DE19545130C2 - Verfahren und Vorrichtungen für ein modulares Mikrosystem für hochgenaue chemische Schnell-Analysen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein modular aufgebautes Mikrosystem für hochgenaue Schnell- Analysen. Das System hat eine geringe Ähnlichkeit mit einer maßanalytischen Tüpfelplatte mit sehr genau definierten Mikro-Kammern (Containments), bei der erfindungsgemäß die einzelnen Module mittels bekannter Methoden der hochpräzisen mikrosystemtechnologischen Massenproduktion hergestellt werden.

Die Erfindung stellt als "Labor auf dem Chip" ein echtes passives (d. h. kein stromverbrauchendes) Mikrosystem dar, das besonders durch alle Verfahren, deren Strukturen photolithographisch hergestellt werden, z. B. mittels der LIGA oder Silizium- Technologie, preiswert in Massen produziert werden kann. Bestimmte Varianten der erfindungsgemäßen Idee können auch durch die bekannten Techniken der Dickfilmtechnik (Siebdruck-Prinzip) auf Papier oder ähnliche Träger produziert werden. Der Aktuator stellt die Probe-Aliquotisierung über beliebige Mikro-Pipetten mit oder ohne Ventile im Probennahme-Modul dar, der Sensor wird aus der Serie der Mikro- Reaktoren mit dem Indikator und dem maßanalytischen, inkrementellen Äquivalenten im Titrations-Modul gebildet. Das System ergibt sich durch die Vereinigung beider und der Graduierung und/oder Skalierung in absoluten Äquivalenz-Einheiten mit der automatischen Rückführbarkeit auf das Mol.

Die Erfindung betrifft wegen der enormen Vielseitigkeit der verschiedenen maßanalytischen Verfahren und der außergewöhnlichen Variationsbreite der Kombinationsmöglichkeiten der Funktions-Module eine neue Klasse allgemein anwendbarer, hochgenauer, chemischer Schnell-Tests. Gemeinsames Merkmal ist ganz allgemein, daß die Stoffkonzentrations-Bestimmung in beliebigen Proben über konzentrationsabhängige geometrische Ausdehnungen oder mittels schnell und leicht feststellbarer, absoluter Äquivalenzmengen-Ermittlung auf oder in geeigneten Trägern durchgeführt wird, anstelle der sonst allgemein üblichen konzentrations­ proportionalen Intensitätsmessung von markierten, stofferkennenden Zonen (Indikator).

Ein besonderer, gemeinsamer Vorzug der verschiedenen und äußerst zahlreichen Ausführungsformen der Erfindung ist, daß zur Ermittlung der der betreffenden Analytkonzentration äquivalenten Reagenzmenge (chemisch stabiler maßanalytischer Titrator) nur eine Ortsbestimmung einer leicht feststellbaren (vorzugsweise optischen) Änderung eines geeignet gewählten Indikators (Farbumschlag) auf einem entsprechend skalierten Träger notwendig ist.

Es handelt sich bei dieser Erfindung auch um eine neue Generation von rationell zu fertigenden, absolut messenden Teststreifen, -röhrchen, Passiv-Sammlern mit integrierter Quantifizierung oder ähnlichem. Die Erfindung führt im Prinzip eine maßanalytische Titration im sog. Titrations-Modul über eine Serie von Mikrotitrationen in Mikro-Reaktionskammern durch, wobei der Äquivalenzpunkt entweder bei einem konstanten Mikro-Reaktor-Titer pro Mikro-Titrations-Raum durch eine im Probennahme- Modul genau abgemessene aber variable Probenmenge oder bei konstanten Proben- Aliquoten pro Mikro-Reaktions-Raum durch Variation des Reagenz-Titers von Mikro- Reaktor zu Mikro-Reaktor eingestellt wird. Zur Erhöhung des dynamischen Einsatzbereiches (erfaßbarer Konzentrationsbereich) kann auch beides, das Proben- Aliquot in den Mikro-Reaktoren und die dort zur Umsetzung verwendete Reagenzmenge gleichzeitig und gegenläufig verändert werden.

Die Anzahl der für den Schnell-Test erforderlichen Mikro-Reaktoren hängt vom betreffenden Anwendungsfall, dem Erfassungsbereich und der gewünschten Genauigkeit ab. So genügt beispielsweise zur Feststellung einer Grenzwert- Überschreitung prinzipiell eine einzige Proben-Aliquotisierung und ein einziger Mikro- Reaktor mit einer dem betreffenden Grenzwert entsprechenden Äquivalenzmenge des Titrators. Tritt in diesem Mikro-Reaktor eine Umfärbung des analytselektiven Indikators auf, wurde in der Probe der Grenzwert überschritten. Da dies jedoch wegen der Miniaturisierung zu unhandlich kleinen Schnell-Test-Vorrichtungen führt, soll erfindungsgemäß eine Grenzwert-Kontrolle durch leicht mögliche Mehrfachbestimmungen erfolgen. Um dazu einen evtl. möglichen systematischen Fehler (z. B. Staubkorn oder Luftblase in der Probennahme-Pipette) zu verringern, wird erfindungsgemäß sowohl das Proben-Aliquot als auch der Probennahme-Zeitraum gering geändert, was zu entsprechenden stöchiometrischen Änderungen des Titers in den entsprechend vorbereiteten Mikro-Reaktoren führt. Eine statistisch sichere Grenzwert-Überschreitung liegt nur dann vor, wenn alle Reaktoren einen Indikator- Umschlag anzeigen. Diese Redundanz erhöht die Zuverlässigkeit des Schnelltests außerordentlich ohne daß der analytische Aufwand und der Chemikalien-Abfall entsprechend ansteigt.

Alternativ sind natürlich auch Einsatzgebiete denkbar, in denen es beispielsweise analytisch chemisch genau darauf ankommt, untere und obere Grenzbereiche mit erhöhter Genauigkeit zu erfassen (z. B. biologische Streubreite bei medizinischen Diagnosen). Hier kann man erfindungsgemäß die beiden Grenzkonzentrations-Bereiche durch verhältnismäßig zahlreichere Mikro-Reaktoren mit feinerer Skalierung überstreichen. Auch hier erhöht die analytische Redundanz die Zuverlässigkeit von Schnell-Tests erheblich, so daß sie in Bereiche der Präzisions-Analytik hineinreichen und damit einem Bedürfnis entgegenkommen.

Die vorliegende Erfindung, die zu einer neuen Klasse von Schnell-Tests führt, löst auch das generelle, schwierige Problem aller sog. relativen Analysenverfahren und klassischer Schnell-Tests, die mittels einer störanfälligen Signal-Intensitäts-Messung durchgeführt werden, weil erfindungsgemäß nur noch eine leicht feststellbare Veränderung eines geeigneten Indikators oder Anfang und Ende einer markierten Zone bzw. eine analytrelevante Markierung von einem Untergrund in oder auf einem Träger zu unterscheiden sind. Dadurch werden erstmals kalibrationsfreie, absolut messende Schnelltests möglich, deren Genauigkeit nur von der Wahl der graduellen Titrationsmittel-Dosierung und/oder Proben-Aliquotisierung pro Mikro-Reaktor abhängt. Da die Schärfe der Erkennung eines Indikator-Umschlagpunktes bei der Maßanalyse bekanntlich leicht 0,1% Relativ-Prozent vom Äquivalenzvolumen ausmacht, lassen sich erfindungsgemäß extrem genau messende Meßsysteme aufbauen, wenn beispielsweise 1000 Mikro-Reaktoren in geeigneter Anordnung auf einem geeigneten Träger untergebracht werden und eine ganze Konzentrationsdekade des Analyten mit gleicher Genauigkeit erfaßt werden muß.

Aus der DE 36 29 272 C2 ist eine Mikrotiterplatte bekannt, welche mindestens eine als Reaktionsraum dienende Vertiefung mit einem Durchmesser von wenig­ stens 1 mm aufweist.

Die DE 19 11 762 beschreibt einen Titrierapparat bestehend aus mit Mulden versehenen Titrierplatten und einem Satz Tropfpipetten. Mit diesem Titrierap­ parat ist simultan eine Vielzahl absolut identischer Titrator-Titrand-Reaktionen durchführbar.

Dieser Stand der Technik auf dem Gebiet der sog. naßchemischen Analyse ist, bezogen auf die absoluten Mengen der miteinander reagierenden Stoffe (Analyt mit Standardlösung), nahezu dergleiche wie vor 100 Jahren, als beispielsweise die Maßanalyse als eine absolute Bestimmungsmethode eingeführt wurde. Bei den sog. titrimetrischen Verfahren (Säure-Base-, Redox-, Fällungs-, Komplex-, Assoziations-, Affinitäts-, etc. Titration) werden immer noch Volumina von i. d. R. 10 bis 100 mL bearbeitet und inzwischen ach mittels automatischer Titratoren mit integrierter Auswertungssoftware titriert. Da die Menge des zugesetzten Reagenzes (Titrator) durch das Volumen und den sog. Titer gegeben ist, muß die vorliegende Probenmenge in Abhängigkeit von der Analytkonzentration unterschiedlich dosiert werden, um den volumenmäßigen Verbrauch an Reagenz in einem durch die Dosiergenauigkeit limitierten Bereich zu halten. Üblicherweise sollten die zu Analytkonzentrationen bei einer titrimetrischen Analyse innerhalb einer Dekade liegen. Dies erfordert bei der Probenvorbereitung u. U. entsprechende Verdünnungsschritte.

Dieser Stand der Technologie bei der naßchemischen Maßanalyse produziert bei Serienanalysen eine entsprechend große Menge an Abfall, der je nach der Umweltrelevanz der Probe des Reagenzes oder der Äquivalenzpunkterkennungs- Indikatoren oder sonstiger Hilfsstoffe als Sondermüll deklariert werden muß. Bei den weltweit täglich durchgeführten über 100 Millionen chemischen Analysen werden nicht wenige so durchgeführt und belasten daher die Umwelt. Ein besonders drastisches Beispiel ist die laut Wasserabgabengesetz vorgeschriebene Bestimmung des sog. chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB-Wert), ein operativ definierter Parameter. Hier wird nach einem DIN-Verfahren bestimmt, wieviel Stoffe in einer Probe sind, die durch eine heiße, saure Dichromat-Standardlösung in einer bestimmten Zeiteinheit oxidiert werden. Dazu muß der Überschuß des Oxidationsmittels auch nach der Bestimmung erhalten bleiben, d. h. es muß das hochtoxische Chromat entsorgt werden. Bei einer zu hohen Chloridkonzentration muß zur Bindung dieses Anions, das natürlich vom Chromat auch oxidiert wird aber keine organische Belastung darstellt, die man eigentlich dadurch erfassen möchte, ein Quecksilbersalz als Chloridfänger hinzufügen. Dies alles läuft mit Probenmengen von 20 mL und Totalvolumina zwischen 30 und 100 mL bei Konzentrationen entsprechend 0,1 normaler Standardlösungen ab, was pro Analyse zu Milligram-Mengen an Abfall führt. Erfindungsgemäß wird bei gleichbeleibender Genauigkeit und sogar verkürztem Zeitaufwand die Abfallmenge um den Faktor < 1000 (!) reduziert.

Bei vielen klassischen Analysen, die inzwischen aus Gründen einer stringenteren Umweltpolitik erforderlich werden, wird der Informationsgewinn durch eine teilweise katastrophale Umweltbelastung mehr als kompensiert.

Allgemein kann festgestellt werden, daß einer generellen Miniaturisierung der klassischen Maßanalyse praktische Grenzen gesetzt sind. Der Umgang mit graduierten Volumenmeßgefäßen unter 1 mL ist nicht einfach und die derzeitigen Pipetten im Mikroliterbereich haben zu große Fehler und sind entsprechend aufwendig konstruiert. Bei der optischen Bestimmung des Äquivalenzpunktes müssen entsprechend kleine Strahlenquerschnitte verwendet werden, was zu apparativen Problemen bezüglich des Streulichtanteils führt.

Weil diese klassische Maßanalyse bei der Verwendung geeigneter Titratoren (Urtiter- Substanzen) eine absolute Bestimmungsmethode ist, die keiner Eichung mittels künstlicher oder natürlicher Standards (zertifizierte Standardreferenzmaterialien) bedarf, wird sie generell auch zur Kontrolle beliebiger Eich- oder Kalibierungslösungen eingesetzt. Demgegenüber bestimmt man die meisten Analyte anorganischer wie organischer Art durch sog. Relativ-Verfahren, die genau kalibiert werden müssen.

Bei fast allen analytisch-chemischen Relativ-Methoden wird die Intensität eines bestimmten Analysensignals (elektromagnetische Strahlung, elektrischer Strom, Widerstand oder Potential, sonstiges analytproportionales Sensor oder Detektorsignal) gemessen und mit dem einer Vergleichsprobe mit bekanntem Gehalt verglichen. Der Stand der Technik ist, daß bisher lediglich der letzte Schritt einer chemischen Analyse, den der Vermessung der Intensität eines Analysensignals, durch die apparativen Entwicklungen entscheidend verbessert werden konnte. Natürlich gibt es vor allem im klinischen Bereich mehr oder weniger große Automaten, die eine komplette chemische Naßanalyse vollautomatisch durchführen. Entsprechende Entwicklungen haben die seit den 60er Jahren bekannte Technikon-Auto-Analyzer Methode, die durch einen mit einem gasförmigen Zwischenraum segmentierten Probenstrom charakterisiert ist, verbessert.

Eine weitere Entwicklung hat versucht, das sog. Probenhandling zu vereinfachen und die Routine-Analytik zu automatisieren. Dies ist die Fließ-Injektionsanalyse (FIA, [E. H. Hansen, International Laboratory Vol. 15, No. 8, S. 14, 1986]), die analog dem Technikon-Auto-Analyzer System funktioniert, aber auf einen segmentierten Probenfluß verzichtet. Hier dosiert ein automatisches Probenahmeventil (Probenschleife) eine bestimmte Volumenmenge an Probe in einen Strom einer geeigneten Träger- oder Transportflüssigkeit (Carrier-Solution) der die Probe dann mit oder ohne Reaktions- oder Mischkammern mit allen erforderlichen Reagenzien vermischt und an einen Detektor vorbeiströmen läßt. Aus der Höhe oder Fläche eines dort erzeugten Analyt- Signal-Peaks wird dann die unbekannte Konzentration errechnet. Der Vorteil gegenüber den segmentierten Verfahren liegt darin, daß man durch die gewünschte Diffusion und Vermischen des Probensegments mit der Transportflüssigkeit beliebige Konzentrationsgradienten (sprich Verdünnungen) erzeugen kann.

Eine weitere Entwicklung auf dem Gebiet der naßchemischen Analyse sind entsprechende, mikroprozessor-gesteuerte Tischroboter-Systeme, die lediglich die Laborantentätigkeit automatisch erledigen.

