DE10106008A1

DE10106008A1 - PCR-Mikroreaktor zum Vermehren von DNA unter Verwendung von Mikromengen eines Probenfluids

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Publication number: DE10106008A1
Application number: DE10106008A
Authority: DE
Inventors: Jacqueline Tso; Sally A Swedberg; Paul K Webber
Original assignee: Agilent Technologies Inc
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 2000-02-11
Filing date: 2001-02-09
Publication date: 2001-09-06
Also published as: US6613560B1

Abstract

Es wird ein Mikroreaktor (11) zum Ausführen der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bei der Vermehrung von DNA unter Verwendung von Mikromengen eines Probenfluids geschaffen. Der Mikroreaktor ist eine Vorrichtung, die aus einer Reaktionszone, die durch zwei oder mehrere Innenoberflächen definiert ist und angepaßt ist, um etwa 1 bis 500 mul eines Fluids zu enthalten, einer Einrichtung zum Einbringen von PCR-Reaktionskomponenten in die Reaktionszone, einer Einrichtung zum Entfernen des PCR-Reaktionsproduktes aus der Reaktionszone und einer Einrichtung zum Steuern der Temperatur der Reaktionszone besteht, wobei die Vorrichtung aus einem Material hergestellt ist, das unter den Bedingungen, bei denen eine PCR-Reaktion durchgeführt wird, thermisch, chemisch und mechanisch stabil ist. Ein optimales Material ist Polyimid. Der Mikroreaktor kann mehr als eine Reaktionszone enthalten und kann zusätzlich andere Typen von Mikrostrukturen und Mikromerkmalen enthalten, wie z. B. Mikrokanäle, die bei chemischen und biochemischen Trennungen verwendet werden können.

Description

Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet von miniaturisierten Vorrichtungen zum Durchführen chemischer und biochemischer Prozesse und insbesondere bezieht sich dieselbe auf einen neuartigen Mikroreaktor zum Durchführen einer DNS-Verstärkung bzw. Vermehrung unter Verwendung der Polymerase Kettenreaktion oder "PCR" (PCR = polymerase chain reaction).

Bei einem Probenanalysegerät ergeben kleinere Abmessungen im allgemeinen eine verbesserte Leistungsfähigkeits charakteristik und gleichzeitig reduzierte Herstellungs- und Analysekosten. Miniaturisierte Trennungssysteme liefern beispielsweise einen effektiveren Systementwurf, ergeben einen geringeren Aufwand und ermöglichen eine erhöhte Ana lysegeschwindigkeit, einen verringerten Proben- und Lö sungsmittelverbrauch und die Möglichkeit einer erhöhten Er fassungswirksamkeit.

Dementsprechend sind mehrere Lösungsansätze in Verbindung mit der Miniaturisierung von Vorrichtung für eine Verwen dung bei einer chemischen Analyse entwickelt worden, und zwar insbesondere bei der Mikrosäulenflüssigkeitschromato graphie (µLC; µLC = micro column liquid chromatography), bei der Säulen mit Durchmessern von 100 bis 200 µm verwen det werden, bei der Kapillarelektrophorese (CE; CE = capil lary electrophoresis), bei der eine elektrophoretische Trennung in Kapillaren mit einem Durchmesser in der Größen ordnung von 25 bis 100 µm durchgeführt wird, und bei der Mikrokanalelektrophorese (MCE; MCE = microchannel elec trophoresis), bei der eine Elektrophorese in einem Mikroka nal auf einem im wesentlichen planaren Substrat ausgeführt wird. Der herkömmliche Lösungsansatz bei der Miniaturisie rungstechnologle, wie sie bei der CE und bei der µLC ange wendet wird, umfaßt die Verwendung eines Silizium enthal tenden Materials, d. h. eine Kapillare, die aus Quarzgut. (fused silica), Quarz oder Glas hergestellt ist. Bei der MCE, einem attraktiven Verfahren, das im Zusammenhang mit Anwendungen mit einem hohen Durchsatz nützlich ist, und das eine Reduzierung der Gesamtsystemgröße relativ zu der CE ermöglicht, sind miniaturisierte Vorrichtung durch Silizi ummikrobearbeitung oder Lithographietechniken, z. B. der Mikrolithographie, dem Formen und dem Ätzen, hergestellt worden. Siehe hierzu beispielsweise Fan et al. (1994) Anal. Chem. 66(1): 177-184; Manz et al., (1993) Adv. in Chrom. 33: 1-66; Harrison et al. (1993), Sens. Actuators, B B.0(2): 107-116; Manz et al. (1991), Trends Anal. Chem. 10(5): 144-149; und Manz et al. (1990) Sensors and Actuators B (Chemical) B1(1-6): 249-255. Die Verwendung von Mikrobear beitungstechniken, um miniaturisierte Trennungssysteme in Silizium herzustellen, liefert den praktischen Vorteil, daß eine Massenherstellung solcher Systeme ermöglicht wird, und es gibt mehrere Techniken, die durch die Mikroelektronikin dustrie zum Herstellen von Mikrostrukturen aus Siliziumsub straten nun entwickelt worden sind. Beispiele solcher Mi krobearbeitungstechniken, um miniaturisierte Trennungsvor richtung auf Silizium- oder Borosilikatglas-Chips herzu stellen, können den U.S.-Patenten US 5,194,133, erteilt an Clark, US 5,132,012, erteilt an Miura et al., 4,908,112, erteilt an Pace, und 4,891,120, erteilt an Sethi et al., entnommen werden.

Die Verwendung von Silizium enthaltenden Substraten, wie z. B. Quarzgut-, Quarz- und Glas, bei Mikroanalysevorrichtung ist in vielerlei Hinsicht problematisch. Silizium dioxidsubstrate weisen beispielsweise hochenergetische Oberflächen auf und absorbieren stark viele Verbindungen, und zwar insbesondere Basen. Siliziumdioxidmaterialien ge hen zudem zu einem erheblichen Ausmaß in Lösung, wenn die selben mit basischen Lösungen verwendet werden. Darüber hinaus wird, wenn dieselben bei Elektrophoreseanwendungen verwendet werden, die Innenoberfläche einer Silikakapillare oder eines Silikamikrokanals bei einem basischen pH-Wert als ein Ergebnis der Deprotonierung der Oberflächensilanol gruppen (d. h. dieselben liegen in der Form von anionischen Si-O^-Gruppen vor) negativ aufgeladen. Die Oberflächenladung an dem Inneren der Kapillare oder des Mikrokanals ver schlimmert nicht nur das Problem der ungewollten Adsorption eines gelösten Stoffes, sondern moduliert ferner die Ge schwindigkeit des Elektrosomoseflusses (ebenfalls als "Elektroendoosmosefluß" oder EOF bezeichnet) an einer nichtmodifizierten Oberfläche, was wiederum die Empfind lichkeit und die Reproduzierbarkeit der durchgeführten che mischen Analyse beeinträchtigt. (Das heißt, daß die EOF- Geschwindigkeit eine Funktion des Zeta-Potentials ζ ist, das im wesentlichen durch die Oberflächenladung bestimmt wird.) Die Mikroherstellung unter Verwendung von Silizium an sich ist auf ähnliche Weise problematisch, insofern, als daß sich sogar unter milden Oxidationsbedingungen eine Si likaoberfläche auf einem Siliziumsubstrat bilden wird.

Aus den im vorhergehenden beschriebenen Gründen wäre es wünschenswert, Mikroanalyse- und andere miniaturisierte Vorrichtungen aus Materialien herzustellen, die nicht Sili zium-basiert sind, wie z. B. unter Verwendung unaufwendiger und ohne weiteres verfügbarer Polymermaterialien. Es würde ferner wünschenswert sein, die Verwendbarkeit von Mikrovor richtungen über die elektrophoretischen und chromatographi schen Trennungstechniken hinaus auf andere Typen von chemi schen Prozessen zu erweitern, nämlich auf Prozesse, die ho he Temperaturen, pH-Extremwerte, scharfe Reagenzien oder dergleichen einbeziehen können. Die vorliegende Erfindung liefert solche Mikroanalysevorrichtungen.

Das Gebiet, auf das sich die vorliegende Erfindung bezieht, ist der Bioanalyse zugeordnet. Eine wichtige Technik, die gegenwärtig bei der Bioanalyse und bei dem aufstrebenden Gebiet der Genomenforschung verwendet wird, ist die Polyme rase-Kettenreaktion (PCR; PCR = polymerase chain reaction) -Verstärkung bzw. Vermehrung der DNA bzw. DNS. Als ein Er gebnis dieses leistungsfähigen Werkzeuges ist es möglich, von ansonsten nicht erfaßbaren Mengen von DNA auszugehen und verstärkte bzw. vermehrte Mengen des Materials für eine anschließende Analyse zu erzeugen. Die Technik wird in dem U.S.-Patent Nr. 4,683,195, erteilt an Mullis et al., und in verwandten U.S.-Patenten Nr. 4,683,202, 4,800,159 und 4,965,188, erteilt an Mullis et al., beschrieben. Automati sierte Systeme zum Durchführen einer PCR sind bekannt, wie sie beispielsweise in den U.S.-Patenten Nr. 5,333,675 und 5,656,493, erteilt an Mullis et al., beschrieben sind. Die PCR verwendet eine sich wiederholende Folge von Schritten, um Kopien von Polynucleotidsequenzen zu erzeugen, die zwi schen zwei Initiator- ("Primer"- bzw. "Starter"-) Sequenzen positioniert sind. Ausgehend von einer Schablone (Templa te), zwei Primersequenzen (mit einer Länge von üblicherwei se etwa 15-30 Nucleotiden), einem PCR-Puffer, freien Deoxy nucleosid-Tri-Phosphaten (dNTPs) und einer thermostabilen DNA-Polymerase (üblicherweise Taq-Polymerase) werden diese Komponenten gemischt und daraufhin erhitzt, um die doppel strängige DNA zu trennen. Ein darauffolgender Abkühlungs schritt ermöglicht, daß die Primere zu komplementären Se quenzen an den einsträngigen DNA-Molekülen anlagern, die die Sequenz, die vermehrt werden soll, enthalten. Eine Nachbildung bzw. Replikation der Zielsequenz wird dann durch die DNA-Polymerase erzielt werden, die einen Strang der DNA erzeugt, die zu der Schablone komplementär ist. Ei ne Wiederholung dieses Prozesses verdoppelt die Anzahl von Kopien der interessierende Sequenz, wobei mehrere Zyklen die Anzahl von Kopien exponentiell erhöhen.

Da die PCR ein wiederholtes Hin-Und-Her-Steuern zwischen höheren und niedrigeren Temperaturen erfordert, müssen PCR- Vorrichtungen aus Materialien hergestellt sein, die in der Lage sind, solchen Temperaturänderungen stand zu halten. Die Materialien müssen mechanisch und chemisch bei hohen Temperaturen stabil sein, und in der Lage sein, wiederhol ten Temperaturänderungen ohne eine mechanische Verschlech terung standzuhalten. Darüber hinaus müssen die Materialien mit der PCR-Reaktion selbst verträglich sein, und dürfen nicht die Polymerase verhindern oder DNA binden.

Bis heute verbleiben jedoch viele Probleme bei der Durch führung einer PCR in Mikrovorrichtungen. Ein Problem umfaßt die geringe thermische Stabilität vieler Materialien. Dies bedeutet, daß viele Materialtypen, wie z. B. Polymermate rialien, den hin-und-her-gesteuerten Temperaturen, die bei der PCR verwendet werden und sich typischerweise in dem Be reich von etwa 37°C bis 90°C befinden, ohne einen erhebli chen oder vollständigen Verlust der mechanischen Integrität nicht standhalten können. Zusätzlich können auf einer Sub stratoberfläche Verunreinigungen vorhanden sein oder aus derselben auslaugen, was das präzise Gleichgewicht der ge eigneten Inhaltsstoffe (Metallionen, Salze, Puffersysteme, Oligonucleotide, Primere und Polymerasen) beeinträchtigt, das für die PCR erforderlich ist, was wiederum nicht er folgreiche Verstärkungs- bzw. Vermehrungsreaktionen ergibt. Ferner kann das Polymeraseenzym oder jede der Komponenten, die in die PCR-Reaktion involviert ist, an eine Mikrokanal oberfläche gebunden oder dort adsorbiert werden. Ein Kon takt zwischen der Polymerase und einer Substratoberfläche wird allgemein eine irreversible Denaturierung ergeben. Diese Typen von "Biobewuchs" sind wegen des sehr hohen Oberflächenbereichs-zu-Volumen-Verhältnisses insbesondere bei Kapillaren oder Mikrokanälen mit Mikrometer- oder Sub mikrometer-Abmessungen problematisch.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen Mikroreaktor, eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Durch führen der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und ein Verfah ren zum Vermehren der Menge eines interessierenden DNA- Moleküls zu schaffen, die eine unaufwendigere Einsetzbar keit aufweisen.

Diese Aufgabe wird durch einen Mikroreaktor gemäß Anspruch 15, eine Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und ein Verfahren ge mäß Anspruch 34, 48 oder 59 gelöst.

Die vorliegende Erfindung erfüllt den im vorhergehenden er wähnten Bedarf in der Technik und liefert einen PCR- Mikroreaktor zum Vermehren einer DNA unter Verwendung von Mikromengen eines Proben-Fluids. Bei seiner einfachsten Ausführung umfaßt der PCR-Mikroreaktor eine Reaktionskam mer, die durch zwei oder mehr Innenoberflächen definiert ist, eine Einrichtung zum Einbringen von PCR-Reak tionskomponenten in die Kammer, eine Einrichtung zum Ent fernen des PCR-Reaktionsproduktes aus der Kammer und eine Einrichtung zum Steuern der Temperatur der Reaktionskammer, wobei die Vorrichtung aus einem Material hergestellt ist, das unter den Bedingungen, bei denen eine PCR-Reaktion durchgeführt wird, thermisch, chemisch und mechanisch sta bil ist, und dieselbe eine Reaktionskammer verwendet, die angepaßt ist, um Fluid in dem Bereich von etwa 1 µl bis 500 µl zu enthalten. Bevorzugte Materialien sind diejenigen, die eine reduzierte Adsorption eines gelösten Stoffes, wie z. B. Biomolekülen, wie z. B. Proteinen, Nucleinsäuren, usw., zeigen und modifiziert, bedeckt bzw. beschichtet oder auf andere Weise behandelt werden können, um den Elektroos mosefluß zu optimieren.

Bei einem zweiten Ausführungsbeispiel der Erfindung umfaßt der PCR-Mikroreaktor folgende Merkmale:
ein Substrat mit einer ersten und einer zweiten im wesent lichen planaren Oberfläche, die sich gegenüber liegen, wo bei in der ersten planaren Oberfläche ein Hohlraum und zu mindest ein Mikrokanal gebildet sind, und wobei der Hohl raum als eine Reaktionszone dient, die sich in Fluidkommu nikation mit jedem Mikrokanal befindet;
eine Abdeckplatte, die über der ersten planaren Oberfläche angeordnet ist, und die in Kombination mit dem Hohlraum ei ne Reaktionskammer und mit jedem Mikrokanal eine Mikrosäule definiert; und
zumindest ein Einlaßtor und zumindest ein Auslaßtor, die mit der Reaktionskammer direkt oder indirekt kommunikativ verbunden sind und den Durchtritt von Fluid von einer ex ternen Quelle in und durch die Reaktionskammer ermöglichen,
wobei das Substrat und die Abdeckplatte aus einem Material bestehen, das thermisch und chemisch stabil und gegen Bio bewuchs resistent ist.

