EP1251946A1 - Kapillarkraftmischer - Google Patents

Kapillarkraftmischer

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EP1251946A1
EP1251946A1 EP00974506A EP00974506A EP1251946A1 EP 1251946 A1 EP1251946 A1 EP 1251946A1 EP 00974506 A EP00974506 A EP 00974506A EP 00974506 A EP00974506 A EP 00974506A EP 1251946 A1 EP1251946 A1 EP 1251946A1
Authority
EP
European Patent Office
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capillary force
capillary
liquids
force mixer
mixing zone
Prior art date
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EP00974506A
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English (en)
French (fr)
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EP1251946B1 (de
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Robert Seidel
Andreas Wolf
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Micro Biolytics GmbH
Original Assignee
Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
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Publication date
Application filed by Albert Ludwigs Universitaet Freiburg filed Critical Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
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Publication of EP1251946B1 publication Critical patent/EP1251946B1/de
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    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0406—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces capillary forces

Definitions

  • the invention relates to an analytical capillary force mixer for determining one or more analytes in an aqueous or other usable solvent, preferably in separately applied sample liquids that mix in the analysis chamber, consisting of a carrier, a detection zone and a channel capable of capillary liquid transport , which combines two or more liquid application openings, the use of the aforementioned capillary mixer to determine one or more measured quantities in one or more liquids, and a method or a method for determining chemical, biochemical, biological, physical or other measurable quantities in one or more liquid samples Using said analytical capillary force meter, and / or method of making and using it
  • Carrier-bound or free tests are often used for the guarative or guarantative analytical determination of constituents of body fluids, in particular blood.
  • reagents are either embedded in appropriate layers of a solid carrier which is brought into contact with the sample, or the reagents are mixed with the sample in a chamber
  • the reaction of liquid sample and reagents leads to a detectable signal in the presence of a target analyte, in particular to a color change, which can be evaluated visually or with the aid of a device, usually reflection-photometric
  • microtiter plates So-called microtiter plates, mostly with a standardized size of 12 7 x 8.5 cm, are used here. These are plates that contain a large number of small vessels, for example 96 or 192, but also fewer or considerably more, are customary, which are filled with different reagents.
  • the amount of reagents in these analysis plates generally ranges from milliliters (10 3 L) to microliters (10 6 L) are the reagents valuable because they are only available in small quantities or are expensive, or both, therefore, miniaturization of the tests is sought, especially if many tests are to be or have to be carried out.
  • the filling of the analysis trough (wells) is usually carried out by machines, as well further analysis is automated with preferred forms of use.
  • microtiter plates for example from Greiner, 64943 Hirschberg, (micro-assay plate) with 1536 wells are known.
  • the working volume with 4-8 ⁇ l is relative high
  • the sequential (sequential) introduction of the analytes is associated with the risk of cross-contamination. Appropriate caution is advised Use or the drop size limits the attempt to miniaturize the test.
  • the working volume of a microtiter plate from Corning Costar (55924 Bodenheim, Germany) is only 1-2 ⁇ l, but here too the independent mixture of analytes introduced into separate wells is not
  • a device for mixing two analytes by spontaneous mixing or vibration is described in US Pat. No.
  • US Pat. No. 5,300,779 also describes an apparatus for mixing two analytes, but there is only one sample application point and reagents are already integrated.
  • US Pat. No. 5,627,041 presents a single-use cuvette for the analysis of biological samples, this being a series of channels, Kapill aren, reservoirs and stop points that allow the controlled flow of sample, reagent and solvent.
  • the complex design of this cuvette is space-intensive and not suitable for the design on microtiter plates.
  • the flow of the analytes through the device does not take place only under centrifugal force spontaneous
  • the US Pat. No. 5,222,808 describes a capillary mixing apparatus in which the mixing is not carried out spontaneously but by means of magnetic particles
  • the object of the present invention is then to eliminate the disadvantages of the prior art.
  • an easy-to-use, independently volume-dosing test element is to be made available, with which, using minimal sample volumes, not only a spatial separation of the detection zone and samples - is possible, but additionally a mixture of two or more separately applied liquids takes place.Maximum possible flexibility for use for a wide variety of samples and analytes should be ensured.
  • the mixing of the liquids and the transport of the liquids to the detection zone should be so fast that the analysis of a Sample is not limited in time by this.
  • test element is intended to result in an inexpensive fer that is easy to produce in terms of production technology This enables the use of the microfluidic channel array for mass testing (high throughput screening, HTS) using standardized robots and machines
  • the design of the novel capillary mixer enables the use of new spectroscopic methods, such as modern variants of UV / VIS or fluorescence spectroscopy or TIRF, in particular IR spectroscopy, for analysis b iological and other substances in water or other water or biological media
  • new spectroscopic methods such as modern variants of UV / VIS or fluorescence spectroscopy or TIRF, in particular IR spectroscopy
  • TIRF fluorescence spectroscopy
  • IR spectroscopy iological and other substances in water or other water or biological media
  • the structure of the new test system allows the analysis of substances in the low nanohter (10 9 L) range. Very many systems can be used on a small one, for example, as specified by the standard Mirotiter plate Combine space, and the filling of the sample feed openings can be carried out automatically.
  • Figure 1 shows a single capillary force mixer according to the invention.
  • Figure 2 shows the function of a capillary force mixer according to the invention.
  • Figure 3 shows such a capillary force mixer with a hydrophobic separating layer.
  • Figure 4 shows an example of the liquid task in a capillary force mixer according to the invention
  • an inert carrier consisting of an inert carrier, a detection zone and a channel capable of capillary liquid transport, which connects two or more sample application openings.
  • the structure of the new test system allows the analysis of very small quantities, ie those in the low nanohter (10 9 L) - Range, in particular in the range from 0.05 to 800 nl, preferably 0.1 to 100, in particular 0.1 to 50 nl.
  • Many systems can be combined in the small space specified by the standard microtiter plates, and the Filling of the test opening can be done automatically Due to the chosen structure and the small size of the system, an active mixture is not necessary, but a mixture takes place independently by diffusion within a few minutes.
  • the capillary mixer also has the advantages of easy filling and good dosing.
  • the capillary force mixer can be flexibly adapted to a given sample to be analyzed by selecting a suitable reagent solution shortly before the measurement
  • a capillary force mixer for the analysis of (in particular two or more) liquids which comprise (in particular two or more) reagents (reactants) which are brought together and mixed for the reaction (their bringing together in particular to obtain closer ( quantitative or qualitative) information about at least one of the reagents (analyte) or forms a new component through a physical or chemical reaction
  • the invention relates in particular to a capillary force mixer according to the preceding paragraph, characterized in that there are two liquid feed points, each of which flows into a capillary, which can be filled separately or in succession and mouth in a common, also capillary-active mixing zone, the capillaries preferably parallel to the edges the mixing zone
  • the invention relates to a capillary force mixer according to one of the last two paragraphs, the capillary-active mixing zone itself being connected directly to the liquid feed points, so that there are no additional capillaries
  • a capillary force mixer is particularly preferred in accordance with the last paragraph, in which the layer thickness of the liquids in the mixing zone is fixed
  • a capillary force mixer according to the last paragraph is preferred, characterized in that the layer thickness of the liquids in the mixing zone is preset in a range from 0.1 to 10,000 ⁇ m, preferably in a range from 1 to 100 ⁇ m
  • a capillary force mixer is more preferred after the penultimate or last paragraph, the mixing zone of which is designed in such a way that the layer thickness of the liquids in the mixing zone is set such that IR spectroscopic measurements are carried out in aqueous solvents. can be led; the layer thickness of the liquids in the mixing zone is preferably preset in a range from below 30 ⁇ m, in particular from 3 to 30, especially from 5 to 10 ⁇ m.
  • a capillary force mixer according to one of the preceding seven paragraphs is particularly preferred, characterized in that one or more functional areas are equipped with temperature control means, or a capillary force mixer according to one of these paragraphs, in which functional layers are introduced in the area of the mixing zone.
  • a capillary force mixer according to the last paragraph is even more preferred, characterized in that one or more functional parts are equipped with sensors, in particular electrochemical sensors.
  • a capillary force mixer according to one of the last 10 paragraphs is even more preferred, characterized in that the volume of the supply capillaries and the mixing zone (in one variant of the invention without supply capillaries only the volume of the mixing zone) is preset in the range from 0.05 to 800 nl, preferably 0 , 1 to 100, in particular 0.1 to 50 nl.
  • a capillary force mixer is preferred according to one of the last twelve paragraphs, which consists of silicon, glass or both (enables high-precision construction). Even more preferred is a capillary force mixer according to one of the last thirteen paragraphs, in which there are means for detection by optical, electrochemical or other suitable means of reactions which take place within the mixing zone integrated into the capillary system after the liquids have been mixed
  • a capillary force mixer which has a lens or a Fresnel lens, in particular in the area of the mixing zone, is preferably integrated on the outside of the capillary force mixer, especially in the case of plastic designs (primarily an optically transparent area). , includes
  • a further preferred embodiment of the invention is based on the use of the capillary force mixer according to one of the last fifteen paragraphs for the analysis of at least two liquids which are brought together and mixed for the reaction and the combination of which leads to obtaining more detailed information about at least one of the liquids, or the reaction thereof forms a new component, characterized in that all liquids are filled into the capillary force mixer by capillary force without the addition of external forces, and their mixing takes place essentially by diffusion
  • the measuring method being a spectroscopic method, in particular a spectroscopic measuring method, which detects electromagnetic waves with a wavelength of about 160 to about 20,000 nm, preferably of about 180 to about 15,000 nm, especially IR.
  • a spectroscopic measuring method which detects electromagnetic waves with a wavelength of about 160 to about 20,000 nm, preferably of about 180 to about 15,000 nm, especially IR.
  • capillary mixer as described above is also preferred for analysis by electrochemical or enzymatic methods
  • a capillary force mixer is particularly preferred, characterized in that, in order to measure a reference value, a detection is carried out directly in situ before filling with the second or later liquid (reagent solution or sample solution)
  • the liquids are on the one hand samples, in particular biological samples such as blood (whole blood), blood plasma, blood serum, saliva, sweat, urine, pus, gastric juice, bile, other digestive juices, cerebrospinal fluid, tear fluid, milk, glandular secretions , Synovial fluid, but also hamolymph from insects, liquid foods or food components in nutritional analysis, culture media, cell plasma, medication, or water samples, for example from lakes, flowing water or clear systems, extracts or other liquids to be analyzed, each according to Refurbishment, such as centrifugation, filtration, chromatography or the like, or in particular without refurbishment (in particular in the case of blood, which may also contain cellular constituents which can be excluded from the mixing area, in particular in the case of a thin layer of the mixing zone, or in the case of larger layers) due to their slow diffusion in the ge In contrast to the surrounding liquid, diffuse very slowly into an area of the mixing zone with a reagent solution, so that there
  • Properties of the surrounding liquid can be measured directly) can be applied to the liquid application zones, these samples being able to detect qualitatively or quantitatively reactants (analytes), in particular enzymes, antibodies, nucleic acids, other biomacromolecules, sugars, lipids, liposaccharides, organic acids, amino acids , Drugs or other xenobiotics, metabohts, enzyme substrates, other organic compounds, heavy metals, ions, gases or the like.