Allen bekannten Systemen, die die naßchemische Analyse nach beliebigen Verfahren, Methoden oder Techniken automatisieren, liegt der Nachteil des großen Aufwandes und des relativ großen Reagenzienverbrauchs zugrunde. So sind beispielsweise die Automaten für die klinische Analyse komplizierte und entsprechend teuere Gebilde, die einen entsprechend großen Stellplatz erfordern und auch eine beachtliche Menge an elektrischer Anschlußleistung benötigen. Als eigenständiger Bereich hat sich bei den Schnell-Methoden auch der der Test-Kits etabliert. Hier wurden zumeist tragbare Reagenzien-Kits entwickelt, die durch Vermischen mit einem Proben-Aliquot im Milliliter-Bereich und zumeist photometrischer Auswertung schnelle Vor-Ort-Analysen ermöglichen sollen. Allen Systemen gemeinsam ist aber der Nachteil, daß die vermessenen Proben in vielen Fällen Sondermüll darstellen und nicht im Mikroliterbereich anfallen. Für den letzteren Bereich kommen zwar sog. µ-TAS (Mikro- Total-Analysen-Systeme) Entwicklungen infrage, die aber noch im Entwicklungsstadium sind. Selbst wenn diese extreme Miniaturisierung der klassischen Analytik kommerziell erhältlich sein würde, ist der Aufwand wegen der erforderlichen Mikropumpen und Signal-Meßeinrichtungen doch erheblich und führt zu keinen preiswerten Geräten.

Als Antwort auf diese gravierenden Nachteile der klassischen Analytik entwickelte sich in den letzten Jahren als Schnell-Test die Alternativmethode der sog. Trockenchemie (Oswald Sonntag: Trockenchemie: Analytik mit trägergebundenen Reagenzien, Thieme-Verlag, Stuttgart 1988) mit all ihren Varianten. Hier wurde versucht, die Probenvorbereitung, die Matrixabtrennung und die selektive Anfärbung mit einem speziellen, den Analyten erkennenden Reagenz auf einen mehr oder weniger planaren Träger aus Papier oder Kunststoff oder dergl, zu platzieren. Dies wird mit Hilfe entsprechender, unterschiedlicher Schichten mit immobilisierten Reagenzien oder Reagenzmischungen erreicht. In der medizinischen Schnellanalytik verwendet man häufig Teststreifen, bei denen ein oder mehrere Testfelder auf einem Kunststoffstreifen angebracht sind. Diese Teststreifen werden überwiegend visuell durch Vergleich der Reaktionsfarbe der Testfelder mit einer Farbskala, die häufig auf dem Etikett der Aufbewahrungsbehälter für diese Teststreifen angebracht sind, ausgewertet. Für die Referenz-Farbskala müssen dann aufwendige und lichtechte Farbdruckverfahren angewandt werden.

Die Teststreifen erfordern für den Anwender nur ein einfaches Eintauchen in die Probe und eine Konzentrationsablesung anhand einer Färbung oder einer Farbintensität die mit dem bloßen Auge geschehen kann. Entsprechende Teststreifen gibt es inzwischen für eine Vielzahl von Analyten im Bereich der Medizin, des Umweltschutzes der Produktionskontrolle usw.. Problematisch ist bei den traditionellen Teststreifen, daß die Zeitspanne des Eintauchens und die Art des Herausnehmens durch Abstreifen überschüssigen Probenvolumens genau vorgeschrieben ist und eingehalten werden muß. Das jeweils analysierte Proben-Aliquot wird durch die Verwendung eines flüssigkeitaufsaugenden Materials bestimmt. Diese Art ist nicht sehr genau; weshalb man auch nur von halbquantitativen Ergebnissen spricht. Ebenso ist die visuelle Analyse nicht standardisiert. Eine Reihe von Variablen kann die Qualität der Resultate beeinflussen (W. Majunke, U. Watterodt, R. Proetzsch, G. Brillinger, Analytiker Taschenbuch Band 5, S. 161, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York 1985). Unterschiedliche Beleuchtungsverhältnisse, störende Eigenfarben der Proben, unterschiedlich genaues Einhalten der Ablesezeiten und individuell unterschiedliches Farbunterscheidungsvermögen ergeben weitere Fehlermöglichkeiten, die einem zuverlässigen Schnelltest im Wege stehen.

Objektiver ist zwar eine Auswertung über ein entsprechendes Reflexionsphotometer, bringt aber wegen der individuell stets möglichen Beeinflussung der Probennahme und Handhabung nicht entscheidend genauere Ergebnisse. Wenn die Teststreifen zu lange eingetaucht werden, verlieren sie ihre speziellen analytselektiven Reagenzien in die Probe und liefern falsche Ergebnisse. Ist die Rundung des Becherglasrandes zur Abstreifung zu stark, bleibt auch mehr Probe auf dem Teststreifen als einkalibiert wurde. Ebenso kann ein einfaches Abwischen mit anderen Hilfsmitteln schlecht standardisiert werden. Teststreifen für eine instrumentelle Auswertung haben ein Testfeld mehr als die, die visuell abgelesen werden. Das sog. Kompensationsfeld ist reagenzienfrei und besteht aus einem speziellen weißen Papier. Es wird durch eine mögliche Eigenfarbe der Probe entsprechend angefärbt. Bevor das optische System die einzelnen Testfelder auswertet, mißt es die Reflexionswerte dieses Kompensationsfeldes und speichert einen Referenzwert, um damit die Eigenfärbung automatisch zu kompensieren.

Das weitverbreiteste Beispiel für diese Analysentechnik ist die Messung des Blutzucker-Gehaltes. Hier wird ein Tropfen Kapillarblut (aus einer kleinen Wunde) auf die Oberfläche des Teststreifens aufgebracht. Das Vollblut wird auf dem mehrlagigen Teststreifen filtiert, von den roten Blutbestandteilen getrennt und dann räumlich getrennt der Analyt Glucose mit immobilisierter Glucoseoxidase katalytisch zu Gluconsäure und Wasserstoffperoxid umgesetzt. Hochmolekulare und zelluläre Bestandteile bleiben zurück und werden nach Ablauf der Einwirkzeit (1-2 min) vom Testfeld abgewischt. Das gebildete Wasserstoffperoxid ist proportional der Glucosekonzentration und wird optisch dadurch angezeigt, daß es das Oxidationsmittel für eine Reaktion zwischen zwei organischen Molekülen darstellt, die dann eine proportionale Menge eines grünblau gefärbten Azofarbstoffes bilden. Hierbei geschieht der Probentransport im Unterschied zu den obigen Verfahren mittels der Kapillarwirkung der Trägermaterialien. Im Prinzip ist dadurch die Messung des Blutzuckergehaltes so einfach wie eine pH-Wert-Messung mittels eines Indikatorpapieres geworden, so daß auch Laien, also der Patient mit Diabetis, eine Selbstkontrolle durchführen kann.

Alle Teststreifen, -stäbchen oder röhrchen, die eine Vielzahl von für die Umwelt oder Klinik wichtige Analyte auf Basis diese sog. Trockenchemie ohne erneute Kalibrierung erfassen, leiden aber unter noch weiteren entscheidenden Nachteilen:

Im Prinzip verläuft die Stofferkennung durch eine geeignete, gut wahrnehmbare Markierung des Analyten durch geeignete Hilfsmittel (Reagenzien). In den meisten Fällen werden bei einer quantitativen, instrumentell-analytischen Methode in der Regel analytkonzentrations-abhängige Farb-Intensitäts-Signale mit Hilfe verschiedenster physikalisch-chemischer Wechselwirkungen ausgemessen. Auch bei der Entstehung von Mischfarben spielen die unterschiedlichen Intensitäten der Grundfarben eine entscheidende Rolle. Nachteilig bei allen Stoffkonzentrationsbestimmungen, die über die Messung einer bestimmten Signal-Intensität verläuft, sind die verschiedensten Störungen, die damit einhergehen. Unabhängig von der Art des eigentlichen Meßsignals (Intensität von elektromagnetischer Strahlung, elektrischer Potentiale/Ströme/Leitfähigkeit, magnetischer oder elektrischer Felder, usw.) führen Veränderungen der Anregungs- und Ausgangssignalstärke und/oder probenmatrix­ bedingte Störfaktoren bei der analytspezifischen Wechselwirkung mit diesen Anregungsenergien zu Fehlmessungen. Auch muß i. d. R. die Probe in ein entsprechendes Meßgerät gebracht werden, in dem diese Messungen, der analytspezifischen energetischen Wechselwirkungen, durchgeführt werden.

Das Photometer kann z. B. Instabilitäten in der Anregungs-Lichtquelle zeigen. Die Intensität des reflektierten Lichtes hängt natürlich von der Intensität des eingestrahlten Lichtes ab, daher muß bei quantitativen Auswertungen auf dieses bezogen werden. Die auszuwertende Verfärbung oder Farbintensität kann z. B. durch die Matrix der Probe ähnlich negativ beeinflußt werden, wodurch die Steigung einer Kalibrationsgeraden variiert wird und die Methode der Standardaddition angewandt werden muß. Die Reflexionsphotometer zur Auswertung bestimmter Teststreifen arbeiten üblicherweise bei einer feststehenden Wellenlänge, um sie kompakt und damit tragbar zu machen. Damit ist allerdings ihr Einsatzbereich nur auf diesen Spektralbereich begrenzt. Sie können die Vielfalt der bekannten Reagenzien nicht ausnutzen und sind für unterschiedliche Indikatoren nicht geeignet.

Aus Gründen erhöhter Selektivität können die trockenchemischen Teststreifen im allgemeinen neben dem eingeschränkt selektiven Reagenz noch weitere Zusatz- und/oder Hilfsstoffe (z. B. Puffer, Maskierungsreagenzien, Stabilisatoren, etc.) enthalten, die Querstörungen durch andere Stoffe in der Probenmatrix ausschalten und die Anfärbung stabilisieren sollen. Allen gemeinsam ist aber, daß die Konzentrationsbestimmung (quantitative Analyse) über eine farbliche (wellenlängen­ mäßige) oder farbintensitätsmäßige Bewertung erfolgt. Will man unterschiedliche Farben (z. B. bei Multi-Analyt-Messungen) vermessen, dann ist ein solches Gerät sehr kompliziert und muß einen Monochromator enthalten. Wegen dieses auch teueren Aufwandes gibt es kaum Meßgeräte, die die unterschiedlichen Farben der unterschiedlichsten Teststreifen objektiv vermessen können. Dies erschwert die genaue quantitative Vor-Ort-Analyse mittels Teststreifen oder -stäbchen erheblich.

Man hat es hier natürlich mit einem hundertprozentigen Relativ-Verfahren zu tun, das erfahrungsgemäß sehr matrixanfällig ist. Alles, was die auszuwertenden Farben beeinflußt, wie z. B. farbige Proben, Suspensionen, zusätzliche, absorbierende Schichten (z. B. Niederschläge, Eiweiß bei biologischen Proben, etc.), die bei der chargenweisen Kalibrierung des Herstellers nicht berücksichtigt wurden, führt zu Fehlmessungen.

Bei allen Schnell-Tests auf Basis der Trockenchemie geschieht der Probentransport nur über minimale Strecken, die durch Diffusion und/oder Kapillarkräfte überwunden werden. Es besteht hier keine Möglichkeit, frei wählbare analytisch-chemische Unit- Operations (Probennahme, Probenvorbereitung, extrahieren, ausfällen, ausgasen, filtrieren, oxidieren, reduzieren, neutralisieren, buffern, etc.), beliebig und anwendungsorientiert zu kombinieren.

Der Erfindung lag demnach folgende Aufgabe zugrunde: Die Unsicherheiten und Ungenauigkeiten der auf der Trockenchemie basierenden Teststreifen sollten beseitigt werden, ohne dabei den Verbrauch an Reagenzien oder die Einfachheit des Verfahrens entscheidend ändern zu müssen. Ferner sollten beliebige Unit-Operations system­ mäßig einfach kombinierbar sein. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß die Einfachheit einer chemischen Analyse mittels eines Teststreifens, -stäbchens oder -röhrchens mit der Genauigkeit der Maßanalyse kombiniert wird. Dies führt zu einem kalibrationsfreien und hochgenauen Verfahren, zu einer sog. Absolutbestimmungsmethode ohne daß der Chemikalien-Abfall, verglichen zur Trockenchemie, wesentlich ansteigt.

Dazu wird erfindungsgemäß zunächst die Probennahme-Genauigkeit entscheidend dadurch verbessert, daß in einem separaten Probennahme-Modul eine oder mehrere Mikro- oder Mikro-Kapillar-Pipetten mit hochgenauem Volumen, die inzwischen preiswert herstellbar sind, verwendet werden. Desweiteren wird der Analyt in diesen genau bekannten Proben-Aliquoten mit oder ohne zusätzliche selektivitätserhöhenden Schritte in weiteren Funktions-Modulen maßanalytisch quantifiziert, wobei keine Farbintensitäten genau festgestellt werden müssen, sondern nur ein klar ausgeprägter Farbumschlag eines geeignet gewählten Indikators. Dies wird erfindungsgemäß mittels des Titrations-Moduls in einem oder mehreren Mikro-Reaktionsräumen oder Mikro- Reaktoren mit Hilfe eines dort vorgelegten, maßanalytischen Standardreagenzes (Maßlösung oder Titrator) unterschiedlicher Konzentration (Mikro-Reaktor-Titer) quasi simultan durchgeführt. Dazu wird das betreffende Titrationsmittel (Standardreagenz, Maßlösung) in genau abgemessenen, stöchiometrischen Mikro- oder Nano- Äquivalenten in geeignet geformte isolierte Mikro-Containments oder Mikro-Reaktoren oder in miteinander verbundenen Mikro-Reaktionsräumen zusammen mit einem geeigneten optischen Äquivalentprodukt-Indikator immobilisiert. Wenn jeder dieser Mikroreaktoren (als Titrationsvolumen) mit der gasförmigen oder flüssigen Probe beispielsweise über eine Mikro-Kapillar-Pipette im darüber befindlichen Probennahme- Modul in Verbindung steht, genügt ein kurzes, zeitlich unkritisches Eintauchen in die flüssige oder gasförmige Probe, damit ein genau definiertes und bekanntes Proben- Aliquot durch Kapillarkräfte, Diffusion, Schwerkraft, Zentrifugalkraft, Druckunterschiede oder mittels einer Transportlösung (A11), in den Mikroreaktor gelangt, wo er mit einer genau bekannten Menge des Titrators reagiert.