Ein zusätzliches Ausführungsbeispiel der vorliegenden Er findung liefert ein Verfahren zum Durchführen der Polymera se-Kettenreaktion (PCR), um eine DNA in einer Probe zu ver mehren bzw. zu verstärken, das das Erhitzen der Probe, um die doppelsträngige DNA in eine einzelsträngige DNA zu trennen, das Abkühlen der Probe, um eine Hybridisierung von Primeroligonucleotiden zu der einzelsträngigen DNA zu er möglichen, das Replizieren der DNA unter Verwendung einer DNA-Polymerase und das Wiederholen der im vorhergehenden erwähnten Schritte, um den gewünschten Grad an Vermehrung zu erzielen, aufweist, wobei die PCR in einem Mikroreaktor durchgeführt wird, der aus einem Material besteht, das unter den Bedingungen, bei denen die PCR-Reaktion durchgeführt wird, thermisch, che misch und mechanisch stabil ist und eine Reaktionskammer verwendet, die angepaßt ist, um etwa 1 µl bis 500 µl Fluid zu enthalten.

Bei einem weiteren Ausführungsbeispiel wird ein Verfahren zum Vermehren der Menge eines interessierenden DNA- Moleküls, das in einem kleinen Volumen eines Probenfluids enthalten ist, unter Verwendung der Polymerase-Ketten reaktion geliefert, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:

a) Einbringen von bis zu etwa 10 µl eines Probenfluids in einen Mikroreaktor, wobei das Probenfluid das interes sierende DNA-Molekül in doppelsträngiger Form, ein er stes und ein zweites Primermolekül, die zu entgegen gesetzten Strängen des DNA-Moleküls komplementär sind, eine thermostabile DNA-Polymerase, freie Desoxynucleo sidtriphosphate und einen PCR-Puffer enthält, und wo bei der Mikroreaktor folgende Merkmale aufweist:
ein Substrat mit einer ersten und einer zweiten im we sentlichen planaren Oberfläche, die sich gegenüber liegen, wobei in der ersten planaren Oberfläche des Substrates ein Hohlraum gebildet ist, und wobei der Hohlraum als eine Reaktorzone dient,
eine Abdeckplatte, die über der ersten planaren Ober fläche angeordnet ist, wobei die Abdeckplatte in Kom bination mit dem Hohlraum eine Reaktionskammer defi niert, und
zumindest ein Einlaßtor und zumindest ein Auslaßtor, die sich mit der Reaktionskammer in Fluidkommunikation befinden, wobei die Tore den Durchtritt des Probenflu ids von einer externen Quelle in und durch die Reakti onskammer ermöglichen, wodurch ein Fluidflußweg defi niert wird,
wobei das Substrat und die Abdeckplatte aus einem Ma terial bestehen, das thermisch stabil und gegen Biobe wuchs resistent ist;
b) Anlegen einer Antriebskraft an die Vorrichtung, um das Probenfluid entlang des Flußweges in die Reaktionskam mer zu bewegen;
c) Aufheizen des Probenfluids in der Reaktionskammer, um die doppelsträngige DNA in eine einzelsträngige DNA zu trennen;
d) Abkühlen der Probe, um eine Hybridisierung der Primer moleküle zu entgegengesetzten Strängen der einzel strängigen DNA und eine Replikation der einzelsträngi gen DNA durch die DNA-Polymerase zu ermöglichen; und
e) Wiederholen der Schritte (c) und (d), um den gewünsch ten Grad an Vermehrung zu erzielen.

Bei einem wiederum weiteren Ausführungsbeispiel der Erfin dung wird ein Verfahren zum Vermehren der Menge eines in teressierenden DNA-Moleküls, das in einem kleinen Volumen eines Probenfluids enthalten ist, unter Verwendung der Po lymerase-Kettenreaktion geliefert, wobei das Verfahren fol gende Schritte aufweist:

a) Einbringen von bis zu etwa 10 µl eines Probenfluids in den Mikroreaktor des zweiten Ausführungsbeispiels der Erfindung, wobei das Probenfluid das interessierende DNA-Molekül in doppelsträngiger Form, ein erstes und ein zweites Primermolekül, die zu entgegengesetzten Strängen des DNA-Moleküls komplementär sind, eine thermostabile DNA-Polymerase, freie Deoxynucleosid triphosphate und einen PCR-Puffer enthält,
b) Anlegen einer Antriebskraft an die Vorrichtung, um das Probenfluid entlang des Flußweges in die Reakti onskammer zu bewegen;
c) Aufheizen des Probenfluids in der Reaktionskammer, um die doppelsträngige DNA in eine einzelsträngige DNA zu trennen;
d) Abkühlen der Probe, um eine Hybridisierung der Primer moleküle zu entgegengesetzten Strängen der einzel strängigen DNA und eine Replikation der einzelsträngi gen DNA durch die DNA-Polymerase zu ermöglichen; und
e) Wiederholen der Schritte (c) und (d), um den gewünsch ten Grad an Vermehrung zu erzielen.

Bevorzugte Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend bezugnehmend auf die beiliegenden Zeich nungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine perspektivische schematische Ansicht eines Ausführungsbeispiels eines Mikroreaktors der Erfindung;

Fig. 2 eine perspektivische schematische Ansicht eines zweiten Ausführungsbeispiels eines Mikroreaktors der Erfindung;

Fig. 3 eine perspektivische schematische Ansicht eines weiteren Ausführungsbeispiels eines Mikroreaktors der Erfindung;

Fig. 4 eine perspektivische schematische Ansicht einer Mikroreaktorvorrichtung der Erfindung, die sowohl einen Trennungsmikrokanal als auch ein auf der Vorrichtung befindliches bzw. Auf-Vorrichtung- (on-device) Reservoir aufweist;

Fig. 5 eine Draufsicht eines Mikroreaktors mit einer "Auf-Vorrichtung"-Reaktionskammer, die durch die Ausrichtung einer Reservoireinrichtung gebildet wird, die auf zwei gegenüberliegenden planaren Oberflächen eines einzelnen flexiblen Substrats gebildet ist;

Fig. 6 eine Draufsicht einer Außenoberfläche eines Mi kroreaktors, bei dem eine optionale bzw. wahlwei se Betätigungseinrichtung über einer "Auf- Vorrichtung"-Reaktionskammer angeordnet ist;

Fig. 7 eine bildliche Darstellung des Mikroreaktors von Fig. 6;

Fig. 8 eine Querschnittansicht des Betätigers, der in Fig. 6 gezeigt ist, entlang den Linien V-V und eine optionale Membran, die zwischen der Reakti onskammer und der Betätigungseinrichtung angeord net ist;

Fig. 9 eine Photographie eines 2%-NuSieve-Agarosegels, das unter Verwendung von SyberGreenI® und UV- Licht sichtbar wurde, wobei diese Photographie die Vermehrung eines Teilfragments eines 308-bp- Vermehrungsproduktes veranschaulicht, wie es bei Beispielen 1-8 beschrieben wird.

Bevor die Erfindung detailliert beschrieben wird, wird dar auf hingewiesen, daß, so lange nichts anderes angezeigt wird, diese Erfindung nicht auf spezielle Materialien, Kom ponenten oder Herstellungsprozesse beschränkt ist, die als solche variieren können. Es wird darauf hingewiesen, daß die Terminologie, die hierin verwendet wird, lediglich zu Zwecken der Beschreibung spezieller Ausführungsbeispiele besteht, und daß dieselbe nicht begrenzend wirken soll. Es muß darauf hingewiesen werden, daß die Singularformen "ei ner", "eine", "ein", "der", "die" und "das" wie sie in der Beschreibung und in den beiliegenden Ansprüchen verwendet werden, auch Pluralbezüge umfassen, so lange der Zusammen hang nicht deutlich etwas anderes anzeigt. Folglich umfaßt die Bezugnahme auf "ein Material" beispielsweise Mischungen aus Materialien, eine Bezugnahme auf "eine Reaktionskammer" mehrere Reaktionskammern und dergleichen.

In dieser Beschreibung und in den Ansprüchen, die folgen, wird auf eine Anzahl von Ausdrücken Bezug genommen, die de finiert sein sollen, um die folgenden Bedeutungen zu haben:

Der Ausdruck "Mikroreaktor" bezieht sich auf eine Vorrich tung mit Merkmalen mit Mikrometer- oder Submikrometerabmes sungen, die bei einer Vielzahl von chemischen Prozessen verwendet werden kann, die sehr kleine Mengen von Fluid um fassen (d. h. "Mikromengen" von Fluid in dem Bereich von etwa 1 µl bis 500 µl und vorzugsweise in dem Bereich von etwa 10 µl bis 200 µl). Der Prozeß von hauptsächlichem In teresse ist die Vermehrung von DNA unter Verwendung der Po lymerase-Kettenreaktion. Wahlweise kann die DNA-Vermehrung bzw. Verstärkung (DNA amplification) zusammen mit einer oder mehreren anderen Typen von Prozeduren durchgeführt werden. Solche Prozeduren umfassen ohne auf dieselben be schränkt zu sein: Präparationstechniken, die vor der PCR durchgeführt werden; eine Analyse und eine Trennung unter Verwendung von beispielsweise der Elektrophorese (z. B. CE oder MCE) oder der Chromatographie (z. B. µLC); und Post- bzw. Nach-Reaktionsreinigungsprozesse. Die Merkmale der Mi kroreaktoren sind an spezielle Verwendungen angepaßt. Mi kroreaktoren beispielsweise, die nicht nur bei der PCR- Vermehrung von DNA sondern ferner bei Trennungsprozessen, wie z. B. der MCE, verwendet werden, enthalten Mikrokanäle (die hierin bei der Offenbarung als "Mikrosäulen" bezeich net werden, d. h. wenn sich die Abdeckplatte an Ort und Stelle auf der Mikrokanalenthaltenden Substratoberfläche befindet) mit einem Durchmesser von der Größenordnung von 1 µm bis 200 µm und typischerweise von 10 µm bis 75 µm und mit einer Länge von etwa 0,1 bis 50 cm. Mikroreaktoren, die lediglich bei einer DNA-Vermehrung verwendet werden, werden Reaktionszonen (die hierin bei der Offenbarung als "Reakti onskammern" bezeichnet werden, d. h. wiederum dann, wenn sich die Abdeckplatte an Ort und Stelle auf der Mikrokanal enthaltenden Substratoberfläche befindet) mit einem Volumen von etwa 1 µl bis etwa 500 µl und typischerweise von etwa 10 µl bis 200 µl enthalten.

Der Ausdruck "Erfassungseinrichtung", wie er hierin verwen det wird, bezieht sich auf jegliche Einrichtung, Struktur oder Konfiguration, die es ermöglicht, eine Probe in einer Mikroanalysevorrichtung der Erfindung unter Verwendung ana lytischer Erfassungstechniken, die in der Technik wohlbe kannt sind, zu untersuchen bzw. abzufragen. Folglich kann eine Erfassungseinrichtung eine oder mehrere Öffnungen um fassen, die mit beispielsweise einer Reaktionskammer oder einem Mikrokanal kommunikativ verbunden sind, und die es einer externen Erfassungsvorrichtung ermöglichen, mit der Kammer oder dem Mikrokanal schnittstellenmäßig verbunden zu sein, um einen Analysestoff in derselben bzw. in demselben zu erfassen. Durch die Anordnung zweier Erfassungseinrichtungen, die sich einander relativ zu der Reaktionskammer oder dergleichen gegenüberliegen, wird ein "Erfassungsweg" gebildet, der die Erfassung von Analysestoffen, die durch die Reaktionskammer fließen, unter Verwendung von Erfassungstechniken ermöglicht, die in der Technik wohlbekannt sind. Ein "optischer Erfassungsweg" bezieht sich auf eine Konfiguration oder Anordnung einer Erfassungseinrichtung, um einen Weg zu bilden, wodurch eine elektromagnetische Strahlung in der Lage ist, von einer externen Quelle zu einer Einrichtung zum Empfangen von Strahlung zu gelangen, wobei die Strahlung die Reaktionskammer, den Mikrokanal oder dergleichen durchquert. Bei dieser Konfiguration können Analysestoffe, die durch den Mikroreaktor fließen, über die Transmission der Strahlung senkrecht zu der Fluidflußrichtung erfaßt werden. Eine Vielzahl von Techniken für eine externe optische Erfassung können ohne weiteres mit den vorliegenden Mikroreaktoren schnittstellenmäßig verbunden werden, einschließlich, aber nicht auf diese begrenzt, der UV/Vis- (Vis = visuell = sichtbar), Nah-IR-, Fluoreszenz-, Brechungsindex- (RI; RI = refractive index) und Raman- Technik.

Eine "transparente Substanz", wie sie hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Substanz, die in der Lage ist, Licht unterschiedlicher Wellenlängen durchzulassen. Folg lich ist eine "transparente Lage" als eine Lage einer Sub stanz definiert, die für spezifische Typen einer interes sierenden Strahlung oder interessierenden Teilchen durch lässig ist. Die transparenten Lagen, die in dem Zusammen hang mit der Erfindung verwendet werden können, werden aus Materialien, wie z. B. Quarz, Saphir, Diamant und Quarzgut, oder aus Polymermaterialien, wie z. B. Polystyren und Sty renbutadiencopolymer, gebildet. "Optisch transparent" be zieht sich auf ein Material, das in der Lage ist, Licht mit Wellenlängen in dem Bereich von etwa 150 nm bis 800 nm durchzulassen.

Ein "Erfassungsschnittpunkt" bezieht sich auf eine Konfigu ration, bei der eine Mehrzahl von Erfassungseinrichtungen, die mit dem Inneren der vorliegenden Mikroreaktoren kommu nikativ verbunden sind, an einer speziellen Position in denselben zusammen angeordnet sind. Eine Anzahl von Erfas sungstechniken können an einer Probe oder an einem getrenn ten Analysestoff an dem Erfassungsschnittpunkt gleichzeitig durchgeführt werden. Ein Erfassungsschnittpunkt wird gebil det, wenn sich eine Mehrzahl von Erfassungswegen kreuzt, oder wenn eine Erfassungseinrichtung, wie z. B. eine Aper tur bzw. Öffnung, mit dem Trennungsabteil an im wesentli chen dem selben Punkt wie ein Erfassungsweg kommunikativ verbunden ist. Die Probe oder ein getrennter Analysestoff können auf diese Weise unter Verwendung einer Kombination aus UV/Vis- und Fluoreszenz-Techniken, optischen und elek trochemischen Techniken, optischen und elektrischen Techni ken und derartigen Kombinationen analysiert werden, um hochempfindliche Erfassungsinformationen zu liefern. Siehe beispielsweise Beckers et al. (1988) J. Chromatogr. 452: 591-600 und U.S.-Patent Nr. 4,927,265, erteilt an Brownlee.