  • qualitatively or quantitatively reactants analytes
  • enzymes antibodies, nucleic acids, other biomacromolecules, sugars, lipids, liposaccharides, organic acids, amino acids , Drugs or other xenobiotics, metabohts, enzyme substrates, other organic compounds, heavy metals, ions, gases or the like.
  • Reagenz ⁇ en0 reagent solutions with complementary (ie to some kind of detectable interaction , eg chemical (essential biochemical or biological) or physical type, with one or more analytes from the samples, capable) reactants (in particular possibly fluorescent, enzyme or other denatured antibodies, low molecular weight reagents (for example substrates un d / or cosubstrates for enzymatic reactions with components in the samples or inter-near (e.g.
  • IR spectroscopy can only with sufficient reliability and reproducibility up to a water layer thickness of about 10 ⁇ m (in particular Traps can also be operated up to 30 ⁇ m) The thickness variation of the measuring chamber must be kept as low as possible for reliable reproducibility
  • IR spectroscopy is a routine method and is used by organic chemists, biochemists, and others for qualitative and quantitative molecular detection.
  • infrared light When infrared light is passed through a sample of an organic substance, some of the frequencies are absorbed, while other frequencies pass through the sample unimpeded
  • IR spectroscopy also includes laser Raman spectroscopy, including Raman confocal laser spectroscopy, Fou ⁇ er transform IR (FTIR) spectroscopy or Hadamard transform IR, or any other IR spectroscopic method using the loading particularly preferred founer transform (FT-IR) spectroscopes are possible without further qualitative and quantitative determinations of analytes in the picogram (pg) range. With other optical methods, such as UV / VIS or in particular fluorescence or chemistry or fluorescence spectroscopy, can still much smaller amounts can also be detected.
  • FTIR Fou ⁇ er transform IR
  • FT-IR founer transform
  • the signal obtained in IR spectroscopy is dependent on the layer thickness of the sample under investigation, so that the IR signal obtained from a ⁇ 10 ⁇ m cell is very weak.
  • This disadvantage can be caused by an immediate previous calibration is largely absorbed, as this largely eliminates the measurement inaccuracies.
  • the control and software required for this are fundamentally already state of the art and can often be found in spectrometers.
  • the possibility of calibrating the samples directly before mixing with the exact same optical path length as in the mixed state is a decisive advantage of the new microfluid channel system. This also enables differential measurements (comparison before / after)
  • Suitable analysis devices in particular FT-IR devices, are easily accessible, in particular commercially available, for example from Bruker (Karlsruhe, Germany), for example Bruker Spectrum GX FT-IR Spectrometer Bruker Equmox 55, examples of UV / VIS devices are lambda 40 or the Lambda 800 UV / VIS Spectrometer System from Perkm Eimer
  • An inert or multi-part substrate is used as the inert carrier (matrix) for a capillary force mixer according to the invention, which substrate is not attacked by the liquids to be appended, or is not attacked, or not attacked significantly, within the time period required for application and measurement, in particular from one or more of the materials mentioned below
  • the new microfluidic channel system has a very simple structure. Due to the lack of any movable components, the (preferred) structure of the carrier is made up of two microtechnologically processed in a batch process Slabs (top and substrate layers) possible. This method is very inexpensive and is based on the latest state of the art.
  • a matrix-shaped array for example consisting of a cover and substrate layer, which contains several of the capillary force mixers according to the invention (optionally with ventilation channels, hydrophobic separating layers or other features of preferred embodiments of these capillary force mixers, as described here) in a matrix-like arrangement , for example in total with the dimensions of conventional microtiter plates, which in particular can be produced directly from two parts (cover and substrate layer).
  • a capillary mixer according to the invention is produced in particular by joining the components of the capillary mixer according to the invention (preferably directed) and connecting them to one another by holding devices such as clamps or the like.
  • the components, e.g. Plates (top and substrate layer) of the microfluidic channel array can also be glued (for example by means of polymerization, polyaddition or polycondensation materials, which can also be filled with fillers, eg to increase the electrical conductivity with silver particles), welding, glass Fusion bonding or other microtechnical processes such as anodic or eutectic bonding. This must be done in a directed manner, i.e. the components must be exactly aligned (“alignment") in order to ensure congruence, for example existing channels, and the assembly must not create any additional volume in the capillary or mixing zone area.
  • a number of materials can be used.
  • the materials are selected so that they are compatible with known microfabrication techniques. These include, for example, methods for removing material from the surface, such as wet etching, electrochemical etching, anisotropic etching or, in particular, chemical wet etching, for example in the case of Si0 2 using hydrogen fluoride / ammonium fluoride in the presence or absence of acetic acid, or dry etching, such as plasma etching processes, such as Sputtering, plasma chemical etching, reactive ion etching, ion beam etching or anisotropic deep etching using RIE, ion beam methods such as ion beam etching, laser ablation (laser ablation), photolithography, in particular laser ablation; Application of material, for example using PVD, be it without plasma support (e.g.
  • thermal evaporation, flash evaporation, MBE, VPE or electronic jet blasting CVD (thermal or plasma-based (PECVD)), laser-based material deposition or wet-chemical metal deposition (galvanic or chemical); or direct molding processes, such as vacuum molding, injection molding or other primary molding methods, pressing, embossing (for example hot embossing), and the like, depending on the suitability for the respective material, or combinations thereof.
  • the materials are also selected for their suitability for the full range of conditions to which the microfluidic systems are to be exposed, including extreme temperature, pH or salt concentration conditions or the application of electrical or magnetic fields.
  • the materials are those which are also used in the semiconductor industry, where microfabrication techniques are used regularly, in particular based on silicon, such as silicon, or other semiconductor materials, such as gallium arsenide.
  • silicon such as silicon
  • other semiconductor materials such as gallium arsenide.
  • Other preferred materials are silicon dioxide, glass, such as borosilicate glasses, quartz, quartz glass, silicone or polysilicon.
  • an insulating layer for example made of silicon dioxide, over the material, in particular where electrical fields are to be used on the microfluidic element.
  • plastics including polymers such as polymethyl methacrylate (PMMA), polycarbonate, polyesters such as polybutylene terephthalate or polyethylene terephthalate, polyamides, polytetrafluoroethylene (TEFLON "), polyvinyl chloride (PVC), polydimethylsiloxane (PDMS), polysulfone, polystyrene, Polyolefins, such as polymethylpentene, polypropylene or polyethylene, polyvinylidine fluoride, acrylonitrile-butadiene copolymer (ABS), cycloolefin polymers such as TOPAS "(thermoplastic olefin polymer with amorphous structure from Hoechst AG, Frankfurt, Germany), block copolymers or mixtures of two or more thereof usable.
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • polycarbonate polyesters such as polybutylene terephthalate or polyethylene terephthalate
  • polyamides polytetrafluoroethylene
  • Parts consisting of such polymers, in particular substrate and cover layers can be produced by known microfabrication processes, for example those mentioned above, or by means of microtechnologically produced mother molds using known molding processes, such as injection molding, embossing or stamping, or by polymerizing the monomeric precursor material within the mold (primary shaping).
  • Such polymeric materials are preferred for many purposes because they can be easily manufactured, inexpensive and also disposable. Ceramic materials are also possible, particularly in the case of hybrid microsystems. Microfluidic elements based on glass or silicon are particularly preferred.
  • All of the materials mentioned can contain specifically treated or coated surfaces or surface sections within the capillary or further the sample application areas, for example hydrophobized areas (in particular separating layers with linear Expansion), for example by silanation (coating with a silane to which a connecting molecule carrying a hydroxyl group is coupled) more functional, such as hydroxyl, groups or metal production, in particular with gold, for example by vapor deposition, or (above all to increase it) the capillary forces) hydrophilization, for example in the case of glass with a medium approach, so that the surface has many hydroxyl groups, for example with Caroic acid, or other introduction of polar groups (for example silanization with silanes containing amino or hydroxyl groups), or in the case of plastics by treatment with argon plasma, plasma etching, corona discharge (eg 10-25 W at 13.56 MHz, 1 Torr chamber pressure, 5-10 min), by covalent bonding of photoreactive hydrophilic polymers, by absorbing wetting agent-like layers or coating with
  • the capillary-active mixing zone is either connected to the liquid supply points via capillaries or directly connected to them, so that there are no separate supply capillaries.
  • the mixing zone comprises the detection zone (detection zone) for the physical or chemical signals resulting from the mixture, for example optical windows, sensors or like
  • transparent materials for the intended optical measuring range, for example, without wanting to derive a restriction, clear plastics or glass for visible light, preferably special optical glass or for short-wave (UV) light Quartz glass and, for long-wave light (IR), preferably silicon.
  • clear plastics or glass for visible light preferably special optical glass or for short-wave (UV) light Quartz glass and, for long-wave light (IR), preferably silicon.
  • Functional areas can be introduced in the mixing zone, for example electrical or biochemical in nature, which are based on the determination of the desired measurement variable.
  • sensors transducers
  • chemical sensors e.g. chemical resistors, chemical capacitors, metal oxide - gas sensors chemically sensitive field effect transistors, such as ISFETS or CHEMFETS, Microelectrodes (potentiometric or amperometric), SAW sensors, e.g. vacuum resonators, or chemosensor arrays), or biological sensors (especially CMOS-compatible), or radiation sensors (e.g.
  • thermoelectric sensors especially for fluorescence or chemiluminescence measurements
  • thermal converters Transducers for ionizing radiation
  • magnetic or mechanical transducers and any combination of such sensors.
  • Means for tempering can also be integrated, such as heating elements, e.g. polysilicon resistors or thermogenerators, or for cooling channels for coolants.
  • heating elements e.g. polysilicon resistors or thermogenerators
  • cooling channels for coolants e.g., such functional layers are necessary for the production of the invention the subject matter is not absolutely necessary - in preferred embodiments of the invention they are not present.
  • Temporary agents may alternatively or additionally also be present externally
  • the area of the mixing zone does not require any grooves or grooves or other means for aligning the capillary flow of introduced liquids along predetermined paths, so that preferably completely smooth surfaces are present
  • the liquid application points can contain means for improved connection of the application point to the capillary area, for example one or more small notches in the transition area between the liquid application point and the capillary area or areas hydrophobicized at the edge, hydrophilic or hydrophilized areas at the transition to the capillary area.However, such means are not absolutely necessary, but on the other hand in preferred embodiments of the inventive capillary mixer are available
  • Venting channels are preferably designed so that they only allow gas to be transported, not liquid (for example, by hydrophobizing the surface, at least in the border area to the mixing zone of the capillary mixer, due to the large cross-section, so that the capillary force is no longer sufficient at the transition from the mixing zone to the venting channel for the further transport of the liquid (stop junction), through formation as a microporous hydrophobic stopper which allows air to pass through but not hydrophilic liquids, or the like
  • a matrix of several of the capillary force mixers according to the invention there is a matrix of several of the capillary force mixers according to the invention, the ventilation channels of which are all connected or coupled to one another in groups, which, for example, in the case of hydrophobic separation tunnels in the mixing chamber, by pressure or, in particular, vacuum shock to overcome the separation of applied samples in all or several mixing zones at the same time and thus to initiate the contact between the samples and their subsequent mixture in a synchronized manner.