Als selektivitätssteigernde Analyt-Erkennungsreak­ tionen können biochemische Reaktionen, welche nach dem Schlüssel-Schloß-Prinzip ablaufen (z. B. enzyma­ tisch oder immunologisch mit Redox-Derivaten, ELISA- verfahrensanalog oder amplifiierend z. B. durch Sub­ strat-Zyklisierung oder mittels PCR-Technik) der maßanalytischen Quantifizierung vorgeschaltet wer­ den. Es wird dabei ein stöchiometrisch freigesetz­ ter, analyt-äquivalenter, d. h. mengenmäßig streng proportionaler, weiterer Stoff nach dem erfindungs­ gemäßen Verfahren bestimmt, was bei den beiden erst­ genannten biochemischen Reaktionsarten einen 100%igen Stoff-Umsatz des Analyten erfordert. (A2)

Erfindungsgemäß ist es äußerst wichtig, daß die Probennahme-Pipetten im Probennahme-Modul auf der Seite der Mikro-Titrationsräume während der Probennahme (Kontakt mit der Probe) verschlossen sind, weil nur so eine hochgenaue Dosierung möglich ist. Dies wird erfindungsgemäß im einfachsten Fall durch sich selbst auflösende Membranen bewerkstelligt, aber auch mikromechanische Ventile oder Lösungen mittels Schutzmembranen für die maßanalytischen Reagenzien, die mittels Dorn gezielt geöffnet werden können, sind möglich (s. Abb. 1). Bevorzugt werden die Probennahme-Volumina parallel gezogen. (A7)

Die einzelnen Module der Gesamtvorrichtung können auf recyclefähigen Materialien wie Kunststoffen (Plexiglas, Polypropylen, PET, Polycarbonat, PE oder andere präzise herstellbare und bearbeitbare Sor­ ten), Silizium, Keramik (Green-Tape-Technik), Papier oder papierähnlichen Materialien basieren. Es ist möglich, die die Module als planare Vorrichtungen auf einem flexiblen Substrat (Kunststoff-Folie, Pa­ pier) aufzubringen, welches beispielsweise aufge­ rollt und mit der Probe in Kontakt gebracht wird und zum Ablesen der betreffenden Analytkonzentration ausgerollt wird. Die flexiblen Substrate lassen sich mittels Dickfiltechnik über reproduzierbare Sieb­ drucke strukturieren. Die Titrationsräume (Reak­ tionsbereiche) beispielsweise können durch Ringe oder Kanäle aus einem flüssigkeitsundurchlässigen Material gestaltet werden, welchem mit dem Titrator mittels Imprägnierung, Mehrfachdruck oder auch mit­ tels automatisch arbeitender Dispenser gefüllt wer­ den. (A10, A24, A25)

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Mikrosystems ist, daß durch Kombination bestimmter, aufeinander konstruktionsmäßig hochgenau abgestimmter Module beliebig komplexe Schnell-Test-Anordnungen zusammengestellt werden können. Als Module kommen u. a. in Betracht: Probennahme-Modul mit einer oder mehreren Mikropipetten gleichen oder variierbaren Inhalts, Probenvorbereitungs-Modul in denen selektivitäts- und empfindlichkeitssteigernde Maßnahmen (u. a. auch Amplifikationen mittels der PCR-Methode) durchgeführt werden können. Bio-Reaktor Module, Oxidations-Module, Reduktions-Module, allgemeine Module zur Durchführung von chemischen Reaktionen, Trenn-Module mit Filtern oder gasdurchlässigen Membranen, Titrations-Module der unterschiedlichen Versionen (kontinuierlich oder diskontinuierlich), usw.. Die einzelnen Module passen konstruktionsmäßig genau übereinander und sind beliebig kombinierbar, wobei erfindungsgemäß eingeplante Verschiebungen untereinander Kanäle öffnen und schließen lassen (s. Abb. 2). Dabei können die einzelnen Module in direktem Kontakt (planare Oberflächen) stehen; es können aber auch dünne Spacer (z. B. aus Teflon o. ä.) als Dichtung dazwischen gelegt werden, wodurch bei entsprechenden Aussparungen auch weitere Verbindungskanäle zwischen den Modulen ermöglicht werden. Der Transport der Proben-Aliquoten erfolgt von den Pipetten im Probenahme-Modul durch die Analyt-Erken­ nungs- oder Amplifikationssäulen im Vorbereitungs- Modul oder direkt in die jeweiligen Mikro-Titra­ tionsräume im Titrations-Modul bevorzugt im Mikro- oder Millimetermaßstab und bevorzugt auf kürzestem Wege mittels vorbereiteter, paßgenauer Mikro-Kanäle in den Modulen. (A11)

Die einzelnen Funktions-Module des erfindungsgemäßen mikrochemischen Analysen- Systems lassen sich geeignet zusammenfügen, aber auch getrennt verwenden. Module, in denen kein chemischer Umsatz mit dort immobilisierten aber inzwischen verbrauchten Reagenzien stattfindet, können nach Durchspülen von wenigen mL Reinigungsmittel (meist Wasser) auch wiederverwendet werden. Wegen der großen Variationsbreite der zusammenstellbaren maßanalytischen Analyseverfahren können die einzelnen Module in großen Stückzahlen preiswert produziert werden.

Die einzelnen Probenahmevorrichtungen des Probenah­ me-Moduls sind bevorzugt als in Matrixform angeord­ nete Hohlräume, beispielsweise als röhrenförmige Vertiefungen mit Abmessungen im Miko- oder Millime­ terbereich, in einem Material mit hydrophoben Ober­ flächen ausgebildet. Die hydrophoben Oberflächen ge­ währleisten eine präzise Probennahme, da überschüs­ sige Probemengen nach dem Befüllen der Probenahme­ vorrichtungen nicht im Bereich der Öffnungen haften bleiben. Die Probenahmevorrichtungen sind bevorzugt zum Zwecke einer hochgenauen Dosierung an dem der Probe abgewandten Ende während der Probenahme ver­ schlossen und außerdem an dem der Probe zugewandten Ende verschließbar. Die Verschließbarkeit kann mit­ tels mikromechanischer Ventile oder durch Verschie­ ben einer entsprechende Öffnungen aufweisenden Deck­ schichtlamelle gewährleistet werden. Durch Ventile läßt sich die Kontaktzeit, d. h. die Zeit der Diffu­ sion des Analyten durch Reagenzschichten der Test­ anordnung, genau einstellen. Statt der Ventile las­ sen sich an dem der Probe abgewandten Ende auch durchstoßbare, quellbare oder sich selbst auflösende Membranen einsetzen. Sich selbst auflösende Membra­ nen können aus nicht störenden Verbindungen wie Dex­ trin, Zucker oder Salz bestehen. (A12, A13, A14, A28, A29)

Falls dazu als Probenahme-Modul ein Array von Mikro-Reaktoren mittels einer einheitlichen, selektiven maßanalytischen Reaktion aber mit unterschiedlichen Mengen des Titrators (Reagenz, das mit dem Analyten selektiv reagiert) versehen, verwendet wird, sind bei Verwendung der üblichen Äquivalenzpunkts-Indikatoren (s. V. Schmidt, W. D. Mayer, Analytiker-Taschenbuch Band 2, S. 207, Springer-Verlag, Berlin- Heidelberg-New York 1981 und Band 3, S. 37, 1983) alle Mikro-Reaktoren im sog. Titrations-Modul, bei denen der Analyt in einem stöchiometrischen Unterschuß vorhanden ist, anders gefärbt, als jene, bei denen der Titrator stöchiometrisch im Unterschuß vorliegt. Bevorzugt wird eine Reihe von Reaktionen simultan in unterschiedlichen Reaktionsräumen durchgeführt. (A6) Da durch Verwendung von Kapillar- oder Mikropipetten die Probenmenge bekannt ist, ebenso die unterschiedlichen Äquivalenzmengen des Titrators in den einzelnen Mikro-Reaktoren oder Kanalstrecke, liegt die Analytkonzentration konzentrationmäßig genau zwischen den Mikroreaktoren, zwischen denen der Indikator umschlägt. Durch die moderne Technologie der photolithographischen Verfahren der Mikrosystemtechnik sind sowohl genaueste Mikropipetten wie auch Mikroreaktoren mit genau kontrolliertem Volumen einfach und preiswert herstellbar.

Die aktuell in der Probe vorliegende chemische Äqui­ valenz-Menge des Analyten in absoluten Mol-Einheiten ist einfach und genau, entsprechend der gewählten Graduierung des Titrators, ablesbar. (A1)

Da es sich hier wegen der Verwendung stabiler maßanalytischer Reagenzien um eine Absolutmethode handelt, kann bei konstanter und bekannter Proben-Aliquotisierung jedem Mikroreaktor oder jedem Streckenpunkt eines Mikroreaktions-Kanals ein Analytkonzentrationswert in beliebigen Einheiten (Mol/L, g/L, %, ppm, mg/dl etc.) zugeordnet werden. Erfindungsgemäß werden die Mikroreaktoren in einer geeigneten logisch durchschaubaren Anordnung mittels der modernen Methoden der Mikrosystemtechnik unter Einhaltung einer hoher Abmessungsgenauigkeit hergestellt.

Zusätzlich zu der Gesamtsumme der bisher bekannten maßanalytisch erfaßbaren Stoffe können durch die erfindungsgemäße Äquivalenzpunktfeststellunge mittel Mikro-Reaktoren oder -Kanäle über Neutralisations-, Fällungs- oder Assoziations-(Antigen-Antikörper-Prä­ zipitation), Komplexbildungs- oder Redox-Reaktionen auch alle die flüssigen oder gasförmigen Analyte kalibrationsfrei bestimmt werden, für die eine tra­ ditionelle selektive, konzentrationsproportionale Indizierung oder Quantifizierung in Form bekannter Schnell-Test-Kits oder im Rahmen klassischer Test- Stäbchen (Trockenchemie) bzw. Gasprüfröhrchen be­ reits bekannt ist. (A22)

Geeignete Herstellungsverfahren für die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens sind vor allem alle photolithographischen Produktionsverfahren, bei denen die Größe der Mikro-Pipette und/oder des Mikro-Reaktors genau vorgegeben werden kann, bzw. auch graduell unterschiedliche Abmessungen im Promille-Bereich leicht herstellbar sind. Hierzu zählt erfindungsgemäß die bekannte Silizium-Technik, die durch die verschiedensten, dem Fachmann bekannten Prozesse, Mikro-Reaktoren beliebiger, aber genau kontrollierter Volumina auch in großen Massen mit den geringsten Streuungen herstellen kann. Das gleiche gilt für die LIGA-Technik, die nicht auf Silizium beschränkt ist, sondern auch preiswerte Spritzgußlösungen in Kunststoff ermöglicht. Bei Dosiergenauigkeiten im Prozent-Bereich kann dazu die sog. Dickfilmtechnik, die auf einer Siebdruckbasis aufbaut, verwendet werden.

Erfindungsgemäß läßt sich der Meßbereich einer solchen Test- und Analysevorrichtung dadurch festlegen, daß im Titrations-Modul entweder eine Reihe graduell unterschiedlich großer Mikro-Reaktoren mit genau bekanntem Volumen hergestellt werden, die dann herstellermäßig mit einer einheitlichen Konzentration des Titrators gefüllt werden oder Mikro-Reaktoren einheitlicher und bekannter Größe (Füll- Volumen) werden mit unterschiedlich konzentrierten aber bekannten Titrator-Füllungen versehen (was herstellungsmäßig aufwendiger ist) oder Kombinationen von beiden.

Da die erfindungsgemäßen Technologien der Mikrosystemtechnik Mikro-Reaktoren einheitlicher Form aber unterschiedlichem Inhalts in einem Arbeitsschritt herstellen können, sind diese Herstellungsmethoden (Silicium- und LIGA-_Technologie) besonders vorteilhaft, weil dann der Füllprozeß mit dem Titrator mit einer einzigen, geeigneten Reagenzien-Mischung (Titrator, Hilfsreagenzien, Indikator(en) und Stabilisatoren) erfolgen kann. Bei der erfindungsgemäßen Version, die auf dem Ausmessen einer Strecke in einem Mikroreaktions-Kanal beruht, können natürlich die Abmessungen des Kanals in Laufrichtung auch variiert werden, was zu besonders großen Erfassungsbereichen führt.

Wird konstruktionsmäßig dafür Sorge getragen, daß das Proben-Aliquot im Mikroreaktions-Kanal in zwei Vorzugsrichtungen diffundieren kann (kontinuierliches Titrations-Modul), so ergeben sich besonders vorteilhafte Lösungen für eine Multi- Analyt-Anordnung. In diesem Fall können mehrere unterschiedliche maßanalytische Lineartitrations-Vorlagen für unterschiedliche Analyte beispielsweise in einer Reihe teststreifenähnlich untergebracht werden.

Erfindungsgemäß ist aber auch ein umgekehrtes Vorgehen möglich, d. h. der Titer einer Mikro-Reaktionskammer (Mikro-Reaktoren gefüllt mit konstant gehaltenen Mikro- Äquivalenten) im Titrations-Modul wird konstant gehalten und die Größe der getesteten Probe wird im Probennahme-Modul entsprechend graduell in bekannten Volumenschritten variiert, was dem maßanalytischen Äquivalent einer Titration einer bekannten Menge "vorgelegter" Standardlösung mit der Probelösung entspricht. Am Endpunkt, d. h. beim Umschlagpunkt des geeignet gewählten Indikators liegen chemisch äquivalente Mengen von Analyt und maßanalytisches Reagenz vor, die eine Absolutbestimmung erlauben.

Der große und entscheidende Vorteil der neuen erfindungsgemäßen Klasse von Analysentechniken liegt darin, daß Meßsignal-Beeinflussungen durch Intensitätsbeeinflussungen anderer Art (matrixbedingte Signalbeeinflussungen etc.), die üblicherweise die Konzentrationsinformation: Signalintensität verfälschen, hier unerheblich sind. Üblicherweise erfolgt der deutlich sichtbare Umschlag des jeweils verwendeten Indikators genau zwischen zwei Mikroreaktoren, deren Äquivalenzkonzentration genaustens bekannt ist. Der Gehalt der Probe an Analyten muß also genau dazwischen liegen, was man durch eine entsprechende, unveränderlich dort angebrachte Skalierung (Mittelwert von beiden) auch vereinfachen kann.

Vorteilhaft ist auch, die Mikro-Reaktoren im Titrations-Modul in einer Reihe zu- oder abnehmender Füllvolumina bzw. Mikro-Äquivalente anzuordnen, weil dann bei einem gleichbleibenden Abstand zwischen zwei benachbarten Mikro-Reaktoren die Auswertung übersichtlicher wird und auf das Ablesen einer Strecke oder einer daneben aufgedruckten Skala hinausläuft.

Erfindungsgemäß ist es unerheblich, ob die einzelnen Mikro-Reaktoren sich berühren oder nicht; eine kontinuierliche Volumenvergrößerung von grabenartigen Hohlräumen genauester Abmessungen gestattet so u. U. genauere Ablesungen. Die geometrische Form dieser Mikro-Gräben ist dabei unerheblich. So kann man bei einer linearen Form beispielsweise thermometer-ähnliche Vorrichtungen erhalten; bei einer kreisförmigen Anordnung eher uhr-ähnliche. Die Grabendimensionen liegen eher im Mikrometer- denn im Millimeterbereich.

Erfindungsgemäß liegt ein echtes modulares Mikrosystem vor, das entsprechend miniaturisiert ist und auch in die Bereiche der Ultra-Mikro-Analyse eindringen kann. Bei chemischen Umsetzungen im Mikroliter und Nanogramm Maßstab werden, verglichen mit der gängigen Laborpraxis, Chemikalien um den Faktor ca. 1 Million eingespart, entsprechend gering ist auch die Abfallbelastung. Wegen des Fortfalls gründlicher Gefäßreinigungs-Schritte werden auch weniger Spülmittel pro Analyse verbraucht.