Der Ausdruck "Flüssigphasenanalyse" wird verwendet, um sich auf jegliche Analyse zu beziehen, die an einem gelösten Stoff in der flüssigen Phase ausgeführt wird. Dementspre chend umfaßt die "Flüssigphasenanalyse", wie sie hierin verwendet wird, chromatographische Trennungen, elektropho retische Trennungen und elektrochromatographische Trennun gen. Der allgemeine Ausdruck "Analyse" bezieht sich auf ei ne Charakterisierung einer Probe oder eine Identifikation einer oder mehrerer Komponenten in derselben und unter scheidet sich von einem chemischen oder biochemischen "Pro zeß", bei dem ein Material chemisch oder biochemisch verän dert wird, um ein gewünschtes Produkt zu erzeugen. Die DNA- Vermehrung unter Verwendung der PCR-Technik stellt hierin einen "Prozeß" dar, obwohl die PCR-Reaktion auch in Verbin dung mit einem analytischen Prozeß durchgeführt werden kann (bei dem beispielsweise die Reaktion überwacht wird, oder wenn das Reaktionsprodukt analysiert wird, bevor dasselbe aus der Vorrichtung entfernt wird).

"Chromatographische" Prozesse umfassen allgemein Vorzugs trennungen von Komponenten, und umfassen Verfahren mit Um kehrphase, eine hydrophobische Wechselwirkung, einen Ionen austausch, die Molekularsiebchromatographie und derglei chen.

"Elektrophoretische" Trennungen beziehen sich auf die Wan derung von Teilchen oder Makromolekülen mit einer elektri schen Nettoladung, wobei die Wanderung durch ein elektri sches Feld beeinflußt wird. Dementsprechend umfassen elek trophoretische Trennungen Trennungen, die in Säulen durch geführt werden, die mit Gelen (wie z. B. Polyacrylamid, Agarose und Kombinationen derselben) gepackt sind, sowie Trennungen, die in Lösung durchgeführt werden.

"Elektrochromatographische" Trennungen beziehen sich auf Trennungen, die unter Verwendung einer Kombination aus elektrophoretischen und chromatographischen Techniken be wirkt werden. Exemplarische elektrochromatographische Tren nungen umfassen Gepackte-Säule-Trennungen unter Verwendung einer elektromotorischen Kraft (Knox et al. (1987) Chroma tographia 24: 135; Knox et al. (1989) J. Liq. Chromatogr 12: 2435; Knox et al. (1991) Chromatographia 32: 317), und mizellare elektrophoretische Trennungen (Terabe et al. (1985) Anal. Chem. 57: 834-841).

Der Ausdruck "Spritzgießen" wird verwendet, um sich auf ei nen Prozeß zum Formen von Kunststoff- oder Nicht- Kunststoff-Keramik-Formen durch Einbringen einer abgemesse nen Länge eines geschmolzenen Kunststoff- oder Keramiksub strates in Formen (oder Gußformen) zu beziehen. Bei einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung können mi niaturisierte Vorrichtungen unter Verwendung des Spritzgie ßens hergestellt werden.

Der Ausdruck "Prägen" wird verwendet, um sich auf einen Prozeß zum Bilden von Polymer-, Metall- oder Keramik-Formen zu beziehen, indem eine Prägeform in Kontakt mit einem be reits existierenden Werkstück aus Polymer, Metall oder Ke ramik gebracht wird. Eine gesteuerte Kraft wird zwischen der Prägeform und dem bereits existierenden Materialwerk stück derart angelegt, daß die Struktur und Form, die durch die Prägeform bestimmt wird, in das bereits existierende Werkstück aus Polymer, Metall oder Keramik gedrückt wird. Der Ausdruck "Heißprägen" wird verwendet, um sich auf einen Prozeß zum Bilden von Polymer-, Metall- oder Keramikformen zu beziehen, indem eine Prägeform in Kontakt mit einem er hitzten bereits existierenden Werkstück aus Polymer, Metall oder Keramik gebracht wird. Das bereits existierende Mate rialwerkstück wird derart erhitzt, daß dasselbe mit der Prägeform konform ist, wenn eine gesteuerte Kraft zwischen der Prägeform und dem bereits existierenden Werkstück ange legt wird. Die sich ergebende Polymer-, Metall- oder Kera mikform wird abgekühlt und daraufhin von der Prägeform ent fernt.

Der Ausdruck "LIGA-Prozeß" wird verwendet, um sich auf ei nen Prozeß zum Herstellen von Mikrostrukturen mit großen Längenverhältnissen und einer erhöhten strukturellen--Präzi sion unter Verwendung der Synchrotronstrahlungslitho graphie, der Galvanobildung und dem Kunststofformen zu be ziehen. Bei einem LIGA-Prozeß werden strahlungsempfindliche Kunststoffe lithographisch mit einer hochenergetischen Strahlung unter Verwendung einer Synchrotronquelle be strahlt, um gewünschte Mikrostrukturen (wie z. B. Kanäle, Tore, Öffnungen bzw. Aperturen und Mikroausrichtungsein richtungen) zu erzeugen, wodurch eine Primerschablone ge bildet wird.

Der Ausdruck "Antriebskraft" bzw. "motorische Kraft" wird verwendet, um sich auf jegliche Einrichtung zum Bewirken einer Bewegung einer Probe entlang eines Flußweges in einem Mikroreaktor zu beziehen und umfaßt das Anlegen eines elek trischen Potentials über jeglichen Abschnitt eines Mikrore aktors, das Anlegen einer Druckdifferenz über jeglichen Ab schnitt des Mikroreaktors oder eine Kombination derselben.

Die Ausdrücke "optionaler", "optionale", "optionales" oder "optional", wie sie hierin verwendet werden, bedeuten, daß das anschließend beschriebene Merkmal oder die anschließend beschriebene Struktur vorhanden sein kann oder auch nicht, oder daß das anschließend beschriebene Ereignis oder der anschließend beschriebene Umstand auftreten kann oder nicht, und daß die Beschreibung Beispielsfälle umfaßt, bei denen ein spezielles Merkmal oder eine spezielle Struktur vorhanden ist, und Fälle umfaßt, bei denen das Merkmal oder die Struktur nicht vorhanden ist, oder Fälle, bei denen das Ereignis oder der Umstand auftritt, und Fälle, bei denen dies nicht der Fall ist.

Ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist in Fig. 1 dargestellt, die schematisch einen Mikroreaktor dar stellt, der beim Durchführen eines chemischen Prozesses, wie z. B. einer PCR, verwendet werden kann. Die Vorrichtung ist allgemein durch 11 dargestellt und umfaßt ein Substrat 13 mit einer im wesentlichen planaren Oberfläche 15, die eine Reaktionszone 17 in der Form eines flachen Hohlraumes, d. h. eines Hohlraumes mit einer Tiefe mit Mikrometer- oder sogar Submikrometerabmessungen, enthält. Eine Abdeckplatte 21 ist derart gezeigt, daß dieselbe über dem Substrat 13 angeordnet ist. Vor der Verwendung der Vorrichtung wird die Unterseite 25 der Abdeckplatte mit der Oberfläche 15 des Substrats 13 ausgerichtet und gegen dieselbe plaziert. Die Abdeckplatte bildet in Kombination mit der Reaktionszone 17 eine Reaktionskammer, in der der gewünschte chemische Pro zeß ausgeführt wird. Ein Fluid, wie z. B. eine zu analysie rende Probe, analytische Reagenzien, Reaktionsstoffe oder dergleichen, wird von einer externen Quelle durch das Ein laßtor 27 in die Reaktionskammer eingebracht; ein Auslaßtor 29 ermöglicht den Durchtritt eines Fluides von der Reakti onskammer zu einem externen Aufnahmebehälter. Dementspre chend ergibt das "Schließen" der Vorrichtung durch Ausrich tung der Abdeckung mit dem Substrat und das Bilden einer Abdichtung zwischen denselben die Bildung einer Reaktions kammer, in die durch das Einlaßtor 27 Fluide eingebracht und durch das Auslaßtor 29 entfernt werden können. Eine flüssigkeitsdichte Abdichtung wird vorzugsweise unter Ver wendung von Druckabdichtungstechniken, einer externen Ein richtung, um die Werkstücke zusammenzupressen (wie z. B. Klammern, Druckfedern oder einer zugeordneten Klemmvorrich tung) oder Haftmitteln aus Verbindungspolymeren, Keramiken und dergleichen, die in der Technik wohl bekannt sind, ge bildet.

Bei einem verwandten Ausführungsbeispiel der Erfindung, wie es in Fig. 2 dargestellt ist, sind Flußwege in der Form von Mikrokanälen in dem Substrat an beiden Enden der Reaktions zone untergebracht. Dies bedeutet, daß eine Vorrichtung 31 ein Substrat 33 mit einer im wesentlichen planaren Oberflä che 35 aufweist, die eine Reaktionszone 37 wiederum in der Form eines flachen Hohlraums enthält. Ein stromaufwärtiger Mikrokanal 39 in der Substratoberfläche befindet sich in einer Fluidkommunikation mit der stromaufwärtigen Region der Reaktionszone 37, während sich ein stromabwärtiger Mi krokanal 41 in Fluidkommunikation mit der stromabwärtigen Region der Reaktionszone 38 befindet. Die Abdeckplatte 43 ist derart gezeigt, daß dieselbe mit ihrer Unterseite 45 der Substratoberfläche zugewandt über dem Substrat 33 ange ordnet ist. Die Unterseite 45 der Abdeckplatte wird mit dem Substrat ausgerichtet und vor der Verwendung der Vorrich tung auf der Oberfläche 35 plaziert. Das Schließen der Vor richtung auf diese Art und Weise, d. h. durch Ausrichten der Abdeckung mit dem Substrat und Bilden einer Abdichtung zwischen denselben, ergibt die Bildung einer Reaktionskam mer, einer stromaufwärtigen Mikrosäule und einer stromab wärtigen Mikrosäule. Auf das Schließen der Vorrichtung hin ermöglicht ein Einlaßtor 47 in der Abdeckplatte das Ein bringen einer Fluids von einer externen Quelle in die stro maufwärtige Mikrosäule, während ein Auslaßtor 49, welches sich ebenfalls in der Abdeckplatte befindet, die Entfernung des Fluids aus der stromabwärtigen Mikrosäule ermöglicht. Die stromaufwärtige Mikrosäule kann als eine Konzentrie rungseinrichtung verwendet werden, um die Konzentration ei nes speziellen Analysestoffes oder einer chemischen Kompo nente vor der chemischen Prozeßverarbeitung in der Reakti onskammer zu erhöhen. Ferner können auf diese Weise unge wollte, möglicherweise störende Proben- und Reaktionskompo nenten unter Verwendung der stromaufwärtigen Mikrosäule entfernt werden. Zusätzlich oder alternativ kann der stro maufwärtige Mikrokanal als ein Präparations- bzw. Vorberei tungs-Mikroreaktor für chemische oder biochemische Präpara tionsprozesse vor einer DNA-Vermehrung in der Reaktionskam mer dienen. Solche Präparationsprozesse können eine Etiket tierung bzw. Indizierung, eine Proteindigerierung und der gleichen umfassen. Die stromabwärtige Mikrosäule kann als eine Reinigungseinrichtung verwendet werden, um nach dem Abschluß einer chemischen Prozeßverarbeitung unerwünschte Komponenten, nicht reagierte bzw. unreagierte Materialien usw. zu entfernen. Dies kann beispielsweise durch Packen der stromabwärtigen Mikrosäule oder Bedecken ihrer Innen oberfläche mit einem Material, das bestimmte Typen von Kom ponenten aus einem Fluid oder einer Reaktionsmischung se lektiv entfernt, durchgeführt werden.

Es wird darauf hingewiesen, daß ein Mikroreaktor der Erfin dung hergestellt werden kann, um zwei oder mehr Reaktions zonen und optionale Mikrokanäle, die sich in Fluidkommuni kation mit dem bzw. denselben befinden, zu enthalten. Ein Beispiel einer solchen Vorrichtung ist in Fig. 3 darge stellt, wobei dieselbe allgemein mit 51 gezeigt ist und ein Substrat 53 und eine Abdeckplatte 55, die mit demselben ausgerichtet ist, aufweist. Die obere Oberfläche 57 des Substrats, eine im wesentlichen planare Oberfläche, ist mit einer ersten Reaktionszone 59 und einer zweiten Reaktions zone 61 versehen. Ein erster stromaufwärtiger Mikrokanal 63 befindet sich in Fluidkommunikation mit der stromaufwärti gen Region der ersten Reaktionszone 59, während sich ein zweiter stromaufwärtiger Mikrokanal 65 in Fluidkommunikati on mit der stromaufwärtigen Region der zweiten Reaktionszo ne 61 befindet. Dementsprechend befindet sich ein erster stromabwärtiger Mikrokanal 67 in Fluidkommunikation mit der stromabwärtigen Region der ersten Reaktionszone 59, während sich ein zweiter stromabwärtiger Mikrokanal 69 in Fluidkom munikation mit der stromabwärtigen Region der zweiten Reaktionszone 61 befindet. Auf das Schließen der Vorrichtung durch Plazieren der Unterseite 71 der Abdeckplatte 55 auf der Substratoberfläche 57 hin werden aus der ersten und der zweiten Reaktionszone 59 und 61 zusammen mit zwei stromaufwärtigen Mikrosäulen (die aus dem ersten und dem zweiten stromaufwärtigen Mikrokanal 63 und 65 gebildet werden) und zwei stromabwärtigen Mikrosäulen (die aus dem ersten und dem zweiten stromabwärtigen Mikrokanal 67 und 69 gebildet werden) zwei Reaktionskammern gebildet. Ein erstes Einlaßtor 73 in der Abdeckplatte 55 ist mit dem stromaufwärtigen Ende des ersten stromaufwärtigen Mikrokanals 63 ausgerichtet, während ein zweites Einlaßtor 75 mit dem stromaufwärtigen Ende des zweiten stromaufwärtigen Mikrokanals ausgerichtet ist, wobei das erste und das zweite Einlaßtor 73 und 75 das Einbringen eines Fluids von einer externen Quelle in die erste bzw. zweite stromaufwärtige Mikrosäule liefern. Dementsprechend ist ein erstes Auslaßtor 77 in der Abdeckplatte 55 mit dem stromabwärtigen Ende des ersten stromabwärtigen Mikrokanals ausgerichtet, während ein zwei tes Auslaßtor 79 mit dem stromabwärtigen Ende des zweiten stromabwärtigen Mikrokanals ausgerichtet ist, wobei das er ste und das zweite Auslaßtor 77 und 79 eine Entfernung des Fluids aus der ersten bzw. zweiten stromabwärtigen Mikro säule liefern. Bei diesem Ausführungsbeispiel und bei den Ausführungsbeispielen von Fig. 1 und 2 können das Substrat und die Abdeckplatte an einer Kante verbunden sein, derart, daß das Schließen der Vorrichtung durch Falten der Abdeck platte auf das Substrat bewirkt wird. Die Kante kann eine Falteinrichtung, wie z. B. eine Reihe von voneinander beab standeten Perforierungen, Vertiefungen oder Öffnungen mit einer Form, wie z. B. einer kreisförmigen, rhombischen, he xagonalen, usw., umfassen, die das Falten und folglich die Gelenkbildung fördern.

