EP1251946B1 - Kapillarkraftmischer - Google Patents

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EP1251946B1
EP1251946B1 EP00974506A EP00974506A EP1251946B1 EP 1251946 B1 EP1251946 B1 EP 1251946B1 EP 00974506 A EP00974506 A EP 00974506A EP 00974506 A EP00974506 A EP 00974506A EP 1251946 B1 EP1251946 B1 EP 1251946B1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
capillary force
liquids
capillary
mixing zone
force mixer
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
EP00974506A
Other languages
English (en)
French (fr)
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EP1251946A1 (de
Inventor
Robert Seidel
Andreas Wolf
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Micro Biolytics GmbH
Original Assignee
Micro Biolytics GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Micro Biolytics GmbH filed Critical Micro Biolytics GmbH
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Application granted granted Critical
Publication of EP1251946B1 publication Critical patent/EP1251946B1/de
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F25/00—Flow mixers; Mixers for falling materials, e.g. solid particles
    • B01F25/30—Injector mixers
    • B01F25/31—Injector mixers in conduits or tubes through which the main component flows
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F33/00—Other mixers; Mixing plants; Combinations of mixers
    • B01F33/30—Micromixers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F33/00—Other mixers; Mixing plants; Combinations of mixers
    • B01F33/30—Micromixers
    • B01F33/3039—Micromixers with mixing achieved by diffusion between layers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F35/00—Accessories for mixers; Auxiliary operations or auxiliary devices; Parts or details of general application
    • B01F35/71—Feed mechanisms
    • B01F35/717—Feed mechanisms characterised by the means for feeding the components to the mixer
    • B01F35/7172—Feed mechanisms characterised by the means for feeding the components to the mixer using capillary forces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F2101/00—Mixing characterised by the nature of the mixed materials or by the application field
    • B01F2101/23—Mixing of laboratory samples e.g. in preparation of analysing or testing properties of materials
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
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    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
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    • B01L2300/0645—Electrodes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0867—Multiple inlets and one sample wells, e.g. mixing, dilution
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0406—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces capillary forces

Definitions

  • the invention relates to the use of an analytical capillary force mixer for the determination of one or more analytes in an aqueous or other useful solvent, in separately applied and in the analysis chamber mixing sample liquids consisting of a carrier, a detection zone and a capillary liquid transport capable channel, the two or more fluid feed ports connects.
  • reagents are either embedded in respective layers of a solid support which is contacted with the sample, or the reagents are mixed in a chamber with the sample.
  • the reaction of liquid sample and reagents leads to a detectable signal, in particular to a color change, which can be evaluated visually or with the aid of a device, usually reflection photometrically.
  • Simultaneous analysis of a large number of samples is often desirable and possible, for example, in flow cytometry, DNA sequencing, various types of chromatography and electrophoresis, and in ligand-receptor studies.
  • rapid DNA analysis plays an important role in the Human Genome Project, and in the pharmaceutical or agricultural industries, research without the simultaneous screening of a large number of substances for their biological effects is unthinkable.
  • microtiter plates usually with a standardized size of 12.7 x 8.5 cm, application. These are plates that contain a variety of small vessels, often eg 96 or 192, but also less or significantly more are common, which are filled with different reagents.
  • the amount of reagents in these analysis plates is in the milliliter (10 -3 L) to the microliter (10 -6 L) range.
  • the reagents are valuable because they are only available in small amounts or expensive, or both. Therefore, a miniaturization of the tests is desired, especially if many tests should or must be performed.
  • the filling of the analysis troughs (wells) is usually carried out by machines, as well as the further analysis in preferred forms of use is automated.
  • microtiter plates are known, for example, from Greiner, 64943 Hirschberg, (micro-assay plate) with 1536 wells.
  • the working volume with 4-8 ⁇ l is relatively high.
  • the sequential (successive) introduction of the analytes is associated with the risk of cross-contamination. Appropriate caution should be used, or the drop size limits the attempt of miniaturization of the test.
  • the working volume of a microtiter plate from Corning Costar (55924 Bodenheim, Germany) is only 1-2 .mu.l, but here, too, the independent mixture of analytes introduced into separate wells is not given.
  • Means for mixing two analytes by spontaneous mixing or vibration is described in U.S. Patent No.
  • Patent US 5,300,779 also describes an apparatus for mixing two analytes, but there is only one sample application site and reagents are already fully integrated.
  • a disposable cuvette for the analysis of biological samples is presented, which contains a series of channels, capillaries, reservoirs and stop points which allow the controlled flow of sample, reagent and solvent. The complex formation of this cuvette is space-consuming and not suitable for the design on microtiter plates.
  • the analyte flows through the device only under centrifugal force, not spontaneously.
  • the patent US 5,222,808 describes a capillary mixing apparatus in which the mixture is not carried out spontaneously, but by magnetic particles.
  • WO 88/07666 describes relatively complex capillary mixers including, inter alia, a plurality of valves with moving parts (see Fig. 71).
  • DE-OS197 46 581 describes via capillaries with pumps or the like associated mixing chambers that operate on the flow principle.
  • US-A-4 088 448 shows a cuvette for optical analysis of a sample mixed with a reagent, the cuvette having a cavity on the surface of which the reagent is applied, for example by evaporation, the liquid penetrating into the cuvette by capillary forces where it mixes with the reagent and can be examined through a transparent window.
  • a capillary force mixer which can be produced at low cost is presented, which is also used in parallel use in a multiple arrangement in a tight arrangement, in particular on the base of a conventional automated HTS microplate, for example in pharmaceutical or agronomic research and development can be. It allows reactions to be carried out with a minimum of sample and reagent, both of which can only be applied shortly before analysis.
  • the design of the novel capillary force mixer allows the application of new spectroscopic methods, such as modern variants of UV / VIS or fluorescence spectroscopy or TIRF, in particular IR spectroscopy, for the analysis of biological and other substances in water or other aqueous or biological media.
  • the design of the novel test system allows the analysis of substances in the low nanoliter (10 -9 L) range.
  • Many systems can be combined on a small space given for example by the standard Mirotiter plate, and the filling of the sample feed openings can be carried out automatically. Due to the selected structure and the small size of the system, an active mixture is not necessary, but mixture takes place independently by diffusion within a short time.
  • IR infrared
  • Figure 1 shows a single capillary force mixer according to the invention.
  • Figure 2 shows the function of a capillary force mixer according to the invention.
  • Figure 3 shows such a capillary force mixer with a hydrophobic separation layer.
  • Figure 4 shows an example of the liquid application in a capillary force mixer according to the invention.
  • the structure of the novel test system allows the analysis of very small amounts, ie those in the low nanoliter (10 -9 L) range, in particular in the range from 0.05 to 800 nl, preferably 0.1 to 100, in particular 0.1 to 50 nl , Many systems can be combined on the small space given by the standard microtiter plates, and the filling of the sample application openings can be automated. Due to the chosen structure and the small size of the system, an active mixture is not necessary, but a mixture takes place independently by diffusion within a few minutes.
  • the capillary mixer also has the advantages of easy filling and good metering. The separate liquid feeders reduce the risk of cross-contamination, and the capillary force mixer can be flexibly adapted to a given sample to be analyzed by selecting a suitable reagent solution just prior to measurement.
  • the invention relates to a capillary force mixer according to one of the last two paragraphs, wherein the capillary-active mixing zone itself is directly connected to the liquid feed points, so that no additional capillaries are present.
  • capillary force mixer according to one of the last three paragraphs, characterized in that no moving or active parts are present for the function.
  • a capillary force mixer according to the last paragraph, wherein the layer thickness of the liquids in the mixing zone is preset.
  • a capillary force mixer according to the last paragraph, characterized in that the layer thickness of the liquids in the mixing zone is fixed in a range of 0.1 to 10,000 microns, preferably in a range of 1 to 100 microns, preset.
  • a capillary force mixer after the penultimate or last paragraph whose mixing zone is formed so that the layer thickness of the liquids in the mixing zone is adjusted so that IR spectroscopic measurements are carried out in aqueous solvents can be;
  • the layer thickness of the liquids in the mixing zone is fixed in a range of less than 30 microns, in particular from 3 to 30, especially from 5 to 10 microns preset.
  • a Kapillarkraftmischer according to one of the preceding seven paragraphs, characterized in that one or more functional areas are equipped with means for tempering, or a Kapillarkraftmischer according to one of these paragraphs, in which functional layers are introduced in the region of the mixing zone.
  • capillary force mixer according to the last paragraph, characterized in that one or more functional parts are equipped with sensors, in particular electrochemical sensors.
  • the volume calibration (amount of liquid) of the (to be applied) liquids is fixed by the dimensions of the mixing zone to the hydrophobic zone.
  • a capillary force mixer according to one of the last 10 paragraphs, characterized in that the volume of Zuzhoukapillaren and the mixing zone (in a variant of the invention without Zuzhoukapillaren only the volume of the mixing zone) in the range of 0.05 to 800 nl is preset, preferably 0 , 1 to 100, in particular 0.1 to 50 nl.
  • capillary force mixer according to one of the last eleven paragraphs, which is composed of two individual parts (cover and substrate layer).
  • a capillary force mixer according to any one of the last twelve paragraphs consisting of silicon, glass or both (allowing high-precision construction) is preferred.
  • capillary force mixer of any of the last thirteen paragraphs, wherein there are means for detecting by optical, electrochemical or other suitable means reactions taking place within the mixing zone integrated in the capillary system after mixing of the liquids.
  • a capillary force mixer according to one of the preceding fourteen paragraphs, which comprises a lens or a Fresnel lens, in particular in the region of the mixing zone, preferably integrated on the outside of the capillary force mixer, especially in plastic embodiments (primarily an optically transparent region), includes.
  • a further preferred embodiment of the invention is the use of the capillary force mixer according to one of the last fifteen paragraphs for the analysis of at least two liquids which are combined and mixed for reaction and their combination leads to obtain more detailed information about at least one of the liquids, or their reaction a new Component forms, characterized in that all liquids are filled by capillary force without adding external forces in the Kapillarkraftmischer and their mixture is substantially by diffusion, directed.
  • the measuring method is a spectroscopic method, in particular a spectroscopic measurement method, the electromagnetic waves having a wavelength of about 160 to about 20,000 nm, preferably from about 180 to about 15,000 nm, especially IR Light with a wavelength of about 700 to about 15000 nm, especially about 2500 to 15000 nm used.
  • capillary force mixer as described above for analysis by electrochemical or enzymatic methods.
  • a capillary force mixer characterized in that for measuring a reference value directly in situ, a detection before filling with the second or subsequent liquid (reagent solution or sample solution) is performed.
