KR20060105787A - 액체를 이용한 마이크로칩 장치 - Google Patents

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KR20060105787A
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도모유키 모리타
아키코 미야
아키라 후쿠다
모토히코 노미
가츠노리 이치키
마나부 츠지무라
šœ스케 시미즈
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가부시키가이샤 에바라 세이사꾸쇼
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Abstract

본 발명은 액체를 이용한 마이크로칩 장치에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은, 액체를 도입하기 위한 적어도 2개의 액체 도입용 마이크로 채널 및 그 적어도 2개의 액체 도입용 마이크로 채널이 접속되어 있는 혼합용 마이크로 채널을 포함하여 이루어지고, 각 액체 도입용 마이크로 채널로부터 도입된 각 액체가 상기 혼합용 마이크로 채널 내에서 합류하는 액체 혼합장치로서, 상기 혼합용 마이크로 채널 내 에서 합류하는 액체 사이의 혼합을 촉진하기 위한 혼합 촉진수단을 가지는 액체 혼합장치를 제공한다. 또 본 발명은 변성제 농도 구배 겔 전기영동법을 위한 전기영동장치 및 마이크로칩 전기영동장치를 제공한다.

Description

액체를 이용한 마이크로칩 장치{MICROCHIP DEVICE USING LIQUID}
본 발명은 마이크로(미소) 유체장치 및 마이크로 화학 분석장치에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 마이크로 채널 내에서 미소량의 2개 이상의 액체(이하 "시약 용액"이라고도 한다)를 합류시켜 효율 좋게 혼합하기 위한 액체 혼합장치 및 액체 혼합방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 마이크로 채널 내에서 혼합되는 액체 사이에서의 화학반응에 의하여 예를 들면 원하는 반응생성물을 효율 좋게 생산하기 위한 마이크로 리액터 등에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 분석 대상물의 변성제의 농도 구배를 이용하여 분석 대상물을 분리·분석하기 위한 화학분석 시스템에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 핵산 변성제의 농도 구배를 이용하여 2개 사슬 핵산(이하 단지 "핵산"이라고도 한다)을 염기 배열의 차이에 의하여 분리하기 위한 변성제 농도 구배 겔 전기영동법(DGGE), 그것을 위한 변성제 농도 구배의 형성방법, 그와 같은 DGGE를 마이크로 채널 내에서 행하기 위한 마이크로칩 전기영동장치 등에 관한 것이다.
특히 본 발명은 마이크로 채널 내에서 상기 완충제끼리를 효율적으로 혼합할 수 있어, DGGE에 유용한 마이크로칩 전기영동장치 등에 관한 것이다.
마이크로 채널구조를 가지는 화학 분석장치의 일례는, 마이크로칩 전기영동 장치이다. 이하에서는 마이크로칩 전기영동장치를 예로 들어 본 발명의 기술배경을 설명한다.
핵산이나 단백질 등의 생체 고분자를 분리·정제 또는 분석하는 수단으로서, 전기영동이 자주 사용된다. 전기영동은, 전해질 용액을 충전한 아가로스나 폴리아크릴아미드 등의 겔이나 마이크로 채널(캐필러리)에 전위를 인가하고, 그 중에서 하전입자를 이동시켜 이동속도의 차이에 의하여 입자를 분리하는 것이다. 2개 사슬 핵산을 전기영동하는 경우는, 이동속도에 영향을 주는 요인은 분자량(분자의 길이)뿐이기 때문에 분자량(길이)의 차에 의하여 분리할 수 있다.
2개 사슬 핵산을 염기 배열의 차이에 의하여 분리하는 방법으로서, 변성제 농도 구배 겔 전기영동(DGGE)이 알려져 있다. DGGE는, 핵산의 변이 검출이나 1염기 다형(SNP)의 검출 등에 이용되고 있다. 또 최근, 활성 오니법이나 메탄발효와 같은 유기성 배수·폐기물처리 프로세스에 있어서 또는 미생물을 이용하여 오염토양·지하수를 정화 수복하는 바이오레메디에이션 등에 있어서 활약하는 미생물군집의 구조해석 등에 DGGE가 이용되고 있다. 이 미생물군집의 구조해석에서는, 전 미생물이 공통으로 가지고 있는 배열인 16S rRNA 유전자가 종종 이용된다. 즉, 대상으로 하는 미생물군집을 포함하는 시료로부터 핵산을 추출하여 DGGE으로 분리한다. DGGE으로 분석되는 시료는, 16S rRNA 유전자 중 복수의 미생물에 공통되는 배열부분을 증폭할 수 있는 PCR용 프라이머로 증폭된 증폭산물이다. DGGE에서는, 16S rRNA 유전자의 염기배열의 차이에 의하여 미생물군집을 구성하는 주된 미생물에 유래하는 핵산을 겔상에서 분리할 수 있다. 동일 겔상의 복수의 레인 사이에 있어서 는 동일 영동거리에 있는 핵산은 동일한 염기배열을 가진다고 판단할 수 있기 때문에, 대상으로 한 미생물군집의 구성의 차이를 판단할 수 있다. 예를 들면 동일 겔상의 다른 레인에 특정한 미생물의 16S rRNA 유전자를 동일하게 조작하여 영동한다. 그 핵산띠의 위치와 비교함으로써 그 미생물이 대상으로 하는 미생물군에 존재하는지의 여부를 판정할 수도 있다.
DGGE의 단점은, 겔제작이나 전기영동에 시간을 요하기 때문에, 높은 스루풋(고속 대량처리)의 해석에는 적합하지 않은 것, 겔의 치수가 약 20 cm × 약 20 cm × 약 1 mm로 크기 때문에 대형의 항온조를 필요로 하여 장치 전체가 대형이 되는 것, 마이크로칩 전기영동과 비교하면 분해능이 뒤떨어지는 것 등이다.
또한 변성제 농도 구배 겔을 제작할 때는, 수작업의 번잡한 조작을 요하여 겔의 변성제 농도 구배를 일정하게 하는 것이 곤란하다. 이 때문에 DGGE에 의하여 미생물군집 구조를 해석하는 경우, 각각의 겔 사이에서의 데이터의 적정한 비교는 곤란하다.
한편, 1990년대초에 만쯔가 화학분석, 생화학분석에 필요한 모든 요소를 1매의 칩상에 조립하는 미소 화학 분석장치, 이른바 마이크로 타스(μTAS)의 개념을 제창하여 이후, 여러가지 타입의 마이크로 타스가 개발되어 왔다.
마이크로 타스의 일 분야에 속하는 마이크로칩 전기영동에서는, 미세 가공기술에 의하여 폭, 깊이 모두 10 ~ 100 ㎛ 정도의 미소한 채널을 형성시킨 기판 위에 또 1매의 기판을 접착시킨 마이크로칩을 사용한다. 일반적으로는 DNA나 RNA의 분자량 측정에 이용된다. DNA나 RNA의 분자량 측정에서는 채널 표면을 화학수식하여 전기침투류를 억제한 상태에서 직쇄의 폴리아크릴아미드나 하이드록시메틸셀룰로스 등의 고분자 매트릭스용액을 채널 내에 충전하여 DNA나 RNA의 분리를 행한다. 종래의 아가로스 겔 전기영동이, 30분∼1시간의 영동시간을 요하는 것에 대하여, 마이크로칩 전기영동장치는 10분 이하로 영동이 끝나, 분석시간을 단축할 수 있다. 시료, 시약의 소비량이 적은 등의 이점이 있다.
마이크로칩 전기영동장치의 더 한층의 마이크로 타스화를 목표로 하여 람제이(일본국 특표평10-507516호 공보 ; 특허문헌1)는, 화학물질을 분석 또는 합성하는 마이크로칩 실험장치를 제안하고 있다. 이 마이크로칩 실험장치는, 대상 물질이 충전된 리저버로부터 다른 리저버를 향하여 대상물질을 운반하기 때문에 복수의 리저버의 전위를 동시에 제어하는 것을 특징으로 한다. 그러나 이 중에서는 2개 사슬 핵산을 분자량의 차이에 의하여 분리하고 있는 것에 지나지 않고, 2개 사슬 핵산을 염기 배열의 차이에 의하여 분리하고 있지 않다.
나프(일본국 특표2001-521622호 공보 ; 특허문헌 2)는, 마이크로 유체 공학적 디바이스에 있어서의 핵산 분석방법과 핵산의 융점 분석방법을 제안하고 있다. 이 중에서 화학 변성제의 농도 구배와 올리고뉴클레오티드프로브를 이용하여 핵산 배열의 변이를 검출하고 있다. 그러나 미리 원하는 핵산 시료에 대하여 고유의 올리고 뉴클레오티드프로브를 설계할 필요가 있기 때문에, 염기 배열이 이미 알려져 있는 변이밖에 검출할 수 없고, 염기 배열이 미지인 변이는 검출할 수 없다.
벡(일본국 특개평8-261986호 공보 ; 특허문헌 3)은, 마이크로칩상에서 전기침투류를 사용한 액체 혼합방법과 액체 혼합장치를 제안하고 있다. 그러나 이 중 에서는 마이크로칩상에서의 액체 혼합방법과 장치를 제공하고 있는 것에 지나지 않고, 변성제 농도 구배나 2개 사슬 핵산의 분리에는 언급하고 있지 않다.
리게티(일본국 특표평10-502738호 공보 ; 특허문헌 4)는, 마이크로칩상에서 점성 폴리머를 이용한 2개 사슬 핵산 단편 중의 점 변이를 검출하는 방법을 제공하고 있다. 그러나 경시적인 온도 구배를 이용하고 있어, 별도의 온도제어를 위한 전용 컴퓨터 프로그램을 필요로 한다.
바바(일본국 특개2003-66003호 공보 ; 특허문헌 5)는, 수용성 고분자가 농도 구배를 붙여 마이크로 채널 내에 영동액으로서 충전되어 있는 마이크로칩 전기영동장치를 제안하고 있다. 그러나 마이크로칩상에서 실현하는 것은 수용성 고분자의 농도 구배이기 때문에, 핵산의 분자량 측정은 가능하나, 2개 사슬 핵산을 염기 배열의 차에 의하여 분리할 수는 없다. 특히 그 영동액의 농도 구배 형성에는 농도가 다른 완충액을 순서대로 충전하여 간다는 번잡한 작업을 수반한다.
이상 설명한 바와 같이 종래의 DGGE에는 실험조작이 번잡한 것, 분석시간이 긴 것, 높은 스루풋의 분석에는 적합하지 않은 것, 대형의 장치를 필요로 하는 것, 캐필러리 전기영동과 비교하면 분해능이 뒤떨어지는 것 등의 단점이 있었다. 또 DGGE에 의하여 미생물군집 구조를 해석하는 경우, 각각의 겔 사이에서의 데이터의 비교가 곤란하다는 단점이 있었다. 또한 지금까지 제안되어 있는 마이크로칩 전기영동장치를 포함하는 마이크로 타스는, 핵산의 분자량 측정이거나, 별도 온도제어 등을 위한 전용 컴퓨터 프로그램을 필요로 하거나, 미리 특정한 염기 배열을 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드프로브의 설계를 필요로 하여 미지의 2개 사슬 핵산 단편을 염기 배열의 차이에 의하여 분리할 수 없다.
특허문헌 1 : 일본국 특표평10-507516호 공보
특허문헌 2 : 일본국 특표2001-521622호 공보
특허문헌 3 : 일본국 특개평8-261986호 공보
특허문헌 4 : 일본국 특표평10-502738호 공보
특허문헌 5 : 일본국 특개2003-66003호 공보
특허문헌 6 : 일본국 특개2001-120971호 공보
액체가 혼합되기 어렵다는 문제는, 마이크로칩 전기영동의 경우뿐만 아니라, 마이크로 채널 내에서 복수의 액체를 혼합하는 경우의 일반적인 문제이다. 이미 설명한 바와 같이 채널의 폭이나 깊이가 작아지면 채널 내의 유동에 관한 레이놀즈수가 매우 작아진다. 레이놀즈수가 100 이하가 되면 채널 내의 유동은 안정된 층류가 되기 쉽고, 합류한 액체 사이에 난류 확산이 생기기 어렵다. 따라서 실질적으로는 계면에서의 분자확산에 의하여서 밖에 액체가 혼합되지 않아, 이것이 신속한 혼합을 방해한다. 특히 채널 내의 유속이 느린 경우, 이 경향은 현저하다. 상기한 문제는 분석용 마이크로칩이나 마이크로 리액터 등의 마이크로칩 장치 전반에 있어서, 실험조작의 간략화, 분석 및 반응시간의 단축화, 높은 스루풋화, 마이크로칩의 소형화, 고정밀도화(예를 들면, 고분해능화)를 방해하는 요인으로 되어 있었다.
상기한 문제의 해결책으로서 채널을 길게 하는 방법이 있다. 예를 들면 2개의 액체 도입용 마이크로 채널을 하나의 혼합용 마이크로 채널에 접속하여 단순하게 2액을 혼합하는 구조(도 1 또는 도 29)에 있어서, 혼합용 마이크로 채널을 길게 하여 충분한 혼합을 행하는 것을 생각할 수 있다(도 2 또는 도 29). 그러나 이 경우, 혼합용 마이크로 채널이 큰 면적을 점유하기 때문에 장치의 소형화가 곤란해지는 것, 및 액체가 채널을 통과하는 데 시간을 요하기 때문에 분석시간이나 반응시간이 길어진다는 단점이 있다.
다른 해결책으로서, 아베 등은 리저버로부터의 채널을 분기시켜 분기된 채널을 교대로 연결함으로써, 액체를 혼합하기 쉽게 한 액체 혼합장치를 제안하고 있다(일본 특개2001-120971 ; 특허문헌 6). 그러나, 이 방법에서는 앞쪽을 흐르는 액체와 뒤쪽을 흐르는 액체가 혼합되기 때문에, 흐름방향으로 농도 구배를 형성시키는 정량적인 농도제어를 행할 수 없다.
(1) 본 발명의 목적은, 마이크로 스케일로 미소량의 액체를 신속하게 혼합할 수 있고 또한 정량적인 농도제어가 가능한 액체 혼합장치 및 액체 혼합방법을 제공하는 것이다.
(2) 본 발명의 다른 목적은, 마이크로 스케일로 행하여지는 실험조작의 간략화, 분석 및 반응시간의 단축화 및 높은 스루풋화, 게다가 칩의 소형화, 고정밀도화(예를 들면, 고분해능화)를 가능하게 하기 위하여 본 발명자에 의하여 발견된 일련의 액체 혼합기술을 적용한 분석용 마이크로칩(예를 들면, 마이크로칩 전기영동장치) 및 마이크로 리액터를 제공하는 것이다.
이미 설명한 바와 같이 종래의 DGGE에는 실험조작이 번잡한 것, 분석시간이 긴 것, 높은 스루풋의 분석에는 적합하지 않은 것, 대형의 장치를 필요로 하는 것, 마이크로 스케일에서의 분석과 비교하여 분해능이 뒤떨어지는 등의 문제가 있다.
(3) 본 발명의 다른 목적은, 마이크로칩상에서 DGGE를 행하기 위한 마이크로칩 전기영동장치 및 전기영동법을 제공하는 것이다.
DGGE를 마이크로칩상에서 행하기 위해서는 변성제를 다른 농도로 함유하는 복수의 완충액을 마이크로 스케일로 혼합하는 것이 필요하게 된다. 예를 들면 변성제함유 완충액과 변성제를 함유하지 않은 완충액을 그것들의 혼합비를 연속적으로 변화시키면서 하나의 마이크로 채널 내에 도입하여, 그 혼합비의 변화에 의한 변성제 농도 구배를 형성하는 것이 필요하다. 유용한 DGGE용 마이크로칩을 제공하기 위해서는, 정확하고 재현성이 높은 변성제 농도 구배를 형성하는 것이 중요하다.
그러나 이미 설명한 바와 같이 마이크로 채널 내에서는 액체끼리가 혼합되기 어렵다는 문제가 있다. 마이크로 채널 내에서 합류한 농도가 다른 2개의 완충액도 서로 섞이지 않아 층형상의 흐름을 형성하는 경향이 있기 때문에, 채널의 폭방향으로 균일한 농도 구배를 얻는 데 시간이 걸리고, 결과적으로 분석시간의 단축화가 방해된다. 도 2와 같이 긴 채널을 사용하여 시간을 들여 혼합을 행하면, 신속하게 소정의 농도 구배를 얻는 것은 어렵다. 또 도 3에 나타내는 혼합방법(일본국 특개2001-120971호에 기재되어 있다)에서는 복수의 부분에서 앞쪽을 흐르는 액체와 뒤쪽을 흐르는 액체가 혼합되기 때문에, DGGE에 필요로 하는 정확한 농도 구배를 형성하는 것은 어렵다. 이와 같이 종래의 혼합방법에서는 마이크로 스케일로 요구되는 농도 구배를 정확하게 형성한다는 요구를 만족할 수 있는 것이 아니고, 농도 구배의 형성을 정밀하고 또한 자유롭게 제어하는 것도 곤란하다.
(4) 본 발명의 다른 목적은, 변성제를 다른 농도로 함유하는 복수의 완충액을 마이크로 채널 내에서 신속하게, 특히 채널의 폭방향에서의 균일한 혼합을 할 수 있어, DGGE에 유용한 변성제 농도 구배를 형성할 수 있는 마이크로칩 전기영동장치 및 전기영동법을 제공하는 것이다.
(5) 본 발명의 다른 목적은, 본 발명자에 의하여 발견된 액체 혼합의 촉진을 위한 일련의 기술을 마이크로 스케일에서의 완충액끼리의 혼합에 적용함으로써 DGGE에 특히 유용한 마이크로칩 전기영동장치 및 전기영동법을 제공하는 것이다.
도 1은 공지의 표준적인 마이크로 혼합용 마이크로 채널을 나타내는 개략도,
도 2는 확산 거리를 충분히 취하기 위한 혼합용 마이크로 채널을 길게 한 마이크로 혼합용 마이크로 채널을 예시하는 개략도,
도 3은 혼합을 촉진하기 위한 액체분할 가는 홈을 가지는 마이크로 채널을 예시하는 도(형태 1-1).
도 4는 형태 1-1의 장치를 나타내는 개략도,
도 5는 본 형태의 전압제어를 나타내는 개념도,
도 6은 본 형태의 농도 구배 형성장치를 나타내는 개략도,
도 7은 본 형태의 송압 제어를 나타내는 개념도(형태 1-2),
도 8은 형태1-2의 액체 혼합장치를 나타내는 개략 구성도,
도 9는 도 8의 액체 혼합장치의 구체적 구성을 나타내는 사시도,
도 10은 도 8의 액체 혼합장치의 고속작동 밸브를 확대하여 나타내는 사시도,
도 11은 도 10의 고속작동 밸브(미작동시)를 나타내는 단면도,
도 12는 도 10의 고속작동 밸브(작동시)를 나타내는 단면도,
도 13은 고속작동 밸브에 사용하는 돌기의 작성방법을 설명하기 위한 도,
도 14는 고속작동 밸브에 사용하는 돌기의 작성공정을 설명하기 위한 도,
도 15는 본 형태의 액체 혼합장치의 다른 예를 나타내는 구성도,
도 16은 본 형태에 의한 혼합의 효과를 설명하기 위한 도,
도 17은 본 형태의 액체 혼합장치의 또 다른 예를 나타내는 구성도,
도 18은 도 16의 액체 혼합장치의 제어에 관한 타임챠트,
도 19는 도 16의 액체 혼합장치의 제어에 관한 다른 타임챠트,
도 20은 본 형태의 액체 혼합장치의 또 다른 예를 나타내는 구성도,
도 21은 도 20의 액체 혼합장치의 제어에 관한 다른 타임 챠트,
도 22는 본 형태의 액체 혼합장치의 또 다른 예를 나타내는 구성도,
도 23은 도 22의 액체 혼합장치의 제어에 관한 다른 타임 챠트,
도 24는 본 형태의 액체 혼합장치의 또 다른 예를 나타내는 구성도,
도 25는 도 24의 액체 혼합장치의 제어에 관한 다른 타임 챠트,
도 26은 본 형태의 액체 혼합장치의 또 다른 예를 나타내는 개념도,
도 27은 본 형태의 액체 혼합장치의 또 다른 예를 나타내는 개념도,
도 28은 종래의 액체 혼합장치의 문제점을 설명하기 위한 도,
도 29는 종래의 액체 혼합장치의 문제점을 설명하기 위한 도(형태1-3)
도 30은 형태 1-3의 액체 혼합장치의 일례를 나타내는 도,
도 31은 단위 채널 길이당의 채널 체적(V)에 대한 접촉계면 면적(S)의 비(S/V)에 대하여 설명하는 도,
도 32a는 도입용 마이크로 채널의 적층방향과 혼합실의 높이 방향이 수직인 경우로서, 도입용 채널과 혼합실이 직접 접속되어 있는 경우의 혼합실에서의 액체의 상태를 나타내는 도,
도 32b는 도입용 마이크로 채널의 적층방향과 혼합실의 높이 방향이 수직인 경우로서, 도입용 마이크로 채널과 혼합실이 예혼합용 마이크로 채널을 거쳐 접속되어 있는 경우의 혼합실에서의 액체의 상태를 나타내는 도,
도 33은 본 형태의 액체 혼합장치의 일례를 나타내는 도,
도 34a는 예혼합용 마이크로 채널과 혼합실이 완만하게 연결되어 있는 경우의 액체의 흐름을 나타내는 도,
도 34b는 예혼합용 마이크로 채널과 혼합실이 완만하게 연결되어 있지 않은 경우의 액체의 흐름을 나타내는 도,
도 35는 본 형태의 액체 혼합장치의 다른 예를 나타내는 도(형태 1-4),
도 36a는 형태 1-4의 액체 혼합장치의 개략 구성을 나타내는 좌측면도,
도 36b는 형태 1-4의 액체 혼합장치의 개략 구성을 나타내는 정면도,
도 36c는 형태 1-4의 액체 혼합장치의 개략 구성을 나타내는 우측면도,
도 36d는 형태 1-4의 액체 혼합장치의 개략 구성을 나타내는 단면도,
도 37은 액체 혼합장치의 층구조와 라미네이션공정을 나타내는 도,
도 38은 다른 층구조에 대하여 나타내는 단면도,
도 39는 액체 혼합장치의 합류부에 대하여 다른 구성을 나타내는 단면도,
도 40은 복수의 액체 도입구를 가지는 형태 1-4의 구성예를 나타내는 도,
도 41은 도 40의 장치에 사용할 수 있는 분기형상 전극의 구성예를 나타내는 도,
도 42는 복수의 액체 도입구를 가지는 형태 1-4의 다른 구성을 나타내는 도,
도 43은 도 40 또는 도 42의 액체 혼합장치의 제어수단 및 방법을 설명하기 위한 도(형태 2-1),
도 44는 형태 2-1의 액체 혼합장치의 일례를 나타내는 도,
도 45는 본 형태의 액체 혼합장치의 다른 예를 나타내는 도,
도 46은 본 형태의 액체 혼합장치의 다른 예를 나타내는 도(형태 2-2),
도 47은 형태 2-2의 액체 혼합장치의 일례를 나타내는 개략도,
도 48은 본 형태의 액체 혼합장치의 다른 예를 나타내는 개략도,
도 49는 본 형태의 액체 혼합장치의 또 다른 예를 나타내는 개략도,
도 50은 본 형태의 액체 혼합장치의 또 다른 예를 나타내는 개략도,
도 51은 본 형태의 액체 혼합장치에 있어서의 액체의 도입형태를 나타내는 모식도,
도 52는 본 형태의 액체 혼합장치의 또 다른의 예를 나타내는 개략도,
도 53은 본 형태의 액체 혼합장치의 또 다른의 예를 나타내는 개략도(형태 2-3),
도 54는 본 형태 2-3의 액체 혼합장치를 나타내는 개략 구성도,
도 55는 도 54의 장치의 기둥형상의 미소 구조물군의 예를 나타내는 도,
도 56은 홈형상의 미소 구조물군을 가지는 본 형태를 나타내는 개략 구성도,
도 57은 홈형상의 미소 구조물군의 예를 나타내는 모식도,
도 58은 홈형상의 미소 구조물군의 다른 예를 나타내는 모식도(형태 A),
도 59a는 형태 A의 마이크로칩 전기영동장치의 기본 구성의 일례를 모식적으로 나타내는 개념도,
도 59b는 형태 A의 기본 구성의 다른 예를 나타내는 개념도,
도 59c는 형태 A의 기본 구성의 또 다른 예를 나타내는 개념도,
도 59d는 형태 A의 기본 구성의 또 다른 예를 나타내는 개념도,
도 60은 형태 A를 위한 변성제 농도 구배 형성부의 구성예를 나타내는 모식도,
도 61은 변성제 농도 구배 형성부의 다른 예를 나타내는 모식도,
도 62는 형태 A를 위한 시료 도입부의 예를 나타내는 모식도,
도 63은 형태 A의 일례를 나타내는 모식도,
도 64는 형태 A의 다른 예를 나타내는 모식도,
도 65는 고속 밸브를 설치한 형태 A의 변성제 농도 구배 형성부를 나타내는 모식도,
도 66은 고속 밸브를 설치한 다른 변성제 농도 구배 형성부를 나타내는 모식도,
도 67은 고속 밸브를 설치한 형태 A의 일례를 나타내는 모식도,
도 68은 고속 밸브를 설치한 형태 A의 다른 예를 나타내는 모식도(형태 B),
도 69는 형태 B에 의한 제 1 형태의 변성제 간헐 배치를 나타내는 개념도,
도 70은 형태 B에 의한 제 2 형태의 변성제 간헐 배치를 나타내는 개념도,
도 71은 변성제 간헐 배치를 가지는 평판 겔을 포함하는 영동장치의 개략 구성을 나타내는 사시도,
도 72는 마이크로 채널에 형성되는 변성제 간헐 배치를 나타내는 개념도,
도 73은 형태 B에 의한 마이크로칩 전기영동장치의 일례를 나타내는 도,
도 74는 형태 B에 의한 마이크로칩 전기영동장치의 다른 예를 나타내는 도,
도 75는 형태 B에 의한 마이크로칩 전기영동장치의 다른 예를 나타내는 도,
도 76은 도 75의 장치를 구성하는 각 기판의 구성도,
도 77은 형태 B에 의한 마이크로칩 전기영동장치의 다른 예를 나타내는 도,
도 78은 형태 B를 위한 완충액 영역 배열을 형성하는 장치의 개략 구성을 나타내는 사시도,
도 79는 평판 겔에 완충액 영역 배열을 형성하는 데 적합한 장치의 개략 구성을 나타내는 사시도,
도 80은 형태 B를 위한 완충액 영역 배열의 형성방법의 일례를 나타내는 개념도,
도 81은 형태 B를 위한 변성제 함유 완충액 영역의 길이의 조정방법을 나타내는 개념도,
도 82는 형태 B의 원리를 설명하기 위한 도,
도 83은 완충액 영역 배열의 형성을 위한 고속작동 밸브를 설치한 장치를 모식적으로 나타내는 도,
도 84는 완충액 영역 배열의 형성을 위한 사출수단의 일례를 모식적으로 나타내는 도면이다.
※ 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명(형태 1-1 ; 도 1 ∼ 도 7)
5 : 제 1 리저버, 6 : 제 2 리저버
7 : 제 1 액체 도입용 마이크로 채널
8 : 제 2 액체 도입용 마이크로 채널
9 : 혼합용 마이크로 채널 10 : 제 3 리저버
11 : 제 1 전극 12 : 제 2 전극
13 : 제 3 전원 14 : 제 1 펌프
15 : 제 2 펌프
(형태 1-2 ; 도 8 ∼ 도 29)
130 : 액체 도입용 마이크로 채널 131 : 혼합용 마이크로 채널
132 : 고속작동 밸브
(형태 1-3 ; 도 30 ∼ 도 35)
205 : 제 1 리저버 206 : 제 2 리저버
207 : 제 1 액체 도입용 마이크로 채널
208 : 제 2 액체 도입용 마이크로 채널
230 : 혼합실 233 : 혼합용 마이크로 채널
234 : 예혼합용 마이크로 채널 235 : 접속부
(형태 1-4 ; 도 36 ∼ 도 43)
330 : 액체 도입용 마이크로 채널 330a : 액체 도입구
331 : 혼합용 마이크로 채널 X : 분기방향
Y : 합류방향
(형태 2-1 ; 도 44 ∼ 도 46)
405 : 제 1 리저버 406 : 제 2 리저버
407 : 제 1 액체 도입용 마이크로 채널
408 : 제 2 액체 도입용 마이크로 채널
430 : 합류부
431, 432, 451, 452 : 도입용 마이크로 채널
433, 453 : 혼합용 마이크로 채널 435 : 히터
440, 450 : 합류부 441, 442 : 도입용 마이크로 채널
443 : 혼합용 마이크로 채널 445, 455 : 히터
(형태 2-2 ; 도 47 ∼ 도 50)
505 : 제 1 리저버 506 : 제 2 리저버
507 : 제 1 액체 도입용 마이크로 채널
508 : 제 2 액체 도입용 마이크로 채널
509, 533 : 혼합용 마이크로 채널 535, 536 : 혼합 대상 액체
510, 537 : 진동자 538 : 밸브
511 : 가동 양력면 512 : 회전자
513 : 요동자
(형태 2-3 ; 도 54 ∼ 도 57)
707 : 제 1 액체 도입용 마이크로 채널
708 : 제 2 액체 도입용 마이크로 채널
709 : 액체 혼합용 농도 구배영역 채널(혼합용 마이크로 채널)
709a : 농도 구배영역 채널 하면 709b : 농도 구배영역 채널 상면
730 : 합류부 731 : 미소 구조물군
(형태 A ; 도 59 ∼ 도 68)
801 : 마이크로칩 802 : 변성제 농도 구배 형성부
803 : 시료 도입부 804 : 전기영동부
805 : 제 1 리저버 806 : 제 2 리저버
807 : 제 1 채널(액체 도입용 마이크로 채널)
808 : 제 2 채널(액체 도입용 마이크로 채널)
809 : 농도 구배영역 채널(혼합용 마이크로 채널)
810 : 제 1 전극 811 : 제 1 전원
812 : 제 2 전극 813 : 제 2 전원
814 : 제 1 펌프 815 : 제 2 펌프
816 : 제 3 리저버 817 : 제 4 리저버
818 : 제 4 채널 819 : 제 5 채널
820 : 제 3 전극 821 : 제 3 전원
822 : 제 4 전극 823 : 제 4 전원
824 : 제 5 리저버 825 : 제 5 전극
826 : 제 5 전원
(형태 B ; 도 69 ∼ 도 84)
901 : 핵산 분석용 채널(마이크로 채널)
902 : 핵산 시료 도입 채널 903 : 마이크로칩 기판
905 : 검출부 906 : 변성제함유 완충액 도입 채널
910 : 기판 911 : 스테이지수단
912 : 사출수단 914 : 평판 겔
[액체 혼합장치 및 액체 혼합방법]
상기한 목적 (1) 및 (2)를 달성하는 본 발명은, 액체를 도입하기 위한 적어도 2개의 액체 도입용 마이크로 채널 및 적어도 2개의 액체 도입용 마이크로 채널이 접속되어 있는 혼합용 마이크로 채널을 포함하여 이루어지고, 각 액체 도입용 마이크로 채널로부터 도입된 각 액체가 혼합용 마이크로 채널 내에서 합류하는 액체 혼합장치로서, 상기 혼합용 마이크로 채널 내에서 합류하는 액체 사이의 혼합을 촉진하기 위한 혼합 촉진수단을 가지는 액체 혼합장치에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 형태에는, 혼합 촉진수단이 액체 사이의 계면의 면적을 증가하는 수단인 제 1 형태(형태 1-1, 형태 1-2, 형태 1-3 및 형태 1-4) 및 혼합 촉진수단이 액체 사이의 계면을 불안정화하는 수단인 제 2 형태(형태 2-1, 형태 2-2 및 형태 2-3)가 포함된다.