Die Materialien, die verwendet werden, um die Substrate und Abdeckplatten bei den Mikroanalysevorrichtungen der Erfin dung zu bilden, werden bezüglich physischer und chemischer Charakteristika ausgewählt, die für eine spezielle Anwen dung wünschenswert sind. Auf alle Fälle muß das Substrat aus einem Material hergestellt werden, das die Bildung von hochdefinierten Merkmalen bzw. Merkmalen mit hoher Defi niertheit (oder Merkmalen mit hoher "Auflösung"), d. h. Mi krokanälen, Kammern und dergleichen, die Mikrometer- oder Submikrometerabmessungen aufweisen, ermöglicht. Das heißt, daß das Material zu einer Mikroherstellung unter Verwendung von beispielsweise Trockenätzen, Naßätzen, Laserätzen, For men, Prägen oder dergleichen in der Lage sein muß, um die gewünschten miniaturisierten Oberflächenmerkmale aufzuwei sen; das Substrat ist vorzugsweise dazu in der Lage, auf eine derartige Art und Weise mikrohergestellt zu werden, um Merkmale in, auf und/oder durch die Oberfläche des Substra tes zu bilden. Es können ferner Mikrostrukturen auf der Oberfläche eines Substrates durch Hinzufügen eines Materi als auf demselben gebildet werden, wobei beispielsweise Po lymerkanäle auf der Oberfläche eines Glassubstrates unter Verwendung eines photobelichtbaren Polyimids gebildet wer den kann. Ferner sollten alle Vorrichtungsmaterialien, die verwendet werden, in Hinblick auf jegliche Reagenzien bzw. Reaktionspartner, mit denen dieselben in Kontakt kommen, unter den Reaktionsbedingungen, die verwendet werden, (z. B. bezüglich des pH-Wertes, der elektrischen Felder, usw.) chemisch inert und physisch stabil sein. Da die PCR relativ hohe Temperaturen mit sich bringt, ist es wichtig, daß alle Materialien in dem Bereich der verwendeten Temperaturen chemisch und physisch stabil sind. Für eine Verwendung mit einer optischen Erfassungseinrichtung sollten die Materia lien, die verwendet werden, optisch transparent sein, und zwar typischerweise transparent für Wellenlängen in dem Be reich von etwa 150 nm bis 800 nm. Silizium, Siliziumdioxid und andere Silizium enthaltende Materialien sollten vermie den werden, wobei bevorzugte Materialien diejenigen sind, die gelöste Stoffe, wie z. B. Proteine oder andere Biomole küle, nicht stark adsorbieren. Geeignete Materialien zum Bilden der vorliegenden Vorrichtung umfassen Polymermate rialien, Keramiken (einschließlich Aluminiumoxid und der gleichen), Glas, Metalle, Verbundstoffe und Laminate der selben, sind aber nicht darauf begrenzt.

Polymermaterialien sind hierin besonders bevorzugt und wer den typischerweise organische Polymere sein, die entweder Homopolymere oder Copolymere, natürlich auftretend oder künstlich, vernetzt oder unvernetzt sind. Spezifische Poly mere von Interesse umfassen Polyimide, Polykarbonate, Poly ester, Polyamide, Polyether, Polyurethane, Polyflurokarbo ne, Polystyrene, Poly(Acrylonitril-Butadien-Styren) (ABS) Acrylat und Acrylsäurepolymere, wie z. B. Polymethylmetha crylat, und andere substituierte und unsubstituierte Polyo lefine und Copolymere derselben, sind aber nicht darauf be grenzt. Polyimide sind von speziellem Interesse und haben sich als ein hochwünschenswertes Substratmaterial bei meh reren Kontexten bzw. Zusammenhängen erwiesen. Es hat sich beispielsweise gezeigt, daß Polyimide geringe Sorptionsei genschaften bezüglich Proteinen zeigen, von denen bekannt ist, daß dieselben bei herkömmlichen Siliziumdioxid basierten Systemen besonders schwierig zu analysieren sind. Polyimide sind beispielsweise unter dem Markennamen Kap ton® (DuPont, Wilmington DE) und Upilex® (Ube Industries, Ltd., Japan) kommerziell verfügbar.

Die Vorrichtungen der Erfindung können ferner aus einem "Verbundstoff" hergestellt werden, d. h. einer Zusammenset zung, die aus ungleichen Materialien besteht. Der Verbund stoff kann ein Blockverbundstoff, z. B. ein A-B-A- Blockverbundstoff, ein A-B-C-Blockverbundstoff oder der gleichen sein. Alternativ kann der Verbundstoff eine hete rogene Kombination von Materialien, d. h. bei der sich die Materialien aus getrennten Phasen unterscheiden, oder eine homogene Kombination von ungleichen Materialien sein. Der Ausdruck "Verbundstoff", wie er hierin verwendet wird, wird verwendet, um einen "Laminat"-Verbundstoff zu umfassen. Ein "Laminat" bezieht sich auf ein Verbundstoffmaterial, das aus mehreren unterschiedlichen verbundenen Schichten eines identischen Materials oder unterschiedlicher Materialien gebildet ist. Weitere bevorzugte Verbundstoffsubstrate um fassen Polymerlaminate, Polymer-Metall-Laminate, z. B. ein Polymer das mit Kupfer beschichtet ist, einen Keramik-in- Metall- oder einen Polymer-in-Metall-Verbundstoff. Ein be vorzugtes Verbundstoffmaterial ist ein Polyimidlaminat, das aus einer ersten Schicht aus Polyimid, wie z. B. Kapton®, das von DuPont (Wilmington, Delaware) verfügbar ist, gebil det ist, die zusammen mit einer zweiten dünnen Schicht ei ner Wärmehaftmittelform von Polyimid, die als KJ® bekannt ist und ebenfalls von DuPont (Wilmington, Delaware) verfüg bar ist, extrodiert worden ist.

Die Oberflächen der Substrate und Abdeckplatten können che misch modifiziert sein, um wünschenswerte chemische oder physikalische Eigenschaften zu liefern, z. B. um die Ad sorption von molekularen Anteilen an den Innenwänden eines Mikrokanals oder einer Reaktionskammer und den EOF zu redu zieren. Die Oberfläche eines Polymer- oder Keramik- Substrates kann beispielsweise mit einer elektrisch neutra len Molekularspezies, zwitterionischen Gruppen, hydrophilen oder hydrophobischen Oligomeren oder Polymeren, usw. be deckt sein oder funktionalisiert sein, um dieselben zu ent halten. Mit Polylmiden, Polyamiden und Polyolefinen, die Reaktionsorte oder funktionelle Gruppen aufweisen, wie z. B. Carboxyl-, Hydroxyl-, Amino- und Haloalkyl-Gruppen (z. B. Polyvinylalkohol, Polyhydroxystyren, Polyacrylsäure, Po lyacrylnitril, usw.), oder mit Polymeren, die modifiziert werden können, um solche Reaktionsorte oder funktionelle Gruppen zu enthalten, ist es möglich, Gruppen an der Ober fläche chemisch zu binden, die eine Vielzahl von wünschens werten Oberflächeneigenschaften liefern können. Ein exem plarisch modifiziertes Substrat ist ein Polyimid- funktionalisiertes Substrat, um oberflächengebundene was serlösliche Polymere, wie z. B. Polyethylenoxid (PEO), zu enthalten, was dazu tendiert, eine unerwünschte Adsorption zu reduzieren und eine nicht spezifische Bindung bei einer DNA-Vermehrung und anderen Verfahren, die Hybridisierungs techniken umfassen, zu minimieren. Die Substratoberfläche kann ferner vorteilhafterweise unter Verwendung von ober flächenaktiven Stoffen (z. B. Polyethylenoxidtriblockcopo lymeren, wie z. B. diejenigen, die unter dem Markennamen "Pluronic" verfügbar sind, Polyoxyethylensorbitan oder "TWEEN"), natürlichen Polymeren (z. B. Bovinserumalbomin oder "BSA") oder anderen Anteilen, die die gewünschten Oberflächencharakteristika, insbesondere bei Reduzierung der Sorption von Biomolekülen, wie z. B. Proteinen, lie fern, modifiziert werden.

Es sollte ferner betont werden, daß unterschiedliche Regio nen eines einzelnen Substrates chemisch unterschiedliche Oberflächen aufweisen können, so daß beispielsweise die In nenoberfläche eines Mikrokanals ein erstes Material aufwei sen kann, während die Innenoberfläche einer Reaktionskam mer, die sich in Fluidkommunikation mit diesem Mikrokanal befindet, ein zweites Material aufweisen kann. Die Reakti onskammer oder die Reaktionskammern können beispielsweise Innenoberflächen aufweisen, die mit beispielsweise PEO oder dergleichen bedeckt oder funktionalisiert sind, während die Innenoberflächen der Mikrokanäle, die den Reaktionskammern bzw. der Reaktionskammer zugeordnet sind, nicht bedeckt oder nicht funktionalisiert sein können. Ferner können stromaufwärtige und stromabwärtige Mikrokanäle hergestellt sein, um ein Ionenaustauschharz, eine Metallchelatebil dungsverbindung, ein Affinitätadsorbermaterial oder der gleichen zu enthalten, d. h. Materialien, die ausgewählt sind, um ein Fluid oder eine Probe durch Entfernen einer oder mehrerer Komponenten oder Typen von Komponenten von derselben zu reinigen. Auf diese Weise können unterschied liche Komponenten und Merkmale, die in dem selben Substrat vorhanden sind, verwendet werden, um unterschiedliche che mische oder biochemische Prozesse oder unterschiedliche Schritte in einem einzigen chemischen oder biochemischen Prozeß durchzuführen.

Die vorliegenden Mikroreaktoren können unter Verwendung jeglichen geeigneten Verfahrens hergestellt werden, ein schließlich, aber nicht darauf begrenzt, Mikroformungs- und Gußtechniken, Prägungsverfahren, die Oberflächenmikrobear beitung und Volumenmikrobearbeitung. Die letztgenannte Technik umfaßt die Bildung von Mikrostrukturen durch direk tes Ätzen in ein Volumenmaterial, und zwar typischerweise unter Verwendung chemischen Naßätzens oder des Reaktionsio nenätzens ("RIE"; RIE = reactive ion etching). Die Oberflä chenmikrobearbeitung umfaßt die Herstellung von Filmen, die auf die Oberfläche eines Substrates aufgebracht werden. Ein exemplarischer Oberflächenmikrobearbeitungsprozeß ist als "LIGA" bekannt. Siehe hierzu beispielsweise Becker et al. (1986), "Fabrication of Microstructures with High Aspects Rations and Great Structural Heights by Synchrotron Radia tion Lithography Galvanoforming, and Plastic Moulding (LIGA Process)", Microelektronic Engineering 4(1): 35-36, Ehrfeld et al. (1988), "1988 LIGA Process: Sensor Construction Techniques via x-Ray Lithography", Tech. Digest from IEEE Solid-State Sensor and Actuator Workshop, Hilton Head, SC; Guckel et al. (1991) J. Micromech. Microeng. 1: 135-138.

LIGA umfaßt das Aufbringen einer relativ dicken Schicht ei nes Röntgenstrahlungsresists bzw. -Schutzlackes auf einem Substrat gefolgt von einem Aussetzen desselben bezüglich einer hochenergetischen Röntgenstrahlung durch eine Rönt genmaske und das Entfernen der belichteten Resist- Abschnitte unter Verwendung eines chemischen Entwicklers. Das LIGA-Formstück, das auf diese Weise bereitgestellt wird, kann verwendet werden, um Strukturen mit horizontalen Abmessungen - d. h. Durchmessern - in der Größenordnung von Mikrometern zu präparieren.

Eine bevorzugte Technik zum Präparieren der vorliegenden Mikroreaktoren ist die Laserablation. Bei der Laserablation werden kurze Pulse eines intensiven ultravioletten Lichtes in einer dünnen Oberflächenschicht eines Materials absor biert. Bevorzugte Pulsenergien sind größer als etwa 100 Millijoule pro Quadratzentimeter, wobei die Pulsdauern kür zer als etwa 1 Mikrosekunde sind. Unter diesen Bedingungen hitzedissoziiert bzw. löst das intensive UV-Licht die che mischen Bindungen in der Substratoberfläche. Die absorbier te UV-Energie ist auf ein solch kleines Volumen des Materi als konzentriert, daß dieselbe die dissoziierten Fragmente schnell aufheizt und dieselben von der Substratoberfläche weg herausschleudert. Da diese Prozesse so schnell auftre ten, besteht keine Zeit für die Hitze, sich in das umlie gende Material auszubreiten. Als ein Ergebnis wird die um liegende Region nicht geschmolzen oder auf andere Weise be schädigt, und der Rand der ablatierten Merkmale kann die Form des einfallenden optischen Strahls mit einer Präzision in der Größenordnung von etwa 1 Mikrometer oder weniger nachbilden. Die Laserablation wird typischerweise die Ver wendung eines hochenergetischen Photonenlasers, wie z. B. eines Excimer-Lasers des F₂-, ArF-, KrCl, KrF oder XeCl- Typs, aufweisen. Andere UV-Lichtquellen mit im wesentlichen den selben optischen Wellenlängen und Energiedichten können jedoch ebenfalls verwendet werden. Die Laserablationstech niken werden beispielsweise von Znotins et a. (1987) Lasen Focus Electro Optics, auf Seite 54-70, und in den U.S.-Patenten Nr. 5,291,226 und 5,305,015, erteilt an Schantz et al., beschrieben.

Die Herstellungstechnik, die verwendet wird, muß Merkmale mit einer ausreichend hohen Definiertheit liefern, d. h. Mikrometerskalakomponenten, -kanäle, -kammern usw., derart, daß eine präzise Ausrichtung - "Mikroausrichtung" - dieser Merkmale möglich ist. Die "Mikroausrichtung" bezieht sich auf die präzise und genaue Ausrichtung der laserablatierten Merkmale und umfaßt die Ausrichtung von komplementären Mi krokanälen oder Mikroabteilen zueinander, von Einlaß- und/oder Auslaßtoren zu Mikrosäulen oder Reaktionskammern, von Erfassungseinrichtungen zu Mikrosäulen oder Trennungs abteilen, von Erfassungseinrichtungen zu anderen Erfas sungseinrichtungen, von Vorsprüngen und zusammenpassenden Vertiefungen, von Rillen und zusammenpassenden Leisten und dergleichen.

Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung ist auf ei nen Mikroreaktor gerichtet, wie er in Fig. 4 gezeigt ist, der sowohl eine miniaturisierte Säule zum Durchführen von Trennungsprozessen, z. B. elektrophoretischen oder chroma tographischen Trennungen, als auch ein Reservoirabteil auf weist, das als eine Reaktionskammer zum Ausführen einer oder mehrerer chemischer oder biochemischer Reaktionen dient. Die Vorrichtung ist allgemein mit 2 gezeigt und um faßt ein ausgewähltes Substrat 4 mit einer ersten und ei ner zweiten im wesentlichen planaren Oberfläche, die sich gegenüber liegen und mit 6 bzw. 8 angezeigt sind, wobei dieselbe aus einem anderen Material als Silizium oder Sili ziumdioxid hergestellt ist. Das Material ist vorzugsweise, wie wohl nicht notwendigerweise, UV-absorbierend und laser ablatierbar. In einer ersten planaren Oberfläche 6 des Substrats 4 ist ein Mikrokanal 10 laserablatiert oder auf andere Weise gebildet. Es ist ohne weiteres erkennbar, daß, obwohl der Mikrokanal 10 in einer allgemein erstreckten Form dargestellt ist, die Mikrokanäle, die bei der Ausfüh rung der Erfindung gebildet werden, eine Vielzahl von Kon figurationen aufweisen können, wie z. B. einen geradlini gen, serpentinenförmigen, spiralförmigen oder jeglichen kurvigen Weg, der erwünscht ist, und jegliche Anzahl von unterschiedlichen Querschnittformen aufweisen kann, d. h. jegliche einer breiten Vielzahl von Kanalgeometrien, ein schließlich halbkreisförmig, rechteckig, rhombisch und der gleichen, und die Kanäle können in einem breiten Bereich von Längenverhältnissen gebildet sein. Zusätzlich können zwei oder mehr Mikrokanäle in einem einzigen Substrat vor handen sein. Wie es in Fig. 4 angezeigt ist, weist der Mi krokanal 10 ein stromaufwärtiges Ende, das mit 12 angezeigt ist, und ein mit 14 angezeigte stromabwärtiges Ende auf.