  • capillary force mixer according to one of the last four paragraphs is very preferred, one of the liquids being a biological sample, in particular whole blood.
  • the fluids are on the one hand to samples, in particular biological samples, such as blood (whole blood), blood plasma, blood serum, saliva, sweat, urine, pus, gastric juice, bile, other digestive juices, cerebrospinal fluid, tear fluid, milk, glandular secretions, synovial fluid , but also hemolymph from insects, liquid foods or food components in nutritional analysis, culture media, cytoplasm, medicines, or water samples, such as lakes, flowing waters or sewage treatment plants, extracts or other liquids to be analyzed, each after workup, such as centrifugation, filtration Chromatography or the like, or in particular without workup (in particular in the case of blood, where cellular components may be excluded, which may be excluded from the mixing area especially at low layer thickness of the mixing zone, or at larger layer thicknesses due to their slow diffusion in the Contrary to the liquid surrounding them only very slowly diffuse into a region of the mixing zone with a Reaganzates so that there properties of the surrounding liquid can be measured directly) can be applied to the liquid application zones, these samples qualitatively
  • reagents there are solutions of detection reagents ("reagents”, “reagent solutions”), with complementary (ie to any kind of detectable interaction, eg chemical (including biochemical or biological) or physical, with one or more analytes from the Reactants (in particular optionally fluorescence, enzyme or otherwise derivatized antibodies, low molecular weight reagents (for example substrates and / or cosubstrates for enzymatic reactions with components in the samples or intercalating (eg fluorescent) dyes), enzymes or other catalysts, mixtures of enzymes or other catalysts with substrates and / or cosubstrates, complexing agents, etc., which preferably each cause a specific change of a physical or chemical property ("signal") after mixing with a sample, and which can be detected evaluated for analytical purposes can be, especially computer-aided.
  • Preferred applications are also PCR and hybridization of nucleic acids or derivatives (eg fluorescently labeled, or with modified bases and / or backbones) thereof.
  • the mixture is essentially by diffusion means that no external auxiliaries for mixing (such as vibration, stirring, centrifugation or the like) are necessary and, in particular, no such agents are used to cause the mixture of applied liquids (if necessary to overcome hydrophobic separation layers). to bring the applied liquids into contact). In particular, it is the interdiffusion of two or more liquids, in contrast to the diffusion of solid substances in a liquid.
  • auxiliaries for mixing such as vibration, stirring, centrifugation or the like
  • IR spectroscopic investigations in aqueous solutions which are not possible in conventional fluid channel systems because of the high absorption in this spectral range of the water used as solvent.
  • IR spectroscopy can be operated with sufficient reliability and reproducibility only up to a water layer thickness of about 10 microns (in special cases, up to 30 microns). The thickness variation of the measuring chamber is to be kept as low as possible for reliable reproducibility.
  • IR spectroscopy is a routine method used by organic chemists, biochemists and others for qualitative and quantitative molecular detection.
  • infrared light When infrared light is passed through a sample of organic matter, some of the frequencies are absorbed while other frequencies are conducted through the sample unattenuated.
  • Applications in the analysis of organic substances almost exclusively use IR light with wavenumbers in the range 650-4000 cm -1 (Mitt-IR). Wavelengths below 650 cm -1 are referred to as Far Infrared (FIR), those above 4000 cm -1 as Near Infrared (NIR).
  • FIR Far Infrared
  • NIR Near Infrared
  • IR spectroscopy also includes laser Raman spectroscopy, including Raman confocal laser spectroscopy, Fourier transform IR (FTIR) spectroscopy or Hadamard transform IR, or any other IR spectroscopic method.
  • FTIR Fourier transform IR
  • FT-IR Fourier transform IR
  • the signal obtained in IR spectroscopy is dependent on the layer thickness of the examined sample, so that the IR signal obtained from a ⁇ 10 ⁇ m cell is very weak.
  • This disadvantage can be largely absorbed by an immediately preceding calibration, as this largely eliminates the measurement inaccuracies.
  • the necessary control and software are basically already state of the art and often found in spectrometers.
  • the ability to calibrate samples directly before mixing at exactly the same optical path length as in the mixed state is a key advantage of the new microfluidic channel system. This allows in particular also differential measurements (comparison before / after).
  • Suitable analyzers in particular FT-IR devices, are readily available, in particular commercially available, for example from Bruker (Karlsruhe, Germany), e.g. Bruker Spectrum GX FT-IR Spectrometer Bruker Equinox 55; Examples of UV / VIS devices are the Lambda 40 or the Lambda 800 UV / VIS Spectrometer System from Perkin Elmer.
  • the inert carrier (matrix) for a capillary force mixer according to the invention is a one-part or multi-part substrate which is not or not substantially attacked by the liquids to be applied or not within the time period required for application and measurement, in particular one or more of the following mentioned materials.
  • the new microfluidic channel system is very simple in a preferred embodiment of the invention. Due to the absence of any moving components, the (preferred) construction of the carrier is made of two microfabricated batch processes Plates (cover and substrate layer) possible. This method is very inexpensive and based on the latest state of the art.
  • a matrix-like array for example consisting of a cover and substrate layer, which contains several of the capillary force mixer according to the invention (optionally with venting channels, hydrophobic separating layers or other features of preferred embodiments of these capillary force mixers, as described herein) in a matrix-like arrangement, eg Overall, with the dimensions of conventional microtiter plates, are present, which can be prepared in particular directly from two parts (cover and substrate layer).
  • a capillary force mixer according to the invention takes place, in particular, by joining the components of the capillary force mixer according to the invention (preferably in a directed manner) and connecting them together by holding devices, such as clamps or the like.
  • the ingredients e.g. Plates (cover and substrate layer), the Mikrofluidkanalarrays can also by gluing (for example by means of polymerization, polyaddition or polycondensation, which may also be mixed with fillers, for example, to increase the electrical conductivity with silver particles), welding, glass fusion bonding or other microtechnical processes such as anodic or eutectic bonding are joined together.
  • This must be done in a directional manner, that is, the components must be precisely aligned (“alignment") to ensure the congruence, such as existing channels, and the assembly must not create additional volume in the capillary or mixing zone area.
  • the materials are selected to be compatible with known microfabrication techniques. These include, for example, methods for removing material from the surface, such as wet etching, electrochemical etching, anisotropic etching or in particular chemical wet etching, for example in the case of SiO 2 by means of hydrogen fluoride / ammonium fluoride in the presence or absence of acetic acid, or dry etching, such as plasma etching processes, such as Sputtering, plasma chemical etching, reactive ion etching, ion beam etching or anisotropic deep etching by means of RIE, ion beam methods, such as ion beam etching, laser ablation (laser ablation), photolithography, in particular laser ablation; Application of material, for example by means of PVD, without plasma support (eg thermal evaporation, flash evaporation, MBE, VPE or electron beam evaporation), CVD (thermally, thermal vaporation, thermal vaporation, flash evaporation, M
  • the materials are also selected for their suitability for the full range of conditions to which the microfluidic systems are subjected, including extreme temperature, pH or salt concentration conditions, or the application of electrical or magnetic fields.
  • the materials are those which are also used in the semiconductor industry, where microfabrication techniques are used on a regular basis, in particular based on silicon, such as silicon, or other semiconductor materials, such as gallium arsenide.
  • Other preferred materials are silica, glass, such as borosilicate glasses, quartz, fused silica, silicone, or polysilicone.
  • plastics including polymers such as polymethyl methacrylate (PMMA), polycarbonate, polyesters such as polybutylene terephthalate or polyethylene terephthalate, polyamides, polytetrafluoroethylene (TEFLON®), polyvinyl chloride (PVC), polydimethylsiloxane (PDMS), polysulfone, polystyrene, polyolefins such as polymethylpentene , Polypropylene or polyethylene, polyvinylidine fluoride, acrylonitrile-butadiene copolymer (ABS), cycloolefin polymers such as TOPAS® (thermoplastic olefin polymer having amorphous structure of Hoechst AG, Frankfurt, Germany) block copolymers or mixtures of two or more thereof.
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • PET polycarbonate
  • polyesters such as polybutylene terephthalate or polyethylene terephthalate
  • polyamides polytetrafluoro
  • Parts consisting of such polymers in particular substrate layers and cover layers, can be produced by known microfabrication methods, for example, or by microfabricated parent molds using known molding methods such as injection molding, embossing or stamping or by polymerization of the monomeric precursor material within the mold (primary shaping).
  • Such polymeric materials are preferred for many purposes because they can be easily manufactured, inexpensively and disposable. Ceramic materials are also possible, especially in hybrid microsystems. Microfluidic elements based on glass or silicon are particularly preferred.
  • All of said materials may contain specifically treated or coated surfaces or surface portions within the capillary or further sample application areas, for example, hydrophobized areas (particularly liners having linear Expansion), for example by silanization (coating with a silane to which a compound carrying a hydroxyl group is coupled) more functional, such as hydroxyl, groups or metalation, in particular with gold, for example by vapor deposition, or (especially to increase the capillary forces) hydrophilization in the case of glass by means of etching, so that the surface has many hydroxyl groups, for example with Caro's acid, or other introduction of polar groups (eg silanization with amino- or hydroxyl-containing silanes), or in the case of plastics by treatment with argon plasma, plasma etching, Corona discharge (eg 10-25 W at 13.56 MHz, 1 Torr chamber pressure, 5-10 min), by covalent bonding of photoreactive equipped hydrophilic polymers, by application of wetting agent-like layers or coating with nanocomposites by sol / gel technology,
  • the capillary-active mixing zone is either connected to the liquid feed points via capillaries, or connected directly to these, so that no separate feed capillaries are present.
  • the mixing zone comprises the detection zone (detection zone) for the physical or chemical signals resulting from the mixture, for example optical windows, sensors or the like.
  • the construction with transparent for the intended optical measuring range materials is possible, for example, without intending to derive a limitation for visible light clear plastics or glass for short-wave (UV) light preferably special optical glass or quartz glass and for long-wave light (IR) preferably silicon.
  • UV short-wave
  • IR long-wave light
  • the wettability of the matrix is absolutely necessary, which can be achieved by appropriate treatment of the surfaces (see above).
  • sensors can be introduced, for example, electrical or biochemical nature, which depend on the determination of the desired measured variable.