형태 1-1
본 발명의 형태 1-1은, 혼합 촉진수단으로서, 혼합용 마이크로 채널 내에서 합류하는 액체 사이의 접촉계면을 늘리도록 각 액체의 유량(유속)을 제어하는 기구를 가진다.
형태 1-1의 장치의 혼합 촉진수단은, 액체 도입용 마이크로 채널에 도입하는 액체의 유량을 다른 액체 도입용 마이크로 채널과 독립하여 제어할 수 있는 하나 이상의 액체 도입수단이다.
형태 1-1의 일례에서는 혼합 촉진수단은, 바람직하게는 상기 액체 도입수단이 유량을 제어할 수 있는 펌프, 액체 도입용 마이크로 채널에 설치된 밸브, 및 그것들의 조합이다.
형태 1-1의 다른 예에서는, 상기 액체 도입수단은, 액체 도입용 마이크로 채널의 각 도입부에 설치된 제 1 전극과, 상기 혼합용 마이크로 채널의 배출부에 설치된 제 2 전극으로 구성되고, 제 1과 제 2 전극 사이에 전압을 인가함으로써 각 액체 도입용 마이크로 채널에 전기침투류를 일으키게 한다.
형태 1-1에 사용되는 액체 혼합방법의 일례는, 2개 이상의 액체 도입용 마이 크로 채널을 통하여 2개 이상의 액체를 도입하여, 각 액체 도입용 마이크로 채널이 공통지점에서 합류하고 있는 혼합용 마이크로 채널 중으로 액체를 도입하여 혼합하는 공정으로서, 액체 도입용 마이크로 채널로부터 도입되는 액체의 유량을, 다른 액체 도입용 마이크로 채널로부터의 유량과 다른 유량으로 함으로써, 혼합용 마이크로 채널 내에서 합류한 액체 사이에 형성되는 접촉계면의 면적을 증가시키는 공정을 포함한다.
형태 1-1에 사용되는 액체 혼합방법의 다른 예에서는, 액체 도입용 마이크로 채널에 도입되는 각 액체의 유량을 펌프에 의하여 제어하는 것, 액체 도입용 마이크로 채널에 설치된 밸브에 의하여 각 액체의 유량을 제어하는 것 및 그것들의 조합에 의하여 각 액체의 유량을 제어하는 것을 포함한다.
형태 1-1에 사용되는 액체 혼합방법의 다른 예에서는, 액체 도입용 마이크로 채널의 각 도입부에 설치된 제 1 전극과, 혼합용 마이크로 채널의 배출부에 설치된 제 2 전극과의 사이에 전압을 인가함으로써 생긴 전기침투류에 의하여 혼합용 마이크로 채널 내로 액체를 도입하는 공정으로서, 부여되는 전위를 액체 도입용 마이크로 채널마다 바꿈으로써, 각 액체 도입용 마이크로 채널 중으로부터 도입되는 유량을 독립하여 제어하는 공정을 포함한다.
형태 1-2
본 발명의 형태 1-2는, 혼합 촉진수단으로서, 복수의 액체 도입용 마이크로 채널의 적어도 어느 하나에 설치된 고속작동 밸브를 가진다.
형태 1-2의 일례에서는, 고속작동 밸브는 피에조소자를 사용한 밸브체 구동 수단이다. 형태 1-2의 다른 예에서는, 채널의 국소적 가열에 의한 액체의 체적팽창을 이용하여 혼합용 마이크로 채널에의 미소 유량의 액체의 토출을 고속으로 제어 가능한 수단이다. 형태 1-2의 다른 예에서는, 고속작동 밸브는, 액체 도입용 마이크로 채널 내에서 미세 공극을 개폐 가능한 밸브체를 구동하는 수단이다.
형태 1-2에 사용되는 액체 혼합방법의 일례에서는, 혼합용 마이크로 채널에 접속되는 2개 이상의 액체 도입용 마이크로 채널로부터 각각 액체를 도입하여 혼합용 마이크로 채널 내에서 2개 이상의 액체를 합류시키는 공정으로서, 복수의 액체 도입용 마이크로 채널의 적어도 어느 하나에 설치된 고속작동 밸브를 고속으로 개폐 구동함으로써 도입되는 액체의 유량에 변동을 주는 공정을 포함한다.
형태 1-2에 사용되는 액체 혼합방법의 다른 예에서는, 고속작동 밸브를 고속으로 개폐 구동함으로써 도입되는 액체의 유량에 짧은 시간 간격으로 변동을 주어 혼합용 마이크로 채널 내를 차지하는 액체의 비율(체적비)을 채널 폭의 방향에서 연속적 또는 단속적으로 변화시킴으로써, 액체 사이의 접촉계면의 면적을 증가시키는 공정을 포함한다.
형태 1-2에 사용되는 액체 혼합방법의 다른 예에서는 고속작동 밸브의 개폐 주기를 일정하게 하여, 개폐 주기의 1주기 중, 밸브가 개방되어 있는 시간의 비율(듀티비)을 가변으로 하는 공정을 포함한다. 이 액체 혼합방법에서는, 복수의 액체 도입용 마이크로 채널의 적어도 2개 이상에 고속작동 밸브를 각각 설치하고, 복수의 고속작동 밸브를 동기시켜 개폐 제어하는 공정을 포함한다. 이 액체 혼합방법의 다른 예에서는 혼합용 마이크로 채널에 흐르는 액의 총유량이 일정해지도록 복 수의 고속작동 밸브를 동기시켜 개폐 제어하는 공정을 포함한다.
형태 1-1 및 1-2의 액체 혼합장치는 마이크로칩에 적용할 수 있고, 바람직하게는 분석 대상물을 혼합용 마이크로 채널에 도입할 수 있는 시료 도입부를 더 가지는 마이크로칩 전기영동장치에 적용할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 마이크로칩 전기영동장치에 사용되는 유량의 제어기구는, 혼합을 촉진할 뿐만 아니라, 분석 대상물을 분리하기 위한 변성제의 농도 구배를 형성하는 것에 도움이 된다. 상기한 제어기구(예를 들면 형태 1-1, 1-2 및 그것들의 조합을 사용할 수 있는)를 사용하여 도입되는 복수의 액체(예를 들면 변성제를 다른 농도로 함유하는 액체)의 유량을 제어함으로써, 혼합용 마이크로 채널 내에서 합류하는 특정한 액체 또는 합류하는 액체 내의 시약의 농도분포(예를 들면 변성제의 농도분포)를 흐름방향으로 형성할 수 있다.
형태 1-3
본 발명의 형태 1-3은, 혼합 촉진수단으로서, 혼합용 마이크로 채널의 적어도 일부에, 그 채널 높이를 그 채널 폭보다도 작게 함으로써 형성된 혼합실을 가진다.
형태 1-3의 일례에서는, 혼합 대상의 액체를 도입하는 복수의 마이크로 채널이 상하방향으로 적층하여 합류되어 혼합실에 접속된다.
형태 1-3의 다른 예에서는, 혼합실의 상류에, 복수의 도입용 마이크로 채널을 합류시킨 예혼합용(pre-mixing) 마이크로 채널을 가진다.
형태 1-3에 사용되는 액체 혼합방법의 일례는, 혼합 대상의 액체를 복수의 마이크로 채널을 거쳐 도입하고, 도입된 액체를 합류시켜 혼합실로 도입시키는 공정으로서, 그것들 합류 액체를, 채널 높이가 채널 폭보다 작은 혼합실로 도입하는 공정을 포함한다.
형태 1-3에 사용되는 액체 혼합방법의 다른 예에서는 마이크로 채널에 도입된 액체를 상하방향으로 적층하도록 합류하는 공정을 포함한다.
형태 1-3에 사용되는 액체 혼합방법의 다른 예에서는 마이크로 채널에 도입된 액체를 합류후 하나의 예혼합용 마이크로 채널에 도입시킨 후에 혼합실로 도입하는 공정을 포함한다.
형태 1-4
본 발명의 형태 1-4는, 혼합 촉진수단으로서 각 액체 도입용 마이크로 채널로부터 분기되는 복수의 분기 채널이 집합하여 접속되는 합류부로서, 복수의 분기 채널끼리가 3차원 공간상에서 서로 다르게 배치되는 형태로 혼합용 마이크로 채널에 접속되는 합류부를 가진다.
형태 1-4의 일례에서는, 복수의 기판을 라미네이트하여 형성되는 층구조로서, 복수의 기판이 분기 채널의 대략 합류방향 또는 대략 분기방향에서 겹쳐진 층구조를 가진다. 바람직하게는 합류부의 채널은 곡선적인 형상이다.
형태 1-4 장치의 제법의 일례는, 합류부의 채널을 포토리소그래피기술을 사용하여 제작하는 공정을 포함한다. 그 제법의 다른 예는, 합류부의 채널의 단면형상을 곡선적인 형상으로 가공하면 좋다.
형태 1-4의 다른 예는, 액체를 도입하기 위한 복수의 액체 도입구를 가지는 1군의 액체 도입용 마이크로 채널 및 이들 채널이 접속되는 혼합용 마이크로 채널을 가지는 액체 혼합장치로서, 상기 복수의 액체 도입구가 기하학적 배치로 설치되어 있는 액체 혼합장치에 관한 것이다. 그 기하학적 배치의 예는 직선형상, 원호형상, 또는 타원형상이다.
복수의 액체 도입구를 가지는 형태 1-4의 일례에서는 각 액체 도입용 마이크로 채널의 채널 폭이 혼합용 마이크로 채널보다 좁은 액체 도입용 마이크로 채널이 집합하여 혼합용 마이크로 채널이 형성된다. 이 형태의 다른 예는, 액체의 적어도 일부를 전기침투류에 의하여 구동하는 장치로서, 복수의 액체 도입구의 기하학적 배치에 대응하도록 분기형상의 구동 전극이 착탈 자유롭게 설치되는 장치이다. 이 형태의 또 다른 예에서는, 액체의 적어도 일부를 펌프 압력에 의하여 구동하는 장치로서, 복수의 액체 도입구의 기하학적 배치에 대응하도록 분기형상의 액압 도입관이 착탈 자유롭게 설치되는 장치이다.
복수의 액체 도입구를 가지는 형태 1-4의 다른 예에서는 복수의 액체 도입구에 대하여 이것과 대략 동일 평면상에서 배치되는 구동 전극이 설치된다. 이 형태의 다른 예에서는 액체 도입용 마이크로 채널군의 각각에 펌프압력 및/또는 전기침투류를 독립하여 제어 가능한 제어수단을 가진다. 이 형태의 또 다른 예에서는, 그 제어수단은 동일한 액체가 도입되는 액체 도입용 마이크로 채널군 중에서 송액이 행하여지는 채널수를 제어함으로써 동일한 액체의 혼합용 마이크로 채널에의 총유입량을 변경 가능하게 한다. 이 형태의 또 다른 예에서는 상기 제어수단은 동일한 액체가 도입되는 각 액체 도입용 마이크로 채널의 제어 밸브를 제어 가능하게 한다. 상기 제어수단을 가지는 형태 1-4의 다른 예에서는, 동일한 액체가 도입되는 액체 도입용 마이크로 채널군에 대하여, 그 상류에 채널군의 채널수보다도 적은 수의 압력 펌프 또는 전기침투류 구동기구가 설치된다.
액체 도입구에 구동전극이 설치되는 형태 1-4의 일례에서는 상기 제어수단은 각 액체 도입용 마이크로 채널의 전극과 전원과의 사이를 독립으로 온/오프 제어 가능하다. 이 형태의 다른 예에서는 그 전기침투류 구동기구는, 상기 전원과 전극과의 사이를 온/오프하는 스위치 또는 릴레이를 포함한다.
형태 2-1
본 발명의 형태 2-1는, 혼합 촉진수단으로서 액체 도입용 마이크로 채널 및/또는 혼합용 마이크로 채널 내의 액체를 가열하기 위한 히터이다.
형태 2-1의 일례에서는 혼합 촉진수단이, 혼합용 마이크로 채널 내의 액체를 아래쪽으로부터 가열하기 위한 히터이다.
형태 2-1의 다른 예에서는, 복수의 액체 도입용 마이크로 채널의 적어도 하나를 가열하기 위한 적어도 하나의 히터를 포함하고, 복수의 액체 도입용 마이크로 채널이 히터에 의한 가열에 의하여 온도가 높아지는 순서로 수직방향으로 밑으로부터 적층하도록 혼합용 마이크로 채널에 접속된다.
형태 2-1에 사용되는 액체 혼합방법의 일례는, 복수의 혼합 대상의 액체를 복수의 액체 도입용 마이크로 채널을 거쳐 도입하고, 복수의 액체를 합류시켜 혼합용 마이크로 채널에 도입하는 공정으로서, 히터에 의하여 액체 도입용 마이크로 채널 및 /또는 혼합용 마이크로 채널 내의 액체를 가열하는 공정을 포함한다. 이 액 체 혼합방법의 다른 예에서는 복수의 액체를 상하방향으로 적층하여 합류시켜 혼합용 마이크로 채널에 도입하는 공정을 포함한다. 이 액체 혼합방법의 또 다른 예에서는 히터에 의하여 혼합용 마이크로 채널 내의 액체를 가열하는 공정을 포함한다. 이 액체 혼합방법의 다른 예에서는 히터에 의하여 혼합용 마이크로 채널 내의 액체를 아래쪽으로부터 가열하는 공정을 포함한다.
형태 2-1에 사용되는 액체 혼합방법의 다른 예에서는 복수의 액체 도입용 마이크로 채널의 적어도 하나의 채널 내의 액체를 히터에 의하여 가열하여 복수의 액체 도입용 마이크로 채널 내의 액체를, 온도가 높은 순으로 밑으로부터 위로 적층하여 합류시키도록 혼합용 마이크로 채널에 도입하는 공정을 포함한다.
형태 2-2
본 발명의 형태 2-2는, 혼합 촉진수단으로서 혼합용 마이크로 채널에서 합류하는 액체 사이에 형성된 계면을 흩어지게 하기 위한 기계적 변동수단을 가진다.
형태 2-2의 일례에서는 기계적 변동수단이 혼합용 마이크로 채널 내의 합류부 부근에 설치된 가동 양력면(lifting surface), 회전자 또는 요동자이다.
형태 2-2의 다른 예에서는 기계적 변동수단이, 혼합용 마이크로 채널의 벽면에 설치된 진동자이다. 형태 2-2의 또 다른 예에서는 기계적 변동수단이, 혼합용 마이크로 채널의 벽면 밖에 설치된 진동자이다. 여기서, 가동 양력면이란 동작함으로써 상하면에 압력차를 일으켜 뒤쪽으로 와도(渦度)를 형성하는 면의 것으로, 바람직하게는 단면이 날개형 형상을 한 플랩이어도 좋고, 단순한 평판면이어도 좋다.
형태 2-2의 다른 예에서는 회전자 또는 요동자가 자력에 의하여 구동된다.
형태 2-2에 사용되는 액체 혼합방법의 일례는, 2개 이상의 액체 도입용 마이크로 채널을 통하여 2종류 이상의 액체를 상기 액체 도입용 마이크로 채널이 공통지점에서 합류하고 있는 혼합용 마이크로 채널 내로 도입하여 혼합하는 공정으로서, 액체 도입용 마이크로 채널의 합류부 부근(혼합용 마이크로 채널의 상류부)에 있어서, 합류하는 액체 사이의 접촉계면을 기계적 변동수단에 의하여 흩어지게 하는 공정을 포함한다. 이 액체 혼합방법의 다른 예에서는 기계적 변동수단이, 혼합용 마이크로 채널의 외벽에 설치된 진동자, 또는 혼합용 마이크로 채널 내에 설치된 가동 양력면, 회전자 또는 요동자이다.
형태 2-2에 사용되는 액체 혼합방법의 다른 예는, 합류하는 액체를 혼합용 마이크로 채널 내에 각 액 사이의 접촉계면을 유지하도록 도입하는 공정 및 액체의 도입 완료 후, 유동을 정지하고 나서, 진동자에 의하여 각 액 사이의 접촉계면을 불안정화하는 공정을 포함한다. 이 액체 혼합방법의 일례에서는, 혼합용 마이크로 채널의 벽면에 설치되어 있는 진동자에 의하여 각 액 사이의 접촉계면을 불안정화하는 공정을 포함한다. 이 액체 혼합방법의 다른 예에서는 혼합용 마이크로 채널의 벽면밖에 설치되어 있는 진동자에 의하여 진동을 혼합용 마이크로 채널 내의 액체에 전파시켜 각 액 사이의 접촉계면을 불안정화하는 공정을 포함한다.
형태 2-3
본 발명의 형태 2-3은, 혼합 촉진수단으로서, 혼합용 마이크로 채널 내에 다수 배열된 미소한 구조물을 가진다. 형태 2-3의 일례에서는, 미소 구조물이 혼합 용 마이크로 채널의 채널 폭보다 충분히 작은 돌기 또는 홈이다.
혼합 촉진수단을 가지는 형태의 조합
본 발명의 액체 혼합장치 및 방법에는, 형태 1-1 내지 2-3에 나타내는 혼합 촉진수단을 단독으로 사용할 수도 있고, 그것들을 모두 조합하여 사용할 수도 있다.
바람직한 조합의 일례에는, 유량제어에 의하여 액체 사이의 접촉계면을 증가하기 위한 제 1 형태과, 유량제어에 의하여 증가한 액체 사이의 접촉계면을 파괴하기 위한 제 2 형태와의 조합이다. 특히 바람직한 조합으로는, 형태 1-1의 유량 독립제어와, 형태 2-1의 히터와의 조합이 포함된다. 형태 1-1에 의한 유량제어에 의하여 혼합용 마이크로 채널에서 형성되는 액체 사이의 접촉계면의 면적이 증가함과 동시에, 증가한 접촉계면이 형태 2-1의 히터에 의한 열대류로 불안정화하면, 혼합이 효과적으로 촉진된다.
마찬가지로 액체 사이의 면적을 늘릴 수 있는 제 1 형태(형태 1-1 내지 1-4)의 적어도 하나와, 액체 사이의 접촉계면을 불안정화할 수 있는 제 2 형태(형태 2-1내지 2-3)의 적어도 하나와의 조합에 의하여 혼합을 효과적으로 촉진할 수 있다.
형태 2-1의 히터는, 다른 혼합 촉진수단과 조합시키는 것이 용이하다. 예를 들면 형태 1-3의 혼합실의 아래쪽 또는 형태 1-4의 분기 채널의 합류부의 아래쪽에 히터를 사용하면, 가열되는 액체계면이 늘어나기 때문에 바람직하다. 형태 2-3의 작고 가는 구조체에 열전도율이 높은 재료를 사용하고, 이것을 히터에 의하여 가열하여도 좋다.
동일 타입의 혼합 촉진수단이어도 그것들이 동일한 마이크로칩상에 적용 가능하면, 하나의 마이크로칩상에 함께 적용할 수 있다. 예를 들면 형태 1-1 또는 1-2의 유량제어에 의한 합류 액체의 접촉계면의 증가와, 형태 1-3 또는 형태 1-4의 채널형상에 의거하는 합류 액체의 접촉계면의 증가를 동시에 사용하여도 좋다. 마찬가지로 동일한 채널상에 직렬로 적용 가능하면, 하나의 채널상에 복수의 혼합 촉진수단을 설치할 수 있다. 또한 온도 감수성의 시약이나 반응체를 사용하는 경우는, 히터 이외의 수단, 예를 들면 형태 2-2의 진동자에 의한 방법을 사용하면 좋다.
액체 혼합장치 및 방법의 마이크로칩 전기영동장치에의 적용
상기한 형태 1-1 내지 2-3의 액체 혼합장치 및 방법은, 마이크로칩 전기영동장치에 사용할 수 있다.
액체 혼합장치 및 방법을 사용하는 마이크로칩 전기영동장치의 일례에서는 변성제를 다른 농도로 함유하는 적어도 하나의 완충액을 각각 도입하기 위한 액체 도입마이크로 채널, 각 액체 도입 마이크로 채널로부터 도입된 완충액의 혼합에 의한 농도 구배영역을 형성하기 위한 혼합용 마이크로 채널, 혼합용 마이크로 채널에 분석 대상물을 함유하는 시료를 도입하기 위한 시료 도입부 및 혼합용 마이크로 채널 내에서의 액체 합류를 위한 형태 1-1 내지 2-3까지 나타내는 적어도 하나의 혼합 촉진수단을 가진다. 이 형태에서는 형태 1-1 내지 2-3의 액체 혼합장치 및 방법을 단독으로 또는 모든 바람직한 조합으로 적용함으로써 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액끼리의 혼합을 촉진할 수 있다.
상기한 각 형태의 액체 혼합수단 또는 유량 제어수단은, 하기의 형태 A 또는 형태 B에 사용할 수 있다. 그것들의 조합은, 본 명세서의 개시에 따라 모든 형태에 있어서 적용 가능하다. 본 명세서의 개시는, 그것들의 바람직한 조합 및 바람직한 조합의 실시형태를 교시한다.
[분석 대상물의 분리장치 및 방법]
상기한 목적 (3), (4) 및 (5)를 달성하는 본 발명은, 분석 대상물의 변성제의 농도 구배를 이용하는 분석 대상물의 분리장치 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 형태는, 분석 대상물의 변성제의 농도 구배영역을 형성하기 위한 마이크로 채널을 포함하여 이루어지고, 농도 구배영역에 도입된 분석 대상물이 전기영동되는 장치에 관한 것이다. 본 발명의 분리장치 및 방법에는 하기와 같이 변성제 농도 구배의 형태가 다른 "형태 A" 및 "형태 B"가 있다. 이들 형태에 있어서, 전형적인 분석 대상물은 2개 사슬 핵산이다. 2개 사슬 핵산에는 2개 사슬 DNA와 2개 사슬 RNA 등이 있다.
형태 A
형태 A에서는, 다른 농도로 변성제를 함유하는 완충액을 혼합함으로써, 변성제 농도가 연속적으로 변화되는 변성제 농도 구배를 형성한다.
형태 A의 일례는, 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액을 도입하기 위한 적어도 2개의 액체 도입용 마이크로 채널 및 상기 적어도 2개의 액체 도입용 마이크로 채널이 접속되어 있는 혼합용 마이크로 채널을 포함하여 이루어지는 마이크로칩 전기영동장치로서, 각 액체 도입용 마이크로 채널로부터 변동되는 비율로 도입 되는 각 완충액이 혼합용 마이크로 채널 내에서 합류함으로써 변성제의 농도 구배영역이 형성되는 장치이다.
형태 A의 다른 예에서는 "다른 농도로 변성제를 함유하는 2개의 완충액"이, 변성제함유 완충액과 변성제불함유 완충액(이하 단지 완충액이라고도 한다)이다.
형태 A의 마이크로칩 전기영동장치의 일례에서는, 바람직하게는 혼합용 마이크로 채널 내에서 합류하는 완충액 사이의 혼합을 촉진하기 위한 적어도 하나의 혼합 촉진수단을 가진다. 형태 A에 사용되는 혼합 촉진수단에는 상기한 형태 1-1 내지 2-3의 액체 혼합장치 및 그것들의 조합이 포함된다. 형태 A에 사용되는 혼합 촉진수단의 일례는, 따로 특별한 장치를 필요로 하지 않아 비용면에서 유리한 유량 독립제어, 예를 들면 형태 1-1의 전기침투류의 제어 또는 형태 1-1의 펌프에 의한 독립제어수단이다.
형태 A의 장치의 다른 예는, 영동용 완충액 중의 핵산 변성제의 농도 구배가 형성되는 농도 구배영역 채널(혼합용 마이크로 채널)과; 농도 구배영역 채널의 상류측에 설치되어 농도 구배영역 채널에 완충액을 공급하기 위한 복수의 리저버 및 채널(액체 도입용 마이크로 채널)을 가지는 농도 구배 형성부와; 농도 구배영역 채널의 하류측에 설치되어 농도 구배영역 채널에 2개 사슬 핵산을 포함하는 핵산 시료를 도입하기 위한 시료 도입부를 가진다. 이 형태에서는 각 리저버 내에 핵산 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액이 충전된다. 예를 들면 리저버 내의 완충액의 각각에 전위를 줌으로써 그것들에 생기는 각 전기침투류를 제어할 수 있어 전기침투류의 제어에 의하여 임의의 리저버로부터의 완충액을 적절한 유량으로 농도 구배영역 채널 내에 공급할 수 있다. 완충액의 공급은 전기침투류에 의한 구동에 한정되지 않는다. 상기 리저버 및 채널에 형태 1-1 및 1-2에 있어서 설명한 바와 같은 펌프 및/또는 밸브를 설치함으로써 각 리저버로부터 완충액의 공급을 제어할 수 있다.
상기 액체구동을 위한 제어수단을 사용하여 농도 구배 형성부의 리저버 및 채널로부터 핵산 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액을 농도 구배영역 채널 내로 변동하는 비율로 합류시킬 수 있다. 농도 구배영역 채널 내에 도입되는 다른 농도의 완충액의 유입 비율을 연속적으로 변화시킴으로써, 농도 구배영역 채널 내에 핵산 변성제 농도 구배를 형성할 수 있다. 이 농도 구배영역에 핵산 시료를 도입하여 전기영동할 수 있다.
형태 A의 장치의 일례에서는, 농도 구배영역 채널(9)을 가지고, 그 상류측에 농도 구배 형성부(2)가 설치되고, 그 하류측에 시료 도입부(3)를 가지는 전기영동부(4)가 설치된다. 또한 이 형태에서는 농도 구배 형성부(2)에는 변성제함유 완충액이 충전되는 제 1 리저버(5)와 이것에 통하는 제 l 채널(7)과; 핵산 변성제 불함유 완충액이 충전되는 제 2 리저버(6)와 이것에 통하는 제 2 채널(8)을 포함한다. 이 형태에서는 제 1 채널(7)과 제 2 채널(8)이 합류함으로써 농도 구배영역 채널(9)이 형성된다. 또한 이 형태는, 제 1 리저버(5)에 접속되는 제 1 전극(10)과 이것에 접속되는 제 1 전원(11) 및 제 2 리저버(6)에 접속되는 제 2 전극(12)과 이것에 접속되는 제 2 전원(13)을 더 포함한다.
상기한 형태에서는 제 1 및 제 2 전원(11, 13)의 각 전위를 제어함으로써 변 성제함유 완충액과 변성제 불함유 완충액의 각각에 생기는 전기침투류를 제어하여 2종의 액체를 변동하는 비율로 혼합할 수 있다. 그것들 완충액이 변동하는 비율의 혼합에 의하여 농도 구배영역 채널(9) 내에 변성제 농도 구배영역을 형성하면서 전기영동부(4)에 도입할 수 있다(각 부호는 도 59 내지 도 64를 참조).
형태 A의 장치의 다른 예에서는, 또한 농도 구배 형성부에 제 1 리저버 또는 제 1 채널 내의 액체를 구동 가능한 제 1 펌프(14) 및 제 2 리저버 또는 제 2 채널 내의 액체를 구동 가능한 제 2 펌프(15)를 포함한다(각 부호는 도 59 내지 도 64를 참조). 이 형태에서는, 제 1 전원과 제 2 전원에 의한 전위의 부여를 제어하는 것 및 제 1 펌프와 제 2 펌프의 각 출력을 제어함으로써, 변성제함유 완충액 및 완충액의 각 유량을 제어할 수 있다.
형태 A의 장치의 다른 예에서는, 전기영동부에 설치되는 시료 도입부에 핵산시료가 충전되는 제 3 리저버와 이것에 통하는 제 4 채널 및 핵산시료 폐액용 제 4 리저버와 이것에 통하는 제 5 채널을 포함한다. 이 형태에서는 제 4 채널과 제 5 채널이 농도 구배영역 채널과 교차하여 연통되어 있고, 또한 제 3 리저버에 접속되는 제 3 전극과 이것에 접속되는 제 3 전원 및 제 4 리저버에 접속되는 제 4 전극과 이것에 접속되는 제 4 전원을 포함한다. 이 형태에서는 제 3 및 제 4 전원의 각 전위를 제어하는 것 및 전기침투류 및/또는 전기영동을 일으키게 함으로써 핵산 시료를 농도 구배영역 채널에 도입할 수 있다. 핵산 시료의 공급은 전기침투류에 의한 구동에 한정되지 않는다. 상기 리저버 및 채널에 형태 1-1 및 1-2에 있어서 설명한 바와 같은 펌프 및/또는 밸브를 설치함으로써 리저버로부터의 핵산 시료의 공급을 제어할 수 있다.
형태 A에 사용되는 다른 예에서는, 전기영동부(4)에는 농도 구배영역 채널상의 하류측(시료 도입부보다 하류측)에 설치된 폐액용 제 5 리저버(24) 및 제 5 리저버(24)에 접속되는 제 5 전극(25)과 이것에 접속되는 제 5 전원(26)을 포함한다(각 부호는 도 59 내지 도 64를 참조). 이 형태에서는 시료 도입부(3)로부터 도입된 핵산 시료를 농도 구배영역 채널(9) 내에서 전기영동할 수 있다.
