩衝液領域配列を形成するのに適した装置の概略構成を示す斜 視図である。
[図 80]態様 Bのための緩衝液領域配列の形成方法の一例を示す概念図である。 圆 81]態様 Bのための変性剤含有緩衝液領域の長さの調整方法を示す概念図であ る。
[図 82]態様 Bの原理を説明するための図である。
[図 83]緩衝液領域配列の形成のための高速作動バルブを設置した装置を模式的に 示す。
[図 84]緩衝液領域配列の形成のための射出手段の一例を模式的に示す。
符号の説明
(態様 1 1;図 1一 7)
5;第 1のリザーバー、 6;第 2のリザーバー、 7;第 1の液体導入用マイクロチャンネル 、 8;第 2の液体導入用マイクロチャンネル、 9;混合用マイクロチャンネル、 10;第 3の リザーバー、 11;第 1の電極、 12;第 2の電極、 13;第 3の電源、 14;第 1のポンプ、 1 5;第 2のポンプ：
(態様 1 2;図 8— 29)
130;液体導入用マイクロチャンネル、 131;混合用マイクロチャンネル、 132;高速 作動バルブ：
(態様 1 3;図 30— 35)
205;第 1のリザーバー、 206;第 2のリザーバー、 207;第 1の液体導入用マイクロ チャンネル、 208;第 2の液体導入用マイクロチャンネル、 230;混合室、 233;混合用 マイクロチャンネル、 234;予混合用マイクロチャンネル、 235;接続部：
(態様 1-4;図 36— 43)
330;液体導入用マイクロチャンネル、 330a;液体導入口、 331;混合用マイクロチ ヤンネル、 X；分岐方向、 Y;合流方向：
(態様 2—1；図 44一 46)
405;第 1のリザーバー、 406;第 2のリザーバー、 407;第 1の液体導入用マイクロ チャンネル、 408;第 2の液体導入用マイクロチャンネル、 430;合流部、 431, 432, 451, 452;導入用マイクロチャンネル、 433, 453;混合用マイクロチャンネル、 435 ；ヒータ、 440, 450;合流部、 441, 442;導入用マイクロチャンネル、 443;混合用マ イク口チャンネル、 445、 455;ヒータ：
(態様 2— 2;図 47— 50) 505;第 1のリザーバー、 506;第 2のリザーバー、 507;第 1の液体導入用マイクロ チャンネル、 508;第 2の液体導入用マイクロチャンネル、 509, 533;混合用マイクロ チャンネル、 535, 536;混合対象の液体、 510, 537;振動子、 538;ノ レブ、 511; 可動揚力面、 512;回転子、 513;揺動子：
(態様 2— 3;図 54— 57)
707;第 1の液体導入用マイクロチャンネル、 708;第 2の液体導入用マイクロチャン ネル、 709;液体混合用濃度勾配領域チャンネル (混合用マイクロチャンネル）、 709 a;濃度勾配領域チャンネル下面、 709b;濃度勾配領域チャンネル上面、 730;合流 部、 731;微小構造物群：
(態様 A;図 59— 68)
801;マイクロチップ、 802;変性剤濃度勾配形成部、 803;試料導入部、 804;電 気泳動部、 805;第 1のリザーバー、 806;第 2のリザーバー、 807;第 1のチャンネル（ 液体導入用マイクロチャンル）、 808;第 2のチャンネル、（液体導入用マイクロチャン ル）、 809;濃度勾配領域チャンネル（混合用マイクロチャンネル）、 810;第 1の電極 、 811;第 1の電源、 812;第 2の電極、 813;第 2の電源、 814;第 1のポンプ、 815; 第 2のポンプ、 816;第 3のリザーバー、 817;第 4のリザーバー、 818;第 4のチャンネ ル、 819;第 5のチャンネル、 820;第 3の電極、 821;第 3の電源、 822;第 4の電極、 823;第 4の電源、 824;第 5のリザーノ一、 825;第 5の電極、 826;第 5の電源
(態様 B;図 69— 84)
901；核酸分析用チャンネル（マイクロチャンネル）、 902;核酸試料導入チャンネル 、 903;マイクロチップ基板、 905;検出部、 906;変性剤含有緩衝液導入チャンネル 、 910;基板、 911;ステージ手段、 912;射出手段、 914;平板ゲル。
本発明を実施するための態様
[液体混合装置および方法]
本発明の液体混合装置は、液体を導入するための少なくとも 2つの液体導入用マ イク口チャンネル、および少なくとも 2つの液体導入用マイクロチャンネルが接続して V、る混合用マイクロチャンネルを含んでなり、各液体導入用マイクロチャンネル力も導 入された各液体が前記混合用マイクロチャンネル内で合流する液体混合装置であつ て、前記混合用マイクロチャンネル内で合流する液体間の混合を促進するための混 合促進手段を有する。
[0103] 本発明による第 1の態様において、混合促進手段は、混合される液体間の界面の 面積を増加する手段である。第 1の態様の液体混合装置の例には、下記に示される 態様 1 1、 1—2、 1—3および 1 4が含まれる。
[0104] 本発明による第 2の態様において、混合促進手段は、混合される液体間の界面を、 熱的、機械的および Zまたは構造的手段により不安定化する手段である。第 2の態 様の液体混合装置の例には、下記に示される態様 2—1、 2— 2および 2— 3が含まれる
[0105] 以下、本発明の各態様ついて順に説明する。
[0106] 餱様 1 1 (闵 4ー闵 7)
本態様の装置の混合促進手段は、液体導入用マイクロチャンネルに導入する液体 の流量を他の液体導入用マイクロチャンネルと独立して制御できる少なくとも 1つの 液体導入手段である。
[0107] 図 4は本態様の装置を示す。この装置は、第 1の試薬溶液が充填された第 1のリザ 一バー 5と、第 2の試薬溶液が充填された第 2リザーバー 6と、第 1のリザーバー 5に 通じる第 1のチャンネル (液体導入用マイクロチャンネル） 7と、第 2のリザーバー 6に 通じる第 2のチャンネル（液体導入用マイクロチャンネル） 8と、第 1のチャンネル 7と第 2のチャンネル 8が連結する第 3のチャンネル（混合用マイクロチャンネル） 9と第 3のリ ザ一バー 10とを含み、さらに第 1のリザーバー 5には、第 1の電極 11を含み、さらに 第 2のリザーバー 6には、第 2の電極 12を含み、さらに第 3のリザーバー 10には、第 3 の電極 13を含む。
[0108] 第 1の電極 11と第 3の電極 13との間に電圧 VIを印加すると、生じる電気浸透流に より第 1のリザーバー 5からは第 1の試薬溶液が第 1のチャンネル 7を通じて、第 3のチ ヤンネル 9に導入される。同様に第 2の電極 12と第 3の電極 13との間に電圧 V2を印 加すると、第 2のリザーバー 6からは第 2の試薬溶液が第 2のチャンネル 8を通じて、 第 3のチャンネル 9に導入される。
[0109] 一般的に、マイクロチャンネルでは、 2液が合流すると層流が形成され 2液が接する 界面が安定に維持される。このため拡散係数が小さい供試液の場合、拡散による混 合が十分に行われず、 2層に分離したまま混合用マイクロチャンネル内を流れること が知られて ヽる。このとき図 5 (b)の実線に示すように電圧 VIと電圧 V2に適宜変動 成分を与えると、 2液が形成する界面に不安定を生じさせ、 2液が接する界面の面積 が広くなる、あるいは界面構造を崩壊させることができるため、 2液を高速かつ均一に 混合できる。よって、電圧 VIと電圧 V2に適宜変動成分を与えることにより、第 1の試 薬溶液と第 2の試薬溶液を第 3のチャンネル 9上で任意の割合で速やかに混合でき る。さらに、電圧 VIと電圧 V2を図 5(a)の破線、一点鎖線のように連続的に変化させ れば、第 1の試薬溶液と第 2の試薬溶液の流量比を連続的に変化させることができる 。ここで図 5(b)の破線、一点鎖線のように電圧信号に変動成分を重畳させると第 1と 第 2の試薬溶液が十分混合し、第 3のチャンネル 9に試薬溶液の濃度勾配領域を速 やかに形成できる。変動成分としては、正弦波、ノコギリ波、矩形波等及びそれらの 組合せも考えられる。また、拡散の促進や流量保持のため各チャンネルの変動成分 の位相をずらすことも考えられる。
[0110] 図 6は本態様の一例を示すものである。第 1の試薬溶液が充填された第 1のリザー バー 5と、第 2の試薬溶液が充填された第 2リザーバー 6と、第 1のリザーバー 5に通じ る第 1のチャンネル (液体導入用マイクロチャンネル） 7と、第 2のリザーバー 6に通じる 第 2のチャンネル（液体導入用マイクロチャンネル） 8と、第 1のチャンネル 7と第 2のチ ヤンネル 8が連結する第 3のチャンネル (混合用マイクロチャンネル） 9と第 3のリザー バー 10とを含み、さらに第 1のリザーバー 5には、第 1の電極 11を含み、さらに第 2の リザーバー 6には、第 2の電極 12を含み、さらに第 3のリザーバー 10には、第 3の電 極 13を含む。さらに第 1のリザーバー 5と第 2のリザーバー 6に、それぞれ第 1のボン プ 14と第 2のポンプ 15を付加した構造である。
[0111] これらのポンプによる送液により、図 4における電気浸透流による送液を補助するこ とができ、試薬溶液の粘性が高 、場合にぉ 、ても比較的高速で送液することができ る。この場合、図 7 (b)の実線に示すように第 1のポンプ 14と第 2のポンプ 15の送液 圧に適宜変動成分を与えると、 2液が形成する界面に不安定を生じさせ、 2液が接す る界面の面積が広くなる、あるいは界面構造を崩壊させることができるため、 2液を高 速で均一に混合できる。よって、第 1のポンプ 14と第 2のポンプ 15の送液圧に適宜 変動成分を与えることにより、第 1の試薬溶液と第 2の試薬溶液を第 3のチャンネル 9 上で任意の割合で速やかに混合できる。さらに、第 1のポンプ 14と第 2のポンプ 15の 送液圧を図 7(a)の破線、一点鎖線のように連続的に変化させれば、第 1の試薬溶液 と第 2の試薬溶液の流量比を連続的に変化させることができる。ここで図 7(b)の破線、 一点鎖線のように送液圧に変動成分を重畳させると第 1の試薬溶液と第 2の試薬溶 液が十分混合し、第 3のチャンネル 9に試薬溶液濃度勾配領域を形成できる。また図 6において、ポンプ 14とポンプ 15の送液圧および電極 11と電極 12の付与電位を同 時に制御し、さらに効果的な拡散促進と濃度勾配の制御を実施することも可能である 。変動成分としては、正弦波、ノコギリ波、矩形波等及びそれらの組合せも考えられる 。また、拡散の促進や流量保持のため各チャンネルの変動成分の位相をずらすこと も考えられる
11^1-2 (^18-^122)
本態様の装置の混合促進手段は、少なくとも 1つの液体導入用マイクロチャンネル に設けられた高速作動バルブである。
[0112] 図 8は、本態様のマイクロチップ装置のチャンネルの概略構成を示し、図 9は本態 様のマイクロチップの具体的な構成を示す。このマイクロチップのマイクロチャンネル は、 2つの液体導入用マイクロチャンネル 130a, 130b及びこれらが合流する 1つの 混合用マイクロチャンネル 31からなる。本態様に従い、液体導入用マイクロチャンネ ルの 1つには高速動作バルブ 132が取り付けられている。
[0113] 図 9はマイクロチップ全体の構成を示す。また図 10は高速作動バルブ機構の部分 を拡大して示し、図 11はその高速作動バルブの断面を示す。図 9に示すように、液 体導入用マイクロチャンネルの各リザーバー力も A液と B液がシリンジポンプ Pで加圧 され、各液体導入用マイクロチャンネル 130a, 130bにそれぞれ導入され、 1つの混 合用マイクロチャンネル 131で合流する。 A液を導入する液体導入用マイクロチャン ネル 130aの途中にはピエゾ素子駆動による高速作動バルブ 132が備えられている 。その高速作動バルブが開閉することで、 A液の液体導入用マイクロチャンネル 130 aから混合用マイクロチャンネル 131への導入が制御される。高速作動バルブ 132の 制御により A液の流入量に変動が与えられ、混合用マイクロチャンネル 131内に供給 される液の A液と B液の混合比等を制御できる。
[0114] 高速作動バルブは、図 11 (液体導入用マイクロチャンネル 30aの軸方向断面)及び 図 12に示されるように、液体導入用マイクロチャンネル 130aの一部を含む。その部 分は、 PDMS (ポリジメチルシロキサン）製の膜でできた厚さ 20 μ m、幅 300 μ m程度の 弁体 133である。同じチャンネル内で弁体に近接するところに突起 134を設け、弁体 133に対し外部から当接する φ 250 μ m程度の圧子 135を設けて、この圧子 135が ピエゾ素子により駆動される構成となっている。弁体 133と突起 134との間の空間は 10 m程度の微細間隙 hとなっている。弁体 133が応答周波数 10kHz以上で動作す るピエゾ素子により直接上下に高速駆動されることによってその微細間隙 hの開閉が 行われる。
[0115] 本態様に使用される高速作動バルブによる好都合な機能は、バルブ開閉動作が高 速性であること、およびその開閉時の作動体積 (バルブの弁体が動 、てチャンネルを 閉ざす際にチャンネル内にあった液体が押しのけられる体積に相当する）が小さいこ とである。この点、本態様のようにチャンネル内の突起を半円柱状等にして弁体が突 起と線接触に近い形で接触するようにし、また弁体が上下するストローク (h)も 10 m 程度の微小にすることが好ま U、。
[0116] また、本態様に使用できる他の高速作動ノ レブとしては、インクジェットプリンタで用 いられているようなバルブがある。例えば、熱で液体導入用マイクロチャンネルを局所 的に加熱することにより、液体導入用チャンネル内を流れている液体を気化させて体 積を膨張させ、これによつての液体導入用チャンネルカゝら混合用マイクロチャンネル への一定の微小流量の吐出を高速で制御できるバルブを用いてもよい。
[0117] 図 13及び図 14を参照して、高速作動バルブに使用される半円柱状の突起 134の 製作方法を説明する。ガラス基板に 50 mの厚膜レジストを塗布し、フォトリソグラフィ 一工程でチャンネル形成パターンを g線 (波長 436應の紫外光）に露光し、現像する 。図 13に示すように、液体導入用マイクロチャンネルのチャンネル幅は例えば 100 mであり、半円柱状突起を形成する部分に直交するようチャンネル幅 100 mのライン パターンを施す。図 14 (図 13の A— A断面）に示すように、そのブリッジパターンを半 円柱状の突起形状に変形させるため、レジストパターユングしたガラス基板を恒温炉 に投入し、 300°Cで 20分間加熱処理を施す。これによりレジストは 250°C以上では軟 化するため、エッジが表面張力で丸く変形し、最終的には半円柱形状になる。次い でこの基板をドライエッチングにかける。ガラス基板をエッチングすると、レジストも一 緒にエッチングされていくため、結果としてレジスト形状をガラス基板にそのまま転写 できる。このような加工は RIE (Reactive Ion Etching)を用いてもできる力 形状の転写 性を良好に行うには中性粒子ビーム力卩ェが好ま 、。このようにして液体導入用マイ クロチャンネル内に適切な突起構造を形成することができる。
[0118] 本態様に使用される高速作動バルブの"高速での開閉動作"とは、弁体の応答周 波数として、約 10Hz以上、好ましくは 10— 20kHzの周期を持つ動作を意味する。
[0119] 次に図 15— 21を参照し、本態様の液体混合方法について説明する。
[0120] 上述の構成のマイクロチップにおいて A液と B液を導入する時に、 A液の液体導入 用マイクロチャンネル上に設置された高速作動バルブを一定の周期で、高速で開閉 動作させる。そのように液体の流量に短い時間間隔で変動を与えると、混合用マイク 口チャンネル内に形成される A液と B液との間の接触界面は、図 15の混合用マイクロ チャンネル 31中に描かれたような"ひだ (wave) "形状となる。高速作動バルブを通過 して導入される液体 Aは、混合用マイクロチャンネルの幅方向に占める割合が短！ヽ時 間で連続的に変化させることができる。したがって、液体 Aは、混合用マイクロチャン ネル内にぉ 、て合流する他の液体 Bとの接触面積が増加する。このようにして 2液の 接触界面が広くなり、 2液の拡散混合が進みやすくなる。
[0121] 高速作動バルブを使用しない従来のやり方では、図 28に示すように 2液の界面は 混合用マイクロチャンネル内でほぼ直線的に形成される。例えば、幅 200 mのチヤ ンネルで流れの進行方向に単位長さをとつたとき、高速作動バルブを使用すること〖こ より形成された 50 m周期で幅 100 mのひだ形状の界面（図 15参照）を、平らな界 面（図 28参照）と比較すると、ひだ形状を正弦波で近似すれば、その表面積は 4倍に 広がっている。
[0122] 2つの界面間のひだの形成により混合時間がどの程度短縮するかは、次の計算モ デルで示される。図 16のモデルにおいて、ひだの周期が Lのとき、その半分の L/2ま で拡散が進めば、実際はひだの両側力 拡散が進むので混合が完了したと考えられ る。液体の拡散についての単純拡散の計算モデルは、次式で記述される（D =拡散
0 係数 [m2/sec] (変性剤； 10"10,水； 10— 9とする）、 t=時間 [sec])：
式 1
[0123]
Figure imgf000034_0001
[0124] 例えば、変性剤 (拡散係数 D = 10— u)の場合、 5分で混合を完了するように周期 L =
0
2 σを設計するなら、その計算は次式で示される。
式 2
[0125]
び = X 10 — 1 1 X 300 [ m ]
Figure imgf000034_0002
[0126] 上記のように拡散距離 σが 77 [ m]となる。これは、ひだ間の間隔が 50 μ mならば 5 分で混合を完了できることを示す。この時間は、 DGGE分析を行うには十分に短い。
[0127] 図 17の装置では、図 15の混合装置よりも更に混合効率を高めることができる。この 装置には、 2つの液体 A, Bのための 2つの液体導入用マイクロチャンネルの各々に 高速作動バルブ (バルブ Aとバルブ B)が設置されている。この態様に好適な高速作 動バルブの運転タイムチャートの例を図 18及び図 19に示す。
[0128] 前記の態様の装置では、図 18に示すように、バルブ Aとバルブ Bとの開閉動作を同 期させて、バルブ A力 '開"のときはバルブ Bを"閉"に、逆に、バルブ Aが"閉"のとき はバルブ Bを"開"にする。こうすることにより混合用マイクロチャンネル内で A液が形 成するひだ形状の幅をチャンネルの全幅分に広げることができる。また、 A液と B液の 両者の流量の和は常に一定となるので、一定の流速で混合用マイクロチャンネル内 を液体が流れる。したがって、混合用マイクロチャンネル内に濃度勾配を作成するの に好ましい制御特性が得られる。なお、態様 1 2を使用して濃度勾配を形成する方 法については後述する。
