DE19545130A1 - Verfahren und Vorrichtungen für ein modulares Mikrosystem für hochgenaue chemische Schnell-Analysen und Verfahren zur Herstellung - Google Patents
Verfahren und Vorrichtungen für ein modulares Mikrosystem für hochgenaue chemische Schnell-Analysen und Verfahren zur HerstellungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein modular aufgebautes Mikrosystem für hochgenaue Schnell-
Analysen. Das System hat eine geringe Ähnlichkeit mit einer maßanalytischen
Tüpfelplatte mit sehr genau definierten Mikro-Kammern (Containments), bei der
erfindungsgemäß die einzelnen Module mittels bekannter Methoden der hochpräzisen
mikrosystemtechnologischen Massenproduktion hergestellt werden.
Die Erfindung stellt als "Labor auf dem Chip" ein echtes passives (d. h. kein
stromverbrauchendes) Mikrosystem dar, das besonders durch alle Verfahren, deren
Strukturen photolithographisch hergestellt werden, z. B. mittels der LIGA oder Silizium-
Technologie, preiswert in Massen produziert werden kann. Bestimmte Varianten der
erfindungsgemäßen Idee können auch durch die bekannten Techniken der
Dickfilmtechnik (Siebdruck-Prinzip) auf Papier oder ähnliche Träger produziert werden.
Der Aktuator stellt die Probe-Aliquotisierung über beliebige Mikro-Pipetten mit oder
ohne Ventile im Probennahme-Modul dar, der Sensor wird aus der Serie der Mikro-
Reaktoren mit dem Indikator und dem maßanalytischen, inkrementellen Äquivalenten im
Titrations-Modul gebildet. Das System ergibt sich durch die Vereinigung beider und der
Graduierung und/oder Skalierung in absoluten Äquivalenz-Einheiten mit der
automatischen Rückführbarkeit auf das Mol.
Die Erfindung betrifft wegen der enormen Vielseitigkeit der verschiedenen
maßanalytischen Verfahren und der außergewöhnlichen Variationsbreite der
Kombinationsmöglichkeiten der Funktions-Module eine neue Klasse allgemein
anwendbarer, hochgenauer, chemischer Schnell-Tests. Gemeinsames Merkmal ist
ganz allgemein, daß die Stoffkonzentrations-Bestimmung in beliebigen Proben über
konzentrationsabhängige geometrische Ausdehnungen oder mittels schnell und
leicht feststellbarer, absoluter Äquivalenzmengen-Ermittlung auf oder in geeigneten
Trägern durchgeführt wird, anstelle der sonst allgemein üblichen konzentrations
proportionalen Intensitätsmessung von markierten, stofferkennenden Zonen
(Indikator).
Ein besonderer, gemeinsamer Vorzug der verschiedenen und äußerst zahlreichen
Ausführungsformen der Erfindung ist, daß zur Ermittlung der der betreffenden
Analytkonzentration äquivalenten Reagenzmenge (chemisch stabiler maßanalytischer
Titrator) nur eine Ortsbestimmung einer leicht feststellbaren (vorzugsweise optischen)
Änderung eines geeignet gewählten Indikators (Farbumschlag) auf einem entsprechend
skalierten Träger notwendig ist.
Es handelt sich bei dieser Erfindung auch um eine neue Generation von rationell zu
fertigenden, absolut messenden Teststreifen, -röhrchen, Passiv-Sammlern mit
integrierter Quantifizierung oder ähnlichem. Die Erfindung führt im Prinzip eine
maßanalytische Titration im sog. Titrations-Modul über eine Serie von Mikrotitrationen
in Mikro-Reaktionskammern durch, wobei der Äquivalenzpunkt entweder bei einem
konstanten Mikro-Reaktor-Titer pro Mikro-Titrations-Raum durch eine im Probennahme-
Modul genau abgemessene aber variable Probenmenge oder bei konstanten Proben-
Aliquoten pro Mikro-Reaktions-Raum durch Variation des Reagenz-Titers von Mikro-
Reaktor zu Mikro-Reaktor eingestellt wird. Zur Erhöhung des dynamischen
Einsatzbereiches (erfaßbarer Konzentrationsbereich) kann auch beides, das Proben-
Aliquot in den Mikro-Reaktoren und die dort zur Umsetzung verwendete
Reagenzmenge gleichzeitig und gegen läufig verändert werden.
Die Anzahl der für den Schnell-Test erforderlichen Mikro-Reaktoren hängt vom
betreffenden Anwendungsfall, dem Erfassungsbereich und der gewünschten
Genauigkeit ab. So genügt beispielsweise zur Feststellung einer Grenzwert-
Überschreitung prinzipiell eine einzige Proben-Aliquotisierung und ein einziger Mikro-
Reaktor mit einer dem betreffenden Grenzwert entsprechenden Äquivalenzmenge des
Titrators. Tritt in diesem Mikro-Reaktor eine Umfärbung des analytselektiven Indikators
auf, wurde in der Probe der Grenzwert überschritten. Da dies jedoch wegen der
Miniaturisierung zu unhandlich kleinen Schnell-Test-Vorrichtungen führt, soll
erfindungsgemäß eine Grenzwert-Kontrolle durch leicht mögliche
Mehrfachbestimmungen erfolgen. Um dazu einen evtl. möglichen systematischen
Fehler (z. B. Staubkorn oder Luftblase in der Probennahme-Pipette) zu verringern, wird
erfindungsgemäß sowohl das Proben-Aliquot als auch der Probennahme-Zeitraum
gering geändert, was zu entsprechenden stöchiometrischen Änderungen des Titers in
den entsprechend vorbereiteten Mikro-Reaktoren führt. Eine statistisch sichere
Grenzwert-Überschreitung liegt nur dann vor, wenn alle Reaktoren einen Indikator-
Umschlag anzeigen. Diese Redundanz erhöht die Zuverlässigkeit des Schnelltests
außerordentlich ohne daß der analytische Aufwand und der Chemikalien-Abfall
entsprechend ansteigt.
Alternativ sind natürlich auch Einsatzgebiete denkbar, in denen es beispielsweise
analytisch chemisch genau darauf ankommt, untere und obere Grenzbereiche mit
erhöhter Genauigkeit zu erfassen (z. B. biologische Streubreite bei medizinischen
Diagnosen). Hier kann man erfindungsgemäß die beiden Grenzkonzentrations-Bereiche
durch verhältnismäßig zahlreichere Mikro-Reaktoren mit feinerer Skalierung
überstreichen. Auch hier erhöht die analytische Redundanz die Zuverlässigkeit von
Schnell-Tests erheblich, so daß sie in Bereiche der Präzisions-Analytik hineinreichen
und damit einem Bedürfnis entgegenkommen.
Die vorliegende Erfindung, die zu einer neuen Klasse von Schnell-Tests führt, löst auch
das generelle, schwierige Problem aller sog. relativen Analysenverfahren und
klassischer Schnell-Tests, die mittels einer störanfälligen Signal-Intensitäts-Messung
durchgeführt werden, weil erfindungsgemäß nur noch eine leicht feststellbare
Veränderung eines geeigneten Indikators oder Anfang und Ende einer markierten Zone
bzw. eine analytrelevante Markierung von einem Untergrund in oder auf einem Träger
zu unterscheiden sind. Dadurch werden erstmals kalibrationsfreie, absolut messende
Schnelltests möglich, deren Genauigkeit nur von der Wahl der graduellen
Titrationsmittel- Dosierung und/oder Proben-Aliquotisierung pro Mikro-Reaktor abhängt.
Da die Schärfe der Erkennung eines Indikator-Umschlagpunktes bei der Maßanalyse
bekanntlich leicht 0,1% Relativ-Prozent vom Äquivalenzvolumen ausmacht, lassen sich
erfindungsgemäß extrem genau messende Meßsysteme aufbauen, wenn
beispielsweise 1000 Mikro-Reaktoren in geeigneter Anordnung auf einem geeigneten
Träger untergebracht werden und eine ganze Konzentrationsdekade des Analyten mit
gleicher Genauigkeit erfaßt werden muß.
Der Stand der Technik auf dem Gebiet der sog. naßchemischen Analyse ist, bezogen
auf die absoluten Mengen der miteinander reagierenden Stoffe (Analyt mit
Standardlösung), nahezu der gleiche wie vor 100 Jahren, als beispielsweise die
Maßanalyse als eine absolute Bestimmungsmethode eingeführt wurde. Bei den sog.
titrimetrischen Verfahren (Säure-Base-, Redox-, Fällungs-, Komplex-, Assoziations-,
Affinitäts-, etc. Titration) werden immer noch Volumina von i.d.R. 10 bis 100 mL
bearbeitet und inzwischen auch mittels automatischer Titratoren mit integrierter
Auswertungssoftware titriert. Da die Menge des zugesetzten Reagenzes (Titrator) durch
das Volumen und den sog. Titer gegeben ist, muß die vorliegende Probenmenge in
Abhängigkeit von der Analytkonzentration unterschiedlich dosiert werden, um den
volumenmäßigen Verbrauch an Reagenz in einem durch die Dosiergenauigkeit
limitierten Bereich zu halten. Üblicherweise sollten die zu Analytkonzentrationen bei
einer titrimetrischen Analyse innerhalb einer Dekade liegen. Dies erfordert bei der
Probenvorbereitung u. U. entsprechende Verdünnungsschritte.
Dieser Stand der Technologie bei der naßchemischen Maßanalyse produziert bei
Serienanalysen eine entsprechend große Menge an Abfall, der je nach der
Umweltrelevanz der Probe, des Reagenzes oder der Äquivalenzpunkterkennungs-
Indikatoren oder sonstiger Hilfsstoffe als Sondermüll deklariert werden muß. Bei den
weltweit täglich durchgeführten über 100 Millionen chemischen Analysen werden nicht
wenige so durchgeführt und belasten daher die Umwelt. Ein besonders drastisches
Beispiel ist die laut Wasserabgabengesetz vorgeschriebene Bestimmung des sog.
chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB-Wert), ein operativ definierter Parameter. Hier wird
nach einem DIN-Verfahren bestimmt, wieviel Stoffe in einer Probe sind, die durch eine
heiße, saure Dichromat-Standardlösung in einer bestimmten Zeiteinheit oxidiert
werden. Dazu muß der Überschuß des Oxidationsmittels auch nach der Bestimmung
erhalten bleiben, d. h. es muß das hochtoxische Chromat entsorgt werden. Bei einer zu
hohen Chloridkonzentration muß zur Bindung dieses Anions, das natürlich vom
Chromat auch oxidiert wird aber keine organische Belastung darstellt, die man
eigentlich dadurch erfassen möchte, ein Quecksilbersalz als Chloridfänger hinzufügen.
Dies alles läuft mit Probenmengen von 20 mL und Totalvolumina zwischen 30 und 100
mL bei Konzentrationen entsprechend 0,1 normaler Standardlösungen ab, was pro
Analyse zu Milligram-Mengen an Abfall führt. Erfindungsgemäß wird bei
gleichbleibender Genauigkeit und sogar verkürztem Zeitaufwand die Abfallmenge um
den Faktor < 1000 (!) reduziert.
Bei vielen klassischen Analysen, die inzwischen aus Gründen einer stringenteren
Umweltpolitik erforderlich werden, wird der Informationsgewinn durch eine teilweise
katastrophale Umweltbelastung mehr als kompensiert.
Allgemein kann festgestellt werden, daß einer generellen Miniaturisierung der
klassischen Maßanalyse praktische Grenzen gesetzt sind. Der Umgang mit graduierten
Volumenmeßgefäßen unter 1 mL ist nicht einfach und die derzeitigen Pipetten im
Mikroliterbereich haben zu große Fehler und sind entsprechend aufwendig konstruiert.
