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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft
allgemein das Gebiet der chemischen Prozesse und insbesondere eine
integrierte Einrichtung zum Analysieren einer Fluidprobe.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Es gibt viele Anwendungen auf dem
Gebiet der chemischen Prozesse, bei welchen es wünschenswert ist, chemische
Komponenten vor oder nach dem Reagierenlassen von Chemikalien zu
separieren. Beispiele von Reaktionen, die die Separierung von Komponenten
erfordern, beinhalten organische, anorganische, biochemische und
molekulare Reaktionen. Beispiele für chemische Reaktionen beinhalten
die thermische Durchlaufamplifikation wie beispielsweise die Polymerase-Kettenreaktion
(polymerase chain reaction, PCR), die Ligase-Kettenreaktion (ligase
chain reaction, LCR), die isothermische Nukleinsäure-Amplifikation, die selbst-haltende
Sequenzreplikation, Enzym-kinetische Studien, homogene Ligand-bindende
Untersuchungen, affinitätsbindende
Studien sowie komplexere biochemische mechanistische Studien. Herkömmliche
Separationstechniken beinhalten die Elektrophorese wie beispielsweise
die kapillare Elektrophorese, die synchronisierte Umlauf-Elektrophorese
sowie die Freiströmungs-Elektrophorese.
Herkömmliche
Separationstechniken beinhalten auch das isoelektrische Fokussieren
(IEF), die Hybridisierung, die Flüssigkeits- und Gas-Chromatographie
und das molekulare Sieben und Filtern.
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In verschiedenen Proben zu separierende Komponenten
beinhalten Nukleinsäuren,
Aminosäuren,
Peptide, Proteine, Zellen, Viren, Bakterien, organische Verbindungen,
Kohlehydrate, etc.. Beispielsweise können in Amplifikations-Anwendungen
multiple Oligonukleotid-Primer und -Tester, die für viele Organismen
ausgebildet sind, dazu verwendet werden, DNA von einer Vielzahl von
Organismen in einer Probe zu vervielfachen. Nach der Amplifikation
können
Separationstechniken wie beispielsweise Elektrophorese oder IEF
verwendet werden, um die Amplifikationsprodukte nach gewünschten
Eigenschaften, wie beispielsweise ihr Molekulargewicht, zu separieren,
und zwar für
die anschließende
Erfassung mittels Fluoreszenzverfahren.
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Auf dem Gebiet der chemische Separation wird
die Verwendung von Einrichtungen, die eine Reaktionskammer mit integriertem
Separationsbereich verwenden, immer interessanter. Solche integrierten Einrichtungen
haben eine Anzahl von Vorteilen bezüglich herkömmlicher Einrichtungen, bei
denen man eine Fluidprobe zwischen einer Reaktionsvorrichtung und
einer Separationseinrichtung befördert.
Wo die chemische Reaktion und Separationsschritte in einer einzigen
integrierten Einrichtung ausgeführt
werden, kann man beispielsweise eine Kontaminierung und eine Überleitung
von Proben oder Reaktionsprodukten vermeiden. Außerdem kann eine solche integrierte
Einrichtung eine wesentlich schnellere Bearbeitung und Analyse von
Proben ermöglichen.
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Neuere Versuche, in einer einzigen
Vorrichtung Bearbeitungs- und
analytische Funktionalitäten zu
integrieren, insbesondere auf dem Gebiet der MEMS, der Mikrofabrikation
und der Mikroströmungslehre,
haben zu der Entwicklung von Einrichtungen geführt, die mehrere, miteinander
verbundene Substrate beinhalten. Diese Substrate sind normalerweise
mit Klebstoff oder durch Heißkleben, Schmelzverbinden
oder anodisches Verbinden miteinander verbunden. Diese Multisubtrateinrichtungen beinhalten
typischerweise eine Reaktionskammer, die mit einer separaten Separationskomponente
verbunden ist, wie beispielsweise mit einer Kapillarröhre, die
ein geeignetes Elektrophorese-Gel aufweist, und zwar mittels eines
Klebstoffs wie beispielsweise Epoxy. Alternativ haben diese Multisubtrateinrichtungen
Reaktionskammer und Separationskanäle, die in eine Platte hineingeätzt sind
und eine oben auf die Platte aufgeklebte Abdeckung. Beispielsweise
offenbart das US-Patent 5,849,208 von Hayes et al. eine solche Multisubstrateinrichtung.
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Diese Multisubstrateinrichtungen
haben jedoch viele Nachteile. Zunächst wird hinsichtlich der Gleichmäßigkeit
zwischen Einrichtungen während des
Verklebens der Substrate oft ein Kompromiss geschlossen. Zweitens
ist die Massenproduktion dieser Multisubstrateinrichtungen kostenintensiv,
arbeitsintensiv, schwierig zu automatisieren und daher unpraktisch.
Beispielsweise ist beim Aufbringen von Klebstoffen wie beispielsweise
Epoxy das Isolieren des Epoxy auf nur spezifische Bereiche schwierig
zu implementieren und zu steuern auf einer Produktionsbasis, insbesondere
wo die Einrichtung kleine Mikrokanäle beinhaltet. Außerdem können Klebstoffe auch
Lecks zulassen und zu den Kosten der Einrichtung beitragen.
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Außerdem ermöglichen die gängigen integrierten
Einrichtungen nur eine begrenzte Steuerung des Fluids zwischen dem
Reaktions- und dem
Separationsbereich. Beispielsweise kann sich in einer Reaktionskammer
aufgrund der thermischen Expansion von Flüssigkeit oder Gas in diesem
Bereich, aufgrund der Ausbildung von Gasbläschen oder aufgrund der innerhalb
der Kammer ausgeführten
chemischen Reaktionen ein hoher Innendruck entwickeln. Dieser Druck,
kombiniert mit einer erhöhten
Temperatur innerhalb der Kammer, kann schädliche Einwirkungen auf fluidische
Komponenten und die Leistungsfähigkeit
stromaufwärts
und stromabwärts
der Reaktionskammer haben. Ein besonderes Problem ist der Strom
oder die Diffusion von Chemikalien von der Reaktionskammer in unerwünschte Bereiche
hinein, verursacht durch den erhöhten
Druck oder die erhöhte
Temperatur. Diese Situation ist besonders problematisch, wenn empfindliche
Erfassungsverfahren und Vorrichtungen sich stromabwärts der
Reaktionskammer befinden.
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Ein weiteres Problem mit herkömmlichen
integrierten Einrichtungen ist, dass, wenn die Reaktionskammer erwärmt wird,
um eine chemische Reaktion auszuführen, auch der Separationsbereich
erhitzt wird aufgrund der thermischen Leitung. Wenn dieser Separationsbereich
erwärmt
wird, verschlechtert sich jedoch das in diesem Bereich vorhandene Separationsmaterial,
beispielsweise das Elektrophorese-Gel, und dies führt dazu,
dass die Einrichtung nicht mehr funktioniert. Zusätzlich zu
der Verschlechterung des Separationsmaterials verursacht die thermische
Leitung zwischen der Reaktionskammer und dem Separationsbereich
große
thermische Gradienten innerhalb der Einrichtung und verhindert eine
adäquate
Erhitzung einer Probe in der Reaktionskammer.