Bei einer extremen Miniaturisierung des Mikrosystems erreicht man eine Grenze der Ablesbarkeit mit dem bloßen Auge. Hier wird erfindungsgemäß ein einfaches Auswertgerät benutzt, daß den Titrations-Modul stark vergrößert darstellen kann. Eine vorteilhafte Anordnung entsteht dadurch, daß man eine stark vergrößernde Projektion, ähnlich einem Hand-Dia-Betrachter, durchführt. Da es nur auf die Stelle und/oder Position des Indikator-Umschlages ankommt, können dazu auch einfache, mit Tageslicht arbeitende Vorrichtungen verwendet werden.

Es können sämtliche bekannten Testvorrichtungen der Trockenchemie auch in der erfindungsgemäßen Version einer Art absolut messenden, linearen Titration (Vorrichtung) umgewandelt werden. Dazu muß nur der Analyt durch steigende und äquivalente Mengen eines Reagenzes gebunden oder aus dem Lösungsgleichgewicht entfernt werden, was die Farbreaktion mit dem jeweiligen Anfärbe-Cocktail verhindert. So lassen sich beispielsweise Metallkationen bei einem geeigneten pH-Wert (immobilisierter Puffer) durch das bekannte Reagenz Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) so stark komplexieren, daß der betreffende selektive Anfärbe-Cocktail der Trockenchemie keine Anzeige erbringt. Erst nach Überschreiten einer der Analytkonzentration in der Probe entsprechenden Mikro-Äquivalenz-Menge liegt das Metallkation wieder frei im Lösungsgleichgewicht vor und ab diesem Mikroreaktor sind alle weiteren mit geringeren Äquivalenzmengen an Komplex-Standardmittel in Sinne der Trockenchemie unterschiedlich stark angefärbt. Letzteres läßt sich gegebenenfalls bei einer reflexionsphotometrischen Auswertung auch zu einer Extrapolationsmethode zur genauen Endpunktsermittlung ausnutzen.

Die Übertragung der vorliegenden Erfindung des kontrollierten Immobilisierens maßanalytischer Reagenzien auf die klassische Trockenchemie der Teststreifen erlaubt dort eine neue Art von Auswertung durchzuführen. Durch die Immobilisierung von Analyt-Abfang-Reagenzien lassen sich Analysen gemäß der bekannten Methode der Standard-Subtraktion durchführen; während die Immobilisierung des Analyten selbst zu der Methode der Standard-Addition führt. Beide Auswertmethoden haben sich in der instrumentellen Analytik im Spurenbereich und beim Vorliegen komplexer Matrices bestens bewährt, weil sie die Möglichkeit systematischer Fehler stark einengen.

Es lassen sich bestimmte Anionen dadurch quantitativ erfassen, daß in den Mikro- Reaktoren unterschiedliche, aber genau bekannte Metallkationen-Mengen, die mit dem Anion einen schwerlöslichen Niederschlag bilden, mit dem zugehörigen Anfärbereagenzien eingebracht werden.

Die neuen, verschiedenen, erfindungsgemäßen Analysentechniken kann man als pseudo-eindimensional bezeichnen, da die immobilisierten Moleküle des selektiven Analytabfängers und des Analyt-Anzeigers zwar einen dreidimensionalen Raum einnehmen, aber nur die Ausdehnung einer Dimension (= markierte Strecke) oder die Lokalisation der der Analytkonzentration entsprechenden Äquivalenzmenge an Titrator meßtechnisch ausgewertet wird, was beispielsweise über eine dort angebrachte Skala analog der Ablesung einer Quecksilbersäule in einem Thermometer oder Barometer oder einer Uhr bei kreisförmiger Anordnung geschehen kann.

Einen besonders großen dynamischen Meßbereich erhält man, wenn man die mögliche Genauigkeit der Maßanalyse voll ausnutzt und um die 1000 Mikro-Reaktoren mit den dazugehörigen Mikro-Pipetten in einer zweidimensionierten, planaren Anordnung (z. B. in 30 Reihen und 30 Spalten im Scheckkartenformat) unterbringt. Hier kann die maßanalytische Reagenzpositionierung und damit Graduierung auch so verlaufen, daß beispielsweise waagerecht größere Konzentrationssprünge zwischen den einzelnen Mikroreaktoren vorliegen und die in vertikaler Anordnung befindlichen diese größeren Sprünge in kleinerem Sprüngen unterteilen. Dies ist natürlich auch in beliebigen anderen geometrischen Formgebungen möglich, so z. B. auch radial, sternförmig. Die Mikrosystemtechnologie erlaubt beispielsweise hier auch dreidimensionale Gebilde, z. B. Würfel mit jeweils zweidimensionaler Anordnung der betreffenden Mikro- Reaktoren-Arrays. Hierdurch lassen sich durch die 6 Seiten eines Würfels im Prinzip auch leicht 6 Konzentrationsdekaden eines Analyten überstreichen. Herstellungsseitig wird man bei gleichbleibender Volumengraduierung der Mikro-Reaktoren pro Würfelseite hier vorteilhafterweise pro Seite die Konzentration der maßanalytischen Füll-Lösung entsprechend dem gewünschten dynamischen Meßbereich verändern. Bei Anwendungen dieser neuen Mikrotitrationsmethode in Fällen, wo der zu erwartende Konzentrationbereich des Analyten nur in bestimmten Grenzen variiert, wie beispielsweise in der klinischen Analytik, kann man natürlich die Anzahl der Mikro- Reaktoren entsprechend der gewünschten Ablesegenauigkeit wählen und so z. B. mit weit weniger als 100 Mikroreaktoren, die bezüglich der dort immobilisierten Mikro- Äquivalente dem erwarteten Bereich entsprechen, auskommen. Dies entspricht einer Lokalisationsgenauigkeit im festgelegten Bereich von 1%.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt, wie oben gezeigt, auch die quantitative Bestimmung mehrerer Analyte. Bei Multi-Analyt-Anordnungen bestimmen die bekannten analyterkennenden Reagenzien oder -gemische (s. Trockenchemie) die Selektivität und ihre Anordnung auf oder in dem Träger eine Reihenfolge der Streifenposition auf dem Träger, die aussagt, um welchen Analyten es sich handelt und die jeweilige gefärbte oder ungefärbte Strecke oder die Position (digital) sagt aus, welche Konzentration des betreffenden Stoffes aktuell in der Probe vorliegt. Auch hier sind erfindungsgemäß lineare, planare und dreidimensionale Anordnungen von Mikro- Reaktor-Arrays möglich.

Eine derartige Anordnung kann bei einer Markierung, die durch elektromagnetische Strahlung erfaßbar ist, vorteilhaft, schnell und sicher auch mittels eines geeigneten sog. Barcode-Lesers, der ja nur die unterschiedlich gefärbten Bereiche erfassen muß, automatisch in absoluten Konzentrationseinheiten vermessen werden. Hier zählt der Barcode-Leser eigentlich nur die Anzahl der Mikro-Reaktoren bis zum Äquivalenzpunkt- Reaktor ab, was auf eine absolute, digitale (Anfärbung oder Farbumschlag: ja oder nein) Analyse hinausläuft.

Dadurch, daß die absoluten Farbintensitäten der Indikatoren keine Rolle spielen, ist es auch egal, ob evtl. ein Mikroreaktor im Bereich vor oder nach dem Äquivalenzpunkt gestört ist oder nicht. Diese Bereiche der Mikro-Reaktoren stellen redundante Systeme dar. Dies erhöht die Meßsicherheit ebenfalls wesentlich, verglichen zu den traditionellen Teststreifen. Sogar gegenüber einer klassischen maßanalytischen Titration ergeben sich entscheidende Vorteile: Man kann nicht übertitrieren und man hat automatisch eine Endpunktsdokumentation. Ablese- und Übertragungsfehler können ebenfalls weniger auftreten und die Titration ist schneller und mit bedeutend weniger Reagenzien durchgeführt. Wenn erfindunggemäß die neue Vorrichtung zur Durchführung derartiger Titrationen preiswerter herstellbar ist als die Reagenzien für die Makro-Titration einschließlich ihrer Entsorgung kosten, dann wird die Mikrotitration die klassische verdrängen.

Erfindungsgemäß beinhaltet die vorliegende Umwandlung von konzentrationsabhängigen Meßsignal-Intensitätsmessungen in eine eindimensionale, skalierte Streckenmessung auch integrierte Trennoperationen. Für richtige quantitative Analysen komplexer Stoffgemische (z. B. realer Proben aus dem Umwelt-, Medizin-, Biochemie, Materialwissenschafts-, Produktionskontroll-Bereich) werden in der Regel mehr oder weniger aufwendige Analysenverfahren verwendet. Viele beruhen auf einer Kombination von komplizierten Trenn- und Bestimmungsmethoden.

Die hier beschriebene Erfindung löst generell all die dem Fachmann geläufigen Probleme, in dem prinzipiell die jeweiligen Analytkonzentrationen nicht über störanfällige Meß-Signal-Intensitäten sondern mit Hilfe einer vorzugsweise eindimensionalen geometrischen Ausdehnung oder Positionsbestimmung einer optisch erkennbaren Markierung auf einem Träger gemessen werden (Dimension des Meßwertes: eine Längeneinheit (oder skalierte Position) oder bei konstanter Relativbewegung zu einem Signal-Ausleser: eine Signaldauer = Zeiteinheit). Die optisch erkennbare Zone wird, wenn der Analyt keine spezifische, direkte, optische Wechselwirkung erlaubt, durch Reaktion des Analyten mit einem geeigneten, analyt­ spezifischen Nachweis-Reagenz (Indikator) auf einem Träger erzeugt, wobei der Träger dieses Reagenz immobilisiert enthält.

Die Analyse wird im Gegensatz zu den bekannten Teströhrchen für die Gasanalyse, vorzugsweise auf planar aufgebauten Trägern durchgeführt, die wie eine Scheckkarte oder ein Papier-Teststreifen aufgebaut sind und einen schichtenförmigen Aufbau, vorzugsweise eine laminatförmige Struktur haben; jedoch sind auch andere geometrische Formen (s. B. schalen- oder röhrenförmig, oder kreis-, spiral- oder kugel- bzw. würfelförmig) möglich. Ebenso ist es erfindungsgemäß unerheblich, ob auch andere geometrische Formen (wie Kreise, Punkte, Keile etc.) für die optische Abfrage (Meßsignal = Ausdehnung) benutzt werden. Gegenüber den bekannten Gas- Prüfröhrchen, die meistens auf einer durchsichtigen gefüllten Säule beruhen, die mit einem Trägermaterial gefüllt sind und auf dessen Oberflächen sich ein analytselektives Reagenz befindet, besitzt die erfindungsgemäße Vorrichtung lage- und positionsabhängig, extrem exakt dosierte Titratoren und/oder Analyt-Abfangreagenzien und eine integrierte Proben-Aliquotisierung durch die Mikro-Pipette, die erfindungsgemäß mit der Silizium- oder LIGA-Technologie zusammen und in einem einzigen Arbeitsschritt hergestellt werden. Die Dosierung und Positionierung des maßanalytischen Reagenzes ist bei der traditionellen Gasprüfröhrchen-Art (K. Leichnitz, Analytiker-Handbuch, Band 1, S. 205, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York 1980) nicht mit der Genauigkeit möglich, die die Mikrosystentechnik inzwischen bietet. Auch werden hier nicht immer stabile maßanalytische Reagenzien verwendet.

Die progressiv ansteigenden Ketten von Mikro-Reaktionsräumen lassen sich in den verschiedensten Technologien anfertigen. Bei einer Ausführungsvariante aus Papier beginnt der laminatförmige Aufbau beispielsweise mit einem empfindlichen und spezifischen Indikator, der bei Anfärbung generell die Anwesenheit des betreffenden Analyten anzeigt. Auf diesem Indikator-Papierstreifen werden in bestimmten Abständen steigende Mengen eines Abfangreagenzes, welches in der Makro-Labor- Titrationsversion dem Titrator (Titrationsmittel mit bekanntem Titer) enspricht, immobilisiert. Dies kann wiederum auf die unterschiedlichste Art und Weise geschehen. So kann man beispielsweise die Konzentrationen des selektiven Abfangreagenzes in einem trocknungsfähigen Gel sukzessive, von Mikro-Reaktionsraum zu Mikroreaktionsraum, erhöhen und die Begrenzungen dieser Räume durch eine der Siebdrucktechnik entlehenen Weise festlegen. Man kann bei dieser sog. Dickfilmtechnik aber auch steigende Mengen der zu immobilisierenden Komponente durch einen mehrfachen Druckvorgang aufbringen. Als Abschluß wird eine durchsichtige Lage eines auch abdichtenden Stoffes über die Reihe der Mikro- Titrations-Räume gelegt. Dies kann beispielsweise auch durch einen kompletten Einschluß des so vorbereiteten Teststreifens in eine wärmepolymersierbare Folie (Prinzip der ID-Karten oder Ausweise) geschehen.

Eine weitere Variante dieser seriellen Mikro-Titrationsart besteht erfindungsgemäß nur aus einer gleichbleibenden Immobilisierungsdichte des analyt-spezifischen Reagenzes (Titrator) über die gesamte ausgedehntere Analyt-Indikator-Zone. Bei einer kontrollierten Schichtdicke und einem diffusionskontrollierten Eindringen des Analyten durch gegebene Öffnungen in der äußeren Abdeckfolie bewegt sich die Probenlösung aufgrund von Kapillarkräften in dieser Schicht des immobilisierten Anfangreagenzes und wird dabei sukzessive titriert (genauer: rücktitriert, da zunächst der Überschuß des Titrators durch die eindiffundierende Analytmenge beseitigt werden muß), wobei dann die Strecke des Analyt-Überschusses wegen des Indikators eine Anfärbung zeigt.

Eine andere Technologie kann beispielsweise auf der LIGA oder Silizium-Technologie beruhen. Mittels beider Technologien lassen sich Mikro-Reaktionsräume Mikro- Reaktoren mit höchster geometrischer Genauigkeit und Reproduzierbarkeit in beliebigen Anordnungen herstellen. Bei der Vorgabe exakter Reaktionsvolumina kann man beispielsweise als Alternative zu variierenden Immobilisierungsdichten die Abmessungen der Mikro-Reaktoren progressiv vergrößern, was bei einer gleichbleibenden Fülldichte mit dem analyt-spezifischen Abfangreagenz (Titrator) zu steigenden dort immobilisierten Mengen führt. Die eigentliche Form dieser Mikro- Reaktoren ist unwichtig, solange das Eindiffundieren der Probe nicht zu stark beeinflußt wird. So können es beispielsweise rechteckige, runde oder kugelförmige Vertiefungen (Mikro-Kavities) in Kunststoffen (z. B. Plexiglas, PET, PE etc.) sein, die besonders vorteilhaft mit der LIGA-Technik (H. Lehr, W. Ehrfeld, J. Phys. IV (1994), 4 (C9/229)) produziert werden; es können aber auch sog. Containments sein, die üblicherweise als Hohlräume in Silizium geätzt worden sind. Vorteilhafte Ausführungsformen sind natürlich in linearer Anordnung dieser progressiv reagierender Mikro-Reaktoren aufgebaut, was die Ablesung analog einem LED-Array sehr erleichtert.