Bei der optischen Bestimmung des Äquivalenzpunktes müssen entsprechend kleine
Strahlenquerschnitte verwendet werden, was zu apparativen Problemen bezüglich des
Streulichtanteils führt.
Weil diese klassische Maßanalyse bei der Verwendung geeigneter Titratoren (Urtiter- Substanzen)
eine absolute Bestimmungsmethode ist, die keiner Eichung mittels
künstlicher oder natürlicher Standards (zertifizierte Standardreferenzmaterialien)
bedarf, wird sie generell auch zur Kontrolle beliebiger Eich- oder Kalibrierungslösungen
eingesetzt. Demgegenüber bestimmt man die meisten Analyte anorganischer wie
organischer Art durch sog. Relativ-Verfahren, die genau kalibriert werden müssen.
Bei fast allen analytisch-chemischen Relativ-Methoden wird die Intensität eines
bestimmten Analysensignals (elektromagnetische Strahlung, elektrischer Strom,
Widerstand oder Potential, sonstiges analytproportionales Sensor oder Detektorsignal)
gemessen und mit dem einer Vergleichsprobe mit bekanntem Gehalt verglichen. Der
Stand der Technik ist, daß bisher lediglich der letzte Schritt einer chemischen Analyse,
den der Vermessung der Intensität eines Analysensignals, durch die apparativen
Entwicklungen entscheidend verbessert werden konnte. Natürlich gibt es vor allem im
klinischen Bereich mehr oder weniger große Automaten, die eine komplette chemische
Naßanalyse vollautomatisch durchführen. Entsprechende Entwicklungen haben die seit
den 60er Jahren bekannte Technikon-Auto-Analyzer Methode, die durch einen mit
einem gasförmigen Zwischenraum segmentierten Probenstrom charakterisiert ist,
verbessert.
Eine weitere Entwicklung hat versucht, das sog. Probenhandling zu vereinfachen und
die Routine-Analytik zu automatisieren. Dies ist die Fließ-Injektionsanalyse (FIA, [E.H.
Hansen, International Laboratory Vol. 15, No. 8, S. 14, 1986]), die analog dem
Technikon-Auto-Analyzer System funktioniert, aber auf einen segmentierten Probenfluß
verzichtet. Hier dosiert ein automatisches Probenahmeventil (Probenschleife) eine
bestimmte Volumenmenge an Probe in einen Strom einer geeigneten Träger- oder
Transportflüssigkeit (Carrier-Solution) der die Probe dann mit oder ohne Reaktions-
oder Mischkammern mit allen erforderlichen Reagenzien vermischt und an einen
Detektor vorbeiströmen läßt. Aus der Höhe oder Fläche eines dort erzeugten Analyt-
Signal-Peaks wird dann die unbekannte Konzentration errechnet. Der Vorteil
gegenüber den segmentierten Verfahren liegt darin, daß man durch die gewünschte
Diffusion und Vermischen des Probensegments mit der Transportflüssigkeit beliebige
Konzentrationsgradienten (sprich Verdünnungen) erzeugen kann.
Eine weitere Entwicklung auf dem Gebiet der naßchemischen Analyse sind
entsprechende, mikroprozessor-gesteuerte Tischroboter-Systeme, die lediglich die
Laborantentätigkeit automatisch erledigen.
Allen bekannten Systemen, die die naßchemische Analyse nach beliebigen Verfahren,
Methoden oder Techniken automatisieren, liegt der Nachteil des großen Aufwandes
und des relativ großen Reagenzienverbrauchs zugrunde. So sind beispielsweise die
Automaten für die klinische Analyse komplizierte und entsprechend teuere Gebilde, die
einen entsprechend großen Stellplatz erfordern und auch eine beachtliche Menge an
elektrischer Anschlußleistung benötigen. Als eigenständiger Bereich hat sich bei den
Schnell-Methoden auch der der Test-Kits etabliert. Hier wurden zumeist tragbare
Reagenzien-Kits entwickelt, die durch Vermischen mit einem Proben-Aliquot im
Milliliter-Bereich und zumeist photometrischer Auswertung schnelle Vor-Ort-Analysen
ermöglichen sollen. Allen Systemen gemeinsam ist aber der Nachteil, daß die
vermessenen Proben in vielen Fällen Sondermüll darstellen und nicht im
Mikroliterbereich anfallen. Für den letzteren Bereich kommen zwar sog. p-TAS (Mikro-
Total-Analysen-Systeme) Entwicklungen in Frage, die aber noch im Entwicklungsstadium
sind. Selbst wenn diese extreme Miniaturisierung der klassischen Analytik kommerziell
erhältlich sein würde, ist der Aufwand wegen der erforderlichen Mikropumpen und
Signal-Meßeinrichtungen doch erheblich und führt zu keinen preiswerten Geräten.
Als Antwort auf diese gravierenden Nachteile der klassischen Analytik entwickelte sich
in den letzten Jahren als Schnell-Test die Alternativmethode der sog. Trockenchemie
(Oswald Sonntag: Trockenchemie: Analytik mit trägergebundenen Reagenzien,
Thieme-Verlag, Stuttgart 1988) mit all ihren Varianten. Hier wurde versucht, die
Probenvorbereitung, die Matrixabtrennung und die selektive Anfärbung mit einem
speziellen, den Analyten erkennenden Reagenz auf einen mehr oder weniger planaren
Träger aus Papier oder Kunststoff oder dergl. zu platzieren. Dies wird mit Hilfe
entsprechender, unterschiedlicher Schichten mit immobilisierten Reagenzien oder
Reagenzmischungen erreicht. In der medizinischen Schnellanalytik verwendet man
häufig Teststreifen, bei denen ein oder mehrere Testfelder auf einem Kunststoffstreifen
angebracht sind. Diese Teststreifen werden überwiegend visuell durch Vergleich der
Reaktionsfarbe der Testfelder mit einer Farbskala, die häufig auf dem Etikett der
Aufbewahrungsbehälter für diese Teststreifen angebracht sind, ausgewertet. Für die
Referenz-Farbskala müssen dann aufwendige und lichtechte Farbdruckverfahren
angewandt werden.
Die Teststreifen erfordern für den Anwender nur ein einfaches Eintauchen in die Probe
und eine Konzentrationsablesung anhand einer Färbung oder einer Farbintensität die
mit dem bloßen Auge geschehen kann. Entsprechende Teststreifen gibt es inzwischen
für eine Vielzahl von Analyten im Bereich der Medizin, des Umweltschutzes der
Produktionskontrolle usw. Problematisch ist bei den traditionellen Teststreifen, daß die
Zeitspanne des Eintauchens und die Art des Herausnehmens durch Abstreifen
überschüssigen Probenvolumens genau vorgeschrieben ist und eingehalten werden
muß. Das jeweils analysierte Proben-Aliquot wird durch die Verwendung eines
flüssigkeitsaufsaugenden Materials bestimmt. Diese Art ist nicht sehr genau; weshalb
man auch nur von halbquantitativen Ergebnissen spricht. Ebenso ist die visuelle
Analyse nicht standardisiert. Eine Reihe von Variablen kann die Qualität der Resultate
beeinflussen (W. Majunke, U. Watterodt, R. Proetzsch, G. Brillinger, Analytiker
Taschenbuch Band 5, S. 161, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York 1985).
Unterschiedliche Beleuchtungsverhältnisse, störende Eigenfarben der Proben,
unterschiedlich genaues Einhalten der Ablesezeiten und individuell unterschiedliches
Farbunterscheidungsvermögen ergeben weitere Fehlermöglichkeiten, die einem
zuverlässigen Schnelltest im Wege stehen.
Objektiver ist zwar eine Auswertung über ein entsprechendes Reflexionsphotometer
bringt aber wegen der individuell stets möglichen Beeinflussung der Probennahme und
Handhabung nicht entscheidend genauere Ergebnisse. Wenn die Teststreifen zu lange
eingetaucht werden, verlieren sie ihre speziellen analyt-selektiven Reagenzien in die
Probe und liefern falsche Ergebnisse. Ist die Rundung des Becherglasrandes zur
Abstreifung zu stark, bleibt auch mehr Probe auf dem Teststreifen als einkalibriert
wurde. Ebenso kann ein einfaches Abwischen mit anderen Hilfsmitteln schlecht
standardisiert werden. Teststreifen für eine instrumentelle Auswertung haben ein
Testfeld mehr als die, die visuell abgelesen werden. Das sog. Kompensationsfeld ist
reagenzienfrei und besteht aus einem speziellen weißen Papier. Es wird durch eine
mögliche Eigenfarbe der Probe entsprechend angefärbt. Bevor das optische System die
einzelnen Testfelder auswertet, mißt es die Reflexionswerte dieses
Kompensationsfeldes und speichert einen Referenzwert, um damit die Eigenfärbung
automatisch zu kompensieren.
Das weitverbreiteste Beispiel für diese Analysentechnik ist die Messung des
Blutzucker-Gehaltes. Hier wird ein Tropfen Kapillarblut (aus einer kleinen Wunde) auf
die Oberfläche des Teststreifens aufgebracht. Das Vollblut wird auf dem mehrlagigen
Teststreifen filtriert, von den roten Blutbestandteilen getrennt und dann räumlich
getrennt der Analyt Glucose mit immobilisierter Glucoseoxidase katalytisch zu
Gluconsäure und Wasserstoffperoxid umgesetzt. Hochmolekulare und zelluläre
Bestandteile bleiben zurück und werden nach Ablauf der Einwirkzeit (1-2 min) vom
Testfeld abgewischt. Das gebildete Wasserstoffperoxid ist proportional der
Glucosekonzentration und wird optisch dadurch angezeigt, daß es das Oxidationsmittel
für eine Reaktion zwischen zwei organischen Molekülen darstellt, die dann eine
proportionale Menge eines grün blau gefärbten Azofarbstoffes bilden. Hierbei geschieht
der Probentransport im Unterschied zu den obigen Verfahren mittels der
Kapillarwirkung der Trägermaterialien. Im Prinzip ist dadurch die Messung des
Blutzuckergehaltes so einfach wie eine pH-Wert-Messung mittels eines
Indikatorpapieres geworden, so daß auch Laien, also der Patient mit Diabetis, eine
Selbstkontrolle durchführen kann.
Alle Teststreifen, -stäbchen oder -röhrchen, die eine Vielzahl von für die Umwelt oder
Klinik wichtige Analyte auf Basis diese sog. Trockenchemie ohne erneute Kalibrierung
erfassen, leiden aber unter noch weiteren entscheidenden Nachteilen:
Im Prinzip verläuft die Stofferkennung durch eine geeignete, gut wahrnehmbare
Markierung des Analyten durch geeignete Hilfsmittel (Reagenzien). In den meisten
Fällen werden bei einer quantitativen, instrumentell-analytischen Methode in der Regel
analytkonzentrations-abhängige Farb-Intensitäts-Signale mit Hilfe verschiedenster
physikalisch-chemischer Wechselwirkungen ausgemessen. Auch bei der Entstehung
von Mischfarben spielen die unterschiedlichen Intensitäten der Grundfarben eine
entscheidende Rolle. Nachteilig bei allen Stoffkonzentrationsbestimmungen, die über
die Messung einer bestimmten Signal-Intensität verläuft, sind die verschiedensten
Störungen, die damit einhergehen. Unabhängig von der Art des eigentlichen
Meßsignals (Intensität von elektromagnetischer Strahlung, elektrischer
Potentiale/Ströme/Leitfähigkeit, magnetischer oder elektrischer Felder, usw.) führen
Veränderungen der Anregungs- und Ausgangssignalstärke und/oder probenmatrix
bedingte Störfaktoren bei der analytspezifischen Wechselwirkung mit diesen
Anregungsenergien zu Fehlmessungen. Auch muß i.d.R. die Probe in ein
entsprechendes Meßgerät gebracht werden, in dem diese Messungen, der
analytspezifischen energetischen Wechselwirkungen, durchgeführt werden.