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Wo der Separationsbereich Elektroden
erfordert, wie beispielsweise bei der kapillaren Elektrophorese,
der Mikro-Elektrophorese
und der IEF, gibt es außerdem
einige Punkte, die bei herkömmlichen Ausgestaltungen
nicht berücksichtigt
wurden. Der Stand der Technik hat sich meist auf Punkte konzentriert,
die die Ausgestaltung, die Herstellung und den Betrieb des Kapillarkanals
selbst betreffen. Im Gegensatz dazu ist die Ausgestaltung der Elektroden, die
in Kontakt mit dem Fluid sind und die für die elektrokinetische Bewegung
des Fluids verantwortlich sind, noch nicht adäquat behandelt worden. Die
korrekte Ausgestaltung dieser Elektroden ist notwendig für die korrekte,
praktische und kosteneffektive Implementierung von Einwegsystemen
mit großem
Volumen, die sowohl Reaktionskammern als auch Separationsbereiche
in einer einzelnen Einrichtung aufweisen. Im Stand der Technik werden
momentan große,
offene Reservoirs (100 μl
oder mehr) in der Nähe des
Endes jedes Kapillarkanals vorgesehen, und dann wird eine separate
Metallelektrode in jedes offene Reservoir hineingetaucht. Eine solche
plumpe Anordnung ist jedoch für
die Massenproduktion von Einwegeinheiten nicht geeignet. Außerdem sind
externe Elektroden, die in Kontakt mit dem Fluid in der Einwegeinheit
gebracht werden, im allgemeinen nicht praktisch, weil sie vor jeder
Verwendung eventuell gereinigt oder anderweitig "vorbereitet" werden müssen.
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ZUSAMMENFASSUNG
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Die vorliegende Erfindung schafft
eine integrierte Reaktions- und
Separationseinrichtung, die die oben diskutierten Nachteile des
Standes der Technik überwindet.
Insbesondere vermeidet die integrierte Einrichtung der vorliegenden
Erfindung die Verwendung von unbequemen Klebetechniken, was eine kostengünstige Produktion
der Einrichtung mit großem
Volumen ermöglicht.
Außerdem
beinhaltet die integrierte Einrichtung eine Reaktionskammer, die
von dem Separationsbereich thermisch isoliert ist, so dass die korrekte
Erwärmung
einer Probe ohne negative Beeinflussung des Separationsbereichs
möglich
ist.
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Die Einrichtung kann einen einheitlichen
Körper
aufweisen, vorzugsweise ein geformtes polymerisches Bauteil, in
dem eine Reaktionskammer zum chemischen Reagierenlassen einer Probe
ausgebildet ist, ein Separationsbereich zum Separieren von Komponenten
dieser Probe sowie ein Übergangsbereich,
der die Reaktionskammer mit dem Separationsbereich verbindet. Die
Reaktionskammer, der Übergangsbereich
und der Separationsbereich sind in dem einheitlichen Körper ausgeformt
und darin eingeschlossen. Außerdem
beinhaltet der Übergangsbereich
zumindest eine Flussbegrenzung zum Steuern des Fluidflusses zwischen
der Reaktionskammer und dem Separationsbereich. Außerdem hat der
Bereich des einheitlichen Körpers,
der den Übergangsbereich
definiert, eine geringere thermische Leitfähigkeit als der Bereich des
Körpers,
der die Reaktionskammer definiert, so dass der Übergangsbereich die Reaktionskammer
im wesentlichen von der Separationskammer thermisch isoliert.
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Der einheitliche Körper kann
von externen funktionalen Komponenten umgeben sein, wie beispielsweise
von Differentialdruckquellen, elektromotorischen Quellen, Heizern,
Lichtquellen und optischen Erfassern. In der bevorzugten Ausführungsform
ist die Reaktionskammer eine Amplifikationskammer zum Amplifizieren
oder Verstärken
von Nukleinsäure
in der Probe. Außerdem
weist in der bevorzugten Ausführungsform
der Separationsbereich eine Elektrophoresesäule oder eine Kapillare auf,
die ein geeignetes Matrixmaterial beinhaltet, wie beispielsweise
ein Elektrophorese-Gel oder einen Elektrophoresepuffer, um Nukleinsäurenfragmente
in der Probe zu separieren.
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Ein vollständigeres Verständnis der
vorliegenden Erfindung ergibt sich aus der nun folgenden Beschreibung
und den anliegenden Zeichnungen.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine schematische Ansicht einer einheitlichen Prozessiereinrichtung
mit einer integrierten Reaktionskammer, einem integrierten Übergangsbereich
sowie einem integrierten Kapillarelektrophorese-Separationsbereich gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung.
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2 ist
eine schematische Ansicht einer anderen Prozessiereinrichtung mit
einer integrierten Reaktionskammer, einem integrierten Übergangsbereich
sowie einem integrierten Hybridisierungs-Separationsbereich gemäß einer
zweiten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung.
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3A, B, C und E sind
schematische Ansichten von verschiedenen Variationen des Übergangsbereichs,
der eine Reaktionskammer und einen Separationsbereich gemäß der vorliegenden
Erfindung verbindet. 3A zeigt
einen Konstriktor in dem Übergangsbereich. 3B zeigt ein Zwei-Wege-Ventil.
Die 3C und 3D zeigen mehrere Zwei-Wege-Ventile
mit einem Einlasskanal. 3E zeigt
ein Drei-Wege-Ventil.
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4A ist
eine Draufsicht eines exemplarischen mechanischen Ventils gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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4B ist
eine Querschnittsansicht des Ventils der 4A.
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5 ist
eine perspektivische Ansicht einer chemischen Reaktions- und Separationseinrichtung gemäß einer
dritten Ausführungsform
der Erfindung.
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6 ist
eine schematische Ansicht einer anderen chemischen Reaktions- und
Separationseinrichtung gemäß einer
vierten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG
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Die vorliegende Erfindung schafft
eine integrierte Einrichtung für
das Prozessieren einer Fluidprobe. Die Einrichtung weist eine Reaktionskammer auf,
einen Produktseparationsbereich sowie einen Fluidübergangsbereich,
der die Reaktionskammer mit dem Separationsbereich verbindet. Die
Reaktionskammer, der Übergangsbereich
und der Separationsbereich können
in einem einzelnen einheitlichen Körper ausgebildet und darin
eingeschlossen sein, vorzugsweise einem geformten Bauteil aus einem polymerischen
Material. Der Ausdruck "einheitlich" soll hier bedeuten,
dass der Körper
der Einrichtung, der die Reaktionskammer, den Übergangsbereich und den Separationsbereich
bildet, ein einzelnes Bauteil ist. Dieses einheitliche Design ermöglicht die kostengünstige Massenproduktion
der Einrichtung.
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Im Betrieb wird eine Fluidprobe von
einem Bereich zu einem anderen bewegt, und das Fließen dieser
Probe wird zwischen Bereichen gesteuert. Es kann mehr als eine Reaktionskammer,
mehr als einen Übergangsbereich
oder mehr als einen Separation in einer einzelnen integrierten Einrichtung
geben. Auch vorgesehen ist eine Einrichtung wie die beschriebene,
bei der zumindest eine Elektrode angrenzend an zumindest einen der
Bereiche in dem Körper
eingebettet ist. Die Elektroden können in trockener oder beschichteter
Form vorliegen. Der Körper
der Einrichtung kann von externen funktionalen Komponenten wie beispielsweise
elektromotorischen Quellen, Heizern, Lichtquellen und optischen
Erfassern umgeben sein. Die Einrichtung kann auch eine Komponente
eines größeren Systems
sein, beispielsweise einer Fluidflusspatrone, die andere chemische
Prozessierfunktionalitäten
hat. Eine solche Patrone ist in der ebenfalls anhängigen Patentanmeldung
PCT/US98/27632 beschrieben, die am 24. Dezember 1998 angemeldet
wurde und deren Offenbarung hierin durch Bezug aufgenommen wird.
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Der Körper kann aus einem Polymer
sein, aus Keramik oder aus einem anderen Material, das das Ausformen
der Kammern und Kanäle
direkt in das Material hinein ermöglicht. Der Körper kann
verschiedene Gestalten und Größen haben.