  • a pressure or vacuum surge in several capillary force mixers can simultaneously initiate the transfer of hydrophobic separating layers , for example if it is in a pressure chamber
  • Example 1 Structure of a Single Capillary Force Mixer Fig. 1 shows the exemplary structure of a single capillary force mixer, which is for example in a multi-system array (several such capillary force mixers are arranged in a matrix next to each other) or the like, held together
  • the contact surfaces are previously processed by hot forming or casting, advantageously by means of micro-technical processes such as photohthography, dry or wet etching, such as "synchrotron radiation ablation” or also by application processes, for example spinning, CVD or the like that the finished product per microfluidic channel system has a supply capillary (3 and 6) for each of the liquids and a zone (5) for mixing and detection.
  • the plates (cover and substrate layer) of the microfluidic channel array can also be glued, Weld or on whose microtechnical processes, such as anodic or eutectic bonding, are to be merged. The process must be directed and the merging must not create any additional volume
  • Example 2 Capillary Force Mixer for Mixing Two Liquids
  • the capillary force mixer shown schematically as an example in Fig. 2a for the mixing of two liquids with reactants has the following functions, which also apply analogously to capillary force mixers for mixing more than two liquids.
  • the two capillaries (3 and 6 ) are connected in the mixing and detection zone (5).
  • the introduced sample is transferred into the mixing and detection zone by capillary force ( 5) pulled, while the second capillary (6) remains free of liquid (9) This is shown in Fig 2b.
  • the calibration can be carried out by appropriate methods, preferably but not exclusively, by spectroscopic methods, particularly preferably IR spectroscopic methods.
  • the mixing front proceeds in the direction of the first capillary (3).
  • suitable methods for example methods of spectroscopy (especially IR )
  • the entire length of the mixing and detection zone (5) is available for this purpose.
  • the measurement can be distributed simultaneously at several points over the mixing and detection zone (5), or in chronological order at the same point in the mixing - And detection zone (5) are carried out
  • Example 3 Capillary force mixer with a hydrophobic separating layer
  • a layer (13) is introduced in the mixing and detection zone, which gives the site a hydrophobic character.
  • Such layers can be implemented by special surface properties such as roughness, but preferably by a hydrophobic coating , for example made of hydrophobic metal layers such as gold, in an even more preferred embodiment of hydrophobic plastics.
  • a hydrophobic coating for example made of hydrophobic metal layers such as gold, in an even more preferred embodiment of hydrophobic plastics.
  • Teflon is also called.
  • Silanization in particular with alkylsilanes, is also possible.
  • This layer (13) forms one Separation zone and causes that during the introduction (Fig.
  • This preferred embodiment of the invention not only permits the spectroscopic evaluation of both liquids before the mixing, but also enables a very precise determination of the amounts required, in particular of reagent liquid.
  • the mixing is also completed more quickly than in the first embodiment.
  • the steps shown are analogously also transferable for capillary force mixers with more than two, in particular three or four, sample application openings and sample channels opening into a common mixing and detection zone, the separation zone having a corresponding shape, for example in the case of three application openings the shape of a Y, the legs of which each separate the separation zones of the chamber sections means, in the case of four task openings, the shape of a plus sign (+), etc
  • the capillaries can be filled through the sample application opening, as shown schematically in Fig. 4, by a capillary pipette (21), at the end of which the reagent forms a microdrop (22) under gravity or light pressure (26) .
  • the capillary pipette is inserted into the full opening ( 4 or 7) until the drop reaches the bottom of the opening (27) and makes contact with the capillary (3 or 6).
  • the amount of liquid (eg sample) (28) that is absorbed into the microfluidic channel system is included determined by the dimensions of the capillary and a possibly applied back pressure (29) This makes it possible to use very small amounts of liquid, in particular of reagent liquid, which otherwise could not simply be pipetted due to the surface tension of the liquid
  • Example 5 Production of a capillary mixer a) Production of the cover layer (1) (FIG. 1) A glass wafer 10 cm long and wide and 500 ⁇ m thick is coated on both sides by means of chrome sputtering (vacuum dusting) 50 nm thick using a photoresist mask , which covers the underside and the area around the planned supply capillaries (3, 6) and the planned mixing zone (5) (together capillary area) (e.g. 0.5 x 0.5 cm), the remaining chrome layer is covered with a light-sensitive polymer (Photoesist, e.g.
  • Microposit 1818S Photo Resist Shipley Europe Ltd, Coventry, England
  • exposed the exposed area to UV light and developed (eg using Microposit 351 developer 5 1 in water) (photo thography) and then using HCI (36% - ⁇ g) the unprotected area of The chrome layer is removed (patterning).
  • the area of the future supply capillaries and the mixing zone is etched 10 ⁇ m deep with 50% HF and then the photoresist (using a photo resist remover such as Microposit Remover 1112A) and the chrome layer are removed Thickness of the mixing zone (10 ⁇ m) specified New vacuum deposition of chrome (50 nm) on both sides of the surface of the glass wafer, renewed photohthography with a mask that only leaves the areas of the future sample task opening open on the underside, and renewed Cr-Pattemmg with subsequent HF etching (50%, 60 ⁇ m) with subsequent photoresist and chrome removal as well as laser drilling to achieve openings that are accessible from outside as a liquid feed point len (full openings) (4, 7) to the side opposite to the etched out mixing zone area (the future upper side of the capillary power mixer) results in the cover plate (1) of the capillary power mixer to be manufactured
  • top and substrate layers are joined by glass fusion bonding (joining under pressure at 250 to 600 ° C after introducing HF between the layers to be joined using steam or a drop of hydrofluoric acid, which gently attaches the glass surfaces so that they bond firmly through pressure and diffusion) and together form the finished capillary force mixer

Description

Kapillarkraftmischer
Zusammenfassung der Erfindung Die Erfindung betrifft einen analytischen Kapillarkraftmischer zur Bestimmung eines oder mehrerer Analyten in einem wäßrigen oder anderen brauchbaren Losungsmittel vorzugsweise in separat aufgebrachten und in der Analysenkammer sich mischenden Probenflus- sigkeiten, bestehend aus einem Trager, einer Nachweiszone und einem zum kapillaren Flussigkeitstransport befähigten Kanal, der zwei oder mehr Flussigkeitsaufgabeoffnungen verbindet, die Verwendung des genannten KapiUarkraftmischers zur Bestimmung einer oder mehrerer Meßgroßen in einer oder mehreren Flüssigkeiten sowie ein Verfahren oder eine Methode zur Bestimmung chemischer, biochemischer, biologischer, physikalischer oder anderer meßbarer Großen in einer oder mehreren flussigen Proben mit Hilfe des besagten analytischen Kapillarkraftmessers, und/oder Verfahren zur Herstellung und Verwendung davon
Hintergrund der Erfindung
Zur guahtativen oder guantitativen analytischen Bestimmung von Bestandteilen von Korper- flussigkeiten, insbesondere von Blut, werden oft tragergebundene oder freie Tests verwendet Bei diesen sind Reagenzien entweder in entsprechenden Schichten eines festen Tragers eingebettet, der mit der Probe in Kontakt gebracht wird, oder die Reagenzien werden in einer Kammer mit der Probe gemischt Die Reaktion von flussiger Probe und Reagenzien fuhrt bei Anwesenheit eines Zielanalyten zu einem nachweisbaren Signal, insbesondere zu einem Farbumschlag, welcher visuell oder mit Hilfe eines Gerätes, meist reflexionsphoto- metπsch, ausgewertet werden kann
Die gleichzeitige Analyse einer großen Anzahl von Proben ist oft erwünscht und möglich, zum Beispiel bei Durchfluß-Zytometπe, DNA Seguenzierung, verschiedenen Arten der
Chromatographie und Elektrophorese und bei Ligand-Rezeptor-Studien Die rasche DNA- Analyse spielt zum Beispiel bei dem Human Genome Project eine große Rolle und in der Pharma- oder Agrar-Industπe ist die Forschung ohne das gleichzeitige Screening einer großen Anzahl von Stoffen auf ihre biologische Wirkung nicht mehr denkbar
Hier finden sogenannte Mikrotiter-Platten, meist mit einer genormten Große von 12 7 x 8,5 cm Anwendung Dies sind Platten, die eine Vielzahl kleiner Gefäße enthalten häufig z B 96 oder 192, aber auch weniger oder erheblich mehr sind üblich, welche mit verschiedenen Reagenzien gefüllt werden Die Reagenzien-Menge bewegt sich bei diesen Analyse-Platten im Milliliter (103 L) bis in den Mikroliter (106 L) -Bereich Im allgemeinen sind die Reagenzien kostbar, weil sie nur in kleinen Mengen verfugbar oder kostspielig sind, oder beides Daher wird eine Miniaturisierung der Tests angestrebt, besonders wenn viele Tests durchgeführt werden sollen oder müssen Die Füllung der Analysentroge (wells) wird meist durch Automaten vorgenommen, wie auch die weitere Analyse bei bevorzugten Verwendungsformen automatisiert ist Für das High-Throughput-Screenmg (HTS) sind Mikrotiterplatten zum Beispiel der Fa Greiner, 64943 Hirschberg, (Mikro-Assay-Plate) mit 1536 wells bekannt Hier ist das Arbeitsvolumen mit 4-8 μl relativ hoch Das sequentiell (nacheinander) erfolgende Einbringen der Analyten ist mit der Gefahr von Cross-Kontaminationen verbunden Entsprechende Vorsicht ist anzuwenden, bzw die Tropfengroße limitiert den Versuch der Miniatuπ- sierung des Tests Das Arbeitsvolumen einer Mikrotiterplatte von Corning Costar (55924 Bodenheim, Deutschland) liegt zwar bei nur 1-2 μl, allerdings ist auch hier die selbständige Mischung von in getrennte wells eingebrachten Analyten nicht gegeben Eine Einrichtungen zur Mischung zweier Analyten durch spontanes Mischen oder Vibration ist in der amerikanischen Patentschrift US 4,088,448 beschrieben, aber es gibt nur eine Probenaufgabestelle und Nachweisreagenzien egen vorzugsweise in fester Form vor, was ein Vorabbeschicken mit Reagenz erforderlich macht und so die flexible Verwendung der Vorrichtung limitiert Auch Patent US 5,300,779 beschreibt eine Apparatur zur Mischung zweier Analyten, doch egt nur eine Probenaufgabestelle vor und Reagenzien sind bereits fertig integriert In US- Patent US 5,627,041 wird eine Einmal-Kuvette für die Analyse biologischer Proben vorgestellt, wobei diese eine Serie von Kanälen, Kapillaren, Reservoirs und Stop-Punkten enthalt, die den gesteuerten Fluß von Probe, Reagenz und Losungsmittel erlauben Die komplexe Ausbildung dieser Kuvette ist platzintensiv und nicht für die Auslegung auf Mikrotiter-Platten geeignet Zusätzlich erfolgt der Fluß der Analyten durch das Gerat nur unter Zentrifugalkraft nicht spontan Das Patent US 5,222,808 beschreibt eine Kapillar-Misch-Apparatur, in der die Mischung nicht spontan sondern durch magnetische Partikel durchgeführt wird