Das Photometer kann z. B. Instabilitäten in der Anregungs-Lichtquelle zeigen. Die
Intensität des reflektierten Lichtes hängt natürlich von der Intensität des eingestrahlten
Lichtes ab, daher muß bei quantitativen Auswertungen auf dieses bezogen werden. Die
auszuwertende Verfärbung oder Farbintensität kann z. B. durch die Matrix der Probe
ähnlich negativ beeinflußt werden, wodurch die Steigung einer Kalibrationsgeraden
variiert wird und die Methode der Standardaddition angewandt werden muß. Die
Reflexionsphotometer zur Auswertung bestimmter Teststreifen arbeiten üblicherweise
bei einer feststehenden Wellenlänge, um sie kompakt und damit tragbar zu machen.
Damit ist allerdings ihr Einsatzbereich nur auf diesen Spektralbereich begrenzt. Sie
können die Vielfalt der bekannten Reagenzien nicht ausnutzen und sind für
unterschiedliche Indikatoren nicht geeignet.
Aus Gründen erhöhter Selektivität können die trockenchemischen Teststreifen im
allgemeinen neben dem eingeschränkt selektiven Reagenz noch weitere Zusatz
und/oder Hilfsstoffe (z. B. Puffer, Maskierungsreagenzien, Stabilisatoren, etc.) enthalten
die Querstörungen durch andere Stoffe in der Probenmatrix ausschalten und die
Anfärbung stabilisieren sollen. Allen gemeinsam ist aber, daß die
Konzentrationsbestimmung (quantitative Analyse) über eine farbliche (wellenlängen
mäßige) oder farbintensitätsmäßige Bewertung erfolgt. Will man unterschiedliche
Farben (z. B. bei Multi-Analyt-Messungen) vermessen, dann ist ein solches Gerät sehr
kompliziert und muß einen Monochromator enthalten. Wegen dieses auch teueren
Aufwandes gibt es kaum Meßgeräte, die die unterschiedlichen Farben der
unterschiedlichsten Teststreifen objektiv vermessen können. Dies erschwert die genaue
quantitative Vor-Ort-Analyse mittels Teststreifen oder -stäbchen erheblich.
Man hat es hier natürlich mit einem hundertprozentigen Relativ-Verfahren zu tun, das
erfahrungsgemäß sehr matrixanfällig ist. Alles, was die auszuwertenden Farben
beeinflußt, wie z. B. farbige Proben, Suspensionen, zusätzliche, absorbierende
Schichten (z. B. Niederschläge, Eiweiß bei biologischen Proben, etc.), die bei der
chargenweisen Kalibrierung des Herstellers nicht berücksichtigt wurden, führt zu
Fehlmessungen.
Bei allen Schnell-Tests auf Basis der Trockenchemie geschieht der Probentransport nur
über minimale Strecken, die durch Diffusion und/oder Kapillarkräfte überwunden
werden. Es besteht hier keine Möglichkeit, frei wählbare analytisch-chemische Unit-
Operations (Probennahme, Probenvorbereitung, extrahieren, ausfällen, ausgasen,
filtrieren, oxidieren, reduzieren, neutralisieren, buffern, etc.), beliebig und
anwendungsorientiert zu kombinieren.
Der Erfindung lag demnach folgende Aufgabe zugrunde: Die Unsicherheiten und
Ungenauigkeiten der auf der Trockenchemie basierenden Teststreifen sollten beseitigt
werden, ohne dabei den Verbrauch an Reagenzien oder die Einfachheit des Verfahrens
entscheidend ändern zu müssen. Ferner sollten beliebige Unit-Operations system
mäßig einfach kombinierbar sein. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst,
daß die Einfachheit einer chemischen Analyse mittels eines Teststreifens, -stäbchens
oder -röhrchens mit der Genauigkeit der Maßanalyse kombiniert wird. Dies führt zu
einem kalibrationsfreien und hochgenauen Verfahren, zu einer sog.
Absolutbestimmungsmethode ohne daß der Chemikalien-Abfall, verglichen zur
Trockenchemie, wesentlich ansteigt.
Dazu wird erfindungsgemäß zunächst die Probennahme-Genauigkeit entscheidend
dadurch verbessert, daß in einem separaten Probennahme-Modul eine oder mehrere
Mikro- oder Mikro-Kapillar-Pipetten mit hochgenauem Volumen, die inzwischen
preiswert herstellbar sind, verwendet werden. Desweiteren wird der Analyt in diesen
genau bekannten Proben-Aliquoten mit oder ohne zusätzliche selektivitätserhöhenden
Schritte in weiteren Funktions-Modulen maßanalytisch quantifiziert, wobei keine
Farbintensitäten genau festgestellt werden müssen, sondern nur ein klar ausgeprägter
Farbumschlag eines geeignet gewählten Indikators. Dies wird erfindungsgemäß mittels
des Titrations-Moduls in einem oder mehreren Mikro-Reaktionsräumen oder Mikro-
Reaktoren mit Hilfe eines dort vorgelegten, maßanalytischen Standardreagenzes
(Maßlösung oder Titrator) unterschiedlicher Konzentration (Mikro-Reaktor-Titer) quasi
simultan durchgeführt. Dazu wird das betreffende Titrationsmittel (Standardreagenz,
Maßlösung) in genau abgemessenen, stöchiometrischen Mikro- oder Nano-
Äquivalenten in geeignet geformte isolierte Mikro-Containments oder Mikro-Reaktoren
oder in miteinander verbundenen Mikro-Reaktionsräumen zusammen mit einem
geeigneten optischen Äquivalenzpunkt-Indikator immobilisiert. Wenn jeder dieser
Mikroreaktoren (als Titrationsvolumen) mit der gasförmigen oder flüssigen Probe
beispielsweise über eine Mikro-Kapillar-Pipette im darüber befindlichen Probennahme-
Modul in Verbindung steht, genügt ein kurzes, zeitlich unkritisches Eintauchen in die
flüssige oder gasförmige Probe, damit ein genau definiertes und bekanntes Proben-
Aliquot durch Kapillarkräfte und/oder Diffusion und/oder der Schwerkraft in den
Mikroreaktor gelangt, wo er mit einer genau bekannten Menge des Titrators reagiert.
Erfindungsgemäß ist es äußerst wichtig, daß die Probennahme-Pipetten im
Probennahme-Modul auf der Seite der Mikro-Titrationsräume während der
Probennahme (Kontakt mit der Probe) verschlossen sind, weil nur so eine hochgenaue
Dosierung möglich ist. Dies wird erfindungsgemäß im einfachsten Fall durch sich selbst
auflösende Membranen bewerkstelligt aber auch mikromechanische Ventile oder
Lösungen mittels Schutzmembranen für die maßanalytischen Reagenzien, die mittels
Dorn gezielt geöffnet werden können, sind möglich (s. Abb. 1).
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Mikrosystems ist, daß durch
Kombination bestimmter, aufeinander konstruktionsmäßig hochgenau abgestimmter
Module beliebig komplexe Schnell-Test-Anordnungen zusammengestellt werden
können. Als Module kommen u. a. in Betracht: Probennahme-Modul mit einer oder
mehreren Mikropipetten gleichen oder variierbaren Inhalts, Probenvorbereitungs-Modul
in denen selektivitäts- und empfindlichkeitssteigernde Maßnahmen (u. a. auch
Amplifikationen mittels der PCR-Methode) durchgeführt werden können, Bio-Reaktor
Module, Oxidations-Module, Reduktions-Module, allgemeine Module zur Durchführung
von chemischen Reaktionen, Trenn-Module mit Filtern oder gasdurchlässigen
Membranen, Titrations-Module der unterschiedlichsten Versionen (kontinuierlich oder
diskontinuierlich), usw . . Diese Module passen konstruktionsmäßig genau übereinander
und sind beliebig kombinierbar, wobei erfindungsgemäß eingeplante Verschiebungen
untereinander Kanäle öffnen und schließen lassen (s. Abb. 2). Dabei können die
einzelnen Module in direktem Kontakt (planare Oberflächen) stehen; es können aber
auch dünne Spacer (z. B. aus Teflon o. ä.) als Dichtung dazwischen gelegt werden,
wodurch bei entsprechenden
Aussparungen auch weitere Verbindungskanäle zwischen den Modulen ermöglicht
werden.
Die einzelnen Funktions-Module des erfindungsgemäßen mikrochemischen Analysen-
Systems lassen sich geeignet zusammenfügen, aber auch getrennt verwenden.
Module, in denen kein chemischer Umsatz mit dort immobilisierten aber inzwischen
verbrauchten Reagenzien stattfindet, können nach Durchspülen von wenigen mL
Reinigungsmittel (meist Wasser) auch wiederverwendet werden. Wegen der großen
Variationsbreite der zusammenstellbaren maßanalytischen Analysenverfahren können
die einzelnen Module in großen Stückzahlen preiswert produziert werden.
Falls dazu als Probenahme-Modul ein Array von Mikro-Reaktoren mittels einer
einheitlichen, selektiven maßanalytischen Reaktion aber mit unterschiedlichen Mengen
des Titrators (Reagenz, das mit dem Analyten selektiv reagiert) versehen, verwendet
wird, sind bei Verwendung der üblichen Äquivalenzpunkts-Indikatoren (s. V. Schmidt,
W.D. Mayer, Analytiker-Taschenbuch Band 2, S. 207, Springer-Verlag, Berlin-
Heidelberg-New York 1981 und Band 3, S. 37,1983) alle Mikro-Reaktoren im sog.
Titrations-Modul, bei denen der Analyt in einem stöchiometrischen Unterschuß
vorhanden ist, anders gefärbt, als jene, bei denen der Titrator stöchiometrisch im
Unterschuß vorliegt. Da durch Verwendung von Kapillar- oder Mikropipetten die
Probenmenge bekannt ist, ebenso die unterschiedlichen Äquivalenzmengen des
Titrators in den einzelnen Mikro-Reaktoren oder Kanalstrecke, liegt die
Analytkonzentration konzentrationsmäßig genau zwischen den Mikroreaktoren
zwischen denen der Indikator umschlägt. Durch die moderne Technologie der
photolithographischen Verfahren der Mikrosystemtechnik sind sowohl genaueste
Mikropipetten wie auch Mikroreaktoren mit genau kontrolliertem Volumen einfach und
preiswert herstellbar.
Da es sich hier wegen der Verwendung stabiler maßanalytischer Reagenzien um eine
Absolutmethode handelt, kann bei konstanter und bekannter Proben-Aliquotisierung
jedem Mikroreaktor oder jedem Streckenpunkt eines Mikroreaktions-Kanals ein
Analytkonzentrationswert in beliebigen Einheiten (Mol/L, g/L, %, ppm, mg/dl etc.)
zugeordnet werden. Erfindungsgemäß werden die Mikroreaktoren in einer geeigneten
logisch durchschaubaren Anordnung mittels der modernen Methoden der
Mikrosystemtechnik unter Einhaltung einer hoher Abmessungsgenauigkeit hergestellt.