Wenn erfindungsgemäß die Ermittlung von Stoffkonzentrationen nicht über die Intensitäten sondern über eine Streckenmessung erfolgt, dann ist, wie oben bereits erwähnt, die Farbe und die intensitätsmäßige Konstanz dieser spezifisch angefärbten Zone unerheblich; die Farbintensität bestimmt eigentlich nur die Empfindlichkeit, mit der Anfang und Ende der Meßstrecke erkannt werden können. Schwankungen in der Beleuchtung (Lichtquelle), die zur Abmessung der optisch markierten Strecke verwendet wird, sind im Gegensatz zu den bekannten optischen Auswertemethoden hier ohne größeren Einfluß auf das Ergebnis der Messung (Meßwert = Strecke).

Die Erfindung betrifft also ganz allgemein insbesonders die Umsetzung einer analytkonzentrations-abhängigen Lichtintensitäts-Messung (Photometrie: Absorption oder Reflexion; Fluorimetrie) in die einer Ausdehnungsmessung. Barcode-ähnliche Anordnungen erlauben dann einfache und schnelle Simultan-Messungen der unterschiedlichsten Analyte, wobei alle bekannten optischen Anzeigeverfahren der betreffenden Chemo- und Biosensoren vom Fachmann erfindungsgemäß umgesetzt werden können. Die Position des optisch markierten Streifens bestimmt die Stoffart (qualitative Analyse) und die angefärbte oder nicht angefärbte Strecke ist konzentrationsproportional (quantitative Analyse). Erfindungsgemäß ist die Ablesung der maßanalytischen Äquivalenz-Konzentration nicht nur auf den sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums begrenzt. So können bei der Verwendung von fluoreszierenden Indikatoren im Bereich 800-1100 nm implantierbare, von außen ablesbare, medizinische Test-Vorrrichtun­ gen realisiert werden. (A5) Erfindungsgemäß können auch weitere Äquivalenz- (Endpunkt) Bestimmungsmethoden verwendet werden. So läßt sich beispielsweise dies elektrochemisch mittels eines einzeladressierbaren Elektroden- Arrays, das einer planaren Mikro-Reaktor-Anordnung in Berührung gebracht wird, durchführen.

Die vorliegende Erfindung kann mit oder ohne eine integrierte Trennungsoperation wie gas-flüssig oder flüssig-fest Trennungen über Membranen oder Filter, chromatographischer Art (z. B. GC, LC, IC, RP-LC, Gel-, Papier-, Dünnschicht-, Af­ finitätschromatographie) oder Extraktionen, Gaswä­ sche, trägergebundener elektrophoretischer Verfahren usw. (A3) umgesetzt werden.

Dort weiß der Fachmann, daß u. U. auch die Ausdehnung eines Substanzflecks als ungefähres Maß für die vorliegende Menge (Konzentration) herangezogen werden kann. Um diese Chromatographie-Arten allerdings durch einen einfachen Barcode-Leser (Ja oder Nein Entscheidung; nicht gefärbt - gefärbt) ablesbar zu gestalten muß die Diffusion des oder der Analyten in Richtung quer zur Strömungsrichtung der mobilen Phase verhindert werden. Dies geschieht erfindungsgemäß mittels effektiver Diffusionssperren. Geeignet dazu sind alle Materialien, in denen der Diffusionskoeffizient gegenüber dem in Flüssigkeiten vernachlässigbar ist. Dies ist im allgemeinen bei Festkörpern der Fall. Erfindungsgemäß läuft daher eine Chromatographie, die mit Barcode-Lesern auswertbar ist, in fest vorgegebenen, zweidimensionalen Betten (oder Kanälen) konstanter Vertiefung, in denen sich die stationäre Phase befindet, ab.

Bei multiplen Kanälen für die Mehrfachanalyse, die parallel angeordnet sind, müssen sich die seitlichen Begrenzungen gut oberhalb der Oberfläche der stationären Phase befinden, damit kein "Überkriechen" der mobilen Phase in benachbarte Trennstrecken stattfindet. Die geometrische Form der chromatographischen Kanäle ist weniger bedeutsam. Bewährt haben sich halbkreisförmige, ovale, V-förmige, trapez- und rechteckförmige Vertiefungen (Kanäle) gleichbleibender Tiefe auf den unterschiedlichsten Trägermaterialien (z. B. Glas, Keramik, Silizium, Kunststoff, Metall, etc.), die mit den gängigen und bekannten chromatographischen stationären Phasen (fast) dünnschicht-chromatographie-artig gefüllt sind. Je kleiner die Kanäle sind, umso mehr können auf einem Träger mit gegebenen Abmessungen untergebracht werden. Daher sind Mikrokanäle mit Abmessungen im Mikrometerbereich sinnvoll. Nach einer bestimmten, matrixabhängigen Auftrennstrecke, die mittels bekannter, der Trennung förderlicher Materialien gefüllt ist, folgt erfindungsgemäß der Übergang zu einem Mikro- Kanal oder -graben, dessen geometrische Abmessungen im Sinne der Erfindung reproduzierbar und bekannt variieren, so daß dort unterschiedliche Mengen eines Analyt-Titrators oder -Abfängers zusammen mit dem Anzeige-Cocktail (Indikator) immobilisiert werden können. Bei längeren Trennstrecken kann die durch die Kapillar- Mikro-Pipette gezogene Probenmenge nicht ausreichen, nach der Trennzone die Bestimmungszone zu erreichen. In diesem Fall wird die Testvorrichtung nach dem Abstreifen einer Benetzungsschicht in eine Lösung getaucht, die dann die chromatographische mobile Phase darstellt. Letztere wird vorzugsweise durch reine Kapillarkräfte zur Bestimmungszone transportiert. Dort wird der von den anderen Bestandteilen getrennte Analyt wie zuvor beschrieben zweidimensional titriert (Quantifizierungszone für die Absolutbestimmung). Da der Analyt hierbei den mit dem Titrator gefüllten Mikro-Kanal waagerecht durchströmt, kann bei ähnlichen Analyt- Konzentratinen auch mit einem gleichbleibenden Querschnittsvolumen gearbeitet werden. Erst wenn der Analyt auf seinem Weg vollständig mit dem dort fixierten Titrator reagiert hat, ist er mit dem selektiven Anfärbe-Cocktail nicht mehr anfärbbar. Folglich kann auch die Dünnschicht-Chromatographie erfindungsgemäß in eine einfach abzumessende Absolut-Methode umgewandelt werden.

Pro Chromatographie-Kanal kann eine Analyse durchgeführt werden und wegen der standardisierten Herstellungsbedingungen der Mikrosystemtechnik können auch mehr Kanäle für Multi-Analyt-Messungen mittels geeigneter Trenn- und Bestimmungszonen leicht und preiswert in Massen produziert werden. Dies führt erfindungsgemäß zu einem neuartigen, miniaturisierten Multi-Analysensystem, das die traditionelle Dünnschicht-Chromatographie bezüglich der Anzahl Analysen pro Fläche und bezüglich der Genauigkeit und Auswertungs-Einfachheit wesentlich erweitert.

Die Kanal-Länge ist durch die Abmessungen des Trägers bestimmt und liegt im Bereich weniger Zentimeter (vorzugsweise 1 bis 20 cm). Wenn der Träger dieser Trennstrecken Silizium ist, lassen sich mittels der bekannten Techniken der Mikro-Elektronik eine extrem hohe Anzahl an engen vorzugsweise parallelen Kanälen (durch Photolithographie und anisotrope Ätzung) sehr einfach und gleichmäßig erzeugen. Bei Kunststoff-Trägern kann die bekannte LIGA-Technik angewandt werden, die ähnliches ermöglicht. Quarz, Glas, Metall und andere Festkörper lassen sich aber ebenso durch bekannte Techniken entsprechend ritzen oder ätzen. Es sind aber auch kreisförmige Kanal-Anordnungen möglich. Theoretisch lassen sich so pro Zentimeter Trägerbreite weit über 10 Parallel-Analysen durchführen (vergl. Schallplattenrillendichte).

Erfindungsgemäß muß sich bei nicht-elektrophoretischen Trennungen die Korngröße der stationären Phase dem Kanalquerschnitt anpassen. Kanäle im Mikrometerbereich verlangen zur optimalen Funktion eine nanopörose stationäre Phase. Die Kanäle können oben offen oder aber auch abgedeckt betrieben werden. Bei einer dichten Abdeckung füllt die stationäre Phase zeckmäßigerweise den gesamten aus dem Kanal und der Abdeckung gebildeten Hohlraum aus. In einer weiteren Ausführungsform löst die mobile Phase die auf der Innenseite der Abdeckung befindlichen Substanzen zum Stoff-Nachweis auf und verteilt sie durch Diffusion über den gesamten Querschnitt.

Vorteilhaft ist, wenn sich der Bereich mit dem immobilisierten, analytanzeigenden Reagenz und dem Titrator am Ende der Trennstrecke befindet, weil dann die Abtrennung von Störkomponenten gegeben ist. Wichtig ist erfindungsgemäß, daß sich die Zone mit dem aufgetrennten Analyten durch die Reaktion mit diesen Reagenzien vom Untergrund abhebt. Bei analyt-spezifischen Reagenzien kann auf eine vollständige Auftrennung verzichtet werden und man kann die Quantifizierungszone nach vorne schieben, was die Analysenzeit reduziert.

Die Auswertung geschieht mit bloßem Auge an Hand einer Skala, die herstellungsbedingt gegeben ist oder auch in einfachen barcode-ähnlichen Ablese- Automaten: Entweder wird eine angefärbte Zone die Grundreflexion im Analysenkanal konzentrations-abhängig verändern. Es können u. a. aber auch fluoreszierende Zonen (aktive Fluoreszenz) oder umgekehrt Zonen mit ausgelöschter Fluoreszenz (negative Fluoreszenz) vermessen werden.

Erfindungsgemäß können je nach der ungefähr bekannten Laufzeit und Laufstrecke eines Analyten dort lokal auch unterschiedliche Anfärbe-Chemikalien für den oder die Analyten (auch biochemischer Art: enzymatisch oder immunologisch) bereitgehalten werden. Dies erhöht die Vielseitigkeit und Selektivität beträchtlich.

Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich von der klassischen Chromatographie bzw. Elektrophorese bezüglich seiner Durchführung mittels eines Laufmittels bzw. Elektrolyse in einem geeigneten Elektrolyt-Puffer mit oder ohne "Entwicklung" oder "Fixierung" der Trennstrecke nicht. Die Durchführung der Trennungen wird allerdings erheblich durch den Fortfall der Entwicklung beschleunigt und vereinfacht. Die Reagenz-Zugabe erfolgt erfindungsgemäß wesentlich genauer dosiert, was Vorteile bei der Materialeinsparung und in umwelt-relevanter Hinsicht bringt. Die gesteigerte Kapillarwirkung bei engen Kanälen erhöht die Strömungsgeschwindigkeit des Laufmittels und verkürzt dadurch die Analysenzeit beträchtlich.

Durch standardisierte Herstellungsbedingungen lassen sich Trenn-Kanal-Träger herstellen, bei denen im Falle ebenfalls standardisierter Anwendungsbedingungen die zu bestimmenden Stoffe stets als mehr oder weniger ausgedehnte Zone an einer bestimmten Stelle vom Startpunkt entfernt auftreten. Ein Barcode-Leser, der für den bekannten optischen Effekt (Untergrundabhebung durch Anfärbebereich) empfindlichkeitsmäßig optimiert ist, erhält nach einem Startsignal bei konstanter Streckenabtastgeschwindigkeit (Scan-Rate) ein weiteres Signal, dessen Zeitverzögerung für die Stoffart steht und dessen Zeitdauer (Streifenbreite) von der Konzentration des Analyten abhängt. Weitere Anfärbe-Zonen entsprechen weiteren/anderen Stoffen, die mit oder ohne zusätzlich selektivitätserzeugende Reagenzien simultan vermessen werden können, wobei der zeitliche Beginn des Meßsignals für die zu bestimmende Substanz steht und die Dauer (Strecke, mit konstanter Geschwindigkeit abgescant) für die Konzentration. Erfindungsgemäß kann diese Auswertung auch in speziellen Meßgeräten durchgeführt werden, die die Trennstrecken ähnlich schnell wie ein CD-Player an einem analogen optischen Reader vorbeibewegt. Auf diese Weise lasen sich vor allem Träger mit vielen Trenn-Kanälen sehr schnell vermessen. Bei circularen Trenn-Kanälen sind einem CD-Spieler sehr ähnliche Geräteaufbauten, die in wenigen Sekunden Tausende von Analysen auswerten, möglich. Kreisförmige Trenn-Kanäle erfordern allerdings insbesondere bei der Elektrophorese spezielle Start- und Endzonen mit Elektrolytkontakt zur Übertragung des elektrischen Feldes.

Zweckmäßigerweise optimiert man die parallel zu bestimmenden Stoffe nach dem betreffenden Anwendungsfall. In der klinischen Chemie werden beispielsweise die sog. Elektrolyte parallel bestimmt. Alternativ läßt sich beispielsweise Glucose mit Lactat, Kreatinin, Harnstoff und Harnsäure simultan bestimmen, wenn beispielsweise als Reagenz die betreffenden Oxidasen immobilisiert werden, die eine dem Analyten stöchiometrisch entsprechende Menge Wasserstoffperoxid mittels des Co-Substrates Sauerstoff erzeugen. Zur absoluten Konzentrationsbestimmung der Wasserstoffperoxid-Menge wird diese erfindunggemäß in Anlehnung an eine Redox- Titration mit einem immobilisierten Reduktions- oder Oxidationsmittel "zweidimensional titriert".

Eine weitere Variante der Erfindung lehnt sich mehr einer Auswertung über sog. Barcode-Leser an und verzichtet ganz auf Trennoperationen. Hier wird erfindungsgemäß eine barcode-lesbare konzentrationsproportionale "Streifenbreite" durch eine vorgegebene geometrische Probenauftrags- oder kontaktzone und ein progressiv durchgeführtes Abfangen des Analyten oder seiner konzentrationsproportionalen Reaktionsprodukte mit einem speziellen selektiven Reagenz erzeugt.