형태 A에 사용되는 분석 대상물의 분리방법의 일례에서는, 마이크로칩 내의 채널에 변성제함유 완충액과 완충액의 비율을 바꾸어 혼합함으로써 변성제의 농도 구배를 형성하고, 채널 내에 2개 사슬 핵산을 포함하는 핵산 시료를 도입하여 도입된 핵산 시료를 전기영동에 의하여 이동시켜 분리하는 방법이다.
형태 A에 사용되는 분리방법의 다른 예에서는, 핵산 변성제의 농도 구배를 형성하기 위한 농도 구배영역 채널을 가지고, 농도 구배영역 채널의 상류측에 핵산 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액의 각각을 공급하기 위한 복수의 리저버 및 채널이 설치되고, 그 하류측에 2개 사슬 핵산을 포함하는 핵산 시료를 도입하기 위한 시료 도입부가 설치된 마이크로칩상에서 실시되는 방법으로서, 각 리저버 내의 완충액의 각각에 전위를 줌과 동시에 그것들에 생기는 각 전기침투류를 제어하여 그것들 완충제를 변동하는 비율로 혼합시키면서 농도 구배영역 채널 내로 도입하여 농도 구배영역 채널 내에 핵산 변성제의 농도 구배를 형성하는 공정 및 농도 구배영역 채널 내에 핵산 시료를 도입하여 전기영동하는 공정을 포함한다.
형태 B
본 출원인은, 상기한 형태 A에 관한 장치 및 방법을 일본국 특원2003-392302호로서 출원하였다. 그러나 본원에서는 종래의 DGGE의 농도 구배 형성방법에 한정되지 않고, 또한 대량 생산이 용이하고 재현성이 높은 분석을 가능하게 하는 분리기술도 제공한다.
형태 B에서는, 다른 농도로 변성제를 함유하는 완충액끼리를 혼합할 필요가 없는 분리장치 및 방법에 관한 것이다. 형태 B에서는 변성제의 농도 구배가 불연속인 변성제 농도 구배를 이용하는 분석 대상물의 분리방법, 그것을 위한 완충액영역 배열의 형성방법 및 그것들을 사용한 마이크로칩 전기영동장치에 관한 것이다.
형태 B는, 분석 대상물의 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액영역을 영동방향으로 교대로 배치하고, 완충액영역의 배열에 분석 대상물을 도입하여 전기영동하는 공정을 포함한다.
형태 B의 일례에서는, 완충액영역의 배열 중, 변성제를 함유하지 않은 또는 낮은 농도로 함유하는 완충액영역의 각각의 길이(영동방향의 폭)가 하류측을 향하여 점차 작아지도록 배열된다. 형태 B의 다른 예에서는 완충액영역의 배열 중, 변성제를 높은 농도로 함유하는 완충액영역의 길이(영동방향의 폭)가 하류측을 향하여 점차 커지도록 배열된다.
형태 B의 다른 예에서는, 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액영역의 배열이 마이크로 채널 내에 형성된다. 이 경우, 마이크로 채널 내에 소정의 농도로 변성제를 함유하는 제 1 완충액과 이것과는 다른 농도로 변성제를 함유하는 제 2 완충액을 교대로 도입함으로써, 마이크로 채널 내에 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액영역을 교대로 배열한다. 이 형태에서는 상기한 형태 1-1 및 1-2에 사용되는 유량제어의 수단을 사용하여 마이크로 채널 내에 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액영역을 교대로 도입할 수 있다.
형태 B의 다른 예에서는, 완충액영역을 교대로 배열하는 공정이, 제 1 마이크로 채널 내에 제 1 완충액을 도입하고 나서, 제 1 마이크로 채널과 교차하는 제 2 마이크로 채널에 제 2 완충액을 도입함으로써, 제 1 마이크로 채널 내의 제 1 완충액이 제 2 마이크로 채널 내의 제 2 완충액에 의하여 그것들의 교차부에서 분단하는 공정, 및 상기 공정에 따라 제 1 완충액과 제 2 완충액을 교대로 이송하는 공정을 포함한다. 이들 공정에 의하여 제 1 마이크로 채널 내에 제 1 완충액과 제 2 완충액의 교대 배열을 형성한다. 이 형태에서는 제 1 완충액의 이송량을 조절함으로써, 제 1 완충액의 영동방향의 길이를 점차로 변화시키는 공정을 포함할 수도 있다.
형태 B의 방법을 사용하는 장치의 일례는, 마이크로칩 전기영동장치로서, 전기영동을 행하기 위한 제 1 마이크로 채널과, 제 1 마이크로 채널 내로 제 1 완충액을 도입하는 수단과, 제 1 마이크로 채널 내에서 제 1 완충액과는 다른 농도로 변성제를 함유하는 제 2 완충액을 도입하는 수단과, 제 1 마이크로 채널에 2개 사슬 핵산을 포함하는 시료를 도입하는 수단을 가진다.
형태 B의 다른 예는, 2개 사슬 핵산의 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액영역의 배열을 전기영동용 기판에 형성하기 위한 방법으로서, 완충액영역의 배열을 형성해야 할 기판을 스테이지수단에 유지하고, 기판에 대하여 2개 사슬 핵산의 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액을 사출하기 위한 사출수단을 설치하여 상기 스테이지수단 및/또는 상기 사출수단을 위치 제어함과 동시에 사출수단을 차례로 구동함으로써 상기 기판에 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액영역을 배열하는 방법에 관한 것이다.
형태 B에 의한 완충액영역 배열형성을 위한 방법의 다른 예에서는, 기판으로서 전기영동용 마이크로칩 기판을 유지하고, 유지된 마이크로칩 기판의 마이크로 채널 내에 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액영역의 배열을 배치한다. 또 다른 예에서는 상기 기판 대신에 전기영동용의 평판 겔을 유지하고, 유지된 평판 겔에 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액영역의 배열을 배치한다.
형태 B에 의한 완충액영역 배열형성을 위한 장치의 일례는, 2개 사슬 핵산의 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액영역의 배열을 전기영동용 기판상 또는 평판 겔에 형성하기 위한 장치로서, 완충액영역의 배열을 형성해야 할 기판 또는 평판 겔을 유지하기 위한 스테이지수단과, 기판 또는 평판 겔에 대하여 2개 사슬 핵산의 변성제를 다른 농도를 함유하는 완충액을 사출하기 위한 사출수단과, 상기 스테이지수단 및/또는 상기 사출수단을 위치 제어함과 동시에 사출수단을 차례로 구동하기 위한 제어수단을 가진다.
형태 B에 의한 완충액영역 배열형성을 위한 장치 및 방법의 다른 예에서는, 상기 사출수단이 혼합 촉진수단을 가지는 형태 1-1 내지 형태 2-3의 액체 혼합장치 및 방법을 이용할 수 있다. 이 형태에서는 상기 사출수단에 공급된 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액끼리의 혼합이 적절한 액체 혼합수단에 의하여 촉진된다.
본 발명은, 마이크로 스케일로 미소량의 액체를 신속하고 또한 균일하게 혼합할 수 있는 액체 혼합장치 또는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하여 제공되는 액체 혼합장치 또는 방법은, 현존하는 또는 앞으로 개발될 모든 μTAS, 예를 들면 마이크로 화학 분석장치나 마이크로 화학 반응장치(마이크로 리액터)에 적용할 수 있고, 그 결과, 마이크로 스케일로 행하여지는 실험조작의 간략화, 분석시간 및 반응시간의 단축화 및 높은 스루풋화, 게다가 칩의 소형화, 고정밀도화(예를 들면, 고분해능화)가 가능해지는 등, 여러가지 이점을 가져온다.
본 발명은, 다른 측면에서 분석 대상물의 변성제의 농도 구배를 이용하여 분석 대상물을 분리하기 위한 장치 및 방법 및 변성제 농도 구배의 형성장치 및 방법을 제공한다. 특히 본 발명은 마이크로칩상에서 DGGE를 행하기 위한 마이크로칩 전기영동장치 및 전기영동법을 제공한다. 본 발명은 마이크로 스케일로 액체 혼합을 촉진하기 위한 일련의 기술을 마이크로 채널 내에서의 완충액끼리의 혼합에 적용함으로써 DGGE에 유용한 마이크로칩 전기영동장치 및 전기영동법도 제공한다.
본 발명에 의한 DGGE 마이크로칩 전기영동장치 및 그 전기영동법에 의하면, 핵산 변성제의 농도 구배를 정확하게 형성할 수 있고, 또 농도 구배의 형성을 자유롭게 제어할 수 있다. 특히 항상 동일한 변성제 농도 구배 또는 배열을 재현할 수 있는 분석용 칩을 대량으로 제공하는 것이 가능하다. 그 결과, 각각의 데이터 사이에서의 엄밀한 비교 및 검토가 가능해지고, 예를 들면 분석되는 시료에 함유되는 핵산의 비교(전형적으로는 rRNA 유전자의 염기 배열의 비교)에 의거하는 미생물군집의 구조를 해석하는 경우, 채취 데이터의 데이터베이스화가 용이해지는 등, 여러 가지 이점을 가져온다.
[액체 혼합장치 및 방법]
본 발명의 액체 혼합장치는, 액체를 도입하기 위한 적어도 2개의 액체 도입용 마이크로 채널 및 적어도 2개의 액체 도입용 마이크로 채널이 접속되어 있는 혼합용 마이크로 채널을 포함하여 이루어지고, 각 액체 도입용 마이크로 채널로부터 도입된 각 액체가 상기 혼합용 마이크로 채널 내에서 합류하는 액체 혼합장치로서, 상기 혼합용 마이크로 채널 내에서 합류하는 액체 사이의 혼합을 촉진하기 위한 혼합 촉진수단을 가진다.
본 발명에 의한 제 1 형태에 있어서, 혼합 촉진수단은, 혼합되는 액체 사이의 계면의 면적을 증가하는 수단이다. 제 1 형태의 액체 혼합장치의 예에는, 하기에 나타내는 형태 1-1, 1-2, 1-3 및 1-4가 포함된다.
본 발명에 의한 제 2 형태에 있어서, 혼합 촉진수단은, 혼합되는 액체 사이의 계면을 열적, 기계적 및/또는 구조적 수단에 의하여 불안정화하는 수단이다. 제 2 형태의 액체 혼합장치의 예에는 하기에 나타내는 형태 2-1, 2-2 및 2-3이 포함된다.
이하, 본 발명의 각 형태에 대하여 순서대로 설명한다.
형태 1-1(도 4 ~ 도 7)
본 형태의 장치의 혼합 촉진수단은, 액체 도입용 마이크로 채널에 도입하는 액체의 유량을 다른 액체 도입용 마이크로 채널과 독립하여 제어할 수 있는 적어도 하나의 액체 도입수단이다.
도 4는 본 형태의 장치를 나타낸다. 이 장치는, 제 1 시약 용액이 충전된 제 1 리저버(5)와, 제 2 시약 용액이 충전된 제 2 리저버(6)와, 제 1 리저버(5)에 통하는 제 1 채널(액체 도입용 마이크로 채널)(7)과, 제 2 리저버(6)에 통하는 제 2 채널(액체 도입용 마이크로 채널)(8)과, 제 1 채널(7)과 제 2 채널(8)이 연결되는 제 3 채널(혼합용 마이크로 채널)(9)과 제 3 리저버(10)를 포함하고, 또한 제 1 리저버(5)에는 제 1 전극(11)을 포함하고, 또한 제 2 리저버(6)에는 제 2 전극(12)을 포함하고, 또한 제 3 리저버(10)에는 제 3 전극(13)을 포함한다.
제 1 전극(11)과 제 3 전극(13)과의 사이에 전압 V1을 인가하면, 생기는 전기침투류에 의하여 제 1 리저버(5)로부터는 제 1 시약 용액이 제 1 채널(7)을 통하여 제 3 채널(9)에 도입된다. 마찬가지로 제 2 전극(12)과 제 3 전극(13)과의 사이에 전압 V2를 인가하면 제 2 리저버(6)로부터는 제 2 시약 용액이 제 2 채널(8)을 통하여 제 3 채널(9)에 도입된다.
일반적으로 마이크로 채널에서는, 2액이 합류하면 층류가 형성되어 2액이 접하는 계면이 안정적으로 유지된다. 이 때문에 확산 계수가 작은 공시액의 경우, 확산에 의한 혼합이 충분히 행하여지지 않아, 2층으로 분리된 채로 혼합용 마이크로 채널 내를 흐르는 것이 알려져 있다. 이때 도 5(b)의 실선으로 나타내는 바와 같이 전압 V1과 전압 V2에 적절하게 변동성분을 주면, 2액이 형성되는 계면에 불안정을 일으켜 2액이 접하는 계면의 면적이 넓어지는, 또는 계면구조를 붕괴시킬 수 있기 때문에, 2액을 고속으로 또한 균일하게 혼합할 수 있다. 따라서 전압 V1과 전압 V2에 적절하게 변동성분을 줌으로써 제 1 시약 용액과 제 2 시약 용액을 제 3 채널(9)상에서 임의의 비율로 신속하게 혼합할 수 있다. 또한 전압 V1과 전압 V2을 도 5(a)의 파선, 일점쇄선과 같이 연속적으로 변화시키면, 제 1 시약 용액과 제 2 시약 용액의 유량비를 연속적으로 변화시킬 수 있다. 여기서 도 5(b)의 파선, 일점쇄선과 같이 전압신호에 변동성분을 겹치게 하면 제 1과 제 2 시약 용액이 충분히 혼합되어, 제 3 채널(9)에 시약 용액의 농도 구배영역을 신속하게 형성할 수 있다. 변동성분으로서는 정현파, 톱파, 직사각형파 등 및 그것들의 조합도 생각할 수 있다. 또 확산의 촉진이나 유량 유지를 위해 각 채널의 변동성분의 위상을 어긋나게 하는 것도 생각할 수 있다.
도 6은 본 형태의 일례를 나타내는 것이다. 제 1 시약 용액이 충전된 제 1 리저버(5)와, 제 2 시약 용액이 충전된 제 2 리저버(6)와, 제 1 리저버(5)에 통하는 제 1 채널(액체 도입용 마이크로 채널)(7)과, 제 2 리저버(6)에 통하는 제 2 채널(액체 도입용 마이크로 채널)(8)과, 제 1 채널(7)과 제 2 채널(8)이 연결되는 제 3 채널(혼합용 마이크로 채널)(9)과 제 3 리저버(10)를 포함하고, 또한 제 1 리저버(5)에는 제 1 전극(11)을 포함하고, 또한 제 2 리저버(6)에는 제 2 전극(12)을 포함하고, 또한 제 3 리저버(10)에는 제 3 전극(13)을 포함한다. 또한 제 1 리저버(5)와 제 2 리저버(6)에 각각 제 1 펌프(14)와 제 2 펌프(15)를 부가한 구조이다.
이들 펌프에 의한 송액에 의하여 도 4에서의 전기침투류에 의한 송액을 보조할 수 있어, 시약 용액의 점성이 높은 경우에서도 비교적 고속으로 송액할 수 있다. 이 경우, 도 7(b)의 실선에 나타내는 바와 같이 제 1 펌프(14)와 제 2 펌프 (15)의 송액압에 적절하게 변동성분을 주면, 2액이 형성되는 계면에 불안정을 일으켜 2액이 접하는 계면의 면적이 넓어지는, 또는 계면구조를 붕괴시킬 수 있기 때문에, 2액을 고속으로 균일하게 혼합할 수 있다. 따라서 제 1 펌프(14)와 제 2 펌프(15)의 송액압에 적절하게 변동성분을 줌으로써, 제 1 시약 용액과 제 2 시약 용액을 제 3 채널(9)상에서 임의의 비율로 신속하게 혼합할 수 있다. 또한 제 1 펌프(14)와 제 2 펌프(15)의 송액압을 도 7(a)의 파선, 일점쇄선과 같이 연속적으로 변화시키면, 제 1 시약 용액과 제 2 시약 용액의 유량비를 연속적으로 변화시킬 수 있다. 여기서 도 7(b)의 파선, 일점쇄선과 같이 송액압에 변동성분을 겹치게 하면 제 1 시약 용액과 제 2 시약 용액이 충분히 혼합되어, 제 3 채널(9)에 시약 용액 농도 구배영역을 형성할 수 있다. 또 도 6에 있어서 펌프(14)와 펌프(15)의 송액압 및 전극(11)과 전극(12)의 부여 전위를 동시에 제어하여, 더욱 효과적인 확산촉진과 농도 구배의 제어를 실시하는 것도 가능하다. 변동성분으로서는 정현파, 톱파, 직사각형파 등 및 그것들의 조합도 생각할 수 있다. 또 확산의 촉진이나 유량 유지를 위해 각 채널의 변동성분의 위상을 어긋나게 하는 것도 생할 수 있다
형태 1-2(도 8 ~ 도 22)
본 형태의 장치의 혼합 촉진수단은, 적어도 하나의 액체 도입용 마이크로 채널에 설치된 고속작동 밸브이다.
도 8은 본 형태의 마이크로칩 장치의 채널의 개략 구성을 나타내고, 도 9는 본 형태의 마이크로칩의 구체적인 구성을 나타낸다. 이 마이크로칩의 마이크로 채널은 2개의 액체 도입용 마이크로 채널(130a, 130b) 및 이들이 합류하는 하나의 혼 합용 마이크로 채널(31)로 이루어진다. 본 형태에 따라 액체 도입용 마이크로 채널의 하나에는 고속동작 밸브(132)가 설치되어 있다.
도 9는 마이크로칩 전체의 구성을 나타낸다. 또 도 10은 고속작동 밸브 기구의 부분을 확대하여 나타내고, 도 11은 그 고속작동 밸브의 단면을 나타낸다. 도 9에 나타내는 바와 같이 액체 도입용 마이크로 채널의 각 리저버로부터 A액과 B액이 실린지 펌프(P)로 가압되어, 각 액체 도입용 마이크로 채널(130a, 130b)에 각각 도입되고, 하나의 혼합용 마이크로 채널(131)에서 합류한다. A액을 도입하는 액체 도입용 마이크로 채널(130a)의 도중에는 피에조소자 구동에 의한 고속작동 밸브(132)가 구비되어 있다. 그 고속작동 밸브가 개폐됨으로써 A액의 액체 도입용 마이크로 채널(130a)로부터 혼합용 마이크로 채널(131)로의 도입이 제어된다. 고속작동 밸브(132)의 제어에 의하여 A액의 유입량에 변동이 주어지고, 혼합용 마이크로 채널(131) 내에 공급되는 액의 A액과 B액의 혼합비 등을 제어할 수 있다.
고속작동 밸브는, 도 11[액체 도입용 마이크로 채널(30a)의 축방향 단면] 및 도 12에 나타내는 바와 같이 액체 도입용 마이크로 채널(130a)의 일부를 포함한다. 그 부분은 PDMS(폴리디메틸실록산)제의 막으로 생긴 두께 20 ㎛, 폭 300 ㎛ 정도의 밸브체(133)이다. 동일한 채널 내에서 밸브체에 근접하는 곳에 돌기(134)를 설치하고, 밸브체(133)에 대하여 외부로부터 맞닿는 φ250 ㎛ 정도의 압자(135)를 설치하여 이 압자(135)가 피에조소자에 의하여 구동되는 구성으로 되어 있다. 밸브체(133)와 돌기(134)와의 사이의 공간은 10 ㎛ 정도의 미세 간극(h)으로 되어 있다. 밸브체(133)가 응답주파수 10kHz 이상에서 동작하는 피에조소자에 의하여 직접 상 하로 고속 구동됨으로써 그 미세 간극(h)의 개폐가 행하여진다.
본 형태에 사용되는 고속작동 밸브에 의한 적합한 기능은, 밸브 개폐동작이 고속성인 것 및 그 개폐시의 작동 체적(밸브의 밸브체가 움직여 채널을 폐쇄할 때에 채널 내에 있던 액체가 밀어 내지는 체적에 상당한다)이 작은 것이다. 이점, 본 형태와 같이 채널 내의 돌기를 반원기둥형상 등으로 하여 밸브체가 돌기와 선 접촉에 가까운 형으로 접촉하도록 하고, 또 밸브체가 상하하는 스트로크(h)도 10 ㎛ 정도의 미소로 하는 것이 바람직하다.
또, 본 형태에 사용할 수 있는 다른 고속작동 밸브로서는, 잉크젯 프린터에서 사용되고 있는 밸브가 있다. 예를 들면 열로 액체 도입용 마이크로 채널을 국소적으로 가열함으로써, 액체 도입용 채널 내를 흐르고 있는 액체를 기화시켜 체적을 팽창시키고, 이것에 의한 액체 도입용 채널로부터 혼합용 마이크로 채널로의 일정한 미소유량의 토출을 고속으로 제어할 수 있는 밸브를 사용하여도 좋다.
도 13 및 도 14를 참조하여, 고속작동 밸브에 사용되는 반원기둥형상의 돌기(134)의 제작방법을 설명한다. 유리 기판에 50 ㎛의 후막 레지스트를 도포하고, 포토리소그래피공정에서 채널형성 패턴을 g선(파장 436 nm의 자외광)에 노광하여 현상한다. 도 13에 나타내는 바와 같이 액체 도입용 마이크로 채널의 채널 폭은 예를 들면 100 ㎛ 이고, 반원기둥형상 돌기를 형성하는 부분에 직교하도록 채널 폭 100 ㎛의 라인 패턴을 실시한다. 도 14(도 13의 A-A 단면)에 나타내는 바와 같이, 그 브리지 패턴을 반원기둥형상의 돌기형상으로 변형시키기 위해 레지스트 패터닝한 유리 기판을 항온로에 투입하여 300℃에서 20분간 가열처리를 실시한다. 이에 의하여 레지스트는 250℃ 이상에서는 연화되기 때문에, 에지가 표면 장력으로 둥글게 변형되고, 최종적으로는 반원기둥형상이 된다. 이어서 이 기판을 드라이에칭을 한다. 유리 기판을 에칭하면 레지스트도 함께 에칭되어 가기 때문에, 결과적으로 레지스트형상을 유리 기판에 그대로 전사할 수 있다. 이와 같은 가공은 RIE(Reactive Ion Etching)를 사용할 수도 있으나, 형상의 전사성을 양호하게 행하기 위해서는 중성입자 빔가공이 바람직하다. 이와 같이 하여 액체 도입용 마이크로 채널 내에 적절한 돌기구조를 형성할 수 있다.
본 형태에 사용되는 고속작동 밸브의 "고속으로 개폐동작"이란, 밸브체의 응답 주파수로서 약 10Hz 이상, 바람직하게는 10∼20 kHz의 주기를 가지는 동작을 의미한다.
다음에 도 15 내지 도 21을 참조하여 본 형태의 액체 혼합방법에 대하여 설명한다.
상기한 구성의 마이크로칩에 있어서 A액과 B액을 도입할 때에, A액의 액체 도입용 마이크로 채널상에 설치된 고속작동 밸브를 일정한 주기로, 고속으로 개폐동작시킨다. 그와 같이 액체의 유량에 짧은 시간간격으로 변동을 주면, 혼합용 마이크로 채널 내에 형성되는 A액과 B액 사이의 접촉계면은, 도 15의 혼합용 마이크로 채널(31) 중에 그려진 바와 같은 "주름(wave)"형상이 된다. 고속작동 밸브를 통과하여 도입되는 액체 A는, 혼합용 마이크로 채널의 폭방향에 차지하는 비율을 짧은 시간으로 연속적으로 변화시킬 수 있다. 따라서, 액체 A는, 혼합용 마이크로 채널 내에서 합류하는 다른 액체 B와의 접촉면적이 증가한다. 이와 같이 하여 2액 의 접촉계면이 넓어져 2액의 확산 혼합이 진행되기 쉬워진다.
고속작동 밸브를 사용하지 않는 종래의 방식에서는 도 28에 나타내는 바와 같이 2액의 계면은 혼합용 마이크로 채널 내에서 대략 직선적으로 형성된다. 예를 들면 폭 200 ㎛의 채널에서 흐름의 진행방향으로 단위길이를 취하였을 때, 고속작동 밸브를 사용함으로써 형성된 50 ㎛ 주기로 폭 100 ㎛의 주름형상의 계면(도 15참조)을 평평한 계면(도 28 참조)과 비교하여 주름형상을 정현파로 근사하면, 그 표면적은 4배로 넓어져 있다.
2개의 계면 사이의 주름의 형성에 의하여 혼합시간이 어느 정도 단축되는지는 다음의 계산모델로 나타낸다. 도 16의 모델에 있어서, 주름의 주기가 L일 때, 그 반의 L/2까지 확산이 진행되면, 실제로는 주름의 양측에서 확산이 진행되기 때문에 혼합이 완료되었다고 생각된다. 액체의 확산에 대한 단순확산의 계산 모델은, 다음 수학식 (1)에서 기술하는(D0 = 확산 계수[㎡/sec](변성제 ; 1-10, 물 ; 10-9로 한다), t = 시간[sec])
Figure 112006043618114-PCT00001
예를 들면, 변성제(확산 계수 D0 = 10-11)의 경우, 5분으로 혼합을 완료하도록주기 L = 2σ를 설계하면, 그 계산은 다음 수학식 (2)로 나타낸다.
Figure 112006043618114-PCT00002
상기한 바와 같이 확산 거리(σ)가 77[㎛]가 된다. 이것은 주름 사이의 간격이 50 ㎛ 이면 5분으로 혼합을 완료할 수 있는 것을 나타낸다. 이 시간은 DGGE 분석을 행하기 위해서는 충분히 짧다.
도 17의 장치에서는, 도 15의 혼합장치보다 더욱 혼합효율을 높일 수 있다. 이 장치에는 2개의 액체(A, B)를 위한 2개의 액체 도입용 마이크로 채널의 각각에 고속작동 밸브(밸브 A와 밸브 B)가 설치되어 있다. 이 형태에 적합한 고속작동 밸브의 운전타임 챠트의 예를 도 18 및 도 19에 나타낸다.
상기한 형태의 장치에서는 도 18에 나타내는 바와 같이 밸브 A와 밸브 B의 개폐동작을 동기시켜 밸브 A가 "개방"일 때는 밸브 B를 "폐쇄"로, 반대로 밸브 A가 "폐쇄"일 때는 밸브 B를 "개방"으로 한다. 이와 같이 함으로써 혼합용 마이크로 채널 내에서 A 액이 형성하는 주름형상의 폭을 채널의 전 폭분으로 넓힐 수 있다. 또 A 액과 B 액의 양자의 유량의 합은 항상 일정해지기 때문에, 일정한 유속으로 혼합용 마이크로 채널 내를 액체가 흐른다. 따라서 혼합용 마이크로 채널 내에 농도 구배를 작성하는 데 바람직한 제어특성이 얻어진다. 또한 형태 1-2를 사용하여 농도 구배를 형성하는 방법에 대해서는 뒤에서 설명한다.
도 17의 장치에서는, 2액 계면의 표면적이 도 14의 경우의 2배가 되고, 즉, 주름이 형성되지 않는 경우(도 28)의 8배가 된다. 도 18에서는 밸브의 개폐를 완전 개방/완전 폐쇄하고 있다. 그러나 밸브 개방도는 완전 폐쇄 또는 완전 개방 중 어느 하나의 개폐 제어뿐만 아니라, 피에조소자를 사용하여 피에조소자에 주는 전위를 조정함으로써 밸브 개방도를 가변 제어하여도 좋다. 예를 들면 도 19와 같은 운전 타임 챠트에서 운용하여도 좋다. 어쨌든 운전타임 챠트는 상기한 방식에 한정되지 않고, 다른 여러가지 방식으로 밸브의 개폐를 제어 가능하다.
도 20의 장치에서는, 또 더욱 혼합효율을 높일 수 있다. 이 장치에서는 3개의 액체 도입용 마이크로 채널(130a, 130b, 130c)이 혼합용 마이크로 채널(131)에 접속된다. A 액은, 중심위치의 액체 도입용 마이크로 채널(130a)로부터 혼합용 마이크로 채널(131)에 도입되고, B 액은, 그 양쪽에 위치하는 2개의 액체 도입용 마이크로 채널(130b, 130c)로부터 도입된다. 그것들 2개의 액체 도입용 마이크로 채널(130b, 130c)에 고속작동 밸브(밸브 1과 밸브 2)를 각각 설치하고 있다. 이들을 예를 들면 도 21의 운전타임 챠트에 나타내는 바와 같이 개폐 동작시킬 수 있고, 이에 의하여 도 20의 혼합용 마이크로 채널(131) 내에 그려진 바와 같은 주름형상의 계면을 형성할 수 있다. 이 2액의 접촉계면(주름의 전 표면적)은, 도 15의 경우의 2배가 되고, 즉, 주름이 형성되지 않은 경우(도 28)의 16배의 계면 표면적이 얻어지고, 이에 의하여 아주 고효율의 액체 혼합을 실현할 수 있다. 여기서는 A 액과 B 액의 2액체 혼합을 나타내었으나, B 액을 보내기 위한 2개의 액체 도입용 마이크로 채널(130b, 130c) 중 어느 한쪽을 C 액용으로 하면, 혼합용 마이크로 채널(131)에서 A, B, C의 3액을 적합하게 혼합할 수 있다.
다음에 도 22 내지 도 25를 참조하여 본 형태에 의하여 액체도입을 제어하는 방법에 대하여 설명한다.
A 액과 B 액을 혼합용 마이크로 채널 내에서 농도 구배를 가지도록 혼합하는 방법에 있어서, A 액 및 B 액으로서 다른 농도의 용질(예를 들면 핵산 변성제)을 함유하는 액체를 이용할 수 있다. 이 경우에 적합하도록 위에서 설명한 장치에 있어서 밸브의 개폐동작의 운전방법을 바꿈으로써 가능하다. 농도 구배를 형성하는 혼합방법의 일례는, 고속작동 밸브의 개폐주기를 일정하게 하여, 그 1주기 중, 밸브가 개방되어 있는 시간의 비율(듀티비)를 가변 제어하는 것이다.
예를 들면 밸브 A와 밸브 B의 동작을, 도 23의 운전타임 챠트와 같이 동작시키면 다른 농도를 가지는 2액의 계면의 주름형상을 그 크기를 점차 변화시키면서 형성할 수 있다(도 22의 혼합용 마이크로 채널 내에 그린 바와 같이). 그후, 5분 정도방치하면 그 계면을 통하여 2액 사이의 신속한 확산 혼합이 일어나 혼합용 마이크로 채널(31) 내에 일정한 농도 구배를 가지는 혼합액을 형성할 수 있다.