Geeignete Herstellungsverfahren für die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
sind vor allem alle photolithographischen Produktionsverfahren, bei denen die Größe
der Mikro-Pipette und/oder des Mikro-Reaktors genau vorgegeben werden kann, bzw.
auch graduell unterschiedliche Abmessungen im Promille-Bereich leicht herstellbar
sind. Hierzu zählt erfindungsgemäß die bekannte Silizium-Technik, die durch die
verschiedensten, dem Fachmann bekannten Prozesse, Mikro-Reaktoren beliebiger,
aber genau kontrollierter Volumina auch in großen Massen mit den geringsten
Streuungen herstellen kann. Das gleiche gilt für die LIGA-Technik, die nicht auf Silizium
beschränkt ist, sondern auch preiswerte Spritzgußlösungen in Kunststoff ermöglicht.
Bei Dosiergenauigkeiten im Prozent-Bereich kann dazu auch die sog. Dickfilmtechnik,
die auf einer Siebdruckbasis aufbaut, verwendet werden.
Erfindungsgemäß läßt sich der Meßbereich einer solchen Test- und
Analysenvorrichtung dadurch festlegen, daß im Titrations-Modul entweder eine Reihe
graduell unterschiedlich großer Mikro-Reaktoren mit genau bekanntem Volumen
hergestellt werden, die dann herstellermäßig mit einer einheitlichen Konzentration des
Titrators gefüllt werden oder Mikro-Reaktoren einheitlicher und bekannter Größe (Füll-
Volumen) werden mit unterschiedlich konzentrierten aber bekannten Titrator-Füllungen
versehen (was herstellungsmäßig aufwendiger ist) oder Kombinationen von beiden.
Da die erfindungsgemäßen Technologien der Mikrosystemtechnik Mikro-Reaktoren
einheitlicher Form aber unterschiedlichem Inhalts in einem Arbeitsschritt herstellen
können, sind diese Herstellungsmethoden (Silicium- und LIGA-Technologie)
besonders vorteilhaft, weil dann der Füllprozeß mit dem Titrator mit einer einzigen,
geeigneten Reagenzien-Mischung (Titrator, Hilfsreagenzien, Indikator(en) und
Stabilisatoren) erfolgen kann. Bei der erfindungsgemäßen Version, die auf dem
Ausmessen einer Strecke in einem Mikroreaktions-Kanal beruht, können natürlich die
Abmessungen des Kanals in Laufrichtung auch variiert werden, was zu besonders
großen Erfassungsbereichen führt.
Wird konstruktionsmäßig dafür Sorge getragen, daß das Proben-Aliquot im
Mikroreaktions-Kanal in zwei Vorzugsrichtungen diffundieren kann (kontinuierliches
Titrations-Modul), so ergeben sich besonders vorteilhafte Lösungen für eine Multi-
Analyt-Anordnung. In diesem Fall können mehrere unterschiedliche maßanalytische
Lineartitrations-Vorlagen für unterschiedliche Analyte beispielsweise in einer Reihe
teststreifenähnlich untergebracht werden. Die gemeinsame Probe dringt nach dem
Ausführungsbeispiel der Abb. 3 nach der parallelen Probennahme mittels einer
schlitzförmigen Kapillare (7) in die darunter befindliche Präzisions-Kanalzone (8), wo
die unterschiedlichen Analyt-Abfang- und Indizierungsreagenzien mit einem genau
kontrollierten und bekannten Strecken-Titer vorliegen. Hier diffundiert das Proben-
Aliquot in beiden Kanal-Längs-Richtungen, wobei der Analyt durch das dort
immobilisierte Maßreagenz titriert wird. Je nach der vorliegenden Analyt-Konzentration
ergeben sich dadurch mehr oder weniger breite Zonen, die durch einen Indikator
unterschiedlich zum anderen Streckenabschnitt angezeigt werden. Bei
erfindungsgemäßen Multi-Test-Streifen nach dieser Methode müssen zur quantitativen
Auswertung nur noch die unterschiedlich breiten Anfärbezonen der unterschiedlichen
Analyte streckenmäßig vermessen werden, was beispielsweise mit Barcode-Lesern
geschehen kann. Letzterer kann auch die Analyt-Kodierung (9) auslesen.
Erfindungsgemäß ist aber auch ein umgekehrtes Vorgehen möglich, d. h. der Titer einer
Mikro-Reaktionskammer (Mikro-Reaktoren gefüllt mit konstant gehaltenen Mikro-
Äquivalenten) im Titrations-Modul wird konstant gehalten und die Größe der getesteten
Probe wird im Probennahme-Modul entsprechend graduell in bekannten
Volumenschritten variiert, was dem maßanalytischen Äquivalent einer Titration einer
bekannten Menge "vorgelegter" Standardlösung mit der Probelösung entspricht. Am
Endpunkt, d. h. beim Umschlagpunkt des geeignet gewählten Indikators liegen chemisch
äquivalente Mengen von Analyt und maßanalytisches Reagenz vor, die eine
Absolutbestimmung erlauben.
Der große und entscheidende Vorteil der neuen erfindungsgemäßen Klasse von
Analysentechniken liegt darin, daß Meßsignal-Beeinflussungen durch
Intensitätsbeeinflussungen anderer Art (matrixbedingte Signalbeeinflussungen etc.), die
üblicherweise die Konzentrationsinformation: Signalintensität verfälschen, hier
unerheblich sind. Üblicherweise erfolgt der deutlich sichtbare Umschlag des jeweils
verwendeten Indikators genau zwischen zwei Mikroreaktoren, deren
Äquivalenzkonzentration genauestens bekannt ist. Der Gehalt der Probe an Analyten
muß also genau dazwischen liegen, was man durch eine entsprechende,
unveränderlich dort angebrachte Skalierung (Mittelwert von beiden) auch vereinfachen
kann.
Vorteilhaft ist auch, die Mikro-Reaktoren im Titrations-Modul in einer Reihe zu- oder
abnehmender Füllvolumina bzw. Mikro-Äquivalente anzuordnen, weil dann bei einem
gleichbleibenden Abstand zwischen zwei benachbarten Mikro-Reaktoren die
Auswertung übersichtlicher wird und auf das Ablesen einer Strecke oder einer daneben
aufgedruckten Skala hinausläuft.
Erfindungsgemäß ist es unerheblich, ob die einzelnen Mikro-Reaktoren sich berühren
oder nicht; eine kontinuierliche Volumenvergrößerung von grabenartigen Hohlräumen
genauester Abmessungen gestattet so u. U. genauere Ablesungen. Die geometrische
Form dieser Mikro-Gräben ist dabei unerheblich. So kann man bei einer linearen Form
beispielsweise thermometer-ähnliche Vorrichtungen erhalten; bei einer kreisförmigen
Anordnung eher uhr-ähnliche. Die Grabendimensionen liegen eher im Mikrometer- denn
im Millimeterbereich. Die Abb. 6 verdeutlicht eine bevorzugte Ausführungsform in
Papiertechnologie. Der oberere Teil zeigt in Papier gelegte Diffusions-Reaktions-
Kanäle unterschiedlicher Breite aber mit konstantem Flächen-Titer des
maßanalytischen Reagenzes.
Erfindungsgemäß liegt ein echtes modulares Mikrosystem vor, das entsprechend
miniaturisiert ist und auch in die Bereiche der Ultra-Mikro-Analyse eindringen kann. Bei
chemischen Umsetzungen im Mikroliter und Nanogramm Maßstab werden, verglichen
mit der gängigen Laborpraxis, Chemikalien um den Faktor ca. 1 Million eingespart,
entsprechend gering ist auch die Abfallbelastung. Wegen des Fortfalls gründlicher
Gefäßreinigungs-Schritte werden auch weniger Spülmittel pro Analyse verbraucht.
Bei einer extremen Miniaturisierung des Mikrosystems erreicht man eine Grenze der
Ablesbarkeit mit dem bloßen Auge. Hier wird erfindungsgemäß ein einfaches
Auswertgerät benutzt, daß den Titrations-Modul stark vergrößert darstellen kann. Eine
vorteilhafte Anordnung entsteht dadurch, daß man eine stark vergrößernde Projektion,
ähnlich einem Hand-Dia-Betrachter, durchführt. Da es nur auf die Stelle und/oder
Position des Indikator-Umschlages ankommt, können dazu auch einfache, mit
Tageslicht arbeitende Vorrichtungen verwendet werden.
Es können sämtliche bekannten Testvorrichtungen der Trockenchemie auch in der
erfindungsgemäßen Version einer Art absolut messenden, linearen Titration(vorrichtung)
umgewandelt werden. Dazu muß nur der Analyt durch steigende und
äquivalente Mengen eines Reagenzes gebunden oder aus dem Lösungsgleichgewicht
entfernt werden, was die Farbreaktion mit dem jeweiligen Anfärbe-Cocktail verhindert.
So lassen sich beispielsweise Metallkationen bei einem geeigneten pH-Wert
(immobilisierter Puffer) durch das bekannte Reagenz Ethylendiamintetraessigsäure
(EDTA) so stark komplexieren, daß der betreffende selektive Anfärbe-Cocktail der
Trockenchemie keine Anzeige erbringt. Erst nach Überschreiten einer der
Analytkonzentration in der Probe entsprechenden Mikro-Äquivalenz-Menge liegt das
Metallkation wieder frei im Lösungsgleichgewicht vor und ab diesem Mikroreaktor sind
alle weiteren mit geringeren Äquivalenzmengen an Komplex-Standardmittel in Sinne
der Trockenchemie unterschiedlich stark angefärbt. Letzteres läßt sich gegebenenfalls
bei einer reflexionsphotometrischen Auswertung auch zu einer Extrapolationsmethode
zur genauen Endpunktsermittlung ausnutzen.
Die Übertragung der vorliegenden Erfindung des kontrollierten Immobilisierens
maßanalytischer Reagenzien auf die klassische Trockenchemie der Teststreifen erlaubt
dort eine neue Art von Auswertung durchzuführen. Durch die Immobilisierung von
Analyt-Abfang-Reagenzien lassen sich Analysen gemäß der bekannten Methode der
Standard-Subtraktion durchführen; während die Immobilisierung des Analyten selbst zu
der Methode der Standard-Addition führt. Beide Auswertmethoden haben sich in der
instrumentellen Analytik im Spurenbereich und beim Vorliegen komplexer Matrices
bestens bewährt, weil sie die Möglichkeit systematischer Fehler stark einengen.
Es lassen sich bestimmte Anionen dadurch quantitativ erfassen, daß in den Mikro-
Reaktoren unterschiedliche, aber genau bekannte Metallkationen-Mengen, die mit dem
Anion einen schwerlöslichen Niederschlag bilden, mit dem zugehörigen
Anfärbereagenzien eingebracht werden.
Die neuen, verschiedenen, erfindungsgemäßen Analysentechniken kann man als
pseudo-eindimensional bezeichnen, da die immobilisierten Moleküle des selektiven
Analytabfängers und des Analyt-Anzeigers zwar einen dreidimensionalen Raum
einnehmen, aber nur die Ausdehnung einer Dimension (= markierte Strecke) oder die
Lokalisation der der Analytkonzentration entsprechenden Äquivalenzmenge an Titrator
meßtechnisch ausgewertet wird, was beispielsweise über eine dort angebrachte Skala
analog der Ablesung einer Quecksilbersäule in einem Thermometer oder Barometer
oder einer Uhr bei kreisförmiger Anordnung geschehen kann.