Allgemeine Beschreibung der Erfindung Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht dann, die Nachteile des Standes der Technik zu beseitigen Insbesondere soll ein einfach zu handhabendes, selbststandig volumendosierendes Testelement zur Verfugung gestellt werden, mit dem unter Verwendung minimaler Probenvolumina nicht nur eine räumliche Trennung von Detektionszone und Proben- aufgabestelle möglich ist, sondern zusätzlich eine Mischung von zwei oder mehr separat aufgetragenen Flüssigkeiten stattfindet Höchstmögliche Flexibilität zum Einsatz für verschiedenste Proben und Analyten sollte gewahrleistet sein Zusätzlich soll das Mischen der Flüssigkeiten und der Transport der Flüssigkeiten zu der Detektionszone so schnell sein, daß die Analyse einer Probe zeitlich dadurch nicht limitiert wird Ein weiterer Gesichtspunkt in der Ausarbeitung der beschriebenen Erfindung ist das Bedürfnis, die Einbeziehung neuerer Messmethoden, wie, ohne auf dieses Beispiel beschrankt zu sein, beispielsweise IR- Spektroskopie, in die Analysemethoden zu ermöglichen Auch der für diese Methoden durch die Absorptionseigenschaften üblicher biologischer Losungsmittel bedingte maximale Durchmesser des Kapillarkanals muss berücksichtigt werden Des weiteren soll durch einen einfachen Aufbau des Testelements eine kostengünstige, produktionstechnisch einfach zu realisierende Fertigung ermöglicht werden, die auch den Gebrauch des Mikrofluidkanalar- rays für Massentestung (high throughput screening, HTS) unter Verwendung standardisierter Roboter und Maschinen ermöglicht
Dies wird durch den Gegenstand der Erfindung, wie er in den Patentansprüchen und nachfolgend dargestellt und naher erläutert wird, erreicht Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen insbesondere dann, daß ein kostengünstig herzustellender Kapillarkraftmischer vorgestellt wird, der auch bei paralleler Verwendung in mehrfacher Ausfuhrung in dichter Anordnung insbesondere auf der Grundflache einer herkömmlichen Mikrotiterplatte für auto- matisierte HTS zum Beispiel in der pharmazeutischen oder agribezogenen Forschung und Entwicklung angewandt werden kann Er erlaubt, daß Reaktionen mit einem Minimum an Probe und Reagenz, welche beide jeweils erst kurz vor der Analyse aufgetragen werden können, durchgeführt werden können Zusätzlich ermöglicht die Auslegung des neuartigen KapiUarkraftmischers die Anwendung neuer spektroskopischer Methoden, wie moderner Varianten der UV/VIS- oder der Fluoreszenzspektroskopie oder TIRF, insbesondere der IR- Spektroskopie, für die Analyse biologischer und anderer Stoffe in Wasser oder anderen wassπgen oder biologischen Medien Der Aufbau des neuartigen Testsystems erlaubt die Analyse von Stoffen im niedrigen Nanohter (109 L) -Bereich Es lassen sich sehr viele Systeme auf einem beispielsweise durch die Standard-Mirotiter-Platte vorgegebenen kleinen Raum kombinieren, und die Füllung der Probenaufgaboffnungen kann automatisiert durchgeführt werden Durch den gewählten Aufbau und die geringe Große des Systems ist eine aktive Mischung nicht notig, sondern Mischung findet selbständig durch Diffusion innerhalb einer kurzen Zeit statt Für die Detektion des Analyten können beispielsweise alle Varianten der Spektrometπe benutzt werden, sofern die Messstrahlfokussierung der Weite der Nachweiszone angemessen angepaßt wird Durch den besonderen Aufbau ist es möglich, insbesondere Infrarot (IR)-spektroskopιsche Untersuchungen in wassngen Losungen durchzufuhren, die in üblichen Fluidkanalsystemen wegen der hohen Absorption in diesem Spek- tralbereich des als Losungsmittel benutzten Wassers nicht möglich sind
Verzeichnis der Abbildungen
Abbildung 1 (Fig 1) zeigt einen einzelnen erfmdungsgemassen Kapillarkraftmischer Abbildung 2 (Fig 2) zeigt die Funktion eines erfmdungsgemassen KapiUarkraftmischers Abbildung 3 (Fig 3) zeigt einen solchen Kapillarkraftmischer mit hydrophober Trennschicht Abbildung 4 (Fig 4) zeigt exemplarisch die Flussigkeitsaufgabe bei einem erfmdungsgemassen Kapillarkraftmischer
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist ein nachfolgend als Kapillarkraftmischer bezeichnetes analytisches Mikrofluidkanalarray zur Bestimmung eines oder mehrerer Analyten oder des Zu- Standes eines oder mehrerer Analyten in einem wassngen oder ferner einem anderen brauchbaren (insbesondere hydrophilen) Losungsmittel oder Losungsmittelgemisch (Analyt plus Losungsmιttel(gemιsch) = nachfolgend "Flüssigkeit"), bestehend aus einen inerten Trager, einer Nachweiszone und einem zum kapillaren Flussigkeitstransport befähigten Kanal, der zwei oder mehr Probenaufgabeoffnungen verbindet Der Aufbau des neuartigen Test- Systems erlaubt die Analyse kleinster Mengen, d h solcher im niedrigen Nanohter (109 L) - Bereich, insbesondere im Bereich von 0,05 bis 800 nl, vorzugsweise 0,1 bis 100, insbesondere 0,1 bis 50 nl Es lassen sich sehr viele Systeme auf dem durch die Standard-Mikrotiter- Platten vorgegebenen kleinen Raum kombinieren, und die Füllung der Probeaufgabeoff- nungen kann automatisiert durchgeführt werden Durch den gewählten Aufbau und die geringe Große des Systems ist eine aktive Mischung nicht notig, sondern eine Mischung findet selbständig durch Diffusion innerhalb weniger Minuten statt Der Kapillarmischer hat überdies die Vorteile leichter Befullbarkeit und guter Dosierbarkeit Durch die getrennten Flussigkeitsaufgabestellen wird die Gefahr der Cross-Kontammation verringert, und der Kapillarkraftmischer kann flexibel durch Auswahl einer geeigneten Reagenzlosung kurz vor der Messung an eine gegebene, zu analysierende Probe angepasst werden Insbesondere handelt es sich um einen Kapillarkraftmischer für die Analyse von (insbesondere zwei oder mehr) Flüssigkeiten, die (insbesondere zwei oder mehr) Reagenzien (Reak- tanden) umfassen, die zur Reaktion zusammengeführt und gemischt werden (wobei deren Zusammenfuhrung insbesondere zum Erhalt näherer (quantitativer oder qualitativer) Infor- mationen über mindestens eines der Reagenzien (Analyt) fuhrt oder durch physikalische oder chemische Reaktion eine neue Komponente bildet), dadurch gekennzeichnet, dass zum Kapillarkraftmischer mindestens zwei Flussigkeitsaufgabestellen (= Probenaufgabeoff- nungen) gehören und er Kapillarbereiche (insbesondere Zufuhrkapillaren) umfasst, die ermöglichen, dass die Flüssigkeiten durch Kapillarkraft ohne Zufügen äußerer Kräfte in den Kapillarkraftmischer aufgenommen werden und dass eine selbst kapillaraktive Mischzone vorliegt, in welche die Flüssigkeiten durch Kapillarkraft gelangen und in welcher eine Mischung der Flüssigkeiten im wesentlichen durch Diffusion erfolgt
Die Erfindung betrifft insbesondere einen Kapillarkraftmischer nach dem vorhergehenden Absatz, dadurch gekennzeichnet, dass zwei jeweils in eine Kapillare mundende Flussig- keitsaufgabestellen vorliegen, die getrennt oder nacheinander befullbar sind und in einer gemeinsamen, ebenfalls kapillarwirksamen Mischzone munden, wobei vorzugsweise die Kapillaren parallel zu den Kanten der Mischzone verlaufen
In einer anderen Ausfuhrungsform betrifft die Erfindung einen Kapillarkraftmischer nach einem der beiden letzten Absätze, wobei die kapillaraktive Mischzone selbst direkt mit den Flussigkeitsaufgabestellen verbunden ist, so dass keine zusätzlichen Kapillaren vorliegen
Starker bevorzugt ist ein Kapillarkraftmischer nach einem der drei letzten Absätze dadurch gekennzeichnet, dass keine beweglichen oder aktiven Teile zur Funktion vorhanden sind
Insbesondere bevorzugt ist ein Kapillarkraftmischer gemass dem letzten Absatz worin die Schichtdicke der Flüssigkeiten in der Mischzone fest voreingestellt ist
Bevorzugt ist ein Kapillarkraftmischer nach dem letzten Absatz, dadurch gekennzeichnet dass die Schichtdicke der Flüssigkeiten in der Mischzone fest in einem Bereich von 0 1 bis 10 000 μm, vorzugsweise in einem Bereich von 1 bis 100 μm, voreingestellt ist
Starker bevorzugt ist ein Kapillarkraftmischer nach dem vorletzten oder letzten Absatz dessen Mischzone so ausgebildet ist dass die Schichtdicke der Flüssigkeiten in der Mischzone so eingestellt ist daß IR-spektroskopische Messungen in wassngen Losungsmitteln durch- geführt werden können; vorzugsweise ist die Schichtdicke der Flüssigkeiten in der Mischzone fest in einem Bereich von unter 30 μm, insbesondere von 3 bis 30, vor allem von 5 bis 10 μm voreingestellt.
Besonders bevorzugt ist ein Kapillarkraftmischer nach einem der vorhergehenden sieben Absätze, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere funktionale Bereiche mit Mitteln zum Temperieren ausgestattet sind, oder ein Kapillarkraftmischer nach einem dieser Absätze, bei dem funktionale Schichten im Bereich der Mischzone eingebracht sind.
Noch bevorzugter ist ein Kapillarkraftmischer nach dem letzten Absatz, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere funktionale Teile mit Sensoren, insbesondere elektroche- mischen Sensoren, ausgestattet sind.