농도 구배를 형성하는 혼합방법에 적합한 운전타임 챠트의 예에 대하여 도 23을 사용하여 설명한다. 먼저 기본은 밸브 A가 "개방"일 때, 밸브 B는 "폐쇄", 반대로 밸브 A가 "폐쇄"일 때, 밸브 B는 "개방"이다. 이 기본에 따르면서 1주기의 시간을 예를 들면 100 msec(밀리초)로 설정하고,, 처음의 1주기에서는 90 msec 동안 밸브 A를 "개방"으로 한다. 다음 2주기째에서는 80 msec 동안 밸브 A를 "개방"으로 한다. 또한 다음 3주기째에서는 70 msec 동안 밸브 A를 "개방"으로 한다. 이와 같이 하여 1주기 중의 밸브 A의 개방시간을 서서히 짧게 하여 가면, 혼 합용 마이크로 채널 내에 농도가 하류방향(도면의 좌측으로부터 우측을 향하여)으로 서서히 일차 선형으로 짙어지는 농도 구배가 얻어진다.
상기한 방식으로도 충분히 확산 혼합이 진행되나, 도 24와 도 25에 나타내는 장치와 방법에 의하면 확산 혼합이 더욱 개선된다. 이 방식에서는 도 25의 운전타임 챠트에 나타내는 바와 같이, 밸브 A가 "개방"인 시간(T1)은 고정하고, 밸브 A가 "폐쇄"인 시간(T2)을 변화시킨다. T1은 바람직하게는 고속작동 밸브가 동작할 수 있는 최단의 펄스시간 동안 정도로 설정한다. 예를 들면 밸브의 응답 주파수가 1 kHz이면 최소 작동시간인 1 msec의 수배인 5 msec에 T1을 설정한다. 그리고 도 22와 같은 농도 구배를 형성하면, T2를 서서히 길게 설정하여 가면 좋다. 그와 같이 하면 도 22의 경우보다 A 액과 B 액과의 계면이 증가하기 때문에, 확산 혼합이 더욱 고속으로 진행되어 단시간으로 혼합이 완료된다.
이상의 설명에서는 2개의 액체 도입용 마이크로 채널을 합류시켜 하나의 혼합용 마이크로 채널에 송액하는 예를 나타내었다. 그러나 도 26과 같이 그 혼합 구성단위를 몇단이나 조합하여 다수회의 혼합을 행할 수도 있다. 이 경우, 각처에 도입되는 액체는 종류를 바꾸어도 좋은 것은 물론이다. 또 도 27과 같이 2개 이상의 다수의 액체 도입용 마이크로 채널(도 27에서는 4개의 액체 도입용 마이크로 채널)을 한번에 하나의 혼합용 마이크로 채널에 도입하여 혼합을 행한다고 하여도 좋다.
형태 1-3(도 30 ~ 도 35)
본 형태의 장치의 혼합 촉진수단은, 혼합용 마이크로 채널의 형상에 관한 것 으로, 혼합용 마이크로 채널의 채널 높이를 그 채널 폭보다 작게 함으로써 형성된 혼합실이다.
도 30에 나타내는 본 형태의 장치는, 혼합 대상의 액체를 도입하기 위한 2개의 액체 도입용 마이크로 채널(207, 208)과, 2개의 액체 도입용 마이크로 채널을 상하방향으로 적층하여 합류시킨 하나의 예혼합용 마이크로 채널(234)과, 예혼합용 마이크로 채널에 연결된 혼합실(230)을 포함한다. 예혼합용 마이크로 채널(234)과 혼합실(230)이 혼합용 마이크로 채널을 구성한다.
본 형태의 장치에서는 혼합 대상의 액체가 액체 도입용 마이크로 채널(207, 208)로부터 도입되고, 혼합 대상의 액체가 상하방향으로 적층하여 합류되고, 액체 도입용 마이크로 채널에 연결된 예혼합용 마이크로 채널(234)에 도입되어 합류한 액체가 예혼합용 마이크로 채널에 연결된 혼합실(230)로 도입된다. 본 형태에서는 액체 도입용 마이크로 채널 및 예혼합용 마이크로 채널이라는 좁은 채널을 통하여 액체가 편평형의 혼합실(230)에 도입됨으로써, 액체 사이의 계면 면적이 증대하고, 그것에 의하여 복수의 액체의 혼합이 촉진된다.
본 형태의 장치에서는, 액체 도입용 마이크로 채널(207, 208)의 상류에 리저버(205, 206)를 접속할 수 있고, 이 경우, 리저버(205, 206)에 2종류의 액체를 공급한다. 액체의 공급은, 공지의 어떠한 방법에 의하여 행할 수 있고, 예를 들면 기계적 또는 전기적 구동력에 의하여 행할 수 있다. 구체적으로는 송액 펌프나 밸브에 의하여 유량을 조절함으로써 행하는 것이 가능하다. 예를 들면, 리저버 사이에서의 인가 전압 또는 부여 전위를 조절함에 의한 전기침투류의 제어, 마이크로 실린지 등에 의한 송액의 압력을 조절함에 의한 송액 펌프의 제어에 의하여 각 액체의 유량을 조절할 수 있다.
본 형태에서 혼합 대상의 액체는 2종류이나, 이것에 한정되지 않고 혼합되는 액체는 2종류 이상이어도 좋다. 또 본 형태에서 액체 도입용 마이크로 채널은 2개이나, 이것에 한정되지 않고, 액체 도입용 마이크로 채널은 2개 이상으로 할 수 있다.
본 형태에 있어서 채널 높이란, 복수의 액끼리가 접함으로써 형성되는 액접촉계면에 대하여 수직한 방향의 채널 치수를 의미하고, 채널 폭이란, 액접촉 계면에 평행하고, 흐름의 방향으로 수직한 방향의 채널 치수를 의미한다. 본 형태에 있어서 예를 들면 예혼합용 마이크로 채널(234)에 대해서는 채널 폭을 500 ㎛, 채널 높이를 100 ㎛, 혼합실(230)에 대해서는 채널 폭을(최대가 되는 부분에서) 10 mm, 채널 높이를 5 ㎛로 하도록 설계할 수 있다.
본 형태에 의한 액체의 혼합 프로세스를 더욱 상세하게 설명한다. 먼저 본 형태에 있어서는, 액체 도입용 마이크로 채널 및 예혼합용 마이크로 채널 내의 액체의 흐름은 실질적으로 층류이다. 라는 것은, 액체 도입용 마이크로 채널이나 예혼합용 마이크로 채널의 폭이 좁기 때문이다. 또한 이 경향은, 액체 도입용 마이크로 채널을 흐르는 액체의 유량이 작은 경우, 더욱 현저하다. 그 결과, 예혼합용 마이크로 채널에 있어서는, 각 액체 사이의 계면에서만 혼합이 생기나, 액체 사이의 계면의 면적이 작기 때문에 각 액 사이의 혼합은 생기기 어렵다. 한편, 합류한 액체가 이 예혼합용 마이크로 채널로부터 혼합실로 유입되면 혼합실에서는 액체 사 이의 계면 면적이 커지기 때문에, 계면에 있어서의 확산 혼합에 의하여 혼합 대상의 액체가 충분히 신속하게 혼합된다.
액체 도입용 마이크로 채널은 혼합실과 직접 접속되어 있어도 좋고, 도 30의 형태와 같이 혼합실의 상류에 예혼합용 마이크로 채널이 설치되어도 좋다. 그러나 도 30의 형태와 같이 혼합실의 상류에 예혼합용 마이크로 채널을 설치하는 것이 바람직하다. 왜냐하면 예혼합용 마이크로 채널이 없고, 2개의 액체 도입용 마이크로 채널로부터 직접 혼합실에 접속한 경우, 채널 폭이 급격하게 넓어지기 때문에, 흐름이 흩어지기 때문이다. 본 형태와 같이 혼합실의 상류에 예혼합실을 설치한 경우, 유입되는 액의 흐름은 흩어지지 않는다.
여기서 예혼합용 마이크로 채널 및 혼합실에서의 액체가 쉽게 섞이는 것을 검토한다. 계면에서의 확산 혼합을 생각한 경우, 액체가 쉽게 섞이는 것은 단위 채널 길이당의 채널 체적(V)과 접촉계면 면적(S)과의 비(S/V)에 의존한다. 이 비(S/V)는 채널 높이(H)에 의하면 1/H로 나타낼 수 있기 때문에(도 31 참조, L ; 채널 길이, W ; 채널 폭, H ; 채널 높이), 액체가 쉽게 섞이는 것은 채널 높이(H)에만 의존하는 것을 알 수 있다.
S/V = 1/H
S : 접촉계면 면적 [㎛2]
V : 유로 체적[㎛3〕
H : 유로 높이[㎛]
예를 들면 예혼합용 마이크로 채널의 각 액의 채널 높이가 50 ㎛ 이고, 혼합실의 각 액의 채널 높이가 2.5 ㎛인 경우에 대하여 검토하면, 채널 체적(V)과 접촉계면 면적(S)과의 비(S/V)는, 예혼합용 마이크로 채널에서 1/50(㎛-1), 혼합실에서 1/2.5(㎛-1)이 된다. 따라서 혼합실은 예혼합용 마이크로 채널보다 20배 정도 섞이기 쉽다고 할 수 있다.
여기서 본 형태의 장치에 있어서는, 액체 도입용 마이크로 채널을 채널의 높이방향에서 합류시킨다. 채널의 높이방향에서 합류시킴으로써 혼합실에서의 액체 사이의 계면이 충분히 넓어져 각 액 사이의 혼합이 신속하게 행하여지기 때문이다. 반대로 채널 폭방향으로 합류시킨 경우(도 32), 액체 사이의 계면면적이 채널 체적에 대하여 작아져 액체를 신속하게 혼합하는 것이 곤란해진다. 본 형태의 액체 혼합장치는, 액체 도입용 마이크로 채널이 상하방향으로 적층되어 합류하여 예혼합용 마이크로 채널 및 혼합실에서 접속되어 있다.
이어서 혼합실 내에서의 혼합시간에 대하여 검토한다. 일반적으로 액체의 확산은 단순 확산의 방정식에 의하여 기술할 수 있다.
Figure 112006043618114-PCT00003
D0 : 확산 계수[㎡/sec]
t : 시간[sec]
σ : 확산 거리[m]
이 방정식은, 확산 계수가 D0(㎡/sec)인 2개의 액체를 접촉시키면, 시간 t(sec)에 있어서 σ(m)까지 확산되어 서로 혼합된다는 것이다.
예를 들면 변성제의 확산 계수(D0)가 10-11인 경우, 5초 후의 확산 거리(σ)는 10 ㎛ 이다. 따라서 채널 높이가 20 ㎛ 이하이면, 이론적으로는 5초로 혼합을 완료시킬 수 있다. 실제로 본 형태에 있어서의 확산에 있어서는, 상하 2액의 양쪽으로부터 확산이 진행되기 때문에, 혼합실의 채널 높이를 L이라 하면, 그 절반인 L/2까지 확산이 진행되면, 대략 혼합은 완료되었다고 생각하여도 좋다. 5초로 혼합을 완료하고 싶은 경우, 실제로는 채널 높이를 10 ㎛로 설계할 수 있다. 또한 마이크로칩 DGGE 을 행하는 경우, 5초라는 혼합시간은 충분히 짧기 때문에 본 형태의 액체 혼합장치는 마이크로칩 DGGE에 적합한 액체 혼합장치라 할 수 있다.
또, 이상의 검토로부터 채널 높이를 작게 하면 혼합시간을 단축할 수 있는 것을 이해할 수 있으나, 채널 폭이 채널 높이와 마찬가지로 작으면 흘릴 수 있는 유량이 작아져 산업 응용상, 실용적이지 않다. 따라서 고속으로 송액하고, 또한 혼합시간을 짧게 하기 위하여 채널 폭을, 채널 높이보다 길게 하는 것이 바람직하다.
도 33은 다른 형태를 나타낸다. 이 형태의 장치는, 혼합 대상의 액체를 도입하기 위한 2개의 액체 도입용 마이크로 채널(207, 208)과, 2개의 채널이 상하방 향으로 적층하여 합류한 하나의 예혼합용 마이크로 채널(234)과, 예혼합용 마이크로 채널과 혼합실을 연결하는 접속부(235)와, 접속부에 연결된 혼합실(230)을 포함한다. 여기서 본 형태의 액체 혼합장치에서는, 예혼합용 마이크로 채널과 혼합실이 완만한 구배를 구비한 합류부(23)에 의하여 연결되어 있다.
본 형태와 같이 예혼합용 마이크로 채널과 혼합실이 완만하게 연결되어 있는 것이 바람직하다. 왜냐하면 예혼합용 마이크로 채널과 혼합실이 완만하게 연결되어 있는 경우, 예혼합용 마이크로 채널과 혼합실과의 합류부에서 웅덩이영역이 발생하지 않아 채널의 도중에서 액체가 소용돌이에 휘말리는 일이 없기 때문에 각 액체 사이의 계면이 흩어지지 않고 액체를 흘린 순서대로 혼합하여 혼합실로부터 인출할 수 있기 때문이다(도 34a). 한편, 접속부를 서서히 끝이 퍼지는 형상으로 하지 않는 경우, 웅덩이영역이 생겨, 그곳에 소용돌이가 발생한다. 그 결과, 복수의 액체를 액체 도입용 마이크로 채널로부터 동시에 주입하였다 하여도 웅덩이영역에서 액체가 체류하여 핀포인트로 혼합해야 할 액체가 시간적으로 전후하여 혼합실에 도달하여 혼합되게 되어 정밀한 농도 구배를 형성하는 것이 어렵게 된다(도 34b). 특히 정확한 농도 구배를 형성하는 것이 바람직한 마이크로칩 DGGE 에서는 본 형태의 액체 혼합장치는 적합하다.
도 33의 형태에 있어서는, 예를 들면, 예혼합용 마이크로 채널(234)에 대해서는 채널 폭을 500 ㎛, 채널 높이를 100 ㎛, 접속부(235)에 대해서는 채널 흐름방향의 길이를 15 mm, 혼합실(230)에 대해서는 채널 폭을 10 mm, 채널 높이를 5 ㎛로 설계할 수 있다.
도 35는 또 다른 일 형태를 나타낸다. 이 형태의 장치는, 혼합 대상의 액체를 도입하기 위한 2개의 액체 도입용 마이크로 채널(207, 208)과, 액체 도입용 마이크로 채널이 합류한 하나의 혼합용 마이크로 채널[혼합실(230)]을 포함한다. 본 형태에서는 혼합 대상의 액체가 액체 도입용 마이크로 채널(207, 208)을 거쳐 합류되나, 혼합실(230)은 합류 후의 각 액체 사이의 계면면적이 커지도록 설계되어 있다.
도 35의 형태에 있어서는, 예를 들면, 혼합실의 채널 높이를 20 ㎛, 채널 폭을 100 ㎛로 설계할 수 있다. 본 형태의 장치는, 기판을 2매 접합하여 제작할 필요가 없고, 유리의 드라이에칭으로 가공할 수 있다. 더욱 상세하게는 패턴 마스크에 Ni의 스퍼터막을 사용하여 ICP 에칭을 행함으로써 가공할 수 있다.
형태 1-4(도 36 ~ 도 43)
본 형태의 장치의 혼합 촉진수단은, 액체 도입용 마이크로 채널이 혼합용 마이크로 채널에 접속되는 합류부의 형상 및 액체 도입용 마이크로 채널의 배치 등에 관한 것이다. 상세하게는 그 혼합 촉진수단은, 액체 도입용 마이크로 채널이 복수의 분기 채널을 가지고, 분기 채널로부터 혼합용 마이크로 채널에의 합류부로서, 복수의 분기 채널끼리가 3차원 공간상에서 서로 다르게 배치되는 형태로 혼합용 마이크로 채널에 접속하는 합류부이다.
먼저, 이 형태의 기술배경을 설명한다.
본 형태는 혼합하는 액체마다 채널을 세분화하여 그것들을 포개어 넣어 합류시킴으로써 다종의 액체를 층형상으로 나열시키면서 채널 내를 흘림으로써 각 액체 의 접촉면적을 증대시켜 액체 사이의 확산을 촉진하는 것이 용이해진다는 발견에 의거한다. 검토를 더욱 진행시킨 결과, 하기의 과제가 발견되었다.
(1) 액체 도입용 마이크로 채널에의 액체 도입구가 각각의 액체에 대하여 하나인 경우, 본 형태를 실현하기 위해서는 액체마다 채널로 분기시켜, 그것들을 다시 합류시키는 구조가 필요하다. 이 구조를 2차원형상 칩의 하나의 층에 형성하는 것은 용이하지 않다. 이 구조는 3차원적인 입체 교차를 필요로 한다. 이것을 리소그래피와 에칭으로 제작하고자 하면, 1매의 칩의 표리에 에칭이나 희생층을 형성할 필요가 있어, 제조공정이 복잡해진다.
(2) 또, 채널 폭 100 ㎛ 정도의 마이크로 채널에 있어서 리소그래피와 에칭으로 제작을 행하면, 합류부가 각이 져, 송액시의 압력손실이 커진다.
(3) 각 액체의 도입방법을 위하여 하나의 액체 도입용 마이크로 채널로부터 분기시키는 구조를 취하지 않고 분기 채널수에 따라 복수의 도입구를 설치할 수 있다. 이 구조에 의하면, 2차원형상 칩의 하나의 층에 혼합용 마이크로 채널을 형성할 수 있다. 그러나 그 경우는 칩의 상류에서의, 또는 준비적 단계에서의 액체의 도입기구나 도입방법이 복잡해진다.
(4) 상기한 바와 같이 복수의 도입구를 설치한 장치에 있어서, 혼합용 마이크로 채널 내에서 혼합 액체의 혼합 농도비를 자유롭게 제어하는 방법이 확립되어 있지 않다. 예를 들면 DGGE 를 행하기 위한 마이크로칩 전기영동장치에서는, 정확하고 재현성 좋게 핵산 변성제의 농도 구배를 형성하기 위해서는 농도 구배를 정밀하게 제어하는 것에 대응할 필요가 있다.
본 형태는, 상기한 문제를 해결하는 액체 혼합장치에 관한 것이다. 또한 본 형태는, 복수의 도입구를 가지는 액체 도입용 마이크로 채널을 가지는 액체 혼합장치에 있어서, 마이크로 채널 내에서 신속하게 시약 용액을 혼합하고, 또한 흐름방향의 농도 구배를 양호하게 제어할 수 있는 장치를 제공한다.
도 36은 본 형태의 장치의 개략 구성을 (a),(c) 측면, (b) 정면 및 (d) 단면으로 나타낸다. 이 장치는, 액체를 도입하기 위한 2개의 액체 도입용 마이크로 채널(330) 및 이들이 접속되는 혼합용 마이크로 채널(331)을 구비한 마이크로칩이다. 액체는, 2개의 액체 도입용 마이크로 채널(330)(도 36의 왼쪽)로부터 들어가, 내부에서 합류하여 하나의 혼합용 마이크로 채널(331)에서 혼합된다. 액체 도입용 마이크로 채널(330)의 각각은, 빗형상으로 나뉘어진 2개의 분기 채널(330a)을 가지고, 이들 2개의 분기 채널끼리가 상하로부터 혼합용 마이크로 채널(331)에 접속된다(이 접속방향을 합류방향 Y라 부른다). 그 합류부에서는 도 36(d)의 단면 DD 및 단면 EE에 나타내는 바와 같이 분기 채널(330a)의 분기방향(X)은 합류방향(Y)에 대하여 대략 직각의 빗형상이다. 이들 분기 채널(330a) 끼리가 서로 3차원상에서 맞물리도록 통합되어, 하나의 혼합용 마이크로 채널에 합류한다. 이 형태의 합류부를 거쳐 합류하는 액체는, 마이크로 채널 내에서도 신속하고 균등하게 서로 섞일 수 있다.
도 37은 도 36의 장치의 개략 구성을 사시도 등으로 나타낸다. 이 장치는, 소정의 채널 등이 형성된 기판을 라미네이트하여 제조할 수 있다. 이 형태에서는 중간의 기판 2개의 기판을 라미네이트한 구조이다. 중간의 기판은, 각 액체 도입 용 마이크로 채널(330) 및 그것들의 분기 채널(330a) 및 혼합용 마이크로 채널(331)은 각각 1매의 기판 위에 형성되고, 혼합용 마이크로 채널(331)이 형성되어 있다(도 36(d)의 단면 BB의 것). 이것을 중심으로, 각 액체 도입용 마이크로 채널이 형성된 2개의 기판[도 36(d)의 단면 AA 및 CC의 것]을 상하로부터 라미네이트하고, 다시 덮개가 되는 기판을 라미네이트한다. 이와 같이 하여 합류방향(Y), 즉 분기방향(X)과 대략 수직한 방향에서 겹쳐진 층구조를 형성한다. 복수의 분기 채널(330a)은 하나의 액체 도입용 마이크로 채널에 이것과 대략 동일 평면상에서 설치된다. 이와 같이 합류하는 분기 채널(330a)은 빗살형상의 구조라 할 수 있다.
도 38에서는 도 36의 장치와 동일한 채널구조를 분기방향(X)[즉 합류방향(Y)과 대략 수직한 방향]에서 라미네이트하고 있다. 이 형태에서는 분기된 분기 채널마다 기판을 설치한 층구조를 형성한다.
도 39는 도 36의 단면 FF, GG 및 도 38의 합류부 구조에 곡선적 형상을 적용한 구성을 예시한다. 이와 같이 합류부의 채널은 곡선적으로 구성되어도 좋다. 이와 같이 하면 합류부에서의 압손을 저감시킨 액체 혼합장치를 제작할 수 있다.
기판의 재질은, 유리, 석영, 플라스틱, 실리콘 수지 등으로부터 적절하게 선택할 수 있다. 상기한 바와 같은 다수층의 겹침이나 표리의 복수단계의 구성은 리소그래피·에칭가공에 의하여 제작할 수 있다. 단 본 형태의 장치는, 포토리소그래피기술로 제작할 수도 있고, 합류부의 각 채널의 단면형상을 곡선(대략 유선형)으로 가공함으로써 더욱 양호하게 압손을 저감시킨다고 하여도 좋다.
다음에 액체 도입을 효율적으로 행하기 위한 형태를 설명한다. 이 형태는 복수의 도입구를 가지는 액체 도입용 마이크로 채널을 가지는 장치에 관한 것이다.
도 40의 장치에서는, 시약 용액을 도입하기 위한 복수의 액체 도입구(330a)를 가지는 액체 도입용 마이크로 채널(330)이 집합하여 혼합용 마이크로 채널(331)에 접속된다. 이 집합형 채널구성에서는 액체 도입용 마이크로 채널(330)이 모여서 생긴 폭은, 혼합용 마이크로 채널(331)의 채널 폭과 동일하다. 여기서 일군의 복수의 액체 도입구(330a)는, 동일한 액체(동일 농도의 완충액 또는 동종의 시약 용액 등, 도 40에서는 제 1 시약 용액 또는 제 2 시약 용액)를 액체 도입용 마이크로 채널(330)에 보내는 액체 도입용 마이크로 채널군에 대응하고 있다. 그것들은 기판 위에 규칙적인 기하학적 배치로 설치된다. 기하학적 배치로서는, 도 40(a) 또는 도 40(b)와 같은 직선형상이나 원호형상, 타원형상의 2차원적 배치를 들 수 있다. 또 이들 장치와같이 각각의 액체 도입구(330a)군을 위한 각 기하학적 배치는, 서로 상사형인 것이 바람직하다.
본 형태의 장치로서, 각 액체 도입구(330a)에 전극을 설치하여 액체를 전기침투류에 의하여 구동하는 것이 있다. 이 형태에서는 도 41에 나타내는 바와 같은 분기형상의 구동전극을 제작하여, 각 액체 도입구군의 소정의 기하학적 배치에 대응하 도록 설치하면 좋다. 도 41은 직선적인 기하학적 배치에 대응한 분기전극의 구성을 모식적으로 나타낸다. 이와 같은 분기전극을 착탈 자유롭게 설치함으로써 일정한 액체 도입구군으로부터 시약 용액을 효율적으로 구동할 수 있다. 예를 들면 동일한 시약 용액을 도입하는 복수의 액체 도입구(330a)에 대하여 하나의 분기전극을 사용하여 복수의 액체 도입구(330a)로부터 동시에 송액을 행할 수 있다.
도시 생략하였으나, 액체를 펌프압력에 의하여 구동하는 장치이면 그 액체 도입구군의 기하학적 배치에 대응하는 분기형상의 액압 도입관을 설치하여 모든 액체 도입구에 동시에 또한 동일하게 압력을 인가할 수 있고, 마찬가지로 시약 용액체의 효율적인 도입을 행할 수 있다. 또 본 형태의 혼합장치를 마이크로칩에 적용하는 경우, 마이크로칩 장치의 박형화를 가능하게 한다. 도 42에 나타내는 바와 같이 복수의 액체 도입구(330a)의 위치에 대응하는 분기형상의 구동전극을, 액체 도입구와 대략 동일 평면상에서 설치할 수 있다.
다음에 본 형태의 장치에 적합한 액체 도입의 제어수단 및 방법에 대하여 설명한다. 상기한 바와 같이 동일한 액체가 1군의 액체 도입구(330a)를 통하여 도입되는 형태에서는 그것들의 액체 도입용 마이크로 채널군의 상류에 펌프 또는 전기침투류 구동기구를 설치할 수 있다. 이 경우, 사용되는 펌프 또는 전기침투류 구동기구의 수가, 동종의 액체 도입을 위한 액체 도입용 마이크로 채널의 채널수보다 적어도 액체 도입을 적정하게 제어할 수 있다.
도 43은 전기침투류를 구동하기 위한 제어수단의 예를 나타낸다. 각 액체 도입용 마이크로 채널(330)로부터는 동일 시약 용액이 전기침투류에 의하여 혼합용 마이크로 채널(331)의 방향으로 피드된다. 여기서 스위치에 의하여 전원 전위차(A-C)가 인가된 채널에서는 시약 용액이 하류로 피드되고, 다른 시약 용액과 층형상으로 합류하여 혼합된다. 한편 동일 시약 용액의 채널에서도 스위치에 의하여 전원 전위차(B-C)가 부여된다. 이들 채널에 있어서는, 적절한 전위(B)를 설정함으로써 시약 용액이 하류로 흐르지 않고 또한 역류하지 않게 할 수 있다.
그것들 복수의 스위치의 온/오프를 적절하게 바꿈으로써 동일 시약 용액을 하류에 흘리는 채널의 유효갯수를 변화시키면, 그 결과 동일 시약 용액의 혼합용 마이크로 채널(331)에의 총유입량을 경시적이고 또한 독립으로 변화시킬 수 있다. 동일 시약 용액을 보내기 위한 액체 도입용 마이크로 채널의 각 군(즉 각 시약 용액마다)에 설치된 스위치군을 온/오프제어하는 것만으로, 각 시약 용액의 유입 유량을 적은 전원수로 다단계적으로 변화시킬 수 있고, 혼합용 마이크로 채널에서의 해당 시약 용액의 농도를 제어할 수 있다. 특히 그 총유입량을 경시적으로 제어하면, 혼합후의 흐름방향에 형성되는 해당 시약 용액의 농도분포를 정밀도 좋게 제어할 수 있다.
복수의 스위치에는 릴레이를 사용하여도 좋고, 또 전극 대신 또는 그 보조로서 압력 펌프를 설치하여 각 시약 용액마다 압력구동을 제어하여도 좋다. 압력 펌프를 설치하는 경우에는, 각 액체 도입용 마이크로 채널에 각각 제어 밸브를 설치하고, 그것들 제어 밸브를 구동 제어하도록 하여 각 시약 용액매의 유량을 변화시켜도 좋다.
형태 2-1(도 44 ~ 도 46)
본 형태의 장치의 혼합 촉진수단은, 액체 도입용 마이크로 채널 및/또는 혼합용 마이크로 채널에 설치된 히터를 포함하여 이루어진다.
도 44는 본 형태의 장치를 나타낸다. 본 형태의 장치는, 혼합 대상의 액체를 도입하기 위한 액체 도입용 마이크로 채널(431, 432)과, 복수의 채널을 합류부(430)에서 합류시킨 하나의 혼합용 마이크로 채널(433)과, 혼합용 마이크로 채널 내의 액체를 가열하기 위한 히터(435)를 포함한다.
본 형태의 장치에 있어서는, 혼합 대상의 액체가 액체 도입용 마이크로 채널(431, 432)로부터 도입되어 혼합 대상의 액체가 합류부(430)에서 합류되어 합류된 액체가 합류부(430)에 접속된 혼합용 마이크로 채널(433)에 도입되고, 히터(435)(예를 들면, 크롬강 히터 및 펠체소자 등)에 의하여 혼합용 마이크로 채널 내의 용액이 가열되어 혼합용 마이크로 채널 내의 액체가 혼합된다. 본 형태에 의하면, 혼합용 마이크로 채널 내에서 합류된 액체가 히터(435)에 의하여 가열되고, 혼합용 마이크로 채널 내의 액체의 온도가 상승하여 액체 내의 용질의 브라운운동이 활성화되기 때문에, 분자확산이 촉진되어 복수의 액체의 신속한 혼합이 가능해진다. 또 가열에 의한 열대류에 의해서도 합류한 액체의 혼합이 촉진된다.
액체의 공급은, 공지의 어떠한 방법에 의해서도 행할 수 있고, 예를 들면 기계적 또는 전기적 구동력에 의하여 행할 수 있다. 구체적으로는 송액 펌프나 밸브에 의하여 유량을 조절함으로써, 변화시키는 것이 가능하다. 예를 들면 리저버 사이의 인가 전압 또는 부여 전위를 조절함에 의한 전기침투류의 제어, 마이크로 실린지 등에 의한 송액의 압력을 조절함에 의한 송액 펌프의 제어에 의하여 각 액체의 유량을 조절할 수 있다.
본 형태의 장치에 있어서 혼합 대상의 액체는 2종류이나, 이것에 한정하지 않고, 혼합하는 액체는 2종류 이상이어도 좋다. 또 본 형태의 액체 도입용 마이크로 채널은 2개이나, 이것에 한정하지 않고, 2개 이상으로 할 수 있다.