Einen besonders großen dynamischen Meßbereich erhält man, wenn man die mögliche
Genauigkeit der Maßanalyse voll ausnutzt und um die 1000 Mikro-Reaktoren mit den
dazugehörigen Mikro-Pipetten in einer zweidimensionierten, planaren Anordnung (z. B.
in 30 Reihen und 30 Spalten im Scheckkartenformat) unterbringt. Hier kann die
maßanalytische Reagenzpositionierung und damit Graduierung auch so verlaufen, daß
beispielsweise waagerecht größere Konzentrationssprünge zwischen den einzelnen
Mikroreaktoren vorliegen und die in vertikaler Anordnung befindlichen diese größeren
Sprünge in kleineren Sprüngen unterteilen. Dies ist natürlich auch in beliebigen
anderen geometrischen Formgebungen möglich, so z. B. auch radial, sternförmig. Die
Mikrosystemtechnologie erlaubt beispielsweise hier auch dreidimensionale Gebilde
z. B. Würfel mit jeweils zweidimensionaler Anordnung der betreffenden Mikro-
Reaktoren-Arrays. Hierdurch lassen sich durch die 6 Seiten eines Würfels im Prinzip
auch leicht 6 Konzentrationsdekaden eines Analyten überstreichen. Herstellungsseitig
wird man bei gleichbleibender Volumengraduierung der Mikro-Reaktoren pro
Würfelseite hier vorteilhafterweise pro Seite die Konzentration der maßanalytischen
Füll-Lösung entsprechend dem gewünschten dynamischen Meßbereich verändern. Bei
Anwendungen dieser neuen Mikrotitrationsmethode in Fällen, wo der zu erwartende
Konzentrationsbereich des Analyten nur in bestimmten Grenzen variiert, wie
beispielsweise in der klinischen Analytik, kann man natürlich die Anzahl der Mikro-
Reaktoren entsprechend der gewünschten Ablesegenauigkeit wählen und so z. B. mit
weit weniger als 100 Mikroreaktoren, die bezüglich der dort immobilisierten Mikro-
Äquivalente dem erwarteten Bereich entsprechen, auskommen. Dies entspricht einer
Lokalisationsgenauigkeit im festgelegten Bereich von 1%.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt, wie oben gezeigt, auch die quantitative
Bestimmung mehrerer Analyte. Bei Multi-Analyt-Anordnungen bestimmen die
bekannten analyterkennenden Reagenzien oder -gemische (s. Trockenchemie) die
Selektivität und ihre Anordnung auf oder in dem Träger eine Reihenfolge der
Streifenposition auf dem Träger, die aussagt, um welchen Analyten es sich handelt und
die jeweilige gefärbte oder ungefärbte Strecke oder die Position (digital) sagt aus,
welche Konzentration des betreffenden Stoffes aktuell in der Probe vorliegt. Auch hier
sind erfindungsgemäß lineare, planare und dreidimensionale Anordnungen von Mikro-
Reaktor-Arrays möglich.
Eine derartige Anordnung kann bei einer Markierung, die durch elektromagnetische
Strahlung erfaßbar ist, vorteilhaft, schnell und sicher auch mittels eines geeigneten sog.
Barcode-Lesers, der ja nur die unterschiedlich gefärbten Bereiche erfassen muß,
automatisch in absoluten Konzentrationseinheiten vermessen werden. Hier zählt der
Barcode-Leser eigentlich nur die Anzahl der Mikro-Reaktoren bis zum Äquivalenzpunkt-
Reaktor ab, was auf eine absolute, digitale (Anfärbung oder Farbumschlag: ja oder
nein) Analyse hinausläuft.
Dadurch, daß die absoluten Farbintensitäten der Indikatoren keine Rollle spielen, ist es
auch egal, ob evtl. ein Mikroreaktor im Bereich vor oder nach dem Äquivalenzpunkt
gestört ist oder nicht. Diese Bereiche der Mikro-Reaktoren stellen redundante Systeme
dar. Dies erhöht die Meßsicherheit ebenfalls wesentlich, verglichen zu den
traditionellen Teststreifen. Sogar gegenüber einer klassischen maßanalytischen
Titration ergeben sich entscheidende Vorteile: Man kann nicht übertitrieren und man
hat automatisch eine Endpunktsdokumentation. Ablese- und Übertragungsfehler
können ebenfalls weniger auftreten und die Titration ist schneller und mit bedeutend
weniger Reagenzien durchgeführt. Wenn erfindungsgemäß die neue Vorrichtung zur
Durchführung derartiger Titrationen preiswerter herstellbar ist als die Reagenzien für
die Makro-Titration einschließlich ihrer Entsorgung kosten, dann wird die Mikrotitration
die klassische verdrängen.
Erfindungsgemäß beinhaltet die vorliegende Umwandlung von
konzentrationsabhängigen Meßsignal-Intensitätsmessungen in eine eindimensionale,
skalierte Streckenmessung auch integrierte Trennoperationen. Für richtige quantitative
Analysen komplexer Stoffgemische (z. B. realer Proben aus dem Umwelt-, Medizin-,
Biochemie, Materialwissenschafts-, Produktionskontroll-Bereich) werden in der Regel
mehr oder weniger aufwendige Analysenverfahren verwendet. Viele beruhen auf einer
Kombination von komplizierten Trenn- und Bestimmungsmethoden.
Die hier beschriebene Erfindung löst generell all die dem Fachmann geläufigen
Probleme, in dem prinzipiell die jeweiligen Analytkonzentrationen nicht über
störanfällige Meß-Signal-Intensitäten sondern mit Hilfe einer vorzugsweise
eindimensionalen geometrischen Ausdehnung oder Positionsbestimmung einer
optisch erkennbaren Markierung auf einem Träger gemessen werden (Dimension des
Meßwertes: eine Längeneinheit (oder skalierte Position) oder bei konstanter
Relativbewegung zu einem Signal-Ausleser: eine Signaldauer = Zeiteinheit). Die
optisch erkennbare Zone wird, wenn der Analyt keine spezifische, direkte, optische
Wechselwirkung erlaubt, durch Reaktion des Analyten mit einem geeigneten, analyt
spezifischen Nachweis-Reagenz (Indikator) auf einem Träger erzeugt, wobei der Träger
dieses Reagenz immobilisiert enthält.
Die Analyse wird im Gegensatz zu den bekannten Teströhrchen für die Gasanalyse,
vorzugsweise auf planar aufgebauten Trägern durchgeführt, die wie eine Scheckkarte
oder ein Papier-Teststreifen aufgebaut sind und einen schichtenförmigen Aufbau,
vorzugsweise eine laminatförmige Struktur haben; jedoch sind auch andere
geometrische Formen (z. B. schalen- oder röhrenförmig, oder kreis-, spiral- oder kugel-
bzw. würfelförmig) möglich. Ebenso ist es erfindungsgemäß unerheblich, ob auch
andere geometrische Formen (wie Kreise, Punkte, Keile etc.) für die optische Abfrage
(Meßsignal = Ausdehnung) benutzt werden. Gegenüber den bekannten Gas-
Prüfröhrchen, die meistens auf einer durchsichtigen gefüllten Säule beruhen, die mit
einem Trägermaterial gefüllt sind und auf dessen Oberflächen sich ein analytselektives
Reagenz befindet, besitzt die erfindungsgemäße Vorrichtung lage- und
positionsabhängig, extrem exakt dosierte Titratoren und/oder Analyt-Abfangreagenzien
und eine integrierte Proben-Aliquotisierung durch die Mikro-Pipette, die
erfindungsgemäß mit der Silizium- oder LIGA-Technologie zusammen und in einem
einzigen Arbeitsschritt hergestellt werden. Die Dosierung und Positionierung des
maßanalytischen Reagenzes ist bei der traditionellen Gasprüfröhrchen-Art (K.
Leichnitz, Analytiker-Handbuch, Band 1, S.205, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New
York 1980) nicht mit der Genauigkeit möglich, die die Mikrosystemtechnik inzwischen
bietet. Auch werden hier nicht immer stabile maßanalytische Reagenzien verwendet.
Die progressiv ansteigenden Ketten von Mikro-Reaktionsräumen lassen sich in den
verschiedensten Technologien anfertigen. Bei einer Ausführungsvariante aus Papier
beginnt der laminatförmige Aufbau beispielsweise mit einem empfindlichen und
spezifischen Indikator, der bei Anfärbung generell die Anwesenheit des betreffenden
Analyten anzeigt. Auf diesem Indikator-Papierstreifen werden in bestimmten Abständen
steigende Mengen eines Abfangreagenzes, welches in der Makro-Labor-
Titrationsversion dem Titrator (Titrationsmittel mit bekanntem Titer) entspricht,
immobilisiert. Dies kann wiederum auf die unterschiedlichste Art und Weise geschehen.
So kann man beispielsweise die Konzentrationen des selektiven Abfangreagenzes in
einem trocknungsfähigen Gel sukzessive, von Mikro-Reaktionsraum zu
Mikroreaktionsraum, erhöhen und die Begrenzungen dieser Räume durch eine der
Siebdrucktechnik entliehenen Weise festlegen. Man kann bei dieser sog.
Dickfilmtechnik aber auch steigende Mengen der zu immobilisierenden Komponente
durch einen mehrfachen Druckvorgang aufbringen. Als Abschluß wird eine
durchsichtige Lage eines auch abdichtenden Stoffes über die Reihe der Mikro-
Titrations-Räume gelegt. Dies kann beispielsweise auch durch einen kompletten
Einschluß des so vorbereiteten Teststreifens in eine wärmepolymerisierbare Folie
(Prinzip der ID-Karten oder Ausweise) geschehen.
Eine weitere Variante dieser seriellen Mikro-Titrationsart besteht erfindungsgemäß nur
aus einer gleichbleibenden Immobilisierungsdichte des analyt-spezifischen Reagenzes
(Titrator) über die gesamte ausgedehntere Analyt-Indikator-Zone. Bei einer
kontrollierten Schichtdicke und einem diffusionskontrollierten Eindringen des Analyten
durch gegebene Öffnungen in der äußeren Abdeckfolie bewegt sich die Probenlösung
aufgrund von Kapillarkräften in dieser Schicht des immobilisierten Anfangreagenzes
und wird dabei sukzessive titriert (genauer: rücktitriert, da zunächst der Überschuß des
Titrators durch die eindiffundierende Analytmenge beseitigt werden muß), wobei dann
die Strecke des Analyt-Überschusses wegen des Indikators eine Anfärbung zeigt.
Eine andere Technologie kann beispielsweise auf der LIGA oder Silizium-Technologie
beruhen. Mittels beider Technologien lassen sich Mikro-Reaktionsräume Mikro-
Reaktoren mit höchster geometrischer Genauigkeit und Reproduzierbarkeit in
beliebigen Anordnungen herstellen. Bei der Vorgabe exakter Reaktionsvolumina kann
man beispielsweise als Alternative zu variierenden Immobilisierungsdichten die
Abmessungen der Mikro-Reaktoren progressiv vergrößern, was bei einer
gleichbleibenden Fülldichte mit dem analyt-spezifischen Abfangreagenz (Titrator) zu
steigenden dort immobilisierten Mengen führt. Die eigentliche Form dieser Mikro-
Reaktoren ist unwichtig, solange das Eindiffundieren der Probe nicht zu stark beeinflußt
wird. So können es beispielsweise rechteckige, runde oder kugelförmige Vertiefungen
(Mikro-Kavities) in Kunststoffen (z. B. Plexiglas, PET, PE etc.) sein, die besonders
vorteilhaft mit der LIGA-Technik (H. Lehr, W. Ehrfeld, J. Phys.IV (1994), 4 (C91229))
produziert werden; es können aber auch sog. Containments sein, die üblicherweise als
Hohlräume in Silizium geätzt worden sind. Vorteilhafte Ausführungsformen sind
natürlich in linearer Anordnung dieser progressiv reagierender Mikro-Reaktoren
aufgebaut, was die Ablesung analog einem LED-Array sehr erleichtert.