Das interne Netzwerk von Kammern und Kanälen kann in einem makroskopischen,
einem mikroskopischen oder einem dazwischen liegenden Maßstab vorliegen
oder auch eine Kombination daraus bilden. Beispielsweise kann die
Einrichtung eine makroskopische Reaktionskammer beinhalten, die
zu einem Mikrokanal-Übergangsbereich
und Separationsbereich führt. Im
allgemeinen beinhaltet die integrierte Einrichtung der vorliegenden
Erfindung zumindest eine Reaktionskammer in Fluidverbindung mit
zumindest einem Separationsbereich durch zumindest einen Übergangsbereich.
Eine Vielzahl von Kombinationen von Kammern, Übergangsbereichen und Separationsbereichen
sollen in den Bereich der Erfindung fallen. Beispielsweise kann
ein Separationsbereich einer Reaktionskammer vorangehen und/oder
von der Kammer ausgehen. Es können
auch mehrere Separationsbereiche in Reihe oder parallel angeschlossen sein.
Diese Separationsbereiche können
verschieden ausgestaltet sein und jeweils unterschiedliche Separationsfunktionen
erfüllen.
Beispielsweise kann eine Reaktionskammer durch einen Übergangsbereich
hindurch zu einer Hybridisierungsstelle führen, die ihrerseits zu einem
Elektrophoresekanal führt.
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1 zeigt
eine Ausführungsform
einer Prozessiereinrichtung 2, die durch einen einheitlichen Körper 4 gebildet
wird. In dem Körper 4 sind
eine Reaktionskammer 6, ein Separationsbereich 8 sowie ein Übergangsbereich 10 ausgeformt,
der die Reaktionskammer mit dem Separationsbereich verbindet. Die
Reaktionskammer 6 hat eine Einlassöffnung 12 zum Einbringen
einer Probe und von Reagenten, wie für die in der Kammer ausgeführte jeweilige
Reaktion erforderlich. Die Einrichtung 2 kann auch eine
Auslassöffnung
zusätzlich
zu der Einlassöffnung 12 beinhalten.
Die Öffnungen
können
dazu dienen, die Einrichtung mit einer externen Pumpe, Vakuumquelle oder
Spritze zu verbinden. Alternativ können die Öffnungen auch zur Belüftung dienen.
In dieser Ausführungsform
ist der Separationsbereich 8 eine Kapillar-Elektrophoreseröhre 14,
in der sich ein geeignetes Separationsmaterial befindet, beispielsweise Elektrophorese-Gels
oder -Polymere, um Komponenten der Probe zu separieren. Solche Separationsmaterialien
sind in der Technik wohlbekannt.
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Die integrierte Einrichtung 2 beinhaltet
auch eine Einspritzelektrode 20 und eine Separationselektrode 22,
die in dem einheitlichen Körper 4 eingebettet
sind. Die Elektroden 20 und 22 befinden sich an entgegengesetzten
Enden der Einrichtung, um einen elektrophoretischen, elektro-osmotischen
oder IEF-Ionenstrom durch den Separationsbereich 8 hindurch
zu treiben. Jede Elektrode ist vorzugsweise in dem Körper 4 so
eingebettet, dass ein Ende der Elektrode durch eine Außenfläche des
Körpers
hindurch hervorsteht und das andere Ende der Elektrode in einem
inneren Bereich des Körpers
hineinsteht.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Einrichtung 2 in Kombination mit einem externen Instrument
(nicht dargestellt) verwendet und ist dazu ausgestaltet, in dieses
externe Instrument eingesetzt zu werden, das eine Heizer zum Erhitzen
der Reaktionskammer 6 hat und elektrische Anschlüsse zum Anlegen
einer Spannungsdifferenz zwischen den Elektroden 20, 22.
Dieses Instrument kann optional einen optischen Detektor 16 zum
Erfassen von separierten Komponenten der Probe in dem Separationsbereich 8 beinhalten.
Zusätzlich
kann das Instrument ein Paar von optischen Anordnungen 18A, 18B zum Überwachen
der Reaktionskammer 6 beinhalten. Geeignete optische Anordnungen
für die
Verwendung mit der Einrichtung der vorliegenden Erfindung sind in
der US-Anmeldung mit der Serien-Nr. 09/081,260 offenbart, angemeldet
am 19. Mai 1998, deren Offenbarung hierin durch Bezug aufgenommen
wird.
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Die Reaktionskammer 6 ist
für den
jeweiligen auszuführenden
Prozess ausgestaltet, wie beispielsweise eine PCR, eine LCR, eine
isothermische Nukleinsäure-Amplifikation,
eine selbstanhaltende Sequenzreplikation, enzym-kinetische Studien, homogene
Ligand-bindende Versuche, affinitäts-bindende Versuche, chemische
oder Temperatur-vermittelte Lysis von Zielmikroorganismen, komplexere
biochemische mechanistische Studien, das Studium von bestimmten
physiologischen Prozessen und andere synthetische und Ligand-bindende
Prozesse. Die Volumenkapazität
der Kammer hängt
von ihrer Anwendung ab. In einer bevorzugten Ausführungsform
hat die Kammer für
PCR Anwendungen eine Volumenkapazität zwischen ungefähr 10 bis
100 Mikroliter. Thermische Energie kann der Reaktionskammer 6 zugeführt werden,
indem der Bereich des Körpers 4,
der die Kammer bildet, mit einem externen Heizer gekoppelt wird.
Alternativ kann ein Heizelement permanent mit dem Körper gekoppelt
sein, und zwar unter Verwendung von Siebdrucktechniken oder Abscheidetechniken
für dünne Filme.
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Hinsichtlich des Separationsbereichs 8 können elektrophoretische
Funktionalitäten,
Hybridisierungs-Funktionalitäten oder
IEF-Funktionalitäten
vorgesehen sein, unterschiedliche Filtrierungs- oder andere Separationsmechanismen
wie beispielsweise das molekulare Sieben. wo die Separationsfunktionalität die Elektrophorese
ist, ist der Separationsbereich 8 vorzugsweise eine Kapillare,
wie in 1. Der Separationsbereich
kann eine geeignete Separationsmatrix beinhalten, wie beispielsweise
ein Gel oder eine andere für
die Elektrophorese oder IEF geeignete Lösung, wie es an sich in der
Technik bekannt ist. Diese Lösungen
können
Puffer, Additive, polymerische Agenten, etc., beinhalten. In der
bevorzugten Ausführungsform
hat die Kapillarröhre 14 einen
Durchmesser von ungefähr
0,05 bis 1 mm und eine Länge
von 1–10
cm.
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2 zeigt
eine andere Ausführungsform eine
Prozessiereinrichtung 30, bei welcher der Separationsbereich 32 ein
Hybridisierungsbereich ist, der ein Feld von Nukleinsäure-Hybridisierungsstellen 34 beinhaltet.
Jede Hybridisierungsstelle ist vorzugsweise ein Kanal oder eine
Kammer, beschichtet mit einem unbeweglich gemachten Reagenz wie
beispielsweise Polynukleotid-Testern. Ein unbeweglich gemachtes
Reagenz ist ein Reagenz, das kovalent oder nicht kovalent an der
Oberfläche
der Struktur angebracht ist. Das unbeweglich gemachte Reagenz kann durch
verschiedene, in der Technik wohlbekannte Verfahren auf die Oberfläche aufgebracht
werden, beispielsweise Eintauchen, Aufschreiben mit einem Stift,
Ausgeben durch eine Kapillarröhre
hindurch oder durch die Verwendung von Reagenzstrahldrucken oder
einer anderen geeigneten Ausgabetechnik.