  • sensors such as, in particular, chemical sensors (eg, chemical resistors, chemocapacities, metal oxide gas sensors, chemically senistive field-effect transistors, such as ISFETs or CHEMFETs, Microelectrodes (potentiometric or amperometric), SAW sensors, eg vacuum resonators, or chemosensor arrays); or biological sensors (in particular CMOScompatible), or radiation sensors (eg photodiodes or image sensors, in particular for fluorescence or chemiluminescence measurements); also thermal transducers, ionizing radiation transducers, magnetic or mechanical transducers; as well as any combinations of such sensors.
  • chemical sensors eg, chemical resistors, chemocapacities, metal oxide gas sensors, chemically senistive field-effect transistors, such as ISFETs or CHEMFETs, Microelectrodes (potent
  • tempering may be integrated, such as heating elements, such as polysilicon resistors or thermal generators, or for cooling channels for coolant.
  • heating elements such as polysilicon resistors or thermal generators
  • cooling channels for coolant Such functional layers are, however, not absolutely necessary for the production of the article embodying the invention - they are not present in preferred embodiments of the invention. Temperature control may alternatively or additionally also be present externally.
  • the area of the mixing zone does not require any grooves or grooves or other means for aligning the capillary flow of introduced liquids along predetermined paths, so that preferably completely smooth surfaces are present.
  • the fluid delivery sites may include means for improved connection of the delivery site to the capillary area, for example one or more small notches in the interface between the fluid delivery site and the capillary area or marginally hydrophobicized, hydrophilic or hydrophilicized areas at the transition to the capillary area.
  • means for improved connection of the delivery site to the capillary area for example one or more small notches in the interface between the fluid delivery site and the capillary area or marginally hydrophobicized, hydrophilic or hydrophilicized areas at the transition to the capillary area.
  • such means are not absolutely necessary, but on the other hand present in preferred embodiments of the inventive capillary force mixer.
  • Venting channels are preferably designed so that they allow only a gas, not the liquid transport (for example by hydrophobizing the surface, at least in the boundary region to the mixing zone of the capillary force mixer, by large cross-section, so that the capillary force is no longer sufficient at the transition from the mixing zone to the venting channel for the further transport of the liquid (stop junction), by training as a microporous, hydrophobic plug, the air, but not permeable to hydrophilic liquids, or the like.
  • a matrix of a plurality of the capillary force mixers according to the invention there is a matrix of a plurality of the capillary force mixers according to the invention, the venting channels of which are connected (coupled) to one another or in groups, which is permitted, for example, in the case of hydrophobic separation towers in the mixing chamber, due to pressure or, in particular, reduced pressure to simultaneously overcome the separation of applied samples in all or several mixing zones, thereby synchronizing the contact between the samples and their subsequent mixture.
  • the overcoming of hydrophobic separating layers can be initiated synchronously by a pressure or negative pressure impact in the case of several capillary force mixers, for example if they are present in a pressure chamber.
  • Example 1 Construction of a single capillary force mixer
  • Fig. 1 illustrates the exemplary construction of a single capillary force mixer, which is present for example in a multi-system array (several such capillary force mixer next to each other in a matrix).
  • the two plates (1, 2) are joined together directionally and held together by holding devices such as clamps or the like.
  • the contact surfaces have previously been processed by hot working or casting, advantageously by microtechnical methods such as photolithography, dry or wet etching, such as "synchrotron radiation ablation” or by application methods, such as spinning, CVD or the like, that the finished product per Mikrofluidkanalsystem a supply capillary (3 and 6) for each of the liquids and a zone (5) for mixing and detection.
  • the plates (cover and substrate layer) of the microfluidic channel array can also be joined by gluing, welding or other microtechnical processes such as anodic or eutectic bonding. In this case, the procedure must be directed and the assembly must not give rise to additional volume.
  • Example 2 Capillary force mixer for mixing two liquids
  • the capillary force mixer shown schematically as an example in Fig. 2a for the mixing of two liquids with reactants has the following functions, which apply mutatis mutandis to Kapillarkraftmischer for the mixture of more than two liquids.
  • the two capillaries (3 and 6) are connected in the mixing and detection zone (5).
  • the introduced sample is drawn by capillary force into the mixing and detection zone (5), while the second capillary (6) free of Liquid remains (9).
  • the calibration can be done by appropriate methods, preferably, but not exclusively, by spectroscopic methods, particularly preferably IR spectroscopic methods are performed.
  • Example 3 Capillary force mixer with hydrophobic separation layer
  • a layer (13) is introduced in the mixing and detection zone, which layer gives the site a hydrophobic character.
  • Such layers can be made of special surface texture such as roughness, but preferably by hydrophobic coating, such as hydrophobic metal layers such as gold, in even more preferred embodiment of hydrophobic plastics.
  • hydrophobic coating such as hydrophobic metal layers such as gold
  • Teflon As an example of such a hydrophobic plastic, without deriving any limitations from it, called Teflon. Silanization, in particular with alkyl silanes, is also possible.
  • This layer (13) forms a separation zone and, during the introduction (Fig.
  • a contact between the two liquids (14, 16) can be made and the mixture (18, Fig. 3e) is spontaneous.
  • a vent channel (19) as shown in Fig. 1 must be incorporated, so that a complete filling the mixing zone is ensured.
  • the mixture is also completed faster than in the first embodiment.
  • the illustrated steps are mutatis mutandis transferable for Kapillarkraftmischer with more than two, in particular three or four, sample application openings and sample channels, which open into a common mixing and detection zone, the separation zone has corresponding shape, for example, at three feed openings the shape of a Y whose Leg each means the separation zones of the chamber sections, with four task openings the shape of a plus sign (+), etc.
  • venting channels (19) can be coupled, which allows the separation zone to be overcome by coordinated (sub-) pressure surge.
  • Example 4 Filling a capillary force mixer
  • the capillary pipette is lowered into the filling opening (4 or 7) until the drop reaches the bottom of the opening (27) and makes contact with the capillary (3 or 6).
  • the amount of liquid (e.g., sample) (28) taken up into the microfluidic channel system is determined by the dimensions of the capillary and a potentially applied back pressure (29). This makes it possible to use very small amounts of liquid, in particular of reagent liquid, which otherwise could not be simply pipetted because of the surface tension of the liquid.

Description

    Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft die Verwendung eines analytischen Kapillarkraftmischers zur Bestimmung eines oder mehrerer Analyten in einem wäßrigen oder anderen brauchbaren Lösungsmittel, in separat aufgebrachten und in der Analysenkammer sich mischenden Probenflüssigkeiten, bestehend aus einem Träger, einer Nachweiszone und einem zum kapillaren Flüssigkeitstransport befähigten Kanal, der zwei oder mehr Flüssigkeitsaufgabeöffnungen verbindet.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Zur qualitativen oder quantitativen analytischen Bestimmung von Bestandteilen von Körperflüssigkeiten, insbesondere von Blut, werden oft trägergebundene oder freie Tests verwendet. Bei diesen sind Reagenzien entweder in entsprechenden Schichten eines festen Trägers eingebettet, der mit der Probe in Kontakt gebracht wird, oder die Reagenzien werden in einer Kammer mit der Probe gemischt. Die Reaktion von flüssiger Probe und Reagenzien führt bei Anwesenheit eines Zielanalyten zu einem nachweisbaren Signal, insbesondere zu einem Farbumschlag, welcher visuell oder mit Hilfe eines Gerätes, meist reflexionsphotometrisch, ausgewertet werden kann.
  • Die gleichzeitige Analyse einer großen Anzahl von Proben ist oft erwünscht und möglich, zum Beispiel bei Durchfluß-Zytometrie, DNA Sequenzierung, verschiedenen Arten der Chromatographie und Elektrophorese und bei Ligand-Rezeptor-Studien. Die rasche DNA-Analyse spielt zum Beispiel bei dem Human Genome Project eine große Rolle, und in der Pharma- oder Agrar-Industrie ist die Forschung ohne das gleichzeitige Screening einer großen Anzahl von Stoffen auf ihre biologische Wirkung nicht mehr denkbar.
  • Hier finden sogenannte Mikrotiter-Platten, meist mit einer genormten Größe von 12,7 x 8,5 cm, Anwendung. Dies sind Platten, die eine Vielzahl kleiner Gefäße enthalten, häufig z.B. 96 oder 192, aber auch weniger oder erheblich mehr sind üblich, welche mit verschiedenen Reagenzien gefüllt werden. Die Reagenzien-Menge bewegt sich bei diesen Analyse-Platten im Milliliter (10-3 L) bis in den Mikroliter (10-6 L) -Bereich. Im allgemeinen sind die Reagenzien kostbar, weil sie nur in kleinen Mengen verfügbar oder kostspielig sind, oder beides. Daher wird eine Miniaturisierung der Tests angestrebt, besonders wenn viele Tests durchgeführt werden sollen oder müssen. Die Füllung der Analysentröge (wells) wird meist durch Automaten vorgenommen, wie auch die weitere Analyse bei bevorzugten Verwendungsformen automatisiert ist. Für das High-Throughput-Screening (HTS) sind Mikrotiterplatten zum Beispiel der Fa. Greiner, 64943 Hirschberg, (Mikro-Assay-Plate) mit 1536 wells bekannt. Hier ist das Arbeitsvolumen mit 4-8 µl relativ hoch. Das sequentiell (nacheinander) erfolgende Einbringen der Analyten ist mit der Gefahr von Cross-Kontaminationen verbunden. Entsprechende Vorsicht ist anzuwenden, bzw. die Tropfengröße limitiert den Versuch der Miniaturisierung des Tests. Das Arbeitsvolumen einer Mikrotiterplatte von Corning Costar (55924 Bodenheim, Deutschland) liegt zwar bei nur 1-2 µl, allerdings ist auch hier die selbständige Mischung von in getrennte wells eingebrachten Analyten nicht gegeben. Eine Einrichtungen zur Mischung zweier Analyten durch spontanes Mischen oder Vibration ist in der amerikanischen Patentschrift US 4,088,448 beschrieben, aber es gibt nur eine Probenaufgabestelle und Nachweisreagenzien liegen vorzugsweise in fester Form vor, was ein Vorabbeschicken mit Reagenz erforderlich macht und so die flexible Verwendung der Vorrichtung limitiert. Auch Patent US 5,300,779 beschreibt eine Apparatur zur Mischung zweier Analyten, doch liegt nur eine Probenaufgabestelle vor und Reagenzien sind bereits fertig integriert. In US-Patent US 5,627,041 wird eine Einmal-Kuvette für die Analyse biologischer Proben vorgestellt, wobei diese eine Serie von Kanälen, Kapillaren, Reservoirs und Stop-Punkten enthält, die den gesteuerten Fluß von Probe, Reagenz und Lösungsmittel erlauben. Die komplexe Ausbildung dieser Kuvette ist platzintensiv und nicht für die Auslegung auf Mikrotiter-Platten geeignet. Zusätzlich erfolgt der Fluß der Analyten durch das Gerät nur unter Zentrifugalkraft, nicht spontan. Das Patent US 5,222,808 beschreibt eine Kapillar-Misch-Apparatur, in der die Mischung nicht spontan, sondern durch magnetische Partikel durchgeführt wird. Die WO 88/07666 beschreibt relativ komplexe Kapillarmischer, die unter anderem mehrere Ventile mit beweglichen Teilen umfassen (siehe Fig. 71). Die DE-OS197 46 581 beschreibt über Kapillaren mit Pumpen oder dergleichen verbundene Mischkammern, die nach dem Durchflussprinzip funktionieren.