Wenn erfindungsgemäß die Ermittlung von Stoffkonzentrationen nicht über die
Intensitäten sondern über eine Streckenmessung erfolgt, dann ist, wie oben bereits
erwähnt, die Farbe und die intensitätsmäßige Konstanz dieser spezifisch angefärbten
Zone unerheblich; die Farbintensität bestimmt eigentlich nur die Empfindlichkeit, mit der
Anfang und Ende der Meßstrecke erkannt werden können. Schwankungen in der
Beleuchtung (Lichtquelle), die zur Abmessung der optisch markierten Strecke
verwendet wird, sind im Gegensatz zu den bekannten optischen Auswertemethoden
hier ohne größeren Einfluß auf das Ergebnis der Messung (Meßwert = Strecke).
Die Erfindung betrifft also ganz allgemein insbesondere die Umsetzung einer
analytkonzentrationsabhängigen Lichtintensitäts-Messung (Photometrie: Absorption
oder Reflexion; Fluorimetrie) in die einer Ausdehnungsmessung. Barcode-ähnliche
Anordnungen erlauben dann einfache und schnelle Simultan-Messungen der
unterschiedlichsten Analyte, wobei alle bekannten optischen Anzeigeverfahren der
betreffenden Chemo- und Biosensoren vom Fachmann erfindungsgemäß umgesetzt
werden können. Die Position des optisch markierten Streifens bestimmt die Stoffart
(qualitative Analyse) und die angefärbte oder nicht angefärbte Strecke ist
konzentrationsproportional (quantitative Analyse). Erfindungsgemäß ist die Ablesung
der maßanalytischen Äquivalenz-Konzentration nicht nur auf den sichtbaren Bereich
des elektromagnetischen Spektrums begrenzt. Erfindungsgemäß können auch weitere
Äquivalenz- (Endpunkt) Bestimmungsmethoden verwendet werden. So läßt sich
beispielsweise dies elektrochemisch mittels eines einzeladressierbaren Elektroden-
Arrays, das mit einer planaren Mikro-Reaktor-Anordnung in Berührung gebracht wird,
durchführen.
Die vorliegende Erfindung kann mit oder ohne eine integrierte Trennungsoperation
umgesetzt werden. Vorbild für eine Ausführungsvariante der Erfindung mit Trennung
sind alle Arten der Dünnschicht-, Papier-, Gel-, Affinitäts-Chromatographie sowie die
verschiedensten trägergebundenen elektrophoretischen Verfahren. Dort weiß der
Fachmann, daß u. U. auch die Ausdehnung eines Substanzflecks als ungefähres Maß
für die vorliegende Menge (Konzentration) herangezogen werden kann. Um diese
Chromatographie-Arten allerdings durch einen einfachen Barcode-Leser (Ja oder Nein
Entscheidung; nicht gefärbt - gefärbt) ablesbar zu gestalten muß die Diffusion des oder
der Analyten in Richtung quer zur Strömungsrichtung der mobilen Phase verhindert
werden. Dies geschieht erfindungsgemäß mittels effektiver Diffusionssperren. Geeignet
dazu sind alle Materialien, in denen der Diffusionskoeffizient gegenüber dem in
Flüssigkeiten vernachlässigbar ist. Dies ist im allgemeinen bei Festkörpern der Fall.
Erfindungsgemäß läuft daher eine Chromatographie, die mit Barcode-Lesern
auswertbar ist, in fest vorgegebenen, zweidimensionalen Betten (oder Kanälen)
konstanter Vertiefung, in denen sich die stationäre Phase befindet, ab.
Bei multiplen Kanälen für die Mehrfachanalyse, die parallel angeordnet sind, müssen
sich die seitlichen Begrenzungen gut oberhalb der Oberfläche der stationären Phase
befinden, damit kein "Überkriechen" der mobilen Phase in benachbarte Trennstrecken
stattfindet. Die geometrische Form der chromatographischen Kanäle ist weniger
bedeutsam. Bewährt haben sich halbkreisförmige, ovale, V-förmige, trapez- und
rechteckförmige Vertiefungen (Kanäle) gleichbleibender Tiefe auf den
unterschiedlichsten Trägermaterialien (z. B. Glas, Keramik, Silizium, Kunststoff, Metall,
etc.), die mit den gängigen und bekannten chromatographischen stationären Phasen
(fast) dünnschicht-chromatographie-artig gefüllt sind. Je kleiner die Kanäle sind, umso
mehr können auf einem Träger mit gegebenen Abmessungen untergebracht werden.
Daher sind Mikrokanäle mit Abmessungen im Mikrometerbereich sinnvoll. Nach einer
bestimmten, matrixabhängigen Auftrennstrecke, die mittels bekannter, der Trennung
förderlicher Materialien gefüllt ist, folgt erfindungsgemäß der Übergang zu einem Mikro-
Kanal oder -graben, dessen geometrische Abmessungen im Sinne der Erfindung
reproduzierbar und bekannt variieren, so daß dort unterschiedliche Mengen eines
Analyt-Titrators oder -Abfängers zusammen mit dem Anzeige-Cocktail (Indikator)
immobilisiert werden können. Bei längeren Trennstrecken kann die durch die Kapillar-
Mikro-Pipette gezogene Probenmenge nicht ausreichen, nach der Trennzone die
Bestimmungszone zu erreichen. In diesem Fall wird die Testvorrichtung nach dem
Abstreifen einer Benetzungsschicht in eine Lösung getaucht, die dann die
chromatographische mobile Phase darstellt. Letztere wird vorzugsweise durch reine
Kapillarkräfte zur Bestimmungszone transportiert. Dort wird der von den anderen
Bestandteilen getrennte Analyt wie zuvor beschrieben zweidimensional titriert
(Quantifizierungszone für die Absolutbestimmung). Da der Analyt hierbei den mit dem
Titrator gefüllten Mikro-Kanal waagerecht durchströmt, kann bei ähnlichen Analyt-
Konzentratinen auch mit einem gleichbleibenden Querschnittsvolumen gearbeitet
werden. Erst wenn der Analyt auf seinem Weg vollständig mit dem dort fixierten Titrator
reagiert hat, ist er mit dem selektiven Anfärbe-Cocktail nicht mehr anfärbbar. Folglich
kann auch die Dünnschicht-Chromatographie erfindungsgemäß in eine einfach
abzumessende Absolut-Methode umgewandelt werden.
Pro Chromatographie-Kanal kann eine Analyse durchgeführt werden und wegen der
standardisierten Herstellungsbedingungen der Mikrosystemtechnik können auch mehr
Kanäle für Multi-Analyt-Messungen mittels geeigneter Trenn- und Bestimmungszonen
leicht und preiswert in Massen produziert werden. Dies führt erfindungsgemäß zu
einem neuartigen, miniaturisierten Multi-Analysensystem, das die traditionelle
Dünnschicht-Chromatographie bezüglich der Anzahl Analysen pro Fläche und
bezüglich der Genauigkeit und Auswertungs-Einfachheit wesentlich erweitert.
Die Kanal-Länge ist durch die Abmessungen des Trägers bestimmt und liegt im Bereich
weniger Zentimeter (vorzugsweise 1 bis 20 cm). Wenn der Träger dieser Trennstrecken
Silizium ist, lassen sich mittels der bekannten Techniken der Mikro-Elektronik eine
extrem hohe Anzahl an engen vorzugsweise parallelen Kanälen (durch
Photolithographie und anisotrope Ätzung) sehr einfach und gleichmäßig erzeugen. Bei
Kunststoff-Trägern kann die bekannte LIGA-Technik angewandt werden, die ähnliches
ermöglicht. Quarz, Glas, Metall und andere Festkörper lassen sich aber ebenso durch
bekannte Techniken entsprechend ritzen oder ätzen. Es sind aber auch kreisförmige
Kanal-Anordnungen möglich. Theoretisch lassen sich so pro Zentimeter Trägerbreite
weit über 10 Parallel-Analysen durchführen (vergl. Schallplattenrillendichte).
Erfindungsgemäß muß sich bei nicht-elektrophoretischen Trennungen die Korngröße
der stationären Phase dem Kanalquerschnitt anpassen. Kanäle im Mikrometerbereich
verlangen zur optimalen Funktion eine nanopörose stationäre Phase. Die Kanäle
können oben offen oder aber auch abgedeckt betrieben werden. Bei einer dichten
Abdeckung füllt die stationäre Phase zeckmäßigerweise den gesamten aus dem Kanal
und der Abdeckung gebildeten Hohlraum aus. In einer weiteren Ausführungsform löst
die mobile Phase die auf der Innenseite der Abdeckung befindlichen Substanzen zum
Stoff-Nachweis auf und verteilt sie durch Diffusion über den gesamten Querschnitt.
Vorteilhaft ist, wenn sich der Bereich mit dem immobilisierten, analytanzeigenden
Reagenz und dem Titrator am Ende der Trennstrecke befindet, weil dann die
Abtrennung von Störkomponenten gegeben ist. Wichtig ist erfindungsgemäß, daß sich
die Zone mit dem aufgetrennten Analyten durch die Reaktion mit diesen Reagenzien
vom Untergrund abhebt. Bei analyt-spezifischen Reagenzien kann auf eine vollständige
Auftrennung verzichtet werden und man kann die Quantifizierungszone nach vorne
schieben, was die Analysenzeit reduziert.
Die Auswertung geschieht mit bloßem Auge an Hand einer Skala, die
herstellungsbedingt gegeben ist oder auch in einfachen barcode-ähnlichen Ablese-
Automaten: Entweder wird eine angefärbte Zone die Grundreflexion im Analysenkanal
konzentrations-abhängig verändern. Es können u. a. aber auch fluoreszierende Zonen
(aktive Fluoreszenz) oder umgekehrt Zonen mit ausgelöschter Fluoreszenz (negative
Fluoreszenz) vermessen werden.
Erfindungsgemäß können je nach der ungefähr bekannten Laufzeit und Laufstrecke
eines Analyten dort lokal auch unterschiedliche Anfärbe-Chemikalien für den oder die
Analyten (auch biochemischer Art: enzymatisch oder immunologisch) bereitgehalten
werden. Dies erhöht die Vielseitigkeit und Selektivität beträchtlich.
Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich von der klassischen
Chromatographie bzw. Elektrophorese bezüglich seiner Durchführung mittels eines
Laufmittels bzw. Elektrolyse in einem geeigneten Elektrolyt-Puffer mit oder ohne
"Entwicklung" oder "Fixierung" der Trennstrecke nicht. Die Durchführung der
Trennungen wird allerdings erheblich durch den Fortfall der Entwicklung beschleunigt
und vereinfacht. Die Reagenz-Zugabe erfolgt erfindungsgemäß wesentlich genauer
dosiert, was Vorteile bei der Materialeinsparung und in umwelt-relevanter Hinsicht
bringt. Die gesteigerte Kapillarwirkung bei engen Kanälen erhöht die
Strömungsgeschwindigkeit des Laufmittels und verkürzt dadurch die Analysenzeit
beträchtlich.