[0129] 図 17の装置では、 2液界面の表面積が図 14の場合の 2倍となり、すなわち、ひだが 形成されない場合（図 28)の 8倍となる。図 18ではバルブの開閉を全開 Z全閉制御 している。しかし、バルブ開度は、全閉又は全開いずれかの開閉制御だけでなぐピ ェゾ素子を使用し、ピエゾ素子に与える電位を調整することにより、バルブ開度を可 変制御してもよい。例えば、図 19のような運転タイムチャートで運用してもよい。いず れにしても、運転タイムチャートは前記の方式に限定されず、他の様々な方式でバル ブの開閉を制御可能である。
[0130] 図 20の装置では、また更に混合効率を高めることができる。この装置では、 3本の 液体導入用マイクロチャンネル 130a, 130b, 130cが混合用マイクロチャンネル 131 に接続する。 A液は、中心位置の液体導入用マイクロチャンネル 130aから混合用マ イク口チャンネル 131に導入され、 B液は、その両脇に位置する 2つの液体導入用マ イクロチャンネル 130b, 130c力ら導入される。それら 2つの液体導入用マイクロチヤ ンネル 130b, 130cに高速作動バルブ（バルブ 1とバルブ 2)を各々設置している。こ れらを、例えば、図 21の運転タイムチャートに示すように開閉動作させることができ、 これにより図 20の混合用マイクロチャンネル 131内に描かれたようなひだ形状の界面 を形成できる。この 2液の接触界面（ひだの全表面積）は、図 15の場合の 2倍となり、 すなわち、ひだが形成されないの場合（図 28)の 16倍の界面表面積が得られ、これ により非常に高効率な液体混合を実現できる。ここでは A液と B液の 2液体混合を示 したが、 B液を送るための 2つの液体導入用マイクロチャンネル 130b, 130cのいず れか一方を C液用にすれば、混合用マイクロチャンネル 131で A、 B、 Cの 3液を好適 に混合できる。
[0131] 次に図 22— 25を参照して、本態様によって液体導入を制御する方法について説 明する。
[0132] A液と B液とを混合用マイクロチャンネル内で濃度勾配を持つように混合する方法 にお 、て、 A液及び B液として異なる濃度の溶質 (例えば核酸変性剤）を含有する液 体を使用することができる。この場合に適するように、上で説明した装置においてバ ルブの開閉動作の運転方法を変えることで可能である。濃度勾配を形成する混合方 法の一例は、高速作動バルブの開閉周期を一定とし、その 1周期のうち、バルブが開 V、て 、る時間の割合 (Duty比）を可変制御することである。
[0133] 例えば、バルブ Aとバルブ Bの動作を、図 23の運転タイムチャートのように動作させ れば、異なる濃度を持つ 2液の界面のひだ形状をその大きさを漸次変化させながら 形成することができる（図 22の混合用マイクロチャンネル内に描いたように)。その後 、 5分程度放置すれば、その界面を通じて 2液間のすみや力な拡散混合が起き、混 合用マイクロチャンネル 31内に一定の濃度勾配を持つ混合液を形成することができ る。
[0134] 濃度勾配を形成する混合方法に好適な運転タイムチャートの例について図 23を用 いて説明する。まず基本は、バルブ Aカ '開"のときバルブ Bは"閉"、逆にバルブ Aが "閉"のときバルブ Bは"開"である。この基本に従いながら、 1周期の時間をたとえば 100 msec (ミリ秒）と設定し、はじめの 1周期では、 90 msec間、バルブ Aを"開"にする 。次の 2周期目では 80 msec間、バルブ Aを"開"にする。さらに次の 3周期目では 70 msec間、バルブ Aを"開"にする。このようにして 1周期中のバルブ Aの開時間を徐々 に短くしていくと、混合用マイクロチャンネル内に濃度が下流方向（図面の左側から 右側に向力つて)で徐々に 1次線形で濃くなる濃度勾配が得られる。
[0135] 前記の方式でも十分に拡散混合が進むが、図 24と図 25に示す装置と方法によれ ばさらに拡散混合が改善される。この方式では、図 25の運転タイムチャートに示すよ うに、バルブ Aカ '開"の時間 T1は固定し、バルブ Aが"閉"の時間 T2を変化させる。 T1は、好ましくは、高速作動バルブが動作できる最短のパルス時間程度に設定する 。例えば、バルブの応答周波数が 1 kHzであれば、最少作動時間である 1 msecの数 倍の 5 msecに T1を設定する。そして、図 22のような濃度勾配を形成するなら、 T2を 徐々に長く設定していけばよい。そのようにすれば図 22の場合よりも A液と B液との 界面が増えるので、拡散混合がより高速で進み、短時間で混合が完了する。
[0136] 以上の説明では、 2つの液体導入用マイクロチャンネルを合流させて 1つの混合用 マイクロチャンネルへ送液する例を示した。しかし、図 26のようにその混合構成単位 を何段にも組み合わせて、多数回の混合を行うこともできる。この場合、各所に導入 される液体は種類を変えてもよいことは言うまでもない。また図 27のように、 2つ以上 の多数の液体導入用マイクロチャンネル（同図では 4本の液体導入用マイクロチャン ネル）を一度に 1つの混合用マイクロチャンネルに導入して混合を行うとしてもよい。
[0137] 餱様 1 3 (図 30—図 35)
本態様の装置の混合促進手段は、混合用マイクロチャンネルの形状に関するもの であり、混合用マイクロチャンネルのチャンネル高さをそのチャンネル幅よりも小さくす ることにより形成された混合室である。
[0138] 図 30に示す本態様の装置は、混合対象の液体を導入するための 2つの液体導入 用マイクロチャンネル 207, 208と、 2つの液体導入用マイクロチャンネルを上下方向 に積層して合流させた 1つの予混合用のマイクロチャンネル 234と、予混合用マイク 口チャンネルに連結された混合室 230とを含む。予混合用のマイクロチャンネル 234 と混合室 230が混合用マイクロチャンネルを構成する。
[0139] 本態様の装置においては、混合対象の液体が液体導入用マイクロチャンネル 207 , 208から導入され、混合対象の液体が上下方向に積層して合流され、液体導入用 マイクロチャンネルに連結された予混合用マイクロチャンネル 234へ導入され、合流 した液体が予混合用マイクロチャンネルに連結された混合室 230へ導入される。本 態様にお ヽては、液体導入用マイクロチャンネルおよび予混合用マイクロチャンネル という狭いチャンネルを通ってきた液体が扁平型の混合室 230に導入されることによ り、液体間の界面面積が増大し、それによつて複数の液体の混合が促進される。
[0140] 本態様の装置においては、液体導入用マイクロチャンネル 207, 208の上流にリザ 一バー 205, 206を接続することができ、この場合、リザーバー 205, 206へ 2種類の 液体を供給する。液体の供給は、公知のいかなる方法によって行うことができ、例え ば、機械的あるいは電気的駆動力によって行うことができる。具体的には、送液ボン プゃバルブにより流量を調節することによって行うことが可能である。例えば、リザー バー間での印加電圧または付与電位を調節することによる電気浸透流の制御、マイ クロシリンジ等による送液の圧力を調節することによる送液ポンプの制御により、各液 体の流量を調節することができる。
[0141] 本態様にぉ 、て混合対象の液体は 2種類である力 これに限られず、混合される液 体は 2種類以上であってよい。また、本態様において液体導入用マイクロチャンネル は 2つであるが、これに限られず、液体導入用マイクロチャンネルは 2つ以上にするこ とがでさる。
[0142] 本態様において、チャンネル高さとは、複数の液同士が接することで形成される液 接触界面に対して垂直な方向のチャンネル寸法を意味し、チャンネル幅とは、液接 触界面に平行で、流れの方向に垂直な方向のチャンネル寸法を意味する。本態様 において、例えば、予混合用マイクロチャンネル 234についてはチャンネル幅を 500 μ m、チャンネル高さを 100 /z m、混合室 230についてはチャンネル幅を（最大とな る箇所において） 10mm、チャンネル高さを 5 mとするように設計することができる。
[0143] 本態様による液体の混合プロセスをより詳細に説明する。まず、本態様においては 、液体導入用マイクロチャンネルおよび予混合用マイクロチャンネル内の液体の流れ は実質的に層流である。というのは、液体導入用マイクロチャンネルゃ予混合用マイ クロチャンネルの幅が狭いためである。なお、この傾向は、液体導入用マイクロチャン ネルを流れる液体の流量が小さい場合、より顕著である。その結果、予混合用マイク 口チャンネルにおいては、各液体間の界面でのみ混合が生じる力 液体間の界面の 面積が小さいため各液間の混合は生じにくい。一方、合流した液体がこの予混合用 マイクロチャンネル力 混合室へ流入すると、混合室にお 、ては液体間の界面面積 が大きくなるため、界面における拡散混合によって混合対象の液体が十分速やかに 混合される。
[0144] 液体導入用マイクロチャンネルは混合室と直接接続されていてもよいし、図 30の態 様ように混合室の上流に予混合用マイクロチャンネルが設けられて 、てもよ 、。しか し、図 30の態様ように混合室の上流に予混合用マイクロチャンネルを設けることが好 ましい。なぜなら、予混合用マイクロチャンネルがなぐ 2つの液体導入用マイクロチヤ ンネルから直接に混合室に接続した場合、チャンネル幅が急激に拡がるため、流れ が乱れてしまうからである。本態様のように混合室の上流に予混合室を設けた場合、 流入する液の流れは乱れな 、。
[0145] ここで、予混合用マイクロチャンネルおよび混合室における液体の混ざりやすさを 検討する。界面での拡散混合を考えた場合、液体の混ざりやすさは、単位チャンネ ル長あたりのチャンネル体積 (V)と接触界面面積 (s)との比（sZv)に依存する。こ の比（SZV)は、チャンネル高さ（H)によれば 1ZHと表すことができるので（図 31参 照、 L;チャンネル長さ、 W;チャンネル幅、 H;チャンネル高さ）、液体の混ざりやすさ はチャンネル高さ（H)にのみ依存することが分かる。
式 3
[0146]
S ZV= 1 /H
S ： 接触界面面積 [ /z m2]
V ： 流路体積 ]
H ： 流路髙さ m]
[0147] 例えば、予混合用マイクロチャンネルの各液のチャンネル高さが 50 μ mであり、混 合室の各液のチャンネル高さが 2. 5 mである場合について検討すると、チャンネ ル体積 (V)と接触界面面積 (S)との比（SZV)は、予混合用マイクロチャンネルで 1 /50 ( μ m"1)、混合室で 1/2. 5 ( μ m"1)となる。したがって、混合室は予混合用マ イク口チャンネルより 20倍ほど混ざりやす!/、と!/、える。
[0148] ここで、本態様の装置にお!、ては、液体導入用マイクロチャンネルをチャンネルの 高さ方向で合流させる。チャンネルの高さ方向で合流させることによって、混合室に おける液体間の界面が十分広くなり、各液間の混合が速やかに行われるためである 。逆に、チャンネル幅方向に合流させた場合（図 32)、液体間の界面面積がチャンネ ル体積に対して小さくなり、液体を速やかに混合することが困難になる。本態様の液 体混合装置は、液体導入用マイクロチャンネルが上下方向に積層されて合流して予 混合用マイクロチャンネル、および混合室へと接続されて ヽる。
[0149] 次いで、混合室内での混合時間について検討する。一般に、液体の拡散は単純拡 散の方程式によって記述することができる。
式 4 Do 拡散係数 [m 2 Z s e c ]
t 時間 [ s e c ]
a 拡散距離 [m]
[0151] この方程式は、拡散係数が D (m2Zsec)である 2つの液体を接触させると、時間 t (
0
sec)にお 、て σ (m)まで拡散して互いに混合すると!/、うものである。
[0152] 例えば、変性剤の拡散係数 D力 11である場合、 5秒後の拡散距離 σは 10 m
0
である。したがって、チャンネル高さが 20 m以下ならば、理論的には 5秒で混合を 完了させることができる。実際、本態様における拡散においては、上下 2液の両方か ら拡散が進むため、混合室のチャンネル高さを Lとすると、その半分の LZ2まで拡散 が進めば、ほぼ混合は完了したと考えてよい。 5秒で混合を完了したい場合、実際に はチャンネル高さを 10 μ mに設計することができる。なお、マイクロチップ DGGEを 行う場合、 5秒という混合時間は十分に短いため、本態様の液体混合装置はマイクロ チップ DGGEに好適な液体混合装置と 、える。
[0153] また、以上の検討から、チャンネル高さを小さくすれば混合時間を短縮できることが 理解できる力 チャンネル幅がチャンネル高さと同じように小さいと、流せる流量が小 さくなり、産業応用上、実用的でない。したがって高速に送液し、かつ、混合時間を 短くするために、チャンネル幅を、チャンネル高さよりも長くすることが好ましい。
[0154] 図 33は、別の態様を示す。この態様の装置は、混合対象の液体を導入するための 2つの液体導入用マイクロチャンネル 207, 208と、 2つのチャンネルが上下方向に 積層して合流した 1つの予混合用マイクロチャンネル 234と、予混合用マイクロチャン ネルと混合室とを連結する接続部 235と、接続部に連結された混合室 230とを含む。 ここで、本態様の液体混合装置においては、予混合用マイクロチャンネルと混合室と 力 なだらかな勾配を備えた合流部 235によって連結されている。
[0155] 本態様のように予混合用マイクロチャンネルと混合室とがなだらかに連結されてい ることが好ましい。なぜなら、予混合用マイクロチャンネルと混合室とがなだらかに連 結されている場合、予混合用マイクロチャンネルと混合室との合流部において、淀み 領域が発生せず、チャンネルの途中で液体が渦を卷くことがないため、各液体間の 界面が乱れず、液体を流した順に混合して混合室カゝら取り出すことができるからであ る（図 34a)。一方、接続部を徐々に先広がりな形状にしない場合、淀み領域が生じ、 そこに渦が発生してしまう。その結果、複数の液体を液体導入用マイクロチャンネル 力 同時に注入したとしても、淀み領域で液体が滞留し、ピンポイントで混合すべき 液体が時間的に前後して混合室に到達し混合されることになり、精密な濃度勾配を 形成することが難しくなつてしまう（図 34b)。特に、正確な濃度勾配を形成することが 望まし 、マイクロチップ DGGEにお!/、ては、本態様の液体混合装置は好適である。
[0156] 図 33の態様においては、例えば、予混合用マイクロチャンネル 234についてはチ ヤンネル幅を 500 μ m、チャンネル高さを 100 μ m、接続部 235についてはチャンネ ル流れ方向の長さを 15mm、混合室 230についてはチャンネル幅を 10mm、チャン ネル高さを 5 μ mと設計することができる。
[0157] 図 35は、また別の一態様を示す。この態様の装置は、混合対象の液体を導入する ための 2つの液体導入用マイクロチャンネル 207, 208と、液体導入用マイクロチャン ネルが合流した 1つの混合用マイクロチャンネル (混合室 230)とを含む。本態様にお いては、混合対象の液体が液体導入用マイクロチャンネル 207, 208を介して合流さ れる力 混合室 230は合流後の各液体間の界面面積が大きくなるように設計されて いる。
[0158] 図 35の態様においては、例えば、混合室のチャンネル高さを 20 μ m、チャンネル 幅を 100 mと設計することができる。本態様の装置は、基板を 2枚貼り合わせて作 製する必要がなぐガラスのドライエッチングで加工することができる。より詳細には、 パターンマスクに Niのスパッタ膜を用い ICPエッチングをおこなうことでカ卩ェすることが できる。
[0159] 餱様 1 4 (図 36—図 43)
本態様の装置の混合促進手段は、液体導入用マイクロチャンネルが混合用マイク 口チャンネルへ接続する合流部の形状、および液体導入用マイクロチャンネルの配 置等に関する。詳しくは、その混合促進手段は、液体導入用マイクロチャンネルが複 数の分岐チャンネルを有し、分岐チャンネルから混合用マイクロチャンネルへの合流 部であって、複数の分岐チャンネル同士が 3次元空間上で互い違いに配置される形 態で混合用マイクロチャンネルに接続する合流部である。
[0160] 先ず、この態様の技術背景を説明する。
[0161] 本態様は、混合する液体毎にチャンネルを細分ィ匕し、それらを入れ子的に合流さ せることにより多種の液体を層状に並ばせながら、チャンネル内を流すことにより、各 液体の接触面積を増大させ、液体間の拡散を促進することが容易になるという発見 に基づく。さらに検討を進めた結果、下記の課題が見出された。
(1)液体導入用マイクロチャンネルへの液体導入口が各々の液体につき 1つである 場合、本態様を実現するには液体毎にチャンネルに分岐させて、それらを再び合流 させる構造が必要である。この構造を 2次元形状チップの 1つの層に形成することは 容易でない。この構造は 3次元的な立体交差を必要とする。これをリソグラフィとエツ チングで製作しょうとすると、 1枚のチップの裏表にエッチングや犠牲層を形成する必 要があり製造工程が複雑となる。
(2)また、チャンネル幅 100 μ m程度のマイクロチャンネルにおいてリソグラフィ一とェ ツチングで製作を行うと、合流部が角張り、送液の際の圧力損失が大きくなる。
(3)各液体の導入方法のために 1つの液体導入用マイクロチャンネル力 分岐させる 構造をとらずに、分岐チャンネル数に応じて複数の導入口を設けることができる。この 構造によれば、 2次元形状チップの 1つの層に混合用マイクロチャンネルを形成する ことができる。し力しながら、その場合はチップの上流における、あるいは準備的段階 における液体の導入機構や導入方法が複雑になる。
(4)上記のように複数の導入口を設けた装置にぉ 、て、混合用マイクロチャンネル内 で混合液体の混合濃度比を自由に制御する方法が確立されていない。例えば、 DG GEを行うためのマイクロチップ電気泳動装置では、正確で再現性よく核酸変性剤の 濃度勾配を形成するためには、濃度勾配を精密に制御することに対応する必要があ る。
[0162] 本態様は、前記の問題を解決する液体混合装置に関する。さらに本態様は、複数 の導入口を持つ液体導入用マイクロチャンネルを有する液体混合装置にぉ 、て、マ イクロチャンネル内で速やかに試薬溶液を混合し、かつ流れ方向の濃度勾配を良好 に制御等することができる装置を提供する。