Die erste planare Oberfläche 6 umfaßt ferner eine Auf- Vorrichtung-Reservoireinrichtung 16, die aus einem Hohlraum gebildet ist, der in der ersten planaren Oberfläche 6 lase rablatiert oder auf andere Weise hergestellt worden ist. Der Hohlraum kann in jeglicher Geometrie und mit einem be liebigen Längenverhältnis, die lediglich durch die Gesamt dicke des Substrates 4 beschränkt sind, gebildet sein, um eine Reservoireinrichtung mit einem gewünschten Volumen zu liefern. Die Reservoireinrichtung kann verwendet werden, um ein Ausgleichsflußfluid, eine Fluidregelungsfunktion oder Reagenzien zum Verbessern der Erfassung oder Trennung von Flüssigprobenbestandteilen zu liefern. Die Reservoirein richtung kann ferner als eine Reaktionszone dienen, in der chemische oder biochemische Prozesse durchgeführt werden sollen. Solche Prozesse umfassen, wie es bereits früher hierin angemerkt wurde, eine Trennung (z. B. eine chromato graphische, elektrophoretische oder elektrochromatographi sche Trennung), Filterungs- und Diagnosevorgänge (unter Verwendung von beispielsweise einer Hybridisierung oder ei ner anderen Bindungseinrichtung) und eine chemische oder biochemische Synthese (z. B. DNA-Vermehrung, wie sie unter Verwendung der PCR ausgeführt werden kann), sind aber nicht darauf beschränkt. Die Reservoireinrichtung 16 befindet sich in Fluidkommunikation mit dem Mikrokanal 10 über eine Fluidleitungseinrichtung 18, die aus einer Rohrleitung ge bildet ist, die in der ersten planaren Oberfläche 6 lasera blatiert oder auf andere Weise hergestellt ist.

Eine Abdeckplatte 20 ist über der ersten planaren Oberflä che 6 angeordnet und bildet in Verbindung mit dem Mikroka nal 10 eine längliche Trennungsmikrosäule. Ferner bildet die Abdeckplatte 20 in Kombination mit der Reservoirein richtung 16 bildet ein Reservoirabteil (oder es wird, wenn der Reservoireinrichtung als eine Reaktionszone dient, eine "Reaktionskammer" auf das Plazieren der Abdeckplatte auf das Substrat hin gebildet werden) und auf ähnliche Weise in Kombination mit der Fluidleitungseinrichtung 18 ein Fluid leitungsabteil, das das Reservoirabteil mit der Trennungs mikrosäule kommunikativ verbindet. Die Abdeckplatte 20 kann über der ersten planaren Oberfläche 6 befestigbar ausge richtet werden, um eine flüssigkeitsdichte Trennungsmikro säule zu bilden, indem Druckabdichtungstechniken, eine ex terne Einrichtung, um die Werkstücke zusammen zu drücken (wie z. B. Klammern, Druckfedern oder zugeordnete Klemmvor richtungen) oder Haftmittel aus Verbindungspolymeren, Kera miken und dergleichen, die in der Technik wohl bekannt sind, verwendet werden.

Bei einer speziellen Vorrichtungskonfiguration umfaßt die Abdeckplatte 20 eine getrennte Komponente mit einer im we sentlichen planaren Oberfläche, die in der Lage ist, mit der ersten planaren Oberfläche 6 des Substrates 4 eng schnittstellenmäßig verbunden zu sein. Bei einer bevorzug ten Vorrichtung sind das Substrat und die Abdeckplatte je doch in einem einzigen, flexiblen Substrat gebildet. Bezug nehmend auf Fig. 4 umfaßt das flexible Substrat einen er sten und einen zweiten Abschnitt, die dem Substrat 4 und der Abdeckplatte 20 entsprechen, wobei jeder Abschnitt eine im wesentlichen planare Innenoberfläche aufweist. Der erste und der zweite Abschnitt sind durch zumindest eine Faltein richtung, die allgemein mit 26 angezeigt ist, getrennt, derart, daß die Abschnitte ohne weiteres gefaltet werden können, um aufeinander aufzuliegen. Die Falteinrichtung 26 kann eine Reihe von voneinander beabstandeten Perforierun gen in dem flexiblen Substrat, eine Reihe von voneinander beabstandeten Schlitz-förmigen Vertiefungen oder Öffnungen, die sich lediglich teilweise durch das flexible Substrat, erstrecken, oder dergleichen umfassen. Die Perforierungen oder Vertiefungen können kreisförmige, rautenförmige, hexa gonale oder andere Formen aufweisen, die eine Gelenk- bzw. Knickbildung entlang einer vorbestimmten geradlinigen Linie fördern.

Die Vorrichtung 2 von Fig. 4 kann durch Laserablatieren ei nes Mikrokanales 10, einer Reservoireinrichtung 16 und ei ner Fluidleitungseinrichtung 18 in dem Substrat 4 gebildet werden. Eine Trennungsmikrosäule, ein Reservoirabteil und ein Fluidleitungsabteil werden dann vorgesehen, indem das flexible Substrat an der Falteinrichtung 26 derart gefaltet wird, daß der Abdeckplattenabschnitt 20 den Mikrokanal, das Reservoir und die Fluidleitungseinrichtung einschließt.

Bei jeder der im vorhergehenden beschriebenen Vorrichtungen kann die Abdeckplatte 20 ferner eine Vielzahl von Öffnungen oder anderen Merkmalen aufweisen, die in dieselbe lasera blatiert oder auf andere Weise hergestellt worden sind. Insbesondere kann eine erste Öffnung angeordnet sein, um mit dem Trennungsabteil (das durch die Kombination aus dem Mikrokanal 10 und der Abdeckplatte 20 gebildet wird) be nachbart zu dem stromaufwärtigen Ende 12 des Mikrokanales 10 kommunikativ verbunden zu sein, um ein Einlaßtor 22 zu liefern. Das Einlaßtor ermöglicht den Durchtritt eines Flu ids von einer externen Quelle in das Trennungsabteil, wenn die Abdeckplatte 20 über der ersten planaren Oberfläche 6 angeordnet ist. Eine zweite Öffnung kann auf ähnliche Weise angeordnet sein, um mit der Trennungsmikrosäule benachbart zu dem stromabwärtigen Ende 14 des Mikrokanales 10 kommuni kativ verbunden zu sein, um ein Auslaßtor 24 zu bilden, das den Durchtritt eines Fluides von dem Trennungsabteil in ei nen externen Aufnahmebehälter ermöglicht. Dementsprechend erstreckt sich ein Flußweg von einem stromaufwärtigen Ende der Trennungsmikrosäule und verläuft zu einem stromabwärti gen Ende derselben, wodurch eine Flüssigphasenanalyse von Proben ausgeführt werden kann, indem Fluide von einer zuge ordneten Quelle (nicht gezeigt) durch das Einlaßtor über tragen, die Fluide durch die Trennungsmikrosäule geleitet werden und ermöglicht wird, daß die Fluide das Trennungsab teil über das Auslaßtor verlassen.

Verschiedene Einrichtungen zum Anlegen einer Antriebskraft entlang der Länge der Trennungsmikrosäule, wie z. B. eine Druckdifferenz oder ein elektrisches Potential, können ohne weiteres bei jeder der im vorhergehenden beschriebenen Vor richtungen mit der Säulenvorrichtung über das Einlaß- und Auslaßtor schnittstellenmäßig verbunden werden. Bei der Elektrophorese wird ein Spannungsgradient über den Flußweg von dem Einlaßtor zu dem Auslaßtor angelegt, wodurch be wirkt wird, daß die Komponenten in dem fließenden Fluid mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten fließen, die proportio nal zu deren Ladungen und/oder Massen sind. Wie es für Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich ist, kann eine ge eignete Einrichtung verwendet werden, um einen Spannungs gradienten über den Flußweg anzulegen.

Bei der speziellen Vorrichtungskonfiguration von Fig. 4 er möglicht die Fluidleitungseinrichtung 18 den Durchtritt ei nes Fluides von der Reservoireinrichtung 16 in die Tren nungsmikrosäule an einer Position, die im wesentlichen auf halbem Weg zwischen dem stromaufwärtigen und dem stromab wärtigen Ende 12 und 14 des Mikrokanals 10 liegt. Es wird darauf hingewiesen, daß, obwohl die Fluidleitungseinrich tung 18 auf diese Art und Weise dargestellt worden ist, die Fluidleitungseinrichtung angeordnet sein kann, um mit dem Trennungsabteil an jeglicher Position zwischen oder an dem stromaufwärtigen und dem stromabwärtigen Ende desselben kommunikativ verbunden zu sein.

Indem eine Fluidkommunikation zwischen dem Fluidleitungsab teil und der Trennungsmikrosäule ermöglicht wird, kann wäh rend des Fluidflußverlaufes eine Anzahl von Trennungs- oder Erfassungsverbesserungsoperationen durchgeführt werden. Die Reservoireinrichtung 16 kann beispielsweise verwendet wer den, um ein flüssiges Reagenz oder einen Farbstoff, z. B. einen Fluoreszenzindikator, zu liefern, der in der Lage ist, mit dem Analysestoff zu reagieren, um beispielsweise die Erfaßbarkeit desselben zu verbessern.

Die Reservoireinrichtung 16 kann verwendet werden, um Rea genzien, wie z. B. organische Zusätze, oberflächenaktive Stoffe, ionische Wirkstoffe bzw. Agenzen, anorganische Wirkstoffe oder dergleichen, zu liefern, die der Trennungs mikrosäule durch einen Anfangsmischschritt hinzugefügt wer den können. Der chemische oder biochemische Prozeß, der in der Reaktionskammer durchgeführt wird, kann mit einem Tren nungsprozeß (der beispielsweise in einem stromaufwärtigen Mikrokanal ausgeführt wird, der sich in einer Fluidkommuni kation mit der Reaktionskammer befindet) oder einem Reini gungsprozeß (der beispielsweise in einem stromabwärtigen Mikrokanal ausgeführt wird, der sich in einer Fluidkommuni kation mit der Reaktionskammer befindet) vorgenommen wer den, wobei in diesem Fall eine Anzahl von Reagenzien, die die Empfindlichkeit und die Auflösung beeinflussen, einge leitet bzw. eingebracht werden können, einschließlich Puf fern, Wirkstoffen, die die Lösungsionenstärke beeinflussen, Wirkstoffen, die die Dielektrizitätskonstante oder Viskosi tät verändern, und oberflächenaktiven Stoffen, und zwar entweder oberhalb oder unterhalb ihrer kritischen Mizell konzentration (CMC; CMC = critical micellar concentration). Oberflächenaktive Stoffe unterhalb der CMC können mit der Innenoberfläche der Trennungsmikrosäule assoziieren und folglich die Selektivität bzw. die Selektivwirkung eines Flüssigphasentrennungssystems verändern. Eine mizellare Bildung aufgrund der Verwendung von oberflächenaktiven Stoffen oberhalb der CMC kann als eine pseudogepackte Säu lenphase bei einem Trennungsmechanismus dienen, der als mi zellare elektrokinetische Kapillarchromatographie (MEKC; MEKC = micellar electrokinetic capillary chromatography) bekannt ist. Geeignete oberflächenaktive Stoffe für die MEKC umfassen SDS und CTAB. Zusätzlich können chirale Se lektoren (z. B. Cyclodextrin, Kronenether oder dergleichen) verwendet werden, um eine verbesserte Trennung von optisch aktiven Spezies zu bewirken.

Eine Anzahl von Puffertypen können von der Reservoirein richtung 16 geliefert werden, wie z. B. übliche organische Puffer (z. B. Acetat- oder Citratpuffer), anorganische Puf fer (z. B. Phosphat- oder Boratpuffer) oder Good's-Puffer (z. B. MES, ACES, MOPS, CAPS, HEPES und dergleichen), aber nicht ausschließlich diese. Wirkstoffe, die die Lösungsio nenstärke beeinflussen, wie z. B. neutrale Salze (z. B. NaCl, KCl oder LiCl), können alternativ von der Reservoir einrichtung geliefert werden. Wirkstoffe können von dem Re servoir ferner geliefert werden, um die Dielektrizitätskon stante einer Lösung in dem Trennungsabteil zu beeinflussen. Geeignete Wirkstoffe umfassen übliche organische Lösungs mittel, wie z. B. MeOH, EtOH, CH₃CN und Isopropylalkohol, sind aber nicht darauf begrenzt. Ferner kann von der Reser voireinrichtung 16 eine Anzahl von Wirkstoffen geliefert werden, um die Viskosität der Lösung, die durch das Tren nungsabteil fließt, zu verändern, wie z. B. Methylzellulo se, Dextran, Polyacrylamid, Polyethylenglykol oder Polyvi nylalkohol. Wirkstoffe, die auf diese Art und Weise verwen det werden können, um die Oberflächenbenetzbarkeit zu ver ändern, umfassen neutrale oberflächenaktive Stoffe (TWEEN, BRIJ oder Alkylglukoside), zwitterionische oberflächenakti ve Stoffe (z. B. CHAPS oder CHAPSO) und veränderte oberflä chenaktive Stoffe (SDS oder CTAB).

Die Reservoireinrichtung 16 kann ferner verwendet werden, um eine Analyse zu optimieren, indem ein erhöhter Druck an die Trennungsmikrosäule angelegt wird, nachdem ein gelöster Stoff begonnen hat, sich zu trennen. Insbesondere kann die Reservoireinrichtung verwendet werden, um ein bekanntes Volumen eines Puffers zu der Trennungsmikrosäule an einem Punkt zu liefern, nachdem eine Trennung begonnen hat, wo durch der Druck, der auf die flüssige Probe ausgeübt wird, erhöht wird.

Bei jeder der im vorhergehenden beschriebenen Vorrichtungen können optionale Einrichtungen zum Einbringen eines Fluides von einer externen Quelle in das Reservoirabteil vorgesehen sein. Immer noch bezugnehmend auf die Vorrichtung von Fig. 4 ist eine Fluidleitungseinrichtung 28, die eine Rohrlei tung umfaßt, die in dem Substrat 4 laserablatiert oder auf andere Weise hergestellt ist, derart dargestellt, daß die selbe ein erstes Ende 30 aufweist, das sich in Fluidkommu nikation mit der Reservoireinrichtung 16 befindet. Die Flu idleitungseinrichtung 28 weist ein zweites Ende 32 auf, das sich in Fluidkommunikation mit einer Düsenöffnung 34 befin det, die in der Abdeckplatte 20 gebildet ist. Die Düsenöff nung 34 kann beispielsweise eine Öffnung umfassen, die in die Abdeckplatte 20 laserablatiert oder auf andere Weise hergestellt worden ist. Alternativ kann die Düsenöffnung in der Abdeckplatte positioniert sein, um sich in einer direk ten Fluidkommunikation mit dem Reservoirabteil zu befinden. Bei jeder der im vorhergehenden beschriebenen Konfiguratio nen ermöglicht die Düsenöffnung 34 jedoch das schnittstel lenmäßige Verbinden einer externen Fluidquelle mit dem Re servoirabteil, wodurch extern enthaltene Puffer, Reagenzein oder dererlei Fluide in das Reservoirabteil für einen an schließenden Durchtritt in das Trennungsabteil eingebracht werden können. Die externe Fluidquelle kann mit der Düsen öffnung durch eine zugeordnete mechanische Ventileinrich tung schnittstellenmäßig verbunden sein, um eine umlenkbare Fluidverbindung zu liefern. Dieses Merkmal ermöglicht, daß eine Vielzahl von Einbringungsverfahren oder anderen Fluid einbringungseinrichtungen verwendet werden können, um Rea genzien oder eine Probe über die Düsenöffnung 34 in das Re servoirabteil einzubringen, einschließlich der Druckein spritzung, der hydrodynamischen Einspritzung oder der elek trokinetischen Einspritzung. Die externe Ventil- und Ein bringungseinrichtung kann mit der Düsenöffnung durch eine Muffenkopplung mit derselben kommunikativ verbunden sein; jegliches andere geeignete Verbindungsverfahren, das in der Technik bekannt ist, kann jedoch ebenfalls hierbei verwen det werden.