  • US-A-4 088 448 zeigt eine Küvette zur optischen Analyse einer Probe, welche mit einem Reagent gemischt ist, wobei die Küvette einen Hohlraum aufweist, an dessen Oberfläche der Reagent beispielsweise durch Verdampfen aufgebracht ist, wobei die Flüssigkeit durch Kapillarkräfte in die Küvette eindringt und sich dort mit dem Reagent mischt und durch ein transparentes Fenster untersucht werden kann.
  • Es ist eine Aufgabe der Erfindung unter Verwendung minimaler Probenvolumina eine Möglichkeit bereitzustellen, Flüssigkeiten einfach und selbständig zu analysieren, wobei nicht nur eine räumliche Trennung von Detektionszone und Probenaufgabenstelle möglich ist, sondern zusätzlich ein Mischen von zwei oder mehr separat aufgetragenen Flüssigkeiten stattfindet.
  • Diese Aufgabe wird durch die Verwendung des Kapillarkraftmischers gemäß Anspruch 1 gelöst. Bevorzugte Ausführungsvarianten sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
  • Höchstmögliche Flexibilität zum Einsatz für verschiedenste Proben und Analyten sollte gewährleistet sein. Zusätzlich soll das Mischen der Flüssigkeiten und der Transport der Flüssigkeiten zu der Detektionszone so schnell sein, daß die Analyse einer Probe zeitlich dadurch nicht limitiert wird. Ein weiterer Gesichtspunkt in der Ausarbeitung der beschriebenen Erfindung ist das Bedürfnis, die Einbeziehung neuerer Messmethoden, wie, ohne auf dieses.Beispiel beschränkt zu sein, beispielsweise IR-Spektroskopie, in die Analysemethoden zu ermöglichen. Auch der für diese Methoden durch die Absorptionseigenschaften üblicher biologischer Lösungsmittel bedingte maximale Durchmesser des Kapillarkanals muss berücksichtigt werden. Des weiteren soll durch einen einfachen Aufbau des Testelements eine kostengünstige, produktionstechnisch einfach zu realisierende Fertigung ermöglicht werden, die auch den Gebrauch des Mikrofluidkanalarrays für Massentestung (high throughput screening, HTS) unter Verwendung standardisierter Roboter und Maschinen ermöglicht.
  • Dies wird durch den Gegenstand der Erfindung, wie er in den Patentansprüchen und nachfolgend dargestellt und näher erläutert wird, erreicht. Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen insbesondere darin, daß ein kostengünstig herzustellender Kapillarkraftmischer vorgestellt wird, der auch bei paralleler Verwendung in mehrfacher Ausführung in dichter Anordnung insbesondere auf der Grundfläche einer herkömmlichen Mikrotiterplatte für automatisierte HTS zum Beispiel in der pharmazeutischen oder agribezogenen Forschung und Entwicklung angewandt werden kann. Er erlaubt, daß Reaktionen mit einem Minimum an Probe und Reagenz, welche beide jeweils erst kurz vor der Analyse aufgetragen werden können, durchgeführt werden können. Zusätzlich ermöglicht die Auslegung des neuartigen Kapillarkraftmischers die Anwendung neuer spektroskopischer Methoden, wie moderner Varianten der UV/VIS- oder der Fluoreszenzspektroskopie oder TIRF, insbesondere der IR-Spektroskopie, für die Analyse biologischer und anderer Stoffe in Wasser oder anderen wässrigen oder biologischen Medien. Der Aufbau des neuartigen Testsystems erlaubt die Analyse von Stoffen im niedrigen Nanoliter (10-9 L) -Bereich. Es lassen sich sehr viele Systeme auf einem beispielsweise durch die Standard-Mirotiter-Platte vorgegebenen kleinen Raum kombinieren, und die Füllung der Probenaufgaböffnungen kann automatisiert durchgeführt werden. Durch den gewählten Aufbau und die geringe Größe des Systems ist eine aktive Mischung nicht nötig, sondern Mischung findet selbständig durch Diffusion innerhalb einer kurzen Zeit statt. Für die Detektion des Analyten können beispielsweise alle Varianten der Spektrometrie benutzt werden, sofern die Messstrahlfokussierung der Weite der Nachweiszone angemessen angepaßt wird. Durch den besonderen Aufbau ist es möglich, insbesondere Infrarot (IR)-spektroskopische Untersuchungen in wässrigen Lösungen durchzuführen, die in üblichen Fluidkanalsystemen wegen der hohen Absorption in diesem Spektralbereich des als Lösungsmittel benutzten Wassers nicht möglich sind.
    • Verzeichnis der Abbildungen
  • Abbildung 1 (Fig 1) zeigt einen einzelnen erfindungsgemässen Kapillarkraftmischer.
    Abbildung 2 (Fig 2) zeigt die Funktion eines erfindungsgemässen Kapillarkraftmischers.
    Abbildung 3 (Fig 3) zeigt einen solchen Kapillarkraftmischer mit hydrophober Trennschicht.
    Abbildung 4 (Fig 4) zeigt exemplarisch die Flüssigkeitsaufgabe bei einem erfindungsgemässen Kapillarkraftmischer.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines nachfolgend als Kapillarkraftmischer bezeichneten analytisches Mikrofluidkanalarrays zur Bestimmung eines oder mehrerer Analyten oder des Zustandes eines oder mehrerer Analyten in einem wässrigen oder ferner einem anderen brauchbaren (insbesondere hydrophilen) Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch (Analyt plus Lösungsmittel(gemisch) = nachfolgend "Flüssigkeit"), bestehend aus einen inerten Träger, einer Nachweiszone und einem zum kapillaren Flüssigkeitstransport befähigten Kanal, der zwei oder mehr Probenaufgabeöffnungen verbindet. Der Aufbau des neuartigen Testsystems erlaubt die Analyse kleinster Mengen, d.h. solcher im niedrigen Nanoliter (10-9 L) - Bereich, insbesondere im Bereich von 0,05 bis 800 nl, vorzugsweise 0,1 bis 100, insbesondere 0,1 bis 50 nl. Es lassen sich sehr viele Systeme auf dem durch die Standard-Mikrotiter-Platten vorgegebenen kleinen Raum kombinieren, und die Füllung der Probeaufgabeöffnungen kann automatisiert durchgeführt werden. Durch den gewählten Aufbau und die geringe Größe des Systems ist eine aktive Mischung nicht nötig, sondern eine Mischung findet selbständig durch Diffusion innerhalb weniger Minuten statt. Der Kapillarmischer hat überdies die Vorteile leichter Befüllbarkeit und guter Dosierbarkeit. Durch die getrennten Flüssigkeitsaufgabestellen wird die Gefahr der Cross-Kontamination verringert, und der Kapillarkraftmischer kann flexibel durch Auswahl einer geeigneten Reagenzlösung kurz vor der Messung an eine gegebene, zu analysierende Probe angepasst werden.
  • insbesondere handelt es sich um einen Kapillarkraftmischer für die Analyse von (insbesondere zwei oder mehr) Flüssigkeiten, die (insbesondere zwei oder mehr) Reagenzien (Reaktanden) umfassen, die zur Reaktion zusammengeführt und gemischt werden (wobei deren Zusammenführung insbesondere zum Erhalt näherer (quantitativer oder qualitativer) Informationen über mindestens eines der Reagenzien (Analyt) führt oder durch physikalische oder chemische Reaktion eine neue Komponente bildet), dadurch gekennzeichnet, dass zum Kapillarkraftmischer mindestens zwei Flüssigkeitsaufgabestellen (= Probenaufgabeöffnungen) gehören und er Kapillarbereiche (insbesondere Zuführkapillaren) umfasst, derart, dass die Flüssigkeiten durch Kapillarkraft ohne Zufügen äußerer Kräfte in den Kapillarkraftmischer aufgenommen werden und dass eine selbst kapillaraktive Mischzone vorliegt, in welche die Flüssigkeiten durch Kapillarkraft gelangen und in welcher eine Mischung der Flüssigkeiten im wesentlichen durch Diffusion erfolgt, wobei zwei jeweils in eine Kapillare mündende Flüssigkeitsaufgabestellen vorliegen, die getrennt befüllbar sind und in einer gemeinsamen, ebenfalls kapillarwirksamen Mischzone münden, in einer beveizugten Ausführungsform der Erfindung verlaufen die Kapillaren parallel zu den Kanten der Mischzone.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Kapillarkraftmischer nach einem der beiden letzten Absätze, wobei die kapillaraktive Mischzone selbst direkt mit den Flüssigkeitsaufgabestellen verbunden ist, so dass keine zusätzlichen Kapillaren vorliegen.
  • Stärker bevorzugt ist ein Kapillarkraftmischer nach einem der drei letzten Absätze, dadurch gekennzeichnet, dass keine beweglichen oder aktiven Teile zur Funktion vorhanden sind.
  • Insbesondere bevorzugt ist ein Kapillarkraftmischer gemäss dem letzten Absatz, worin die Schichtdicke der Flüssigkeiten in der Mischzone fest voreingestellt ist.
  • Bevorzugt ist ein Kapillarkraftmischer nach dem letzten Absatz, dadurch gekennzeichnet, dass die Schichtdicke der Flüssigkeiten in der Mischzone fest in einem Bereich von 0,1 bis 10.000 µm, vorzugsweise in einem Bereich von 1 bis 100 µm, voreingestellt ist.
  • Stärker bevorzugt ist ein Kapillarkraftmischer nach dem vorletzten oder letzten Absatz, dessen Mischzone so ausgebildet ist, dass die Schichtdicke der Flüssigkeiten in der Mischzone so eingestellt ist, daß IR-spektroskopische Messungen in wässrigen Lösungsmitteln durchgeführt werden können; vorzugsweise ist die Schichtdicke der Flüssigkeiten in der Mischzone fest in einem Bereich von unter 30 µm, insbesondere von 3 bis 30, vor allem von 5 bis 10 µm voreingestellt.