[0163] 図 36は、本態様の装置の概略構成を側面 (a) , (c)、正面 (b)及び断面 (d)で示す 。この装置は、液体を導入するための 2つの液体導入用マイクロチャンネル 330およ びこれらが接続する混合用マイクロチャンネル 331を備えたマイクロチップである。液 体は、 2つの液体導入用マイクロチャンネル 330 (図 36の左側）から入り、内部で合 流し 1つの混合用マイクロチャンネル 331で混合する。液体導入用マイクロチャンネ ル 330の各々は、櫛形状に分かれた 2つの分岐チャンネル 330aを有し、これら 2つ の分岐チャンネル同士が上下カゝら混合用マイクロチャンネル 331に接続する（この接 続方向を合流方向 Yと称する）。その合流部では、図 36 (d)の断面 DD及び断面 EE に示されるように、分岐チャンネル 330aの分岐方向 Xは合流方向 Yに対しほぼ直角 の櫛型形状である。これら分岐チャンネル 330a同士が互いに 3次元上で嚙み合わさ るように統合され、 1つの混合用マイクロチャンネルに合流する。この形態の合流部を 介して合流する液体は、マイクロチャンネル内でも速やかに均等に混ざり合うことがで きる。
[0164] 図 37は、図 36の装置の概略構成を斜視図等で示す。この装置は、所定のチャンネ ル等が形成された基板を張り合わせて製造することができる。この態様では、中間の 基板 2つの基板を張り合わせた構造である。中間の基板は、各液体導入用マイクロ チャンネル 330およびそれらの分岐チャンネル 330a並びに混合用マイクロチャンネ ル 331は各々 1枚の基板上に形成され、混合用マイクロチャンネル 331が形成されて いる（図 36 (d)の断面 BBのもの）。これを中心に、各液体導入用マイクロチャンネル が形成された 2つの基板（図 36 (d)の断面 AA及び CCのもの）を上下から張り合わせ 、さらに蓋となる基板を張り合わせる。こうして、合流方向 Y、つまり分岐方向 Xとほぼ 垂直な方向で重ね合わされた層構造を形成する。複数の分岐チャンネル 330aは 1 つの液体導入用マイクロチャンネルにこれとほぼ同一平面上で設けられる。このよう に合流する分岐チャンネル 330aは櫛歯状の構造であると言える。
[0165] 図 38では、図 36の装置と同様のチャンネル構造を分岐方向 X(つまり合流方向 Yと ほぼ垂直な方向）で張り合わせている。この態様では、分岐した分岐チャンネル毎に 基板を設けた層構造を形成する。 [0166] 図 39は、図 36の断面 FF, GG及び図 38の合流部構造に曲線的形状を適用した 構成を例示する。このように合流部のチャンネルは曲線的に構成されてもよい。この ようにすれば合流部における圧損を低減させた液体混合装置を作製できる。
[0167] 基板の材質は、ガラス、石英、プラスチック、シリコン榭脂など力も適宜選ぶことがで きる。前記のような多数層の重ね合わせや表裏の複数段階の構成はリソグラフィー · エッチング加工により製作することができる。ただし本態様の装置は、フォトリソグラフ ィー技術で製作することもでき、合流部の各チャンネルの断面形状を曲線 (概流線形 )に加工することによりより良好に圧損を低減させるとしてもよい。
[0168] 次に、液体導入を効率的に行うための態様を説明する。この態様は、複数の導入 口を持つ液体導入用マイクロチャンネルを有する装置に関する。
[0169] 図 40の装置では、試薬溶液を導入するための複数の液体導入口 330aを有する液 体導入用マイクロチャンネル 330が集合して混合用マイクロチャンネル 331に接続す る。この集合型のチャンネル構成では、液体導入用マイクロチャンネル 330が寄り集 まってできた幅は、混合用マイクロチャンネル 331のチャンネル幅と同一である。ここ で、一群の複数の液体導入口 330aは、同一の液体（同一濃度の緩衝液または同種 の試薬溶液等、図 40では第 1の試薬溶液又は第 2の試薬溶液)を液体導入用マイク 口チャンネル 330へ送る液体導入用マイクロチャンネル群に対応して ヽる。それらは 基板上に規則的な何学的配置で設けられる。幾何学的配置としては、図 40 (a)又は (b)のような直線状や円弧状、楕円状の 2次元的配置が挙げられる。またこれら装置 のように、各々の液体導入口 330a群のための各幾何学的配置は、互いに相似形で あることが好ましい。
[0170] 本態様の装置として、各液体導入口 330aに電極を設けて液体を電気浸透流により 駆動するものがある。この態様では、図 41に示すような分岐状の駆動電極を作製し、 各液体導入口群の所定の幾何学的配置に対応するように設置するとよい。図 41は、 直線的な幾何学的配置に対応した分岐電極の構成を模式的に示す。このような分岐 電極を着脱自在に設けることにより、一定の液体導入口群から試薬溶液を効率的に 駆動することができる。例えば、同一の試薬溶液を導入する複数の液体導入口 330a に対して 1つの分岐電極を使用し、複数の液体導入口 330aから同時に送液を行うこ とがでさる。
[0171] また図示して ヽな 、が、液体をポンプ圧力により駆動する装置であれば、その液体 導入口群の幾何学的配置に対応する分岐状の液圧導入管を設置して、すべての液 体導入口に同時にかつ等しく圧力をかけることができ、同様に試薬溶液体の効率的 な導入を行うことができる。また、本態様の混合装置をマイクロチップに適用する場合 、マイクロチップ装置の薄型化を可能にする。図 42に示すように、複数の液体導入口 330aの位置に対応する分岐状の駆動電極を、液体導入口とほぼ同一平面上で設 けることができる。
[0172] 次に本態様の装置に好適な液体導入の制御手段および方法につ!、て説明する。
前記のように同一の液体が一群の液体導入口 330aを通じて導入される態様では、 それらの液体導入用マイクロチャンネル群の上流にポンプ又は電気浸透流駆動機 構を設けることができる。この場合、使用されるポンプ又は電気浸透流駆動機構の数 が、同種の液体導入のための液体導入用マイクロチャンネルのチャンネル数よりも少 なくても、液体導入を適正に制御することができる。
[0173] 図 43は、電気浸透流を駆動するための制御手段の例を示す。各液体導入用マイク 口チャンネル 330からは同一試薬溶液が電気浸透流によって混合用マイクロチャン ネル 331の方向へフィードされる。ここでスィッチにより電源電位差 A-Cが印加され たチャンネルでは試薬溶液が下流にフィードされ、他の試薬溶液と層状に合流し混 合する。他方、同一試薬溶液のチャンネルでもスィッチにより電源電位差 B-Cが付 与される。これらチャンネルにおいては、適切な電位 Bを設定することにより試薬溶液 が下流に流れず且つ逆流しな 、ようにすることができる。
[0174] それら複数のスィッチのオン'オフを適宜切り替えることにより同一試薬溶液を下流 に流すチャンネルの有効本数を変化させれば、その結果、同一試薬溶液の混合用 マイクロチャンネル 331への総流入量を経時的かつ独立に変化させることができる。 同一試薬溶液を送るための液体導入用マイクロチャンネルの各群 (すなわち各試薬 溶液ごと）に設けられたスィッチ群をオンオフ制御するだけで、各試薬溶液の流入流 量を、少ない電源数で多段階的に変化させることができ、混合用マイクロチャンネル での当試薬溶液の濃度を制御できる。特にその総流入量を経時的に制御すれば、 混合後の流れ方向に形成される当試薬溶液の濃度分布を精度良く制御できる。
[0175] 複数のスィッチにはリレーを用いてもよし、また電極の代わり又はその補助として圧 力ポンプを設けて各試薬溶液毎に圧力駆動を制御してもよ、。圧力ポンプを設ける 場合には、各液体導入用マイクロチャンネルにそれぞれ制御バルブを設け、それら 制御バルブを駆動制御するようにして各試薬溶液毎の流量を変化させてもょ 、。
[0176] 餱様 2— 1 (図 44一図 46)
本態様の装置の混合促進手段は、液体導入用マイクロチャンネルおよび Zまたは 混合用マイクロチャンネルに設置されたヒータを含んでなる。
[0177] 図 44は本態様の装置を示す。本態様の装置は、混合対象の液体を導入するため の液体導入用マイクロチャンネル 431, 432と、複数のチャンネルを合流部 430で合 流させた 1つの混合用のマイクロチャンネル 433と、混合用マイクロチャンネル内の液 体を加熱するためのヒータ 435とを含む。
[0178] 本態様の装置においては、混合対象の液体が液体導入用マイクロチャンネル 431 , 432から導入され、混合対象の液体が合流部 430で合流され、合流された液体が 合流部 430に接続された混合用マイクロチャンネル 433へ導入され、ヒータ 435 (例 えば、クロム鋼ヒータ及びペルチェ素子など）により混合用マイクロチャンネル内の溶 液が加熱され、混合用マイクロチャンネル内の液体が混合される。本態様によれば、 混合用マイクロチャンネル内で合流した液体力 Sヒータ 435により加熱され、混合用マ イク口チャンネル内の液体の温度が上昇し、液体内の溶質のブラウン運動が活性ィ匕 されるため、分子拡散が促進され、複数の液体の速や力な混合が可能となる。また、 加熱による熱対流によっても、合流した液体の混合が促進される。
[0179] 液体の供給は、公知のいかなる方法によっても行うことができ、例えば、機械的ある いは電気的駆動力によって行うことができる。具体的には、送液ポンプやバルブによ り流量を調節することによって、変化させることが可能である。例えば、リザーバー間 の印加電圧または付与電位を調節することによる電気浸透流の制御、マイクロシリン ジ等による送液の圧力を調節することによる送液ポンプの制御により、各液体の流量 を調節することができる。
[0180] 本態様の装置にお!、て混合対象の液体は 2種類である力 これに限らず、混合す る液体は 2種類以上であってよい。また、本態様の液体導入用マイクロチャンネルは 2つであるが、これに限らず、 2つ以上にすることができる。
[0181] 図 45は別の態様を示す。この態様の装置は、液体導入用マイクロチャンネル 441, 442と、液体導入用マイクロチャンネル 441, 442を合流部 40で合流させた 1つの混 合用のマイクロチャンネル 443と、混合用マイクロチャンネル 443をカ卩熱するためこの マイクロチャンネル 443の下方に取り付けられたヒータ 445とを含む。本態様によれ ば、混合対象の液体が合流部 440において鉛直方向に積層されて合流され、合流 された液体が合流部 440に接続された混合用マイクロチャンネル 443へ導入され、 混合用マイクロチャンネルの下方に取り付けられたヒータ 445により、混合用マイクロ チャンネル 443内の溶液がその下面力 加熱される。こうして、混合用マイクロチャン ネル内の液体の混合が促進される。本態様においては、合流した液体力ヒータ 445 により加熱され、混合用マイクロチャンネルの下側にある液体の温度が上昇し、チヤ ンネル 443内で熱対流が生じるため、鉛直方向の対流による拡散効果が促進され、 合流した液体の混合が促進される。また、加熱による分子拡散の増大によっても、合 流した液体の混合が促進される。
[0182] 図 46はまた別の態様を示す。本態様の装置は、液体導入用マイクロチャンネル 45 1, 452と、液体導入用マイクロチャンネル 451, 452を合流部 450で合流させた 1つ の混合用のマイクロチャンネル 453と、液体導入用マイクロチャンネル 453を加熱す るためのヒータ 455とを含む。本態様によれば、ヒータ部 455により液体導入用マイク 口チャンネル 452内の溶液が加熱され、加熱されて!、な 、チャンネル 451内の液体と 加熱されたチャンネル 452内の液体とが合流部 450において、加熱されて温度の高 いチャンネル 452内の液体を下にして鉛直方向に下力も順に積層されて合流され、 合流された液体が合流部 450に接続された混合用マイクロチャンネル 453へ導入さ れる。こうして、混合用マイクロチャンネル内の液体の混合が促進される。本態様にお いては、チャンネル 452内の液体力ヒータ 455により加熱されたにもかかわらず、合 流部 450にお!/、て加熱されて!、な!/、チャンネル 451内の液体の下側に積層されて 合流されるため、加熱された液体が上側に移動しょうとしてチャンネル 453内で熱対 流が生じ、鉛直方向の対流による拡散効果が促進され、合流した液体の混合が促進 される。また、加熱による分子拡散の増大によっても、合流した液体の混合が促進さ れる。
[0183] 本態様のように液体導入用マイクロチャンネルをヒータによって加熱する場合、液 体導入用マイクロチャンネル内の液体は、高温の液体力 順に鉛直方向に下力 積 層して合流される。本態様に使用し得るヒータは、公知のあらゆる加熱装置から選択 することができる。例えば、クロム鋼ヒータやペルチェ素子を使用することができる。ヒ ータの設置位置は、チャンネル内の液体を加熱することができれば、いかる位置であ つてもよい。例えば、チャンネル壁面に設置することができる。また、ヒータの設置個 数は 1個だけでなぐ複数個であってよい。
[0184] 餱様 2— 2 (闵 47—闵 53)
本態様の装置の混合促進手段は、混合用マイクロチャンネルで合流する液体間の 界面を乱すための機械的変動手段である。第 1のタイプの機械的変動手段は、混合 用マイクロチャンネル内の合流部付近に設置された振動子、可動揚力面、回転子ま たは揺動子である。第 2のタイプの機械的変動手段は、混合用マイクロチャンネル内 の合流部付近に限らず、それより下流側の混合用マイクロチャンネルの壁面または 壁面外に設置された振動子である。
[0185] 図 47—図 50は、第 1のタイプの機械的変動手段を有する 1つの態様を示す。図 47 の装置では、合流部に振動子 510が設置されている。この装置は、第 1の液体が充 填された第 1のリザーバー 505と、第 2の液体が充填された第 2リザーバー 506と、第 1のリザーバー 505に通じる第 1のチャンネル 507 (液体導入用マイクロチャンネル）と 、第 2のリザーバー 506に通じる第 2のチャンネル 508 (液体導入用マイクロチャンネ ル）と、第 1のチャンネル 507と第 2のチャンネル 508が連結する第 3のチャンネル 50 9 (混合用マイクロチャンネル）とを含み、さらに第 3のチャンネル 509の壁面に振動子 510を含む。振動子 510は図示しない電源および駆動制御手段に接続されている。 第 1のリザーバー 505からは第 1の液体が第 1のチャンネル 507を通じて、第 3のチヤ ンネル 509に導入され、第 2のリザーバー 506からは第 2の液体が第 2のチャンネル 5 07を通じて、第 3のチャンネル 509に導入される。
[0186] 一般的に、マイクロチャンネルでは、 2液が合流すると層流が形成され 2液が接する 界面が安定に維持される。このため拡散係数が小さい供試液の場合、拡散による混 合が十分に行われず、 2層に分離したまま流れることが知られている。このときチャン ネル壁面あるいは壁面外側のごく近傍に設置した振動子 510により（あるいは 1っ以 上の複数個の振動子群により）混合部の流れ場に適宜変動成分を与えると、 2液が 形成する界面に不安定を生じさせ、 2液が接する界面の面積が広くなる、あるいは前 記揚力面により発生される渦 (渦度）によって界面構造を崩壊させること、あるいは渦 変動による負圧領域内にキヤビテーシヨンを発生させることができるため、 2液を迅速 かつ均一に混合できる。
[0187] 図 48に示す別の態様の装置では、合流部に可動揚力面 511が設置されている。こ の装置は、第 1の液体が充填された第 1のリザーバー 505と、第 2の液体が充填され た第 2リザーバー 506と、第 1のリザーバー 505に通じる第 1のチャンネル 507と、第 2 のリザーバー 506に通じる第 2のチャンネル 508と、第 1のチャンネル 507と第 2のチ ヤンネル 508が連結する第 3のチャンネル 509とを含み、さらに第 3のチャンネル 509 の合流部に可動揚力面 511を含む。可動揚力面 511は図示しな 、電源および駆動 制御手段に接続されている。第 1のリザーバー 505からは第 1の液体が第 1のチャン ネル 507を通じて、第 3のチャンネル 509に導入され、第 2のリザーバー 506からは第 2の液体が第 2のチャンネル 507を通じて、第 3のチャンネル 509に導入される。この とき合流部に設置した可動揚力面 511により界面の不安定を誘起する周波数で適宜 変動成分を与えると、 2液が形成する界面に不安定を生じさせ、 2液が接する界面の 面積が広くなる、あるいは界面構造を崩壊させること、あるいは液体内にキヤビテーシ ヨンを発生させることができるため、 2液を高速で均一に混合できる。
[0188] 図 49に示す更に別の態様の装置では、合流部に回転子 512が設置されている。こ の装置は、第 1の液体が充填された第 1のリザーバー 505と、第 2の液体が充填され た第 2リザーバー 506と、第 1のリザーバー 505に通じる第 1のチャンネル 507と、第 2 のリザーバー 506に通じる第 2のチャンネル 508と、第 1のチャンネル 507と第 2のチ ヤンネル 508が連結する第 3のチャンネル 509とを含み、さらに第 3のチャンネル 509 内に回転子 512を含む。回転子 512は図示しな ヽ電源および駆動制御手段に接続 されている。第 1のリザーバー 505からは第 1の液体が第 1のチャンネル 507を通じて 、第 3のチャンネル 509に導入され、第 2のリザーバー 506からは第 2の液体が第 2の チャンネル 507を通じて、第 3のチャンネル 509に導入される。このときチャンネル 50 9内に設置した回転子 512 (あるいは複数個の回転子列により）により適宜変動成分 を与えると、 2液が形成する界面に不安定を生じさせ、 2液が接する界面の面積が広 くなる、あるいは界面構造を崩壊させる、あるいは液体内にキヤビテーシヨンを発生さ せることができるため、 2液を高速で均一に混合できる。
[0189] 図 50に示す更に別の態様の装置では、合流部に揺動子 513が設置されている。こ の装置は、第 1の液体が充填された第 1のリザーバー 505と、第 2の液体が充填され た第 2リザーバー 506と、第 1のリザーバー 505に通じる第 1のチャンネル 507と、第 2 のリザーバー 506に通じる第 2のチャンネル 508と、第 1のチャンネル 507と第 2のチ ヤンネル 508が連結する第 3のチャンネル 509とを含み、さらに第 3のチャンネル 509 内に揺動子 513を含む。揺動子 513は図示しない電源および駆動制御手段に接続 されている。第 1のリザーバー 505からは第 1の液体が第 1のチャンネル 507を通じて 、第 3のチャンネル 509に導入され、第 2のリザーバー 506からは第 2の液体が第 2の チャンネル 507を通じて、第 3のチャンネル 509に導入される。このときチャンネル内 に設置した揺動子 513 (あるいは複数個の揺動子列により）により適宜変動成分を与 えると、 2液が形成する界面に不安定を生じさせ、 2液が接する界面の面積が広くな る、あるいは界面構造を崩壊させる、あるいは液体内にキヤビテーシヨンを発生させる ことことができるため、 2液を高速で均一に混合できる。