Es wird nun auf Fig. 5 Bezug genommen, in der eine Variati on des im vorhergehenden erwähnten Mikroreaktors zeigt, und in der die Vorrichtung allgemein mit 52 angezeigt ist, die einen Tragekörper 54 mit einer ersten und einer zweiten Komponentenhälfte aufweist, die mit 56 bzw. 58 angezeigt sind. Die erste und die zweite Komponentenhälfte 56 und 58 weisen jeweils im wesentlichen planare Innenoberflächen auf, die mit 60 bzw. 62 angezeigt sind, und in denen Merk male mit hoher Definiertheit laserablatiert oder auf andere Weise hergestellt sein können. Insbesondere ist eine erste Mikrokanalstruktur 64 in der ersten planaren Innenoberflä che 60 laserablatiert oder auf andere Weise hergestellt, während eine zweite Mikrokanalstruktur 66 in der zweiten planaren Innenoberfläche 62 laserablatiert oder auf andere Weise hergestellt ist. Die erste und die zweite Mikrokanal struktur in dem Tragekörper 54 sind zueinander spiegelbild lich gebildet. Auf ähnliche Art und Weise umfaßt die Säu lenvorrichtung 52 eine erste und eine zweite Reservoirein richtung 68 und 70, die aus Hohlräumen gebildet sind, die in der ersten und der zweiten planaren Oberfläche 60 bzw. 62 laserablatiert oder auf andere Weise hergestellt sind, wobei die Hohlräume spiegelbildlich zueinander gebildet sind. Eine erste und eine zweite Fluidleitungseinrichtung, die mit 72 und 74 angezeigt sind, sind aus Rohrleitungen gebildet, die in der ersten und der zweiten planaren Ober fläche laserablatiert oder auf andere Weise hergestellt sind, wobei die Rohrleitungen im wesentlichen spiegelbild lich zueinander gebildet sind. Wie es im vorhergehenden be schrieben wurde ermöglicht die Fluidleitungseinrichtung ei ne Fluidkommunikation zwischen der Reservoireinrichtung und den Mikrokanälen.

Die Säulenvorrichtung 52 wird zusammengebaut, indem die er ste und die zweite Komponentenhälfte 56 und 58 in einer flach aneinanderliegenden Anordnung ausgerichtet werden (wie z. B. durch Falten). Die erste und die zweite Kompo nentenhälfte werden unter Verwendung von Druckabdichtungs techniken, wie z. B. der Anwendung einer Spannkraft oder unter Verwendung von Haftmitteln, die in der Technik voll Flüssigphasentrennungsvorrichtungen wohl bekannt sind, in einer befestigbaren Ausrichtung zueinander gehalten, um flüssigkeitsdichte Trennungsmikrosäulen, Reservoirabteile und Fluidleitungsabteile zu bilden. Wie es im vorhergehen den beschrieben wurde, werden die erste und die zweite Kom ponentenhälfte 56 und 58 durch zumindest eine Falteinrich tung getrennt, die allgemein mit 76 angezeigt ist, derart, daß die Hälften gefaltet werden können, um aufeinander auf zuliegen. Bei besonders bevorzugten Vorrichtungen umfaßt die Falteinrichtung 76 eine Reihe von voneinander beabstan deten Perforierungen in dem Substrat oder voneinander beab standeten Schlitz-förmigen Vertiefungen oder Öffnungen, die sich lediglich teilweise durch das Substrat erstrecken.

Die Vorrichtung 52 umfaßt ferner eine Einrichtung zum kom munikativen Verbinden zugeordneter externer Fluidbehälter einrichtungen (nicht gezeigt) mit der Trennungsmikrosäule (die durch die Ausrichtung der Mikrokanäle 64 und 66 gebil det ist), um eine Flüssigphasentrennungsvorrichtung zu lie fern. Insbesondere kann eine Mehrzahl von Öffnungen in dem Tragekörper 54 laserablatiert oder auf andere Weise herge stellt sein, wobei sich die Öffnungen von zumindest einer Außenoberfläche des Tragekörpers aus erstrecken und mit zu mindest einem Mikrokanal kommunikativ verbunden sind, wobei die Öffnungen den Durchtritt eines Fluides durch dieselben ermöglichen. Insbesondere kann ein Einlaßtor in der zweiten Komponentenhälfte 58 laserablatiert oder auf andere Weise hergestellt sein, um mit einem ersten Ende 78 des Mikroka nals 66 kommunikativ verbunden zu sein. Auf die selbe Art und Weise kann ein Auslaßtor in der zweiten Komponenten hälfte laserablatiert oder auf andere Weise hergestellt sein, um mit einem zweiten Ende 80 des Mikrokanals 66 kom munikativ verbunden zu sein.

Dementsprechend erstreckt sich ein Flußweg von dem ersten Ende 78 des Mikrokanals 66 zu dem zweiten Ende 80 dessel ben. Der Flußweg wird durch Leiten von Fluiden von einer zugeordneten Quelle (nicht gezeigt) durch das Einlaßtor, Leiten der Fluide durch das Trennungsabteil, das durch die Ausrichtung der Mikrokanäle 64 und 66 gebildet ist, und Er möglichen, daß die Fluide die Trennungsmikrosäule über das Auslaßtor verlassen, eingerichtet.

Optional kann das Fluid aus dem Reservoirabteil durch eine Antriebseinrichtung, wie z. B. einen Betätiger bzw. ein Stellglied oder dergleichen, entfernt werden. Bezugnehmend auf Fig. 6-8 ist der Mikroreaktor 52 derart dargestellt, daß derselbe eine optionale Betätigungseinrichtung 102 auf weist, die über dem Reservoirabteil angeordnet ist, das durch die Ausrichtung der ersten und der zweiten Reservoir einrichtung 68 und 70 gebildet ist. Wie es am besten in der Querschnittdarstellung von Fig. 8 ersichtlich ist, ist das Reservoirabteil optional mit einer dünnen Membran 104 abge deckt, um eine Membrantyppumpe zu bilden. Ein erstes passi ves Einwegmikroventil 106 ist optional in dem Fluidleitung sabteil integriert, das durch die Ausrichtung der ersten und der zweiten Fluidleitungseinrichtung 72 und 74 gebildet wird, um einen Rückfluß eines verdrängten Fluides in das Reservoirabteil zu verhindern, wobei ein zweites passives Einwegmikroventil 108 in einer Reservoirbefüllungseinrich tung optional integriert ist, um sicherzustellen, daß das Fluid, das aus dem Reservoirabteil verdrängen wird, zu der Trennungsmikrosäule fließt.

Immer noch bezugnehmend auf Fig. 8 ist ein optionaler Gas- oder Flüssigkeits-gefüllter Hohlraum 110 unmittelbar ober halb der Membran 104 angeordnet. Die Betätigungseinrichtung 102 kann verwendet werden, um durch Durchbiegen der Membran 104 eine Fluidverdrängung von dem Reservoirabteil zu bewir ken. Insbesondere kann die Betätigungseinrichtung 102 wir ken, um die Membran 104 direkt durchzubiegen. Dementspre chend kann die Betätigungseinrichtung eine piezoelektri sche, Kolben-, Solenoid- oder ein anderer Typ von Membran durchbiegungsvorrichtung sein. Alternativ kann die Betäti gungseinrichtung eine Heizeinrichtung sein, durch die die Temperatur in dem Hohlraum 110 geregelt wird. Die Heizein richtung kann eine Heizeinrichtung des Widerstandstyps oder ein beliebiger Typ einer geeigneten Heizeinrichtung, die in der Technik bekannt ist, sein. Auf eine Betätigung hin nimmt die Temperatur der Heizeinrichtung zu, wodurch der Inhalt des Hohlraums 110 aufgeheizt wird, das Volumen des selben zunimmt, eine abwärts gerichtete Durchbiegung der Membran 104 erzeugt wird, und das Fluid an dem Ventil 106 vorbei aus dem Reservoirabteil in die Fluidleitungseinrich tung und in die Trennungsmikrosäule verdrängt wird.

Alternativ kann sich die Heizeinrichtung 102 in einem ther mischen Kontakt mit dem Reservoirabteil selbst befinden. Bei dieser Konfiguration nimmt, wenn die Heizeinrichtungs temperatur zunimmt, das Volumen des Fluids in dem Reser voirabteil zu, wodurch dasselbe aus dem Reservoirabteil in die Trennungsmikrosäule verdrängt wird.

Weitere Beispiele für Pumpvorrichtungen, die in die vorlie genden Vorrichtungen aufgenommen werden können, umfassen diejenigen, die nach den Prinzipien des Ultraschall bewirkten Transports (Moroney et al. (1991) Proc MEM S'91, S. 277) oder des elektrohydrodynamisch bewirkten Transports (Richter et al. (1991) Proc MEM S'91, S. 271) arbeiten. Zu sätzlich können chemische Ventile verwendet werden, die aus elektrisch getriebenen Polyelektrolytgelen bestehen (Osada (1991) Adv. Materials 3: 107; Osada et. al (1992) Nature 355: 242).

Die Verwendung von transparenten Materialien bei den vor liegenden Mikroreaktoren, d. h. für das Substrat und vor zugsweise die Abdeckplatte, ermöglicht die Verwendung der Brechungsindex- (RI-) Erfassung, um getrennte interessie rende Analysestoffe, die durch die Trennungsmikrosäulen fließen, zu erfassen. Eine zugeordnete Laserdiode, die eine Strahlung mit einer Wellenlänge emittiert, bei der das Vor richtungsmaterial "transparent" ist, ermöglicht beispiels weise einen Erfassungsaufbau, bei dem keine zusätzlichen Merkmale in den Vorrichtungen vorgesehen sein müssen.

Eine optionale Erfassungseinrichtung kann bei jedem der vorliegenden Mikroreaktoren einbezogen werden. Insbesondere auf die Vorrichtung von Fig. 3 bezugnehmend können eine oder mehrere Erfassungseinrichtungen in dem Substrat 4 und/oder der Abdeckplatte 20 laserablatiert oder auf andere Weise hergestellt sein. Insbesondere wird die Erfassungs einrichtung im wesentlichen stromabwärts bezüglich des stromaufwärtigen Endes 12 der Mikrosäule 10 angeordnet sein, um die Erfassung einer oder mehrerer Komponenten, die in derselben enthalten sind, zu ermöglichen. Es kann bei spielsweise eine Öffnung durch das Substrat 4 vorgesehen sein, um mit dem Trennungskanal 10 kommunikativ verbunden zu sein. Eine entsprechende Öffnung kann auf ähnliche Weise in der Abdeckplatte 20 gebildet sein und so angeordnet sein, daß sich dieselbe in einer koaxialen Ausrichtung zu der Erfassungsöffnung in dem Substrat befindet, wenn die Abdeckplatte an dem Substrat befestigt ist. Bei einem Tren nungsprozeß können Elektroden mit der miniaturisierten Säu lenvorrichtung über die betreffenden entsprechenden Öffnun gen verbunden sein, um getrennte interessierende Analyse stoffe, die durch das Trennungsabteil fließen, durch elek trochemische Erfassungstechniken zu erfassen. Bei einer speziellen Vorrichtungskonfiguration bilden die koaxial ausgerichteten Öffnungen einen optischen Erfassungsweg, der die optische Erfassung getrennter Analysestoffe, die durch die Trennungsmikrosäule fließen, über die Transmission ei ner Strahlung senkrecht zu der Hauptachse der Trennungsmi krosäule (und dementsprechend senkrecht zu der Richtung des elektroosmotischen Flusses bei einer elektrophoretischen Trennung) ermöglicht.

Eine breite Vielzahl von zugeordneten optischen Erfassungs vorrichtungen können mit den miniaturisierten Säulen unter Verwendung der optionale Erfassungseinrichtungen schnitt stellenmäßig verbunden werden. Folglich kann die Erfassung von Analysestoffen in Proben, die durch das Trennungsabteil fließen, ohne weiteres unter Verwendung von UV/Vis-, Fluo reszenz-, Brechungsindex- (RI-), Raman- und dererlei spek trophotometrischen Techniken ausgeführt werden.

Ferner wird es ohne weiteres deutlich, daß die Verwendung einer optis 12745 00070 552 001000280000000200012000285911263400040 0002010106008 00004 12626chen Erfassungseinrichtung mit Öffnungen, die in das Substrat oder die Abdeckplatte ablatiert (oder auf an dere Weise hergestellt) sind, eine sehr gute Steuerung über die effektive optische Erfassungsweglänge liefert. Die re sultierende Erfassungsweglänge ist im wesentlichen gleich der kombinierten Dicke des Substrats 4 und der Abdecklatte 20.

Wie es im vorhergehenden in der Beschreibungseinleitung er örtert wurde, ist die PCR eine wohlbekannte und allgemein verwendete Technik auf dem Gebiet der Bioanalyse und der Genomenforschung. Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, daß die Erörterung der PCR-Verfahren, die hier geliefert wird, lediglich veranschaulichend ist und nicht begrenzend sein soll. Eine DNA bzw. DNS (Deoxyribonucleic acid = Deso xyribonucleinsäure) kann durch thermisches Hin- und Her steuern einer speziell gebildeten flüssigen Reaktionsmi schung gemäß einem Polymerase-Kettenreaktions- (PCR-) Pro tokoll vermehrt werden, das mehrere Inkubationen bei unter schiedlichen Temperaturen umfaßt. Die Reaktionsmischung be steht aus verschiedenen Komponenten, wie z. B. der DNA, die vermehrt werden soll (dem Ziel) und zumindest zwei Oligonu cleotidprimeren, die auf eine vorbestimmte Weise ausgewählt sind, um zu einem Abschnitt der Ziel-DNA komplementär zu sein. Die Reaktionsmischung umfaßt ferner verschiedene Puf fer, Enzyme und Desoxyribonucleotidtriphosphate, wie z. B. dATP, dCTP, dGTP und dTTP.

Die Reaktionsmischung kann ferner Deckwirkstoffe oder ober flächenaktive Stoffe umfassen, um einen Biobewuchs durch Modifizieren der Innenoberflächen des Mikroreaktors zu ver hindern. Beispiele solcher Deckwirkstoffe umfassen Poly ethylenoxidtriblockcopolymere, Polyethylenglykole (PEG) mit Molekulargewichten, die von etwa 200 bis etwa 8000 reichen, natürliche Polymere, wie z. B. Bovinserumalbomine (BSA) oder andere Anteile, die die gewünschten Oberflächencharak teristika liefern, insbesondere diejenigen, die die Sorpti on von Biomolekülen, wie z. B. Proteinen, reduzieren.