Ganz besonders bevorzugt ist ein Kapillarkraftmischer nach einem der letzten neun Absätze, dadurch gekennzeichnet, dass in der Mischzone eine oder bei mehr als zwei Flüssigkeitsaufgabestellen mehrere hydrophobe oder anders gestaltete Trennschichten vorhanden (= auf die Innenfläche des Kapiliarbereichs, insbesondere der Mischzone aufge- bracht) sind, die eine vorzeitige Mischung der durch Kapillarkraft in die Mischzone gebrachten Flüssigkeiten verhindern, insbesondere weiter dadurch gekennzeichet, dass zur vollständigen Füllung der Mischzone ein Entlüftungskanal (Lüftungsschacht) vorhanden ist; vorzugsweise ist hierbei die Volumenkalibrierung (Flüssigkeitsmenge) der (aufzutragenden) Flüssigkeiten durch die Abmessungen der Mischzone bis zur hydrophoben Zone fest vor- gegeben.
Noch stärker bevorzugt ist ein Kapillarkraftmischer gemäss einem der letzten 10 Absätze, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen der Zuführkapillaren und der Mischzone (in einer Erfindungsvariante ohne Zuführkapillaren nur das Volumen der Mischzone) im Bereich von 0,05 bis 800 nl voreingestellt ist, vorzugsweise 0,1 bis 100, insbesondere 0,1 bis 50 nl beträgt.
Sehr bevorzugt ist ein Kapillarkraftmischer gemäss einem der letzten elf Absätze, der aus zwei Einzelteilen (Deck- und Substratschicht) zusammengesetzt ist.
Insbesondere ist ein Kapillarkraftmischer gemäss einem der letzten zwölf Absätze, der aus Silizium, aus Glas oder beidem besteht (ermöglicht hochpräzise Konstruktion) bevorzugt. Noch bevorzugter ist ein Kapillarkraftmischer nach einem der letzten dreizehn Absätze, bei dem Mittel zur Detektion auf optischem, elektrochemischem oder anderem geeignetem Wege von Reaktionen vorliegen, die innerhalb der in das Kapillarsystem integrierten Mischzone nach Mischung der Flüssigkeiten stattfinden
Besonders bevorzugt ist hierbei ein Kapillarkraftmischer gemäss einem der vorstehenden vierzehn Absätze, der eine Linse oder eine Fresnel-L se, insbesondere im Bereich der Mischzone, vorzugsweise integriert auf der Aussenseite des KapiUarkraftmischers, vor allem bei Kunststoffausfuhrungen (in erster Linie eines optisch transparenten Bereichs), umfasst
Eine weitere bevorzugte Ausfuhrungsform der Erfindung ist auf Verwendung des Kapillar- kraftmischers nach einem der letzten fünfzehn Absätze für die Analyse mindestens zweier Flüssigkeiten, die zur Reaktion zusammengeführt und gemischt werden und deren Zusammenfuhrung zum Erhalt näherer Informationen über mindestens eine der Flüssigkeiten fuhrt, oder deren Reaktion eine neue Komponente bildet, dadurch gekennzeichnet, daß alle Flüssigkeiten durch Kapillarkraft ohne Zufügen äußerer Kräfte in den Kapillarkraftmischer gefüllt werden und deren Mischung im wesentlichen durch Diffusion erfolgt, gerichtet
Insbesondere ist die Verwendung des KapiUarkraftmischers nach dem vorstehenden Absatz bevorzugt, wobei die Messmethode eine spektroskopische Methode, insbesondere eine spektroskopische Messmethode, die elektromagnetische Wellen mit einer Wellenlange von etwa 160 bis etwa 20000 nm, vorzugsweise von etwa 180 bis etwa 15000 nm vor allem IR- Licht mit einer Wellenlange von etwa 700 bis etwa 15000 nm, vor allem etwa 2500 bis 15000 nm, benutzt
Bevorzugt ist auch die Verwendung eines KapiUarkraftmischers wie oben beschrieben für die Analyse durch elektrochemische oder enzymatische Methoden
Besonders bevorzugt ist die Verwendung gemäss einem der letzten drei Absätze eines Ka- pillarkraftmischers, dadurch gekennzeichnet, dass zur Messung eines Referenzwertes direkt in situ eine Detektion vor der Befullung mit der zweiten oder spateren Flüssigkeit (Rea- genziosung oder Probenlosung) durchgeführt wird
Sehr bevorzugt ist die Verwendung eines KapiUarkraftmischers nach einem der letzten vier Absätze, wobei eine der Flüssigkeiten eine biologische Probe, insbesondere Vollblut, ist Sehr bevorzugte Ausfuhrungsformen der erfmdungsgemassen Verfahren und Vorrichtungen finden sich in den Beispielen
Bei den Flüssigkeiten handelt es sich zum einen um Proben, insbesondere um biologische Proben, wie Blut (Vollblut) , Blutplasma, Blutserum, Speichel, Schweiss, Urin, Eiter, Magen- saft, Galle, andere Verdauungssafte, Liquor, Tranenflussigkeit, Milch, Drusensekrete, Syn- ovialflussigkeit, aber auch Hamolymphe aus Insekten, flussige Nahrungsmittel oder Nah- rungsmittelbestandteile in der Ernahrungsanalytik, Kulturmedien, Zellplasma, Medikamente, oder auch Gewasserproben, beispielsweise aus Seen, fliessenden Gewässern oder Klaranlagen, Extrakte oder sonstige zu analysierende Flüssigkeiten, die jeweils nach Aufarbei- tung, wie Zentπfugation, Filtration, Chromatographie oder dergleichen, oder insbesondere ohne Aufarbeitung (insbesondere im Falle von Blut, wo auch zellulare Bestandteile enthalten sein können, die insbesondere bei geringer Schichtdicke der Mischzone aus dem Mischbereich ausgeschlossen sein können, oder bei grosseren Schichtdicken aufgrund ihrer langsamen Diffusion im Gegensatz zur sie umgebenden Flüssigkeit nur sehr langsam in einen Bereich der Mischzone mit einer Reaganzlosung eindiffundieren, so dass dort
Eigenschaften der umgebenden Flüssigkeit direkt gemessen werden können) auf die Flus- sigkeitsaufgabezonen aufgegeben werden können, wobei diese Proben qualitativ oder quantitativ nachzuweisende Reaktanden (Analyte), insbesondere Enzyme, Antikörper, Nukleinsäuren, andere Biomakromolekule, Zucker, Lipide, Liposacchande, organische Sauren, Aminosäuren, Medikamente oder andere Xenobiotika, Metabohte, Enzymsubstrate, andere organische Verbindungen, Schwermetalle, Ionen, Gase oder dergleichen enthalten Zum anderen handelt es sich um Losungen von Nachweisreagenzien ("Reagenzιen0 "Reagenzlosungen"), mit komplementären (d h zu irgend einer Art der nachweisbaren Wechselwirkung, z B chemischer (emschhesslich biochemischer oder biologischer) oder physi- kahscher Art, mit einem oder mehreren Analyten aus den Proben, befähigten) Reaktanden (insbesondere gegebenenfalls fluoreszenz-, enzym- oder anderweitig denvatisierten Anti- korpern, niedermolekulare Reagenzien (beispielsweise Substrate und/oder Kosubstrate für enzymatische Reaktionen mit Komponenten in den Proben oder interkaherende (z B Fluoreszenz-) Farbstoffe), Enzyme oder andere Katalysatoren, Mischungen von Enzymen oder anderen Katalysatoren mit Substraten und/oder Kosubstraten, Komplexbildner, etc die vorzugsweise nach der Durchmischung mit einer Probe jeweils eine spezifische Änderung einer physikalischen oder chemischen Eigenschaft ("Signal") bewirken, welche detektiert werden kann und für analytische Zwecke ausgewertet werden kann vor allem computerge- stutzt Bevorzugte Anwendungen sind auch PCR und Hybridisierung von Nukleinsäuren oder Derivaten (z B fluoreszenzmarkiert, oder mit modifizierten Basen und/oder Back- bones) davon
Dass die Mischung im wesentlichen durch Diffusion erfolgt, bedeutet, dass keine ausseren Hilfsmittel zur Mischung (wie Vibration, Ruhren, Zentπfugagtion oder dergleichen) notig sind und insbesondere keine derartigen Mittel eingesetzt werden, um die Mischung aufgetragener Flüssigkeiten hervorzurufen (allenfalls zur Überwindung hydrophober Trennschichten, um die aufgetragenen Flüssigkeiten in Kontakt zu bringen) Insbesondere handelt es sich um die Ine anderdiffusion von 2 oder mehr Flüssigkeiten, im Unterschied zur Diffusion von Festsubstanzen in eine Flüssigkeit
Die Detektion von aus der Durchmischung resultierenden (oder vorhergehenden, um insbesondere eine Kalibrierung zu ermöglichen) Signalen ist mit herkömmlichen Spektrometern möglich, lediglich die Meßstrahlfokussierung sollte der Weite der Nachweiszone angepaßt werden Durch den besonderen Aufbau ist es möglich, insbesondere Infrarot (IR)-spektros- kopische Untersuchungen in wassngen Losungen durchzufuhren, die in üblichen Fluidka- nalsystemen wegen der hohen Absorption in diesem Spektralbereich des als Losungsmittel benutzten Wassers nicht möglich sind IR-Spektroskopie kann mit ausreichender Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit nur bis zu einer Wasserschichtdicke von etwa 10 μm (in besonderen Fallen auch bis zu 30 μm) betrieben werden Die Dickenvariation der Messkam- mer ist dabei für eine zuverlässige Reproduzierbarkeit so gering wie möglich zu halten
IR-Spektroskopie ist eine Routine-Methode und wird von organischen Chemikern, Biochemikern und anderen zum qualitativen und quantitativen Molekulnachweis eingesetzt Wenn Infrarot-Licht durch eine Probe eines organischen Stoffes geleitet wird, werden einige der Frequenzen absorbiert, wahrend andere Frequenzen ungeschwacht durch die Probe gelei- tet werden Anwendungen in der Analyse organischer Stoffe benutzen fast ausschließlich IR-ücht mit Wellenzahlen im Bereich 650-4000 cm 1 (Mitt-IR) Wellenzahlen unterhalb von 650 cm 1 werden als fernes IR (Far Infrared = FIR) bezeichnet , solche oberhalb von 4000 cm 1 als Nah-IR (Near Infrared = NIR)
IR-Spektroskopie schließt auch Laser-Raman-Spektroskopie ein, einschließlich Raman-kon- fokaler Laser-Spektroskopie, Fouπer-Transformations-IR (FTIR)-spektroskopιe oder Hada- mard-Transformations-IR, oder jede andere IR-spektroskopische Methode Mittels der be- sonders bevorzugten Founer-Transform (FT-IR)-Spektroskopιe sind ohne weiteres qualitative und quantitative Bestimmungen von Analyten im Pikogramm (pg)-Bereιch möglich Mit anderen optischen Methoden, wie UV/VIS- oder insbesondere Fluoreszenz- oder Chemiiu- mmeszenzspektroskopie, können noch sehr viel geringere Mengen nachgewiesen werden Auch die "Total infernal reflection fluorescence technique (TIRF, siehe Garlamd PB et al Optical evanescent methods for study of biomolecular mteractions, Quart Rev Biophys 29 91-117 (1996), die auf der Detektion von ausserhalb des Hauptstrahls aus dem Material herausgetragenen Strahlen basiert, kann Anwendung finden
Wie bei allen Methoden der Spektroskopie ist auch bei der IR-Spektroskopie das erhaltene Signal abhangig von der Schichtdicke der untersuchten Probe, so daß das IR-Signal, das von einer < 10 μm Zelle erhalten wird, sehr schwach ist Dieser Nachteil kann durch eine unmittelbar vorhergehende Kalibrierung zum größten Teil aufgefangen werden, da dadurch die Mess-Ungenauigkeiten zu einem großen Teil eliminiert werden Die hierfür notwendige Steuerung und Software sind grundsätzlich bereits Stand der Technik und oft in Spektro- metern zu finden Die Möglichkeit zur Kalibrierung der Proben direkt vor der Mischung bei der exakt gleichen optischen Weglange wie im Mischzustand ist ein entscheidender Vorteil des neuen Mikrofluidkanalsystems Dies ermöglicht insbesondere auch Differenzmessungen (Vergleich vorher/nachher)
Geeignete Analysegerate, insbesondere FT-IR-Gerate, sind leicht zugänglich, insbesondere kommerziell erhältlich, beispielsweise von Bruker (Karlsruhe, Deutschland), z B Bruker Spectrum GX FT-IR Spectrometer Bruker Equmox 55, Beispiele für UV/VIS-Gerate sind das Lambda 40 oder das Lambda 800 UV/VIS Spectrometer System von Perkm Eimer
Als inerter Trager (Matrix) für einen erfmdungsgemassen Kapillarkraftmischer dient ein em- oder mehrteiliges Substrat, das durch die zu app zierenden Flüssigkeiten nicht oder nicht innerhalb des für die Applikation und Messung erforderlichen Zeitraumes nicht oder nicht wesentlich angegriffen wird, insbesondere aus einem oder mehreren der nachfolgend genannten Materialien
Das neue Mikrofluidkanalsystems ist in einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung sehr einfach aufgebaut Durch das Fehlen jeglicher beweglicher Komponenten ist der (bevorzugte) Aufbau des Tragers aus zwei mikrotechnisch im Batch-Verfahren bearbeiteten Platten (Deck- und Substratschicht) möglich. Dieses Verfahren ist sehr kostengünstig und basiert auf dem letzten Stand der Technik. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung kann ein matrixförmiges Array, beispielsweise bestehend aus einer Deck- und Substratschicht, welches mehrere der erfindungsgemässen Kapillarkraftmischer (gegebenen- falls mit Entlüftungskanälen, hydrophoben Trennschichten oder anderen Merkmalen bevorzugter Ausführungsformen dieser Kapillarkraftmischer, wie hierin beschrieben) in matrixartiger Anordnung beinhaltet, z.B. insgesamt mit den Abmessungen von üblichen Mi- krotiterplatten, vorliegen, das insbesondere direkt aus zwei Teilen (Deck- und Substratschicht) hergestellt werden kann.