Für eine kalibrationsfreie, absolute Analyse muß allerdings das aktuell analysierte Aliquot der Probe konstant und bekannt sein. In diesem Fall ist dem jeweiligen Mikro- Reaktor eine Mikro-Probenahme-Vorrichtung vorgeschaltet. Dies kann erfindungsgemäß beispielsweise dadurch geschehen, daß beim Einbringen des Barcode-Analyse-Teststreifens in die Probe eine präzise Mikropipette durch Kapillarkräfte gefüllt wird und dann durch unterschiedliche Mechanismen das Eindringen weiterer Probe verhindert wird. Dies kann durch die verschiedensten Mikroventile (Aktuatoren) erfolgen, die elektrisch, magnetisch oder andersartig bewegt werden können. Eine vorteilhafte, energiemäßig passive Form ist die einer Rückschlagklappe am Mikro-Pipetten-Eingang, die dadurch geschlossen wird, daß eine flüssige Probe eine zuvor dort stationierte aufquellende Substanz diese Klappe fest abschließt. Bei gasförmigen Proben, die in der Regel auch größere Pipetten-Räume benötigen, sind passive magnetische Ventile die mittels externer Magnetfelder von außen gesteuert werden können, eine vorteilhafte Lösung. Wichtig ist erfindungsgemäß nur, daß die jeweils aktuell untersuchte Probenmenge sehr genau bekannt ist und durch die Graduierung in Mol-Bruchteilen mittels der immobilisierten Titratoren kalibrationsfreie, absolute Konzentrations-Messungen möglich werden.

Zusammenfassend lassen sich folgende besonders vorteilhafte Varianten der Erfindung aufzählen:

• a) Das Proben-Aliquot im Mikroliterbereich ist genauestens bekannt und konstant für jeden Mikro-Reaktor, der sich in unmittelbarer Nachbarschaft zur Pipette befindet. Die Graduierung der Maßlösung erfolgt durch unterschiedlich große und genauestens bekannte Volumina dieser Reaktoren. Die Füllung geschieht herstellmäßig einfach mit einer einzigen Maßlösung, die mit allen Hilfsreagenzien (spezifischer, analytselektiver Indikator, Maskierungsmittel, Puffer, Stabilisierungsmittel, etc.) versetzt ist. Die Immobilsierungsart, ob als Gel, Suspension oder später eintrocknende Flüssigkeit, ist unwesentlich.
• b) Das Proben-Aliquot im Mikroliterbereich ist genauestens bekannt, variiert aber durch eine geeignet konstruierte Vorrichtung in einer fein abgestuften Menge von bis zu 1/1000stel. In diesem Fall ist die Graduierung der Maßlösung (einschließlich Hilfsreagenzien, wie Indikator, Puffer, etc.) in der einzelnen Mikroreaktoren gleich und ebenso genauestens bekannt. Diese Variante entspricht einem umgekehrten Vorgehen wie unter a) beschrieben.
• c) Kombinationen aus a) und b) wobei bei gegenläufigen Graduierungen besonders große, erfaßbare Konzentrationsbereiche entstehen.
• d) Die Mikro-Pipetten können von den Mikro-Reaktoren getrennt werden, wodurch wiederverwendbare Vorrichtungen für diese Mikro-Maßanalyse entstehen. So läßt sich beispielsweise ein entsprechender Multi-Mikro-Pipetten-Block mit unterschiedlichen Volumina mit Injektionsöffnung herstellen, bei dem durch Injektion des Titrators (einschließlich des Indikators und Hilfsstoffe) alle Pipetten gefüllt werden und dann nach Aufsetzen auf die passig konstruierten Mikroreaktoren mit konstanter und bekannter Menge an Probe mittels einer Verschiebung von Spacer-Ventilen der Ausfluß der unterschiedlichen Titratormengen in die Reaktoren stattfindet.
• e) Der wiederverwendbare Mikro-Pipetten-Block nach d) nimmt die unterschiedlichen Probe-Mengen auf und die Titratormenge (einschließlich der Indikations- und Hilfsmittel) ist in den Mikro-Reaktoren konstant. Hierbei lassen sich titratorseitig besonders einfache Papier-Teststreifen herstellen, auf die der Multi-Mikro-Pipetten- Block einfach aufgesetzt wird und alle Ventile auf Einfluß der Proben-Aliquote in die Mikro-Reaktoren mittels eines einfachen Handgriffes geschaltet werden. Beim Wechseln von einer zur anderen Probe werden einfach einige mL zur Auswaschung der letzten Probe durch den Pipetten-Block gespritzt, wodurch alle Mikro-Pipetten auch automatisch gefüllt werden. Für den Titrator muß dann ein neuer Teststreifen verwendet werden. Teststreifen aus Papier werden bevorzugt mit den Methoden der Siebdrucktechnik strukturiert und mit Reagenzien versehen.
• f) Ein einziges Proben-Aliquot im Mikrolitermaßstab wird mit oder ohne chromatographische Vortrennung mittels Mikro-Kanäle, -kapillaren oder -gräben, die den Titrator mit einem genauestens bekannten Titer pro Strecke einschließlich aller notwendigen Indikatoren und Hilfsstoffe enthalten, quantifiziert.
• g) Bei radialer, sternförmiger Anordnung der Variante nach d) läßt sich bei einer Multi- Analysen-Anordnung der Probentransport durch Zentrifugalkräfte beschleunigen, was zu starken Zeiteinsparungen führt.

Allgemein kann festgestellt werden, daß jede Variante der Erfindung die bestehenden Probleme der Teststreifen-Analytik und Maßanalytik (zu große Chemikalienmengen) löst und daß für derartige absolut messende Schnelltests ein großer Markt existiert.

Eine besondere Variante ist auch bei der Analyse organischer Moleküle möglich, wenn als Titrator entsprechende, nicht an der Bindungsstelle abgesättigte Antikörper- Moleküle für den Analyten in Form von Mikro-Affinitätssäulen unterschiedlicher, aber genau bekannter Kapazität verwendet werden. Hier entspricht die Durchbruchs- Konzentration dem Äquivalenzpunkt. Als Indikator können dann u. a. die selektiven Mischungen der Gasprüfröhrchen verwendet werden. Alternativ können auch Mikro- Affinitätssäulen konstruiert werden, bei denen die dort eingebrachten analytspezifischen Antikörper-Moleküle an den entsprechenden Bindungsstellen mit einer derivatisierten Form des Analyten zu 100% abgesättigt sind, wobei aber der eigentliche Analyt eine wesentlich höhere Affinitätskonstante als sein Derivat aufweist. Erfindungsgemäß sollte der derivatisierte Molekülbereich des Analyten mittels maßanalytischer Methoden erfaßbar sein. So läßt sich beispielsweise an das Analytmolekül eine stabile Redox-Gruppe (z. B. Ferrocen, Ascorbat, Chinon, etc.) in einheitlichem Redoxzustand kovalent anknüpfen. Diese Redox-Gruppe wird im Verlauf der Parallel-Reaktion stöchiometrisch proportional zum Analytgehalt aus der Mikro- Affinitätssäule verdrängt und kann dann wie oben erläutert durch entsprechende Redox-Reagenzien in der Mikro-Reaktoren genauestens in Äquivalenten (Mol- Einheiten) erfaßt werden. Natürlich läßt sich erfindungsgemäß die Affinitätssäule auch mit der Mikro-Pipette vereinigen. Beispiel hierfür sind die sog. Capillary Fill Devices, die mit einer nachteilhaften fluorimetrischen Relativmethode, die wieder Intensitäten genau messen muß, im Handel sind.

Der Fachmann kann sich nun die verschiedensten Titrationsarten (z. B. Säure-Base, Redox, komplexometrische Titrationen, Fällungstitrationen, Affinitäts-Präzipitation) umgesetzt in progressiven, inkrementellen Serien von Mikro-Titrationszonen und/oder - räumen vorstellen, deren Anzahl bei steigender Menge eines Abfangreagenzes dort bei einem gegebenen generellen Analyt-Indikator für die Analytkonzentration steht.

Im folgenden sind einige erfindunggemäße Beispiele aufgeführt. Da die Erfindung ein komplettes, modulares und extrem variierbares System betrifft, können aus Platzgründen, hier nur wenige Ausführungsbeispiele genauer beschrieben werden.

Ausführungsbeispiel 1 Generelle, vorteilhafte Aufbau-Versionen der erfindungsgemäßen modularen Vorrichtung mit einer elektrochemischen Indikation

Der bevorzugte Aufbau für Übersichtsmessungen besteht in einer planaren, teststreifen­ förmigen Anordnung aus einem durchsichtigen Kunststoff mit den Abmessungen ca. 1 × 0,5 × 10 cm (B × H × L) wie der Abb. 1 schematisch skizziert ist. Die vorliegende Test- Anordnung besteht aus einem Probennahme-Modul mit einem Array von erfindungsgemäßen Mikro-Pipetten (1) mit konstantem und genau bekanntem Volumen im Mikroliterbereich. In diesem Beispiel ist die Skalierung (5) der maßanalytischen Mikro- oder Nano-Äquivalente des Titrators, der sich in den Mikroreaktoren (4a) befindet, wegen des durchsichtigen Materials auf dem Probennahme-Modul angebracht. Sie kann aber auch auf der Unterseite des Titrations-Moduls (unten) angebracht sein. Die Mikro-Kapillaren (1) werden mit einer Trennfolie (2) unten abgedichtet. Eine Anordnung mit Dornen (3) und Verbindungskanälen zu den einzelnen Mikro-Reaktoren im Mikroliterbereich erlaubt ein rasches Durchstoßen der Trennfolie (2). Das Volumen der Mikro-Reaktoren muß ausreichend groß sein, die Proben-Aliquote ohne Verlust aufzunehmen.

Anstelle der visuellen Äquivalenzpunktsfeststellung mit Hilfe eines geeigneten Indikators in den Mikro-Reaktoren kann auch eine hier nicht abgebildete elektrochemische Indizierung durchgeführt werden. Im Falle einer elektrochemischen Indikation der maßanalytischen Titration in den isolierten Mikro-Reaktionsräumen mittels entsprechender Mikroelektroden finden die mikrochemischen, maßanalytischen Umsätze in einem darüber befindlichen Modul statt. In diesem Fall kann auf Indikatoren verzichtet werden. Die Proben-Aliquote fließen vielmehr nach der maßanalytischen Reaktion in einem separaten Modul in das wiederverwendbare Meß-Modul mit einer der Anzahl der Mikro-Reaktoren entsprechenden Anzahl von elektrochemischen Meßzellen. Jede dieser Meßzellen kann über im Boden eingelassene Kontakte elektrisch kontaktiert und bezüglich Leitfähigkeit, pH- oder Redox-Wert vermessen werden. Der elektrochemische Äquivalenzpunkt-Leser ist nach Spülen wiederverwendungsfähig. Er wird durch ein passgenaues Aufsetzen von Reaktions-Module, evtl. Probenvorbereitungsmodul und Probennahme-Modul wieder zu einer Schnell-Test- Anordnung komplettiert.

Die Abb. 2 zeigt schematisch den Aufbau eines Probennahme-Moduls mit variablen aber genau bekannten Volumina der Kapillar-Pipetten (1). Die keilförmige Form auf Abb. 2 ist nicht maßstäblich. Zusätzlich zur variablen Länge der Kapillar-Pipetten, kann natürlich auch ihr Durchmesser verändert werden, so daß man die Aliquotisierung um den Faktor ca. 100 verändern kann. Bei zu langen Kapillar-Pipetten muß allerdings zu einer anderen Produktionstechnik als dem LIGA-Verfahren übergangen werden. Hier müssen die engen Röhrchen gebohrt werden, was durch klassische Feinwerktechnik aber auch mittels Laser geschehen kann. Das auf Abb. 2 gezeigte Probennahme-Modul mit variabler Aliquotisierung kann wiederverwendet werden. Dazu wird sie jeweils mit der neuen Probe mittels einer Spritze durchspült. Dazu sind die beiden Abdeckplatten mit den Verbindungs-Kapillaren (6) mittels Führungsschienen so angebracht, daß sie abwechselnd unten und oben die Kanale verbinden. Wegen der variablen Proben- Aliquotisierung, können bei diesem Schnell-Test-System die maßanalytischen Titer in den Mikro-Reaktoren (4b) im Titrations-Modul konstant bleiben. Die einzelnen Mikro- Reaktoren werden mit den einzelnen Proben-Aliquoten dadurch simultan gefüllt, daß die beiden Abdeckplatten mit den Verbindungskapillaren (6) seitlich verschoben werden. Die Mikro-Reaktoren des Typs (4b) können auch auf einem papierähnlichen Träger untergebracht werden.

Dadurch gestaltet sich beispielsweise eine Schnell-Analyse mit einer Kombination: Variable Probenmenge, konstanter Titer in den Mikro-Reaktoren wie folgt: a) Eintauchen des Probennahme-Moduls in die Probe b) Aufsetzen desselben auf das elektrochemische Meß-Modul unter Dazwischenschaltung einer passenden Folie mit den an den richtigen Stellen punktförmig immobisiserten konstanten Mengen Titrationsmittel, c) Öffnen der Probenkanäle und der Versiegelung des maßanalytischen Reagenzes und Überspülen in die Meßzellen, c) Vermessung des Meßzellen-Arrays zur Feststellung des Ortes der stärksten Meßsignal-Änderung, d) Ablesen der dort vorliegenden Äquivalenz-Konzentration an Analyt.

Ausführungsbeispiel 2 Die genaue Bestimmung einer Säure- oder Basenkonzentration mittels einer Systemkonfiguration mit Einzel-Reaktoren

Auf einem planaren Träger aus einem preiswerten, der LIGA-Technologie zugänglichen Material wird gemäß Abb. 1 ein lineares Array von Mikro-Reaktionskammern mit ansteigendem Volumen und mit ihnen in Verbindung stehenden Kapillar-Füll-Pipetten erzeugt der Gesamtabmessungen 10 × 1 × 0,5 cm (L × B × H). Zur Erleichterung der reproduzierbaren und automatisierbaren Füllung der Mikro-Kammern (Reaktoren mit Füllvolumen im Mikro- und Nanolitermaßstab, hier Durchmesser 0,1 mm) können diese auch mit unten offenen Kammern produziert werden, die dann nach Füllung mittels der verschiedensten Techniken mit einer optisch durchlässigen Bodenplatte verschlossen werden. Die Füllung mit genau dem Kammervolumen entsprechenden Mengen des Titrators (bei der Säurebestimmung: Lauge; bei der Laugenbestimmung: Säure) geschieht beispielsweise mittels eines Dispensers aber auch durch einfache Tauchfüllung in einer vorzugsweise gelartig vorliegenden Standardlösung einer schwerflüchtigen Lauge oder Säure, der ein geeigneter pH-Indikator beigefügt ist. Beispiele für immobilisierte Laugen sind neben den bekannten alkalischen Urtitersubstanzen wie Alkalikarbonate auch Substanzen, wie stark oder schwach basische Ionenaustauscher, die an ihrer Oberfläche (z. B. mittels Amino-Gruppen) Protonen binden können. Beispiele für immobilisierte Säuren sind dementsprechend neben den klassischen sauren Urtitersubstanzen wie Hydrogensulfat und -phosphat u. a. stark oder schwach saure Ionenaustauscher (z. B. mit SO₃H-Gruppen). Alternativ lassen sich natürlich auch Titrationen im Nanolitermaßstab durchführen, wenn der Titrator nur kovalent an den unterschiedlich großen Kammeroberflächen angebunden ist.