Das Doppelstrang-DNA-Molekül wird unter Verwendung von Hit ze in zwei komplementäre Einzelstränge denaturiert. Die Primere lagern sich dann zu den Strängen an, wobei die Nu cleosidmonophosphatreste in Anwesenheit einer thermostabi len DNA-Polymerase mit den Primeren verbunden werden, um ein Pirmererweiterungsprotodukt zu erzeugen. Nach der Pri mererweiterung existieren doppelt so viele doppelsträngige DNA-Moleküle. Dieser Prozeß wird wiederholt, wobei sich die Menge der vorhandenen DNA jedesmal in etwa verdoppelt. Das Ergebnis ist eine exponentielle Zunahme der Konzentration der Ziel-DNA, was als "Vermehrung" bzw. "Verstärkung" ("Am plification") der Ziel-DNA bekannt ist. Das Verfahren der Polymerase-Kettenreaktion wird vollständiger in den U.S.-Patenten Nr. 4,683,202 und Nr. 4,683,195 beschrieben.

Bei einem Ausführungsbeispiel der Erfindung wird eine Lö sung mit einem Volumen in dem Bereich von etwa 1 µL bis 500 µL und vorzugsweise 10 µL bis 200 µL, die die zu vermehren de Probe und geeignete Puffer und Reagenzien enthält, über jegliches geeignete Verfahren in den Mikroreaktor einge bracht. Das Einbringen der Probe wird unter Verwendung jeg licher geeigneten Einrichtung, einschließlich der elektro kinetischen Einspritzung, der hydrodynamischen Einsprit zung, der spontanen Fluidverdrängung und dergleichen, er zielt. Die spezielle verwendete Einrichtung wird vor allem von der Konfiguration des Kanals sowie der Notwendigkeit, ein präzises Probenvolumen einzubringen, abhängen. Wenn beispielsweise die verwendete Mikrokanalkonfiguration einen zweiten Mikrokanal aufweist, der den ersten oder Haupt- Mikrokanal schneidet, umfaßt, kann der zweite Kanal mit der Probe befüllt werden, die durch Anlegen eines geeigneten elektrischen Feldes in den Hauptmikrokanal bewegt wird.

Sobald das Probenfluid in die Reaktionskammer geleitet wor den ist, wird der Mikroreaktor einem Wärme-Hin-und-Her- Steuervorgang unterzogen. Der Thermo-Hin-und-Her- Steuervorgang wird im allgemeinen einen Denaturierungs schritt bei etwa 93°C bis etwa 95°C für etwa 5 bis 30 Se kunden, einen Entspannungsschritt bei etwa 50°C bis etwa 65°C für 2 bis 20 Sekunden und einen Polymerisationsschritt bei etwa 72°C für 5 bis 30 Sekunden umfassen. Die Probe wird im allgemeinen 30 oder mehr Zyklen ausgesetzt, um die gewünschte Vermehrung zu erzeugen. Der Wärme-Hin-und-Her- Steuervorgang kann durch jegliches geeignete und bequeme Verfahren erzielt werden. Kommerzielle Wärme-Hin-und-Her- Steuereinrichtungen, wie z. B. der RapidCycler® von Idaho Technologies und der GeneAmp 2400® von PE-Applied Biosy stems, sind verfügbar, wobei ein Wärme-Hin-und-Her- Steuervorgang ferner unter Verwendung einer Peltierplatte oder einer anderen Heizblockvorrichtung durchgeführt werden kann. Solche Verfahren und Vorrichtungen sind für Fachleute auf dem Gebiet wohlbekannt. Alternativ ist ein Wär me-Hin-und-Her-Steuervorgang unter Verwendung einer Wolframlampe als eine Infrarotstrahlungsquelle und mit einer Abkühlung, die durch eine Silenoid-torgesteuerte Quelle mit kompri mierter Luft bewirkt wird, ein geeignetes Verfahren.

Nachdem der Wärme-Hin-und-Her-Steuervorgang abgeschlossen ist, wird der Mikroreaktor auf eine Temperatur von etwa 4°C abgekühlt, wobei die vermehrte Probe für eine anschließende Analyse, Prozeßverarbeitung, Behandlung oder eine Untersu chung entfernt wird. Die Probe wird über das Auslaßtor ent fernt und kann dann unter Verwendung jeglicher geeigneter Technik extrahiert werden.

Es wird darauf hingewiesen, daß, obwohl die vorhergehende Beschreibung die bevorzugten Ausführungsbeispiele der vor liegenden Erfindung veranschaulicht, der Mikroreaktor gemäß der Erfindung verwendet werden kann, um eine andere Nu cleinsäurevermehrung und/oder andere Reaktionstechniken ne ben der PCR auszuführen. Das im vorhergehenden beschriebe ne Beispiel ist lediglich exemplarisch. Diese Techniken um fassen die Ligasekettenreaktion und die Reparaturkettenre aktion, wie sie in Abramson et al. (1993) Current Opinion in Biotechnolgoy 4: 41-47 erörtert werden. Die Ligaseketten reaktion wird ferner in Barany (1991) PCR Methods and App lications 1: 5-16 erörtert. Andere Verfahren, für die die Erfindung verwendet werden kann, umfassen das 3SR- Verfahren, das in Fahy et al. (1991), PCR Methods and App lications 1: 25-33 offenbart wird und die Strangversetzungs untersuchung (SDA; SDA = Strand Displacement Assay), die in Walker et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 392-396 erörtert wird.

Alle diese zusätzlichen Techniken umfassen Reaktionsmi schungen, die Denaturierungs-, Entspannungs- und Erweite rungsprozessen unterzogen werden. Dieselben unterscheiden sich hauptsächlich lediglich in den spezifischen Erweite rungsmechanismen, die bei dem Primererweiterungsprozeß ver wendet werden, bei dem die angelagerten Oligonucleotide er weitert werden, um den Zielstrang nachzubilden bzw. zu re plizieren. Die Reparaturkettenreaktion und die LCR umfassen einen sich wiederholenden Wärme-Hin-und-Her-Steuervorgang. Die 3SR- und SDA-Verfahren umfassen einen Anfangsdenaturie rungsschritt, der durch eine isotherme Inkubation für die Entspannungs- und Streckungsprozesse gefolgt wird.

Weitere mögliche Anwendungen der im vorhergehenden be schriebenen Geräte können ferner die cDNA-Synthese vor der PCR, die Ligation und die Kinase der DNA und anschließende Enzymbehandlungen umfassen, bei denen Reagenzienzusätze während der Inkubationen oder des Wärme-Hin-und-Her- Steuervorganges erforderlich sein können. Folglich sind die Ausführungsbeispiele der Erfindung Gegenstand von Modifi zierung, Variation und Änderung, ohne den korrekten Schutz bereich der beiliegenden Ansprüche zu verlassen. Dement sprechend sollen alle solche Änderungen, Modifizierungen und Variationen, die in den Schutzbereich der beiliegenden Ansprüche fallen, umfaßt sein. Alle Patentanmeldungen, Pa tente und andere Veröffentlichungen, die hierin genannt wurden, werden in ihrer Gesamtheit unter Bezugnahme aufgenommen.

Es wird darauf hingewiesen, daß, obwohl die Erfindung in dem Zusammenhang mit bevorzugten spezifischen Ausführungs beispielen derselben beschrieben worden ist, die vorherge hende Beschreibung lediglich exemplarisch und nicht den Schutzbereich der Erfindung begrenzend sein soll. Andere Aspekte, Vorteile und Modifikationen innerhalb des Schutz bereiches der Erfindung werden für Fachleute auf dem Ge biet, das die Erfindung betrifft, offenbar sein.

Alle Patente, Patentanmeldungen und Veröffentlichungen, die hierin erwähnt werden, werden hiermit in ihrer Gesamtheit unter Bezugnahme aufgenommen.

Ein GeneAmp® EZ rTth RNA PCR Kit® und der GeneAmp® rTth DNA Polymerase & EZ Buffer Pack® (PE-Applied Biosystems) wurden bei einem Beispiel 1 verwendet, um ein 308-bp-DNA- Bruchstück bzw. Fragment unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung zu vermehren. Es wurde zunächst eine Master- Mischung aus den Reagenzien, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, präpariert. Alle Reagenzien ausgenommen von Wasser und PEG 8000 wurden von dem GeneAmp® EZ rTth RNA PCR Kit® und dem GeneAmp® rTth DNA Polymerase & EZ Buffer Pack® er halten. Das PEG 8000 wurde von Sigma erhalten und war nu cleasefrei.

10 µL der Master-Mischung wurde in eine 200-µm- Innendurchmesser-12-Zoll- (30-cm-) Kapton®-Polyimidkapilla renröhre aufgebracht, die von Microlumen erhalten wurde.

Die Probe wurde in die Kapillarenröhrenrohrleitung über ei ne Kapillarwirkung geladen, wobei die Enden der Kapillar röhre unter Verwendung eines schnell aushärtenden Epoxids abgedichtet wurden. Die Röhre wurde daraufhin in eine dünn wandige 0,2-mL-PCR-Röhre eingefügt, wobei die ganze Ein heit in eine Thermo-Hin-und-Her-Steuereinrichtung Idaho Technology RapidCycler® plaziert wurde. Die Probe wurde unter Verwendung der folgenden Hin-und-Her-Steuersequenz einem Wärme-Hin-und-Her-Steuervorgang unterzogen.
1. 10 Minuten bei 94°C;
2. 30 Sekunden bei 94°C;
3. 15 Sekunden bei 61°C;
4. 30 Sekunden bei 72°C;
5. 10 Minuten bei 72°C; und
6. gespeichert bis zur Verwendung bei 4°C.

Schritte 2-4 wurden in 35 Zyklen wiederholt.

Das Produkt wurde entfernt und bei 4°C gespeichert. Ein aliquoter Teil von 3,5 µL des gespeicherten Produktes wurde in eine 0,5-mL-Phiale plaziert, wobei 3,5 µL des 2x- Lastpuffers, das 2x SyberGreen I® (Molecular Probes) ent hält, hinzugefügt wurde. Die Lösung wurde bei Dunkelheit 15 Minuten lang bei Zimmertemperatur bebrütet bzw. inkubiert, wobei eine Vermehrung über Agarosegelelektrophorese unter Verwendung eines 2%-NuSieve-3 : 1-Agarose-Gels bei 4°C unter Verwendung von 70 V für 2 Stunden und 45 Minuten bestärkt wurde.

Tabelle 1 Master-Mischung-Reagenzien

Komponente
Volumen (µL)
Wasser	19,25
PEG 8000	3,75
5X-EZ-Puffer®	10,0
dGTP	1,5
dATP	1,5
dTTP	1,5
dCTP	1,5
rTth-DNA-Polymerase	2,0
Mn(OAc)₂-Lösung, 25 mM	5,0
Primer DM 151	1,5
Primer DM 152	1,5
pAW109-RNA	1,0

Das Verfahren, das bei Beispiel 1 verwendet wurde, wurde 7mal unter Verwendung der Polyimidkapillarenrohrleitung, die verschiedenen Verfahren der Behandlung unterzogen wurde, und einer 380-µm-Innendurchmesser-Polyethylenröhre wieder holt. Das Produkt, das bei Beispiel 1 erzeugt wurde, und jedes der Produkte, die unter Verwendung der vorbehandelten Kapillarrohrleitung und der Polyethylenrohrleitung erhalten wurden, wurde einer Agarosegelelektrophorese unter Verwen dung eines 2%-NuSieve-3 : 1-Agarose-Gels bei 4°C unter Ver wendung von 70 V für 2 Stunden und 45 Minuten unterzogen. Die Ergebnisse der Elektrophorese sind in Fig. 9 darge stellt. Eine Tabellenaufstellung der Beispiele, der Behand lungen und der Säulennummer in Fig. 9 sind in Tabelle 2 dargestellt.

Das Verfahren, das in Beispiel 1 beschrieben ist, wurde verwendet, um unter Verwendung von Bovinserumalbomin (BSA) in einer 1 mg/mL-Konzentration in der Master-Mischung an stelle des PEG 8000 DAN zu vermehren.

Claims

1. Vorrichtung zum Durchführen einer Polymerase-Ketten reaktion (PCR), mit
einer Reaktionskammer, die durch zwei oder mehr Innen oberflächen definiert ist;
einer Einrichtung (27; 47) zum Einbringen von PCR- Reaktionskomponenten in die Kammer;
einer Einrichtung (29; 49) zum Entfernen des PCR- Reaktionsprodukts aus der Kammer; und
einer Einrichtung zum Steuern der Temperatur der Reak tionskammer,
wobei die Vorrichtung aus einem Material hergestellt ist, das unter den Bedingungen, bei denen eine PCR- Reaktion durchgeführt wird, thermisch, chemisch und mechanisch stabil ist, und wobei dieselbe eine Reakti onskammer verwendet, die angepaßt ist, um Fluid in dem Bereich von etwa 1 µl bis 500 µl zu enthalten.

2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der die Reaktions kammer angepaßt ist, um Fluid in dem Bereich von etwa 10 µl bis 200 µl zu enthalten.

3. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder 2, bei der das Mate rial ein Polymer ist.

4. Vorrichtung gemäß Anspruch 3, bei der das Material bei Temperaturen in dem Bereich von 37°C bis 94°C stabil ist.

5. Vorrichtung gemäß Anspruch 3 oder 4, bei der das Mate rial eine Glasübergangstemperatur T_g von zumindest et wa 100°C aufweist.

6. Vorrichtung gemäß Anspruch 5, bei der das Material ei ne Glasübergangstemperatur T_g in dem Bereich von etwa 100°C bis 150°C aufweist.

7. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6, bei der das Material aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polyimiden, Polykarbonaten, Polyestern, Polyamiden, Polyethern, Polyurethanen, Polyfluorokarbonen, Poly styrenen, Poly(Acrylonitril-Butadien-Styren), Poly methylmethacrylat, Polyolefinen und Copolymeren der selben besteht.

8. Vorrichtung gemäß Anspruch 7, bei der das Material Po lyimid ist.

9. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, bei der das Material derart ist, daß in demselben Merkmale mit hoher Definiertheit hergestellt werden können.

10. Vorrichtung gemäß Anspruch 9, bei der die Merkmale Mi krokanäle mit einem Durchmesser von etwa 1 µm bis 200 µm aufweisen.

11. Vorrichtung gemäß Anspruch 10, bei der die Merkmale Mikrokanäle mit einem Durchmesser von etwa 10 µm bis 75 µm aufweisen.

12. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, bei der die Substratoberfläche behandelt ist, um die ther mische Stabilität, die chemische Stabilität und die Biobewuchsresistenz zu erhöhen.

13. Vorrichtung gemäß Anspruch 12, bei der die Oberflä chenbehandlung die Bildung einer Polyethylenoxid schicht aufweist.

14. Vorrichtung gemäß Anspruch 12, bei der die Oberflä chenbehandlung die Bildung einer Schicht aus Bovinse rumalbomin aufweist.