  • Besonders bevorzugt ist ein Kapillarkraftmischer nach einem der vorhergehenden sieben Absätze, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere funktionale Bereiche mit Mitteln zum Temperieren ausgestattet sind, oder ein Kapillarkraftmischer nach einem dieser Absätze, bei dem funktionale Schichten im Bereich der Mischzone eingebracht sind.
  • Noch bevorzugter ist ein Kapillarkraftmischer nach dem letzten Absatz, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere funktionale Teile mit Sensoren, insbesondere elektrochemischen Sensoren, ausgestattet sind.
  • Ganz besonders bevorzugt ist ein Kapillarkraftmischer nach einem der letzten neun Absätze, dadurch gekennzeichnet, dass in der Mischzone eine oder bei mehr als zwei Flüssigkeitsaufgabestellen mehrere hydrophobe oder anders gestaltete Trennschichten vorhanden (= auf die Innenfläche des Kapillarbereichs, insbesondere der Mischzone aufgebracht) sind, die eine vorzeitige Mischung der durch Kapillarkraft in die Mischzone gebrachten Flüssigkeiten verhindern, insbesondere weiter dadurch gekennzeichet, dass zur vollständigen Füllung der Mischzone ein Entlüftungskanal (Lüftungsschacht) vorhanden ist; vorzugsweise ist hierbei die Volumenkalibrierung (Flüssigkeitsmenge) der (aufzutragenden) Flüssigkeiten durch die Abmessungen der Mischzone bis zur hydrophoben Zone fest vorgegeben.
  • Noch stärker bevorzugt ist ein Kapillarkraftmischer gemäss einem der letzten 10 Absätze, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen der Zuführkapillaren und der Mischzone (in einer Erfindungsvariante ohne Zuführkapillaren nur das Volumen der Mischzone) im Bereich von 0,05 bis 800 nl voreingestellt ist, vorzugsweise 0,1 bis 100, insbesondere 0,1 bis 50 nl beträgt.
  • Sehr bevorzugt ist ein Kapillarkraftmischer gemäss einem der letzten elf Absätze, der aus zwei Einzelteilen (Deck- und Substratschicht) zusammengesetzt ist.
  • Insbesondere ist ein Kapillarkraftmischer gemäss einem der letzten zwölf Absätze, der aus Silizium, aus Glas oder beidem besteht (ermöglicht hochpräzise Konstruktion) bevorzugt.
  • Noch bevorzugter ist ein Kapillarkraftmischer nach einem der letzten dreizehn Absätze, bei dem Mittel zur Detektion auf optischem, elektrochemischem oder anderem geeignetem Wege von Reaktionen vorliegen, die innerhalb der in das Kapillarsystem integrierten Mischzone nach Mischung der Flüssigkeiten stattfinden.
  • Besonders bevorzugt ist hierbei ein Kapillarkraftmischer gemäss einem der vorstehenden vierzehn Absätze, der eine Linse oder eine Fresnel-Linse, insbesondere im Bereich der Mischzone, vorzugsweise integriert auf der Aussenseite des Kapillarkraftmischers, vor allem bei Kunststoffausführungen (in erster Linie eines optisch transparenten Bereichs), umfasst.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist auf Verwendung des Kapillarkraftmischers nach einem der letzten fünfzehn Absätze für die Analyse mindestens zweier Flüssigkeiten, die zur Reaktion zusammengeführt und gemischt werden und deren Zusammenführung zum Erhalt näherer Informationen über mindestens eine der Flüssigkeiten führt, oder deren Reaktion eine neue Komponente bildet, dadurch gekennzeichnet, daß alle Flüssigkeiten durch Kapillarkraft ohne Zufügen äußerer Kräfte in den Kapillarkraftmischer gefüllt werden und deren Mischung im wesentlichen durch Diffusion erfolgt, gerichtet.
  • Insbesondere ist die Verwendung des Kapillarkraftmischers nach dem vorstehenden Absatz bevorzugt, wobei die Messmethode eine spektroskopische Methode, insbesondere eine spektroskopische Messmethode, die elektromagnetische Wellen mit einer Wellenlänge von etwa 160 bis etwa 20000 nm, vorzugsweise von etwa 180 bis etwa 15000 nm, vor allem IR-Licht mit einer Wellenlänge von etwa 700 bis etwa 15000 nm, vor allem etwa 2500 bis 15000 nm, benutzt.
  • Bevorzugt ist auch die Verwendung eines Kapillarkraftmischers wie oben beschrieben für die Analyse durch elektrochemische oder enzymatische Methoden.
  • Besonders bevorzugt ist die Verwendung gemäss einem der letzten drei Absätze eines Kapillarkraftmischers, dadurch gekennzeichnet, dass zur Messung eines Referenzwertes direkt in situ eine Detektion vor der Befüllung mit der zweiten oder späteren Flüssigkeit (Reagenzlösung oder Probenlösung) durchgeführt wird.
  • Sehr bevorzugt ist die Verwendung eines Kapillarkraftmischers nach einem der letzten vier Absätze, wobei eine der Flüssigkeiten eine biologische Probe, insbesondere Vollblut, ist.
  • Sehr bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemässen Verfahren und Vorrichtungen finden sich in den Beispielen.
  • Bei den Flüssigkeiten handelt es sich zum einen um Proben, insbesondere um biologische Proben, wie Blut (Vollblut), Blutplasma, Blutserum, Speichel, Schweiss, Urin, Eiter, Magensaft, Galle, andere Verdauungssäfte, Liquor, Tränenflüssigkeit, Milch, Drüsensekrete, Synovialflüssigkeit, aber auch Hämolymphe aus Insekten, flüssige Nahrungsmittel oder Nahrungsmittelbestandteile in der Ernährungsanalytik, Kulturmedien, Zellplasma, Medikamente, oder auch Gewässerproben, beispielsweise aus Seen, fliessenden Gewässern oder Kläranlagen, Extrakte oder sonstige zu analysierende Flüssigkeiten, die jeweils nach Aufarbeitung, wie Zentrifugation, Filtration, Chromatographie oder dergleichen, oder insbesondere ohne Aufarbeitung (insbesondere im Falle von Blut, wo auch zelluläre Bestandteile enthalten sein können, die insbesondere bei geringer Schichtdicke der Mischzone aus dem Mischbereich ausgeschlossen sein können, oder bei grösseren Schichtdicken aufgrund ihrer langsamen Diffusion im Gegensatz zur sie umgebenden Flüssigkeit nur sehr langsam in einen Bereich der Mischzone mit einer Reaganzlösung eindiffundieren, so dass dort Eigenschaften der umgebenden Flüssigkeit direkt gemessen werden können) auf die Flüssigkeitsaufgabezonen aufgegeben werden können, wobei diese Proben qualititativ oder quantitativ nachzuweisende Reaktanden (Analyte), insbesondere Enzyme, Antikörper, Nukleinsäuren, andere Biomakromoleküle, Zucker, Lipide, Liposaccharide, organische Säuren, Aminosäuren, Medikamente oder andere Xenobiotika, Metabolite, Enzymsubstrate, andere organische Verbindungen, Schwermetalle, Ionen, Gase oder dergleichen enthalten. Zum anderen handelt es sich um Lösungen von Nachweisreagenzien ("Reagenzien", "Reagenzlösungen"), mit komplementären (d.h. zu irgend einer Art der nachweisbaren Wechselwirkung, z.B. chemischer (einschliesslich biochemischer oder biologischer) oder physikalischer Art, mit einem oder mehreren Analyten aus den Proben, befähigten) Reaktanden (insbesondere gegebenenfalls fluoreszenz-, enzym- oder anderweitig derivatisierten Antikörpern, niedermolekulare Reagenzien (beispielsweise Substrate und/oder Kosubstrate für enzymatische Reaktionen mit Komponenten in den Proben oder interkalierende (z. B. Fluoreszenz-)Farbstoffe), Enzyme oder andere Katalysatoren, Mischungen von Enzymen oder anderen Katalysatoren mit Substraten und/oder Kosubstraten, Komplexbildner, etc., die vorzugsweise nach der Durchmischung mit einer Probe jeweils eine spezifische Änderung einer physikalischen oder chemischen Eigenschaft ("Signal") bewirken, welche detektiert werden kann und für analytische Zwecke ausgewertet werden kann, vor allem computergestützt. Bevorzugte Anwendungen sind auch PCR und Hybridisierung von Nukleinsäuren oder Derivaten (z.B. fluoreszenzmarkiert, oder mit modifizierten Basen und/oder Backbones) davon.
  • Dass die Mischung im wesentlichen durch Diffusion erfolgt, bedeutet, dass keine äusseren Hilfsmittel zur Mischung (wie Vibration, Rühren, Zentrifugagtion oder dergleichen) nötig sind und insbesondere keine derartigen Mittel eingesetzt werden, um die Mischung aufgetragener Flüssigkeiten hervorzurufen (allenfalls zur Überwindung hydrophober Trennschichten, um die aufgetragenen Flüssigkeiten in Kontakt zu bringen). Insbesondere handelt es sich um die Ineinanderdiffusion von 2 oder mehr Flüssigkeiten, im Unterschied zur Diffusion von Festsubstanzen in eine Flüssigkeit.
  • Die Detektion von aus der Durchmischung resultierenden (oder vorhergehenden, um insbesondere eine Kalibrierung zu ermöglichen) Signalen ist mit herkömmlichen Spektrometern möglich, lediglich die Meßstrahlfokussierung sollte der Weite der Nachweiszone angepaßt werden. Durch den besonderen Aufbau ist es möglich, insbesondere Infrarot (IR)-spektroskopische Untersuchungen in wässrigen Lösungen durchzuführen, die in üblichen Fluidkanalsystemen wegen der hohen Absorption in diesem Spektralbereich des als Lösungsmittel benutzten Wassers nicht möglich sind. IR-Spektroskopie kann mit ausreichender Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit nur bis zu einer Wasserschichtdicke von etwa 10 µm (in besonderen Fällen auch bis zu 30 µm) betrieben werden. Die Dickenvariation der Messkammer ist dabei für eine zuverlässige Reproduzierbarkeit so gering wie möglich zu halten.