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Beim Verbinden des komplementären Analyt-Polynukleotids
mit dem unbeweglich gemachten Polynukloetid-Tester kann ein gekennzeichneter
Tester, beispielsweise ein mit Fluoreszenz gekennzeichneter Trester,
hinzugefügt
werden, um sich mit dem Analyt-Polynukleotid zu verbinden. Der Betrag
der Fluoreszenz ist direkt proportional zu der Menge des Analyts
in der Testprobe. Alternativ kann die Hybridisierungsprüfung in
einem wettbewerblichen Format ausgeführt werden, wo ein Polynukleotid
mit einer erfassbaren Kennzeichnung gepaart wird. Das Polynukleotid-gekennzeichnete
Reagenz konkurriert mit dem Analyt um die Verbindung mit dem unbeweglich gemachten
Polynukleotid. In einer anderen Ausführungsform weist der Hybridisierungsbereich
Mikrostruktursäulen
auf, wie beschrieben in der ebenfalls anhängigen Anmeldung mit der US-Serien-Nr. 09/115,454,
angemeldet am 14. Juli 1998, deren Offenbarung hierin durch Bezug
aufgenommen wird.
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Andere Separationsbereiche gemäß der vorliegenden
Erfindung beinhalten Ligand-bindende Stellen, bei welchen Elemente
eines Bindungspaars sich in diesen Stellen befinden und sich mit
komplementären
Bindungspaaren in der Probe koppeln. Außerdem kann der Separationsbereich
selektive Filter, wie beispielsweise Molekulargewichtsfilter, beinhalten.
Mehrere Funktionalitäten
können
sich in einem Separationsbereich befinden. Beispielsweise können elektromotorische
Separationen, wie beispielsweise die Elektrophorese, mit Filtern
kombiniert sein, um bestimmte Proben vorzuprozessieren, wo eine
Mischung aus einem Proteinhintergrund und Nukleinsäure dazu
gebracht wird, durch elektromotorische Kräfte durch einen Molekulargewichts-Ausschlussfilter
hindurch zu strömen,
wodurch das Protein herausgefiltert wird.
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Das Strömen zwischen der Reaktionskammer
und dem Separationsbereich kann durch Differentialdruck, hydrodynamische
Kräfte,
elektromotorische Kräfte,
Kapillarwirkung, pneumatische Kräfte, hydraulische
Kräfte,
mechanische Kräfte,
etc., bewirkt werden. Die einheitliche Einrichtung kann mit Instrumenten
verbunden sein, um das Strömen
des Fluids zu bewirken, wie beispielsweise mit Pumpen, einem Vakuum,
elektrischen Anschlüssen,
etc.. Die elektromotorische Beweglichkeit von Molekülen und insbesondere
Nukleinsäuren,
wie beim isoelektrischen Fokus und der elektrophoretischen Mobilität, ist ein
bequemer Bewegungsmechanismus aufgrund der Vorhersagbarkeit der
Bewegung. Wenn Bedingungen wie beispielsweise die Pufferionische
Stärke, die
Dimensionen der Kanäle,
die Art und Dichte des Gels, die Stromdichte, der Spannungsabfall,
die Zeit, etc., konstant sind, ist es relativ einfach, den Ort der Moleküle vorherzusagen.
Unter gesteuerten Bedingungen sollte sich zum Zeitpunkt T das Analyt
konsistent an der Position X befinden. Dieses Konzept ist in 4 veranschaulicht, wobei
die Stelle 114 den Aufenthaltsort des Zieles bezeichnet.
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Für
ein elektrisch angeregtes Fließen
kann eine Reihe von Elektroden teilweise oder vollständig in
dem Körper
der Einrichtung eingebettet sein, oder alternativ vor der Verwendung
eingesetzt werden. Wie in 1 dargestellt,
können
Elektrode 20, 22 betätigt werden, um ein Fließen von
Fluid von der Reaktionskammer 6 zu dem Separationsbereich 8 oder anders
herum zu induzieren. Außerdem
kann auch, abhängig
von der Arbeitsweise des Systems und den Anforderungen der Reaktionskammer 6,
eine gemeinsame Elektrode (nicht dargestellt) in dem Übergangsbereich 10 oder
nahe dieses Bereichs beinhaltet sein, um die Separationsvorgänge anzutreiben. Sowohl
das Einspritzen der Probe als auch die Elektrophorese können erzielt
werden durch Anlegen einer Spannung zwischen Elektroden. Die Spannung kann
durch eine Energiequelle aufgebracht werden, die sich außerhalb
der Einrichtung befindet. Alternativ kann auch eine geeignete Energiequelle
in die Einrichtung integriert sein.
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Vor der Verwendung kann die Einrichtung Elektroden
haben, die trocken sind, beschichtet oder in Vorkontakt mit elektrolytischen
Fluiden stehen. Um die Einrichtung zu verwenden, sollten die Elektroden Elektrolyten
ausgesetzt werden. Trockene Elektroden können in Kontakt mit Lösungen gebracht
werden, in dem Fluide in die Elektrodenbereiche hineingespritzt
werden oder indem zuvor dort angeordnete Fluide aus Anschlussreservoiren
freigegeben werden. Wo die Elektroden beschichtet sind, kann die Beschichtung
auf verschiedene Art und Weise gelöst werden, damit die Elektroden
die elektrolytische Lösung
kontaktieren. Außerdem
kann der Zeitpunkt, zu dem die Beschichtung von bestimmten Elektroden gelöst ist,
gesteuert werden, um die Aktivierung jeder Elektrode zu steuern
und so die daraus resultierende elektrisch angetriebene Bewegung
von Fluiden oder Komponenten vorzuschreiben.
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Das Einbetten von Elektroden in dem
Körper der
Einrichtung hat eine Vielzahl von Vorteilen. Eingebettete Elektroden
erleichtern die Reproduzierbarkeit der Position der Elektrode in
jeder Einrichtung, damit bei mehreren Einrichtungen reproduzierbare Ergebnisse
erzielt werden können.
Außerdem
ermöglichen
eingebettete Elektroden die Massenproduktion von solchen Einrichtungen,
was zu reduzierten Herstellkosten führt. Außerdem vermeidet die Einwegeinrichtung
der vorliegenden Erfindung Probleme mit der Verunreinigung oder
Kontamination der Elektroden, die auftreten kann, wenn Elektroden permanent
in mehrfach zu verwendenden Einrichtungen angebracht sind und für lange
Zeit in Kontakt mit leitenden Fluiden sich befinden.
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Die Elektroden können mit geringen zusätzlichen
Kosten auf unterschiedliche Art und Weise in die einheitliche Einrichtung
eingebettet werden. Zunächst
können
Metallelektroden in einer Maschine zum Spritzgießen von Plastik eingebracht
und während
des Spritzgießvorgangs "überformt" werden. Zweitens können die Metallelektroden selektiv
siebgedruckt oder anderweitig abgeschieden werden, beispielsweise
durch Plattieren, durch Abscheiden eines dünnen Films, etc., und auf den
einheitlichen Körper
der Einrichtung musterartig gestaltet werden. Beispielsweise kann
ein Ende einer siebgedruckten Metalllinie dazu verwendet werden,
Fluid in der Einrichtung zu kontaktieren, während das andere Ende einen
Anschluss bildet, der elektrisch im Eingriff mit einem externen
Instrument ist. Beide diese Techniken und auch andere ähnliche
Techniken sind kosteneffektiv und sehr geeignet für Produktionslinien mit
großem
Volumen. Die Elektroden befinden sich vorzugsweise in der Nähe von Belüftungsöffnungen, die
das Ableiten der während
des Aufbringens der starken elektrischen Felder, die der Elektrophorese zugeordnet
sind, entstehenden Gase ermöglichen. Diese
Entlüftungsöffnungen
könnten
einfache Öffnungen
in der Röhre
selbst sein oder gasdurchlässige
hydrophobe Membranen wie beispielsweise Gore-Tex.