[0190] 上記の各態様によれば、第 1の液体と第 2の液体とを第 3のチャンネル 509上で任 意の割合で速やかに混合できる。異なる濃度の第 1の液体と第 2の液体を使用すれ ば、その混合比を連続的に変化させることにより、第 3のチャンネル 509に濃度勾配 領域を形成できる。
[0191] 図 51—図 53は、第 2のタイプの機械的変動手段を有する装置の態様を示す。この タイプの装置は、複数の液体導入用マイクロチャンネルと、複数の液体導入用マイク 口チャンネルを合流させた 1つの混合用のマイクロチャンネルと、混合用マイクロチヤ ンネル中の各液体間の界面を不安定ィ匕するための振動子とを含む。この態様では、 振動子 (好ましくは複数の振動子）が混合用マイクロチャンネルの下流側にも設けら れ、混合の促進は混合用マイクロチャンネルへの液体の導入後に行われることに特 徴がある。具体的には、混合対象の液体を各液間の接触界面が保持されるように導 入した後、液の導入を止め、次いで、前記振動子によって各液間の接触界面を不安 定化して各液体を混合する。濃度勾配を形成するなら、混合用マイクロチャンネル内 の流れ方向で 2つの液体の体積比が連続的に変化するように合流を完了させ、次い で、振動子の出力および駆動時間を制御しつつ振動子を駆動する。
[0192] 2種類の液体は、各液体導入用マイクロチャンネル力 の流量の割合を変えて導入 することにより、混合用マイクロチャンネル内に様々な形態の幾何学的パターンを形 成し得る（例えば、上記の態様 1 1および 1 2による流量制御を適用できる)。図 51 は、混合用マイクロチャンネルに形成された 2種類の液体の形態を表している。混合 対象の液体 635, 636は、複数の液体導入用マイクロチャンネルカゝら合流部を経由 して、混合用マイクロチャンネル 633に導入される力 背景技術において説明した通 り、マイクロチャンネル内では混合が進み難いため、それら液体は接触界面を保持し た状態を維持する傾向にある。 2液の割合を変えて導入すれば、チャンネルの長さ方 向に対して 2液の割合が連続的に変化するように導入することができる（図 51a及び 図 51b)。また 2液を交互に、且つその比率をチャンネルの長さ方向に対して変化す るように導入することができる（図 51c)。さらには単純にチャンネルの長さ方向を 2液 で二分するように導入することができる（図 51d)。連続的な濃度勾配を形成するには 、チャンネルの長さ方向に対して液体の体積比が連続的に変化する形態でそれらの 接触界面が安定に保持しておくことが望ましい。
[0193] 図 52は、図 51の形態に従って混合用マイクロチャンネル 633へ導入された 2種類 の液体を、混合用マイクロチャンネル 633の壁面に沿って設置された複数の振動子 を使用して混合し、濃度勾配が形成されるプロセスを表している。振動子は、混合用 マイクロチャンネル 633の壁面に沿って複数設置する。上記のように液体 635, 636 は、接触界面を保持した状態で混合用マイクロチャンネルに導入される（図 51c、図 5 2a)。次いで、振動子 637を駆動することにより液体 635, 636間の界面の不安定を 誘起する周波数で適宜変動成分を与え、各液体間の界面を不安定化させることがで きる。振動子の駆動により、各液体間の界面の面積が増大し、または、各液体間の界 面が破壊され、または、液体内にキヤビテーシヨンが発生することによって、各液体を 迅速かつ均一に混合することができる。適正な体積比を維持するように導入された 2 つの液体は、振動子の駆動によりチャンネルの長さ方向で互いに混ざり合い、チャン ネル流れ方向に一様かつ連続的な濃度勾配を形成することができる（図 52b)。
[0194] 図 53は、図 51の混合用マイクロチャンネルに導入された 2種類の液体を混合する 様子を表したものである。まず、液体 635, 636力 図 51aに示すように接触界面を保 持した状態で混合用マイクロチャンネルに導入されている（図 51a)。次いで、混合用 マイクロチャンネル端部に設置した振動子 637により界面の不安定を誘起する周波 数で適宜変動成分を与え、各液体間の界面を不安定化させる。それによつて、各液 体間の界面の面積が増大し、または、各液体間の界面が破壊され、または、液体内 にキヤビテーシヨンが発生することにより、各液体を迅速かつ均一に混合することがで きる（図 53b)。具体的には、混合後に、チャンネル内の流れ方向に対して 2液の混合 比が連続的に変化をするように、体積比を変化させつつ両液体間の接触界面が安 定に保持されるように液体 635, 636を導入し、出力および駆動時間を制御しつつ振 動子を駆動させることにより、図 53b示すような液体の濃度勾配を形成させることがで きる。
[0195] 混合対象の液体を導入する方法および装置は、公知のあらゆる方法および装置を 使用することができる。例えば、ポンプの流量を制御して 2種類の液体をそれぞれ任 意の割合で導入する方法、バルブの開閉時間を制御して混合対象の液の割合を変 化させる方法、電気浸透流駆動方式にぉ ヽて付与電位を制御して液体を導入する 方法、あるいは関らの方法（M. Yamada and M. Seki, Proc. IEEE the 16th
International Symposium on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS), 2003, pp. 347-350, 2003を参照）を挙げることができる。混合対象の液体を導入する方法およ び装置は、各液体を混合した後に、チャンネルの長さ方向に対して各液体の混合比 が連続的となるように、体積比を変化させて各液体間の接
触界面が安定に保持されるように導入できるものであることが望ま U 、。
[0196] 本態様に使用される振動子およびその駆動方法としては、公知のあらゆる手段およ び方法を使用することができる。例えば、圧電素子、静電ァクチエータ、形状記憶効 果可動素子、電磁カァクチエータ、高分子動電材による方法などを挙げることができ る。本態様で使用される液体は 2種類である力 これに限らず、 2種類以上であってよ い。また、本態様の液体導入用マイクロチャンネルは 2つである力 これに限らず、 2 つ以上でもよい。
[0197] 振動子の設置位置は、混合用マイクロチャンネル内の液体の界面を振動させること ができれば、いかなる位置であってもよい。例えば、混合用マイクロチャンネルの壁面 に設置したり（図 52)、混合用マイクロチャンネルの端部に設置することができる（図 5 3)。また、混合用マイクロチャンネルの両側に設置することや、混合用マイクロチャン ネルの壁面と端部の両方に並存させることもできる。さらに、チャンネル内の液体に振 動を伝播させることができれば、振動子をチャンネル力 離れた位置に設けてもょ ヽ 。さらに、振動子の設置個数は、 1つに限らず、複数個であってもよい。
[0198] 餱様 2— 3 (闵 54—闵 58)
本態様の装置の混合促進手段は、混合用マイクロチャンネル内の合流部付近に多 数配列された微小構造物である。
[0199] 本態様の装置の基本構成は、液体を導入する 2つ以上の液体導入用マイクロチヤ ンネルおよびそれらが接続して形成される 1つの混合用マイクロチャンネルを含んで なり、混合用マイクロチャンネル内には微小な構造物が多数配列されている。液体導 入用マイクロチャンネル力も導入されて合流した液体は、混合用マイクロチャンネル 内の微小構造物群に接触によって混合が促進される。マイクロチップ電気泳動装置 を例に挙げると、前記液体導入用マイクロチャンネルが緩衝液及び Z又は変性剤含 有緩衝液を導入するためのマイクロチャンネルであり、前記混合用マイクロチャンネ ルが濃度勾配形成領域のチャンネルである。以下、マイクロチップ電気泳動装置の 態様を説明する。
[0200] 図 54の装置は、濃度勾配領域チャンネル 709 (混合用マイクロチャンネル）内に混 合促進手段として微小構造物群を設けている。この図に示されるように、変性剤濃度 勾配形成部 2では、液体を導入するための第 1のチャンネル 707 (液体導入用マイク 口チャンネル）と第 2のチャンネル 708 (液体導入用マイクロチャンネル）が共通の合 流部 730で連結されてマイクロチャンネル 709に接続され、その合流部 730の下流 近傍にはそのチャンネル幅より微小な構造物群 731が設けられている。この微小構 造物群 731は、微細な大きさの構造物が幾何学的な配列でほぼ等間隔に列をなし、 好ましくは各列の構造物が液体の流動方向力 見て互い違いに並ぶよう設けられる 。第 1のチャンネル 707と第 2のチャンネル 8から導入された液体は合流部 730で接 触し層状になって流れるが、微小構造物群 31を通過する際にそれらの接触界面に 渦による拡散作用が生じるので、それら 2液は良好に混合されて力もチャンネル 709 の下流側 (矢印方向）へ流れる。
[0201] 図 55は、微小構造物群 731として柱状構造物の配列を備えた態様を示す。この柱 状構造物群は、混合液体の接触界面に平行で流動方向に垂直な軸を持つものとし て構成でき、図 55 (a)のような円柱でもよいし、図 55 (b)のような三角柱でもよい。微 小構造物群 731の形状は、特に限定されず、合流した液体が通過する際にその流 れが側壁から剥離し、その剥離渦の拡散作用によって速や力な混合を可能にするも のであれば、あらゆる形状を適用可能である。また、上流から核酸試料が流れてくる 場合、その流れが柱状構造物にからむため、核酸の分子量分離が可能である。
[0202] 図 56は、微小構造物群 731として、合流部 730の下流近傍でマイクロチャンネル 7 09の壁面に細 ヽ溝を規則的な幾何学形状が設けられた態様を示す。合流部 730で 合流した液体は、微小構造物群 731を通過する際に各溝に沿ってチャンネル幅方 向の流れが生じ、さらに溝縁の負からも剥離渦が生じて拡散作用が生じ、これにより 速やかな混合が可能となる。
[0203] 細い溝力もなる微小構造物群 731は、図 57のような流動方向と交差する網目状の ものでもよいし、図 58のような独立した V字状の溝を多数設けたものでもよい。これら の図で示されるように、微小構造物群 731はマイクロチャンネル 709の下面 709a及 びその上面 709bに前記の溝配列を備えている。このような微小構造物群 731は、公 知のフォトリソグラフィー技術などの微細加工技術を用いて作製することができる。
[0204] 液体混合 置の 1¾告方法
本発明の液体混合装置は、当該技術分野において周知であるマイクロチップ製造 のための慣例的な方法によって製造される。
[0205] 本発明の液体混合装置は、通常、 2枚の基板で構成されるが、 1枚の基板で構成 することもできる。マイクロチップが 2枚の基板で構成される場合、 1枚の基板には、フ オトリソグラフィー技術などの微細加工技術を用いて、幅、深さともに 10— 100 m程 度のチャンネルを形成させ、もう 1枚の基板には、超音波加工などの機械加工を用い て、リザーバー用の穴を開ける。これら 2枚の基板を、熱による溶融接合などの接着 技術を用いて貼り合わせると、所定の位置にチャンネルとリザーバーを有するマイク 口チップが得られる。
[0206] マイクロチャンネルの寸法 (幅および深さ）は、要求される仕様および可能な加工精 度に基づいて決定されるものである。また分析対象物 (例えば、 2本鎖核酸)より大き ければ lmmまで許容される。本発明に適用し得る"マイクロチャンネル"の寸法は、 概して lnm— 1000 /ζ πι、現状の加工精度から好ましくは lnm— 500nm、より好まし くは 10 μ m— 100 μ mである。
[0207] 基板の加工は、パターン幅、深さに応じて、ウエットエッチングだけでなぐドライエツ チングゃサンドブラスト力卩ェを用いてよぐ当然、マスクもフォトレジストマスクだけでな く、 Niや Crなどのメタルマスクを利用してもよい。例えば、マイクロチャンネルは、フォ トリソグラフィー技術によりレジストマスクをパターユングした後、 HFの 10%希釈液で ウエットエッチングにより形成することができる。チャンネル内の深さが異なる部分は、 マスクを変えて、複数回パター-ング工程とエッチング工程を行うことで形成すること ができる。
[0208] 基板の材料は、ガラス、石英、パイレックス (登録商標）、プラスチック、シリコン、榭 脂、金属から、用途や製造方法に応じて選択することができる。例えば、ガラス基板 の貼り合わせは、 1%に希釈した HF溶液をガラス接合面に滴下した後、両者をァライ メントして重ね、 70kPaの圧力で 60時間放置することにより行うことができる。なお、 接合は、溶融接合、真空装置内でのビーム照射を利用した直接接合などを利用する ことができる。
[0209] プラスチックの場合、マイクとチップの作製には射出成形、金型転写、ナノインプリ ンティング、ナノスタンプを利用することができ、低コストであり、大量生産、使い捨て に適する。
[0210] 液体混合 置の用涂 本発明の液体混合装置は、微少量の液体を混合することが必要とされるあらゆる装 置に適用することができる。例えば、本発明は、化学分析または生化学分析のため の分析用マイクロチップのような微小化学分析装置（ μ TAS)に適用することができ、 それら装置における微小量の液体の混合を高速ィ匕することができる。さらに化学合成 のためのマイクロリアクターでは、瞬間的な加熱や冷却機構を付加することによる中 間反応の抑制など、従来のビーカ内反応ではできな力つたファインケミカルへの応用 も可能となる。
[0211] マイクロリアクターの用途の一例は、芳香族化合物と高反応活性な炭素カチオンと を混合する場合のフリーデル 'クラフツィ匕反応において、モノ置換体だけを高収率で 得る装置である。従来のビーカ内での反応では、トリメトキシベンゼンとイミ-ゥムカチ オンを混合した場合、トリメトキシベンゼンの置換率は 80%以下、目的のモノ置換体の 収率は 40%以下、副生成物としてのジ置換体の収率が 30%以上である。しかし、本発 明を適用したマイクロリアクターによれば、それら反応体の高効率かつ迅速な混合が 可能になるため、トリメトキシベンゼン置換率は 90%以上、モノ置換体の収率は 90%以 上、ジ置換体の収率は 5%以下となり、望ましい反応生成物だけを選択的に製造でき る。その結果、同じ収量を得るのに必要とされる原料及び反応試薬の量も少なくなる
[0212] また、本発明を適用できる他の用途としてマイクロチップ電気泳動装置が挙げられ る。マイクロチップ上で電気泳動を行うことは、使用される試料や試薬が少量で足りる ；反応時間や分析時間が短縮する；反応およびプロセス処理時間が短縮され、反応 効率や生成物収率が向上する；廃液が少量である；高スループット分析に適するとい つた様々な利点を有する。特に、本発明の液体混合装置および方法を、変性剤濃度 勾配を形成するための緩衝液の混合に使用することにより、 DGGEに有用なマイクロ チップ電気泳動装置を提供することができる。
[0213] [分析対象物を分離する装置および方法]
以下、 DGGEを使用して分析対象物を分離する装置および方法について説明す る。
[0214] DGGEに関する餱様 A 態様 Aでは、変性剤濃度勾配が泳動方向に連続的に変化するように形成される。
[0215] 本態様のマイクロチップ電気泳動装置は、変性剤を異なる濃度で含有する緩衝液 を導入するための少なくとも 2つの液体導入用マイクロチャンネル、および少なくとも 2 つの液体導入用マイクロチャンネルが接続している混合用マイクロチャンネルを含ん でなり、各液体導入用マイクロチャンネルカゝら変動する割合で導入される各緩衝液が 前記混合用マイクロチャンネル内で合流することにより前記変性剤の濃度勾配領域 が形成される。
[0216] さらに好ましい態様は、混合用マイクロチャンネル内で合流する緩衝液間の混合を 促進するための混合促進手段を有する。この混合促進手段には、上で説明した態様 1—1から 2— 3までの各態様およびそれらのあらゆる組合せを適用することができる。
[0217] 餱様 Aのマイクロチップ雷気泳動装置
図 59a、図 59b、図 59c、及び図 59dは、マイクロチップ電気泳動装置の基本構造 を模式的に示す。先ずこれらを参照して本態様の基本概念を説明する。
[0218] 図 59aは、 1枚のマイクロチップ 801上に、変性剤濃度勾配形成部 802と、電気泳 動部 804とを含む。変性剤濃度勾配形成部 802は、電気泳動部 804の濃度勾配領 域チャンネル 809と連結しており、変性剤濃度勾配形成部 802から変性剤を含む泳 動用緩衝液が濃度勾配領域チャンネル 809に供給される。電気泳動部 804は、濃 度勾配領域チャンネル 809とその下流側に接続された試料導入部 803を含む。一般 的なやり方では、濃度勾配形成部 802にお 、て変性剤を異なる濃度で含有する緩 衝液同士が変化する割合で混合され、こうして得られる変性剤濃度勾配を持つ緩衝 剤領域力 濃度勾配領域チャンネル 9の上流側力 その下流側の電気泳動部 804 へ逐次導入される。
[0219] 試料導入部 803は電気泳動部 804に設けられている。精製 DNA等の核酸試料（ 以下 DNA試料）は、試料導入部 803から電気泳動部 804の濃度勾配領域チャンネ ル 809内へ導入される。チャンネル 809内の変性剤濃度勾配領域へ DNA試料が導 入されると、ここで DN A試料中の 2本鎖 DNAが塩基配列の違 ヽ〖こより分離される。
[0220] 図 59bに示すマイクロチップ電気泳動装置は、 1枚のマイクロチップ 801上に変性 剤濃度勾配形成部 802と、試料導入部 803と、電気泳動部 804とを含み、電気泳動 部 804にお ヽて、試料導入部 803は濃度勾配領域チャンネル 809を横切る形態で 濃度勾配領域チャンネル 809と連結されて ヽる。この形態で試料導入部 803を連結 することにより、電気泳動部 804の領域外から (濃度勾配領域チャンネル 809とは別 個の試料導入チャンネルから) DNA試料を導入でき、試料の導入操作が容易になる
[0221] 図 59c及び図 59dに示すマイクロチップ電気泳動装置は、 1枚のマイクロチップ 80 1上に変性剤濃度勾配形成部 802と、試料導入部 803と、電気泳動部 804とを含み 、変性剤濃度勾配形成部 802が電気泳動部 804を含み、変性剤濃度勾配形成部 8 02が電気泳動部 804を兼ねる構成となって ヽる。変性剤濃度勾配形成部 802が電 気泳動部 804を兼ねることによって、マイクロチップの小型化が可能になる上、変性 剤濃度勾配 802で形成した変性剤濃度勾配領域を電気泳動部 804に移動させる必 要がなくなる。
[0222] 次に、上記態様の各構成部分を説明する。