도 45는 다른 형태를 나타낸다. 이 형태의 장치는, 액체 도입용 마이크로 채널(441, 442)과, 액체 도입용 마이크로 채널(441, 442)을 합류부(40)에서 합류시킨 하나의 혼합용 마이크로 채널(443)과, 혼합용 마이크로 채널(443)을 가열하기 위하여 이 마이크로 채널(443)의 아래쪽에 설치된 히터(445)를 포함한다. 본 형태에 의하면 혼합 대상인 액체가 합류부(440)에 있어서 연직방향으로 적층되어 합류되고, 합류된 액체가 합류부(440)에 접속된 혼합용 마이크로 채널(443)에 도입되고, 혼합용 마이크로 채널의 아래쪽에 설치된 히터(445)에 의하여 혼합용 마이크로 채널(443) 내의 용액이 그 하면에서 가열된다. 이와 같이 하여 혼합용 마이크로 채널 내의 액체의 혼합이 촉진된다. 본 형태에 있어서는 합류된 액체가 히터(445)에 의하여 가열되고, 혼합용 마이크로 채널의 아래쪽에 있는 액체의 온도가 상승하여 채널(443) 내에서 열대류가 생기기 때문에, 연직방향의 대류에 의한 확산효과가 촉진되어 합류한 액체의 혼합이 촉진된다. 또 가열에 의한 분자확산의 증대에 의해서도, 합류한 액체의 혼합이 촉진된다.
도 46은 또 다른 형태를 나타낸다. 본 형태의 장치는, 액체 도입용 마이크로 채널(451, 452)과, 액체 도입용 마이크로 채널(451, 452)을 합류부(450)에서 합류시킨 하나의 혼합용 마이크로 채널(453)과, 액체 도입용 마이크로 채널(453)을 가열하기 위한 히터(455)를 포함한다. 본 형태에 의하면, 히터부(455)에 의하여 액체 도입용 마이크로 채널(452) 내의 용액이 가열되고, 가열되어 있지 않은 채널(451) 내의 액체와 가열된 채널(452) 내의 액체가 합류부(450)에서 가열되어 온도가 높은 채널(452) 내의 액체를 밑으로 하여 연직방향으로 밑으로부터 순서대로 적층하여 합류되고, 합류된 액체가 합류부(450)에 접속된 혼합용 마이크로 채널(453) 에 도입된다. 이와 같이 하여 혼합용 마이크로 채널 내의 액체의 혼합이 촉진된다. 본 형태에 있어서는 채널(452) 내의 액체가 히터(455)에 의하여 가열되었음에도 불구하고, 합류부(450)에 있어서 가열되어 있지 않은 채널(451) 내의 액체의 아래쪽에 적층되어 합류되기 때문에, 가열된 액체가 위쪽으로 이동하려고 하여 채널(453) 내에서 열대류가 생기고, 연직방향의 대류에 의한 확산효과가 촉진되어 합류한 액체의 혼합이 촉진된다. 또 가열에 의한 분자확산의 증대에 의해서도, 합류한 액체의 혼합이 촉진된다.
본 형태와 같이 액체 도입용 마이크로 채널을 히터에 의하여 가열하는 경우, 액체 도입용 마이크로 채널 내의 액체는, 고온의 액체로부터 순서대로 연직방향으로 밑으로부터 적층하여 합류된다. 본 형태에 사용할 수 있는 히터는, 공지의 모든 가열장치로부터 선택할 수 있다. 예를 들면, 크롬강 히터나 펠체소자를 사용할 수 있다. 히터의 설치위치는, 채널 내의 액체를 가열할 수 있으면, 어떠한 위치이어도 좋다. 예를 들면 채널 벽면에 설치할 수 있다. 또 히터의 설치갯수는 1개뿐만 아니라, 복수개이어도 좋다.
형태 2-2(도 47 ~ 도 53)
본 형태의 장치의 혼합 촉진수단은, 혼합용 마이크로 채널에서 합류하는 액체 사이의 계면을 흩어지게 하기 위한 기계적 변동수단이다. 제 1 타입의 기계적 변동수단은, 혼합용 마이크로 채널 내의 합류부 부근에 설치된 진동자, 가동 양력면, 회전자 또는 요동자이다. 제 2 타입의 기계적 변동수단은, 혼합용 마이크로 채널 내의 합류부 부근에 한정하지 않고, 그것보다 하류측의 혼합용 마이크로 채널 의 벽면 또는 벽면 밖에 설치된 진동자이다.
도 47 내지 도 50은, 제 1 타입의 기계적 변동수단을 가지는 하나의 형태를 나타낸다. 도 47의 장치에서는, 합류부에 진동자(510)가 설치되어 있다. 이 장치는 제 1 액체가 충전된 제 1 리저버(505)와, 제 2 액체가 충전된 제 2 리저버(506)와, 제 1 리저버(505)에 통하는 제 1 채널(507)(액체 도입용 마이크로 채널)과, 제 2 리저버(506)에 통하는 제 2 채널(508)(액체 도입용 마이크로 채널)과, 제 1 채널(507)과 제 2 채널(508)이 연결되는 제 3 채널(509)(혼합용 마이크로 채널)을 포함하고, 또한 제 3 채널(509)의 벽면에 진동자(510)를 포함한다. 진동자(510)는 도시 생략한 전원 및 구동제어수단에 접속되어 있다. 제 1 리저버(505)로부터는 제 1 액체가 제 1 채널(507)을 통하여 제 3 채널(509)에 도입되고, 제 2 리저버(506)로부터는 제 2 액체가 제 2 채널(507)을 통하여 제 3 채널(509)에 도입된다.
일반적으로 마이크로 채널에서는 2액이 합류하면 층류가 형성되어 2액이 접하는 계면이 안정되게 유지된다. 이 때문에 확산 계수가 작은 공시액의 경우, 확산에의한 혼합이 충분히 행하여지지 않아, 2층으로 분리된 채로 흐르는 것이 알려져 있다. 이때 채널 벽면 또는 벽면 바깥쪽의 극히 근방에 설치한 진동자(510)에 의하여(또는 하나 이상의 복수개의 진동자군에 의하여) 혼합부의 유동장에 적절하게 변동성분을 주면, 2액이 형성하는 계면에 불안정을 일으켜 2액이 접하는 계면의 면적이 넓어지는, 또는 상기 양력면에 의하여 발생되는 소용돌이(와도)에 의하여 계면구조를 붕괴시키는 것, 또는 소용돌이 이동에 의한 음압 영역 내에 캐비테이션(공동현상)을 발생시킬 수 있기 때문에, 2액을 신속하고 또한 균일하게 혼합할 수 있다.
도 48에 나타내는 다른 장치에서는, 합류부에 가동 양력면(511)이 설치되어 있다. 이 장치는, 제 1 액체가 충전된 제 1 리저버(505)와, 제 2 액체가 충전된 제 2 리저버(506)와, 제 1 리저버(505)에 통하는 제 1 채널(507)과, 제 2 리저버(506)에 통하는 제 2 채널(508)과, 제 1 채널(507)과 제 2 채널(508)이 연결되는 제 3 채널(509)을 포함하고, 또한 제 3 채널(509)의 합류부에 가동 양력면(511)을 포함한다. 가동 양력면(511)은 도시 생략한 전원 및 구동제어수단에 접속되어 있다. 제 1 리저버(505)로부터는 제 1 액체가 제 1 채널(507)을 통하여 제 3 채널(509)에 도입되고, 제 2 리저버(506)로부터는 제 2 액체가 제 2 채널(507)을 통하여 제 3 채널(509)에 도입된다. 이때 합류부에 설치한 가동 양력면(511)에 의하여 계면의 불안정을 유기하는 주파수로 적절하게 변동성분을 주면, 2액이 형성하는 계면에 불안정을 일으켜 2액이 접하는 계면의 면적이 넓어지는 또는 계면구조를 붕괴시키는 것, 또는 액체 내에 캐비테이션(공동현상)을 발생시킬 수 있기 때문에, 2액을 고속으로 또한 균일하게 혼합할 수 있다.
도 49에 나타내는 또 다른의 형태의 장치에서는, 합류부에 회전자(512)가 설치되어 있다. 이 장치는, 제 1 액체가 충전된 제 1 리저버(505)와, 제 2 액체가 충전된 제 2 리저버(506)와, 제 1 리저버(505)에 통하는 제 1 채널(507)과, 제 2 리저버(506)에 통하는 제 2 채널(508)과, 제 1 채널(507)과 제 2 채널(508)이 연결하는 제 3 채널(509)을 포함하고, 또한 제 3 채널(509) 내에 회전자(512)를 포함한다. 회전자(512)는 도시 생략한 전원 및 구동제어수단에 접속되어 있다. 제 1 리 저버(505)로부터는 제 1 액체가 제 1 채널(507)을 통하여 제 3 채널(509)에 도입되고, 제 2 리저버(506)로부터는 제 2 액체가 제 2 채널(507)을 통하여, 제 3 채널(509)에 도입된다. 이때 채널(509) 내에 설치한 회전자(512)(또는 복수개의 회전자열에 의하여)에 의하여 적절하게 변동성분을 주면 2액이 형성하는 계면에 불안정을 일으켜 2액이 접하는 계면의 면적이 넓어지는 또는 계면구조를 붕괴시키는, 또는 액체 내에 캐비테이션(공동현상)을 발생시킬 수 있기 때문에, 2액을 고속으로 또한 균일하게 혼합할 수 있다.
도 50에 나타내는 또 다른의 형태의 장치에서는, 합류부에 요동자(513)가 설치되어 있다. 이 장치는, 제 1 액체가 충전된 제 1 리저버(505)와, 제 2 액체가 충전된 제 2 리저버(506)와, 제 1 리저버(505)에 통하는 제 1 채널(507)과, 제 2 리저버(506)에 통하는 제 2 채널(508)과, 제 1 채널(507)과 제 2 채널(508)이 연결하는 제 3 채널(509)을 포함하고, 또한 제 3 채널(509) 내에 요동자(513)를 포함한다. 요동자(513)는 도시 생략한 전원 및 구동제어수단에 접속되어 있다. 제 1 리저버(505)로부터는 제 1 액체가 제 1 채널(507)을 통하여 제 3 채널(509)에 도입되고, 제 2 리저버(506)로부터는 제 2 액체가 제 2 채널(507)을 통하여 제 3 채널(509)에 도입된다. 이때 채널 내에 설치한 요동자(513)(또는 복수개의 요동자열에 의하여)에 의하여 적절하게 변동성분을 주면, 2액이 형성하는 계면에 불안정을 일으켜 2액이 접하는 계면의 면적이 넓어지는 또는 계면구조를 붕괴시키는, 또는 액체 내에 캐비테이션(공동현상)을 발생시킬 수 있기 때문에, 2액을 고속이고도 균일하게 혼합할 수 있다.
상기한 각 형태에 의하면, 제 1 액체와 제 2 액체를 제 3 채널(509)상에서 임의의 비율로 신속하게 혼합할 수 있다. 다른 농도의 제 1 액체와 제 2 액체를 이용하면, 그 혼합비를 연속적으로 변화시킴으로써, 제 3 채널(509)에 농도 구배영역을 형성할 수 있다.
도 51 내지 도 53은 제 2 타입의 기계적 변동수단을 가지는 장치의 형태를 나타낸다. 이 타입의 장치는, 복수의 액체 도입용 마이크로 채널과, 복수의 액체 도입용 마이크로 채널을 합류시킨 하나의 혼합용 마이크로 채널과, 혼합용 마이크로 채널중의 각 액체 사이의 계면을 불안정화하기 위한 진동자를 포함한다. 이 형태에서는 진동자(바람직하게는 복수의 진동자)가 혼합용 마이크로 채널의 하류측에도 설치되고, 혼합의 촉진은 혼합용 마이크로 채널에의 액체의 도입후에 행하여지는 것에 특징이 있다. 구체적으로는 혼합 대상의 액체를 각 액 사이의 접촉계면이 유지되도록 도입한 후, 액의 도입을 정지하고, 이어서 상기 진동자에 의하여 각 액 사이의 접촉계면을 불안정화하여 각 액체를 혼합한다. 농도 구배를 형성하면, 혼합용 마이크로 채널 내의 흐름방향으로 2개의 액체의 체적비가 연속적으로 변화되도록 합류를 완료시키고, 이어서 진동자의 출력 및 구동시간을 제어하면서 진동자를 구동한다.
2종류의 액체는, 각 액체 도입용 마이크로 채널로부터의 유량의 비율을 바꾸어 도입함으로써 혼합용 마이크로 채널 내에 여러가지 형태의 기하학적 패턴을 형성할 수 있다(예를 들면, 상기한 형태 1-1 및 1-2에 의한 유량제어를 적용할 수 있다). 도 51은 혼합용 마이크로 채널에 형성된 2종류의 액체의 형태를 나타내고 있 다. 혼합 대상의 액체(635, 636)는, 복수의 액체 도입용 마이크로 채널로부터 합류부를 경유하여 혼합용 마이크로 채널(633)에 도입되나, 배경기술에 있어서 설명한 바와 같이 마이크로 채널 내에서는 혼합이 진행되기 때문에 그것들 액체는 접촉계면을 유지한 상태를 유지하는 경향에 있다. 2액의 비율을 바꾸어 도입하면, 채널의 길이방향에 대하여 2액의 비율이 연속적으로 변화되도록 도입할 수 있다(도 51a 및 도 51b). 또 2액을 교대로, 또한 그 비율을 채널의 길이방향에 대하여 변화되도록 도입할 수 있다(도 51c). 또한 단순하게 채널의 길이방향을 2액으로 이분하도록 도입할 수 있다(도 51d). 연속적인 농도 구배를 형성하기 위해서는, 채널의 길이방향에 대하여 액체의 체적비가 연속적으로 변화되는 형태에서 그것들의 접촉계면이 안정되게 유지하여 두는 것이 바람직하다.
도 52는 도 51의 형태에 따라 혼합용 마이크로 채널(633)에 도입된 2종류의 액체를, 혼합용 마이크로 채널(633)의 벽면을 따라 설치된 복수의 진동자를 사용하여 혼합하고, 농도 구배가 형성되는 프로세스를 나타내고 있다. 진동자는 혼합용 마이크로 채널(633)의 벽면을 따라 복수로 설치한다. 상기한 바와 같이 액체(635, 636)는 접촉계면을 유지한 상태에서 혼합용 마이크로 채널에 도입된다(도 51c, 도 52a). 이어서 진동자(637)를 구동함으로써 액체(635, 636) 사이의 계면의 불안정을 유기하는 주파수로 적절하게 변동성분을 주어 각 액체 사이의 계면을 불안정화시킬 수 있다. 진동자의 구동에 의하여 각 액체 사이의 계면의 면적이 증대하고, 또는 각 액체사이의 계면이 파괴되고, 또는 액체 내에 캐비테이션(공동현상)이 발생함으로써, 각 액체를 신속하고 또한 균일하게 혼합할 수 있다. 적정한 체적비를 유지 하도록 도입된 2개의 액체는, 진동자의 구동에 의하여 채널의 길이방향에서 서로 혼합되어 채널흐름방향으로 똑같이 또한 연속적인 농도 구배를 형성할 수 있다(도 52b).
도 53은 도 51의 혼합용 마이크로 채널에 도입된 2종류의 액체를 혼합하는 모양을 나타낸 것이다. 먼저, 액체(635, 636)가 도 51a에 나타내는 바와 같이 접촉계면을 유지한 상태에서 혼합용 마이크로 채널에 도입되어 있다(도 51a). 이어서 혼합용 마이크로 채널 단부에 설치한 진동자(637)에 의하여 계면의 불안정을 유기하는 주파수로 적절하게 변동성분을 주어 각 액체 사이의 계면을 불안정화시킨다. 그것에 의하여 각 액체 사이의 계면의 면적이 증대하고, 또는 각 액체사이의 계면이 파괴되어, 또 액체 내에 캐비테이션(공동현상)이 발생함으로써 각 액체를 신속하고 또한 균일하게 혼합할 수 있다(도 53b). 구체적으로는 혼합 후에, 채널 내의 흐름방향에 대하여 2액의 혼합비가 연속적으로 변화하도록 체적비를 변화시키면서 양 액체 사이의 접촉계면이 안정되게 유지되도록 액체(635, 636)를 도입하여 출력 및 구동시간을 제어하면서 진동자를 구동시킴으로써, 도 53b에 나타내는 바와 같은 액체의 농도 구배를 형성시킬 수 있다.
혼합 대상의 액체를 도입하는 방법 및 장치는, 공지의 모든 방법 및 장치를 사용할 수 있다. 예를 들면 펌프의 유량을 제어하여 2종류의 액체를 각각 임의의 비율로 도입하는 방법, 밸브의 개폐시간을 제어하여 혼합 대상의 액의 비율을 변화시키는 방법, 전기침투류 구동방식에 있어서 부여 전위를 제어하여 액체를 도입하는 방법, 또는 Seki 등의 방법(M. Yamada and M. Seki, Proc. IEEE the 16 th International Symposium on Micro Electro Mechanical Systems(MEMS), 2003, pp. 347-350, 2003을 참조)을 들 수 있다. 혼합 대상의 액체를 도입하는 방법 및 장치는 각 액체를 혼합한 후에 채널의 길이방향에 대하여 각 액체의 혼합비가 연속적이 되도록 체적비를 변화시켜 각 액체 사이의 접촉계면이 안정되게 유지되도록 도입할 수 있는 것이 바람직하다.
본 형태에 사용되는 진동자 및 그 구동방법으로서는, 공지의 모든 수단 및 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면 압전소자, 정전 액츄에이터, 형상기억효과 가동소자, 전자력 액츄에이터, 고분자 소자력에 의한 방법 등을 들 수 있다. 본 형태에서 사용되는 액체는 2종류이나, 이것에 한정하지 않고 2종류 이상이어도 좋다. 또 본 형태의 액체 도입용 마이크로 채널은 2개이나, 이것에 한정하지 않고, 2개 이상이어도 좋다.
진동자의 설치위치는, 혼합용 마이크로 채널 내의 액체의 계면을 진동시킬 수 있으면 어떠한 위치이어도 좋다. 예를 들면 혼합용 마이크로 채널의 벽면에 설치하거나(도 52), 혼합용 마이크로 채널의 단부에 설치할 수 있다(도 53). 또 혼합용 마이크로 채널의 양측에 설치하는 것이나, 혼합용 마이크로 채널의 벽면과 단부의 양쪽에 병존시킬 수도 있다. 또한 채널 내의 액체에 진동을 전파시킬 수 있으면 진동자를 채널로부터 떨어진 위치에 설치하여도 좋다. 또한 진동자의 설치갯수는 하나로 한정하지 않고, 복수개이어도 좋다.
형태 2-3(도 54 ~ 도 58)
본 형태의 장치의 혼합 촉진수단은, 혼합용 마이크로 채널 내의 합류부 부근 에 다수 배열된 미소 구조물이다.
본 형태의 장치의 기본구성은, 액체를 도입하는 2개 이상의 액체 도입용 마이크로 채널 및 그것들이 접속하여 형성되는 하나의 혼합용 마이크로 채널을 포함하여 이루어지고, 혼합용 마이크로 채널 내에는 미소한 구조물이 다수 배열되어 있다. 액체 도입용 마이크로 채널로부터 도입되어 합류한 액체는, 혼합용 마이크로 채널 내의 미소 구조물군에 접촉에 의하여 혼합이 촉진된다. 마이크로칩 전기영동장치를 예로 들면 상기 액체 도입용 마이크로 채널이 완충액 및/또는 변성제함유 완충액을 도입하기 위한 마이크로 채널이고, 상기 혼합용 마이크로 채널이 농도 구배 형성영역의 채널이다. 이하, 마이크로칩 전기영동장치의 형태를 설명한다.
도 54의 장치는, 농도 구배영역 채널(709)(혼합용 마이크로 채널) 내에 혼합 촉진수단으로서 미소 구조물군을 설치하고 있다. 이 도면에 나타내는 바와 같이 변성제 농도 구배 형성부(2)에서는, 액체를 도입하기 위한 제 1 채널(707)(액체 도입용 마이크로 채널)과 제 2 채널(708)(액체 도입용 마이크로 채널)이 공통의 합류부(730)에서 연결되어 마이크로 채널(709)에 접속되고, 그 합류부(730)의 하류 근방에는 그 채널 폭보다 미소한 구조물군(731)이 설치되어 있다. 이 미소 구조물군(731)은 미세한 크기의 구조물이 기하학적인 배열로 대략 등간격으로 열을 이루고, 바람직하게는 각 열의 구조물이 액체의 유동방향에서 보아 서로 다르게 나열하도록 설치된다. 제 1 채널(707)과 제 2 채널(8)로부터 도입된 액체는 합류부(730)에서 접촉하여 층형상이 되어 흐르나, 미소 구조물군(31)을 통과할 때에 그것들의 접촉계면에 소용돌이에 의한 확산작용이 생기기 때문에, 그것들 2액은 양호하게 혼합되 고 나서 채널(709)의 하류측(화살표방향)으로 흐른다.
도 55는 미소 구조물군(731)으로서 기둥형상 구조물의 배열을 구비한 형태를 나타낸다. 이 기둥형상 구조물군은 혼합 액체의 접촉계면에 평행하고 유동방향으로 수직한 축을 가지는 것으로서 구성할 수 있고, 도 55(a)와 같은 원기둥이어도 좋고, 도 55(b)와 같은 삼각기둥이어도 좋다. 미소 구조물군(731)의 형상은, 특별히 한정되지 않고, 합류한 액체가 통과할 때에 그 흐름이 측벽으로부터 박리되고, 그 박리 소용돌이의 확산작용에 의하여 신속한 혼합을 가능하게 하는 것이면, 모든 형상을 적용 가능하다. 또 상류로부터 핵산 시료가 흘러 오는 경우, 그 흐름이 기둥형상 구조물에 얽히기 때문에, 핵산의 분자량 분리가 가능하다.
도 56은 미소 구조물군(731)으로서 합류부(730)의 하류 근방에서 마이크로 채널(709)의 벽면에 가는 홈을 규칙적인 기하학형상이 설치된 형태를 나타낸다. 합류부(730)에서 합류한 액체는, 미소 구조물군(731)을 통과할 때에 각 홈을 따라 채널 폭방향의 흐름이 생기고, 또한 홈 가장자리로부터도 박리 소용돌이가 생겨 확산작용이 생기고, 이에 의하여 신속한 혼합이 가능해진다.
가는 홈으로 이루어지는 미소 구조물군(731)은, 도 57과 같은 유동방향과 교차하는 그물코형상의 것이어도 좋고, 도 58과 같은 독립된 V자형상의 홈을 다수 설치한 것이어도 좋다. 이들 도면으로 나타내는 바와 같이 미소 구조물군(731)은 마이크로 채널(709)의 하면(709a) 및 그 상면(709b)에 상기한 홈 배열을 구비하고 있다. 이와 같은 미소 구조물군(731)은, 공지의 포토리소그래피 기술 등의 미세 가공기술을 사용하여 제작할 수 있다.
액체 혼합장치의 제조방법
본 발명의 액체 혼합장치는, 상기 기술분야에서 주지인 마이크로칩 제조를 위한 관례적인 방법에 의하여 제조된다.
본 발명의 액체 혼합장치는, 통상 2매의 기판으로 구성되나, 1매의 기판으로 구성할 수도 있다. 마이크로칩이 2매의 기판으로 구성되는 경우, 1매의 기판에는 포토리소그래피 기술 등의 미세 가공기술을 사용하여 폭, 깊이 모두 10 ~ 100 ㎛ 정도의 채널을 형성시키고, 또 1매의 기판에는 초음파 가공 등의 기계가공을 사용하여 리저버용 구멍을 뚫는다. 이들 2매의 기판을 열에 의한 용융접합 등의 접착기술을 사용하여 접합하면 소정의 위치에 채널과 리저버를 가지는 마이크로칩이 얻어진다.
마이크로 채널의 치수(폭 및 깊이)는, 요구되는 사양 및 가능한 가공 정밀도 에 의거하여 결정되는 것이다. 또 분석 대상물(예를 들면, 2개 사슬 핵산)보다 크면 1 mm까지 허용된다. 본 발명에 적용할 수 있는 "마이크로 채널"의 치수는 개략 1 nm ~ 1000 ㎛, 현상의 가공 정밀도로부터 바람직하게는 1 nm ~ 500 nm, 더욱 바람직하게는 10 ㎛ ∼ 100 ㎛ 이다.
기판의 가공은 패턴 폭, 깊이에 따라 웨트에칭 뿐만 아니라, 드라이에칭이나 샌드블라스트가공을 이용하여도 좋고, 당연, 마스크도 포토레지스트 마스크뿐만 아니라, Ni나 Cr 등의 메탈 마스크를 이용하여도 좋다. 예를 들면 마이크로 채널은, 포토리소그래피 기술에 의하여 레지스트 마스크를 패터닝한 후, HF의 10% 희석액으로 습식에칭에 의하여 형성할 수 있다. 채널 내의 깊이가 다른 부분은, 마스 크를 바꾸어 복수회 패터닝공정과 에칭공정을 행함으로써 형성할 수 있다.
기판의 재료는, 유리, 석영, 파이렉스(등록상표), 플라스틱, 실리콘, 수지, 금속으로부터 용도나 제조방법에 따라 선택할 수 있다. 예를 들면 유리기판의 접합은 1%로 희석한 HF 용액을 유리 접합면에 적하한 후, 양자를 얼라이먼트하여 겹치고, 70 kPa의 압력으로 60시간 방치함으로써 행할 수 있다. 또한 접합은 용융접합, 진공장치 내에서의 빔 조사를 이용한 직접접합 등을 이용할 수 있다.
플라스틱의 경우, 마이크로 칩의 제작에는 사출성형, 금형전사, 나노인프린팅, 나노스탬프를 이용할 수 있어, 저비용으로 대량 생산, 1회용에 적합하다.
액체 혼합장치의 용도
본 발명의 액체 혼합장치는, 미소량의 액체를 혼합하는 것이 필요하게 되는 모든 장치에 적용할 수 있다. 예를 들면 본 발명은 화학분석 또는 생화학분석을 위한 분석용 마이크로칩과 같은 미소 화학 분석장치(μTAS)에 적용할 수 있고, 그들 장치에 있어서의 미소량의 액체의 혼합을 고속화할 수 있다. 또한 화학 합성을 위한 마이크로 리액터에서는 순간적인 가열이나 냉각기구를 부가함에 의한 중간 반응의 억제 등, 종래의 비커 내 반응에서는 할 수 없었던 파인케미컬에의 응용도 가능해진다.
마이크로 리액터의 용도의 일례는, 방향족 화합물과 고반응 활성의 탄소 카티온을 혼합하는 경우의 프리델·크래프트화 반응에서 모노 치환체만을 높은 수율로 얻는 장치이다. 종래의 비커 내에서의 반응에서는 트리메톡시벤젠과 이미늄 카티온을 혼합한 경우, 트리메톡시벤젠의 치환율은 80 % 이하, 목적의 모노 치환체의 수율은 40 % 이하, 부생성물로서의 디치환체의 수율이 30 % 이상이다. 그러나 본 발명을 적용한 마이크로 리액터에 의하면, 그것들 반응체의 고효율 또한 신속한 혼합이 가능해지기 때문에, 트리메톡시벤젠 치환율은 90 % 이상, 모노 치환체의 수율은 90 % 이상, 디치환체의 수율은 5 % 이하가 되어 바람직한 반응 생성물만을 선택적으로 제조할 수 있다. 그 결과, 동일한 수량을 얻는 데 필요하게 되는 원료 및 반응 시약의 양도 적어진다.
또 본 발명을 적용할 수 있는 다른 용도로서 마이크로칩 전기영동장치를 들 수 있다. 마이크로칩상에서 전기영동을 행하는 것은, 사용되는 시료나 시약이 소량으로 충분하고, 반응시간이나 분석시간이 단축되고, 반응 및 프로세스 처리 시간이 단축되어 반응효율이나 생성물 수율이 향상하고, 폐액이 소량이고, 높은 스루풋 분석에 적합하다는 다양한 이점을 가진다. 특히, 본 발명의 액체 혼합장치 및 방법을, 변성제 농도 구배를 형성하기 위한 완충액의 혼합에 사용함으로써, DGGE에 유용한 마이크로칩 전기영동장치를 제공할 수 있다.
[분석 대상물을 분리하는 장치 및 방법]
이하, DGGE를 사용하여 분석 대상물을 분리하는 장치 및 방법에 대하여 설명한다.
DGGE에 관한 형태 A
형태 A에서는, 변성제 농도 구배가 영동방향으로 연속적으로 변화되도록 형성된다.
본 형태의 마이크로칩 전기영동장치는, 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충 액을 도입하기 위한 적어도 2개의 액체 도입용 마이크로 채널 및 적어도 2개의 액체 도입용 마이크로 채널이 접속되어 있는 혼합용 마이크로 채널을 포함하여 이루어지고, 각 액체 도입용 마이크로 채널로부터 변동하는 비율로 도입되는 각 완충액이 상기 혼합용 마이크로 채널 내에서 합류함으로써 상기 변성제의 농도 구배영역이 형성된다.
더욱 바람직한 형태는, 혼합용 마이크로 채널 내에서 합류하는 완충액 사이의 혼합을 촉진하기 위한 혼합 촉진수단을 가진다. 이 혼합 촉진수단에는 상기에서 설명한 형태 1-1 내지 2-3까지의 각 형태 및 그것들의 모든 조합을 적용할 수 있다.
형태 A의 마이크로칩 전기영동장치
도 59a, 도 59b, 도 59c 및 도 59d는, 마이크로칩 전기영동장치의 기본구조를 모식적으로 나타낸다. 먼저 이들을 참조하여 본 형태의 기본개념을 설명한다.
도 59a는 1매의 마이크로칩(801) 위에, 변성제 농도 구배 형성부(802)와, 전기영동부(804)를 포함한다. 변성제 농도 구배 형성부(802)는 전기영동부(804)의 농도 구배영역 채널(809)과 연결되어 있고, 변성제 농도 구배 형성부(802)로부터 변성제를 함유하는 영동용 완충액이 농도 구배영역 채널(809)에 공급된다. 전기영동부(804)는, 농도 구배영역 채널(809)과 그 하류측에 접속된 시료 도입부(803)를 포함한다. 일반적인 방식에서는 농도 구배 형성부(802)에서 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액끼리가 변화되는 비율로 혼합되고, 이와 같이 하여 얻어지는 변성제 농도 구배를 가지는 완충제 영역이, 농도 구배영역 채널(9)의 상류측으로부터 그 하류측의 전기영동부(804)로 차차 도입된다.