  • IR-Spektroskopie ist eine Routine-Methode und wird von organischen Chemikern, Biochemikern und anderen zum qualitativen und quantitativen Molekülnachweis eingesetzt. Wenn Infrarot-Licht durch eine Probe eines organischen Stoffes geleitet wird, werden einige der Frequenzen absorbiert, während andere Frequenzen ungeschwächt durch die Probe geleitet werden. Anwendungen in der Analyse organischer Stoffe benutzen fast ausschließlich IR-Licht mit Wellenzahlen im Bereich 650-4000 cm-1 (Mitt-IR). Wellenzahlen unterhalb von 650 cm-1 werden als fernes IR (Far Infrared = FIR) bezeichnet, solche oberhalb von 4000 cm-1 als Nah-IR (Near Infrared = NIR).
  • IR-Spektroskopie schließt auch Laser-Raman-Spektroskopie ein, einschließlich Raman-konfokaler Laser-Spektroskopie, Fourier-Transformations-IR (FTIR)-spektroskopie oder Hadamard-Transformations-IR, oder jede andere IR-spektroskopische Methode. Mittels der besonders bevorzugten Fourier-Transform (FT-IR)-Spektroskopie sind ohne weiteres qualitative und quantitative Bestimmungen von Analyten im Pikogramm (pg)-Bereich möglich. Mit anderen optischen Methoden, wie UV/VIS- oder insbesondere Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzspektroskopie, können noch sehr viel geringere Mengen nachgewiesen werden. Auch die "Total internal reflection fluorescence technique (TIRF, siehe Garlamd PB et al.: Optical evanescent methods for study of biomolecular interactions, Quart. Rev. Biophys. 29, 91-117 (1996), die auf der Detektion von ausserhalb des Hauptstrahls aus dem Material herausgetragenen Strahlen basiert, kann Anwendung finden.
  • Wie bei allen Methoden der Spektroskopie ist auch bei der IR-Spektroskopie das erhaltene Signal abhängig von der Schichtdicke der untersuchten Probe, so daß das IR-Signal, das von einer < 10 µm Zelle erhalten wird, sehr schwach ist. Dieser Nachteil kann durch eine unmittelbar vorhergehende Kalibrierung zum größten Teil aufgefangen werden, da dadurch die Mess-Ungenauigkeiten zu einem großen Teil eliminiert werden. Die hierfür notwendige Steuerung und Software sind grundsätzlich bereits Stand der Technik und oft in Spektrometern zu finden. Die Möglichkeit zur Kalibrierung der Proben direkt vor der Mischung bei der exakt gleichen optischen Weglänge wie im Mischzustand ist ein entscheidender Vorteil des neuen Mikrofluidkanalsystems. Dies ermöglicht insbesondere auch Differenzmessungen (Vergleich vorher/nachher).
  • Geeignete Analysegeräte, insbesondere FT-IR-Geräte, sind leicht zugänglich, insbesondere kommerziell erhältlich, beispielsweise von Bruker (Karlsruhe, Deutschland), z.B. Bruker Spectrum GX FT-IR Spectrometer Bruker Equinox 55; Beispiele für UV/VIS-Geräte sind das Lambda 40 oder das Lambda 800 UV/VIS Spectrometer System von Perkin Elmer.
  • Als inerter Träger (Matrix) für einen erfindungsgemässen Kapillarkraftmischer dient ein ein- oder mehrteiliges Substrat, das durch die zu applizierenden Flüssigkeiten nicht oder nicht innerhalb des für die Applikation und Messung erforderlichen Zeitraumes nicht oder nicht wesentlich angegriffen wird, insbesondere aus einem oder mehreren der nachfolgend genannten Materialien.
  • Das neue Mikrofluidkanalsystems ist in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sehr einfach aufgebaut. Durch das Fehlen jeglicher beweglicher Komponenten ist der (bevorzugte) Aufbau des Trägers aus zwei mikrotechnisch im Batch-Verfahren bearbeiteten Platten (Deck- und Substratschicht) möglich. Dieses Verfahren ist sehr kostengünstig und basiert auf dem letzten Stand der Technik. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung kann ein matrixförmiges Array, beispielsweise bestehend aus einer Deck- und Substratschicht, welches mehrere der erfindungsgemässen Kapillarkraftmischer (gegebenenfalls mit Entlüftungskanälen, hydrophoben Trennschichten oder anderen Merkmalen bevorzugter Ausführungsformen dieser Kapillarkraftmischer, wie hierin beschrieben) in matrixartiger Anordnung beinhaltet, z.B. insgesamt mit den Abmessungen von üblichen Mikrotiterplatten, vorliegen, das insbesondere direkt aus zwei Teilen (Deck- und Substratschicht) hergestellt werden kann.
  • Die Herstellung eines erfindungsgemässen Kapillarkraftmischers erfolgt insbesondere, indem man die Bestandteile des erfindungsgemässen Kapillarkraftmischers (vorzugsweise gerichtet) zusammengefügt und durch Halteeinrichtungen, wie Klemmen oder dergleichen, miteinander verbindet. Die Bestandteile, z.B. Platten (Deck- und Substratschicht), des Mikrofluidkanalarrays können auch durch Verkleben (beispielsweise mittels Polymerisations-, Polyadditions- oder Polykondensationswerkstoffen, die auch mit Füllstoffen versetzt sein können, z.B. zur Erhöhung der elektrischen Leitfähigkeit mit Silberpartikeln), Verschweissen, Glass Fusion Bonding oder andere mikrotechnische Verfahren wie anodisches oder eutektisches Bonding zusammengefügt werden. Hierbei muß gerichtet verfahren werden, d.h., die Bauteile müssen genau fluchten ("Alignment"), um die Deckungsgleichheit, beispielsweise vorhandener Kanäle, zu gewährleisten, und die Zusammenfügung darf im Kapillar- bzw. Mischzonenbereich kein zusätzliches Volumen entstehen lassen.
  • Eine Reihe von Materialien können verwendet werden. Vorzugsweise, da die Vorrichtungen mikrotechnisch hergestellt werden, sind die Materialien so ausgesucht, dass sie mit bekannten Mikrofabrikations-Techniken kompatibel sind. Hierzu gehören z.B. Methoden zur Entfernung von Material von der Oberfläche, wie Nassätzen, elektrochemisches Ätzen, anisotropes Ätzen oder insbesondere chemische Nassätzung, beispielsweise im Falle von SiO2 mittels Fluorwasserstoff/Ammoniumfluorid in An- oder Abwesenheit von Essigsäure, oder Trockenätzen, wie Plasmaätzprozesse, wie Zerstäubung, plasmachemisches Ätzen, reaktives Ionenätzen, Ionenstrahlätzen oder anisotropes Tiefenätzen mittels RIE, lonenstrahlverfahren, wie Ionenstrahlätzen, Laserablation (Laser-Abtragung), Photolithographie, insbesondere Laserablation; Aufbringen von Material, beispielsweise mittels PVD, sei es ohne Plasmaunterstützung (z.B. thermisches Verdampfen, Flash-Verdampfen, MBE, VPE oder Elektronenstrahlverdampfen), CVD (thermisch gestützt oder plasmagestützt (PECVD)), lasergestützte Materialabscheidung oder nasschemische Metallabscheidung (galvanisch oder chemisch); oder direkte Formgebungsverfahren, wie Vakuumformung, Spritzguss oder andere Urformmethoden, Pressung, Prägung (beispielsweise heisse Prägung), und dergleichen, je nach Eignung für das jeweilige Material, oder Kombinationen davon. Die Materialien werden auch selektioniert nach ihrer Eignung für den gesamten Bereich an Bedingungen, denen die Mikrofluidiksysteme ausgesetzt werden sollen, einschließlich extremer Temperatur-, pH- oder Salzkonzentrationsbedingungen oder der Anwendung elektrischer oder magnetischer Felder. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei den Materialien um solche, die auch in der Halbleiterindustrie Anwendung finden, wo regelmässig Mikrofabrikationstechniken Anwendung finden, insbesondere auf Siliziumbasis, wie Silizium, oder andere Halbleitermaterialien, wie Galliumarsenid. Andere bevorzugte Materialien sind Siliziumdioxid, Glas, wie Borosilikatgläser, Quarz, Quarzglas, Silikon oder Polysilikon. Im Falle von Halbleitermaterialien kann es oft zweckmässig sein, eine Isolierschicht, beispielsweise aus Siliziumdioxid, über das Material zu schichten, insbesondere, wo elektrische Felder auf dem Mikrofluidelement Anwendung finden sollen. Weitere bevorzugte Materialien sind Kunststoffe, u.a. Polymere, wie Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat, Polyester, wie Polybutylentherephthalat oder Polyethylentherephthalat, Polyamide, Polytetrafluorethylen (TEFLON® ), Polyvinylchlorid (PVC), Polydimethylsiloxan (PDMS), Polysulfon, Polystyrol, Polyolefine, wie Polymethylpenten, Polypropylen oder Polyethylen, Polyvinylidinfluorid, Acrylnitril-Butadien-Copolymer (ABS), Cycloolefinpolymere wie TOPAS® (Thermoplastisches Olefin-Polymer mit amorpher Struktur der Hoechst AG, Frankfurt, Deutschland) Blockcopolymere oder Gemische von zwei oder mehr davon verwendbar. Aus solchen Polymeren bestehende Teile, insbesondere Substrat- und Deckschichten, sind nach bekannten, beispielsweise den oben genannten, Mikrofabrikationsverfahren herstellbar, oder mittels mikrotechnisch hergestellter Mutterformen unter Verwendung bekannter Formungsverfahren, wie Spritzguss, Prägen oder Stempeln, oder durch Polymerisation des monomeren Vorläufermaterials innerhalb der Form (Urform). Derartige polymere Materialien sind für viele Zwecke bevorzugt, da sie leicht herstellbar, preisgünstig und auch wegwerfbar sein können. Auch Keramikmaterialien sind möglich, insbesondere bei hybrid aufgebauten Mikrosystemen. Mikrofluidikelemente auf Glas- oder Siliziumbasis sind besonders bevorzugt. Alle genannten Materialien können spezifisch behandelte oder beschichtete Oberflächen oder Oberflächenabschnitte innerhalb des Kapillar- oder ferner der Probenaufgabebereiche enthalten, beispielsweise hydrophobisierte Bereiche (insbesondere Trennschichten mit linearer Ausdehnung), z.B. durch Silanierung (Beschichtung mit einem Silan, an das ein eine Hydroxygruppe tragendes Verbindungsmolekül gekoppelt wird) funktioneller, wie Hydroxy-, Gruppen oder Metallierung, insbesondere mit Gold, z.B. durch Aufdampfen, oder (vor allem zur Erhöhung der Kapillarkräfte) Hydrophilisierung, z.B. bei Glas mittels Anätzung, so dass die Oberfläche viele Hydroxygruppen aufweist, beispielswiese mit Caro'scher Säure, oder anderweitige Einführung polarer Gruppen (z.B. Silanisierung mit amino-oder hydroxygruppenhaltigen Silanen), oder bei Kunststoffen durch Behandlung mit Argon-Plasma, Plasmaätzung, Korona-Entladung (z.B. 10-25 W bei 13,56 MHz, 1 Torr Kammerdruck, 5-10 min), durch kovalente Bindung photoreaktiv ausgerüsteter hydrophiler Polymerer, durch Aufbringung netzmittelartiger Schichten oder Beschichtung mit Nanokompositen mittels Sol-/Geltechnologie, durch dünne Al2O3-Beschichtung (Bedampfen mit Al, nachfolgende Oxidation auf elektrochemischem Wege, durch Erhitzen in Wasser oder mittels Wasserdampf), im Falle von PMMA insbesondere durch Anätzen mit KOH; oder durch andere thermische, physikalische oder chemische Methoden, je nach Eignung für das jeweilige Material.