[0223] 以下では説明の簡略ィ匕のため、異なる濃度で変性剤を含む緩衝液として、変性剤 を含有する緩衝液と、変性剤を含有しな 、緩衝液 (本明細書では単に緩衝液と ヽぅ 場合もある）とを使用する態様について説明する。
[0224] 本態様にお 、て、一方の緩衝液が変性剤を含有するか、含有しな！、かが重要では なぐ緩衝液間の変性剤の相対的濃度差が重要である。例えば、 "変性剤を含有しな い緩衝液"が相対的に低濃度の変性剤を含有しており、 "変性剤を含有する緩衝液" 力 変性剤を含有しな ヽ緩衝液"よりも有意に高 ヽ濃度の変性剤を含有すれば同様 の効果を得られる。このような態様も本発明の範囲内である。
[0225] 図 60は、図 59a— 59dの装置における変性剤濃度勾配形成部 802の具体的構成 を示す。図 60の変性剤濃度勾配形成部 802には、一定濃度で変性剤を含有する緩 衝液が充填された第 1のリザーバー 805と、変性剤を含有しな!、緩衝液が充填され た第 2リザーバー 806と、第 1のリザーバー 805に通じる第 1のチャンネル 807 (液体 導入マイクロチャンネル）と、第 2のリザーバー 806に通じる第 2のチャンネル 808 (液 体導入マイクロチャンネル）と、第 1のチャンネル 807と第 2のチャンネル 808が合流し て形成された濃度勾配領域チャンネル 809 (混合用マイクロチャンネル）とを含む。第 1のリザーバー 805は、第 1の電源 811と接続された第 1の電極 810を含む。第 2のリ ザ一バー 806は、第 2の電源 813と接続された第 2の電極 812を含む。
[0226] 変性剤濃度勾配形成部 802において、第 1の電源 811と電極 810及び第 2の電源 813と電極 812を介して各リザーバー内に電圧を印加すると、これによつてチャンネ ル内に電気浸透流が生じる。その電気浸透流によって第 1のリザーバー 805からは 変性剤含有緩衝液が第 1のチャンネル 807を通じて濃度勾配領域チャンネル 809に 導入される。同様にして、第 2のリザーバー 806からは緩衝液が第 2のチャンネル 80 8を通じて、チャンネル 809に導入される。
[0227] 上記のように第 1の電源 811と第 2の電源 813の各電位を制御することにより、チヤ ンネル 807およびチャンネル 808からの各緩衝液の流入の割合を変えることができる 。こうして、変性剤含有緩衝液と緩衝液とを、濃度勾配領域チャンネル 809の上流点 (チャンネル 807およびチャンネル 808からの各緩衝液の合流点）において、任意の 割合で混合することができる。チャンネル 809内に連続的な変性剤濃度勾配領域を 形成するためには、第 1の電源 811と第 2の電源 813の各電位を連続的に変化させ る、好ましくは、互いに合流する 2つの緩衝液の流量間の割合を一定の速度で変化 させることにより、変性剤含有緩衝液と緩衝液の混合比を連続的に変化させる。
[0228] 図 61は、変性剤濃度勾配形成部 802について別の構成を示す。図 61の変性剤濃 度勾配形成部 802には、変性剤含有緩衝液が充填された第 1のリザーバー 805と、 緩衝液が充填された第 2リザーバー 806と、第 1のリザーバー 805に通じる第 1のチヤ ンネル 807と、第 2のリザーノ ー 806に通じる第 2のチャンネル 808と、第 1のチャンネ ル 807と第 2のチャンネル 808が合流して形成される濃度勾配領域チャンネル 809と を含む。第 1のリザーバー 805は、第 1の電源 811と接続された第 1の電極 810を含 み、その上流側に第 1のポンプ 814が接続される。さらに第 2のリザーバー 806には、 第 2の電源 813と接続された第 2の電極 812を含み、その上流側に第 2のポンプ 815 が接続される。
[0229] 図 61の変性剤濃度勾配形成部 802は、図 60に示される第 1のリザーバー 805と第 2のリザーバー 806に、それぞれ第 1のポンプ 814と第 2のポンプ 815を付カ卩した構 造である。この態様では、第 1のポンプ 814および第 2のポンプ 815を介した送液によ り、各電気浸透流による送液を補助することができ、変性剤含有緩衝液や緩衝液の 粘性が高 、場合にぉ ヽても濃度勾配領域チャンネル 809へ適正な液体導入および 変性剤濃度勾配の形成が確実になるという利点がある。
[0230] 図 61の変性剤濃度勾配形成部 802においても、第 1の電源 811と第 2の電源 813 の各電位の制御に加え、第 1のポンプ 814と第 2のポンプ 815の流量を制御すること により、第 1のリザーバー 805からは変性剤含有緩衝液が第 1のチャンネル 807を通 じてチャンネル 809に導入され、同様に第 2のリザーバー 806からは緩衝液が第 2の チャンネル 808を通じてチャンネル 809に導入される。こうして、変性剤含有緩衝液と 緩衝液とを、濃度勾配領域チャンネル 809の上流点（チャンネル 807およびチャンネ ル 808からの各緩衝液の合流点）において、任意の割合で混合することができる。チ ヤンネル 809内に連続的な変性剤濃度勾配領域を形成するためには、第 1の電源 8 11と第 2の電源 813の各電位を連続的に変化させる、好ましくは、互いに合流する 2 つの緩衝液の流量間の割合を一定の速度で変化させることにより、変性剤含有緩衝 液と緩衝液の混合比を連続的に変化させる。第 1のポンプ 814と第 2のポンプ 815は 、図 61に示されるようにそれぞれ第 1のリザーバーと第 2のリザーバーに接続されても よ！、し、第 1のチャンネル 807と第 2のチャンネル 808の上に設けられてもよ!/、。
[0231] 図 62は、図 59b及び図 59dの装置における試料導入部 803の具体的構成を示す 。図 62に示される試料導入部 803は、 DNA試料が充填された第 3のリザーバー 816 と、排出される DNA試料廃液のための第 4のリザーバー 817と、第 3のリザーバー 81 6に通じる第 4のチャンネル 818と、第 4のリザーバー 817に通じる第 5のチャンネル 8 19とを含む。第 4のチャンネル 818と第 5のチャンネル 819とは、チャンネル 809と交 差して接続され、そこで第 4のチャンネル 818と第 5のチャンネル 819とが連通する。 さらに、第 3のリザーバー 816には第 3の電極 820が接続され、第 3の電極 820には 第 3の電源 821が接続される。さらに第 4のリザーバー 817には第 4の電極 822が接 続され、第 4の電極 822には第 4の電源 823が接続される。
[0232] 試料導入部 803において、第 3の電源 821と第 4の電源 823の各電位を制御するこ とにより、 DNA試料の供給が行われる。 DNA試料は第 3の電源 821と第 4の電源 82 3の電位の制御により生じた電気浸透流と電気泳動力により第 3のリザーバー 816か らチャンネル 818, 819を通じて第 4のリザーバー 817の方へ送られる。そのプロセス において、 DNA試料は、第 4のチャンネル 818および第 5のチャンネル 819のチャン ネル 809上の交点に導入され、次いで、チャンネル 809の両端に電圧を印加する。 チャンネル 809内への電圧印加により、チャンネル 818, 819との交点に導入されて いる DNA試料断片のみがチャンネル 809内に導入される。チャンネル 809内には D NA変性剤の濃度勾配があるため、そこに導入された DNA試料は濃度勾配内で電 気泳動的に分離されることができる。
[0233] 図 63は、図 59bの装置の一態様を示す。電気泳動部 804には、チャンネル 809の 下流側には廃液用の第 5のリザーバー 824が設けられている。第 5のリザーバー 824 は、第 5の電源 826と接続された第 5の電極 825を含む。チャンネル 809の上流側に は、図 60を参照して説明した通りの変性剤濃度勾配形成部 802と、図 62を参照して 説明した通りの試料導入部 803とを含む。第 1一第 5の電源は適宜共用してもよい。
[0234] 図 63の態様において、変性剤濃度勾配形成部 2で形成される変性剤濃度勾配を 持つ緩衝剤流がチャンネル 809内に導入されることにより、チャンネル 809内に変性 剤濃度勾配領域の流れ (移動)が生じる。この変性剤濃度勾配領域上に試料導入部 803から DNA試料が導入される。ここで、チャンネル 809に上流側から導入される変 性剤濃度勾配領域は、変性剤濃度勾配形成部 802およびチャンネル 809内で生じ る電気浸透流により下流方向に移動する。その一方、チャンネル 809内に導入され た DNA試料は、変性剤濃度勾配形成部 802およびチャンネル 809内で生じる電気 浸透流による下流への移動量と、 DNA試料自身の負電荷により生じる電気泳動によ る上流への移動量との総和によって移動する。 DNA試料の正味の移動量は、変性 剤濃度勾配領域の下流方向への移動量よりも、 DNA試料自身の負電荷に起因する 上流への電気泳動の分だけ小さくなる。ここで十分時間が経過すれば、 DNA試料 は上流に位置する変性剤濃度勾配領域に到達できる。したがって、所定時間の泳動 により DNA試料中の GCクランプが付 、た 2本鎖 DNA断片力 塩基配列の違 、およ び変性剤濃度勾配に依存して、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE)によりチヤ ンネル 809の移動方向で分離される。
[0235] 本態様における DGGEの原理は、尿素やホルムアミドなどの DNA変性剤により核 酸塩基の電荷を中和するためヌクレオチド間の水素結合が切断され、 2本鎖 DNAが 1本鎖 DNAに解離する現象を利用するものである。 DNA試料は、その一端に DNA 変性剤濃度が高くても 1本鎖 DNAに解離しにくい人工的な DNA配列 (GCクランプ） を付けて PCR増幅した2本鎖 DNAを含む。 DNA変性剤の濃度勾配が形成された ゲル中で GCクランプを付けた 2本鎖 DNAを電気泳動すると、ある変性剤濃度にお いて、 GCクランプが付いていない側の 2本鎖 DNAが 1本鎖 DNAに解離し、その 2本 鎖 DNAの移動速度は小さくなる。 2本鎖 DNAが 1本鎖 DNAに解離する変性剤濃度 はその塩基配列に依存するため、同じ濃度勾配領域上で異なる塩基配列を有する 2 本鎖 DNAを泳動すると、移動距離に差が生じる。こうして 2本鎖 DNAを塩基配列の 違いによって分離することができる。
[0236] 図 64は、図 59bの装置の一態様を示す。図 64の電気泳動部 804は、廃液用の第 5のリザーバー 824と、第 5のリザーバー 824に通じるチャンネル 809と含む。第 5のリ ザ一バー 824は、第 5の電源 826と接続された第 5の電極 825を含む。この態様は、 その上流側に図 61を参照して説明した通りの変性剤濃度勾配形成部 802と、図 62 を参照して説明した通りの試料導入部 803とを含む。
[0237] 図 64の態様において、変性剤濃度勾配形成部 802で形成される変性剤濃度勾配 を持つ緩衝剤の流れ (移動）がチャンネル 809内に導入されることにより、チャンネル 809内に変性剤濃度勾配流が生じる。この変性剤濃度勾配領域上に試料導入部 80 3から DNA試料が導入される。ここで、変性剤濃度勾領域は、第 1の電源 811と第 2 の電源 813の電位による電気浸透流に加えて、第 1のポンプ 810及び第 2のポンプ 8 15の駆動によりチャンネル 809内を下流に移動する。一方、チャンネル 809に導入さ れた DNA試料は、第 1のポンプ 814、第 2のポンプ 815及び第 1の電源 811と第 2の 電源 813の電位による電気浸透流による下流への移動と、 DNA試料自身の負電荷 により生じる電気泳動による上流への移動との総和により移動する。 DNA試料の正 味の移動量は、変性剤濃度勾配領域の下流方向への移動量よりも、 DNA試料自身 の負電荷に起因する上流への電気泳動の分だけ小さくなる。ここで十分時間が経過 すれば、 DNA試料は上流に位置する変性剤濃度勾配領域に到達できる。したがつ て、所定時間の泳動により DNA試料中の GCクランプが付いた 2本鎖 DNA断片が、 塩基配列の違!ヽおよび変性剤濃度勾配に依存して、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動
(DGGE)によりチャンネル 9の移動方向で分離される。
[0238] 本態様のマイクロチップ電気泳動装置のチャンネル及びリザーバーには、高分子 マトリックスを含有する緩衝液が充填される。これは、高分子マトリックスの網目構造 や高分子マトリックスと DNAの相互作用によって、 DNAを分離できる力 である。本 態様に使用し得る高分子マトリックスは、ポリアクリルアミド、ヒドロキシェチルセルロー ス、ヒドロキシプロピノレメチノレセノレロース、ヒドロキシセノレロース、メチノレセノレロースなど のセルロース誘導体、ポリエチレンォキシド、ポリメチレングリコール、ポリプロピレング リコール、ポリビュルアルコール、ポリビュルピロリドンなどのポリオール類、デキストラ ン、プルランなど力 適宜選択される。高分子マトリックスがヒドロキシェチルセルロー スの場合は、 2本鎖 DNAの長さに依存し、 0. 01%— 3. 0%の濃度範囲にあること が好ましい。このような緩衝液の例として、トリスー酢酸緩衝液ゃトリス ホウ酸緩衝液 などがある。
[0239] 本態様に使用し得る DNA変性剤は、尿素、ホルムアミド、ホルムアルデヒド、水酸 化ナトリウムなどの強アルカリなど力 適宜選択される。好ましくは尿素とホルムアミド である。ホルムアミドと尿素を変性剤として用いた場合、一般的には、 7M尿素、 40% ホルムアミドを含む変性剤含有緩衝液を 100%変性剤含有緩衝液とし、変性剤を含 んでいない緩衝液を 0%緩衝液とする。一般的には、 60°Cで泳動する場合、変性剤 濃度勾配は、 0%— 100%または 20%— 70%の範囲である力 16S rRNA遺伝子 を用いた微生物群集構造解析の場合、 35%— 55%が好ましい。
[0240] 本態様で分析可能な DNA試料には、人の血液や細胞などのような生体試料や、 食品、土壌や河川水、海水などの環境試料、あるいは活性汚泥やメタン発酵汚泥な ど力も抽出した 2本鎖 DNAを用いる。抽出したゲノム DNAの所定の領域を、 PCR反 応などにより、一端に DNA変性剤濃度が高くても 1本鎖 DNAに解離しにくい人工的 な DNA配列（GCクランプ）を付けて増幅した 2本鎖 DNAを用いることができる。
[0241] 本態様による DNAの検出手段は、蛍光検出、発光検出、吸光検出、電気化学的 検出などから選択される。蛍光検出では、あら力じめ PCR反応のプライマーを蛍光標 識しておく方法、 PCR産物を蛍光標識する方法、あらカゝじめ PCR産物を DNA染色 剤で染色する方法、および、高分子マトリックス含有緩衝液に DNA染色剤を含有さ せ、電気泳動中に染色する方法などがある。蛍光標識物質としては、フルォレセイン 、ローダミン、 Cy3、 Cy5、 BODIPY FL、 TexasRed、 Alexa Fluorなどがある。 D NA染色剤としては、 SYBR Green, Vistra Green,ェチジゥムブロマイド、 YOY Ο— 1、 ΤΟΤΟ— 1、 thiazole orangeなどがある。検出器には、蛍光検出、発光検出 、吸光検出の場合、光電子増倍管、 UV検出器、フォトダイオード検出器などを用い ることがでさる。
[0242] 次に、本態様のマイクロチップ電気泳動装置を用いた分析について、図 63を参照 しつつその操作手順の一例を以下に示す。
[0243] 第 1のリザーバー 805、第 2のリザーバー 806、第 3のリザーバー 816、第 4のリザー ノ ー 817、又は第 5のリザーバー 824のいずれかを通じて、第 1のチャンネル 807、 第 2のチャンネル 808、チャンネル 809、第 4のチャンネル 818、及び第 5のチャンネ ル 819内に、高分子マトリックスを含有する緩衝液を充填する。毛管現象で充填され な 、場合は注射器などで圧力をかけて充填するとよ ヽ。
[0244] 前記緩衝液の充填の後、第 1のリザーバー 805には変性剤含有緩衝液を充填し、 第 2のリザーバー 806、第 4のリザーバー 817、第 5のリザーバー 824には緩衝液を 充填し、第 3のリザーバー 816には DNA試料を充填する。第 4のリザーバー 817およ び第 5のリザーバー 824には、場合により変性剤を含有しない緩衝液を充填してよい 。使用される緩衝液と DNA試料には、全て高分子マトリックスを含有させることが好ま しい。 DNA試料、第 4のリザーバー 817、第 5のリザーバー 824に充填する緩衝液に は高分子マトリックスを含有させなくてもよ 、。
[0245] 次に、第 1の電極 810、第 2の電極 812、第 3の電極 820、第 4の電極 822、及び第 5の電極 825を、第 1のリザーバー 805、第 2のリザーバー 806、第 3のリザーバー 81 6、第 4のリザーバー 817、及び第 5のリザーバー 824にそれぞれ差し込む。但し、そ れら電極は、あらかじめ第 1のリザーバー 805、第 2のリザーバー 806、第 3のリザー バー 816、第 4のリザーバー 817、及び第 5のリザーバー 824の内部にそれぞれ形成 されていてもよい。
[0246] 次に、第 5の電極 825を接地し、第 1の電極 810、及び第 2の電極 811に所定の電 位を与え、所定の変性剤濃度の緩衝液をチャンネル 809に導入する。このとき、第 4 のチャンネル 818と第 5のチャンネル 819に緩衝液が流れ込まないように、第 3の電 極 820と第 4の電極 822に所定の電位を与えることが好ましい。
[0247] 次に、まず第 4のチャンネル 818及び第 5のチャンネル 819で生じる電気浸透流速 度が 2本鎖 DNAの電気泳動速度より大きい場合には、第 4の電極 822を接地し、第 3の電極 820に所定の電圧を印加し、 DNA試料をチャンネル 809、第 4のチャンネ ル 818、第 5のチャンネル 819の交点に導入する。逆に第 4のチャンネル 818及び第 5のチャンネル 819で生じる電気浸透流速度力 2本鎖 DNAの電気泳動速度より小 さい場合には、第 3の電極 820を接地し、第 4の電極 822に所定の電圧を印加する。 どちらの場合にも、第 3のチャンネル 809に DNA試料が流れ込まないように、第 1の 電極 810、第 2の電極 812、及び第 5の電極 825に所定の電位を与えることが好まし い。