Die Herstellung eines erfindungsgemässen KapiUarkraftmischers erfolgt insbesondere, indem man die Bestandteile des erfindungsgemässen KapiUarkraftmischers (vorzugsweise gerichtet) zusammengefügt und durch Halteeinrichtungen, wie Klemmen oder dergleichen, miteinander verbindet. Die Bestandteile, z.B. Platten (Deck- und Substratschicht), des Mi- krofluidkanalarrays können auch durch Verkleben (beispielsweise mittels Polymerisations-, Polyadditions- oder Polykondensationswerkstoffen, die auch mit Füllstoffen versetzt sein können, z.B. zur Erhöhung der elektrischen Leitfähigkeit mit Silberpartikeln), Verschweis- sen, Glass Fusion Bonding oder andere mikrotechnische Verfahren wie anodisches oder eutektisches Bonding zusammengefügt werden. Hierbei muß gerichtet verfahren werden, d.h., die Bauteile müssen genau fluchten ("Alignment"), um die Deckungsgleichheit, bei- spielsweise vorhandener Kanäle, zu gewährleisten, und die Zusammenfügung darf im Kapillar- bzw. Mischzonenbereich kein zusätzliches Volumen entstehen lassen.
Eine Reihe von Materialien können verwendet werden. Vorzugsweise, da die Vorrichtungen mikrotechnisch hergestellt werden, sind die Materialien so ausgesucht, dass sie mit bekann- ten Mikrofabrikations-Techniken kompatibel sind. Hierzu gehören z.B. Methoden zur Entfernung von Material von der Oberfläche, wie Nassätzen, elektrochemisches Ätzen, anisotropes Ätzen oder insbesondere chemische Nassätzung, beispielsweise im Falle von Si02 mittels Fluorwasserstoff/Ammoniumfluorid in An- oder Abwesenheit von Essigsäure, oder Trockenätzen, wie Plasmaätzprozesse, wie Zerstäubung, plasmachemisches Ätzen, reaktives lonenätzen, lonenstrahlätzen oder anisotropes Tiefenätzen mittels RIE, lonenstrahlverfah- ren, wie lonenstrahlätzen, Laserablation (Laser-Abtragung), Photolithographie, insbesondere Laserablation; Aufbringen von Material, beispielsweise mittels PVD, sei es ohne Plasmaunterstützung (z.B. thermisches Verdampfen, Flash-Verdampfen, MBE, VPE oder Elektro- nenstrahlverda pfen), CVD (thermisch gestützt oder plasmagestützt (PECVD)), lasergestützte Materialabscheidung oder nasschemische Metallabscheidung (galvanisch oder chemisch); oder direkte Formgebungsverfahren, wie Vakuumformung, Spritzguss oder andere Urformmethoden, Pressung, Prägung (beispielsweise heisse Prägung), und dergleichen, je nach Eignung für das jeweilige Material, oder Kombinationen davon. Die Materialien werden auch selektioniert nach ihrer Eignung für den gesamten Bereich an Bedingungen, denen die Mikrofluidiksysteme ausgesetzt werden sollen, einschließlich extremer Temperatur-, pH- oder Salzkonzentrationsbedingungen oder der Anwendung elektrischer oder magnetischer Felder. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei den Materi- alien um solche, die auch in der Halbleiterindustrie Anwendung finden, wo regelmässig Mi- krofabrikationstechniken Anwendung finden, insbesondere auf Siliziumbasis, wie Silizium, oder andere Halbleitermaterialien, wie Galliumarsenid. Andere bevorzugte Materialien sind Siliziumdioxid, Glas, wie Borosilikatgläser, Quarz, Quarzglas, Silikon oder Polysilikon. Im Falle von Halbleitermaterialien kann es oft zweckmässig sein, eine Isolierschicht, beispiels- weise aus Siliziumdioxid, über das Material zu schichten, insbesondere, wo elektrische Felder auf dem Mikrofluidelement Anwendung finden sollen. Weitere bevorzugte Materialien sind Kunststoffe, u.a. Polymere, wie Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat, Polyester, wie Polybutylentherephthaiat oder Polyethylentherephthalat, Polyamide, Polytetraflu- orethylen (TEFLON"), Polyvinylchlorid (PVC), Polydimethylsiloxan (PDMS), Polysulfon, Po- lystyrol, Polyolefine, wie Polymethylpenten, Polypropylen oder Polyethylen, Polyvinylidinflu- orid, Acrylnitril-Butadien-Copolymer (ABS), Cycloolefinpolymere wie TOPAS" (Thermoplastisches Olefin-Polymer mit amorpher Struktur der Hoechst AG, Frankfurt, Deutschland) Blockcopolymere oder Gemische von zwei oder mehr davon verwendbar. Aus solchen Polymeren bestehende Teile, insbesondere Substrat- und Deckschichten, sind nach bekannten, beispielsweise den oben genannten, Mikrofabrikationsverfahren herstellbar, oder mittels mikrotechnisch hergestellter Mutterformen unter Verwendung bekannter Formungsverfahren, wie Spritzguss, Prägen oder Stempeln, oder durch Polymerisation des monomeren Vorläufermaterials innerhalb der Form (Urform). Derartige polymere Materialien sind für viele Zwecke bevorzugt, da sie leicht herstellbar, preisgünstig und auch wegwerfbar sein können. Auch Keramikmaterialien sind möglich, insbesondere bei hybrid aufgebauten Mikrosyste- men. Mikrofluidikelemente auf Glas- oder Siliziumbasis sind besonders bevorzugt. Alle genannten Materialien können spezifisch behandelte oder beschichtete Oberflächen oder Oberflächenabschnitte innerhalb des Kapillar- oder ferner der Probenaufgabebereiche enthalten, beispielsweise hydrophobisierte Bereiche (insbesondere Trennschichten mit linearer Ausdehnung), z B durch Silanierung (Beschichtung mit einem Silan, an das ein eine Hydro- xygruppe tragendes Verbindungsmolekul gekoppelt wird) funktioneller, wie Hydroxy-, Gruppen oder Metalherung, insbesondere mit Gold, z B durch Aufdampfen, oder (vor allem zur Erhöhung der Kapillarkrafte) Hydrophihsierung, z B bei Glas mitteis Anatzung, so dass die Oberflache viele Hydroxygruppen aufweist, beispielswiese mit Caro scher Saure, oder anderweitige Einfuhrung polarer Gruppen (z B Silanisierung mit ammo-oder hydroxygruppen- haltigen Silanen), oder bei Kunststoffen durch Behandlung mit Argon-Plasma, Plasmaatzung, Korona-Entladung (z B 10-25 W bei 13,56 MHz, 1 Torr Kammerdruck, 5-10 min), durch kovalente Bindung photoreaktiv ausgerüsteter hydrophiler Polymerer, durch Aufbπn- gung netzmittelartiger Schichten oder Beschichtung mit Nanokompositen mittels SolJGel- technologie, durch dünne Al203-Beschιchtung (Bedampfen mit AI, nachfolgende Oxidation auf elektrochemischem Wege, durch Erhitzen in Wasser oder mittels Wasserdampf), im Falle von PMMA insbesondere durch Anatzen mit KOH, oder durch andere thermische, physikalische oder chemische Methoden, je nach Eignung für das jeweilige Material
Die kapillaraktive Mischzone ist entweder über Kapillaren mit den Flussigkeitsaufgabestellen verbunden, oder direkt mit diesen verbunden, so dass keine separaten Zufuhrkapillaren vorhanden sind Die Mischzone umfasst die Nachweiszone (Detektionszone) für die aus der Mischung resultierenden physikalischen oder chemischen Signale, beispielswiese optische Fenster, Sensoren oder dergleichen
Um optische Auswertung zu ermöglichen, ist der Aufbau mit für den vorgesehenen optischen Meßbereich transparenten Materialien möglich, zum Beispiel, ohne dadurch eine Einschränkung ableiten zu wollen, für sichtbares Licht klare Kunststoffe oder Glas, für kurzwel- hges (UV) Licht vorzugsweise optisches Spezialglas oder Quarzglas und für langwelliges Licht (IR) vorzugsweise Silizium Für die Befullung des Kanals durch Kapillarkraft ist die Benetzbarkeit der Matrix zwingend notig, was durch entsprechende Behandlung der Oberflachen erreicht werden kann (siehe oben)
In der Mischzone können funktionale Bereiche (Schichten) eingebracht werden zum Beispiel elektrischer oder biochemischer Natur, die sich nach der Bestimmung der gesuchten Meßgroße richten Hier handelt es sich vorzugsweise um Sensoren (Wandler), wie insbesondere chemische Sensoren (z B Chemowiderstande, Chemokapazitaten, Metalloxid- Gassensoren chemisch senistive Feldeffekttransistoren, wie ISFETS oder CHEMFETS, Mikroelektroden (potentiometπsch oder amperometπsch), SAW-Sensoren, z B Vakuumresonatoren, oder Chemosensorarrays), oder biologische Sensoren (insbesondere CMOS- kompatible), oder Strahlungssensoren (z B Fotodioden oder Bildsensoren, insbesondere für Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzmessungen), ferner auch thermische Wandler, Wandler für ionisierende Strahlung, magnetische oder mechanische Wandler, sowie beliebige Kombinationen derartiger Sensoren Auch Mittel zum Temperieren können integriert sein, wie Heizelemente, z B Polysiliziumwiderstande oder Thermogeneratoren, oder zur Abkühlung Kanäle für Kuhlmittel Solche funktioneile Schichten sind jedoch für die Herstellung des die Erfindung ausmachenden Gegenstandes nicht zwingend notig - in bevorzug- ten Ausfuhrungsformen der Erfindung hegen sie nicht vor Tempeπermittel können alternativ oder ergänzend auch extern vorliegen
Der Bereich der Mischzone bedarf keinerlei Riefen oder Rillen oder anderer Mittel zur Ausrichtung des Kapillarflusses eingebrachter Flüssigkeiten entlang vorbestimmter Wege, so dass vorzugsweise völlig glatte Oberflachen vorliegen