  • Die kapillaraktive Mischzone ist entweder über Kapillaren mit den Flüssigkeitsaufgabestellen verbunden, oder direkt mit diesen verbunden, so dass keine separaten Zuführkapillaren vorhanden sind. Die Mischzone umfasst die Nachweiszone (Detektionszone) für die aus der Mischung resultierenden physikalischen oder chemischen Signale, beispielswiese optische Fenster, Sensoren oder dergleichen.
  • Um optische Auswertung zu ermöglichen, ist der Aufbau mit für den vorgesehenen optischen Meßbereich transparenten Materialien möglich, zum Beispiel, ohne dadurch eine Einschränkung ableiten zu wollen, für sichtbares Licht klare Kunststoffe oder Glas, für kurzwelliges (UV) Licht vorzugsweise optisches Spezialglas oder Quarzglas und für langwelliges Licht (IR) vorzugsweise Silizium. Für die Befüllung des Kanals durch Kapillarkraft ist die Benetzbarkeit der Matrix zwingend nötig, was durch entsprechende Behandlung der Oberflächen erreicht werden kann (siehe oben).
  • In der Mischzone können funktionale Bereiche (Schichten) eingebracht werden, zum Beispiel elektrischer oder biochemischer Natur, die sich nach der Bestimmung der gesuchten Meßgröße richten. Hier handelt es sich vorzugsweise um Sensoren (Wandler), wie insbesondere chemische Sensoren (z.B. Chemowiderstände, Chemokapazitäten, Metalloxid-Gassensoren, chemisch senistive Feldeffekttransistoren, wie ISFETS oder CHEMFETS, Mikroelektroden (potentiometrisch oder amperometrisch), SAW-Sensoren, z.B. Vakuumresonatoren, oder Chemosensorarrays); oder biologische Sensoren (insbesondere CMOSkompatible), oder Strahlungssensoren (z.B. Fotodioden oder Bildsensoren, insbesondere für Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzmessungen); ferner auch thermische Wandler, Wandler für ionisierende Strahlung, magnetische oder mechanische Wandler; sowie beliebige Kombinationen derartiger Sensoren. Auch Mittel zum Temperieren können integriert sein, wie Heizelemente, z.B. Polysiliziumwiderstände oder Thermogeneratoren, oder zur Abkühlung Kanäle für Kühlmittel. Solche funktionelle Schichten sind jedoch für die Herstellung des die Erfindung ausmachenden Gegenstandes nicht zwingend nötig - in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung liegen sie nicht vor. Temperiermittel können alternativ oder ergänzend auch extern vorliegen.
  • Der Bereich der Mischzone bedarf keinerlei Riefen oder Rillen oder anderer Mittel zur Ausrichtung des Kapillarflusses eingebrachter Flüssigkeiten entlang vorbestimmter Wege, so dass vorzugsweise völlig glatte Oberflächen vorliegen.
  • Die Flüssigkeitsaufgabestellen können Mittel zur verbesserten Verbindung der Aufgabestelle mit dem Kapillarbereich enthalten, beispielsweise eine oder mehrere kleine Kerben im Übergangsbereich zwischen Flüssigkeitsaufgabestelle und Kapillarbereich oder am Rande hydrophobisierte, am Übergang zum Kapillarbereich hydrophile oder hydrophilisierte Bereiche. Jedoch sind derartige Mittel nicht zwingend notwendig, aber andererseits bei bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemässen Kapillarkraftmischers vorhanden.
  • Entlüftungskanäle sind vorzugsweise so konzipiert, dass sie nur einen Gas-, nicht den Flüssigkeitstransport ermöglichen (beispielsweise durch Hydrophobisierung der Oberfläche, wenigstens im Grenzbereich zur Mischzone des Kapillarkraftmischers, durch grossen Querschnitt, so dass am Übergang von der Mischzone zum Entlüftungskanal die Kapillarkraft nicht mehr ausreicht für den Weitertransport der Flüssigkeit (Stop Junction), durch Ausbildung als mikroporöser, hydrophober Stopfen, der Luft, aber nicht hydrophile Flüssigkeiten durchlässt, oder dergleichen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt eine Matrix mehrerer der erfindungsgemässen Kapillarkraftmischer vor, deren Entlüftungskanäle alle oder gruppenweise miteinander verbunden (gekoppelt) vorliegen, was beispielsweise im Falle hydrophober Trennzonnen in der Mischkammer erlaubt, durch Druck- oder insbesondere Unterdruckstoß die Trennung von applizierten Proben in allen oder mehreren Mischzonen gleichzeitig zu überwinden und so den Kontakt zwischen den Proben und deren anschliessende Mischung synchronisiert einzuleiten. Auch bei getrennten Entlüftungskanälen kann jedoch durch einen Druck- oder Unterdruckstoss bei mehreren Kapillarkraftmischern synchron die Überwindung hydrophober Trennschichten eingeleitet werden, beispielsweise bei Vorliegen in einer Druckkammer.
    • Beispiele: Die nachfolgenden Exemplifizierungen dienen der Illustration der Erfindung, ohne ihren Umfang einschränken zu wollen. Beispiel 1: Aufbau eines einzelnen Kapillarkraftmischers
  • Abb. 1 stellt den beispielhaften Aufbau eines einzelnen Kapillarkraftmischers, der beispielsweise in einem Multisystemarray (mehrere derartige Kapillarkraftmischer matrixartig nebeneinanderliegend) vorliegt, dar. Die beiden Platten (1, 2) werden gerichtet zusammengefügt und durch Halteeinrichtungen, wie Klemmen oder dergleichen, zusammengehalten. Die Kontaktflächen sind vorher durch Warmumformung oder Gießen, vorteilhaft durch mikrotechnische Verfahren wie Photolithographie, trockenes oder nasses Ätzen, so wie "Synchroton Radiation ablation" oder auch durch Auftragsverfahren, beispielsweise Aufspinnen, CVD oder ähnlichem, so bearbeitet worden, daß das fertige Produkt pro Mikrofluidkanalsystem eine Zuführkapillare (3 und 6) für jede der Flüssigkeiten und eine Zone (5) für die Mischung und Detektion aufweist. Die Platten (Deck- und Substratschicht) des Mikrofluidkanalarrays können auch durch Verkleben, Verschweissen oder andere mikrotechnische Verfahren wie anodisches oder eutektisches Bonding zusammengefügt werden. Hierbei muß gerichtet verfahren werden und die Zusammenfügung darf kein zusätzliches Volumen entstehen lassen.
    • Beispiel 2: Kapillarkraftmischer für die Mischung zweier Flüssigkeiten
  • Der als Beispiel in Abb. 2a schematisch dargestellte Kapillarkraftmischer für die Mischung zweier Flüssigkeiten mit Reaktanden hat die folgenden Funktionen, die sinngemäß auch für Kapillarkraftmischer für die Mischung von mehr als zwei Flüssigkeiten zutreffen. Die beiden Kapillaren (3 und 6) sind in der Misch- und Detektionszone (5) verbunden. Bei Befüllung der ersten Kapillare (3) durch die Füllöffnung (= Flüssigkeitsaufgabestelle) -(4) mit Probenflüssigkeit (8) wird die eingebrachte Probe durch Kapillarkraft in die Misch- und Detektionszone (5) gezogen, während die zweite Kapillare (6) frei von Flüssigkeit bleibt (9). Dies ist in Abb. 2b dargestellt. Nun kann die Kalibrierung durch entsprechende Methoden, vorzugsweise, aber nicht ausschließlich, durch spektroskopische Methoden, besonders bevorzugt IR-spektroskopische Methoden, durchgeführt werden. Anschließend wird die zweite Kapillare (6) durch die Füllöffnung (= Flüssigkeitsaufgabestelle) (7) mit Reagenzflüssigkeit (10) befüllt. An der Kontaktfläche mit der Probenflüssigkeit (8) in der Misch- und Detektionszone (5) findet sofort eine Mischung (11) statt (Abb. 2c). Die Mischfront schreitet in Richtung der ersten Kapillare (3) voran. Dies kann zeitaufgelöst durch geeignete Methoden, zum Beispiel Methoden der Spektroskopie (insbesondere IR), detektiert werden. Dazu steht die gesamte Länge der Misch- und Detektionszone (5) zur Verfügung. Die Messung kann dabei gleichzeitig an mehreren Punkten über die Misch- und Detektionszone (5) verteilt, oder in zeitlicher Folge an der selben Stelle der Misch- und Detektionszone (5) durchgeführt werden.