Wird eine derartige Testvorrichtung in die zu messende Probe getaucht, dann werden erst einmal gleichzeitig alle, je nach gewünschter Graduierung mehr oder weniger zahlreiche, Mikro-Pipetten durch die Kapillarwirkung gefüllt. Nach dem Herausziehen der Test-Vorrichtung wird der weitere Transport der Probe in die im Ausführungsbeispiel 2 jeweils darunter liegende Mikro-Titrations-Kammern dadurch gestartet, daß entweder eine Verschlußfolie durchstoßen wird oder die Mikro-Reaktoren in Titrations-Modul sind mit einer sich selbst auflösenden Schicht abgedeckt. Alternativ kann auch erst eine kontrollierte Verschiebung des Probennahme-Moduls den Weg zur Titration öffnen. Dann reagiert der Analyt mit der dort jeweils vorliegenden und genau bekannten Menge des Base- oder Säure-Standards, wobei es je nach der Säure- oder Basenkonzentration in der Probe zu einer Veränderung der Indikatorfärbung dort und nur dort kommt, wo die Äquivalenz überschritten ist. An einer seitlich angebrachten Skala läßt sich dann die Absolutkonzentration des Analyten (hier Säure oder Base) genau ablesen. Der Probentransport kann ebenfalls durch eine mechanisch oder andersartig eingeleitete Kapillarwirkung aber auch durch Eintauchen in eine Art Entwicklungsflüssigkeit mit oder ohne Hilfsreagenzien geschehen. Auch eine Befüllung der Mikro-Reaktions-Kammern mittels Vakuum oder Überdruck ist denkbar und erfindungsgemäß nebensächlich. Durch die Wahl eines geeigneten und einheitlichen pH-Indikators, der der zu bestimmenden Säure- oder Basenstärke (pK-Wert) entspricht, liegen einheitliche Anfärbebereiche (Kette der Mikroreaktionen mit oder ohne stöchiometrischen Analyt-Überschuß) vor, die auch automatisiert als digitale Ja-Nein Antwort (bezüglich der Erreichung des Endpunktes) ausgewertet werden können, was eine hohe Genauigkeit garantiert.

Bei dieser Analysenmethode wird in dem hier vorgestellten Ausführungsbeispiel die klassische Titration einer zu bestimmenden Säure mit einer Lauge (oder umgekehrt) in eine Serie von parallel und getrennt ablaufenden Mikrotitrationen kontrolliert variierter Titratormengen verwandelt, die durch die Art ihrer Anordnung eine digitale oder streckenmäßige Auswertung ähnlich wie die Volumenablesung an einer Bürette ermöglichen. Der Vorteil liegt einmal darin, daß in diesem Beispiel eigentlich nur die Position der noch gerade angefärbten Zone mit dem höchsten immobilisierten Laugengehalt zur genauen Konzentrationsermittlung genügt, die anderen also redundant sind und daß die Intensität nicht mehr wichtig ist. Im Falle der pH-Wert Messung, die bei starken Säuren und Laugen ungenau wird, ist diese "Flächentitrationsart" wesentlich genauer. Diese Art von Barcode-Analyse hat in den LED-Leuchtketten zur Intensitätsanzeige bestimmter elektronischer Signale ihren Gegenpart.

Die herstellungsmäßig genau konfektionierten Titrations-Module für eine absolute Konzentrationsbestimmung von Säuren und Laugen können erfindungsgemäß natürlich auch zur Gas-Analyse verwendet werden. So setzt man beispielsweise Kohlendioxid in einem Mikro-Gaswäscher-Modul mit bekannten Mengen von Natronlauge um. Die Abnahme der NaOH-Konzentration ist so leicht feststellbar. Analog kann Ammoniak mittels HCl ausgewaschen und bestimmt werden.

Ausführungsbeispiel 3 Absolute Serien Bestimmungen von Säuren und Laugen mittels einer Systemkonfiguration: Titration in Reaktions-Kanälen

Hat man eine Vielzahl von Proben auf ihre Säure- oder Basekonzentration hin zu überprüfen, so sieht eine bevorzugte Form der Erfindung anders aus. Auf einem geeigneten, mikrostrukturierbaren Träger befinden sich pro Analyse eine Aufgabevorrichtung, die mit einem darunter liegenden engen Mikro-Kanal genauer Abmessungen in Verbindung steht. Der gesamte Querschnitt dieses Kanals ist lückenlos mit dem Titrator-Standard-Reagenz, dem auch noch ein geeigneter pH- Indikator beigefügt ist, gefüllt. Die Bodenplatte kann wieder, wie oben gezeigt, optisch durchlässig gewählt werden. Bei dieser Version wird die Analysenprobe mittels einer genauen und speziellen Mikroliterspritze über das Aufgabe-Port-System in den Kanal als kontinuierliche Mikro-Reaktionskammer gedrückt, wobei der Probepfropfen mittels einer kurzen Nachspülung mit dergleichen oder einer zweiten Spritze in den Kanal gedrückt wird. Hier läuft mit dem dort gleichmäßig immobilisierten Titrator die Neutralisationsreaktion solange ab, bis der stöchiometrische Titratorüberschuß abgebaut ist. Dies läuft wie im obigen Beispiel auf das Ausmessen einer Mikro-Kanal- Strecke mit bekanntem Titer hinaus, was ein absolutes, an einer Skala ablesbares Ergebnis ergibt. Alternativ kann man auch erst alle Probenports mit einem Probenaliquot im Mikroliter-Maßstab füllen und dann die ganze Multi-Analysen- Vorrichtung in eine Lösung tauchen, damit es zu einem Probentransport durch die Reaktionskanäle mittels Kapillarkräften kommt. Die Art des Transportes ist erfindungsgemäß unerheblich. Eine bevorzugte Ausführungsform benutzt dazu, wie in Abb. 6 skizziert, entsprechend getränktes Fließpapier. Unter Zuhilfenahme eines geeigneten Spacers läßt sich diese Ausführungsform auch in einer Heißklebefolie einschweißen, was den Flächen-Titer stabilisiert.

Ausführungsbeispiel 4 Bestimmung eines Analyten mit Redox-Eigenschaften durch eine Systemkonfiguration: "zweidimensionale Redox-Titration"

In einer Vorrichtung wie unter Beispiel 2 oder 3 beschrieben, werden bei der Bestimmung eines Oxidationsmittels die üblicherweise dazu verwendeten Reduktionsmittel in den Mikro-Reaktoren immobilisiert. Bei der Bestimmung eines Reduktionsmittels wird umgekehrt ein geeignetes Oxidationsmittel dort in bekannter Menge untergebracht. Als Indikator werden die bekannten Redox-Indikatoren verwendet. In einigen Fällen zeigt sich der chemisch umgesetzte oder noch im Überschuß vorliegende Redox-Titrator auch selbst an. Beispiele dafür sind Permanganat, Chromat, Jod usw.. Oxidationsmittel mit einem Standardpotential positiver als +0,35 V (GKE) lassen sich mit immobilisiertem Kaliumjodid und etwas Stärke (z. B. 0,05 M KJ mit 5% Stärke) sehr gut mit beiden Vorrichtungen absolut quantitativ bestimmen, wenn ein stärker reduzierend wirkendes Reduktionsmittel als Titrator damit zusammen immobilisiert wird. Sehr häufig muß bei biochemischen Verfahren Wasserstoffperoxid gemessen werden. Dies gelingt mit der hier beschriebenen, erfindungsgemäßen Systemkonfiguration sehr genau. Erst nach Überschreiten des Äquivalenzpunktes der Reaktion mit dem immobiblisierten Reduktionsmittel liegt freies Wasserstoffperoxid vor, das elementares Jod erzeugt, was mit der Stärke zu einer intensiven Schwarzfärbung führt. Als Reduktionsmittel können alle stabil in den Mikro-Reaktoren zu immobilisierenden Reduktionsmittel, wie z. B. Titan(III)-, Eisen(II)-salze, Arsenit, Thiosulfat, Oxalat, Ascorbinsäure o. a. auch zusammen mit geeigneten anderen Redox-Indikatoren verwendet werden. Eine absolute quantitative Bestimmung von Wasserstoffperoxid ist für alle Biosensoren, die auf Oxidasen beruhen sehr interessant.

Bei der quantitativen Bestimmung von Analyten mit reduzierenden Eigenschaften werden erfindungsgemäß Oxidationsmittel mit einem entsprechend positiveren Redox- Potential in den Mikro-Reaktionskammern immobilisiert. Besonders vorteilhafte, einfache Ausführungsformen erhält man wenn man einen selbstindizierenden Stoff wie etwa Kaliumpermanganat oder Ce(IV)-salze, die im UV-Licht fluoreszieren, dazu verwendet. Auch Chromat verändert dabei seine Farbe von gelb nach grün.

Ausführungsbeispiel 5 Bestimmung von anorganischem Phosphat durch Ausfällen als Aluminiumphosphat mit einer Systemkonfiguration: Fällungs- Reaktor

Hier wird als Titrator Aluminiumsulfat in einer sauren Umgebung verwendet. Die freien Aluminiumionen ergeben mit immobilisierten Morin unter UV-Bestrahlung eine intensive grüne Fluoreszenz. Werden die maßanalytischen Aluminium-Ionen zunehmend vom Phosphat als unlöslicher Aluminiumphosphat-Niederschlag aus dem Lösungsgleichgewicht entfernt, verlöscht diese Fluoreszenz. Kurz vor Erreichen des Äquivalenzpunktes besteht hier eine lineare Beziehung zwischen der Fluoreszenz und dem Restgehalt an Aluminium, die man bei einer quantitativen Intensitätsmessung zu Extrapolations-Rechnungen verwenden kann (Prinzip: Standard-Subtraktion). Alternativ kann aber der Endpunkt dieser maßanalytischen Fällungs-Titration auch mittels bekannter Adsorptions-Indikatoren, die den Endpunkt empfindlicher anzeigen, angezeigt werden.

Ausführungsbeipiel 6 Bestimmung eines Schwermetalls durch eine Systemkonfiguration: komplexometrische Titration a) Bestimmung von Cadmium

Als Titrator wird entsprechend immobilisiertes EDTA verwendet. Der Titer pro Mikro- Reaktor muß bei Proben-Aliquoten von 0,1 mL im Nano-Äquivalent-Bereich liegen, wenn Proben im ppm Bereich gemessen werden sollen. Der ebenfalls mit zu immobilisierende Puffer soll bei pH < 9 liegen. Als Indikator wird das Reagenz-Cocktail verwendet, das auch bei der trockenchemischen kolorimetrischen Teststreifen-Methode verwendet wird. In der oben erwähnten Literatur sind noch weitere selektive Indikatoren für Cadmium erwähnt.

b) Bestimmung von Fluorid

Als Titrator dient in diesem Fall das intensiv rot gefärbte Eisen(III)rhodanid, das im Verlaufe der zweidimensionalen Titration durch die Bildung eines starken Eisen-Fluor- Komplexes entfärbt wird. Der Titrator ist also selbstindizierend. Soll das Fluorid im ppm- Bereich gemessen werden, so sind Probenvolumina von 0,1 mL und Titrator- Konzentrationen im Nano-Mol Bereich pro Mikro-Reaktor erforderlich.

Ausführungsbeispiel 7 Die Bestimmung eines Antikörper/Antigen Partners mittels der Systemkonfiguration: Mikro-Kanal-Säule

Diese Ausführungsvariation entspricht einer Fällungs- oder komplexometrischen Titration. Bei der quantitativen Bestimmung eines Antikörpers dient das Antigen immobilisiert auf einer Oberfläche als Titrator. Es liegt in den Mikro-Reaktions- Kammern oder Kanälen als Assoziat mit einem farblich markierten Antikörper mit niedrigerer Affinitätskonstante als der Analyt vor, so daß es durch letzteren freigesetzt wird und wegdiffundieren kann, wodurch es zu einem Verschwinden der Kammeranfärbung kommt. Die Wegdiffusion läßt sich unter Ausnutzung von kapillaren Saugkräften beschleunigen. Aus Gründen der Empfindlichkeit wird zur Markierung vorzugsweise eine fluoreszierende Verbindung verwendet.

Ein Antigen als Analyt wird analog mit dem dazugehörigen Antikörper als Titrator bestimmt. Letzterer wird abgesättigt mit einem markierten Antikörper, der eine kleinere Affinitätskonstante als der eigentliche Analyt aufweist.

Ausführungsbeispiel 8 Durchführung von Immuno-Assays mit Enzym-Markierung mittels der Sys 09412 00070 552 001000280000000200012000285910930100040 0002019545130 00004 09293temkonfiguration ELISA

Hier wird nach dem Probennahme-Modul ein Immunoreaktor-Modul geschaltet. In den Mikro-Reaktoren diese Moduls befindet sich der Analyt in enzymmarkierter Form an seinen Partner gebunden. Letzterer ist selbst kovalent an einer Oberfläche gebunden. Nach Öffnung der Verbindungskanäle zuwischen beiden Modulen, verdrängt der stärker gebundene Analyt sein enzymmarkiertes Derivat aus den Bindungsstellen, wodurch die Enzymmarkierung mobil wird und mit einer kleinen Menge Flüssigkeit in das Quantifizierungs-Modul gefördert werden kann. Dort reagiert es eine bestimmte Zeit mit dem dazugehörigen Substrat bevor die dabei erzeugten oder verbrauchten Substanzen im Titrations-Modul genau erfaßt werden. Bei Verwendung von Glucose-Oxidase als Markierungs-Enzym kann der Titrations-Modul wieder aus einem Bestehen, das auch zur Messung von Wasserstoffperoxid verwendet wird.

Ausführungsbeispiel 9 Bestimmung des chemischen Sauerstoff-Bedarfs (CSB-Wert) und des TOC-Wertes mit einer speziellen, anwendungsspezifischen Systemkonfiguration

Eine besondere Ausführungsform einer säure- und hitzebeständigen, mit Dichromat beladenen Probenvorbereitungs-Modul kann die extrem umweltbelastende klassische CSB-Bestimmung nach DIN ersetzen und gleichzeitig auch den TOC-Wert liefern. Die einzelnen Mikro-Reaktoren enthalten variable Chromat-Mengen im Mikro-Mol Bereich. Sie können durch eine geeignete Mikro-Verbindungskanal-Schaltung durch kontrolliertes Verschieben der Module gegeneinander und entsprechender Spacer mit Mikro-Gaswäscher-Reaktoren zur Messung des entstandenen Kohlendioxids in Verbindung gebracht werden. Die Mokro-Gaswäscher enthalten in diesem Fall variable Mengen NaOH mit dem Indikator Phenolphthalein. Nach der Probennahme einer angesäuerten Probe werden die Aliquote (Anzahl entsprechend der gewünschten Genauigkeit) in den Oxidations-Modul überführt. Dann wird durch Verschiebung des letzeren die Verbindung zu den Kapillar-Pipetten unterbrochen und die zu den einzelnen Mikro-Gaswäschern geöffnet. Dann wird das System für zwei Stunden (DIN) in den Trockenschrank bei 100°C deponiert. Um ein Eintrocknen zu verhindern, muß Wasser angeboten werden. Dazu wird entweder eine Wanne um die Probenahme- Kapillare gelegt, die Vorrichtung in ein Wasserbad gestellt oder die Erwärmung mit Wasserdampf durchgeführt. Während der Erwärmungsphase oxidiert das Dichromat die in dem Proben-Aliquot vorhandenen oxidierbaren Bestandteile, u. a. auch organische Verbindungen und wird dabei selbst zu einer grünen Chrom(III)-Verbindung reduziert. Dies passiert in allen Mikro-Reaktions-Kammern, in denen das Chromat in einem stöchiometrischen Unterschuß vorliegt. Zur Steigerung der Empfindlichkeit können auch noch geeignete Indikatoren für Chromat oder redox-empfindlich zugesetzt werden. Der CSB-Wert kann direkt an einer Skala, die sich neben dem Array der Mikro- Oxidations-Kammern befindet, in mg O₂/L abgelesen werden. Dieses Verfahren reduziert den Sondermüllabfall des DIN-Verfahrens um mehrere Größenordnungen. Simultan kann aber auch der Mikro-Gaswäscher lokalisiert werden, wo das Phenolphthalein gerade farblos wird. Hier kann dann an einer separaten Skala der TOC-Wert in absoluten Einheiten abgelesen werden.