시료 도입부(803)는, 전기영동부(804)에 설치되어 있다. 정제 DNA 등의 핵산시료(이하 DNA 시료)는, 시료 도입부(803)로부터 전기영동부(804)의 농도 구배영역 채널(809) 내로 도입된다. 채널(809) 내의 변성제 농도 구배영역에 DNA 시료가 도입되면 여기서 DNA 시료 중의 2개 사슬 DNA가 염기배열의 차이에 의하여 분리된다. 도 59b에 나타내는 마이크로칩 전기영동장치는, 1매의 마이크로칩(801)상에 변성제 농도 구배 형성부(802)와, 시료 도입부(803)와, 전기 영동부(804)를 포함하고, 전기영동부(804)에 있어서 시료 도입부(803)는 농도 구배영역 채널(809)을 가로지르는 형태로 농도 구배영역 채널(809)과 연결되어 있다. 이 형태에서 시료 도입부(803)를 연결함으로써, 전기영동부(804)의 영역 밖으로부터[농도 구배영역 채널(809)과는 별개의 시료 도입 채널로부터] DNA 시료를 도입할 수 있어, 시료의 도입 조작이 용이해진다.
도 59c 및 도 59d에 나타내는 마이크로칩 전기영동장치는, 1매의 마이크로칩(801)상에 변성제 농도 구배 형성부(802)와, 시료 도입부(803)와, 전기영동부(804)를 포함하고, 변성제 농도 구배 형성부(802)가 전기영동부(804)를 포함하고, 변성제 농도 구배 형성부(802)가 전기영동부(804)를 겸하는 구성으로 되어 있다. 변성제 농도 구배 형성부(802)가 전기영동부(804)를 겸함으로써, 마이크로칩의 소형화가 가능하게 되는 데다가 변성제 농도 구배(802)로 형성한 변성제 농도 구배영역을 전기영동부(804)로 이동시킬 필요가 없어진다.
다음에 상기 형태의 각 구성부분을 설명한다.
이하에서는 설명의 간략화를 위하여 다른 농도로 변성제를 함유하는 완충액으로서, 변성제를 함유하는 완충액과, 변성제를 함유하지 않은 완충액(본 명세서에서는 단지 완충액이라는 경우도 있다)을 사용하는 형태에 대하여 설명한다.
본 형태에 있어서, 한쪽의 완충액이 변성제를 함유하는지, 함유하지 않은지가 중요한 것이 아니라, 완충액 사이의 변성제의 상대적 농도차가 중요하다. 예를 들면 "변성제를 함유하지 않은 완충액"이 상대적으로 저농도의 변성제를 함유하고 있고, "변성제를 함유하는 완충액"이 "변성제를 함유하지 않은 완충액"보다 유의하게 높은 농도의 변성제를 함유하면 동일한 효과를 얻을 수 있다. 이와 같은 형태도 본 발명의 범위 내이다.
도 60은, 도 59a ∼ 도 59d의 장치에 있어서의 변성제 농도 구배 형성부(802)의 구체적 구성을 나타낸다. 도 60의 변성제 농도 구배 형성부(802)에는 일정 농도로 변성제를 함유하는 완충액이 충전된 제 1 리저버(805)와, 변성제를 함유하지 않은 완충액이 충전된 제 2 리저버(806)와, 제 1 리저버(805)에 통하는 제 1 채널(807)(액체 도입 마이크로 채널)과, 제 2 리저버(806)에 통하는 제 2 채널(808)(액체 도입 마이크로 채널)과, 제 1 채널(807)과 제 2 채널(808)이 합류하여 형성된 농도 구배영역 채널(809)(혼합용 마이크로 채널)을 포함한다. 제 1 리저버(805)는, 제 1 전원(811)과 접속된 제 1 전극(810)을 포함한다. 제 2 리저버(806)는 제 2 전원(813)과 접속된 제 2 전극(812)을 포함한다.
변성제 농도 구배 형성부(802)에 있어서, 제 1 전원(811)과 전극(810) 및 제 2 전원(813)과 전극(812)을 거쳐 각 리저버 내에 전압을 인가하면, 이것에 의하여 채널 내에 전기침투류가 생긴다. 그 전기침투류에 의하여 제 1 리저버(805)로부터는 변성제 함유 완충액이 제 1 채널(807)을 통하여 농도 구배영역 채널(809)에 도입된다. 동일하게 하여 제 2 리저버(806)로부터는 완충액이 제 2 채널(808)을 통하여 채널(809)에 도입된다.
상기한 바와 같이 제 1 전원(811)과 제 2 전원(813)의 각 전위를 제어함으로써 채널(807) 및 채널(808)로부터의 각 완충액의 유입의 비율을 바꿀 수 있다. 이와 같이 하여 변성제함유 완충액과 완충액을, 농도 구배영역 채널(809)의 상류점[채널(807) 및 채널(808)로부터의 각 완충액의 합류점]에 있어서, 임의의 비율로 혼합할 수 있다. 채널(809) 내에 연속적인 변성제 농도 구배영역을 형성하기 위해서는, 제 1 전원(811)과 제 2 전원(813)의 각 전위를 연속적으로 변화시키는, 바람직하게는 서로 합류하는 2개의 완충액의 유량 사이의 비율을 일정한 속도로 변화시킴으로써, 변성제함유 완충액과 완충액의 혼합비를 연속적으로 변화시킨다.
도 61은 변성제 농도 구배 형성부(802)에 대하여 다른 구성을 나타낸다. 도 61의 변성제 농도 구배 형성부(802)에는, 변성제함유 완충액이 충전된 제 1 리저버(805)와, 완충액이 충전된 제 2 리저버(806)와, 제 1 리저버(805)에 통하는 제 1 채널(807)과, 제 2 리저버(806)에 통하는 제 2 채널(808)과, 제 1 채널(807)과 제 2 채널(808)이 합류하여 형성되는 농도 구배영역 채널(809)을 포함한다. 제 1 리저버(805)는, 제 1 전원(811)과 접속된 제 1 전극(810)을 포함하고, 그 상류측에 제 1 펌프(814)가 접속된다. 또한 제 2 리저버(806)에는 제 2 전원(813)과 접속된 제 2 전극(812)을 포함하고, 그 상류측에 제 2 펌프(815)가 접속된다.
도 61의 변성제 농도 구배 형성부(802)는, 도 60에 나타내는 제 1 리저버(805)와 제 2 리저버(806)에, 각각 제 1 펌프(814)와 제 2 펌프(815)를 부가한 구조이다. 이 형태에서는 제 1 펌프(814) 및 제 2 펌프(815)를 거친 송액에 의하여 각 전기침투류에 의한 송액을 보조할 수 있고, 변성제함유 완충액이나 완충액의 점성이 높은 경우에서도 농도 구배영역 채널(809)에 적정한 액체 도입 및 변성제 농도 구배의 형성이 확실해진다는 이점이 있다.
도 61의 변성제 농도 구배 형성부(802)에서도 제 1 전원(811)과 제 2 전원(813)의 각 전위의 제어에 더하여, 제 1 펌프(814)와 제 2 펌프(815)의 유량을 제어함으로써, 제 1 리저버(805)로부터는 변성제함유 완충액이 제 1 채널(807)을 통하여 채널(809)에 도입되고, 마찬가지로 제 2 리저버(806)로부터는 완충액이 제 2 채널(808)을 통하여 채널(809)에 도입된다. 이와 같이 하여 변성제함유 완충액과 완충액을 농도 구배영역 채널(809)의 상류점[채널(807) 및 채널(808)으로부터의 각 완충액의 합류점]에 있어서, 임의의 비율로 혼합할 수 있다. 채널(809) 내에 연속적인 변성제 농도 구배영역을 형성하기 위해서는, 제 1 전원(811)과 제 2 전원(813)의 각 전위를 연속적으로 변화시키는 바람직하게는 서로 합류하는 2개의 완충액의 유량 사이의 비율을 일정한 속도로 변화시킴으로써, 변성제함유 완충액과 완충액의 혼합비를 연속적으로 변화시킨다. 제 1 펌프(814)와 제 2 펌프(815)는, 도 61에 나타내는 바와 같이 각각 제 1 리저버와 제 2 리저버에 접속되어도 좋고, 제 1 채널(807)과 제 2 채널(808)의 위에 설치되어도 좋다.
도 62는 도 59b 및 도 59d의 장치에 있어서의 시료 도입부(803)의 구체적 구 성을 나타낸다. 도 62에 나타내는 시료 도입부(803)는, DNA 시료가 충전된 제 3 리저버(816)와, 배출되는 DNA 시료 폐액을 위한 제 4 리저버(817)와, 제 3 리저버(816)에 통하는 제 4 채널(818)과, 제 4 리저버(817)에 통하는 제 5 채널(819)을 포함한다. 제 4 채널(818)과 제 5 채널(819)은, 채널(809)과 교차하여 접속되고, 그곳에서 제 4 채널(818)과 제 5 채널(819)이 연통된다. 또한 제 3 리저버(816)에는 제 3 전극(820)이 접속되고, 제 3 전극(820)에는 제 3 전원(821)이 접속된다. 또한 제 4 리저버(817)에는 제 4 전극(822)이 접속되고, 제 4 전극(822)에는 제 4 전원(823)이 접속된다.
시료 도입부(803)에 있어서, 제 3 전원(821)과 제 4 전원(823)의 각 전위를 제어함으로써 DNA 시료의 공급이 행하여진다. DNA 시료는 제 3 전원(821)과 제 4 전원(823)의 전위의 제어에 의하여 생긴 전기침투류와 전기영동력에 의하여 제 3 리저버(816)로부터 채널(818, 819)을 통하여 제 4 리저버(817)쪽으로 보내진다. 그 프로세스에 있어서, DNA 시료는 제 4 채널(818) 및 제 5 채널(819)의 채널(809)상의 교점으로 도입되고, 이어서 채널(809)의 양쪽 끝에 전압을 인가한다. 채널(809) 내에의 전압인가에 의하여 채널(818, 819)과의 교점에 도입되어 있는 DNA 시료 단편만이 채널(809) 내로 도입된다. 채널(809) 내에는 DNA 변성제의 농도 구배가 있기 때문에 그곳에 도입된 DNA 시료는 농도 구배 내에서 전기영동적으로 분리될 수 있다.
도 63은, 도 59b의 장치의 일 형태를 나타낸다. 전기영동부(804)에는 채널(809)의 하류측에는 폐액용 제 5 리저버(824)가 설치되어 있다. 제 5 리저버(824) 는 제 5 전원(826)과 접속된 제 5 전극(825)을 포함한다. 채널(809)의 상류측에는 도 60을 참조하여 설명한 바와 같은 변성제 농도 구배 형성부(802)와, 도 62를 참조하여 설명한 바와 같은 시료 도입부(803)를 포함한다. 제 1 전원 ∼ 제 5 전원은 적절하게 공용하여도 좋다.
도 63의 형태에 있어서, 변성제 농도 구배 형성부(2)에서 형성되는 변성제 농도 구배를 가지는 완충제 흐름이 채널(809) 내로 도입됨으로써, 채널(809) 내에 변성제 농도 구배영역의 흐름(이동)이 생긴다. 이 변성제 농도 구배영역상에 시료 도입부(803)로부터 DNA 시료가 도입된다. 여기서 채널(809)에 상류측으로부터 도입되는 변성제 농도 구배영역은, 변성제 농도 구배 형성부(802) 및 채널(809) 내에서 생기는 전기침투류에 의하여 하류방향으로 이동한다. 그 한편, 채널(809) 내에 도입된 DNA 시료는, 변성제 농도 구배 형성부(802) 및 채널(809) 내에서 생기는 전기침투류에 의한 하류로의 이동량과, DNA 시료 자신의 음전하에 의하여 생기는 전기영동에 의한 상류로의 이동량과의 총합에 의하여 이동한다. DNA 시료의 정미(正味)의 이동량은 변성제 농도 구배영역의 하류방향으로의 이동량보다 DNA 시료 자신의 음전하에 기인하는 상류에의 전기영동의 분만큼 작아진다. 여기서 시간이 충분히 경과하면, DNA 시료는 상류에 위치하는 변성제 농도 구배영역에 도달할 수 있다. 따라서 소정시간의 영동에 의하여 DNA 시료 중의 GC 클램프가 붙은 2개 사슬 DNA 단편이, 염기배열의 차이 및 변성제 농도 구배에 의존하여, 변성제 농도 구배 겔 전기영동(DGGE)에 의하여 채널(809)의 이동방향에서 분리된다.
본 형태에 있어서의 DGGE의 원리는, 요소나 포름아미드 등의 DNA 변성제에 의하여 핵산 염기의 전하를 중화하기 위한 뉴클레오티드 사이의 수소결합이 절단되어, 2개 사슬 DNA가 1개 사슬 DNA로 해리되는 현상을 이용하는 것이다. DNA 시료는 그 한쪽 끝에 DNA 변성제 농도가 높더라도 1개 사슬 DNA로 해리되기 어려운 인공적인 DNA 배열(GC 클램프)을 붙여 PCR 증폭한 2개 사슬 DNA를 포함한다. DNA 변성제의 농도 구배가 형성된 겔 중에서 GC 클램프를 붙인 2개 사슬 DNA를 전기영동하면, 어느 변성제 농도에 있어서, GC 클램프가 붙어 있지 않은 측의 2개 사슬 DNA가 1개 사슬 DNA로 해리되어 그 2개 사슬 DNA의 이동속도는 작아진다. 2개 사슬 DNA가 1개 사슬 DNA로 해리되는 변성제 농도는 그의 염기배열에 의존하기 때문에, 동일한 농도 구배영역상에서 다른 염기배열을 가지는 2개 사슬 DNA를 영동하면, 이동거리에 차이가 생긴다. 이와 같이 하여 2개 사슬 DNA를 염기배열의 차이에 의하여 분리할 수 있다.
도 64는, 도 59b의 장치의 일 형태를 나타낸다. 도 64의 전기영동부(804)는, 폐액용 제 5 리저버(824)와, 제 5 리저버(824)에 통하는 채널(809)을 포함한다. 제 5 리저버(824)는, 제 5 전원(826)과 접속된 제 5 전극(825)을 포함한다. 이 형태는 그 상류측에 도 61을 참조하여 설명한 바와 같은 변성제 농도 구배 형성부(802)와, 도 62를 참조하여 설명한 바와 같은 시료 도입부(803)를 포함한다.
도 64의 형태에 있어서, 변성제 농도 구배 형성부(802)에서 형성되는 변성제 농도 구배를 가지는 완충제의 흐름(이동)이 채널(809) 내로 도입됨으로써, 채널(809 )내에 변성제 농도 구배류가 생긴다. 이 변성제 농도 구배영역상에 시료 도입부(803)로부터 DNA 시료가 도입된다. 여기서 변성제 농도 구배영역은 제 1 전원 (811)과 제 2 전원(813)의 전위에 의한 전기침투류에 더하여, 제 1 펌프(810) 및 제 2 펌프(815)의 구동에 의하여 채널(809) 내를 하류로 이동한다. 한편, 채널(809)에 도입된 DNA 시료는, 제 1 펌프(814), 제 2 펌프(815) 및 제 1 전원(811)과 제 2 전원(813)의 전위에 의한 전기침투류에 의한 하류로의 이동과, DNA 시료 자신의 음전하에 의하여 생기는 전기영동에 의한 상류로의 이동과의 총합에 의하여 이동한다. DNA 시료의 정미의 이동량은, 변성제 농도 구배영역의 하류방향으로의 이동량보다도, DNA 시료 자신의 음전하에 기인하는 상류로의 전기영동의 분만큼 작아진다. 여기서 시간이 충분히 경과하면, DNA 시료는 상류에 위치하는 변성제 농도 구배영역에 도달할 수 있다. 따라서 소정시간의 영동에 의하여 DNA 시료 중의 GC 클램프가 붙은 2개 사슬 DNA 단편이, 염기배열의 차이 및 변성제 농도 구배에 의존하여, 변성제 농도 구배 겔전기영동(DGGE)에 의하여 채널(9)의 이동방향에서 분리된다.
본 형태의 마이크로칩 전기영동장치의 채널 및 리저버에는, 고분자 매트릭스를 함유하는 완충액이 충전된다. 이것은 고분자 매트릭스의 그물코구조나 고분자 매트릭스와 DNA의 상호작용에 의하여, DNA를 분리할 수 있기 때문이다. 본 형태에 사용할 수 있는 고분자 매트릭스는, 폴리아크릴아미드, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 하이드록시셀룰로스, 메틸셀룰로스 등의 셀룰로스 유도체, 폴리에틸렌옥시드, 폴리메틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피로리돈 등의 폴리올류, 덱스트란, 풀룰란 등으로부터 적절하게 선택된다. 고분자 매트릭스가 하이드록시에틸셀룰로스인 경우는, 2개 사슬 DNA의 길이에 의존하고, 0.01 % ∼ 3.0 %의 농도범위에 있는 것이 바람직하다. 이와 같은 완충액의 예로서, 트리스 - 아세트산 완충액이나 트리스-붕산 완충액 등이 있다.
본 형태에 사용할 수 있는 DNA 변성제는, 요소, 포름아미드, 포름알데히드, 수산화나트륨 등의 강알칼리 등으로부터 적절하게 선택된다. 바람직하게는 요소와 포름아미드이다. 포름아미드와 요소를 변성제로서 사용한 경우, 일반적으로는 7M 요소, 40 % 포름아미드를 함유하는 변성제 함유 완충액을 100% 변성제 함유 완충액으로 하고, 변성제를 함유하고 있지 않은 완충액을 0% 완충액으로 한다. 일반적으로는 60 ℃에서 영동하는 경우, 변성제 농도 구배는 0% - 100% 또는 20% - 70%의 범위이나, 16S rRNA 유전자를 사용한 미생물군집 구조해석의 경우, 35% - 55%가 바람직하다.
본 형태에서 분석 가능한 DNA 시료에는, 사람의 혈액이나 세포 등과 같은 생체 시료나, 식품, 토양이나 하천수, 바닷물 등의 환경 시료, 또는 활성 오니나 메탄발효 오니 등으로부터 추출한 2개 사슬 DNA를 사용한다. 추출한 게놈 DNA의 소정의 영역을 PCR 반응 등에 의하여 한쪽 끝에 DNA 변성제 농도가 높더라도 1개 사슬 DNA로 해리되기 어려운 인공적인 DNA 배열(GC 클램프)을 붙여 증폭한 2개 사슬 DNA를 사용할 수 있다.
본 형태에 의한 DNA의 검출수단은, 형광검출, 발광검출, 흡광검출, 전기화학적 검출 등으로부터 선택된다. 형광검출에서는 미리 PCR 반응의 프라이머를 형광 표식하여 두는 방법, PCR 산물을 형광 표식하는 방법, 미리 PCR 산물을 DNA 염색제로 염색하는 방법 및 고분자 매트릭스함유 완충액에 DNA 염색제를 함유시켜 전기영 동 중에 염색하는 방법 등이 있다. 형광 표식 물질로서는, 플루오레세인, 로더민, Cy3, Cy5, BODIPY FL, TexasRed, Alexa Fluor 등이 있다. DNA 염색제로서는, SYBR Green, Vistra Green, 에튬 브로마이트(ethidium bromide), YOYO-1, TOTO-1, thiazole orange 등이 있다. 검출기에는 형광검출, 발광검출, 흡광검출의 경우, 광전자 증배관, UV검출기, 포토 다이오드 검출기 등을 사용할 수 있다.
다음에 본 형태의 마이크로칩 전기영동장치를 사용한 분석에 대하여 도 63을 참조하면서 그 조작순서의 일례를 이하에 나타낸다.
제 1 리저버(805), 제 2 리저버(806), 제 3 리저버(816),제 4 리저버(817), 또는 제 5 리저버(824) 중 어느 하나를 통하여, 제 1 채널(807), 제 2 채널(808), 제 3 채널(809), 제 4 채널(818) 및 제 5 채널(819) 내에, 고분자 매트릭스를 함유하는 완충액을 충전한다. 모관현상으로 충전되지 않은 경우는 주사기 등으로 압력을 가하여 충전하면 좋다.
상기 완충액의 충전 후, 제 1 리저버(805)에는 변성제함유 완충액을 충전하고, 제 2 리저버(806), 제 4 리저버(817), 제 5 리저버(824)에는 완충액을 충전하고, 제 3 리저버(816)에는 DNA 시료를 충전한다. 제 4 리저버(817) 및 제 5 리저버(824)에는 경우에 따라 변성제를 함유하지 않은 완충액을 충전하여도 좋다. 사용되는 완충액과 DNA 시료에는, 모두 고분자 매트릭스를 함유시키는 것이 바람직하다. DNA 시료, 제 4 리저버(817), 제 5 리저버(824)에 충전하는 완충액에는 고분자 매트릭스를 함유시키지 않아도 좋다.
다음에 제 1 전극(810), 제 2 전극(812), 제 3 전극(820), 제 4 전극(822) 및 제 5 전극(825)을, 제 1 리저버(805), 제 2 리저버(806), 제 3 리저버(816), 제 4 리저버(817) 및 제 5 리저버(824)에 각각 꽂는다. 단, 그들 전극은 미리 제 1 리저버(805), 제 2 리저버(806), 제 3 리저버(816), 제 4 리저버(817) 및 제 5 리저버(824)의 내부에 각각 형성되어 있어도 좋다.
다음에 제 5 전극(825)을 접지하여, 제 1 전극(810) 및 제 2 전극(811)에 소정의 전위를 주어, 소정의 변성제 농도의 완충액을 채널(809)에 도입한다. 이때 제 4 채널(818)과 제 5 채널(819)로 완충액이 흘러 들어 오지 않도록 제 3 전극(820)과 제 4 전극(822)에 소정의 전위를 주는 것이 바람직하다.
다음에 먼저 제 4 채널(818) 및 제 5 채널(819)에서 생기는 전기침투류 속도가 2개 사슬 DNA의 전기영동속도보다 큰 경우에는 제 4 전극(822)을 접지하고, 제 3 전극(820)에 소정의 전압을 인가하여 DNA 시료를 제 3 채널(809), 제 4 채널(818), 제 5 채널(819)의 교점에 도입한다. 반대로 제 4 채널(818) 및 제 5 채널(819)에서 생기는 전기침투류 속도가, 2개 사슬 DNA의 전기영동속도보다 작은 경우에는 제 3 전극(820)을 접지하여 제 4 전극(822)에 소정의 전압을 인가한다. 어느 쪽의 경우에도 제 3 채널(809)로 DNA 시료가 흘러 들지 않도록, 제 1 전극(810), 제 2 전극(812) 및 제 5 전극(825)에 소정의 전위를 주는 것이 바람직하다.
다음에 제 5 전극(825)을 접지하여, 제 1 전극(810) 및 제 2 전극(812)에 인가하는 전압을 연속적으로 변화시켜 채널(809)에 소정의 변성제 농도 구배를 가지는 영역을 도입한다. 그리고 동시에 이 채널(809)과 제 4 채널(818, 819)과의 교점에서 DNA 시료가 상기 변성제 농도 구배영역을 가지는 채널(809)상으로 도입된 다. 이때 제 4 채널(818)과 제 5 채널(819)로 완충액이 흘러 들지 않도록, 제 3 전극(820)과 제 4 전극(822)에 소정의 전위를 주는 것이 바람직하다. 제 1 전극(810)과 제 2 전극(812)에 부여하는 전위의 변동순서는, 제일 먼저 제 2 전극(812)의 전위를 제 1 전극(810)의 전위보다 크게 하여 두고, 그리고 서서히 제 2 전극(812)의 전위를 작게 하고, 그리고 제 1 전극(810)의 전위를 크게 하여 간다. 이 결과, 채널(809)에 도입되는 변성제 농도 구배영역은, 하류에서는 변성제 농도가 엷고, 상류로 갈 수록 짙은 것으로 형성된다.
상기와 같은 조작에 의하여 DNA 시료 중의 2개 사슬 DNA를 변성제 농도 구배영역 중에서 분리하면서 또는 그 분리 후에, 채널(9)을 향하여 설치된 DNA 검출기에서 검출이 행하여진다. DNA 검출은, 채널(9)의 어느 부분에서 행하여도 좋다. 분석중, 마이크로칩은 일정한 온도로 유지할 필요가 있고, 바람직하게는 40℃ ∼ 70℃이다.
혼합촉진수단을 가지는 형태 A의 마이크로칩 전기영동장치
형태 1-1 내지 형태 2-3까지의 각 형태에서 설명한 혼합 촉진수단을, 상기 형태 A의 마이크로칩 전기영동장치에 적용할 수 있다. 마이크로칩 전기영동장치에 있어서 혼합 촉진수단을 사용하는 경우, 완충액을 도입하기 위한 마이크로 채널(807, 808)이 액체 도입용 마이크로 채널이고, 농도 구배 형성영역의 채널(809)이 혼합용 마이크로 채널이고, 채널(9) 내에서의 완충액의 혼합에 혼합 촉진수단이 사용된다. 또 완충액을 보내기 위한 각 리저버가 액체 도입용 마이크로 채널의 액체 도입구 또는 도입부이다.
또 혼합 촉진수단은, 농도 구배의 형성에도 도움이 된다. 예를 들면 형태 1-1 및 1-2에 의한 유량의 독립제어수단(예를 들면, 부여 전위 또는 인가 전압을 조정함에 의한 전기침투류의 제어, 마이크로 실린지에 의한 압력을 조절함에 의한 송액 펌프의 제어, 또는 그것들에 의한 액체구동을 2차적으로 조절하기 위한 밸브의 제어)을 이용함으로써, 마이크로 채널(807, 808)로부터 도입되는 완충액의 비율을 임의로 변화시킴과 동시에, 합류하는 완충액의 접촉계면을 증가시킬 수 있다. 접촉계면의 증가에 의하여 완충액 사이의 분자확산에 의한 혼합이 촉진되기 때문에, 채널(809) 내에는 채널 폭방향으로 균일한 농도 구배를 신속하게 형성할 수 있다. 이 기술은 DEEG에 유용한 마이크로칩 장치를 제공할 수 있어, DEEG 분석시간의 단축화 및 높은 스루풋화를 가능하게 한다.
도 65 내지 도 68은, 고속 밸브(832)를 설치한 상기 형태 A의 장치를 나타낸다. 이들 도면에 나타내는 바와 같이 예를 들면 제 1 채널(807)에 고속작동 밸브(832)를 설치할 수 있다. 이 변성제 농도 구배 형성부(802)에서 제 1 전원(811)과 전극(810) 및 제 2 전원(813)과 전극(812)을 거쳐 각 리저버 내에 전압을 인가하면 이에 의하여 생기는 전기침투류에 의하여 제 1 리저버(805)로부터 변성제함유 완충액이 제 1 채널(807)을 통하여 농도 구배영역 채널(809)로 도입되고, 마찬가지로 제 2 리저버(806)로부터 변성제 불함유 완충액이 제 2 채널(7)을 통하여 채널(809)에 도입된다. 이때 고속작동 밸브(832)의 개폐동작을 제어함으로써, 제 2 리저버(806)로부터의 일정 유량의 완충액에 대한 제 1 리저버(805)로부터의 변성제함유 완충액의 혼합비율을 임의로 변화시킬 수 있다. 고속작동 밸브(832)의 개폐시간을 연속적으로 변화시킴으로써, 연속적인 농도 구배를 형성할 수 있다.
DGGE에 관한 형태 B
형태 B의 DGGE법은, 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액영역(영동겔)이 영동방향으로 교대로 배치되고, 농도 구배영역에 분석 대상물이 도입되어 전기영동이 행하여진다.
형태 B의 마이크로칩 전기영동장치에서는, 마이크로 채널 내에 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액영역이 영동방향으로 교대로 배치되고, 그 농도 구배영역에 분석 대상물이 도입되어 전기영동이 행하여진다.
(1) 본 형태의 원리
형태 B에 의한 2개 사슬 핵산의 분리방법은, 다른 농도로 변성제를 함유하는 적어도 2개의 완충액영역을 핵산의 영동방향에 대하여 교대로 배치하는 것을 특징으로 한다. 핵산은 그와 같은 변성제 농도의 불연속 배치구조 속을 전기영동적으로 이동함으로써 분리한다. 이 원리를 종래의 DGGE 법을 참조하여 설명한다.
DGGE의 원리는, 요소나 포름아미드 등의 핵산 변성제의 농도 구배가 형성된 겔 중에서 그것들 핵산 변성제가 영동되는 2개 사슬 핵산의 핵산 염기의 전하를 중화함으로써 뉴클레오티드 사이의 수소결합이 절단되어, 2개 사슬 핵산이 1개 사슬 핵산으로 해리되는 현상을 이용하는 것이다. 구체적으로는 영동하는 핵산 단편을, 그 한쪽 끝에 핵산 변성제 농도가 높아도 1개 사슬 핵산으로 해리되기 어려운 인공적인 핵산배열(GC 클램프)을 붙이고 PCR 증폭하여 2개 사슬 핵산으로 조제하여, 조제한 2개 사슬 핵산을 전기영동한다. 이때 어느 변성제 농도에 있어서, GC 클램프 가 붙어 있지 않은 쪽의 2개 사슬 핵산이 1개 사슬 핵산으로 해리되어 이동속도가 작아진다. 2개 사슬 핵산이 1개 사슬 핵산으로 해리되는 변성제 농도는, 2개 사슬 핵산의 염기배열에 의존하기 때문에, 각종 2개 사슬 핵산을 염기배열의 차이에 의하여 분리할 수 있다. 즉, DGGE는 2개 사슬 핵산의 해리에 요하는 변성제 농도의 염기배열 의존성을 교묘하게 이용한다. 다른 염기배열을 가진 2개 사슬 핵산은, 염기배열에 의하여 해리되기 쉬워지는 변성제 농도가 다르다. 따라서 그것들 2개 사슬 핵산은, 변성제 농도에 구배를 가지게 한 겔 중을 전기영동하면, 변성제 농도 구배상에서 점차로 해리상태에서 차이를 생기게 하여 그것들의 분리를 실현한다.