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Ein anderer Aspekt der Prozessiereinrichtung
gemäß der vorliegenden
Erfindung ist der Fluidübergangsbereich
zwischen der Reaktionskammer und dem Separationsbereich. In einigen
Ausführungsformen
kann der Übergangsbereich
eine einfache fluidische Verbindung sein, beispielsweise eine Röhre oder
Leitung zwischen der Reaktionskammer und dem Separationsbereich.
In anderen Ausführungsformen
beinhaltet der Übergangsbereich
Ventile, Fluideinlassöffnungen,
Mischbereiche, etc.. In jeder Ausführungsform hat der Übergangsbereich
einen Fluidstrombegrenzer, wie beispielsweise eine Viskosematrix,
einen Konstriktor, einen fluidischen Kondensator, Öffnungen,
und/oder zumindest ein Ventil, das ein mechanisches Zweiwege- oder Drei-Wege-Ventil
sein kann. Der Fluidstrombegrenzer wird dazu verwendet, den Strom
des Fluids zwischen der Reaktionskammer und dem Separationsbereich
zu steuern.
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Die 3A–E zeigen einige Ausführungsformen
einer integrierten Einrichtung aus der Perspektive des Übergangsbereichs 60 zwischen
der Reaktionskammer 40 und dem Separationsbereich 50. 3A zeigt eine Einrichtung 80 mit
einem Übergangsbereich 60,
bei welchem der Durchflussbegrenzer ein Konstriktor 62 ist.
Der innere Durchmesser des Konstriktors 62 ist sehr schmal
verglichen mit dem vorangehenden Bereich, beispielsweise der Reaktionskammer 40.
Der innere Durchmesser des Konstriktors 62 sollte ausreichend
klein sein, vorzugsweise im Bereich von 0,01 bis 1 mm, so dass die Oberflächenspannung
das Fließen
von Fluid von der Reaktionskammer 40 zu dem Separationsbereich 50 verhindert,
bis die Elektroden 51, 53, 55 aktiviert
sind.
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3B zeigt
eine andere exemplarische Einrichtung 82 mit einem Zwei-Wege-Ventil 64,
das sich in dem Übergangsbereich 60 befindet.
Dieses Ventil 64 kann ein An-Aus-Ventil sein, wie beispielsweise
ein Abklemmventil, ein Membranventil oder ähnliches, um das Fließen von
Fluid durch das Ventil hindurch zu verhindern, wenn dies geschlossen
ist, und das Fließen
des Fluids zu ermöglichen,
wenn das Ventil offen ist. Es kann ermöglicht werden, dass sich die
Fluide in einem Sammelbereich 66 direkt stromaufwärts des
Ventils 64 sammeln. Auf diese Art und Weise kann es möglich sein,
Funktionen an der Fluidprobe vor dem Einspritzen von der Reaktionskammer 40 in
den Separationsbereich 50 hinein auszuführen. Beispielsweise kann das
Ventil 64 während Nukleinsäure Amplifikationsreaktionen
in der Reaktionskammer 40 geschlossen sein, und dann direkt
vor dem Einspritzen der Probe in den Separationsbereich 50 hinein
geöffnet
werden. Außerdem
kann es wünschenswert
sein, das Ventil in eine geschlossene Stellung zurückzuführen, um
das Fließen
des Fluids anzuhalten, und so nur eine Art Stopfen des Fluids in den
Separationsbereich 50 eintreten zu lassen.
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Das Ventil 64 kann auch
beim Echtzeitüberwachen
der Prozesse, die in der Reaktionskammer 40 stattfinden,
verwendet werden. Wenn die Reaktion in der Reaktionskammer fortschreitet,
kann es einer Fluidprobe ermöglicht
werden, durch das Ventil 64 hindurchzutreten, indem das
Ventil in ausgewählten
Abständen
während
des Verlaufs des Reaktionsprozesses geöffnet und geschlossen wird.
Das Fluid fließt
in den Separationsbereich 50 hinein zum Separieren von
Komponenten und zur Erfassung von Chemikalien, so dass der Status
des Reaktionsprozesses zu jedem gegebenen Zeitpunkt angezeigt wird. Die
Erfassung der Probe kann anzeigen, dass der Reaktionsvorgang angepasst
werden sollte, um die Ergebnisse zu optimieren. Beispielsweise kann,
wo eine Nukleinsäure-Amplifikation
in der Reaktionskammer 40 stattfindet, wenn im Verlauf
der Amplifikation eine geringe Nukleinsäure-Konzentration erfasst wird,
die Anzahl der thermischen Zyklen gesteigert werden gemäß dem gewünschten
Ergebnis. So kann ein Benutzer der Einrichtung es vermeiden, zu
viele oder zu wenige Zyklen zu durchlaufen.
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Elektroden in dem Übergangsbereich
und in Bereichen vor dem Übergangsbereich,
beispielsweise der Reaktionskammer 40, können die
Bewegung von Fluid in den Übergangsbereich 60 hinein
erleichtern. Ein gebettete Elektroden 70A, 70B sind
in Form der Zwei-Wege-Ventil-Konfiguration in 3C dargestellt. Die Elektrode 70A ist
in dem Reaktionsbereich 40 eingebettet, und die zweite
Elektrode 70B ist in einem Kanal 72 unmittelbar
stromabwärts
von dem Ventil 64 eingebettet. Die Elektroden 70A, 70B stehen
durch den einheitlichen Körper
der Einrichtung hindurch hervor, so dass sie teilweise dem Fluid
innerhalb der Kammer und des Kanals ausgesetzt sind.
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Die Ausführungsformen des Übergangsbereichs 60,
die in den 3C und 3D dargestellt sind, beinhalten
jede eine Kombination aus mehreren Zwei-Wege-Ventilen innerhalb
eines Kanals, der mit dem Übergangsbereich
verbunden ist. In diesen Ausführungsformen
befindet sich ein seitliches Ventil 68 in einem seitlichen
Kanal 74, um das Fließen
von Fluiden in den Übergangsbereich 60 hinein
zu steuern. Beispielsweise können
Reagenzen und Fluide dem Separationsbereich 60 hinzugefügt oder
aus ihm abgeleitet werden durch diesen seitlichen Kanal 74 hindurch.
Diese zusätzlichen
Fluide können
vor, während
oder nach dem Einspritzen der Probe in den Separationsbereich 50 hinein
eingespritzt werden. Funktionen wie beispielsweise Waschen, das
Beimischen von Ampholinen für
das iso-elektrische Fokussieren in dem Separationsbereich 50,
das Einspritzen von Markern, etc., können mit einer solchen Kanal-
und Ventilanordnung eingesetzt werden.
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In der Einrichtung 84 der 3C kommuniziert der seitliche
Kanal 74 mit dem Übergangsbereich 60 stromabwärts von
dem Zwischenventil 64. In der Einrichtung 86 der 3D kommuniziert der seitliche
Kanal 74 mit dem Übergangsbereich 60 in
dem Sammelabschnitt 66, der sich stromaufwärts von dem
Zwischenventil 64 befindet. In dieser Ausführungsform
kann es Reagenzen ermöglicht
werden, mit Fluid in dem Sammelabschnitt 66 vor dem Einspritzen
des Fluids in den Separationsbereich 50 hinein zu interagieren.
In den Ausführungsformen
der 3C und 3D befindet sich außerdem die
eingebettete gemeinsame Elektrode 70B in dem Übergangsbereich 60 gegenüber dem
seitlichen Kanal 74. Die gemeinsame Elektrode 70B kann
mehrere Funktionen haben. Die gemeinsame Elektrode kann entweder
mit einer seitlichen Elektrode (nicht dargestellt) in dem seitlichen
Kanal 74 arbeiten, um einen Fluidfluss von dem seitlichen
Kanal zu induzieren. Außerdem kann
die gemeinsame Elektrode 70B mit der Einspritzelektrode 70A arbeiten,
um das Fließen
des Fluids von der Reaktionskammer 40 zu erleichtern.