[0248] 次に、第 5の電極 825を接地し、第 1の電極 810及び第 2の電極 812に印加する電 圧を連続的に変化させ、チャンネル 809に所定の変性剤濃度勾配を持つ領域を導 入する。それと同時に、このチャンネル 809と第 4のチャンネル 818, 819との交点で 、DNA試料が上記変性剤濃度勾配領域を有するチャンネル 809上に導入される。 このとき、第 4のチャンネル 818と第 5のチャンネル 819に緩衝液が流れ込まな 、よう に、第 3の電極 820と第 4の電極 822に所定の電位を与えることが好ましい。第 1の電 極 810と第 2の電極 812に付与する電位の変動手順は、最初に第 2の電極 812の電 位を第 1の電極 810の電位より大きくしておき、そして徐々に第 2の電極 812の電位 を小さくし、そして、第 1の電極 810の電位を大きくしていく。この結果、チャンネル 80 9に導入される変性剤濃度勾配領域は、下流では変性剤濃度が薄ぐ上流に行くほ ど濃いものに形成される。
[0249] 上記のような操作により DNA試料中の 2本鎖 DNAを変性剤濃度勾配領域中で分 離しながら又はその分離後に、チャンネル 9に向けて設けられた DNA検出器で検出 が行われる。 DNA検出は、チャンネル 9のいずれの箇所で行ってもよい。分析中、マ イク口チップは一定の温度に保つ必要があり、好ましくは 40°C— 70°Cである。
[0250] 混合促進丰段を有する餱様 Aのマイクロチップ雷気泳動装置 態様 1 1から 2— 3までの各態様にぉ 、て説明した混合促進手段を、上記態様 Aの マイクロチップ電気泳動装置に適用することができる。マイクロチップ電気泳動装置 にお ヽて混合促進手段を使用する場合、緩衝液を導入するためのマイクロチャンネ ル 807, 808が液体導入用マイクロチャンネルであり、濃度勾配形成領域のチャンネ ル 809が混合用マイクロチャンネルであり、チャンネル 9内での緩衝液の混合に混合 促進手段が使用される。また、緩衝液を送るための各リザーバーが液体導入用マイク 口チャンネルの液体導入口または導入部である。
[0251] また混合促進手段は、濃度勾配の形成にも役立つ。例えば、態様 1 1および 1 2 による流量の独立制御手段 (例えば、付与電位または印可電圧を調整することによる 電気浸透流の制御、マイクロシリンジによる圧力を調節することによる送液ポンプの制 御、またはそれらによる液体駆動を 2次的に調節するためのバルブの制御）を利用す ることにより、マイクロチャンネル 807, 808から導入される緩衝液の割合を任意に変 化させると同時に、合流する緩衝液の接触界面を増加させることができる。接触界面 の増加により緩衝液間の分子拡散による混合が促進されるので、チャンネル 809内 にはチャンネル幅方向に均一な濃度勾配を速やかに形成することができる。この技 術は、 DEEGに有用なマイクロチップ装置を提供することができ、 DEEG分析時間の 短縮ィ匕および高スループットィ匕を可能にする。
[0252] 図 65—図 68は、高速バルブ 832を設けた上記態様 Aの装置を示す。これらの図に 示すように、例えば、第 1のチャンネル 807に高速作動バルブ 832を設けることができ る。この変性剤濃度勾配形成部 802において、第 1の電源 811と電極 810及び第 2 の電源 813と電極 812を介して各リザーバー内に電圧を印加すると、これにより生じ る電気浸透流によって第 1のリザーバー 805から変性剤含有緩衝液が第 1のチャン ネル 807を通じて濃度勾配領域チャンネル 809に導入され、同様に第 2のリザーバ 一 806から変性剤不含有緩衝液が第 2のチャンネル 7を通じてチャンネル 809に導 入される。このとき、高速作動バルブ 832の開閉動作を制御することにより、第 2のリ ザ一バー 806からの一定流量の緩衝液に対する第 1のリザーバー 805からの変性剤 含有緩衝液の混合割合を任意に変化させることができる。高速作動バルブ 832の開 閉時間を連続的に変化させることにより、連続的な濃度勾配を形成できる。 [0253] DGGEに関する餱様 B
態様 Bの DGGE法は、変性剤を異なる濃度で含む緩衝液領域 (泳動ゲル）が泳動 方向に交互に配置され、濃度勾配領域に分析対象物が導入されて電気泳動が行わ れる。
[0254] 態様 Bのマイクロチップ電気泳動装置では、マイクロチャンネル内に変性剤を異な る濃度で含む緩衝液領域が泳動方向に交互に配置され、該濃度勾配領域に分析対 象物が導入されて電気泳動が行われる。
(1)本態様の原理
態様 Bによる 2本鎖核酸の分離方法は、異なる濃度で変性剤を含有する少なくとも 2つの緩衝液領域を核酸の泳動方向に対して交互に配置することを特徴とする。核 酸は、そのような変性剤濃度の不連続配置構造の中を電気泳動的に移動することに よって分離する。この原理を従来の DGGE法を参照して説明する。
[0255] DGGEの原理は、尿素やホルムアミドなどの核酸変性剤の濃度勾配が形成された ゲルの中で、それら核酸変性剤が、泳動される 2本鎖核酸の核酸塩基の電荷を中和 することによりヌクレオチド間の水素結合が切断され、 2本鎖核酸が 1本鎖核酸に解 離する現象を利用するものである。具体的には、泳動する核酸断片を、その一端に 核酸変性剤濃度が高くても 1本鎖核酸に解離しにくい人工的な核酸配列 (GCクラン プ)を付けて PCR増幅して 2本鎖核酸に調製し、調製した 2本鎖核酸を電気泳動する 。このとき、ある変性剤濃度において、 GCクランプがついていない側の 2本鎖核酸が 1本鎖核酸に解離し、移動速度が小さくなる。 2本鎖核酸が 1本鎖核酸に解離する変 性剤濃度は、 2本鎖核酸の塩基配列に依存するので、各種の 2本鎖核酸を塩基配列 の違いに応じて分離することができる。つまり、 DGGEは、 2本鎖核酸の解離に要す る変性剤濃度の塩基配列依存性を巧妙に利用する。異なる塩基配列を持った 2本鎖 核酸は、塩基配列によって解離しやすくなる変性剤濃度が異なる。したがって、それ ら 2本鎖核酸は、変性剤濃度に勾配を持たせたゲル中を電気泳動すると、変性剤濃 度勾配上で次第に解離状態に差を生じさせ、それらの分離を実現する。
[0256] この変性剤濃度の塩基配列依存性は、変性剤中の尿素やホルムアミドなどの変性 剤分子が 2本鎖核酸の水素結合部位に作用する頻度の違いであると関連付けて考 えることができ、これは次のように説明することができる。すなわち、ある塩基配列を持 つた 2本鎖核酸の水素結合を部分的に切るには、その部分の 2本鎖核酸の水素結合 部位に変性剤分子をある閾値以上の頻度で作用させなければならない。また、 2本 鎖核酸のある部分の水素結合を切るという反応には有限の反応時間が必要である。 その水素結合部位に、少なくともそれに必要とされる反応時間より長い時間、変性剤 分子が作用しなければならない。この有限の反応時間も、塩基配列に依存すると考 えられる。
[0257] 上記のアイデアに基づき、本発明者は、移動する核酸と変性剤分子との反応頻度 の閾値に加えて、それらの反応時間の閾値にも着目して 2本鎖核酸の分離方法を検 討した。その結果、本発明者は、変性剤の濃度を連続的に変化させることなく反応頻 度を変化させて 2本鎖核酸を分離できることを見出した。本分離方法は、 2本鎖核酸 の水素結合を切るのに必要とされる反応頻度と反応時間の閾値が塩基配列によって 異なることを利用する方法であって、電気泳動方向に変性剤を異なる濃度で含む緩 衝液領域を配列する方法に関する。具体的には、変性剤を高い濃度で含む緩衝液 領域および Zまたは変性剤を含まな ヽ又は低 、濃度で含む緩衝液領域の"長さ（泳 動方向の距離) "を泳動方向で変化させ、ここで、各緩衝液領域は、泳動方向で変性 剤分子との反応頻度又は Z及び反応時間（変性剤を高!ヽ濃度で含む緩衝液領域の 通過時間）が漸次上昇するよう配置される。このように配置された緩衝液領域上に 2 本鎖核酸を泳動させると、それらを塩基配列の違いにより分離可能であることが見出 された。
[0258] 態様 Bでは、各緩衝液領域内に変性剤濃度が連続的に変化する勾配を形成する 必要はな!ヽ。所定濃度の変性剤を含有する緩衝液領域の 2次元分布の勾配を形成 し、泳動方向の下流に行くほど変性剤の分布が密になるようにする。
[0259] 上述の通り、本態様は、変性剤濃度の不連続な配置構造を形成することに関する。
[0260] 本態様に使用される用語"変性剤濃度の不連続配置構造"または"変性剤を異なる 濃度で含有する緩衝液領域の配列"とは、変性剤の濃度が異なる少なくとも 2つの緩 衝液領域を交互に配列した構造を意味する。
[0261] 本態様に使用される用語"緩衝液領域"とは、一定濃度の緩衝液を含むゲル等の 電気泳動用マトリックスをいう。
[0262] 以下では説明の簡略ィ匕のため、変性剤を含有する緩衝液領域と変性剤を含有しな い緩衝液領域との交互配置 (以下"変性剤間欠配置"という)を説明する。ただし、各 緩衝液領域が変性剤を含有するか、含有しないかが重要ではなぐ変性剤の相対的 な濃度差が重要である。例えば、 "変性剤を含有しない領域"が相対的に低濃度の 変性剤を含有しており、"変性剤を含有する領域"が"変性剤を含有しない領域"より も有意に高い濃度の変性剤を含有すれば同様の効果を得られる。このような態様も 本発明の範囲内である。
[0263] 好ま 、態様では、 2本鎖の核酸はその移動距離に応じて変性剤分子との反応頻 度が漸次大きくなるように或いは変性剤分子との反応時間が漸次長くなるように企図 される。この好ましい態様では、泳動方向で徐々に長さが変化する変性剤含有緩衝 液の領域および/または変性剤不含有緩衝液の領域の配列を使用する。
[0264] 上記の緩衝液領域配列による分離原理は次のように説明することができる。ここで は、図 69の態様 (後述の第 1の態様)を例に説明する。図 82に示すように、泳動方向 で変性剤含有緩衝液の領域の間隔が短くなる場合、その配列パターンを横切って泳 動する各核酸は、移動距離が小さいところ (上流域)では時間 tのうち変性剤含有緩 衝液に接触する時間の割合 Aが小さい。そして、移動距離が大きいところ（下流域） では同じ時間 tのうち変性剤含有緩衝液に接触する時間の割合 Bが大きくなる。すな わち、上流と下流とで核酸移動度に有意な差が無ぐ且つ変性剤含有緩衝液の各領 域を通過する時間 A tが同じであるとすれば、同じ長さの時間 t内で核酸が変性剤含 有緩衝液と接触する時間の割合は、通過する変性剤含有緩衝液の領域の数に依存 して A< Bの関係が成り立つ。このように、核酸はその移動距離 (移動時間）によって 同一時間 t内に変性剤含有緩衝液に接触する時間の割合 (すなわち反応頻度）が次 第に増えていく。接触時間の割合が次第に増えていくにつれ、 2本鎖核酸は、塩基 配列の相違に応じて異なる反応閾値を越えたところで解離し、結果としてそれぞれ固 有の移動度 (移動距離)を持つ。したがって、変性剤含有領域の間欠的配置の利用 により、連続的に形成した変性剤濃度勾配を利用する場合と同じ分離効果が得られ る。 [0265] 図 69は、変性剤間欠配置の第 1の態様を示す。この態様では、核酸の泳動方向で 変性剤含有緩衝液の各領域の長さをほぼ一定とし、変性剤不含有緩衝液の各領域 を徐々に短くしていく変性剤間欠配置である。つまり変性剤含有緩衝液同士の間隔 ( 変性剤を含有しな ヽ緩衝液領域の幅）は核酸の泳動方向に行くにしたがって狭まる 。この態様において、核酸が変性剤間欠配置上を移動すると、それが変性剤含有緩 衝液と変性剤不含有緩衝液を交互に通過する。ここで、核酸が各変性剤含有緩衝 液領域の通過に要する時間は、塩基配列の相違に起因する解離反応時間の差より も十分に短くなるよう設定されている。そして、核酸が下流に行くにつれて、それが一 定時間内に変性剤含有緩衝液を通過する頻度は増えて!/、くので (即ち反応頻度が 増加し)、 2本鎖に解離しやすくなる。したがって、 2本鎖の結合が比較的不安定とな る塩基配列を有する核酸は、変性剤間欠配置上の変性剤含有緩衝液領域の密度が 小さ 、場所 (上流域)で解離するが、 2本鎖の結合が比較的安定となる塩基配列を有 する核酸は変性剤含有緩衝液領域の密度がより大き!ヽ場所 (下流域)で解離するこ とになる。この態様は、変性剤含有緩衝液領域の配列密度の変化 (通過頻度の変化 )を利用するものである。
[0266] 図 70は、変性剤間欠配置の第 2の態様を示す。この態様は、核酸の泳動方向で変 性剤不含有緩衝液の各領域の長さをほぼ一定とし、変性剤含有緩衝液の各領域を 徐々に長くしていく変性剤間欠配置である。この態様においても、核酸が、適切な数 の変性剤含有緩衝液領域の通過に要する時間は、塩基配列の相違により生じる解 離反応時間の差よりも短い。泳動される核酸は、各変性剤含有緩衝液領域を通過す る時間が塩基配列の解離に要する反応時間に達していた力否かにより解離の度合 いが異なる。また、核酸が下流に行くにつれて変性剤含有緩衝液領域を通過する時 間が長くなるので、 2本鎖が解離しやすくなる。したがって、核酸の 2本鎖が不安定で あれば変性剤間欠配置の上流域で解離するが、安定であればより下流域で解離す ることになる。この態様は、各々の変性剤含有緩衝液領域の長さ（泳動方向の幅）に 依存する継続的作用（一つの配列での反応時間）の変化を利用するものである。
[0267] なお、核酸が変性剤含有緩衝液を通過するのに要する時間は、変性剤含有緩衝 液の長さと核酸の泳動速度によって決まる。また、核酸が変性剤含有緩衝液を通過 する頻度は、緩衝液の長さと核酸の泳動速度によって決まる。したがって、変性剤含 有緩衝液領域の長さ、変性剤不含有緩衝液領域の長さ、核酸の泳動速度、変性剤 含有緩衝液の変性剤濃度、変性剤間欠配置の全体長などを適切に選択することに より、各種 2本鎖核酸を塩基配列の違いにより適切に分離することができる。これらの ノ メータは分析する核酸の種類や要求される精度などにより異なる。これらは、事 前に実施される予備実験により決定するとよい。例えば、 2本鎖核酸の分離を制御す るために、変性剤含有緩衝液領域の長さや濃度を調節することができる。例えば、変 性剤含有緩衝液領域の長さを短くすれば、核酸が変性剤含有緩衝液領域を通過す る時間が短くなり、精度の良い検出が可能となる。変性剤含有緩衝液領域の変性剤 濃度を薄くすれば、精度の良い検出が可能となる。このように分離精度を制御するた め、変性剤含有緩衝液領域の長さ、変性剤不含有緩衝液領域の長さ、核酸の泳動 速度、変性剤含有緩衝液の変性剤濃度、変性剤間欠配置の全体長などを必要に応 じて調節することができる。
[0268] 変性剤間欠配置の第 1の態様では変性剤不含有緩衝液の各領域のみの長さを変 え、また、第 2の態様では変性剤含有緩衝液の各領域のみの長さを変えているが、こ れらに限らず、変性剤不含有緩衝液の各領域と変性剤含有緩衝液の各領域の両方 の長さを変える配置としてもょ 、。
[0269] 本態様をマイクロチップ上で行う場合、濃度勾配形成領域の上流点における緩衝 液同士の混合操作 (態様 Aのように変性剤の連続的勾配を形成する場合に分析チッ プ上での混合が要求される）が必要とされない点で好都合である。また、そのような分 析チップ上での混合を促進する手段が必要とされな 、と 、う点で好都合である。
[0270] 本態様に使用される緩衝液は、必要に応じて高分子マトリックスを含有する緩衝液 である。これは、高分子マトリックスの網目構造や高分子マトリックスと核酸の相互作 用によって、核酸を分離できるからである。
[0271] 本態様に使用し得る高分子マトリックスは、ポリアクリルアミド、ヒドロキシェチルセル ロース、ヒドロキシプロピノレメチノレセノレロース、ヒドロキシセノレロース、メチノレセノレロース などのセルロース誘導体、ポリエチレンォキシド、ポリメチレングリコール、ポリプロピレ ングリコール、ポリビュルアルコール、ポリビュルピロリドンなどのポリオール類、デキス トラン、プルランなど力も適宜選択される。高分子マトリックスがヒドロキシェチルセル ロースの場合は、 2本鎖 DNAの長さに依存し、 0. 01%— 3. 0%の濃度範囲にある ことが好ま ヽ。この高分子マトリックスをトリス-酢酸緩衝液ゃトリス-ホウ酸緩衝液な どに含有させ、緩衝液として用いる。但し、既成の平板ゲルに緩衝液を打ち込んで緩 衝液領域の配列を形成することもできる。既に高分子マトリックスの網目構造が形成 されて ヽるゲルには、高分子マトリックスを含有しな ヽ緩衝液を使用し得る。
[0272] 本態様に使用される変性剤は、尿素、ホルムアミド、ホルムアルデヒド、および水 酸ィ匕ナトリウムなどの強アルカリなど力 選択される。好ましくは尿素とホルムアミドを 使用する。ホルムアミドと尿素を変性剤として用いた場合、一般的には、 7M尿素、 40 %ホルムアミドを含む変性剤含有緩衝液を 100%変性剤含有緩衝液として使用し、 変性剤を含んでいない緩衝液を 0%緩衝液として使用する力 これに限られない。上 記の通り、態様 Bでは、有意な濃度差を有する変性剤の緩衝液領域配列を形成でき ればよい。
[0273] 本態様の分析対象物には、代表的には単離された 2本鎖核酸 (単に核酸又は核酸 分子ともいう場合も含む)であり、変性剤により解離する性質を有する限りあらゆるタイ プの核酸分子を使用することができる。典型的には、人の血液や細胞などのような生 体試料や、食品、土壌や河川水、海水などの環境試料、あるいは活性汚泥やメタン 発酵汚泥など力 抽出したゲノム核酸の所定の領域を、 PCR反応などにより、一端に 核酸変性剤濃度が高くても 1本鎖核酸に解離しにくい人工的な核酸配列 (GCクラン プ)を付けて増幅した 2本鎖核酸を用いる。なお、本態様の分析対象物は必ずしも核 酸に限定されるとは限らない。例えば、適切な緩衝液及び変性剤並びに分離条件等 を選択することにより電気泳動可能であるならば、そのような生体高分子 (例えば、タ ンパク質)も本態様の分析対象物に含まれ得る。
[0274] 本態様の変性剤間欠配置上で分離した核酸は、検出手段を用いて検出される。検 出手段は、蛍光検出、発光検出、吸光検出、電気化学的検出などから選択され、検 出器として、蛍光検出、発光検出、吸光検出の場合、光電子増倍管、 UV検出器、フ オトダイオード検出器などが使用される。蛍光検出では、あら力じめ PCR反応のブラ イマ一を蛍光標識しておく方法、 PCR産物を蛍光標識する方法、あらかじめ PCR産 物を DNA染色剤で染色する方法、および、高分子マトリックス含有緩衝液に DNA 染色剤を含有させ、電気泳動中に染色する方法などがある。蛍光標識物質としては 、フルォレセイン、ローダミン、 Cy3、 Cy5、 BODIPY FL、 TexasRed、 Alexa Flu orなどがある。 DNA染色剤としては、 SYBR Green, Vistra Green,ェチジゥム ブロマイド、 YOYO— 1、 TOTO— 1、 thiazole orangeなどがある。
(2)本態様の分離方法と装置
本態様の核酸分離を行うための支持体として、平板ゲルまたは電気泳動用のマイク 口チップなどの分析基板が挙げられる。