15. Mikroreaktor (31) zum Vermehren von DNA unter Verwen dung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), mit
einem Substrat (33) mit einer ersten und einer zweiten im wesentlichen planaren Oberfläche, die sich gegen über liegen, wobei das Substrat einen Hohlraum und zu mindest einen Mikrokanal (39, 41) aufweist, die in der ersten planaren Oberfläche (35) gebildet sind, und wo bei der Hohlraum als eine Reaktionszone (37) dient, die sich in einer Fluidkommunikation mit jedem Mikro kanal befindet; und
einer Abdeckplatte (43), die über der ersten planaren Oberfläche (35) angeordnet ist, wobei die Abdeckplatte in Kombination mit dem Hohlraum eine Reaktionskammer und mit jedem Mikrokanal eine Mikrosäule definiert; und
zumindest einem Einlaßtor (47) und zumindest einem Auslaßtor (49), die direkt oder indirekt mit der Reak tionskammer kommunikativ verbunden sind, wobei die To re den Durchtritt eines Fluides von einer externen Quelle in und durch die Reaktionskammer ermöglichen, wodurch ein Fluidflußweg definiert wird;
wobei das Substrat (33) und die Abdeckplatte (43) aus einem Material bestehen, das unter den Bedingungen, die zum Durchführen einer PCR-Vermehrung von DNA ver wendet werden, stabil und resistent gegen Biobewuchs ist.

16. Mikroreaktor gemäß Anspruch 15, bei dem das Substrat material verglichen zu einem Substrat, das aus einem Silizium-enthaltenden Material gebildet ist, eine re duzierte Adsorption von gelösten Stoffen liefert.

17. Mikroreaktor gemäß Anspruch 15 oder 16, bei dem das Substratmaterial modifiziert sein kann, um den elek troosmotischen Fluß eines fließenden Fluids, das sich mit demselben in Kontakt befindet, zu verändern.

18. Mikroreaktor gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17, bei dem das Substratmaterial ein Polymer ist.

19. Mikroreaktor gemäß Anspruch 18, bei dem das Substrat material aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polyi miden, Polykarbonaten, Polyestern, Polyamiden, Polye thern, Polyurethanen, Polyfluorokarbonen, Polystyre nen, Poly(Acrylonitril-Butadien-Styren), Polymethyl methacrylat, Polyolefinen und Copolymeren derselben besteht.

20. Mikroreaktor gemäß Anspruch 19, bei dem das Substrat (33) aus Polyimid besteht.

21. Mikroreaktor gemäß einem der Ansprüche 15 bis 20, bei dem die Substratoberfläche behandelt ist, um die ther mische Stabilität, die chemische Stabilität und die Biobewuchsresistenz weiter zu erhöhen.

22. Mikroreaktor gemäß Anspruch 21, bei dem die Oberflä chenbehandlung die Bildung einer Polyethylenoxid schicht aufweist.

23. Mikroreaktor gemäß Anspruch 21, bei dem die Oberflä chenbehandlung die Bildung einer Schicht aus Bovinse rumalbomin aufweist.

24. Mikroreaktor gemäß einem der Ansprüche 15 bis 23, der ferner einen zusätzlichen Hohlraum aufweist, der in der ersten planaren Oberfläche (57) gebildet ist und in Kombination mit der Abdeckplatte eine zusätzliche Reaktionskammer zum Durchführen einer PCR-Vermehrung von DNA bildet.

25. Mikroreaktor gemäß einem der Ansprüche 15 bis 24, bei dem die Reaktionskammer eine stromaufwärtige Region, in der ein Fluid eingebracht wird, und eine stromab wärtige Region, aus der das Fluid austritt, aufweist, und bei dem der zumindest eine Mikrokanal (39, 41) ei nen stromaufwärtigen Mikrokanal (39), der sich in ei ner Fluidkommunikation mit der stromaufwärtigen Region der Reaktionskammer befindet, und einen stromabwärti gen Mikrokanal (41), der sich in einer Fluidkommunika tion mit der stromabwärtigen Region der Reaktionskam mer befindet, aufweist.

26. Mikroreaktor gemäß Anspruch 25, bei dem der stromauf wärtige Mikrokanal (39) in Kombination mit der Abdeck platte (43) eine stromaufwärtige Mikrosäule bildet, und der stromabwärtige Mikrokanal (41) in Kombination mit der Abdeckplatte (43) eine stromabwärtige Mikro säule bildet.

27. Mikroreaktor gemäß einem der Ansprüche 15 bis 26, der ferner eine Antriebseinrichtung aufweist, um ein Fluid durch den Fluidflußweg zu bewegen.

28. Mikroreaktor gemäß Anspruch 27, bei der die An triebseinrichtung eine Einrichtung zum Anlegen einer Spannungsdifferenz aufweist.

29. Mikroreaktor gemäß Anspruch 27, bei der die An triebseinrichtung eine Einrichtung zum Anlegen einer Druckdifferenz aufweist.

30. Mikroreaktor gemäß einem der Ansprüche 16 bis 29, bei der die Reaktionskammer proportioniert ist, um etwa 1 µl bis 500 µl Fluid zu enthalten.

31. Mikroreaktor gemäß Anspruch 30, bei der die Reaktions kammer proportioniert ist, um etwa 10 µl bis 200 µl Fluid zu enthalten.

32. Mikroreaktor gemäß einem der Ansprüche 15 bis 31, bei dem der zumindest eine Mikrokanal (39, 41) einen Durchmesser von 1 µm bis 200 µm aufweist.

33. Mikroreaktor gemäß Anspruch 32, bei dem der zumindest eine Mikrokanal (39, 41) einen Durchmesser von etwa 10 µm bis 75 µm aufweist.

34. Verfahren zum Durchführen der Polymerase-Ketten reaktion (PCR), um DNA in einer Probe zu vermehren, mit folgenden Schritten:
Erhitzen der Probe, um die doppelsträngige DNA in eine einzelsträngige DNA zu trennen;
Abkühlen der Probe, um eine Hybridisierung von Prime roligonucleotiden zu der einzelsträngigen DNA zu er möglichen;
Replizieren der DNA unter Verwendung einer DNA-Poly merase; und
Wiederholen der im vorhergehenden erwähnten Schritte, um den gewünschten Grad an Vermehrung zu erzielen,
wobei das Verfahren ferner folgenden Schritt aufweist:
Durchführen der PCR in einem Mikroreaktor, der aus einem Material besteht, das unter den Bedingungen, bei denen die PCR-Reaktion durchgeführt wird, thermisch, chemisch und mechanisch stabil ist, und der eine Reak tionskammer verwendet, die angepaßt ist, um etwa 1 µl bis 500 µl Fluid zu enthalten.

35. Verfahren gemäß Anspruch 34, bei dem die Reaktionskam mer angepaßt ist, um Fluid in dem Bereich von etwa 10 µl bis 200 µl zu enthalten.

36. Verfahren gemäß Anspruch 34 oder 35, bei dem das Mate rial ein Polymer ist.

37. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 34 bis 36, bei dem das Material bei Temperaturen in dem Bereich von etwa 37°C bis 94°C stabil ist.

38. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 34 bis 37, bei dem das Material eine Glasübergangstemperatur T_g von zu mindest etwa 100°C aufweist.

39. Verfahren gemäß Anspruch 38, bei dem das Material eine Glasübergangstemperatur T_g in dem Bereich von etwa 100°C bis 150°C aufweist.

40. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 35 bis 39, bei dem das Material aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polyimiden, Polykarbonaten, Polyestern, Polyamiden, Polyethern, Polyurethanen, Polyfluorokarbonen, Poly styrenen, Poly(Acrylonitril-Butadien-Styren), Poly methylmethacrylat, Polyolefinen und Copolymeren der selben besteht.

41. Verfahren gemäß Anspruch 40, bei dem Material Polyimid ist.

42. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 34 bis 41, bei dem das Material derart ist, daß in demselben Merkmale mit hoher Definiertheit hergestellt werden können.

43. Verfahren gemäß Anspruch 42, bei dem die Merkmale Mi krokanäle mit einem Durchmesser von etwa 1 µm bis 200 µm aufweisen.

44. Verfahren gemäß Anspruch 43, bei dem die Merkmale Mi krokanäle mit einem Durchmesser von etwa 10 µm bis 75 µm aufweisen.

45. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 34 bis 44, bei dem die Substratoberfläche behandelt ist, um die thermi sche Stabilität, die chemische Stabilität und die Bio bewuchsresistenz zu erhöhen.

46. Verfahren gemäß Anspruch 45, bei dem die Oberflächen behandlung die Bildung einer Polyethylenoxidschicht aufweist.

47. Verfahren gemäß Anspruch 45, bei dem die Oberflächen behandlung die Bildung einer Schicht aus Bovinserumal bomin aufweist.

48. Verfahren zum Vermehren der Menge eines interessieren den DNA-Moleküls, das in einem kleinen Volumen eines Probenfluids enthalten ist, unter Verwendung der Poly merase-Kettenreaktion, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:

a) Einbringen von bis zu etwa 10 µl eines Probenflu ids, das das interessierende DNA-Molekül in dop pelsträngiger Form, ein erstes und ein zweites Primermolekül, das zu entgegengesetzten Strängen des DNA-Moleküls komplementär ist, eine thermo stabile DNA-Polymerase, freie Desoxynucleosid triphosphate und einen PCR-Puffer enthält, in ei nen Mikroreaktor, wobei der Mikroreaktor folgende Merkmale aufweist:
ein Substrat (33) mit einer ersten und einer zweiten im wesentlichen planaren Oberfläche, die sich gegenüber liegen, wobei das Substrat (33) einen Hohlraum aufweist, der in der ersten plana ren Oberfläche gebildet ist, und wobei der Hohl raum als eine Reaktionszone (37) dient,
eine Abdeckplatte (43), die über der ersten pla naren Oberfläche (35) angeordnet ist, wobei die Abdeckplatte (43) in Kombination mit dem Hohlraum eine Reaktionskammer definiert, und
zumindest einem Einlaßtor (47) und zumindest ei nem Auslaßtor (49), die sich in einer Fluidkommu nikation mit der Reaktionskammer befinden, wobei die Tore den Durchtritt eines Probenfluids von einer externen Quelle in und durch die Reaktions kammer ermöglichen, wodurch ein Fluidflußweg de finiert wird,
wobei das Substrat (33) und die Abdeckplatte (43) aus einem Material bestehen, das thermisch stabil und resistent gegen Biobewuchs ist;
b) Anlegen einer Antriebskraft an die Vorrichtung, um das Probenfluid entlang des Flußweges in die Reaktionskammer zu bewegen;
c) Erhitzen des Probenfluids in der Reaktionskammer, um die doppelsträngige DNA in eine einzelsträngi ge DNA zu trennen;
d) Abkühlen der Probe, um eine Hybridisierung der Primermoleküle zu entgegengesetzten Strängen der einzelsträngigen DNA und eine Replikation der einzelsträngigen DNA durch die DNA-Polymerase zu ermöglichen; und
e) Wiederholen der Schritte (c) und (d), um den ge wünschten Grad an Vermehrung zu erzielen.

49. Das Verfahren gemäß Anspruch 48, bei dem das Substrat material modifiziert sein kann, um den elektroosmoti schen Fluß eines fließenden Fluids, das sich in Kon takt mit demselben befindet, zu verändern.

50. Verfahren gemäß Anspruch 49, bei dem das Substratmate rial ein Polymer ist.

51. Verfahren gemäß Anspruch 50, bei dem das Material aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polyimiden, Poly karbonaten, Polyestern, Polyamiden, Polyethern, Polyu rethanen, Polyfluorokarbonen, Polystyrenen, Po ly(Acrylonitril-Butadien-Styren), Polymethylmethacry lat, Polyolefinen und Copolymeren derselben besteht.

52. Verfahren gemäß Anspruch 51, bei dem das Substrat aus Polyimid besteht.

53. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 48 bis 52, bei dem die Substratoberfläche behandelt ist, um die thermi sche Stabilität, die chemische Stabilität und die Bio bewuchsresistenz weiter zu erhöhen.

54. Verfahren gemäß Anspruch 53, bei dem die Oberflächen behandlung die Bildung einer Polyethylenoxidschicht aufweist.

55. Verfahren gemäß Anspruch 53, bei der die Oberflächen behandlung die Bildung einer Schicht aus Bovinserumal bomin aufweist.

56. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 48 bis 55, bei dem die Vorrichtung ferner einen zusätzlichen Hohlraum aufweist, der in der ersten planaren Oberfläche gebil det ist und in Kombination mit der Abdeckplatte eine zusätzliche PCR-Reaktionskammer bildet.

57. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 48 bis 56, bei dem die Antriebseinrichtung eine Einrichtung zum Anlegen einer Spannungsdifferenz aufweist.

58. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 48 bis 56, bei dem die Antriebseinrichtung eine Einrichtung zum Anlegen einer Druckdifferenz aufweist.

59. Verfahren zum Vermehren der Menge eines interessieren den DNA-Moleküls, das in einem kleinen Volumen eines Probenfluids enthalten ist, unter Verwendung der Poly merase-Kettenreaktion, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:

a) Einbringen von bis zu etwa 10 µl eines Probenflu ids, das das interessierende DNA-Molekül in dop pelsträngiger Form, ein erstes und ein zweites Primermolekül, die zu entgegengesetzten Strängen des DNA-Moleküls komplementär sind, eine thermo stabile DNA-Polymerase, freie Desoxynucleosid triphosphate und einen PCR-Puffer enthält, in ei nen Mikroreaktor, wobei der Mikroreaktor folgende Merkmale aufweist:
ein Substrat (33) mit einer ersten und einer zweiten im wesentlichen planaren Oberfläche, die sich gegenüber liegen, wobei in der ersten plana ren Oberfläche des Substrates (33) ein Hohlraum und zumindest ein Mikrokanal (39, 41) gebildet sind, und wobei der Hohlraum als eine Reaktions zone (37) dient, die sich in einer Fluidkommuni kation mit jedem Mikrokanal (39, 41) befindet,
eine Abdeckplatte (43), die über der ersten pla naren Oberfläche (35) angeordnet ist, wobei die Abdeckplatte (43) in Kombination mit dem Hohlraum eine Reaktionskammer und mit jedem Mikrokanal (39, 41) eine Mikrosäule definiert, und
zumindest ein Einlaßtor (47) und zumindest ein Auslaßtor (49), die mit der Reaktionskammer di rekt oder indirekt kommunikativ verbunden sind, wobei die Tore (47, 49) den Durchtritt eines Pro benfluids von einer externen Quelle in und durch die Reaktionskammer ermöglichen, wodurch ein Fluid flußweg definiert wird,
wobei das Substrat (33) und die Abdeckplatte (43) aus einem Material bestehen, das thermisch stabil und resistent gegen Biobewuchs ist;
b) Anlegen einer Antriebskraft an die Vorrichtung, um das Probenfluid entlang des Flußweges in die Reaktionskammer zu bewegen;
c) Erhitzen des Probenfluids in der Reaktionskammer um die doppelsträngige DNA in eine einzelsträngi ge DNA zu trennen;
d) Abkühlen der Probe, um eine Hybridisierung der Primermoleküle zu entgegengesetzten Strängen der einzelsträngigen DNA und eine Replikation der einzelsträngigen DNA durch die DNA-Polymerase zu ermöglichen; und
e) Wiederholen der Schritte (c) und (d), um den ge wünschten Grad an Vermehrung zu erzielen.

60. Verfahren gemäß Anspruch 59, das ferner das Sammeln des Reaktionsproduktes an dem Auslaßtor aufweist.