Die Flussigkeitsaufgabestellen können Mittel zur verbesserten Verbindung der Aufgabestelle mit dem Kapillarbereich enthalten, beispielsweise eine oder mehrere kleine Kerben im Ubergangsbereich zwischen Fiussigkeitsaufgabestelle und Kapillarbereich oder am Rande hydrophobisierte, am Übergang zum Kapillarbereich hydrophile oder hydrophilisierte Bereiche Jedoch sind derartige Mittel nicht zwingend notwendig, aber andererseits bei bevor- zugten Ausfuhrungsformen des erf dungsgemassen KapiUarkraftmischers vorhanden
Entluftungskanale sind vorzugsweise so konzipiert, dass sie nur einen Gas-, nicht den Flussigkeitstransport ermöglichen (beispielsweise durch Hydrophobisierung der Oberflache, wenigstens im Grenzbereich zur Mischzone des KapiUarkraftmischers, durch grossen Querschnitt, so dass am Übergang von der Mischzone zum Entluftungskanal die Kapillarkraft nicht mehr ausreicht für den Weitertransport der Flüssigkeit (Stop Junction), durch Ausbildung als mikroporöser hydrophober Stopfen, der Luft, aber nicht hydrophile Flüssigkeiten durchlasst, oder dergleichen
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung hegt eine Matrix mehrerer der erfmdungsgemassen Kapillarkraftmischer vor, deren Entluftungskanale alle oder gruppenweise miteinander verbunden (gekoppelt) vorliegen, was beispielsweise im Falle hydrophober Trennzonnen in der Mischkammer erlaubt, durch Druck- oder insbesondere Unterdruckstoß die Trennung von apphzierten Proben in allen oder mehreren Mischzonen gleichzeitig zu überwinden und so den Kontakt zwischen den Proben und deren anschhessende Mischung synchronisiert einzuleiten Auch bei getrennten Entluftungskanalen kann jedoch durch einen Druck- oder Unterdruckstoss bei mehreren Kapiliarkraftmischern synchron die Uber- wmdung hydrophober Trennschichten eingeleitet werden, beispielsweise bei Vorliegen in einer Druckkammer
Beispiele Die nachfolgenden Exemphfizierungen dienen der Illustration der Erfindung, ohne ihren Umfang einschranken zu wollen
Beispiel 1 Aufbau eines einzelnen KapiUarkraftmischers Abb 1 stellt den beispielhaften Aufbau eines einzelnen KapiUarkraftmischers, der beispielsweise in einem Multisystemarray (mehrere derartige Kapillarkraftmischer matrixartig neben- emanderhegend) vorliegt, dar Die beiden Platten (1 , 2) werden gerichtet zusammengefugt und durch Halteeinrichtungen, wie Klemmen oder dergleichen, zusammengehalten Die Kontaktflachen sind vorher durch Warmumformung oder Gießen, vorteilhaft durch mikro- technische Verfahren wie Photohthographie, trockenes oder nasses Atzen, so wie "Syn- chroton Radiation ablation" oder auch durch Auftragsverfahren, beispielsweise Aufspinnen, CVD oder ähnlichem, so bearbeitet worden, daß das fertige Produkt pro Mikrofluidkanalsys- tem eine Zufuhrkapillare (3 und 6) für jede der Flüssigkeiten und eine Zone (5) für die Mischung und Detektion aufweist Die Platten (Deck- und Substratschicht) des Mikroflui- dkanalarrays können auch durch Verkleben, Verschweissen oder andere mikrotechnische Verfahren wie anodisches oder eutektisches Bonding zusammengefugt werden Hierbei muß gerichtet verfahren werden und die Zusammenfugung darf kein zusätzliches Volumen entstehen lassen
Beispiel 2 Kapillarkraftmischer für die Mischung zweier Flüssigkeiten Der als Beispiel in Abb 2a schematisch dargestellte Kapillarkraftmischer für die Mischung zweier Flüssigkeiten mit Reaktanden hat die folgenden Funktionen, die sinngemäß auch für Kapillarkraftmischer für die Mischung von mehr als zwei Flüssigkeiten zutreffen Die beiden Kapillaren (3 und 6) sind in der Misch- und Detektionszone (5) verbunden Bei Befullung der ersten Kapillare (3) durch die Fulloffnung (= Flussigkeitsaufgabestelle) (4) mit Probenflus- sigkeit (8) wird die eingebrachte Probe durch Kapillarkraft in die Misch- und Detektionszone (5) gezogen, wahrend die zweite Kapillare (6) frei von Flüssigkeit bleibt (9) Dies ist in Abb 2b dargestellt Nun kann die Kalibrierung durch entsprechende Methoden, vorzugsweise aber nicht ausschließlich, durch spektroskopische Methoden, besonders bevorzugt IR- spektroskopische Methoden, durchgeführt werden Anschließend wird die zweite Kapillare (6) durch die Fulloffnung (= Flussigkeitsaufgabestelle) (7) mit Reagenzflussigkeit (10) be- fullt An der Kontaktflache mit der Probenflussigkeit (8) in der Misch- und Detektionszone (5) findet sofort eine Mischung (11) statt (Abb 2c) Die Mischfront schreitet in Richtung der ersten Kapillare (3) voran Dies kann zeitaufgelost durch geeignete Methoden, zum Beispiel Methoden der Spektroskopie (insbesondere IR), detektiert werden Dazu steht die gesamte Lange der Misch- und Detektionszone (5) zur Verfugung Die Messung kann dabei gleichzeitig an mehreren Punkten über die Misch- und Detektionszone (5) verteilt, oder in zeit- licher Folge an der selben Stelle der Misch- und Detektionszone (5) durchgeführt werden
Beispiel 3 Kapillarkraftmischer mit hydrophober Trennschicht
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrung (Abb 3) des KapiUarkraftmischers ist in der Misch- und Nachweiszone eine Schicht (13) eingebracht, welche der Stelle einen hydrophoben Charakter verleiht Solche Schichten können ausgeführt sein durch spezielle Oberfla- chenbeschaffenheit wie Rauhigkeit, vorzugsweise jedoch durch hydrophobe Beschichtung, etwa aus hydrophoben Metallschichten wie beispielsweise Gold, in noch starker bevorzugter Ausfuhrung aus hydrophoben Kunststoffen Als Beispiel eines solchen hydrophoben Kunststoffes sei, ohne Einschränkungen daraus abzuleiten, Teflon genannt Auch Silani- sierung, insbesondere mit Alkylsilanen, ist möglich Diese Schicht (13) bildet eine Trenn- zone und bewirkt, dass wahrend des Einbringens (Abb 3a) der wassngen Flüssigkeit (z B Probe) (14) die Kapillarkraft die Flüssigkeit nur bis zu der hydrophoben Grenzflache (13) vordringt (15) Dies ist schematisch in Abb. 3b dargestellt Ebenso wird die zweite Flüssigkeit (z B Reagenz) (16, Abb 3c) nur bis zu der gegenüberliegenden Seite der Grenzflache (13) eingezogen (17, Abb 3d) Auf diese Weise kann eine Kalibrierung an beiden Flussig- keiten (14, 16) in den Kapillarbereichen 15 bzw 17 vor Beginn der Reaktion durch Mischen durchgeführt werden Nach Überwindung der Trennung durch die hydrophoben Kräfte der Trennzone mittels geeigneter Methoden, zum Beispiel eine geringe Erschütterung, Druck- anderung (insbesondere durch Anlegen eines Unterdruckstosses über den Entluftungska- nal 19) oder Hydrophihsierung der Trennzone (z B durch in mindestens einer der Flussig- keiten vorliegende Chemikalien oder Katalysatoren, wie Enzyme, welche die hydrophobe Schicht abbauen), kann ein Kontakt zwischen beiden Flüssigkeiten (14, 16) hergestellt werden und die Mischung (18, Abb 3e) erfolgt spontan In dieser Ausfuhrung muß ein Ent- luftungskanal (19) wie in Abb 1 dargestellt, eingearbeitet sein, damit eine vollständige Ful- lung der Mischzone gewährleistet wird Diese bevorzugte Ausfuhrung der Erfindung erlaubt nicht nur die spektroskopische Auswertung beider Flüssigkeiten vor der Mischung sondern ermöglicht auch eine sehr exakte Bestimmung der benotigten Mengen, insbesondere an Reagenzflussigkeit Die Mischung ist auch rascher beendet als in der ersten Ausfuhrung Die dargestellten Schritte sind sinngemäß auch übertragbar für Kapillarkraftmischer mit mehr als zwei, insbesondere drei oder vier, Probenauftragsoffnungen und Probenkanalen, die in eine gemeinsame Misch- und Nachweiszone munden, wobei die Trennzone entsprechende Form hat, beispielsweise bei drei Aufgabeoffnungen die Form eines Y, dessen Schenkel jeweils die Trennzonen der Kammerabschnitte bedeutet, bei vier Aufgabeoff- nungen die Form eines Plus-Zeichens (+) usw
Sind mehrere derartige Mikrofluidelemente (beispielsweise in Form einer Matrix) vorhanden können deren Entluftungskanale (19) gekoppelt sein, was eine Überwindung der Trennzone durch koordinierten (Unter-)-Druckstoss ermöglicht
Beispiel 4 Befullung eines KapiUarkraftmischers
Die Befullung der Kapillaren durch die Probenaufgabeoffnung kann, wie in Abb 4 schematisch dargestellt, durch eine Kapillarpipette (21) erfolgen, an deren Ende das Reagenz unter Schwerkraft oder leichtem Druck (26) einen Mikrotropfen (22) formt Die Kapillarpipette wird in die Fulloffnung (4 bzw 7) gesenkt, bis der Tropfen den Boden der Öffnung erreicht (27) und Kontakt aufnimmt mit der Kapillare (3 bzw 6) Die Menge an Flüssigkeit (z B Probe) (28), die in das Mikrofluidkanalsystem aufgenommen wird, ist dabei bestimmt durch die Maße der Kapillare und einen möglicherweise applizierten Gegendruck (29) Dadurch wird es möglich, sehr geringe Mengen an Flüssigkeit, insbesondere an Reagenzflussigkeit, zu verwenden, die andernfalls wegen der Oberflachenspannung der Flüssigkeit nicht einfach pipettiert werden konnten