[0275] 本態様に使用し得る平板ゲルには、緩衝液を含んだポリアクリルアミドゲルが挙げ られるがこれに限定されない。緩衝液を含んだポリアクリルアミドゲルは、例えばアタリ ルアミド， N, Nメチレン ビスアクリルアミド，蒸留水からなるアクリルアミド溶液、トリス 酢酸緩衝液、過硫酸アンモ-ゥム溶液、 N, N, Ν' , Ν，ーテトラメチルエチレンジァ ミン、蒸留水を混合して重合させたものである。あらゆるタイプの平板ゲルを当該技術 分野にお 、て知られて 、る定法に従って作成することができる。
[0276] 平板ゲルには、本態様に好適な緩衝液領域形成方法により変性剤間欠配置が形 成される。平板ゲルを使用する場合、例えば、図 71に示すように他の緩衝液で満た された泳動槽に浸され、緩衝液や変性剤間欠配置の蒸発を防止するための蓋がな される。詳細の図示は省略している力 慣例的な電気泳動法と同様に、平板ゲルの 泳動方向の上流側には試料孔が等間隔に設けられ、泳動槽には電極および電源が 接続される。
[0277] 支持体には、平板ゲルのみならず、変性剤間欠配置を支持できるものである限り、 あらゆるタイプの分析基板が含まれる。基板の材質は、例えば、ガラス、石英、プラス チック、シリコン榭脂、紙、など力も選ぶことができる。また、例えば、変性剤間欠配置 が形成された基板に、変性剤間欠配置の蒸発を防止するための蓋となる基板を張り 合わせることで作成してもよい。また、変性剤間欠配置を形成していない基板の部分 を折り曲げることにより、この部分を蓋として利用してもょ 、。
[0278] 典型的な分析基板はマイクロチップである。図 72に示されるように、マイクロチップ の濃度勾配形成領域であるマイクロチャンネル内に変性剤間欠配置を形成すること ができる。このマイクロチャンネル内の変性剤間欠配置では、変性剤含有緩衝液領 域と変性剤不含有緩衝液領域とを泳動方向で交互に配列され、且つ各変性剤不含 有緩衝液領域の幅が次第に泳動方向で短くなつている。
[0279] マイクロチップは、通常少なくとも 2枚の基板力もなる。 1枚の基板には、フォトリソグ ラフィー技術などの微細加工技術を用いて、幅、深さともに 10— 100 m程度のチヤ ンネルを形成させ、もう 1枚の基板には、超音波加工などの機械加工を用いて、リザ 一バー用の穴を開ける。これら 2枚の基板を、熱による溶融接合などの接着技術を用 いて張り合わせると、所定の位置にチャンネルとリザーバーを有するマイクロチップが 得られる。基板の材質は、ガラス、石英、プラスチック、シリコン榭脂などカゝら適宜選ぶ ことができる。マイクロチップでは分析用チャンネルが微細な構造であるので、高スル 一プットの解析、装置全体の小型化などを実現できる。
[0280] 次に、態様 Bのマイクロチップ電気泳動装置について説明する。
[0281] 図 73のマイクロチップ電気泳動装置は、濃度勾配形成領域であるマイクロチャンネ ル 901 (以下"核酸分析用チャンネル 901"という）と、核酸試料の導入のためのマイ クロチャンネル 902とを含むプラスチック製マイクロチップ 903として提供される。核酸 分析用チャンネル 901内に変性剤間欠配置が形成される。このマイクロチップ 903は 、上記チャンネル 901, 902が形成されたプラスチック製基板 903aと、試料導入のた めの核酸投入口及び排出口 902a, 902b,および第 1及び第 2のリザーバー 901a, 901bが設けられたプラスチック製基板 3bとを張り合わせることにより製造される。
[0282] 図 73のマイクロチップを用いて 2本鎖核酸を塩基配列の違いにより分離する方法の 手順の一例を以下に示す。核酸導入チャンネル 902に緩衝液を充填する。ここで、 核酸分析用チャンネル内 901へ試料を導入する方法は、試料である 2本鎖核酸を核 酸分析用チャンネル 901に電気泳動により導入する方法である。核酸投入口 902a に 2本鎖核酸を含有する緩衝液を投入し、核酸投入口 902aと核酸排出口 902bに 直流電源に接続された電極（図示せず)を差し込む。核酸試料は、その一端に核酸 変性剤濃度が高くても 1本鎖核酸に解離しにく 、人工的な核酸配列 (GCクランプ)を 付けて増幅した 2本鎖核酸を含む。 2本鎖核酸は負に帯電しているので、核酸投入 口側を陰極、核酸排出口側を陽極とする。使用する電極は、核酸投入口と核酸排出 口に、例えば蒸着ゃメツキなどによってあら力じめ形成されていてもよい。 2本鎖核酸 が導入される時、核酸分析用チャンネル 1側への試料の拡散を抑制するとよい。この ために第 1のリザーバー 901aと第 2のリザーバー 902aに電極を差し込み、核酸投入 口 902aの電位よりも大きぐ核酸排出口 902bの電位よりも小さい電位を印加すると よい。
[0283] 次に、核酸分析用チャンネル 901の両端に直流電源に接続された電極（図示せず
)を設置する。 2本鎖核酸は負に帯電しているので、第 1のリザーバー側を陰極、第 2 のリザーバー側を陽極とする。電極は、第 ;Lのリザーバーおよび第 2のリザーバーに 例えば蒸着ゃメツキなどによってあらカゝじめ形成されていてもよい。第 1のリザーバー および第 2のリザーバーに差し込んだ電極に所定の電位を印加することにより、およ び分析用基板の両端に設置した電極に所定の電圧を印加することにより、上記のよ うに導入された 2本鎖核酸が変性剤間欠配置内を電気泳動する。泳動される 2本鎖 核酸は、変性剤間欠配置上で塩基配列の違いにより分離される。
[0284] 上記のような操作により分離した核酸は、核酸分析用チャンネル 901内またはその 下流にある検出部 905により検出される。使用し得る検出法は、既に説明したとおり、 蛍光検出、発光検出、吸光検出、電気化学的検出などから選択され、好ましくは蛍 光検出である。蛍光検出では、あら力じめ PCR反応のプライマーを蛍光標識しておく 方法、 PCR産物を蛍光標識する方法、あらカゝじめ PCR産物を DNA染色剤で染色す る方法、および、高分子マトリックス含有緩衝液に DNA染色剤を含有させ、電気泳 動中に染色する方法などがある。蛍光標識物質は、前述の通りであり、検出器も前述 の通りである。分析中、分析用基板 903a、 903bは一定の温度に保つ必要があり、 好ましくは 40°C— 70°Cである。
[0285] 使用されるマイクロチップはガラス製でもよ ヽ。ガラス製のマイクロチップでは、電気 浸透流の効果が大きくなるが、チャンネル表面を公知の技術により修飾して電気浸 透流を抑制するとよい。これにより、プラスチック製のマイクロチップと同じ構成のガラ ス製マイクロチップ上で電気泳動による 2本鎖核酸の分離が可能である。
[0286] 図 74は、ガラス製マイクロチップ電気泳動装置の一態様を示す。電気浸透流が存 在する場合でも、図 74のような構成により 2本鎖核酸の分析が可能となる。その基本 構造は図 5のマイクロチップと同様である力 核酸導入チャンネル 2が下流側に設け られている点で異なる。
[0287] まず、核酸導入チャンネル 2から試料となる 2本鎖核酸を、変性剤間欠配置のある 核酸分析用チャンネル 901に電気浸透流により導入する。核酸投入口 902aに 2本 鎖核酸を含んだ緩衝液を投入し、核酸投入口 902aと核酸排出口 902bに直流電源 に接続された電極を差し込む。核酸投入口と核酸排出口との間に所定の電圧を印 加することにより、 2本鎖核酸を含んだ緩衝液が核酸導入チャンネル 902を電気浸透 流により移動し、核酸分析用チャンネル 901内に導入される。ここで、電気浸透流を 利用するために、核酸投入口側を陽極、核酸排出口側を陰極とする。この 2本鎖核 酸導入の時に、核酸分析用チャンネル 901側への拡散を抑制するとよい。このため に、第 1のリザーバー 901aと第 2のリザーバー 901bに電極を差し込み、核酸投入口 902aの電位よりも小さぐ核酸排出口 902bの電位よりも大きい電位を印加しておくと ょ 、。各電極は例えば蒸着ゃメツキなどによって予め形成されて 、てもよ 、。
[0288] 次に、導入された 2本鎖核酸を電気泳動して分離する。第 1のリザーバー 901aおよ び第 2のリザーバー 902bに差し込んだ電極に所定の電圧を印加することにより、核 酸分析用チャンネル 901内を変性剤間欠配置の緩衝液領域が電気浸透流により輸 送される。その緩衝液領域に導入されて ヽる 2本鎖核酸も電気泳動により移動する。 一般的には電気浸透流による変性剤間欠配置の移動方向と、電気泳動による核酸 の移動方向は互いに対向する方向（反対方向）になる。したがって、図 74の変性剤 間欠配置を使用する場合には、第 1のリザーバー 901aを陽極とし、第 2のリザーバー 901bを陰極とし、これにより変性剤間欠配置は第 2のリザーバー 901bの方向に、 2 本鎖核酸は第 1のリザーバー 901aの方向にそれぞれ移動する。したがって、 2本鎖 核酸は変性剤間欠配置上を電気泳動されて、塩基配列の違いにより分離される。
[0289] 上記のような操作で分離した 2本鎖核酸は、変性剤間欠配置内またはその下流に ある検出部（図示せず)で検出する。
[0290] 図 75は、ガラス製マイクロチップ電気泳動装置の他の態様を示す。この装置は、変 性剤間欠配置が形成される核酸分析用チャンネル 901 (第 1のマイクロチャンネル）と 、核酸分析用チャンネル 901の一端側でこれと交差する変性剤含有緩衝液導入部と 、核酸分析用チャンネル 901の他端側でこれと交差する核酸導入部とを備えて 、る。 第 1のリザーバー 901aは、第 1の緩衝液用の緩衝液投入口であり、第 2のリザーバー 90 lbはその排出口である。
[0291] 変性剤含有緩衝液導入部は、核酸分析用チャンネル 901を横切る変性剤含有緩 衝液導入チャンネル 906 (第 2のマイクロチャンネル）を有する。変性剤含有緩衝液 導入チャンネル 906は、第 2の緩衝液を導入するための変性剤含有緩衝液投入口 9 06aとその排出口 906bを有する。この変性剤含有緩衝液導入チャンネル 906から第 2の緩衝液が導人される。
[0292] 核酸導入部は、核酸分析用チャンネル 901を横切る核酸試料導入チャンネル 902 を有する。核酸試料導入チャンネル 902は、核酸投入口 902aとその排出口 902bを 有する。
[0293] 図 75の装置は、核酸分析用チャンネル 901、変性剤含有緩衝液導入チャンネル 9 06および核酸導入チャンネル 902が形成された基板 903a (図 76 (a)参照）と、各チ ヤンネル端部の緩衝液投入口とその排出口、核酸投入口とその排出口、および変性 剤含有緩衝液投入口とその排出口を形成した基板 903b (図 76 (b)参照）とを、例え ば、熱による溶融接合などの接着技術を用いて張り合わせ 1枚のマイクロチップとし たものである。各リザーバーのための孔は、例えば直径 2— 10mm程度の円形であり 、例えば、超音波加工などの周知の加工技術を用いて形成する。
[0294] 上記構成の装置は、変性剤含有緩衝液導入部により核酸分析用チャンネル 901 内に、図 77に示すような所望の変性剤間欠配置を形成することができる。その形成 方法は、後述の「（3)態様 Bのための緩衝液領域の配列の形成方法及び装置」の項 で詳しく説明する。ここでは図 75のマイクロチップ電気泳動装置を使用する場合であ つて、核酸分析用チャンネル 1に変性剤間欠配置を形成した後に行われる分離工程 を示す。
[0295] 核酸分析用チャンネル 901に所望の変性剤間欠配置を形成した後、核酸投入口 9 02aから核酸排出口 902bの方向に 2本鎖核酸を流動させ、 2本鎖核酸を核酸分析 用チャンネル 901内に導入する。 2本鎖核酸を流動させる方法としては、流動方向と 流動時間 (流動距離)を制御できる方法から任意に選ぶことができるが、ガラス製マイ クロチップであれば核酸投入口 902aと核酸排出口 902bの間に直流電圧を印加して 電気浸透流を発生させる方法が好ましい。なお、 2本鎖核酸導入工程の際に核酸分 析用チャンネル 901に余分な試料が流出しないように、緩衝液投入口 901a、その排 出口 901b、変性剤含有緩衝液投入口 906a、その排出口 906bに、例えば直流電 圧を印加したり圧力をかけたりするとよい。
[0296] 次に、緩衝液投入口 901aと排出口 901bに電極を差し込み所定の直流電圧を印 加すると、導入された 2本鎖核酸が核酸分析用チャンネル 901内の変性剤間欠配置 上を電気泳動し、塩基配列の違いにより分離される。各電極は、チップに例えば蒸着 ゃメツキなどによって予め形成されていてもよい。なお、ガラス製マイクロチップなどの 場合で電気浸透流も同時に起こる場合には、変性剤間欠配置が電気浸透流により 2 本鎖核酸と逆方向、即ち陰極側に流動する。この場合、例えば図 77に示すように緩 衝液の長さが核酸の泳動方向で次第に短くなるように変性剤間欠配置を核酸分析 用チャンネル 901内に形成しておく必要がある。
[0297] 上記のような操作で、核酸試料中の 2本鎖核酸を分離した後、核酸分析用チャンネ ル 901上の所定箇所、例えばその下流にある検出部（図示せず)で 2本鎖核酸を検 出する。分析中、マイクロチップは一定の温度に保つ必要があり、好ましくは 40°C— 70°Cである。また、使用できる変性剤、緩衝液、分析できる試料、検出法等も既述の 装置と同様である。
(3)態様 Bのための緩衝液領域の配列の形成方法及び装置
従来の DGGEでは、変性剤含有緩衝液に連続的な濃度勾配を持たせる必要があ つた。しかし、マイクロチップ電気泳動装置に使用されるマイクロチャンネル内では、 変性剤含有緩衝液と緩衝液の混合に十分な時間を必要とするか、変性剤含有緩衝 液と緩衝液を効率よく混合するための機構を必要とした。
[0298] 態様 Bの発明によると、マイクロチャンネル内に形成された変性剤間欠配置を核酸 が電気泳動するので、変性剤含有緩衝液と緩衝液が全く混合して!/、なくても核酸分 離は実現可能である。特に変性剤含有緩衝液と緩衝液を混合するための撹拌手段 を必要しない。
[0299] 以下では、態様 Bの分離方法に使用できる所望の緩衝液領域の配列の形成方法 及び装置を提供する。
[0300] 図 78は、緩衝液領域配列を形成するための装置の一態様を示す。この装置は、 2 本鎖核酸の変性剤を異なる濃度で含む緩衝液領域の配列を電気泳動用の分析基 板 910上に形成するための装置であって、分析基板 910を保持するためのステージ 手段 911と、その基板 910に対して 2本鎖核酸の変性剤を異なる濃度で含む緩衝液 の液滴 913 (例えば、変性剤を含有しない緩衝液と変性剤を含有する緩衝液の各々 の液滴）を射出するための射出手段 912と、ステージ手段 911及び Z又は射出手段 912を位置制御すると共に射出手段を逐次駆動するための制御手段（図示せず)と を有する。ステージ手段 911及び Z又は射出手段 912は、図中の矢印で示されるよ うに 2次元方向で相互に直進運動できる移動機構を有する。
[0301] 図 78の装置では、上述の核酸分析用チャンネル 1を有するマイクロチップ等の基 板 910をステージ手段 911上に保持し、この基板 910に対して、変性剤を含有しない 緩衝液及び Z又は変性剤を含有する緩衝液液滴 913を射出できる射出手段 912を 使用し、ステージ手段 911及び Z又は射出手段 912を位置制御すると共に所望の 射出手段 912を逐次駆動することができる。このようにして射出手段 912から所定の 変性剤濃度の緩衝液の液滴 913を核酸分析用チャンネル 901内の任意の位置に付 着させ、そこに変性剤間欠配置を形成することができる。なお、 1回の射出で塗布さ れる緩衝液の厚さが薄すぎる場合は、全く同じ分布（同じ変性剤領域)への塗布を適 度な厚さになるまで重ねればよ！、。
[0302] 上記の射出手段 912は、より詳しくは、液滴射出ヘッドを有する射出機構により構 成することができる。例えば、図示しない制御手段を介して電気信号を印加すること により任意のタイミングで標的へ緩衝液を射出することができる。
[0303] 最も簡易には、緩衝液を含んだゲルが予め形成されて ヽる基板をセットし、ゲル中 の緩衝液とは異なる変性剤濃度 (少なくともゲルに含まれて 、る緩衝液よりも高 、濃 度）の緩衝液を射出する 1つの液滴射出ヘッド 912が使用される。これは、例えば、 核酸分析用チャンネル内に緩衝液を含んだゲルが既に充填されて ヽるマイクロチッ プゃ緩衝液を含んだ平板ゲル 914を使用する場合（図 79)である。
[0304] 他方、ゲルを持たな ヽ核酸分析用チャンネルやガラス基板を使用する場合、図 78 に示すように濃度の異なる緩衝液に対応した複数の液滴射出ヘッド 912, 912' を 設け、所望の液滴を選択的に射出させることによって対応可能である。この場合、通 常は緩衝液にはゲルを形成するための高分子マトリックスを含ませる。
[0305] 上記のような液滴射出機構としては、例えばインクジェットプリンタ用の射出ヘッド等 を利用することができる。適切な液滴射出ヘッドを使用することによって、少なくともマ イク口チップ基板 910上の核酸分析用チャンネル 1の幅よりも小さい直径の緩衝液の 液滴 913を容易に塗布することができる。
[0306] 上記の液滴射出機構には、同じ濃度の緩衝液を射出する液滴射出ヘッドを複数連 結して使用してもよい。このようにすれば、変性剤間欠配置の形成時間を短縮ことが できる。また、異なる濃度の緩衝液を射出する液滴射出ヘッド同士を連結してもよぐ 例えば、変性剤含有緩衝液用の液滴射出ヘッドと緩衝液用の液滴射出ヘッドを一体 とした射出ヘッドモジュールとしてもよ 、。このような射出ヘッドモジュールを使用すれ ば、装置がコンパクトになりかつ変性剤間欠配置の形成時間を短縮ことができる。さら に、そのようにモジュールィ匕した液滴射出ヘッド群を更に複数設けて使用すれば、さ らに効率良く変性剤間欠配置を形成することができる。
[0307] また図 79に示すように、マイクロチップ基板 910の代わりに電気泳動用の平板ゲル 914を保持し、平板ゲル 914上の任意の位置に変性剤含有緩衝液の液滴 913を射 出することもできる。このようにして平板ゲル 914の任意の場所に変性剤含有緩衝液 の液滴 913を打ち込むことができ、そこに任意のパターンで変性剤間欠配置を効率 的に形成することができる。
[0308] 上述の通り、位置決め手段（911)と液滴射出手段（912)等を採用することにより任 意のパターンをもつ変性剤間欠配置を容易に形成することができ、またあらゆるタイ プの基板に対応でき、特に同じパターンの変性剤間欠配置を効率良くかつ再現性 良ぐ大量に形成することができる。
[0309] 次に図 80及び図 81を参照して、マイクロチャンネル内への変性剤間欠配置の別の 形成法を説明する。
[0310] まず緩衝液送り工程により、緩衝液 (第 1の緩衝液;変性剤を含有しない緩衝液)を 緩衝液投入ロカゝら排出口方向に流動させる。その駆動方法としては、緩衝液投入口 と排出口の間に直流電圧を印加して電気浸透流を発生させる方法や、緩衝液投入 口、または Zならびに、排出口にポンプを接続して流動させる方法など、流動方向と 流動時間（流動距離)を制御できる方法から任意に選ぶことができる。ここで、緩衝液 送り工程の際に核酸分析用チャンネルから核酸導入チャンネルや変性剤含有緩衝 液導入チャンネルに緩衝液が流出しないようにする。このためには、核酸投入口、核 酸排出口、変性剤含有緩衝液投入口、変性剤含有緩衝液排出口に、例えば直流電 圧を印加する、圧力をかけるなどすることが好ましい。変性剤含有緩衝液導入チャン ネル内の変性剤含有緩衝液の駆動方法と操作は、上記の緩衝液の駆動方法等と同 様である。