이 변성제 농도의 염기배열 의존성은, 변성제 중의 요소나 포름아미드 등의 변성제 분자가 2개 사슬 핵산의 수소결합 부위에 작용하는 빈도의 차이라고 관련지어 생각할 수 있고, 이것은 다음과 같이 설명할 수 있다. 즉, 어느 염기배열을 가진 2개 사슬 핵산의 수소결합을 부분적으로 끊기 위해서는 그 부분의 2개 사슬 핵산의 수소결합 부위에 변성제 분자를 어느 문턱값 이상의 빈도로 작용시키지 않으면 안된다. 또 2개 사슬 핵산이 있는 부분의 수소결합을 끊는다는 반응에는 유한의 반응시간이 필요하다. 그 수소결합 부위에, 적어도 그것에 필요하게 되는 반응시간보다 긴 시간, 변성제 분자가 작용하지 않으면 안된다. 이 유한의 반응시간이나, 염기배열에 의존한다고 생각된다.
상기한 아이디어에 의거하여 본 발명자는 이동하는 핵산과 변성제 분자와의 반응 빈도의 문턱값에 더하여 그것들의 반응시간의 문턱값에도 착안하여 2개 사슬 핵산의 분리방법을 검토하였다. 그 결과, 본 발명자는 변성제의 농도를 연속적으 로 변화시키지 않고 반응 빈도를 변화시켜 2개 사슬 핵산을 분리할 수 있는 것을 발견하였다. 본 분리방법은, 2개 사슬 핵산의 수소결합을 끊는 데 필요하게 되는 반응 빈도와 반응시간의 문턱값이 염기배열에 의하여 다른 것을 이용하는 방법으로서, 전기영동방향으로 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액영역을 배열하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로는 변성제를 높은 농도로 함유하는 완충액영역 및/또는 변성제를 함유하지 않은 또는 낮은 농도로 함유하는 완충액영역의 "길이(영동방향의 거리)"를 영동방향에서 변화시키고, 여기서 각 완충액영역은, 영동방향에서 변성제 분자와의 반응 빈도 또는/및 반응시간(변성제를 높은 농도로 함유하는 완충액영역의 통과시간)이 점차 상승하도록 배치된다. 이와 같이 배치된 완충액영역상에 2개 사슬 핵산을 영동시키면 그것들을 염기배열의 차이에 의하여 분리 가능한 것이 발견되었다.
형태 B에서는 각 완충액영역 내에 변성제 농도가 연속적으로 변화되는 구배를 형성할 필요는 없다. 소정 농도의 변성제를 함유하는 완충액영역의 2차원 분포의 구배를 형성하여 영동방향의 하류로 갈 수록 변성제의 분포가 치밀해지게 한다.
상기한 바와 같이 본 형태는 변성제 농도의 불연속한 배치구조를 형성하는 것에 관한 것이다. 본 형태에 사용되는 용어 "변성제 농도의 불연속 배치구조" 또는 "변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액영역의 배열"이란, 변성제의 농도가 다른 적어도 2개의 완충액영역을 교대로 배열한 구조를 의미한다.
본 형태에 사용되는 용어 "완충액영역"이란, 일정 농도의 완충액을 함유하는 겔 등의 전기영동용 매트릭스를 말한다.
이하에서는 설명의 간략화를 위하여 변성제를 함유하는 완충액영역과 변성제를 함유하지 않은 완충액영역과의 교대 배치(이하 "변성제 간헐배치"라 함)를 설명한다. 단, 각 완충액영역이 변성제를 함유하는지, 함유하지 않은지가 중요하지 않고, 변성제의 상대적인 농도 차이가 중요하다. 예를 들면 "변성제를 함유하지 않은 영역"이 상대적으로 저농도의 변성제를 함유하고 있고, "변성제를 함유하는 영역"이 "변성제를 함유하지 않은 영역"보다 유의하게 높은 농도의 변성제를 함유하면 동일한 효과가 얻어진다. 이와 같은 형태도 본 발명의 범위 내이다.
바람직한 형태에서는 2개 사슬의 핵산은 그 이동거리에 따라 변성제 분자와의 반응 빈도가 점차 커지도록 또는 변성제 분자와의 반응시간이 점차 길어지도록 기도된다. 이 바람직한 형태에서는 영동방향에서 서서히 길이가 변화되는 변성제 함유완충액의 영역 및/또는 변성제 불함유 완충액의 영역의 배열을 사용한다.
상기한 완충액영역 배열에 의한 분리원리는 다음과 같이 설명할 수 있다. 여기서는 도 69의 형태(뒤에서 설명하는 제 1 형태)를 예로 설명한다. 도 82에 나타내는 바와 같이 영동방향에서 변성제함유 완충액의 영역의 간격이 짧아지는 경우, 그 배열 패턴을 가로 질러 영동하는 각 핵산은, 이동거리가 작은 곳(상류 영역)에서는 시간(t) 중 변성제함유 완충액에 접촉하는 시간의 비율(A)이 작다. 그리고 이동거리가 큰 곳(하류영역)에서는 같은 시간(t) 중 변성제함유 완충액에 접촉하는 시간의 비율(B)이 커진다. 즉, 상류와 하류에서 핵산 이동도에 유의한 차가 없고, 또한 변성제함유 완충액의 각 영역을 통과하는 시간(Δt)이 같다고 하면, 같은 길이의 시간(t) 내에서 핵산이 변성제함유 완충액과 접촉하는 시간의 비율 은, 통과하는 변성제함유 완충액의 영역의 수에 의존하여 A < B의 관계가 성립한다. 이와 같이 핵산은 그 이동거리(이동시간)에 의하여 동일시간(t) 내에 변성제함유 완충액에 접촉하는 시간의 비율(즉 반응빈도)이 점차로 증가하여 간다. 접촉시간의 비율이 점차로 증가하여 감에 따라 2개 사슬 핵산은, 염기배열의 상위에 따라 다른 반응 문턱값을 넘은 곳에서 해리되고, 결과로서 각각 고유의 이동도(이동거리)를 가진다. 따라서 변성제함유 영역의 간헐적 배치의 이용에 의하여 연속적으로 형성한 변성제 농도 구배를 이용하는 경우와 동일한 분리효과가 얻어진다.
도 69는 변성제 간헐배치의 제 1 형태를 나타낸다. 이 형태에서는 핵산의 영동방향에서 변성제함유 완충액의 각 영역이 길이를 대략 일정하게 하고, 변성제 불함유 완충액의 각 영역을 서서히 짧게 하여 가는 변성제 간헐배치이다. 즉 변성제함유 완충액끼리의 간격(변성제를 함유하지 않은 완충액영역의 폭)은 핵산의 영동방향으로 감에 따라 좁아진다. 이 형태에 있어서 핵산이 변성제 간헐배치상으로 이동하면, 그것이 변성제함유 완충액과 변성제 불함유 완충액을 교대로 통과한다. 여기서 핵산이 각 변성제함유 완충액영역의 통과에 요하는 시간은, 염기배열의 상위에 기인하는 해리 반응시간의 차보다 충분히 짧아지도록 설정되어 있다. 그리고 핵산이 하류로 감에 따라 그것이 일정시간 내에 변성제함유 완충액을 통과하는 빈도는 증가하여 가기 때문에(즉 반응빈도가 증가하여), 2개 사슬로 해리되기 쉬워 진다. 따라서 2개 사슬의 결합이 비교적 불안정해지는 염기배열을 가지는 핵산은, 변성제 간헐배치상의 변성제함유 완충액영역의 밀도가 작은 장소(상류영역)에서 해리되나, 2개 사슬의 결합이 비교적 안정되는 염기배열을 가지는 핵산은 변성제함유 완충액영역의 밀도가 더욱 큰 장소(하류영역)에서 해리하게 된다. 이 형태는 변성제함유 완충액영역의 배열 밀도의 변화(통과빈도의 변화)를 이용하는 것이다.
도 70은 변성제 간헐배치의 제 2 형태를 나타낸다. 이 형태는 핵산의 영동방향에서 변성제 불함유 완충액의 각 영역의 길이를 대략 일정하게 하고, 변성제함유 완충액의 각 영역을 서서히 길게 하여 가는 변성제 간헐배치이다. 이 형태에 있어서도 핵산이 적절한 수의 변성제함유 완충액영역의 통과에 요하는 시간은, 염기배열의 상위에 의하여 생기는 해리 반응시간의 차보다 짧다. 영동되는 핵산은, 각 변성제함유 완충액영역을 통과하는 시간이 염기배열의 해리에 요하는 반응시간에 도달하여 있는지의 여부에 의하여 해리의 정도가 다르다. 또 핵산이 하류로 감에 따라 변성제함유 완충액영역을 통과하는 시간이 길어지기 때문에, 2개 사슬이 해리되기 쉬워지다. 따라서 핵산의 2개 사슬이 불안정하면 변성제 간헐배치의 상류영역에서 해리되나, 안정되면 하류영역에서 해리되게 된다. 이 형태는 각각의 변성제함유 완충액영역의 길이(영동방향의 폭)에 의존하는 계속적 작용(하나의 배열에서의 반응시간)의 변화를 이용하는 것이다.
또한 핵산이 변성제함유 완충액을 통과하는 데 요하는 시간은, 변성제함유 완충액의 길이와 핵산의 영동속도에 의하여 결정된다. 또 핵산이 변성제함유 완충액을 통과하는 빈도는, 완충액의 길이와 핵산의 영동속도에 의하여 결정된다. 따라서 변성제함유 완충액영역의 길이, 변성제 불함유 완충액영역의 길이, 핵산의 영동속도, 변성제함유 완충액의 변성제 농도, 변성제 간헐배치의 전체 길이 등을 적절하게 선택함으로써 각종 2개 사슬 핵산을 염기배열의 차에 의하여 적절하게 분리 할 수 있다. 이들 파라미터는 분석하는 핵산의 종류나 요구되는 정밀도 등에 따라 다르다. 이들은 사전에 실시되는 예비실험에 의하여 결정하면 좋다. 예를 들면 2개 사슬 핵산의 분리를 제어하기 위하여 변성제함유 완충액영역의 길이나 농도를 조절할 수 있다. 예를 들면 변성제함유 완충액영역의 길이를 짧게 하면, 핵산이 변성제함유 완충액영역을 통과하는 시간이 짧아져 정밀도가 좋은 검출이 가능해진다. 변성제함유 완충액영역의 변성제 농도를 엷게 하면, 정밀도가 좋은 검출이 가능해진다. 이와 같이 분리정밀도를 제어하기 위하여 변성제함유 완충액영역의 길이, 변성제 불함유 완충액영역의 길이, 핵산의 영동속도, 변성제함유 완충액의 변성제 농도, 변성제 간헐배치의 전체 길이 등을 필요에 따라 조절할 수 있다.
변성제 간헐배치의 제 1 형태에서는 변성제 불함유 완충액의 각 영역만의 길이를 바꾸고, 또 제 2 형태에서는 변성제함유 완충액의 각 영역만의 길이를 바꾸고 있으나, 이들에 한정하지 않고, 변성제 불함유 완충액의 각 영역과 변성제함유 완충액의 각 영역의 양쪽의 길이를 바꾸는 배치로 하여도 좋다.
본 형태를 마이크로칩상에서 행하는 경우, 농도 구배 형성영역의 상류점에서의 완충액끼리의 혼합조작(형태 A와 같이 변성제의 연속적 구배를 형성하는 경우에 분석칩상에서의 혼합이 요구된다)이 필요하게 되지 않는 점에서 적합하다. 또 그와 같은 분석칩상에서의 혼합을 촉진하는 수단이 필요하게 되지 않는다는 점에서 적합하다.
본 형태에 사용되는 완충액은, 필요에 따라 고분자 매트릭스를 함유하는 완충액이다. 이것은 고분자 매트릭스의 그물코구조나 고분자 매트릭스와 핵산의 상 호작용에 의하여 핵산을 분리할 수 있기 때문이다.
본 형태에 사용할 수 있는 고분자 매트릭스는, 폴리아크릴아미드, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 하이드록시셀룰로스, 메틸셀룰로스 등의 셀룰로스 유도체, 폴리에틸렌옥시드, 폴리메틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피로리돈 등의 폴리올류, 덱스트란, 풀룰란 등으로부터 적절하게 선택된다. 고분자 매트릭스가 하이드록시에틸셀룰로스인 경우는, 2개 사슬 DNA의 길이에 의존하고, 0.01%∼3.0%의 농도범위에 있는 것이 바람직하다. 이 고분자 매트릭스를 트리스 - 아세트산 완충액이나 트리스 - 붕산 완충액 등에 함유시켜 완충액으로서 사용한다. 단, 기존의 평판겔에 완충액을 넣어 완충액영역의 배열을 형성할 수도 있다. 이미 고분자 매트릭스의 그물코구조가 형성되어 있는 겔에는, 고분자 매트릭스를 함유하지 않은 완충액을 사용할 수 있다.
본 형태에 사용되는 변성제는, 요소, 포름아미드, 포름알데히드 및 수산화나트륨 등의 강알칼리 등으로부터 선택된다. 바람직하게는 요소와 포름아미드를 사용한다. 포름아미드와 요소를 변성제로서 사용한 경우, 일반적으로는 7 M요소, 40% 포름아미드를 함유하는 변성제함유 완충액을 100% 변성제함유 완충액으로서 사용하고, 변성제를 함유하고 있지 않은 완충액을 0% 완충액으로서 사용하나, 이것에 한정되지 않는다. 상기한 바와 같이 형태 B에서는 유의한 농도차를 가지는 변성제의 완충액영역 배열을 형성할 수 있으면 좋다.
본 형태의 분석 대상물에는 대표적으로는 단리된 2개 사슬 핵산(단지 핵산 또는 핵산분자라고 하는 경우도 포함한다)이고, 변성제에 의하여 해리되는 성질을 가지는 한 모든 타입의 핵산분자를 사용할 수 있다. 전형적으로는 사람의 혈액이나 세포 등과 같은 생체 시료나, 식품, 토양이나 하천수, 해수 등의 환경 시료, 또는 활성 오니나 메탄발효 오니 등으로부터 추출한 게놈 핵산의 소정의 영역을, PCR 반응 등에 의하여 한쪽 끝에 핵산 변성제 농도가 높더라도 1개 사슬 핵산으로 해리되기 어려운 인공적인 핵산 배열(GC 클램프)을 붙여 증폭한 2개 사슬 핵산을 사용한다. 또한 본 형태의 분석 대상물은 반드시 핵산에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면 적절한 완충액 및 변성제 및 분리조건 등을 선택함으로써 전기영동 가능하면 그와 같은 생체 고분자(예를 들면, 단백질)도 본 형태의 분석 대상물에 포함될 수 있다.
본 형태의 변성제 간헐배치상에서 분리된 핵산은, 검출수단을 사용하여 검출된다. 검출수단은 형광검출, 발광검출, 흡광검출, 전기화학적 검출 등으로부터 선택되고, 검출기로서 형광검출, 발광검출, 흡광검출의 경우, 광전자 증배관, UV검출기, 포토 다이오드 검출기 등이 사용된다. 형광검출로서는, 미리 PCR 반응의 프라이머를 형광 표식하여 두는 방법, PCR 산물을 형광 표식하는 방법, 미리 PCR 산물을 DNA 염색제로 염색하는 방법 및 고분자 매트릭스함유 완충액에 DNA 염색제를 함유시켜, 전기영동 중에 염색하는 방법 등이 있다. 형광 표식물질로서는 플루오레세인, 로더민, Cy3, Cy5, BODIPY FL, TexasRed, Alexa Fluor 등이 있다. DNA 염색제로서는, SYBR Green, Vistra Green, 에튬 브로마이드, YOYO-1, TOTO-1, thiazole orange 등이 있다.
(2) 본 형태의 분리방법과 장치
본 형태의 핵산분리를 행하기 위한 지지체로서, 평판겔 또는 전기영동용 마이크로칩 등의 분석 기판을 들 수 있다.
본 형태에 사용할 수 있는 평판겔에는 완충액을 포함한 폴리아크릴아미드겔을 들 수 있으나 이것에 한정되지 않는다. 완충액을 함유한 폴리아크릴아미드겔은, 예를 들면 아크릴아미드, N, N 메틸렌-비스아크릴아미드, 증류수로 이루어지는 아크릴아미드용액, 트리스 - 아세트산 완충액, 과황산암모늄용액, N, N, N', N' - 테트라메틸에틸렌디아민, 증류수를 혼합하여 중합시킨 것이다. 모든 타입의 평판겔을 해당 기술분야에서 알려져 있는 정법에 따라 작성할 수 있다.
평판겔에는 본 형태에 적합한 완충액영역 형성방법에 의하여 변성제 간헐배치가 형성된다. 평판겔을 사용하는 경우, 예를 들면 도 71에 나타내는 바와 같이 다른 완충액으로 채워진 영동조에 침지하여 완충액이나 변성제 간헐배치의 증발을 방지하기 위한 덮개가 이루어진다. 상세한 도시는 생략하고 있으나, 관례적인 전기영동법과 마찬가지로 평판겔의 영동방향의 상류측에는 시료 구멍이 등간격으로 설치되고, 영동조에는 전극 및 전원이 접속된다.
지지체에는 평판겔뿐만 아니라, 변성제 간헐배치를 지지할 수 있는 것인 한, 모든 타입의 분석기판이 포함된다. 기판의 재질은 예를 들면 유리, 석영, 플라스틱, 실리콘수지, 종이 등으로부터 선택할 수 있다. 또 예를 들면 변성제 간헐배치가 형성된 기판에, 변성제 간헐배치의 증발을 방지하기 위한 덮개가 되는 기판을 라미네이트함으로써 작성하여도 좋다. 또 변성제 간헐배치를 형성하고 있지 않은 기판의 부분을 구부림으로써 이 부분을 덮개로서 이용하여도 좋다.
전형적인 분석 기판은 마이크로칩이다. 도 72에 나타내는 바와 같이 마이크로칩의 농도 구배 형성영역인 마이크로 채널 내에 변성제 간헐배치를 형성할 수 있다. 이 마이크로 채널 내의 변성제 간헐배치에서는, 변성제함유 완충액영역과 변성제 불함유 완충액영역을 영동방향에서 교대에 배열하고, 또한 각 변성제 불함유 완충액영역의 폭이 점차로 영동방향에서 짧아져 있다.
마이크로칩은 통상 적어도 2매의 기판으로 이루어진다. 1매의 기판에는 포토리소그래피 기술 등의 미세 가공 기술을 사용하여 폭, 깊이 모두 10 ~ 100 ㎛ 정도의 채널을 형성시키고, 또 1매의 기판에는 초음파가공 등의 기계가공을 사용하여 리저버용 구멍을 뚫는다. 이들 2매의 기판을, 열에 의한 용융접합 등의 접착기술을 사용하여 라미네이트하면, 소정의 위치에 채널과 리저버를 가지는 마이크로칩이 얻어진다. 기판의 재질은, 유리, 석영, 플라스틱, 실리콘수지 등으로부터 적절하게 선택할 수 있다. 마이크로칩에서는 분석용 채널이 미세한 구조이기 때문에 높은 스루풋의 해석, 장치 전체의 소형화 등을 실현할 수 있다.
다음에, 형태 B의 마이크로칩 전기영동장치에 대하여 설명한다.
도 73의 마이크로칩 전기영동장치는, 농도 구배 형성영역인 마이크로 채널(901)[이하 "핵산 분석용 채널(901)"이라 함]과, 핵산 시료의 도입을 위한 마이크로 채널(902)을 포함하는 플라스틱제 마이크로칩(903)으로서 제공된다. 핵산 분석용 채널(901) 내에 변성제 간헐배치가 형성된다. 이 마이크로칩(903)은, 상기 채널(901, 902)이 형성된 플라스틱제 기판(903a)과, 시료 도입을 위한 핵산 투입구 및 배출구(902a, 902b) 및 제 1 및 제 2 리저버(901a, 901b)가 설치된 플라스틱제 기판(3b)을 라미네이트함으로써 제조된다.
도 73의 마이크로칩을 사용하여 2개 사슬 핵산을 염기배열의 차이에 의하여 분리하는 방법의 순서의 일례를 이하에 나타낸다. 핵산 도입 채널(902)에 완충액을 충전한다. 여기서 핵산 분석용 채널 내(901)로 시료를 도입하는 방법은, 시료인 2개 사슬 핵산을 핵산 분석용 채널(901)에 전기영동에 의하여 도입하는 방법이다. 핵산 투입구(902a)에 2개 사슬 핵산을 함유하는 완충액을 투입하여, 핵산 투입구(902a)와 핵산 배출구(902b)에 직류 전원에 접속된 전극(도시 생략)을 꽂는다. 핵산 시료는, 그 한쪽 끝에 핵산 변성제 농도가 높더라도 1개 사슬 핵산으로 해리되기 어려운 인공적인 핵산 배열(GC 클램프)을 붙여 증폭된 2개 사슬 핵산을 포함한다. 2개 사슬 핵산은 음(-)으로 대전하고 있기 때문에, 핵산 투입구측을 음극, 핵산 배출구측을 양극으로 한다. 사용하는 전극은 핵산 투입구와 핵산 배출구에, 예를 들면 증착이나 도금 등에 의하여 미리 형성되어 있어도 좋다. 2개 사슬 핵산이 도입될 때, 핵산 분석용 채널 한쪽으로의 시료의 확산을 억제하면 좋다. 이 때문에 제 1 리저버(901a)와 제 2 리저버(902a)에 전극을 꽂아 핵산 투입구(902a)의 전위보다 크고, 핵산 배출구(902b)의 전위보다 작은 전위를 인가하면 좋다.
다음에 핵산 분석용 채널(901)의 양쪽 끝에 직류 전원에 접속된 전극(도시 생략)을 설치한다. 2개 사슬 핵산은 음으로 대전하고 있기 때문에, 제 1 리저버측을 음극, 제 2 리저버측을 양극으로 한다. 전극은 제 1 리저버 및 제 2 리저버에 예를 들면 증착이나 도금 등에 의하여 미리 형성되어 있어도 좋다. 제 1 리저버 및 제 2 리저버에 꽂은 전극에 소정의 전위를 인가함으로써 분석용 기판의 양쪽 끝 에 설치한 전극에 소정의 전압을 인가함으로써 상기한 바와 같이 도입된 2개 사슬 핵산이 변성제 간헐배치 내를 전기영동한다. 영동되는 2개 사슬 핵산은 변성제 간헐배치상에서 염기배열의 차에 의하여 분리된다.
상기와 같은 조작에 의하여 분리한 핵산은, 핵산 분석용 채널(901) 내 또는 그 하류에 있는 검출부(905)에 의하여 검출된다. 사용할 수 있는 검출법은 이미 설명한 바와 같이 형광검출, 발광검출, 흡광검출, 전기화학적 검출 등으로부터 선택되고, 바람직하게는 형광검출이다. 형광검출에서는 미리 PCR 반응의 프라이머를 형광표식하여 두는 방법, PCR 산물을 형광 표식하는 방법, 미리 PCR 산물을 DNA 염색제로 염색하는 방법 및 고분자 매트릭스함유 완충액에 DNA 염색제를 함유시켜 전기영동 중에 염색하는 방법 등이 있다. 형광 표식물질은 상기한 바와 같고, 검출기도 상기한 바와 같다. 분석 중, 분석용 기판(903a, 903b)은 일정한 온도로 유지할 필요가 있고, 바람직하게는 40℃∼70℃이다.
사용되는 마이크로칩은 유리제이어도 좋다. 유리제의 마이크로칩에서는 전기침투류의 효과가 커지나, 채널 표면을 공지의 기술에 의하여 수식하여 전기침투류를 억제하면 좋다. 이에 의하여 플라스틱제의 마이크로칩과 동일한 구성의 유리제 마이크로칩상에서 전기영동에 의한 2개 사슬 핵산의 분리가 가능하다.
도 74는 유리제 마이크로칩 전기영동장치의 일 형태를 나타낸다. 전기침투류가 존재하는 경우에도 도 74와 같은 구성에 의하여 2개 사슬 핵산의 분석이 가능해진다. 그 기본구조는 도 5의 마이크로칩과 동일하나, 핵산 도입 채널(2)이 하류측에 설치되어 있는 점에서 다르다.
먼저, 핵산 도입 채널(2)로부터 시료가 되는 2개 사슬 핵산을, 변성제 간헐배치가 있는 핵산 분석용 채널(901)에 전기침투류에 의하여 도입한다. 핵산 투입구(902a)에 2개 사슬 핵산을 포함한 완충액을 투입하여 핵산 투입구(902a)와 핵산 배출구(902b)에 직류 전원에 접속된 전극을 꽂는다. 핵산 투입구와 핵산 배출구와의 사이에 소정의 전압을 인가함으로써, 2개 사슬 핵산을 포함한 완충액이 핵산 도입 채널(902)을 전기침투류에 의하여 이동하여 핵산 분석용 채널(901) 내에 도입된다. 여기서 전기침투류를 이용하기 위하여 핵산 투입구측을 양극, 핵산 배출구측을 음극으로 한다. 이 2개 사슬 핵산 도입시에 핵산 분석용 채널(901)측으로의 확산을 억제하면 좋다. 이를 위하여 제 1 리저버(901a)와 제 2 리저버(901b)에 전극을 꽂아 핵산 투입구(902a)의 전위보다 작고, 핵산 배출구(902b)의 전위보다 큰 전위를 인가하여 두면 좋다. 각 전극은 예를 들면 증착이나 도금 등에 의하여 미리 형성되어 있어도 좋다.
다음에 도입된 2개 사슬 핵산을 전기영동하여 분리한다. 제 1 리저버(901a) 및 제 2 리저버(902b)에 꽂은 전극에 소정의 전압을 인가함으로써, 핵산 분석용 채널(901) 내를 변성제 간헐배치의 완충액영역이 전기침투류에 의하여 수송된다. 그 완충액영역에 도입되어 있는 2개 사슬 핵산도 전기영동에 의하여 이동한다. 일반적으로는 전기침투류에 의한 변성제 간헐배치의 이동방향과, 전기영동에 의한 핵산의 이동방향은 서로 대향하는 방향(반대방향)이 된다. 따라서 도 74의 변성제 간헐배치를 사용하는 경우에는, 제 1 리저버(901a)를 양극으로 하고, 제 2 리저버(901b)를 음극으로 하고, 이에 의하여 변성제 간헐배치는 제 2 리저버(901b)의 방 향으로 2개 사슬 핵산은 제 1 리저버(901a)의 방향으로 각각 이동한다. 따라서 2개 사슬 핵산은 변성제 간헐배치상을 전기영동하여 염기배열의 차이에 의하여 분리된다.
상기와 같은 조작으로 분리된 2개 사슬 핵산은, 변성제 간헐배치 내 또는 그 하류에 있는 검출부(도시 생략)에서 검출된다.
도 75는 유리제 마이크로칩 전기영동장치의 다른 형태를 나타낸다. 이 장치는 변성제 간헐배치가 형성되는 핵산분석용 채널(901)(제 1 마이크로 채널)과, 핵산분석용 채널(901)의 한쪽 끝측에서 이것과 교차하는 변성제함유 완충액 도입부와, 핵산 분석용 채널(901)의 다른쪽 끝측에서 이것과 교차하는 핵산 도입부를 구비하고 있다. 제 1 리저버(901a)는 제 1 완충액용의 완충액 투입구이고, 제 2 리저버(901b)는 그 배출구이다.
변성제함유 완충액 도입부는, 핵산분석용 채널(901)을 가로지르는 변성제함유완충액 도입 채널(906)(제 2 마이크로 채널)을 가진다. 변성제함유 완충액 도입 채널(906)은, 제 2 완충액을 도입하기 위한 변성제함유 완충액 투입구(906a)와 그 배출구(906b)를 가진다. 이 변성제함유 완충액 도입 채널(906)로부터 제 2 완충액이 도입된다.
핵산 도입부는, 핵산 분석용 채널(901)을 가로지르는 핵산 시료 도입 채널(902)을 가진다. 핵산 시료 도입 채널(902)은 핵산 투입구(902a)와 그 배출구(902b)를 가진다.
도 75의 장치는, 핵산분석용 채널(901), 변성제함유 완충액 도입 채널(906) 및 핵산도입 채널(902)이 형성된 기판(903a)[도 76(a) 참조]과, 각 채널 단부의 완충액 투입구와 그 배출구, 핵산 투입구와 그 배출구 및 변성제함유 완충액 투입구와 그 배출구를 형성한 기판(903b)[도 76(b)참조]을 예를 들면 열에 의한 용융접합 등의 접착기술을 사용하여 라미네이트하여 1매의 마이크로칩으로 한 것이다. 각 리저버를 위한 구멍은, 예를 들면 직경 2∼10 mm 정도의 원형으로, 예를 들면 초음파가공 등의 주지의 가공기술을 사용하여 형성한다.
상기 구성의 장치는, 변성제함유 완충액 도입부에 의하여 핵산분석용 채널(901) 내에, 도 77에 나타내는 바와 같은 원하는 변성제 간헐배치를 형성할 수 있다. 그 형성방법은 뒤에서 설명하는 「(3) 형태 B를 위한 완충액영역의 배열의 형성방법및 장치」의 항에서 상세하게 설명한다. 여기서는 도 75의 마이크로칩 전기영동장치를 사용하는 경우로서, 핵산분석용 채널(1)에 변성제 간헐배치를 형성한 후에 행하여지는 분리공정을 나타낸다.
핵산 분석용 채널(901)에 원하는 변성제 간헐배치를 형성한 후, 핵산 투입구(902a)로부터 핵산 배출구(902b)의 방향으로 2개 사슬 핵산을 유동시켜, 2개 사슬 핵산을 핵산 분석용 채널(901) 내에 도입한다. 2개 사슬 핵산을 유동시키는 방법으로서는 유동방향과 유동시간(유동거리)을 제어할 수 있는 방법으로부터 임의로 선택할 수 있으나, 유리제 마이크로칩이면 핵산 투입구(902a)와 핵산 배출구(902b)의 사이에 직류 전압을 인가하여 전기침투류를 발생시키는 방법이 바람직하다. 또한 2개 사슬 핵산 도입 공정시에 핵산 분석용 채널(901)에 여분의 시료가 유출되지 않도록 완충액투입구(901a), 그 배출구(901b), 변성제함유 완충액 투입구(906a), 그 배출구(906b)에 예를 들면 직류 전압을 인가하거나 압력을 가하거나 하면 좋다.
다음에 완충액 투입구(901a)와 배출구(901b)에 전극을 꽂아 소정의 직류 전압을 인가하면, 도입된 2개 사슬 핵산이 핵산 분석용 채널(901) 내의 변성제 간헐배치상을 전기영동하여, 염기배열의 차이에 의하여 분리된다. 각 전극은 칩에 예를 들면 증착이나 도금 등에 의하여 미리 형성되어 있어도 좋다. 또한 유리제 마이크로칩 등의 경우에 전기침투류도 동시에 일어나는 경우에는, 변성제 간헐배치가 전기침투류에 의하여 2개 사슬 핵산과 역방향, 즉 음극측으로 유동한다. 이 경우, 예를 들면 도 77에 나타내는 바와 같이 완충액의 길이가 핵산의 영동방향에서 점차로 짧아지도록 변성제 간헐배치를 핵산 분석용 채널(901) 내에 형성하여 둘 필요가 있다.