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Zusätzlich zu den Arten der Ventile
in dem Übergangsbereich
der Einrichtung kann die Funktion von mehreren Zwei-Wege-Ventilen
durch ein einzelnes Drei-Wege-Ventil realisiert werden. Die 3E zeigt eine Einrichtung 88 mit
einem Drei-Wege-Ventil 69, die das Einspritzen von zusätzlichen
Fluiden, beispielsweise Reagenzen, in den Übergangsbereich 60 hinein
durch den seitlichen Kanal 74 ermöglicht. Ein Drei-Wege-Ventil
oder eine Kombination aus Zwei-Wege-Ventilen kann auch mit einem
Konzentrationskanal kommunizieren, der ein Fokussiergel und eine
gemeinsame Elektrode hat. In dieser Ausführungsform fließt eine
Chemikalienprobe in den Kanal hinein, um einen Fluidstopfen zu produzieren,
der dann in den Separationsbereich hineinbewegt werden kann.
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Ein exemplarisches Membranventil
ist in der Draufsicht in 4A und
in der Querschnittsansicht in 4B dargestellt.
Das Membranventil 90 weist eine dünne flexible Polymerschicht 92 auf,
die einer Kraft A ausgesetzt werden kann, um die Schicht 92 gegen
eine Oberfläche 94 vorzuspannen,
um den fluidischen Weg zwischen zwei Kanälen 96 und 98 zu verschließen. Das
Ventil 90 kann dann durch Entfernen der Kraft A freigegeben
werden, so dass sich die Membran entspannt und ein Fluid zwischen
den Kanälen 96 und 98 fließen kann.
Die Kraft A, die die flexible Membran auslenkt, kann pneumatisch,
hydraulisch oder mechanisch induziert sein, beispielsweise durch
einen mechanischen Plungerkolben.
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Wieder mit Bezug auf die 3A bis 3E ist es wichtig, dass der Übergangsbereich 60 die
Reaktionskammer 40 thermisch von dem Separationsbereich 50 isoliert.
Diese thermische Isolation ermöglicht
ein korrektes Erhitzen einer Probe in der Reaktionskammer 40 und
verhindert eine Beeinträchtigung des
Materials in dem Separationsbereich 50. Die thermische
Isolation wird erzielt, indem der Übergangsbereich 60 thermisch
widerstandsfähig
gemacht wird, d. h. indem sichergestellt wird, dass der Übergangsbereich 60 eine
geringere thermische Leitfähigkeit
hat als die Reaktionskammer 40. Die thermische Leitfähigkeit
des Übergangsbereichs 60 bezieht
sich sowohl auf die Leitfähigkeit
des Materials, das den Übergangsbereich
bildet, als auch auf die Größe des Übergangsbereichs
relativ zu der Reaktionskammer 40. Die vorliegende Erfindung
zieht mehrere Verfahren in Betracht, um sicherzustellen, dass der Übergangsbereich 60 eine
geringere thermische Leitfähigkeit
hat als die Reaktionskammer 40. Zunächst ist der Bereich des Körpers, der
den Übergangsbereich 60 definiert,
schmaler gemacht als der Bereich des Körpers, der die Reaktionskammer 40 bildet,
so dass der Übergangsbereich 60 die
Reaktionskammer 40 im wesentlichen thermisch von dem Separationsbereich 50 isoliert.
Dies ist die gegenwärtig
bevorzugte Technik und ist in den verschiedenen Ausführungsformen
der 1–3E dargestellt. Zweitens
kann der Übergangsbereich 60 ein
anderes Material aufweisen, das eine geringere thermische Leiffähigkeit
hat als das Material, das die Reaktionskammer 40 bildet.
Drittens können
thermische Isolatoren wie beispielsweise Lufttaschen in dem Körper ausgeformt
sein, der den Übergangsbereich 60 umgibt.
Natürlich
können
auch geeignete Kombinationen dieser Techniken verwendet werden.
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Zumindest eine optische Anordnung
kann mit der Reaktionskammer, dem Separationsbereich und/oder anderen
Bereichen der Einrichtung kommunizieren. Die optischen Anordnungen
können
extern mit der Einrichtung gekoppelt sein und vorzugsweise Festkörperkomponenten,
wie beispielsweise Photodioden und LEDs beinhalten. Wie in 5 dargestellt, beinhaltet
eine Einrichtung 100 eine Lichtquelle 102 wie
beispielsweise eine LED und einen optischen Erfasser 104,
wie beispielsweise eine Linse, einen optischen Filter und eine Photodiode.
Die Lichtquelle 102 und der Erfasser 104 sind
so positioniert, dass sie separierte Komponenten, beispielsweise Nukleinsäurefragmente,
der Probe in der Elektrophoresekapillare 108 erfassen.
Die Nukleinsäurefragmente
können
erfasst werden, wenn sie mit einem einschaltenden Farbstoff wie
beispielsweise Ethidiumbromid gefärbt sind. Ein Beispiel für dieses
Format sorgt dafür,
dass Ethidiumbromid von einem seitlichen Kanal (nicht dargestellt) über elektromotorische
Kräfte
von Elektroden hinzugefügt
wird. Die Lichtquelle 102 ist mit einer Steuerung über einen Anschluss 112 gekoppelt,
und Daten werden von dem Erfasser 104 durch einen Anschluss 110 an
die Steuerung übertragen.
Die Steuerung kann zumindest einen Mikroprozessor oder zumindest
eine Mikrosteuerung aufweisen, um Vorgänge wie beispielsweise den
Antrieb des Fluidstroms, Optik, Erfassung, etc., zu steuern.
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Alternativ kann das optische Erfassungssystem
einen Laser und eine CCD aufweisen. In dieser Ausführungsform
beinhaltet die optische Erfassungsanordnung vorzugsweise einen optischen
Filter wie beispielsweise einen Interferenzfilter oder Bandpassfilter
zum Durchlassen der jeweiligen Erfassungswellenlänge, eine CCD, eine Fokussieroptik,
einen Reflektor/Splitter, und einen Argon-Ionenlaser. Der Betrieb
ist wie folgt: der Laser regt den fluoreszierenden Indikatorfarbstoff
an, der der Produkterfassung zugeordnet ist. Das fluoreszierende
Signal wird mittels der CCD überwacht
und an die Steuerung weitergeleitet. Alternativ kann eine LED verwendet
werden, um den fluoreszierenden Indikatorfarbstoff anzuregen. Es könnten auch
Absorptionsspektroskopie verwendet werden.
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6 zeigt
eine anderen Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung, bei welcher eine Prozessiereinrichtung 150 Elektrodenbereiche 160, 162 und 164 beinhaltet.
Jeder Elektrodenbereich beinhaltet ein zugehöriges Reservoir 166A,
166B, 116C zum Aufbewahren
von elektrophoretisch transportiertem Fluid. Jeder dieser Elektrodenbereiche
hat auch eine Elektrode 167, 168 bzw. 169,
die im Körper 152 der Einrichtung
eingebettet ist. Jede Elektrode steht durch den Körper 152 hindurch
hervor, so dass sie teilweise innerhalb eines Reservoirs eingetaucht
ist. Jedes Reservoir hat außerdem
eine Membran 170A, 170B bzw. 170C, um
Gase abzuleiten. Die Membranen können
aus Gore-Tex bestehen oder aus einem anderen geeigneten hydrophoben
porösen
Material.
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Der erste Elektrodenbereich 160 ist
mit einer Reaktionskammer 154 über einen Kanal 172 verbunden.
In gleicher Art und Weise ist der zweite Elektrodenbereich 162 mit
einem Übergangsbereich 156 über einen
Kanal 174 verbunden. Der Kanal 174 hat außerdem einen
Filter 178, vorzugsweise einen Filter für hohes Molekulargewicht, so
dass nur ausgewählte
Molekularkomponenten hindurchtreten können. Der dritte Elektrodenbereich 164 ist
am Ende eines Separationsbereichs 158 über einen Kanal 176 angebracht.