[0311] 緩衝液送り工程において、緩衝液領域は核酸分析用チャンネル 901内に導入され 、その緩衝液領域がチャンネル 906との交点を通過するところまで導入される。その 後、図 80に示すように、変性剤含有緩衝液送り工程によりチャンネル 6から変性剤含 有緩衝液 (第 2の緩衝液）を送ると、チャンネル 906からの変性剤含有緩衝液領域が チャンネル 901の緩衝液領域を真横から横切る。こうして、緩衝液領域を分断する 1 つの変性剤含有緩衝液領域ができる。次いで再び緩衝液送り工程では、チャンネル 901内に位置する変性剤含有緩衝液領域部分が、チャンネル 906から分離し、排出 口方向に緩衝液領域と共に移動する。こうして、緩衝液領域内に独立した 1つの変 性剤含有緩衝液領域 901cができる。
[0312] 上記のように緩衝液送り工程と変性剤含有緩衝液送り工程とを交互に繰り返すこと により、核酸分析用チャンネル 901内に変性剤間欠配置を形成することができる。こ こで、緩衝液送り工程の時間を調節することにより変性剤含有緩衝液領域と変性剤 含有緩衝液領域との間隔を任意に調整可能であり、例えば、図 69のように変性剤を 含有する緩衝液領域間の間隔が下流に行くほど短くなる形態の変性剤間欠配置チ ヤンネルを形成することができる。
[0313] なお、核酸分析用チャンネルの長さ、変性剤含有緩衝液の長さ、変性剤含有緩衝 液の濃度、その間隔などは、分離の対象となる 2本鎖核酸の種類などにより異なるの で、事前に実施される予備実験などにより決定しておくとよい。
[0314] 図 81は、変性剤含有緩衝液領域の泳動方向の長さ（幅）を小さくできる方法の一例 を示す。変性剤含有緩衝液領域の泳動方向の長さを小さくすることにより、 2本鎖核 酸の分離精度を向上させることができる。図 80の方法により形成される変性剤含有 緩衝液領域の泳動方向の長さは、変性剤含有緩衝液流入口の幅とほぼ等しくなる。 したがって、そのような変性剤含有緩衝液領域の長さを小さくするには、変性剤含有 緩衝液流入口を狭くするとよい。しかし、変性剤含有緩衝液流入口を狭くすると流動 損失が著しく大きくなるので、変性剤含有緩衝液を流動させるのに非常に大きな動 力が必要となる場合がある。
[0315] 上記の問題を回避するためには、図 81で示すように変性剤含有緩衝液導入部に お!、て変性剤含有緩衝液導入チャンネル 906に隣接する補助緩衝液チャンネル 90 6' を設けるとよい。こうしてネ ΐ助緩衝液チャンネノレ 906' の投人口 906c、 906d力ら の補助緩衝液の流入量を増やすことにより変性剤含有緩衝液の流入幅を細めること ができ、泳動方向で変性剤含有緩衝液領域の長さを徐々に短く形成することができ 、同時に流動損失の増加を防ぐこともできる。補助緩衝液の投入口は、図 81のよう〖こ 変性剤含有緩衝液導入チャンネル 6を挟むように複数の補助緩衝液チャンネルおよ び投入口を設けてもょ 、し、その 、ずれか一方のみを設けるとしてもよ 、。
[0316] 流量制御丰段 有する能様 Bの緩衛液铕城の西 R歹 II 形成する 置
態様 Bの装置において、態様 1 1および 1 2において説明したような液体導入用 マイクロチャンネルからの緩衝液の流量を制御する手段 (例えば、印加電圧または付 与電位を調節することによる電気浸透流の制御、マイクロシリンジ等による送液の圧 力を調節することによる送液ポンプの制御、またはそれらによる送液を 2次的に調節 するためのバルブの制御）は、上記の変性剤間欠配置を形成する手段として利用す ることがでさる。
[0317] 態様 Bの装置では、変性剤を異なる濃度で有する緩衝液同士が分子拡散により混 合しにくい条件にあるという前提 (既に説明した通り、液体の拡散係数が極端に小さ い場合には混合が起こらない場合がある）において、態様 1—1および 1—2に示される 流量制御手段を、変性剤間欠配置を形成するような緩衝剤の交互供給に利用するこ とがでさる。
[0318] 図 83は、態様 1 2にお 、て説明した高速作動バルブを設置した態様を示す。この 態様では、 2つの緩衝液導入チャンネル (変性剤を含有しな!、緩衝液のための導入 チャンネルと変性剤を含有する緩衝液のための導入チャンネル)の各々に高速作動 バルブ（バルブ 1およびバルブ 2)を設けて 、る。バルブ 1およびバルブ 2の開閉時間 を制御することで、図 83に示すように核酸分析用チャンネル 1内に変性剤間欠配置 を形成することができる。
[0319] 混合促進丰段を有する餱様 Aのマイクロチップ雷気泳動装置
図 78および図 79に示す変性剤間欠配置を形成する装置において、混合促進手 段を利用することができる。
[0320] 図 84は、射出手段 912を模式的に示す。矢印 aと矢印 bは変性剤を異なる濃度で 含む緩衝液の入力経路を示す。射出手段 912は、変性剤を異なる濃度で含む 2つ の緩衝液、例えば、変性剤含有緩衝液 (矢印 a)と変性剤不含有緩衝液 (矢印 b)とを 任意の割合で混合することができる混合装置（図示して 、な 、)を内蔵して 、る。
[0321] 射出手段 912内の混合装置には、上記の態様 1 1から態様 2— 3の混合促進手段 を有する液体混合装置を使用することができる。適切な混合促進手段を有する混合 装置によれば、矢印 aおよび矢印 aで示す 2つの緩衝液の混合が速やかに行われる ので、所望の濃度で変性剤を含有する緩衝液を連続的に調製することができる。
[0322] 混合装置により混合されて調製された変性剤含有緩衝液は、射出手段 912から所 望濃度の液滴 913として射出される。この態様によれば、異なる濃度の変性剤含有 緩衝液を連続的に供給することが可能となる。したがって、異なる濃度の緩衝液を供 給するためのカートリッジを交換することが必要も無くなる。また、カートリッジ方式の 射出手段を使用する必要も無くなる。また、複数の射出手段を設置する必要も無くな る。このタイプの射出手段を有する態様によれば、少品種大量生産に適した変性剤 間欠配置形成置および方法を提供することができる。
[0323] 例えば、射出手段 912内の混合促進手段として態様 2— 2の液体混合装置を使用 する場合、緩衝液同士の混合を高速ィ匕できるので、混合濃度の情報を受け取ってか ら混合を完了するまでの時間を短くすることができる。また、射出手段に態様 2— 3の 液体混合装置を使用する場合、装置をコンパクトにすることができる。
実施例 [0324] 実施例 1
上記の各態様に記載した通りのマイクロチップ電気泳動装置を用いて、塩基配列 の異なる 2種類の 2本鎖核酸の分離を行った。分析対象物として 2種類の Sphingom onas属に属する微生物から得た 16S rRNA遺伝子の V3領域断片を含む核酸試 料を調製した。
[0325] 実験では、まず 2種類の微生物をそれぞれ液体培地で培養後、遠心分離により回 収した。菌体を混合し、この混合菌体力も塩ィ匕べンジル法により核酸を抽出した。こ の抽出核酸に対して、 16S rRNA遺伝子の V3領域を標的とした、ユニバーサルプ ライマー（フォワード、； 5， - CGCCCGCCGC GCGCGGCGGG CGGGGCGGGG GCACGGGGGG CCTACGGGAG GCAGCAG- 3' (配列番号: 0、リバース 5' - ATTACCGCGG CTGCTGG- 3' (配列番号 2) )を用いて PCRを行い、生成した PC R産物を最終的な核酸試料とした。ユニバーサルプライマーは 末端を FITC標識 してあるものを用いた。フォワードプライマーには GCクランプ領域が付与してある。
[0326] 実験では、パイレックス (登録商標)ガラス (7cm X 3. 5cm)にフォトリソグラフィー技 術により、幅 100 m、深さ 25 mのチャンネルを形成したマイクロチップを用いた。 このマイクロチップを倒立型蛍光顕微鏡に配置し、光電子増倍管で検出した。変性 剤には尿素とホルムアミドを用 ヽた。
[0327] 実験の結果、 2種類の微生物に対応する 2つのピークが検出された。 30分という短 時間で分析は終了し、高速分析が可能なことが確認された。
[0328] 実施例 2
実施例 1の装置を用いて、塩基配列の異なる 2種類以上の 2本鎖核酸を分離した。 2種類以上の 2本鎖核酸が存在する試料には、エストラジオールを単一炭素源として 集積培養した活性汚泥を用 V、た。実験方法は実施例 1と同様である。
[0329] 実験の結果、複数の微生物に対応する複数のピークが検出され、 2種類以上の塩 基配列の異なる 2本鎖核酸の分離も可能であることが確認された。
[0330] 比較例 1
実施例 1の比較として、従来の DGGE装置を用いて、同じ試料を分析した。実験は 、 Muyzerらの方法 (Appl. Environ. Microbiol. , Mar 1 993, 695-700, Vol 59, No. 3)を元にして行った。 DGGE装置は、 DCode U niversal Mutation Detection System (BIORAD) 用いた。
[0331] 実験では、実施例 1と同様に、 2種類の微生物をそれぞれ液体培地で培養後、遠 心分離により回収した菌体を混合し、この混合菌体力 塩ィ匕べンジル法により核酸を 抽出した。この抽出核酸に対して、 16S rRNA遺伝子の V3領域を標的とした、実施 例 1に記載したユニバーサルプライマーを用いて PCRを行 、、生成した PCR産物を 最終的な核酸試料とした。ここで使用したユニバーサルプライマーは、実施例 1とは 異なり、蛍光標識せず、電気泳動後、 Vistra Greenで 2本鎖核酸を蛍光染色する ことにより検出した。フォワードプライマーに GCクランプ領域が存在することは実施例 1と同様である。変性剤濃度勾配ゲルの濃度勾配は、 35%— 55%とした。
[0332] 核酸試料の泳動の結果、 2種類の微生物に対応する 2つのバンドが検出された力 電気泳動時間は 210分であり、変性剤濃度勾配ゲルの作製時間やゲルの染色時間 などを含めると、分析には 6時間程度必要であった。
[0333] 比較例 2
実施例 2の比較対照として、従来の DGGE装置を用いて、同じ試料を分析した。実 験装置、実験方法は比較例 2と同様である。
[0334] 実験の結果、複数の微生物に対応する複数のピークが検出されたが、比較例 1と 同様に、電気泳動時間は 210分であり、変性剤濃度勾配ゲルの作製時間やゲルの 染色時間などを含めると、分析には 6時間程度必要であった。さらに、変性剤濃度勾 配ゲルの作製やゲルの染色など手作業の煩雑な操作が必要であった。
[0335] 上記の実施例において、態様 Aおよび態様 Bの装置を使用することによりマイクロ チップ上での DGGEにより 2本鎖核酸を塩基配列の違 ヽによって分離 ·分析すること ができた。
[0336] また、 DGGEのためのマイクロチップ装置に、態様 1—1から態様 2— 3までに記載し たような混合促進方法および装置を適用することにより、迅速に濃度勾配を形成する ことができ、より短時間で分離'分析をすることができた。

Claims

請求の範囲
[1] 液体を導入するための少なくとも 2つの液体導入用マイクロチャンネル、および該少 なくとも 2つの液体導入用マイクロチャンネルが接続している混合用マイクロチャンネ ルを含んでなり、各液体導入用マイクロチャンネルカゝら導入された各液体が前記混 合用マイクロチャンネル内で合流する液体混合装置であって、
前記混合用マイクロチャンネル内で合流する液体間の混合を促進するための混合 促進手段を有する液体混合装置。
[2] 前記混合促進手段が、混合される液体間の界面の面積を増加する手段である、請 求項 1の液体混合装置。
[3] 前記混合促進手段
力 混合される液体間の界面を不安定ィ匕する手段である、請求項 1の液体混合装置
[4] 前記混合促進手段が、液体導入用マイクロチャンネルに導入する液体の流量を他 の液体導入用マイクロチャンネルと独立して制御できる少なくとも 1つの液体導入手 段を含んでなる、請求項 2の液体混合装置。
[5] 前記液体導入手段が、流量を制御できるポンプである、請求項 4の液体混合装置。
[6] 前記液体導入手段が、液体導入用マイクロチャンネルに設けられたバルブである、 請求項 4の液体混合装置。
[7] 前記液体導入手段が、液体導入用マイクロチャンネルの各導入部に設けられた第
1の電極と、前記混合用マイクロチャンネルの排出部に設けられた第 2の電極とから 構成され、第 1と第 2の電極間に電圧を印加することにより、各液体導入用マイクロチ ヤンネルに電気浸透流を生じさせるものである、請求項 4の液体混合装置。
[8] 前記混合促進手段が、少なくとも 1つの液体導入用マイクロチャンネルに設けられ た高速作動バルブを含んでなる、請求項 2に記載の液体混合装置。
[9] 前記高速作動バルブが、ピエゾ素子を用いた弁体駆動手段である、請求項 8の液 体混合装置。
[10] 前記高速作動バルブが、液体導入用チャンネルの局所的加熱による液体の体積 膨張を利用して、前記混合用マイクロチャンネルへの微小流量の液体の吐出を高速 で制御可能な手段である、請求項 8の液体混合装置。
[11] 前記混合促進手段が、混合用マイクロチャンネルのチャンネル高さをそのチャンネ ル幅よりも小さくすることにより形成された混合室を含んでなる、請求項 2の液体混合 装置。
[12] 前記混合室が、液体導入用マイクロチャンネルを上下方向に積層するように接続 することにより形成されて!ヽる、請求項 11の液体混合装置。
[13] 前記混合室の上流に、前記複数の液体導入用マイクロチャンネルが合流すること により形成される少なくとも 1つの予混合用マイクロチャンネルをさらに含んでなる、請 求項 11の液体混合装置。
[14] 前記混合促進手段が、各液体導入用マイクロチャンネルが接続する複数の分岐チ ヤンネルの合流部であって、該複数の分岐チャンネル同士が 3次元空間上で互 、違 いに配置される形態で前記混合用マイクロチャンネルに接続する合流部を含んでな る、請求項 2の液体混合装置。
[15] 前記分岐チャンネルの 3次元的配置は、分岐チャンネルを有する複数の基板を分 岐チャンネルの合流方向または分岐方向で重ね合わせて形成されている、請求項 1
4の液体混合装置。
[16] 前記混合促進手段が、液体導入用マイクロチャンネルおよび Zまたは混合用マイ クロチャンネルに設置されたヒータを含んでなる、請求項 3の液体混合装置。
[17] 前記ヒータが、混合用マイクロチャンネルの下側に設置されている、請求項 16の液 体混合装置。
[18] 前記混合促進手段が、混合用マイクロチャンネルで合流する液体間の界面を乱す ための機械的変動手段を含んでなる、請求項 3の液体混合装置。
[19] 前記機械的変動手段が、混合用マイクロチャンネル内の合流部付近に設置された 可動揚力面、回転子または揺動子である、請求項 18の液体混合装置。
[20] 前記機械的変動手段が、混合用マイクロチャンネルの壁面に設置された振動子で ある、請求項 18の液体混合装置。
[21] 前記機械的変動手段が、混合用マイクロチャンネルの壁面外に設置された振動子 である、請求項 18の液体混合装置。
[22] 前記混合促進手段が、混合用マイクロチャンネル内の合流部付近に多数配列され た微小構造物を含んでなる、請求項 3の液体混合装置。
[23] 前記微小構造物が、前記混合用マイクロチャンネルのチャンネル幅よりも充分に小 さな突起または溝である、請求項 22の液体混合装置。
[24] 分析対象物を分離するためのマイクロチップ電気泳動装置であって、
分析対象物の変性剤の濃度勾配領域が形成されるマイクロチャンネルを含んでな り、該濃度勾配領域に導入された分析対象物が電気泳動される装置。
[25] 前記分析対象物が 2本鎖核酸である、請求項 24のマイクロチップ電気泳動装置。
[26] 変性剤を異なる濃度で含有する緩衝液を導入するための少なくとも 2つの液体導 入用マイクロチャンネル、および該少なくとも 2つの液体導入用マイクロチャンネルが 接続して ヽる混合用マイクロチャンネルを含んでなり、各液体導入用マイクロチャンネ ルカゝら変動する割合で導入される各緩衝液が前記混合用マイクロチャンネル内で合 流することにより前記変性剤の濃度勾配領域が形成される、請求項 24のマイクロチッ プ電気泳動装置装置。
[27] 前記混合用マイクロチャンネル内で合流する緩衝液間の混合を促進するための混 合促進手段を有する、請求項 26のマイクロチップ電気泳動装置装置。
[28] 請求項 1一 23のいずれかの液体混合装置を含んでなる、請求項 26のマイクロチッ プ電気泳動装置。
[29] 分析対象物を分離するための方法であって、
少なくとも 2つの液体導入用マイクロチャンネルから混合用マイクロチャンネル内に
、分析対象物の変性剤を異なる濃度で含有する緩衝液を変動する割合で導入する ことにより、該混合用マイクロチャンネル内に変性剤の濃度勾配領域を形成し、該濃 度勾配領域に分析対象物を導入して電気泳動する方法。
[30] 前記濃度勾配領域が、変性剤を異なる濃度で含む緩衝液領域を泳動方向に交互 に配置することにより形成される、請求項 24のマイクロチップ電気泳動装置。
[31] 前記分析対象物が 2本鎖核酸である、請求項 30のマイクロチップ電気泳動装置。
[32] 前記変性剤を含まな！/ヽ又は低！ヽ濃度で含む緩衝液領域が、各々の長さが泳動方 向の下流側に向力つて漸次小さくなるように配列される、請求項 30のマイクロチップ 電気泳動装置。
[33] 前記変性剤を高い濃度で含む緩衝液領域が、各々の長さが泳動方向の下流側に 向かって漸次大きくなるように配列される、請求項 30のマイクロチップ電気泳動装置
[34] 分析対象物を分離するための方法であって、
マイクロチャンネル内に分析対象物の変性剤を異なる濃度で含む緩衝液領域を泳 動方向に交互に配置することにより変性剤の濃度勾配領域を形成し、該濃度勾配領 域に分析対象物を導入して電気泳動する方法。
[35] 分析対象物を分離するための方法であって、
変性剤を異なる濃度で含む緩衝液領域を泳動方向に交互に配置し、該緩衝液領 域の配列内に分析対象物を導入し、電気泳動する方法。
[36] 前記分析対象物が 2本鎖核酸である、請求項 35の方法。
[37] 前記変性剤を含まな！/ヽ又は低！ヽ濃度で含む緩衝液領域を、各々の長さが泳動方 向の下流側に向かって漸次小さくなるように配列する、請求項 35の方法。
[38] 前記変性剤を高い濃度で含む緩衝液領域を、各々の長さが泳動方向の下流側に 向かって漸次大きくなるように配列する、請求項 35の方法。
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