Beispiel 5 Herstellung eines KapiUarkraftmischers a) Herstellung der Deckschicht (1) (Fig 1) Ein Glaswafer von 10 cm Lange und Breite und 500 μm Dicke wird von beiden Seiten mittels Chrom-Sputteπng (Vakuumbestaubung) 50 nm dick bechichtet Unter Verwendung einer Photoresist-Maske, welche die Unterseite und den Beeich um die geplanten Zufuhrkapillaren (3, 6) und die geplante Mischzone (5) (zusammen Kapillarbeeich) (z B 0,5 x 0,5 cm) abdeckt, wird die übrige Chromschicht mit einem lichtempfindlichen Polymer (Photoesist, z B Microposit 1818S Photo Resist, Shipley Europe Ltd , Coventry, England) abgedeckt und der nicht abgedeckte Bereich UV-Licht ausgesetzt und entwickelt (z B mittels Microposit 351-Entwιckler 5 1 in Wasser) (Photo thographie) und dann mittels HCI (36 %-ιg) der nicht geschützte Bereich von der Chromschicht befreit (Patterning) Anschhessend wird der Bereich der zukunftigen Zufuhrkapillaren und der Mischzone mit 50 % HF 10 μm tief geatzt und dann die Photoresist- (mittels eines Photo- resist-Entferners, wie Microposit Remover 1112A) und die Chromschicht entfernt Damit ist die Dicke der Mischzone (10 μm) vorgegeben Erneute Vakuumablagerung von Chrom (50 nm) auf beiden Flachenseiten des Glaswafers, erneute Photohthographie mit einer Maske, die nur die Bereiche der zukunftigen Proenaufgabenoffnung auf der Unterseite freilasst, und erneutes Cr-Pattemmg mit nachfolgener HF-Atzung (50 %, 60 μm) mit nachfolgender Photoresist- und Chromentfernung sowie Laserbohren zur Erzielung von aussen zugänglicher Offnungen als Flussigkeitsaufgabestellen (Fulloffnungen) (4, 7) zur dem herausgeatzten Mischzonenbereich entgegengesetzten Seite (der zukunftigen Oberseite des Kapil- larkraftmischers) ergibt die Deckplatte (1) des herzustellenden KapiUarkraftmischers
b) Herstellung der Substratschicht Ein Glaswafer wie unter a) beschrieben wird zunächst auf der Ober- und Unterseite mit einer 50 nm-Chromschicht vakuumbeschichtet, dann wird durch Photohthographie und Cr-Patterning auf der Oberseite die Vertiefung für die Flussig- keitsaufgabe eingeatzt (36 % HCI), analog wie unter a) beschrieben Nach BHF-Atzung (50 μm) ist die Substratplatte (2) fertig
c) Zusammenfugen der Deck- und der Substratschicht Die Deck- und die Substratschicht werden zusammengefugt durch Glass-Fusion-Bonding (Zusammenfugen unter Druck bei 250 bis 600 °C nach Einbringen von HF zwischen die zu verbindenden Schichten mittels Dampf oder eines Tropfens Fluorwasserstoffsaure, was die Glasflachen leicht anatzt, so dass sie sich durch Druck und Diffusion fest verbinden) und ergeben zusammen den fertigen Kapillarkraftmischer

Claims

Patentanspruche
1 Kapillarkraftmischer für die Analyse von Flüssigkeiten, die Reagenzien umfassen, die zur Reaktion zusammengeführt und gemischt werden, dadurch gekennzeichnet, dass zum Kapillarkraftmischer mindestens zwei Flussigkeitsaufgabestellen gehören und er Kapillarbereiche umfasst, die ermöglichen, dass die Flüssigkeiten durch Kapillarkraft ohne Zufügen äußerer Kräfte in den Kapillarkraftmischer aufgenommen werden und dass eine selbst kapillaraktive Mischzone vorliegt, in welche die Flüssigkeiten durch Kapillarkraft gelangen und in welcher eine Mischung der Flüssigkeiten im wesentlichen durch Diffusion erfolgt
2 Kapillarkraftmischer nach Anspruch 1 , worin zwei jeweils in eine Kapillare mundende
Flussigkeitsaufgabestellen vorliegen, die getrennt oder nacheinander befullbar sind und in einer gemeinsamen, ebenfalls kapillarwirksamen Mischzone munden
3 Kapillarkraftmischer nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die kapillaraktive Mischzone selbst direkt mit den Flussigkeitsaufgabestellen verbunden ist, so dass keine zusätzlichen Kapillaren vorliegen
4 Kapillarkraftmischer nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass keine beweglichen oder aktiven Teile zur Funktion vorhanden sind
5 Kapillarkraftmischer nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Schichtdicke der Flüssigkeiten in der Mischzone fest voreingestellt ist
6 Kapillarkraftmischer nach Anspruch 5, wobei die Schichtdicke der Flüssigkeiten in der Mischzone fest in einem Bereich von 0, 1 bis 10 000 μm voreingestellt ist
7 Kapillarkraftmischer nach Anspruch 6, wobei die Schichtdicke der Flüssigkeiten in der Mischzone fest in einem Bereich von 1 bis 100 μm voreingestellt ist
8 Kapillarkraftmischer nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Schichtdicke der Flüssigkeiten in der Mischzone so eingestellt ist, daß IR-spektroskopische Messungen in wassngen Losungsmitteln durchgeführt werden können 9 Kapillarkraftmischer nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Schichtdicke der Flüssigkeiten in der Mischzone fest in einem Bereich von 3 bis 30, insbesondere von 5 bis 10 μm, voreingestellt ist
10 Kapillarkraftmischer nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere funktionale Teile mit Mitteln zum Temperieren ausgestattet sind
11 Kapillarkraftmischer nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass funktionale Schichten in die Mischzone eingebracht sind
12 Kapillarkraftmischer nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere funktionale Teile mit Sensoren ausgestattet sind
13 Kapillarkraftmischer nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere funktionale Teile mit elektrochemischen Sensoren ausgestattet sind
14 Kapillarkraftmischer nach Ansprüchen 1 bis 13, wobei in der Mischzone eine hydrophobe oder anders gestaltete Trennschicht vorhanden ist, die eine vorzeitige Mischung der durch Kapillarkraft in die Mischzone gebrachten Flüssigkeiten verhindert
15 Kapillarkraftmischer nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass zur vollständigen Füllung der Mischzone ein Entluftungsgang vorhanden ist
16 Kapillarkraftmischer gemäss einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Volumenkalibrierung der Flüssigkeiten durch die Abmessungen der Zufuhrkapillaren und der Mischzone bis zur hydrophoben Zone fest vorgegeben ist
17 Kapillarkraftmischer gemäss einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet dass das Volumen der Zufuhrkapillaren und der Mischzone im Bereich von 0,05 bis 800 nl, vorzugsweise 0,1 bis 100, insbesondere 0,1 bis 50 nl betragt
18 Kapillarkraftmischer gemäss einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet dass er aus zwei Einzelteilen (Deck- und Substratschicht) zusammengefugt ist
19 Kapillarkraftmischer gemäss einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet dass er aus Silizium, aus Glas oder aus beidem besteht Kapillarkraftmischer nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass ferner Mittel zur Detektion auf optischem, elektrochemischem oder anderem geeignetem Wege von Reaktionen vorliegen, die innerhalb der in das Kapillarsystem integrierten Mischzone nach Mischung der Flüssigkeiten stattfinden
Kapillarkraftmischer nach einem der Ansprüche 1 bis 19, der eine Linse oder eine Fres- nel-Lmse, insbesondere im Bereich der Mischzone, vorzugsweise integriert auf der Aus- senseite des KapiUarkraftmischers, umfasst
Verwendung des KapiUarkraftmischers nach einem der Ansprüche 1 bis 21 für die Analyse mindestens zweier Flüssigkeiten, die zur Reaktion zusammengeführt und gemischt werden und deren Zusammenfuhrung zum Erhalt näherer Informationen über mindestens eine der Flüssigkeiten fuhrt, oder deren Reaktion eine neue Komponente bildet, wobei alle Flüssigkeiten durch Kapillarkraft ohne Zufügen äußerer Kräfte in den Kapillarkraftmischer gefüllt werden und deren Mischung im wesentlichen durch Diffusion erfolgt
Verwendung nach Anspruch 22 des KapiUarkraftmischers, wobei die Messmethode eine spektroskopische Methode ist
Verwendung nach Anspruch 23 des KapiUarkraftmischers, wobei die spektroskopische Messmethode elektromagnetische Wellen mit einer Wellenlange von etwa 160 bis etwa 20000 nm, insbesondere von etwa 180 bis etwa 15000 nm, benutzt
Verwendung nach Anspruch 23 des KapiUarkraftmischers, wobei die spektroskopische Meßmethode IR-Licht mit einer Wellenlange von etwa 700 bis etwa 15000 nm benutzt
VenΛ/endung nach Anspruch 23 des KapiUarkraftmischers für die Analyse durch elektrochemische oder enzymatische Methoden
Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 26 des KapiUarkraftmischers dadurch gekennzeichnet dass zur Messung eines Referenzwertes direkt in situ eine Detektion vor der Befullung mit der zweiten oder spateren Reagenzlosung durchgeführt wird
Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 27 des KapiUarkraftmischers, wobei eine der Flüssigkeiten eine biologische Probe, insbesondere Vollblut, darstellt
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