Ein Ventil 180 in dem Übergangsbereich 156 steuert
den Strom des Fluids von der Reaktionskammer 174, und ein
Ventil 182 steuert den Kreuzstrom des Fluids durch einen
seitlichen Kanal 184 hindurch. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Einrichtung 150 für die Nukleinsäureanalyse
verwendet, und die Reaktionskammer 154 ist eine Nukleinsäure-Amplifikationskammer.
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Beispiele
für die
Arbeitsweise
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Die vorliegende Erfindung zieht außerdem bestimmte
Verfahren in Betracht, um verschiedene Ausführungsformen der oben beschriebenen
Reaktions- und Separationseinrichtung zu verwenden.
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1. Verfahren zur Verwendung
einer Elektrophorese-Einrichtung der vorliegenden Erfindung:
-
- i) Eine unbekannte Probe wird mit dem geeigneten
PCR, beispielsweise einer Mastermix-Lösung, gemischt und in den Reaktionskammerbereich des
Analysesystems eingeführt;
- ii) eine PCR-Reaktionssequenz (oder eine andere DNA Amplifikationstechnik
oder chemische Reaktion) wird mit der Lösung innerhalb der Reaktionskammer
ausgeführt;
- iii) eine optisch Überwachung
der Reaktionsprodukte innerhalb der Kammer wird durchgeführt, um
das Fortschreiten der Amplifikationsreaktion zu verfolgen;
- iv) wenn festgestellt wird, dass ausreichend Produkt, wie beispielsweise
Nukleinsäure,
innerhalb der Reaktionskammer erzeugt worden ist, werden die Injektionselektroden
und gemeinsame Elektroden aktiviert, so dass sie einen Probenstopfen durch
den Übergangsbereich
hindurch in den oberen Bereich des Separationsbereichs hineinziehen,
beispielsweise eine Elektrophoreseröhre, die ein geeignetes Gel
beinhaltet. Dieser elektrophoretische Einspritzschritt kann innerhalb
einer sehr kurzen Zeit ausgeführt
werden, wodurch die Erzeugung von Bläschen innerhalb der Reaktionskammer
minimiert wird;
- v) die gemeinsamen Elektroden und Elektrophorese-Elektroden
werden aktiviert, so dass sich der Probenstopfen durch das Gel hindurch
bewegt und die hohle Separationsröhre hinunter;
- vi) wenn die separierten Molekülbänder die Länge der Röhre durchqueren, passieren
sie das optische Erfassungssystem, und Daten, die das Produkt repräsentieren,
werden bestimmt.
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2. Verfahren zur Verwendung
der Elektrophorese-Einrichtung, die in 6 gezeigt ist:
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- i) Die Probe und geeignete Reagenzen werden
einem Nukleinsäure-Amplifikationsprozess
in der Reaktionskammer 154 unterzogen, während die Ventil 180, 182 geschlossen
sind;
- ii) eine optisch Überwachung
der Reaktionsprodukte innerhalb der Kammer 154 wird ausgeführt, um
das Fortschreiten der Amplifikationsreaktion zu verfolgen;
- iii) während
das Ventil 180 geschlossen ist, wird das Ventil 182 geöffnet, und
eine geeignete Pufferlösung
wird in die Separationssäule
oder die Kapillare 158 hinein durch die Einlassöffnung 184 eingespritzt;
- iv) eine geeignete Elektrophorese-Spannung wird zwischen den
Elektroden 167 und 168 angelegt, während das
Ventil 180 geöffnet
und das Ventil 182 geschlossen ist. Während dieser Phase werden Spezies
mit hohem Molekulargewicht an dem Molekulargewichtsfilter 178 gesammelt;
- v) eine geeignete Elektrophorese-Spannung wird dann zwischen
den Elektroden 168 und 169 angelegt, während die
Ventile 180 und 182 geschlossen sind. Während dieser
Phase werden die an dem Filter 178 gesammelten Spezies
mit dem hohen Molekulargewicht elektrophoretisch die Separationskapillare 158 hinunter
transportiert;
- vi) wenn die aufgefangenen Molekularspezies elektrophoretisch
die Kapillare 158 hinab transportiert werden, erreichen
sie den optischen Erfasser 186 und werden durch optische
Fluoreszenz erfasst.
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3. Verfahren zur Verwendung
einer Einrichtung mit einem Hybridisierungsbereich und Drei-Wege-Ventil:
-
- i) Die Schritte i) bis iii) in Beispiel 1 werden
mit einer Probe ausgeführt;
- ii) ein erstes Drei-Wege-Ventil in dem Übergangsbereich wird geöffnet, so
dass die Reaktionsmischung unter hydrodynamischer Kraft von der
Reaktionskammer fließen
kann, durch das Ventil, durch einen Hybridisierungsbereich (ersten
Separationsbereich) hindurch, durch ein zweites Drei-Wege-Ventil
hindurch und in einen angeschlossenen Ausschussbereich hinein. Wenn
das Fluid durch den Hybridisierungsbereich hindurchfließt, hybridisieren
Zielmoleküle
in der Probe, um Liganden oder Tester aufzufangen, die kovalent mit
der Oberfläche
des Hybridisierungsbereichs verbunden sind;
- iii) das erste Drei-Wege-Ventil wird geschaltet, so dass ein
Reagenz hydrodynamisch von einem Reagenzzugangskanal durch das erste
Drei-Wege-Ventil hindurch, durch den Hybridisierungsbereich hindurch,
durch das zweite Drei-Wege-Ventil hindurch
und in den Ausschussbereich hinein fließen kann. Reporter-Moleküle oder
Tester hybridisieren oder verbinden sich mit den im vorangegangenen
Schritt ii) aufgefangenen Zielmolekülen;
- iv) eine Waschlösung
wird in den Reagenz-Zugangskanal eingeführt und fließt durch
den Hybridisierungsbereich hindurch, durch das zweite Drei-Wege-Ventil
hindurch und in den Ausschuss hinein;
- v) eine Elutionslösung
oder Auswaschlösung
wird in den Reagenz-Zugangskanal hineingeführt und fließt durch
das erste Drei-Wege-Ventil hindurch und in den Hybridisierungsbereich
hinein, bis dieser Bereich gefüllt
ist, und dann wird der Fluss für einen
ausgewählten
Zeitraum angehalten;
- vi) das zweite Drei-Wege-Ventil schaltet, um den Hybridisierungsbereich
und einen zweiten Zugangskanal mit einem zweiten Separationsbereich
zu verbinden;
- vii) die Auswaschlösung
mit den Zielmolekülen wird
von der Hybridisierungsoberfläche
durch chemische, thermische oder elektrische Mittel ausgewaschen;
- viii) die Auswaschlösung
mit den Zielmolekülen nimmt
ihren Fluss durch das zweite Drei-Wege-Ventil hindurch zu dem Zeitpunkt
wieder auf, zu dem ein Reagenz durch den zweiten Zugangskanal hindurch
hinzugefügt
wird, wo die Auswaschlösung
und das Reagenz sich treffen und zusammen in den zweiten Separationsbereich
hineinfließen;
- ix) Elektroden in Verbindung mit dem zweiten Separationsbereich
werden aktiviert und führen
dazu, dass die Zielmoleküle
sich separieren und zu ihren pI-Stellen migrieren;
- x) eine CCD Kamera bildet die gesamte Länge des zweiten Separationskanals
optisch ab, um ein Strichcode-artiges Ergebnis zu bilden.