    • Beispiel 3: Kapillarkraftmischer mit hydrophober Trennschicht
  • In einer besonders bevorzugten Ausführung (Abb. 3) des Kapillarkraftmischers ist in der Misch- und Nachweiszone eine Schicht (13) eingebracht, welche der Stelle einen hydrophoben Charakter verleiht. Solche Schichten können ausgeführt sein durch spezielle Oberflächenbeschaffenheit wie Rauhigkeit, vorzugsweise jedoch durch hydrophobe Beschichtung, etwa aus hydrophoben Metallschichten wie beispielsweise Gold, in noch stärker bevorzugter Ausführung aus hydrophoben Kunststoffen. Als Beispiel eines solchen hydrophoben Kunststoffes sei, ohne Einschränkungen daraus abzuleiten, Teflon genannt. Auch Silanisierung, insbesondere mit Alkylsilanen, ist möglich. Diese Schicht (13) bildet eine Trennzone und bewirkt, dass während des Einbringens (Abb. 3a) der wässrigen Flüssigkeit (z.B. Probe) (14) die Kapillarkraft die Flüssigkeit nur bis zu der hydrophoben Grenzfläche (13) vordringt (15). Dies ist schematisch in Abb. 3b dargestellt. Ebenso wird die zweite Flüssigkeit (z.B. Reagenz) (16, Abb. 3c) nur bis zu der gegenüberliegenden Seite der Grenzfläche (13) eingezogen (17, Abb. 3d). Auf diese Weise kann eine Kalibrierung an beiden Flüssigkeiten (14, 16) in den Kapillarbereichen 15 bzw. 17 vor Beginn der Reaktion durch Mischen durchgeführt werden. Nach Überwindung der Trennung durch die hydrophoben Kräfte der Trennzone mittels geeigneter Methoden, zum Beispiel eine geringe Erschütterung, Druckänderung (insbesondere durch Anlegen eines Unterdruckstosses über den Entlüftungskanal 19) oder Hydrophilisierung der Trennzone (z.B. durch in mindestens einer der Flüssigkeiten vorliegende Chemikalien oder Katalysatoren, wie Enzyme, welche die hydrophobe Schicht abbauen), kann ein Kontakt zwischen beiden Flüssigkeiten (14, 16) hergestellt werden und die Mischung (18, Abb. 3e) erfolgt spontan. In dieser Ausführung muß ein Entlüftungskanal (19) wie in Abb. 1 dargestellt, eingearbeitet sein, damit eine vollständige Füllung der Mischzone gewährleistet wird. Diese bevorzugte Ausführung der Erfindung erlaubt nicht nur die spektroskopische Auswertung beider Flüssigkeiten vor der Mischung, sondern ermöglicht auch eine sehr exakte Bestimmung der benötigten Mengen, insbesondere an Reagenzflüssigkeit. Die Mischung ist auch rascher beendet als in der ersten Ausführung. Die dargestellten Schritte sind sinngemäß auch übertragbar für Kapillarkraftmischer mit mehr als zwei, insbesondere drei oder vier, Probenauftragsöffnungen und Probenkanälen, die in eine gemeinsame Misch- und Nachweiszone münden, wobei die Trennzone entsprechende Form hat, beispielsweise bei drei Aufgabeöffnungen die Form eines Y, dessen Schenkel jeweils die Trennzonen der Kammerabschnitte bedeutet, bei vier Aufgabeöffnungen die Form eines Plus-Zeichens (+) usw.
  • Sind mehrere derartige Mikrofluidelemente (beispielsweise in Form einer Matrix) vorhanden, können deren Entlüftungskanäle (19) gekoppelt sein, was eine Überwindung der Trennzone durch koordinierten (Unter-)-Druckstoss ermöglicht.
    • Beispiel 4: Befüllung eines Kapillarkraftmischers
  • Die Befüllung der Kapillaren durch die Probenaufgabeöffnung kann, wie in Abb. 4 schematisch dargestellt, durch eine Kapillarpipette (21) erfolgen, an deren Ende das Reagenz unter Schwerkraft oder leichtem Druck (26) einen Mikrotropfen (22) formt. Die Kapillarpipette wird in die Füllöffnung (4 bzw. 7) gesenkt, bis der Tropfen den Boden der Öffnung erreicht (27) und Kontakt aufnimmt mit der Kapillare (3 bzw. 6). Die Menge an Flüssigkeit (z.B. Probe) (28), die in das Mikrofluidkanalsystem aufgenommen wird, ist dabei bestimmt durch die Maße der Kapillare und einen möglicherweise applizierten Gegendruck (29). Dadurch wird es möglich, sehr geringe Mengen an Flüssigkeit, insbesondere an Reagenzflüssigkeit, zu verwenden, die andernfalls wegen der Oberflächenspannung der Flüssigkeit nicht einfach pipettiert werden könnten.
    • Beispiel 5: Herstellung eines Kapillarkraftmischers
    • a) Herstellung der Deckschicht (1) (Fig. 1): Ein Glaswafer von 10 cm Länge und Breite und 500 µm Dicke wird von beiden Seiten mittels Chrom-Sputtering (Vakuumbestäubung) 50 nm dick bechichtet. Unter Verwendung einer Photoresist-Maske, welche die Unterseite und den Beeich um die geplanten Zuführkapillaren (3, 6) und die geplante Mischzone (5) (zusammen Kapillarbeeich) (z.B. 0,5 x 0,5 cm) abdeckt, wird die übrige Chromschicht mit einem lichtempfindlichen Polymer (Photoesist, z.B. Microposit 1818S Photo Resist, Shipley Europe Ltd., Coventry, England) abgedeckt und der nicht abgedeckte Bereich UV-Licht ausgesetzt und entwickelt (z.B. mittels Microposit 351-Entwickler 5:1 in Wasser) (Photolithographie) und dann mittels HCl (36 %-ig) der nicht geschützte Bereich von der Chromschicht befreit (Patterning). Anschliessend wird der Bereich der zukünftigen Zuführkapillaren und der Mischzone mit 50 % HF 10 µm tief geätzt und dann die Photoresist- (mittels eines Photoresist-Entferners, wie Microposit Remover 1112A) und die Chromschicht entfernt. Damit ist die Dicke der Mischzone (10 µm) vorgegeben. Erneute Vakuumablagerung von Chrom (50 nm) auf beiden Flächenseiten des Glaswafers, erneute Photolithographie mit einer Maske, die nur die Bereiche der zukünftigen Proenaufgabenöffnung auf der Unterseite freilässt, und erneutes Cr-Patterning mit nachfolgener HF-Ätzung (50 %, 60 µm) mit nachfolgender Photoresist- und Chromentfernung sowie Laserbohren zur Erzielung von aussen zugänglicher Öffnungen als Flüssigkeitsaufgabestellen (Füllöffnungen) (4, 7) zur dem herausgeätzten Mischzonenbereich entgegengesetzten Seite (der zukünftigen Oberseite des Kapillarkraftmischers) ergibt die Deckplatte (1) des herzustellenden Kapillarkraftmischers.
    • b) Herstellung der Substratschicht: Ein Glaswafer wie unter a) beschrieben wird zunächst auf der Ober- und Unterseite mit einer 50 nm-Chromschicht vakuumbeschichtet, dann wird durch Photolithographie und Cr-Patterning auf der Oberseite die Vertiefung für die Flüssigkeitsaufgabe eingeätzt (36 % HCl), analog wie unter a) beschrieben. Nach BHF-Ätzung (50 µm) ist die Substratplatte (2) fertig.
    • c) Zusammenfügen der Deck- und der Substratschicht: Die Deck- und die Substratschicht werden zusammengefügt durch Glass-Fusion-Bonding (Zusammenfügen unter Druck bei 250 bis 600 °C nach Einbringen von HF zwischen die zu verbindenden Schichten mittels Dampf oder eines Tropfens Fluorwasserstoffsäure, was die Glasflächen leicht anätzt, so dass sie sich durch Druck und Diffusion fest verbinden) und ergeben zusammen den fertigen Kapillarkraftmischer.

Claims (10)

  1. Verwendung eines Kapillarkraftmischers für die Analyse von Flüssigkeiten, die Reagenzien umfassen, die zur Reaktion zusammengeführt und gemischt werden, wobei zum Kapillarkraftmischer mindestens zwei Flüssigkeitsaufgabestellen (4, 7) gehören und er Kapillarbereiche (3, 6) umfaßt, derart, daß die Flüssigkeiten durch Kapillarkraft ohne Zufügen äußerer Kräfte in den Kapillarkraftmischer aufgenommen werden und daß eine selbst kapillaraktive Mischzone (5) vorliegt, in welche die Flüssigkeiten durch Kapillarkraft gelangen und in welcher eine Mischung der Flüssigkeiten im wesentlichen durch Diffusion erfolgt, dadurch gekennzeichnet, daß die zwei Flüssigkeitsaufgabestellen (4, 7) jeweils in die Kapillaren (3, 6) münden, welche getrennt befüllt werden und in der gemeinsamen, ebenfalls kapillarwirksamen Mischzone (5) münden.
  2. Verwendung des Kapillarkraftmischers nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass keine beweglichen oder aktiven Teile zur Funktion vorhanden sind.
  3. Verwendung der Kapillarkraftmischers nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Schichtdicke der Flüssigkeiten in der Mischzone fest voreingestellt ist.
  4. Verwendung des Kapillarkraftmischer nach einem des voraugegaugenen Ansprüche, wobei die Schichtdicke der Flüssigkeiten in der Mischzone fest in einem Bereich von 1 bis 100 µm fest voreingestellt ist.
  5. Verwendung des Kapillarkraftmischers nach einem des voraugegaugenen Ansprüche worin die Schichtdicke der Flüssigkeiten in der Mischzone so eingestellt ist, dass IR-spektroskopische Messungen in wässrigen Lösungsmitteln durchgeführt werden können, insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass die Schichtdicke der Flüssigkeiten in der Mischzone fest in einem Bereich von 3 bis 30, insbesondere von 5 bis 10 µm, voreingestellt ist.
  6. Verwendung des Kapillarkraftmischers nach einem des voraugegaugenen Ansprüche, wobei in der Mischzone eine hydrophobe oder anders gestaltete Trennschicht vorhanden ist, die eine vorzeitige Mischung der durch Kapillarkraft in die Mischzone gebrachten Flüssigkeiten verhindert.
  7. Verwendung des Kapillarkraftmischer nach einem des voraugegaugenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur vollständigen Füllung der Mischzone ein Entlüftungsgang vorhanden ist.
  8. Verwendung des Kapillarkraftmischers nach einem des voraugegaugenen Ansprüche, wobei die Messmethode eine spektroskopische Methode ist, wobei vorzugsweise die spektroskopische Messmethode IR-Licht mit einer Wellenlänge von etwa 700 bis etwa 15000 nm benutzt, oder für die Analyse durch elektrochemische oder enzymatische Methoden.
  9. Verwendung des Kapillarkraftmischers nach einem des voraugegaugenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Messung eines Referenzwertes direkt in situ eine Detektion vor der Befüllung mit der zweiten oder späteren Reagenzlösung durchgeführt wird.
  10. Verwendung des Kapillarkraftmischers nach einem des voraugegaugenen Ansprüche, wobei eine der Flüssigkeiten eine biologische Probe, insbesondere Vollblut, darstellt, welches zelluläre Bestandteile enthält die bei geringer Schichtdicke der Mischzone aus dem Mischbereich ausgeschlossen werden oder aufgrund ihrer langsamen Diffusion im Gegensatz zur sie umgebenden Flüssigkeit nur sehr langsam in einen Bereich der Mischzone mit Reagenzlösung eindiffundieren, so dass die Eigenschaften der umgebenden Flüssigkeit direkt gemessen werden können.
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