Zur TOC (Total Organic Carbon)-Bestimmung werden in einem Oxidations-Modul die organischen Bestandteile der Probe durch starke Oxidationsmittel wie Dichro­ mat, Cer(IV), Wasserstoffperoxid plus UV-Licht usw. bei einem passend gewählten pH-Wert zu Kohlendioxid oxidiert und anschließend mittels einer gaspermeab­ len Membran in den Titrations-Modul übergeführt und maßanalytisch als Hydrogencarbonat "titriert". (A36)

Ausführungsbeispiel 10 Wasserbestimmung nach Karl Fischer mittels einer speziellen lösungsmittel-beständigen Systemkonfiguration

Eine weitere besondere Ausführungsform stellt auch eine Vorrichtung zur Wasserbestimmung in organischen Lösungsmitteln dar. Hier werden die bekannten Karl-Fischer-Reagenzien in den Mikro-Reaktoren unter wasserfreien Bedingungen in variabler Menge immobilisiert. Die in die Kammern eindringenden Wasserspuren in den zu prüfenden Flüssigkeiten reagieren stöchiometrisch mit dem Karl Fischer Reagenz, wobei Jod vierwertigen Schwefel zu sechswertigem aufoxidiert und dabei zu Jodid reduziert wird. Sobald also ein stöchiometrisch äußerst geringer Überschuß an elementarem Jod vorliegt, hat alles Wasser in den Proben-Aliquoten ausreagiert. Dieser Punkt wird durch die Verwendung von Stärke noch ausgeprägter angezeigt.

Ausführungsbeispiel 11 Absolut anzeigender Biosensor für Glucose mittels der System­ konfiguration: Enzym-Reaktor

Zur Demonstration der überaus großen Bandbreite von Möglichkeiten, absolut messende Testanordnungen im Sinne der vorliegenden Erfindung herzustellen, wird hier stellvertretend ein Glucose-Sensor beschrieben. Wegen der gewünschten Kalibrationsfreiheit muß die gesamte, in dem genommenen Proben-Aliquot vorhandene Glucose mit Hilfe des Enzyms Glucose-Oxidase (GOD) zu Gluconsäure und Wasserstoffperoxid umgesetzt werden. Daher ist eine entsprechend kleine Blutmenge (im Mikroliterbereich) und eine ausreichende Menge GOD im Enzym-Mikro-Reaktor zu verwenden. Als Mikro-Reaktions-Kammer eignet sich hier wegen der meist limitierten Probenmenge (1 Tropfen Blut) besonders die Version der Erfindung, die auf einer Mikro-Kanal-Anordnung beruht. Die Blutprobe wird über eine Kapillar-Füll-Pipette aliquotisiert und in die Vorrichtung eingebracht. Von dort aus fließt die Probe analog Abb. 6 durch eine Zone mit immobilisierter GOD, die sich auch bereits innerhalb des Mikro-Reaktions-Kanals befinden kann. In diesem Kanal soll die stöchiometrisch aus Glucose entstandene Wasserstoffperoxid-Menge quantitativ durch "Titration" mit Standard-Reduktions-Äquivalenten bestimmt werden. Als Reduktionsmittel wird vorzugsweise ein Gel mit einem definierten Kaliumjodid-Gehalt verwendet. Als Indikator wird vorzugsweise Stärke verwendet. Die Blutprobe strömt filtriert oder unfiltriert (der GOD-beladene Mikro-Reaktor wirkt für die roten Blutkörperchen wie ein Filter) in den Titrations- und Meß-Kanal. Dort reagiert das gebildete Wasserstoffperoxid mit dem maßanalytischen Reduktionsmittel zu elementarem Jod, das durch die bekannte Jod- Stärke-Reaktion tiefschwarz gefärbt ist, solange bis die Gesamtmenge an Wasserstoffperoxid umgesetzt ist. Dabei wird eine der Konzentration streng proportionale Strecke des Titrationskanals schwarz gefärbt. Die in der Blutprobe vorhandene Glucosekonzentration kann an einer aufgedruckten Skala in mg/dl oder einer anderen Konzentration abgelesen werden (Ende der Schwarzfärbung). Alternativ kann das Wasserstoffperoxid auch durch einen Standard aus Kaliumpermanganat aufoxidiert werden, wobei das Kaliumpermanganat zu farblosem Mangan(II) entfärbt wird.

Da z. B. Kaliumjodid und Kaliumpermanganat Urtitersubstanzen sind, ergeben sich hierdurch generische und absolut anzeigende Testvorrichtungen für eine große Vielzahl von Stoffen, die mit ihren Oxidasen selektiv unter Bildung von Wasserstoffperoxid oxidiert werden können.

Selbstverständlich müssen die Mikro-Reaktoren in beiden oben skizzierten Anwendungsbeispielen neben einer Standardmenge an Titrationsreagenz auch noch ein geeignetes Puffer- und Stabilisierungs-Cocktail enthalten, deren optimale Zusammensetzung zu finden aber für einen Fachmann kein Problem darstellt. Alternativ kann bei Oxidasen auch die Abnahme der Sauerstoffkonzentration mittels eines Fluoreszenz-Signales eines Farbstoffes, das durch Sauerstoff gequenscht wird, gemessen werden.

Für andere Nachweisreaktionen können die Reaktoren auch mit Dehydrogenasen oder Phosphatasen beladen werden, welche bei der Reaktion mit dem Analyten stöchiometrische und einer maßanalytischen Titration zugängliche Stoffe wie Wasserstoffperoxid, HADH oder Phenol freisetzen. (A32)

Ausführungsbeispiel 12 Quantitatives Gas-Dosimeter (Passiv-Proben-Sammler) mittels einer besonderen Systemkonfiguration mit Gas-Diffusions-Sammlern

Hierbei wird ein spezielles Probennahme-Modul mit engen, langen Difusions-Mikro- Röhrchen verwendet. Sie stehen im unmittelbaren Kontakt zu einer Sammelphase in einem weiteren Modul, in dem der gasförmige Analyt chemisch gebunden wird. Nach einer vorgeschriebenen Sammelzeit wird der Analyt in seiner neuen Verbindungsform durch Füllen der Diffusions-Röhrchen mit einer geeigneten Flüssigkeit aus der Sammelphase gewaschen und die Menge der aus dem Gas neu gebildeten Verbindung mit oder ohne chromatographische Trenn-Operationen titrimetrisch erfindungsgemäß durch eine geeignete stöchiometrische Reaktion mit Äquivalenzpunkt-Anzeige bestimmt.

Beispielsweise läßt sich ein Ozon-Dosimeter einfach dadurch aufbauen, daß als Sammelphase ein maßanalytisches Reduktions-Äquivalent gewählt wird und als Indikator KJ plus Stärke. Der Mikro-Reaktor im Titrations-Modul, der schwarz gefärbt ist, zeigt an, daß die gesammelte Ozon-Konzentration dem letzten, benachbarten Reduktions-Äquivalent entspricht.

Claims (24)

1. Verfahren zur Konzentrationsbestimmung eines in einer Probe enthaltenen Analyten, Analytgemi­ sches oder eines biochemischen analyt-äquvalen­ ten Stoffes (Titrand) mit Hilfe eines selektiven Reagenzes (Titrator), dadurch gekennzeichnet,
daß bei jeweils bekanntem Probenvolumen und be­ kanntem chemischen Äquivalent des Titrators eine Reihe von räumlich getrennt und maßanalytisch quantitativ ablaufenden Titrator-Titrand-Reak­ tionen durchgeführt werden,
wobei sich die einzelnen Titrator-Titrand-Reak­ tionen zumindest hinsichtlich mindestens einer der beiden Größen Probevolumen und chemisches Titrator-Äquivalent unterscheiden.

2. Verfahren zur Konzentrationsbestimmung nach An­ spruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß sich die einzelnen Titrator-Titrand-Reaktio­ nen der Reaktionsreihe zumindest darin unter­ scheiden,
daß bei konstantem Probevolumen das Titrator- Äquivalent inkrementell geändert wird oder
daß bei konstantem Titrator-Äquivalent das Pro­ bevolumen inkrementell geändert wird.

3. Verfahren zur Konzentrationsbestimmung nach An­ spruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich die einzelnen Titrator-Titrand-Reaktio­ nen der Reaktionsreihe zumindest darin unter­ scheiden, daß Probevolumen und Titrator-Äquiva­ lent gegenläufig inkrementell geändert werden.

4. Verfahren zur Konzentrationsbestimmung nach ei­ nem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Probennahme und Volumenabmessung für alle Titrator-Titrand-Reaktionen der Reaktions­ reihe gleichzeitig durchgeführt wird.

5. Verfahren zur Konzentrationsbestimmung nach ei­ nem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß Probenvolumina im Mikro- und Nanoliterbe­ reich und Mikro- oder Nanoäquivalente des Titra­ tors verwendet werden.

6. Verfahren zur Konzentrationsbestimmung nach ei­ nem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Ergebnis der Konzentrationsbestimmung visuell, elektrochemisch oder durch optische Auswertevorrichtungen wie Barcode-Leser oder Projektionsvorrichtungen jeweils im Zuge einer Ortsbestimmung von Titrator-Titrand-Reaktionen mit Titratorüberschuß oder Titratorunterschuß ermittelt wird.

7. Verfahren zur Konzentrationsbestimmung nach ei­ nem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß bei der Titrator-Titrand-Reaktion zusätzlich Indikatorreagenzien und/oder Hilfsstoffe wie Puffer, Maskierungs- oder Komplexierungsstoffe, Stabilisatoren oder Beschleuniger eingesetzt werden.

8. Verfahren zur Konzentrationsbestimmung nach ei­ nem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß nach der Probenahme und vor der Titrator- Titrand-Reaktion Neutralisations-, Komplexie­ rungs-, Oxidations-, Reduktions-, Abscheide- oder Gaswäscheschritte und/oder empfindlich­ keits- und selektivitätssteigernde chemische und/oder biochemische Analyt-Erkennungsreaktio­ nen und/oder chromatographische oder elektropho­ retische Trennungsoperationen durchgeführt wer­ den.

9. Vorrichtung zur Konzentrationsbestimmung eines in einer Probe enthaltenen Analyten oder Analyt­ gemisches (Titrand) mit Hilfe eines selektiven Reagenzes (Titrator), dadurch gekennzeichnet,
daß die Vorrichtung ein Probenahmemodul mit ei­ ner Mehrzahl von Probenahmevorrichtungen und ein Titrationsmodul mit einer Mehrzahl von räumlich getrennten Reaktionsbereichen umfaßt und
daß die einzelnen Probenahmevorrichtungen mit unterschiedlichen Probevolumina beschickt sind und/oder im Bereich der einzelnen Reaktionsbe­ reiche unterschiedliche chemische Titrator- Äquivalente angeordnet sind,
wobei die jeweiligen Probevolumina und jeweili­ gen Titrator-Äquivalente genau bekannt sind.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Reaktionsbereiche in der Reihenfolge steigender Titrator-Äquivalente angeordnet sind.

11. Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Anordnung der Probenahmevorrichtungen im Probenahmemodul mit der Position der Reaktions­ bereiche korreliert ist und einen quantitativen Transport der Probevolumina zu den Reaktionsbe­ reichen gewährleistet.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsbereiche im Titrationsmodul als Vertiefungen mit gleichem oder unterschiedlichem Fassungsvermögen ausgebildet sind.

13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Vertiefungen Fassungsvermögen im Mikro- und Nanoliterbereich aufweisen.

14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsbereiche auf dem Titrationsmo­ dul durch Dickfilmtechniken wie Siebdruck defi­ niert sind.

15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 14 dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsbereiche in einer ein-, zwei oder dreidimensionalen Matrix oder kreis-, spi­ ral oder helixförmig auf dem oder im Titrations­ modul angeordnet sind.

16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Probenahmevorrichtungen als Kavitäten wie Pipetten oder Kapillaren mit be­ kanntem und gleichem, verschiedenem oder vari­ ierbarem Fassungsvermögen ausgebildet sind.

17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenahmevorrichtungen als Diffusions- Röhrchen ausgebildet sind, welche mit einem eine Sammelphase für gasförmige Analyte enthaltenden Modul in Verbindung stehen.

18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenahmevorrichtungen an der der Probe zugewandten Seite verschließbar sind.

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Verschluß als durchstoßbare oder sich auflösende Membran, als Rückschlagklappe oder als mikromechanisches Ventil ausgebildet ist.

20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen Probenahmemodul und Titrationsmodul ein Vorbereitungsmodul zur Oxidation oder Reduk­ tion/Gasaustreibung und/oder elektrophoretischen oder chromatographischen Trennung und/oder zur chemischen oder biochemischen Analyt-Erken­ nung, -Amplifikation oder -Abtrennung angeordnet ist.

21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Vorbereitungsmodul als permeable Mem­ bran, Filter, Chromatographie-Säule oder als Strömungskanäle oder Umleitungen aufweisender Spacer ausgestaltet ist.

22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Probenahmemodul und/oder das Titrations­ modul und/oder das Vorbereitungsmodul mittels Dickfilmtechniken wie Siebdruck oder mittels LIGA-Verfahren oder mittels Halbleiterstruktu­ rierungsverfahren wie Photolithographie struktu­ riert oder mikrostrukturiert ist.

23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Funktionsmodule derart ausge­ staltet sind, daß das Einbringen des Titranden in das Vorbereitungsmodul und/oder in das Titra­ tionsmodul durch gegenseitiges Verschieben der Module und/oder eines dazwischenliegenden Spa­ cers mit entsprechenden Aussparungen realisier­ bar ist.

24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen Probenahmemodul und Titrationsmodul ein Spacer, eine Gleitschicht oder eine Trenn­ folie angeordnet ist.