-
4. Verfahren zur Verfahren
einer Einrichtung mit einem Hybridisierungsbereich, einem Elektrophoresebereich
und einem Drei-Wege-Ventil:
-
- i) die Schritte i) bis vii) im Beispiel 3 werden
mit einer Probe ausgeführt;
- ii) die Auswaschlösung
mit den Zielmolekülen nimmt
ihren Strom durch das zweite Drei-Wege-Ventil hindurch wieder auf;
- iii) Elektroden in Verbindung mit dem zweiten Separationsbereich
werden aktiviert und führen
dazu, dass die Auswaschlösung
mit den Zielmolekülen
in den Separation hineinströmt
und die Zielmoleküle
sich in der Matrix in dem zweiten Separationsbereich separieren;
- iv) eine CCD Kamera bildet die gesamte Länge des zweiten Separationskanals
optisch ab, um ein Strichcode-artiges Ergebnis zu bilden.
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Herstellung
-
Die Einrichtungen der vorliegenden
Erfindung können
beispielsweise durch Spritzgießen, Gießen, Bearbeiten
oder andere geeignete Mittel zur Herstellung eines einheitlichen
Körpers
ohne Verkleben von mehreren Bauteilen produziert werden. Das Formen
durch Gießen
ermöglicht
das Ausbilden eines zusammenhängenden
Elements mit Reaktionskammer, Übergangsbereich
und Separationsbereich. Ventilstrukturen können auch in dem Formteil eingeschlossen
sein, oder alternativ der Einrichtung hinzugefügt werden, nachdem der einheitliche
Körper
ausgeformt worden ist.
-
Obwohl ein einheitlicher Körper beschrieben worden
ist, kann eine Einrichtung der vorliegenden Erfindung auch dadurch
produziert werden, dass einer oder mehrere Plastikfolien mit einem
geformten polymerischen Bauteil laminiert oder versiegelt werden.
Beispielsweise kann der Körper
der Einrichtung ein geformtes polymerisches Bauteil aufweisen, in dem
die Reaktionskammer, der Übergangsbereich und
der Separationsbereich ausgeformt sind, und eine erste und eine
zweite Plastikfolie, die an entgegengesetzten Seiten des geformten
polymerischen Teils angebracht sind, so dass sie die Reaktionskammer,
den Übergangsbereich
und/oder den Separationsbereich umschließen. Um bei der Übertragung von
Energie zu den Probenkomponenten zu helfen oder um bei der optischen
Erfassung der Komponenten zu helfen, ist es bevorzugt, dass diese
Plastikfolien relativ dünn
sind, beispielsweise dass die Folien jede eine Dicke im Bereich
von 0,01 bis 0,5 mm haben und noch besser eine Dicke von ungefähr 0,05 mm.
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Die integrierten Einrichtungen der
vorliegenden Erfindung bestehen vorzugsweise aus einer Anzahl von
polymerischen Materialien. Darin enthalten sind, aber die Erfindung
ist nicht begrenzt auf, Polyolefine wie beispielsweise Polypropylen
und Polyethylen, Polyester wie beispielsweise Polyethylenterephthalat,
Styren mit Polymeren wie beispielsweise Polystyren, Styrenacrylonitril,
und Acrylonitrilbutadienstyren, Polycarbonat, acrylische Polymere
wie beispielsweise Polymethylmethacrylat und Polyacrylonitril, Chlor
enthaltende Polymere wie beispielsweise Polyvinylchlorid und Polyvinylidenchlorid,
Acetalhomopolymere und Copolymere, zellulosehaltige Materialien
und ihre Ester, Zellulosenitrat, Fluorin enthaltende Polymere wie
beispielsweise Polyvinylidenfluorid, Polytetrafluorethylen, Polyamide, Polyimide, Polyetheretherketon,
schwefelhaltige Polymere wie beispielsweise Polyphenylensulfid und
Polyethersulfon, Polyurethane, Silizium enthaltende Polymere wie
beispielsweise Polydimethylsiloxan. Außerdem können diese Aufbauten aus Copolymeren
sein, Mischungen und/oder Laminaten der oben genannten Materialien
sowie aus Glas und keramischen Materialien.
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Außerdem können Elektroden auch "überformt" sein, indem Elektroden teilweise an
ihren gewählten
Stellen in die Form eingesetzt werden, so dass die Elektroden in
den einheitlichen Körper
eingebettet werden, nachdem das Material der Form hinzugefügt worden
ist und sich verfestigt hat. Die Elektroden können aus Platin, Silber, Kohlenstoff, Gold
oder einem anderen geeigneten chemisch leitenden Material sein.
Andere Komponenten können optional
auf ähnliche
Art und Weise an der Einrichtung überformt werden.
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In der Alternative können, nachdem
der einheitliche Körper
ausgeformt worden ist, Elektroden, Filter, Widerstandsheizelemente,
etc., in den Körper eingebettet
werden unter Verwendung von Siebdrucktechniken oder Abscheidetechniken
für dünne Filme.
Reagenzen, Matrizen oder Fluide können in verschiedene Reservoire
hineingespritzt werden und Kanäle
des ausgeformten Körpers.
Außerdem
kann die Einrichtung auch Komponenten beinhalten, die sich außerhalb
des einheitlichen Körper
befinden, wie beispielsweise Optiken, elektrische Anschlüsse für die Elektroden,
Heizer, die in dem Körper
eingebettet sind, pneumatische Schnittstellen zu Pumpen oder Vakui,
etc.. Alternativ können
sich solche Komponenten auch in einem externen Instrument befinden,
in welches hinein die einheitliche Einrichtung platziert wird für die Probenbearbeitung,
wie oben beschrieben.
-
Zusammenfassend kann die gesamte
Anordnung aus Reaktionskammer, Übergangsbereich und
Separationsbereich in einem einzelnen einheitlichen Einwegkörper ausgeformt
sein. Es gibt eine Anzahl von Gründen,
warum die Einrichtung der vorliegenden Erfindung gegenüber herkömmlichen
Implementierungen stark verbessert ist.
- 1)
Die gesamte Einrichtung kann entsorgt werden, so dass eine Übertragung
von Probenmaterial und eine Verunreinigung von Probe zu Probe kein Problem
ist;
- 2) alle hauptsächlichen
Elemente der Einrichtung sind in eine analytische Komponente integriert;
es ist nicht notwendig, die Probe oder die Reaktionsprodukte von
einer Einrichtung mit einer Reaktionskammer zu einer separaten Einrichtung
mit einer Separationsröhre
zu übertragen;
- 3) es sind Maßnahmen
getroffen zum thermischen Isolieren der Reaktionskammer von dem Separationsbereich,
so dass eine korrekte Erwärmung
einer Probe und ein korrekter Betrieb des Separationsbereichs sichergestellt
sind;
- 4) es sind Maßnahmen
getroffen für
die optische Erfassung sowohl in der Reaktionskammer als auch der
Separationsröhre;
- 5) es sind Maßnahmen
getroffen zum Entlüften und
anderweitigen Handhaben der während
der Elektrophorese oder während
des iso-elektrischen Fokussierens erzeugten Gase;
- 6) die Nachteile der Verklebetechniken, um Substrate und Module
zu verbinden, werden vermieden; und
- 7) eingebettete Elektroden sorgen für eine Reproduzierbarkeit und
eine Massenproduktion bei geringen Kosten.
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Die vorliegende Erfindung ist oben
in verschiedenen Details mit Bezug auf die Ausführungsformen und die Zeichnungen
beschrieben worden. Modifikationen oder Substitutionen können jedoch
an den hier beschriebenen Einrichtungen und Verfahren auf der Grundlage
dieser Offenbarung vorgenommen werden, ohne dass der breite Bereich
der Erfindung verlassen wird. Daher sollte der Bereich der Erfindung
durch die nun folgenden Ansprüche
und ihre gesetzlichen Äquivalente
bestimmt sein.