Durch standardisierte Herstellungsbedingungen lassen sich Trenn-Kanal-Träger
herstellen, bei denen im Falle ebenfalls standardisierter Anwendungsbedingungen die
zu bestimmenden Stoffe stets als mehr oder weniger ausgedehnte Zone an einer
bestimmten Stelle vom Startpunkt entfernt auftreten. Ein Barcode-Leser, der für den
bekannten optischen Effekt (Untergrundabhebung durch Anfärbebereich)
empfindlichkeitsmäßig optimiert ist, erhält nach einem Startsignal bei konstanter
Streckenabtastgeschwindigkeit (Scan-Rate) ein weiteres Signal, dessen
Zeitverzögerung für die Stoffart steht und dessen Zeitdauer (Streifenbreite) von der
Konzentration des Analyten abhängt. Weitere Anfärbe-Zonen entsprechen
weiteren/anderen Stoffen, die mit oder ohne zusätzlich selektivitätserzeugende
Reagenzien simultan vermessen werden können, wobei der zeitliche Beginn des
Meßsignals für die zu bestimmende Substanz steht und die Dauer (Strecke, mit
konstanter Geschwindigkeit abgescannt) für die Konzentration. Erfindungsgemäß kann
diese Auswertung auch in speziellen Meßgeräten durchgeführt werden, die die
Trennstrecken ähnlich schnell wie ein CD-Player an einem analogen optischen Reader
vorbeibewegt. Auf diese Weise lasen sich vor allem Träger mit vielen Trenn-Kanälen
sehr schnell vermessen. Bei circularen Trenn-Kanälen sind einem CD-Spieler sehr
ähnliche Geräteaufbauten, die in wenigen Sekunden Tausende von Analysen
auswerten, möglich. Kreisförmige Trenn-Kanäle erfordern allerdings insbesondere bei
der Elektrophorese spezielle Start- und Endzonen mit Elektrolytkontakt zur Übertragung
des elektrischen Feldes.
Zweckmäßigerweise optimiert man die parallel zu bestimmenden Stoffe nach dem
betreffenden Anwendungsfall. In der klinischen Chemie werden beispielsweise die sog.
Elektrolyte parallel bestimmt. Alternativ läßt sich beispielsweise Glucose mit Lactat,
Kreatinin, Harnstoff und Harnsäure simultan bestimmen, wenn beispielsweise als
Reagenz die betreffenden Oxidasen immobilisiert werden, die eine dem Analyten
stöchiometrisch entsprechende Menge Wasserstoffperoxid mittels des Co-Substrates
Sauerstoff erzeugen. Zur absoluten Konzentrationsbestimmung der
Wasserstoffperoxid-Menge wird diese erfindungsgemäß in Anlehnung an eine Redox-
Titration mit einem immobilisierten Reduktions- oder Oxidationsmittel "zweidimensional
titriert".
Eine weitere Variante der Erfindung lehnt sich mehr einer Auswertung über sog.
Barcode-Leser an und verzichtet ganz auf Trennoperationen. Hier wird
erfindungsgemäß eine barcode-lesbare konzentrationsproportionale "Streifenbreite"
durch eine vorgegebene geometrische Probenauftrags- oder -kontaktzone und ein
progressiv durchgeführtes Abfangen des Analyten oder seiner
konzentrationsproportionalen Reaktionsprodukte mit einem speziellen selektiven
Reagenz erzeugt.
Für eine kalibrationsfreie, absolute Analyse muß allerdings das aktuell analysierte
Aliquot der Probe konstant und bekannt sein. In diesem Fall ist dem jeweiligen Mikro-
Reaktor eine Mikro-Probenahme-Vorrichtung vorgeschaltet. Dies kann
erfindungsgemäß beispielsweise dadurch geschehen, daß beim Einbringen des
Barcode-Analyse-Teststreifens in die Probe eine präzise Mikropipette durch
Kapillarkräfte gefüllt wird und dann durch unterschiedliche Mechanismen das
Eindringen weiterer Probe verhindert wird. Dies kann durch die verschiedensten
Mikroventile (Aktuatoren) erfolgen, die elektrisch, magnetisch oder andersartig bewegt
werden können. Eine vorteilhafte, energiemäßig passive Form ist die einer
Rückschlagklappe am Mikro-Pipetten-Eingang, die dadurch geschlossen wird, daß eine
flüssige Probe eine zuvor dort stationierte aufquellende Substanz diese Klappe fest
abschließt. Bei gasförmigen Proben, die in der Regel auch größere Pipetten-Räume
benötigen, sind passive magnetische Ventile die mittels externer Magnetfelder von
außen gesteuert werden können, eine vorteilhafte Lösung. Wichtig ist erfindungsgemäß
nur, daß die jeweils aktuell untersuchte Probenmenge sehr genau bekannt ist und
durch die Graduierung in Mol-Bruchteilen mittels der immobilisierten Titratoren
kalibrationsfreie, absolute Konzentrations-Messungen möglich werden.
Zusammenfassend lassen sich folgende besonders vorteilhafte Varianten der Erfindung
aufzählen:
- a) Das Proben-Aliquot im Mikroliterbereich ist genauestens bekannt und konstant für jeden Mikro-Reaktor, der sich in unmittelbarer Nachbarschaft zur Pipette befindet. Die Graduierung der Maßlösung erfolgt durch unterschiedlich große und genauestens bekannte Volumina dieser Reaktoren. Die Füllung geschieht herstellmäßig einfach mit einer einzigen Maßlösung, die mit allen Hilfsreagenzien (spezifischer, analytselektiver Indikator, Maskierungsmittel, Puffer, Stabilisierungsmittel, etc.) versetzt ist. Die Immobilisierungsart, ob als Gel, Suspension oder später eintrocknende Flüssigkeit, ist unwesentlich.
- b) Das Proben-Aliquot im Mikroliterbereich ist genauestens bekannt, variiert aber durch eine geeignet konstruierte Vorrichtung in einer fein abgestuften Menge von bis zu 1/1000stel. In diesem Fall ist die Graduierung der Maßlösung (einschließlich Hilfsreagenzien, wie Indikator, Puffer, etc.) in der einzelnen Mikroreaktoren gleich und ebenso genauestens bekannt. Diese Variante entspricht einem umgekehrten Vorgehen wie unter a) beschrieben.
- c) Kombinationen aus a) und b) wobei bei gegenläufigen Graduierungen besonders große, erfaßbare Konzentrationsbereiche entstehen.
- d) Die Mikro-Pipetten können von den Mikro-Reaktoren getrennt werden, wodurch wiederverwendbare Vorrichtungen für diese Mikro-Maßanalyse entstehen. So läßt sich beispielsweise ein entsprechender Multi-Mikro-Pipetten-Block mit unterschiedlichen Volumina mit Injektionsöffnung herstellen, bei dem durch Injektion des Titrators (einschließlich des Indikators und Hilfsstoffe) alle Pipetten gefüllt werden und dann nach Aufsetzen auf die passig konstruierten Mikroreaktoren mit konstanter und bekannter Menge an Probe mittels einer Verschiebung von Spacer-Ventilen der Ausfluß der unterschiedlichen Titratormengen in die Reaktoren stattfindet.
- e) Der wiederverwendbare Mikro-Pipetten-Block nach d) nimmt die unterschiedlichen Probe-Mengen auf und die Titratormenge (einschließlich der Indikations- und Hilfsmittel) ist in den Mikro-Reaktoren konstant. Hierbei lassen sich titratorseitig besonders einfache Papier-Teststreifen herstellen, auf die der Multi-Mikro-Pipetten- Block einfach aufgesetzt wird und alle Ventile auf Einfluß der Proben-Aliquote in die Mikro-Reaktoren mittels eines einfachen Handgriffes geschaltet werden. Beim Wechseln von einer zur anderen Probe werden einfach einige mL zur Auswaschung der letzten Probe durch den Pipetten-Block gespritzt, wodurch alle Mikro-Pipetten auch automatisch gefüllt werden. Für den Titrator muß dann ein neuer Teststreifen verwendet werden. Teststreifen aus Papier werden bevorzugt mit den Methoden der Siebdrucktechnik strukturiert und mit Reagenzien versehen.
- f) Ein einziges Proben-Aliquot im Mikrolitermaßstab wird mit oder ohne chromatographische Vortrennung mittels Mikro-Kanäle, -kapillaren oder -gräben, die den Titrator mit einem genauestens bekannten Titer pro Strecke einschließlich aller notwendigen Indikatoren und Hilfsstoffe enthalten, quantifiziert.
- g) Bei radialer, sternförmiger Anordnung der Variante nach d) läßt sich bei einer Multi- Analysen-Anordnung der Probentransport durch Zentrifugalkräfte beschleunigen, was zu starken Zeiteinsparungen führt.
Allgemein kann festgestellt werden, daß jede Variante der Erfindung die bestehenden
Probleme der Teststreifen-Analytik und Maßanalytik (zu große Chemikalienmengen)
löst und daß für derartige absolut messende Schnelltests ein großer Markt existiert.
Eine besondere Variante ist auch bei der Analyse organischer Moleküle möglich, wenn
als Titrator entsprechende, nicht an der Bindungsstelle abgesättigte Antikörper-
Moleküle für den Analyten in Form von Mikro-Affinitätssäulen unterschiedlicher, aber
genau bekannter Kapazität verwendet werden. Hier entspricht die Durchbruchs-
Konzentration dem Äquivalenzpunkt. Als Indikator können dann u. a. die selektiven
Mischungen der Gasprüfröhrchen verwendet werden. Alternativ können auch Mikro-
Affinitätssäulen konstruiert werden, bei denen die dort eingebrachten
analytspezifischen Antikörper-Moleküle an den entsprechenden Bindungsstellen mit
einer derivatisierten Form des Analyten zu 100% abgesättigt sind, wobei aber der
eigentliche Analyt eine wesentlich höhere Affinitätskonstante als sein Derivat aufweist.
Erfindungsgemäß sollte der derivatisierte Molekülbereich des Analyten mittels
maßanalytischer Methoden erfaßbar sein. So läßt sich beispielsweise an das
Analytmolekül eine stabile Redox-Gruppe (z. B. Ferrocen, Ascorbat, Chinon, etc.) in
einheitlichem Redoxzustand kovalent anknüpfen. Diese Redox-Gruppe wird im Verlauf
der Parallel-Reaktion stöchiometrisch proportional zum Analytgehalt aus der Mikro-
Affinitätssäule verdrängt und kann dann wie oben erläutert durch entsprechende
Redox-Reagenzien in der Mikro-Reaktoren genauestens in Äquivalenten (Mol-
Einheiten) erfaßt werden. Natürlich läßt sich erfindungsgemäß die Affinitätssäule auch
mit der Mikro-Pipette vereinigen. Beispiel hierfür sind die sog. Capillary Fill Devices, die
mit einer nachteilhaften fluorimetrischen Relativmethode, die wieder Intensitäten genau
messen muß, im Handel sind.
Der Fachmann kann sich nun die verschiedensten Titrationsarten (z. B. Säure-Base,
Redox, komplexometrische Titrationen, Fällungstitrationen, Affinitäts-Präzipitation)
umgesetzt in progressiven, inkrementellen Serien von Mikro-Titrationszonen und/oder -
räumen vorstellen, deren Anzahl bei steigender Menge eines Abfangreagenzes dort bei
einem gegebenen generellen Analyt-Indikator für die Analytkonzentration steht.
Im folgenden sind einige erfindungsgemäße Beispiele aufgeführt. Da die Erfindung ein
komplettes, modulares und extrem variierbares System betrifft, können aus
Platzgründen, hier nur wenige Ausführungsbeispiele genauer beschrieben werden.
Der bevorzugte Aufbau für Übersichtsmessungen besteht in einer planaren, teststreifen
förmigen Anordnung aus einem durchsichtigen Kunststoff mit den Abmessungen ca. 1 ×
0,5 × 10 cm (B×H×L) wie der Abb. 1 schematisch skizziert ist. Die vorliegende Test-
Anordnung besteht aus einem Probennahme-Modul mit einem Array von
erfindungsgemäßen Mikro-Pipetten (1) mit konstantem und genau bekanntem Volumen
im Mikroliterbereich. In diesem Beispiel ist die Skalierung (5) der maßanalytischen
Mikro- oder Nano-Äquivalente des Titrators, der sich in den Mikroreaktoren (4a)
befindet, wegen des durchsichtigen Materials auf dem Probennahme-Modul angebracht.