상기와 같은 조작으로 핵산 시료 중의 2개 사슬 핵산을 분리한 후, 핵산 분석용 채널(901)상의 소정 부분, 예를 들면 그 하류에 있는 검출부(도시 생략)에서 2개 사슬 핵산을 검출한다. 분석 중, 마이크로칩은 일정한 온도로 유지할 필요가 있고, 바람직하게는 40℃ ∼ 70℃ 이다. 또 사용할 수 있는 변성제, 완충액, 분석할 수 있는 시료, 검출법 등도 이미 설명한 장치와 동일하다.
(3) 형태 B를 위한 완충액영역의 배열의 형성방법 및 장치
종래의 DGGE에서는 변성제함유 완충액에 연속적인 농도 구배를 가지게 할 필요가 있었다. 그러나 마이크로칩 전기영동장치에 사용되는 마이크로 채널 내에서는 변성제함유 완충액과 완충액의 혼합에 충분한 시간을 필요로 하거나, 변성제함유 완충액과 완충액을 효율좋게 혼합하기 위한 기구를 필요로 하였다.
형태 B의 발명에 의하면, 마이크로 채널 내에 형성된 변성제 간헐배치를 핵산이 전기영동하기 때문에, 변성제함유 완충액과 완충액이 완전히 혼합되어 있지 않아도 핵산분리는 실현 가능하다. 특히 변성제함유 완충액과 완충액을 혼합하기 위한 교반수단을 필요로 하지 않는다.
이하에서는 형태 B의 분리방법에 사용할 수 있는 원하는 완충액영역의 배열의 형성방법 및 장치를 제공한다.
도 78은 완충액영역 배열을 형성하기 위한 장치의 일 형태를 나타낸다. 이 장치는 2개 사슬 핵산의 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액영역의 배열을 전기영동용 분석기판(910)상에 형성하기 위한 장치로서, 분석기판(910)을 유지하기 위한 스테이지수단(911)과, 그 기판(910)에 대하여 2개 사슬 핵산의 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액의 액적(液滴)(913)(예를 들면, 변성제를 함유하지 않은 완충액과 변성제를 함유하는 완충액의 각각의 액적)을 사출하기 위한 사출수단(912)과, 스테이지수단(911) 및/또는 사출수단(912)을 위치 제어함과 동시에 사출수단을 차례로 구동하기 위한 제어수단(도시 생략)을 가진다. 스테이지수단(911) 및/또는 사출수단(912)은 도면에 있어서 화살표로 나타내는 바와 같이 2차원 방향에서 서로 직진 운동할 수 있는 이동기구를 가진다.
도 78의 장치에서는, 상기한 핵산분석용 채널(1)을 가지는 마이크로칩 등의 기판(910)을 스테이지수단(911)상에 유지하고, 이 기판(910)에 대하여 변성제를 함유하지 않은 완충액 및/또는 변성제를 함유하는 완충액 액적(913)을 사출할 수 있는 사출수단(912)을 사용하여, 스테이지수단(911) 및/또는 사출수단(912)을 위치제 어함과 동시에 원하는 사출수단(912)을 차례로 구동할 수 있다. 이와 같이 하여 사출수단(912)으로부터 소정의 변성제 농도의 완충액의 액적(913)을 핵산 분석용 채널(901) 내의 임의의 위치에 부착시키고, 그곳에 변성제 간헐배치를 형성할 수 있다. 또한 한 번의 사출로 도포되는 완충액의 두께가 너무 얇은 경우는, 완전히 동일한 분포(동일한 변성제영역)로의 도포를 적절한 두께가 될 때까지 겹치면 좋다.
상기한 사출수단(912)은, 더욱 상세하게는 액적 사출헤드를 가지는 사출기구에 의하여 구성할 수 있다. 예를 들면 도시 생략한 제어수단을 거쳐 전기신호를 인가함으로써 임의의 타이밍으로 표적에 완충액을 사출할 수 있다.
가장 간이하게는 완충액을 함유한 겔이 미리 형성되어 있는 기판을 세트하여 겔 중의 완충액과는 다른 변성제 농도(적어도 겔에 함유되어 있는 완충액보다 높은 농도)의 완충액을 사출하는 하나의 액적 사출헤드(912)가 사용된다. 이것은 예를 들면 핵산 분석용 채널 내에 완충액을 함유한 겔이 이미 충전되어 있는 마이크로칩이나 완충액을 함유한 평판겔(914)을 사용하는 경우(도 79)이다.
한편, 겔을 가지지 않은 핵산 분석용 채널이나 유리기판을 사용하는 경우, 도78에 나타내는 바와 같이 농도가 다른 완충액에 대응한 복수의 액적 사출헤드(912, 912')를 설치하여, 원하는 액적을 선택적으로 사출시킴으로써 대응 가능하다. 이 경우, 통상은 완충액에는 겔을 형성하기 위한 고분자 매트릭스를 포함하게 한다.
상기와 같은 액적 사출기구로서는, 예를 들면 잉크젯 프린터용 사출헤드 등 을 이용할 수 있다. 적절한 액적 사출헤드를 사용함으로써, 적어도 마이크로칩 기판(910)상의 핵산 분석용 채널(1)의 폭보다 작은 직경의 완충액의 액적(913)을 용이하게 도포할 수 있다.
상기한 액적 사출기구에는 동일한 농도의 완충액을 사출하는 액적 사출헤드를 복수로 연결하여 사용하여도 좋다. 이와 같이 하면 변성제 간헐배치의 형성시간을 단축할 수 있다. 또 다른 농도의 완충액을 사출하는 액적 사출헤드끼리를 연결하여도 좋고, 예를 들면 변성제함유 완충액용 액적 사출헤드와 완충액용 액적 사출헤드를 일체로 한 사출헤드 모듈로 하여도 좋다. 이와 같은 사출헤드 모듈을 사용하면 장치가 콤팩트해지고, 또한 변성제 간헐배치의 형성시간을 단축할 수 있다. 또한 그와 같이 모듈화한 액적 사출헤드군을 복수로 더 설치하여 사용하면 더욱 효율 좋게 변성제 간헐배치를 형성할 수 있다.
또 도 79에 나타내는 바와 같이 마이크로칩 기판(910) 대신에 전기영동용 평판겔(914)을 유지하고, 평판겔(914)상의 임의의 위치에 변성제함유 완충액의 액적(913)을 사출할 수도 있다. 이와 같이 하여 평판겔(914)의 임의의 장소에 변성제함유 완충액의 액적(913)을 넣을 수 있고, 그곳에 임의의 패턴으로 변성제 간헐배치를 효율적으로 형성할 수 있다.
상기한 바와 같이 위치결정수단(911)과 액적 사출수단(912) 등을 채용함으로써 임의의 패턴을 구비하는 변성제 간헐배치를 용이하게 형성할 수 있고, 또 모든 타입의 기판에 대응할 수 있고, 특히 동일한 패턴의 변성제 간헐배치를 효율 좋게 또한 재현성 좋게, 대량으로 형성할 수 있다.
다음에 도 80 및 도 81을 참조하여 마이크로 채널 내에의 변성제 간헐배치의 다른 형성법을 설명한다.
먼저 완충액 이송공정에 의하여 완충액(제 1 완충액 ; 변성제를 함유하지 않은 완충액)을 완충액 투입구로부터 배출구 방향으로 유동시킨다. 그 구동방법으로서는 완충액 투입구와 배출구의 사이에 직류 전압을 인가하여 전기침투류를 발생시키는 방법이나, 완충액 투입구 또는/및 배출구에 펌프를 접속하여 유동시키는 방법 등, 유동방향과 유동시간(유동거리)을 제어할 수 있는 방법으로부터 임의로 선택할 수 있다. 여기서 완충액 이송공정시에 핵산 분석용 채널로부터 핵산 도입 채널이나 변성제함유 완충액 도입 채널에 완충액이 유출되지 않게 한다. 이를 위해서는 핵산 투입구, 핵산 배출구, 변성제함유 완충액 투입구, 변성제함유 완충액 배출구에, 예를 들면 직류 전압을 인가한다, 압력을 가하는 등으로 하는 것이 바람직하다. 변성제함유 완충액 도입 채널 내의 변성제함유 완충액의 구동방법과 조작은, 상기한 완충액의 구동방법 등과 동일하다.
완충액 이송공정에서 완충액영역은 핵산 분석용 채널(901) 내로 도입되고, 그 완충액영역이 채널(906)과의 교점을 통과하는 곳까지 도입된다. 그후 도 80에 나타내는 바와 같이 변성제함유 완충액 이송공정에 의하여 채널(6)로부터 변성제함유 완충액(제 2 완충액)을 보내면, 채널(906)로부터의 변성제함유 완충액영역이 채널(901)의 완충액영역을 바로 옆으로부터 가로지른다. 이와 같이 하여 완충액영역을 분단하는 하나의 변성제함유 완충액영역이 생긴다. 이어서 다시 완충액 이송공정에서는 채널(901) 내에 위치하는 변성제함유 완충액영역부분이, 채널(906)로부터 분리되어 배출구 방향으로 완충액영역과 함께 이동한다. 이와 같이 하여 완충액영역 내에 독립된 하나의 변성제함유 완충액영역(901c)이 생긴다.
상기한 바와 같이 완충액 이송공정과 변성제함유 완충액 이송공정을 교대로 반복함으로써 핵산 분석용 채널(901) 내에 변성제 간헐배치를 형성할 수 있다. 여기서 완충액 이송공정의 시간을 조절함으로써 변성제함유 완충액영역과 변성제함유 완충액영역과의 간격을 임의로 조정 가능하고, 예를 들면 도 69와 같이 변성제를 함유하는 완충액영역 사이의 간격이 하류로 갈 수록 짧아지는 변성제 간헐배치 채널을 형성할 수 있다.
또한 핵산분석용 채널의 길이, 변성제함유 완충액의 길이, 변성제함유 완충액의 농도, 그 간격 등은 분리의 대상이 되는 2개 사슬 핵산의 종류 등에 따라 다르기때문에 사전에 실시되는 예비실험 등에 의하여 결정하여 두면 좋다.
도 81은 변성제함유 완충액영역의 영동방향의 길이(폭)를 작게 할 수 있는 방법의 일례를 나타낸다. 변성제함유 완충액영역의 영동방향의 길이를 작게 함으로써 2개 사슬 핵산의 분리 정밀도를 향상시킬 수 있다. 도 80의 방법에 의하여 형성되는 변성제함유 완충액영역의 영동방향의 길이는, 변성제함유 완충액 유입구의 폭과 대략 같아진다. 따라서 그와 같은 변성제함유 완충액영역의 길이를 작게 하기 위해서는, 변성제함유 완충액 유입구를 좁게 하면 좋다. 그러나 변성제함유 완충액 유입구를 좁게 하면 유동 손실이 현저하게 커지기때문에, 변성제함유 완충액을 유동시키는 데 아주 큰 동력이 필요하게 되는 경우가 있다.
상기한 문제를 회피하기 위해서는, 도 81에서 나타내는 바와 같이 변성제함 유 완충액 도입부에서 변성제함유 완충액 도입 채널(909)에 인접하는 보조 완충액 채널(906')을 설치하면 좋다. 이와 같이 하여 보조 완충액 채널(906')의 투입구(906c, 906d)로부터의 보조 완충액의 유입량을 늘림으로써 변성제함유 완충액의 유입 폭을 가늘게 할 수 있고, 영동방향에서 변성제함유 완충액영역의 길이를 서서히 짧게 형성할 수 있으며, 동시에 유동 손실의 증가를 방지할 수도 있다. 보조 완충액의 투입구는, 도 81과 같이 변성제함유 완충액 도입 채널(6)을 사이에 두도록 복수의 보조 완충액 채널 및 투입구를 설치하여도 좋고, 그 어느 한쪽만을 설치한다 하여도 좋다.
유량 제어수단을 형태 B의 완충액영역의 배열을 형성하는 장치
형태 B의 장치에 있어서, 형태 1-1 및 1-2에 있어서 설명한 바와 같은 액체 도입용 마이크로 채널로부터의 완충액의 유량을 제어하는 수단(예를 들면, 인가 전압 또는 부여 전위를 조절함에 의한 전기침투류의 제어, 마이크로 실린지 등에 의한 송액의 압력을 조절함에 의한 송액 펌프의 제어, 또는 그것들에 의한 송액을 2차적으로 조절하기 위한 밸브의 제어)은, 상기한 변성제 간헐배치를 형성하는 수단으로서 이용할 수 있다.
형태 B의 장치에서는, 변성제를 다른 농도로 가지는 완충액끼리가 분자확산에의하여 혼합되기 어려운 조건에 있다는 전제(이미 설명한 바와 같이, 액체의 확산 계수가 극단적으로 작은 경우에는 혼합이 일어나지 않는 경우가 있다)에 있어서, 형태1-1 및 1-2에 나타내는 유량 제어수단을, 변성제 간헐배치를 형성하는 완충제의 교대공급에 이용할 수 있다.
도 83은 형태 1-2에서 설명한 고속작동 밸브를 설치한 형태를 나타낸다. 이 형태에서는 2개의 완충액 도입 채널(변성제를 함유하지 않은 완충액을 위한 도입 채널과 변성제를 함유하는 완충액을 위한 도입 채널)의 각각에 고속작동 밸브[밸브(1) 및 밸브(2)]를 설치하고 있다. 밸브(1) 및 밸브(2)의 개폐시간을 제어함으로써 도 83에 나타내는 바와 같이 핵산 분석용 채널(1) 내에 변성제 간헐배치를 형성할 수 있다.
혼합 촉진수단을 가지는 형태 A의 마이크로칩 전기영동장치
도 78 및 도 79에 나타내는 변성제 간헐배치를 형성하는 장치에 있어서, 혼합 촉진수단을 이용할 수 있다.
도 84는 사출수단(912)을 모식적으로 나타낸다. 화살표 a와 화살표 b는 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액의 입력 경로를 나타낸다. 사출수단(912)은, 변성제를 다른 농도로 함유하는 2개의 완충액, 예를 들면 변성제함유 완충액(화살표 a)과 변성제 불함유 완충액(화살표 b)을 임의의 비율로 혼합할 수 있는 혼합장치(도시 생략)를 내장하고 있다.
사출수단(912) 내의 혼합장치에는, 상기한 형태 1-1 내지 형태 2-3의 혼합 촉진수단을 가지는 액체 혼합장치를 사용할 수 있다. 적절한 혼합 촉진수단을 가지는 혼합장치에 의하면, 화살표 a 및 화살표 a에서 나타내는 2개의 완충액의 혼합이 신속하게 행하여지기 때문에, 원하는 농도로 변성제를 함유하는 완충액을 연속적으로 조제할 수 있다.
혼합장치에 의하여 혼합되어 조제된 변성제함유 완충액은, 사출수단(912)으 로부터 소망 농도의 액적(913)으로서 사출된다. 이 형태에 의하면 다른 농도의 변성제함유 완충액을 연속적으로 공급하는 것이 가능해진다. 따라서 다른 농도의 완충액을 공급하기 위한 카트리지를 교환할 필요도 없어진다. 또 카트리지방식의 사출수단을 사용할 필요도 없어진다. 또 복수의 사출수단을 설치할 필요도 없어진다. 이 타입의 사출수단을 가지는 형태에 의하면, 소품종 대량 생산에 적합한 변성제 간헐배치 형성층 및 방법 제공할 수 있다.
예를 들면 사출수단(912) 내의 혼합 촉진수단으로서 형태 2-2의 액체 혼합장치를 사용하는 경우, 완충액끼리의 혼합을 고속화할 수 있기 때문에, 혼합농도의 정보를 수취하고 나서 혼합을 완료하기까지의 시간을 짧게 할 수 있다. 또 사출수단에 형태 2-3의 액체 혼합장치를 사용하는 경우, 장치를 콤팩트하게 할 수 있다.
실시예 1
상기한 각 형태에 기재한 바와 같은 마이크로칩 전기영동장치를 사용하여 염기배열이 다른 2종류의 2개 사슬 핵산의 분리를 행하였다. 분석 대상물로서 2종류의 Sphingomonas 속에 속하는 미생물로부터 얻은 16S rRNA 유전자의 V3 영역 단편을 포함하는 핵산 시료를 조제하였다.
실험에서는 먼저 2종류의 미생물을 각각 액체 배지에서 배양 후, 원심분리에 의하여 회수하였다. 균체를 혼합하고, 이 혼합균체로부터 염화벤질법에 의하여 핵산을 추출하였다. 이 추출 핵산에 대하여, 16S rRNA 유전자의 V3영역을 표적으로 한 유니버셜 프라이머[포워드 ; 5'-CGCCCGCCGC GCGCGGCGGG CGGGGCGGGG GCACGGGGGG CCTACGGGAG GCAGCAG-3'(배열번호 1), 리버스(5')-ATTACCGCGG CTGCTGG-3'(배열번호 2)]를 사용하여 PCR을 행하여 생성한 PCR 산물을 최종적인 핵산 시료로 하였다. 유니버셜 프라이머는 5' 말단을 FITC 표식하고 있는 것을 사용하였다. 포워드 프라이머에는 GC 클램프영역이 부여되어 있다.
실험에서는 파이렉스(등록상표) 유리(7 cm × 3.5 cm)에 포토리소그래피기술에 의하여 폭 100 ㎛, 깊이 25 ㎛의 채널을 형성한 마이크로칩을 사용하였다. 이 마이크로칩을 도립(倒立)형 형광 현미경에 배치하여 광전자 증배관에서 검출하였다. 변성제에는 요소와 포름아미드를 사용하였다.
실험의 결과, 2종류의 미생물에 대응하는 2개의 피크가 검출되었다. 30분이라는 단시간으로 분석은 종료되어, 고속분석이 가능한 것이 확인되었다.
실시예 2
실시예 1의 장치를 사용하여 염기배열이 다른 2종류 이상의 2개 사슬 핵산을 분리하였다. 2종류 이상의 2개 사슬 핵산이 존재하는 시료에는, 에스트라디올을 단일 탄소원으로서 집적 배양한 활성 오니를 사용하였다. 실험방법은 실시예 1과 동일하다.
실험의 결과, 복수의 미생물에 대응하는 복수의 피크가 검출되어, 2종류 이상의 염기배열이 다른 2개 사슬 핵산의 분리도 가능한 것이 확인되었다.
비교예 1
실시예 1의 비교로서, 종래의 DGGE 장치를 사용하여 동일한 시료를 분석하였다. 실험은 Muyzer 등의 방법(App1. Environ. Microbiol., Mar 1993,695-700, Vol 59, No.3)을 기초로 하여 행하였다. DGGE 장치는, DCode Universal Mutation Detection System(BIORAD)을 사용하였다.
실험에서는 실시예 1과 마찬가지로 2종류의 미생물을 각각 액체 배지에서 배양 후, 원심분리에 의하여 회수한 균체를 혼합하고, 이 혼합 균체로부터 염화벤질법에 의하여 핵산을 추출하였다. 이 추출 핵산에 대하여 16S rRNA 유전자의 V3 영역을 표적으로 한 실시예 1에 기재한 유니버셜 프라이머를 사용하여 PCR을 행하여 생성한 PCR 산물을 최종적인 핵산 시료로 하였다. 여기서 사용한 유니버셜 프라이머는, 실시예 1과는 달리, 형광 표식하지 않고, 전기영동 후, Vistra Green으로 2개 사슬 핵산을 형광 염색함으로써 검출하였다. 포워드 프라이머에 GC 클램프영역이 존재하는 것은 실시예 1과 동일하다. 변성제 농도 구배 겔의 농도 구배는, 35% - 55%로 하였다.
핵산 시료의 영동의 결과, 2종류의 미생물에 대응하는 2개의 밴드가 검출되었으나, 전기영동시간은 210분이고, 변성제 농도 구배 겔의 제작시간이나 겔의 염색시간 등을 포함하면, 분석에는 6시간 정도 필요하였다.
비교예 2
실시예 2의 비교 대조로서, 종래의 DGGE 장치를 사용하여 동일한 시료를 분석하였다. 실험장치, 실험방법은 비교예 2와 동일하다.
실험의 결과, 복수의 미생물에 대응하는 복수의 피크가 검출되었으나, 비교예 1과 마찬가지로 전기영동 시간은 210분이고, 변성제 농도 구배 겔의 제작시간이나 겔의 염색시간 등을 포함하면 분석에는 6시간 정도 필요하였다. 또한 변성제 농도 구배 겔의 제작이나 겔의 염색 등 수작업이 번잡한 조작이 필요하였다.
상기한 실시예에 있어서, 형태 A 및 형태 B의 장치를 사용함으로써 마이크로칩상에서의 DGGE에 의하여 2개 사슬 핵산을 염기배열의 차이에 의하여 분리·분석할 수 있었다.
또 DGGE를 위한 마이크로칩 장치에, 형태 1-1 내지 형태 2-3까지 기재한 바와 같은 혼합 촉진방법 및 장치를 적용함으로써 신속하게 농도 구배를 형성할 수 있어, 보다 단시간으로 분리·분석을 할 수 있었다.

Claims (38)

  1. 액체를 도입하기 위한 적어도 2개의 액체 도입용 마이크로 채널 및 상기 적어도 2개의 액체 도입용 마이크로 채널이 접속되어 있는 혼합용 마이크로 채널을 포함하여 이루어지고, 각 액체 도입용 마이크로 채널로부터 도입된 각 액체가 상기 혼합용 마이크로 채널 내에서 합류하는 액체 혼합장치에 있어서,
    상기 혼합용 마이크로 채널 내에서 합류하는 액체 사이의 혼합을 촉진하기 위한 혼합 촉진수단을 가지는 것을 특징으로 하는 액체 혼합장치.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 혼합 촉진수단은, 혼합되는 액체 사이의 계면의 면적을 증가하는 수단 인 것을 특징으로 하는 액체 혼합장치.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 혼합 촉진수단은, 혼합되는 액체 사이의 계면을 불안정화하는 수단인 것을 특징으로 하는 액체 혼합장치.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 혼합 촉진수단은, 액체 도입용 마이크로 채널에 도입하는 액체의 유량을다른 액체 도입용 마이크로 채널과 독립하여 제어할 수 있는 적어도 하나의 액체 도입수단을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 액체 혼합장치.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 액체 도입수단은, 유량을 제어할 수 있는 펌프인 것을 특징으로 하는 액체 혼합장치.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 액체 도입수단은, 액체 도입용 마이크로 채널에 설치된 밸브인 것을 특징으로 하는 액체 혼합장치.
  7. 제 4항에 있어서,
    상기 액체 도입수단은, 액체 도입용 마이크로 채널의 각 도입부에 설치된 제 1 전극과, 상기 혼합용 마이크로 채널의 배출부에 설치된 제 2 전극으로 구성되고, 제 1과 제 2 전극 사이에 전압을 인가함으로써, 각 액체 도입용 마이크로 채널에 전기침투류를 생기게 하는 것을 특징으로 하는 액체 혼합장치.
  8. 제 2항에 있어서,
    상기 혼합 촉진수단은, 적어도 하나의 액체 도입용 마이크로 채널에 설치한 고속작동 밸브를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 액체 혼합장치.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 고속작동 밸브는, 피에조소자를 사용한 밸브체 구동수단인 것을 특징으로 하는 액체 혼합장치.
  10. 제 8항에 있어서,
    상기 고속작동 밸브는, 액체 도입용 채널의 국소적 가열에 의한 액체의 체적팽창을 이용하여 상기 혼합용 마이크로 채널에의 미소 유량의 액체의 토출을 고속으로 제어 가능한 수단인 것을 특징으로 하는 액체 혼합장치.
  11. 제 2항에 있어서,
    상기 혼합 촉진수단은, 혼합용 마이크로 채널의 채널 높이를 그 채널 폭보다작게 함으로써 형성된 혼합실을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 액체 혼합장치.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 혼합실은, 액체 도입용 마이크로 채널을 상하방향으로 적층하도록 접속함으로써 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 액체 혼합장치.
  13. 제 11항에 있어서,
    상기 혼합실의 상류에, 상기 복수의 액체 도입용 마이크로 채널이 합류함으 로써 형성되는 적어도 하나의 예혼합용 마이크로 채널을 더욱 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 액체 혼합장치.
  14. 제 2항에 있어서,
    상기 혼합 촉진수단은, 각 액체 도입용 마이크로 채널이 접속하는 복수의 분기 채널의 합류부로서, 상기 복수의 분기 채널끼리가 3차원 공간상에서 서로 다르게 배치되는 형태로 상기 혼합용 마이크로 채널에 접속되는 합류부를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 액체 혼합장치.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 분기 채널의 3차원적 배치는, 분기 채널을 가지는 복수의 기판을 분기 채널의 합류방향 또는 분기방향에서 겹쳐서 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 액체 혼합장치.
  16. 제 3항에 있어서,
    상기 혼합 촉진수단은, 액체 도입용 마이크로 채널 및/또는 혼합용 마이크로 채널에 설치된 히터를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 액체 혼합장치.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 히터는, 혼합용 마이크로 채널의 아래쪽에 설치되어 있는 것을 특징으 로 하는 액체 혼합장치.
  18. 제 3항에 있어서,
    상기 혼합 촉진수단은, 혼합용 마이크로 채널에서 합류하는 액체 사이의 계면을 흩어지게 하기 위한 기계적 변동수단을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 액체 혼합장치.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 기계적 변동수단은, 혼합용 마이크로 채널 내의 합류부 부근에 설치된 가동 양력면, 회전자 또는 요동자인 것을 특징으로 하는 액체 혼합장치.
  20. 제 18항에 있어서,
    상기 기계적 변동수단은, 혼합용 마이크로 채널의 벽면에 설치된 진동자인 것을 특징으로 하는 액체 혼합장치.
  21. 제 18항에 있어서,
    상기 기계적 변동수단은, 혼합용 마이크로 채널의 벽면 밖에 설치된 진동자인 것을 특징으로 하는 액체 혼합장치.
  22. 제 3항에 있어서,
    상기 혼합 촉진수단은, 혼합용 마이크로 채널 내의 합류부 부근에 다수 배열된 미소 구조물을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 액체 혼합장치.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 미소 구조물은, 상기 혼합용 마이크로 채널의 채널 폭보다 충분히 작은 돌기 또는 홈인 것을 특징으로 하는 액체 혼합장치.
  24. 분석 대상물을 분리하기 위한 마이크로칩 전기영동장치에 있어서,
    분석 대상물의 변성제의 농도 구배영역이 형성되는 마이크로 채널을 포함하여 이루어지고, 상기 농도 구배영역에 도입된 분석 대상물이 전기영동되는 것을 특징으로 하는 마이크로칩 전기영동장치.
  25. 제 24항에 있어서,
    상기 분석 대상물이 2개 사슬 핵산인 것을 특징으로 하는 마이크로칩 전기영동장치.
  26. 제 24항에 있어서,
    변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액을 도입하기 위한 적어도 2개의 액체 도입용 마이크로 채널 및 상기 적어도 2개의 액체 도입용 마이크로 채널이 접속되어 있는 혼합용 마이크로 채널을 포함하여 이루어지고, 각 액체 도입용 마이크로 채널로부터 변동하는 비율로 도입되는 각 완충액이 상기 혼합용 마이크로 채널 내에서 합류함으로써 상기 변성제의 농도 구배영역이 형성되는 것을 특징으로 하는 마이크로칩 전기영동장치.
  27. 제 26항에 있어서,
    상기 혼합용 마이크로 채널 내에서 합류하는 완충액 사이의 혼합을 촉진하기 위한 혼합 촉진수단을 가지는 것을 특징으로 하는 마이크로칩 전기영동장치.
  28. 제 26항에 있어서,
    제 1항 내지 제 23항의 어느 한 항에 기재된 액체 혼합장치를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 마이크로칩 전기영동장치.
  29. 분석 대상물을 분리하기 위한 방법에 있어서,
    적어도 2개의 액체 도입용 마이크로 채널로부터 혼합용 마이크로 채널 내에 분석 대상물의 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액을 변동하는 비율로 도입함으로써 상기 혼합용 마이크로 채널 내에 변성제의 농도 구배영역을 형성하고, 상기 농도 구배영역에 분석 대상물을 도입하여 전기영동하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 24항에 있어서,
    상기 농도 구배영역은, 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액영역을 영동방 향으로 교대로 배치함으로써 형성되는 것을 특징으로 하는 마이크로칩 전기영동장치.
  31. 제 30항에 있어서,
    상기 분석 대상물은, 2개 사슬 핵산인 것을 특징으로 하는 마이크로칩 전기영동장치.
  32. 제 30항에 있어서,
    상기 변성제를 함유하지 않은 또는 낮은 농도로 함유하는 완충액영역이, 각각의 길이가 영동방향의 하류측을 향하여 점차 작아지도록 배열되는 것을 특징으로 하는 마이크로칩 전기영동장치.
  33. 제 30항에 있어서,
    상기 변성제를 높은 농도로 함유하는 완충액영역이, 각각의 길이가 영동방향의 하류측을 향하여 점차로 커지도록 배열되는 것을 특징으로 하는 마이크로칩 전기영동장치.
  34. 분석 대상물을 분리하기 위한 방법에 있어서,
    마이크로 채널 내에 분석 대상물의 변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액영역을 영동방향으로 교대로 배치함으로써 변성제의 농도 구배영역을 형성하고, 상기 농도 구배영역에 분석 대상물을 도입하여 전기영동하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 분석 대상물을 분리하기 위한 방법에 있어서,
    변성제를 다른 농도로 함유하는 완충액영역을 영동방향으로 교대로 배치하고, 상기 완충액영역의 배열 내에 분석 대상물을 도입하여 전기영동하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 35항에 있어서,
    상기 분석 대상물은, 2개 사슬 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 35항에 있어서,
    상기 변성제를 함유하지 않은 또는 낮은 농도로 함유하는 완충액영역을, 각각의 길이가 영동방향의 하류측을 향하여 점차로 작아지도록 배열하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 35항에 있어서,
    상기 변성제를 높은 농도로 함유하는 완충액영역을, 각각의 길이가 영동방향의 하류측을 향하여 점차로 커지도록 배열하는 것을 특징으로 하는 방법.
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