Sie kann aber auch auf der Unterseite des Titrations-Moduls (unten) angebracht sein.
Die Mikro-Kapillaren (1) werden mit einer Trennfolie (2) unten abgedichtet. Eine
Anordnung mit Dornen (3) und Verbindungskanälen zu den einzelnen Mikro-Reaktoren
im Mikroliterbereich erlaubt ein rasches Durchstoßen der Trennfolie (2). Das Volumen
der Mikro-Reaktoren muß ausreichend groß sein, die Proben-Aliquote ohne Verlust
aufzunehmen.
Anstelle der visuellen Äquivalenzpunktsfeststellung mit Hilfe eines geeigneten
Indikators in den Mikro-Reaktoren kann auch eine hier nicht abgebildete
)elektrochemische Indizierung durchgeführt werden. Im Falle einer elektrochemischen
Indikation der maßanalytischen Titration in den isolierten Mikro-Reaktionsräumen
mittels entsprechender Mikroelektroden finden die mikrochemischen, maßanalytischen
Umsätze in einem darüber befindlichen Modul statt. In diesem Fall kann auf Indikatoren 25573 00070 552 001000280000000200012000285912546200040 0002019545130 00004 25454
verzichtet werden. Die Proben-Aliquote fließen vielmehr nach der maßanalytischen
Reaktion in einem separaten Modul in das wiederverwendbare Meß-Modul mit einer der
Anzahl der Mikro-Reaktoren entsprechenden Anzahl von elektrochemischen Meßzellen.
Jede dieser Meßzellen kann über im Boden eingelassene Kontakte elektrisch
kontaktiert und bezüglich Leitfähigkeit, pH- oder Redox-Wert vermessen werden. Der
elektrochemische Äquivalenzpunkt-Leser ist nach Spülen wiederverwendungsfähig. Er
wird durch ein paßgenaues Aufsetzen von Reaktions-Module, evtl.
Probenvorbereitungsmodul und Probennahme-Modul wieder zu einer Schnell-Test-
Anordnung komplettiert.
Die Abb. 2 zeigt schematisch den Aufbau eines Probennahme-Moduls mit variablen
aber genau bekannten Volumina der Kapillar-Pipetten (1). Die keilförmige Form auf
Abb. 2 ist nicht maßstäblich. Zusätzlich zur variablen Länge der Kapillar-Pipetten, kann
natürlich auch ihr Durchmesser verändert werden, so daß man die Aliquotisierung um
den Faktor ca. 100 verändern kann. Bei zu langen Kapillar-Pipetten muß allerdings zu
einer anderen Produktionstechnik als dem LIGA-Verfahren übergangen werden. Hier
müssen die engen Röhrchen gebohrt werden, was durch klassische Feinwerktechnik
aber auch mittels Laser geschehen kann. Das auf Abb. 2 gezeigte Probennahme-Modul
mit variabler Aliquotisierung kann wiederverwendet werden. Dazu wird sie jeweils mit
der neuen Probe mittels einer Spritze durchspült. Dazu sind die beiden Abdeckplatten
mit den Verbindungs-Kapillaren (6) mittels Führungsschienen so angebracht, daß sie
abwechselnd unten und oben die Kanale verbinden. Wegen der variablen Proben-
Aliquotisierung, können bei diesem Schnell-Test-System die maßanalytischen Titer in
den Mikro-Reaktoren (4b) im Titrations-Modul konstant bleiben. Die einzelnen Mikro-
Reaktoren werden mit den einzelnen Proben-Aliquoten dadurch simultan gefüllt, daß
die beiden Abdeckplatten mit den Verbindungskapillaren (6) seitlich verschoben
werden. Die Mikro-Reaktoren des Typs (4b) können auch auf einem papierähnlichen
Träger untergebracht werden.
Dadurch gestaltet sich beispielsweise eine Schnell-Analyse mit einer Kombination:
Variable Probenmenge, konstanter Titer in den Mikro-Reaktoren wie folgt: a)
Eintauchen des Probennahme-Moduls in die Probe b) Aufsetzen desselben auf das
elektrochemische Meß-Modul unter Dazwischenschaltung einer passenden Folie mit
den an den richtigen Stellen punktförmig immobilisierten konstanten Mengen
Titrationsmittel, c) Öffnen der Probenkanäle und der Versiegelung des maßanalytischen
Reagenzes und Überspülen in die Meßzellen, c) Vermessung des Meßzellen-Arrays zur
Feststellung des Ortes der stärksten Meßsignal-Änderung, d) Ablesen der dort
vorliegenden Äquivalenz-Konzentration an Analyt.
Eine weiter generell Ausführungsvariante ist auf der Abb. 7 gezeigt. Die Mikro-Kapillar-
Pipetten (1 Aufsicht und Seitensicht) können mit den Mikro-Reaktoren (4a) mit variablen
Volumen durch paßgenaues Verschieben in Verbindung gebracht werden. Eine
dreidimensionale Darstellung eines Mikro-Reaktors ist in (12) gezeigt. In Abb. 7 unten
ist eine Komposit-Anordnung von zwei Modulen gezeigt. Das Probennahme-Modul (13)
besteht aus einem Keramik-Spritzguß, in dem die Pipetten-Kanäle gebohrt sind. Die
immobilisierten Reagenzien (14) für eine Probenvorbereitung sind in einer Ecke
untergebracht. Die Oberfläche (15) ist hydrophobiert. Das Trägermaterial (16) wird mit
einer Bodenplatte (17) abgeschlossen.
Die Abb. 8 zeigt schematisch die Aufsicht und die Seitenansicht eines weiteren Moduls
mit noch geschlossenen Mikro-Kammern, die bei Bedarf geöffnet werden.
Auf einem planaren Träger aus einem preiswerten, der LIGA-Technologie zugänglichen
Material wird gemäß Abb. 1 ein lineares Array von Mikro-Reaktionskammern mit
ansteigendem Volumen und mit ihnen in Verbindung stehenden Kapillar-Füll-Pipetten
erzeugt der Gesamtabmessungen 10×1×0,5 cm (L×B×H). Zur Erleichterung der
reproduzierbaren und automatisierbaren Füllung der Mikro-Kammern (Reaktoren mit
Füllvolumen im Mikro- und Nanolitermaßstab, hier Durchmesser 0,1 mm) können diese
auch mit unten offenen Kammern produziert werden, die dann nach Füllung mittels der
verschiedensten Techniken mit einer optisch durchlässigen Bodenplatte verschlossen
werden. Die Füllung mit genau dem Kammervolumen entsprechenden Mengen des
Titrators (bei der Säurebestimmung: Lauge; bei der Laugenbestimmung: Säure)
geschieht beispielsweise mittels eines Dispensers aber auch durch einfache
Tauchfüllung in einer vorzugsweise gelartig vorliegenden Standardlösung einer
schwerflüchtigen Lauge oder Säure, der ein geeigneter pH-Indikator beigefügt ist.
Beispiele für immobilisierte Laugen sind neben den bekannten alkalischen
Urtitersubstanzen wie Alkalikarbonate auch Substanzen, wie stark oder schwach
basische Ionenaustauscher, die an ihrer Oberfläche (z. B. mittels Amino-Gruppen)
Protonen binden können. Beispiele für immobilisierte Säuren sind dementsprechend
neben den klassischen sauren Urtitersubstanzen wie Hydrogensulfat und -phosphat
u. a. stark oder schwach saure Ionenaustauscher (z. B. mit SO₃H-Gruppen). Alternativ
lassen sich natürlich auch Titrationen im Nanolitermaßstab durchführen, wenn der
Titrator nur kovalent an den unterschiedlich großen Kammeroberflächen angebunden
ist.
Wird eine derartige Testvorrichtung in die zu messende Probe getaucht, dann werden
erst einmal gleichzeitig alle, je nach gewünschter Graduierung mehr oder weniger
zahlreiche, Mikro-Pipetten durch die Kapillarwirkung gefüllt. Nach dem Herausziehen
der Test-Vorrichtung wird der weitere Transport der Probe in die im
Ausführungsbeispiel 2 jeweils darunter liegende Mikro-Titrations-Kammern dadurch
gestartet, daß entweder eine Verschlußfolie durchstoßen wird oder die Mikro-Reaktoren
in Titrations-Modul sind mit einer sich selbst auflösenden Schicht abgedeckt. Alternativ
kann auch erst eine kontrollierte Verschiebung des Probennahme-Moduls den Weg zur
Titration öffnen. Dann reagiert der Analyt mit der dort jeweils vorliegenden und genau
bekannten Menge des Base- oder Säure-Standards, wobei es je nach der Säure- oder
Basenkonzentration in der Probe zu einer Veränderung der Indikatorfärbung dort und
nur dort kommt, wo die Äquivalenz überschritten ist. An einer seitlich angebrachten
Skala läßt sich dann die Absolutkonzentration des Analyten (hier Säure oder Base)
genau ablesen. Der Probentransport kann ebenfalls durch eine mechanisch oder
andersartig eingeleitete Kapillarwirkung aber auch durch Eintauchen in eine Art
Entwicklungsflüssigkeit mit oder ohne Hilfsreagenzien geschehen. Auch eine Befüllung
der Mikro-Reaktions-Kammern mittels Vakuum oder Überdruck ist denkbar und
erfindungsgemäß nebensächlich. Durch die Wahl eines geeigneten und einheitlichen
pH-Indikators, der der zu bestimmenden Säure- oder Basenstärke (pK-Wert) entspricht,
liegen einheitliche Anfärbebereiche (Kette der Mikroreaktionen mit oder ohne
stöchiometrischen Analyt-Überschuß) vor, die auch automatisiert als digitale Ja-Nein
Antwort (bezüglich der Erreichung des Endpunktes) ausgewertet werden können, was
eine hohe Genauigkeit garantiert.
Bei dieser Analysenmethode wird in dem hier vorgestellten Ausführungsbeispiel die
klassische Titration einer zu bestimmenden Säure mit einer Lauge (oder umgekehrt) in
eine Serie von parallel und getrennt ablaufenden Mikrotitrationen kontrolliert variierter
Titratormengen verwandelt, die durch die Art ihrer Anordnung eine digitale oder
streckenmäßige Auswertung ähnlich wie die Volumenablesung an einer Bürette
ermöglichen. Der Vorteil liegt einmal darin, daß in diesem Beispiel eigentlich nur die
Position der noch gerade angefärbten Zone mit dem höchsten immobilisierten
Laugengehalt zur genauen Konzentrationsermittlung genügt, die anderen also
redundant sind und daß die Intensität nicht mehr wichtig ist. Im Falle der pH-Wert
Messung, die bei starken Säuren und Laugen ungenau wird, ist diese
"Flächentitrationsart" wesentlich genauer. Diese Art von Barcode-Analyse hat in den
LED-Leuchtketten zur Intensitätsanzeige bestimmter elektronischer Signale ihren
Gegenpart.
Die herstellungsmäßig genau konfektionierten Titrations-Module für eine absolute
Konzentrationsbestimmung von Säuren und Laugen können erfindungsgemäß natürlich
auch zur Gas-Analyse verwendet werden. So setzt man beispielsweise Kohlendioxid in
einem Mikro-Gaswäscher-Modul mit bekannten Mengen von Natronlauge um. Die
Abnahme der NaOH-Konzentration ist so leicht feststellbar. Analog kann Ammoniak
mittels HCl ausgewaschen und bestimmt werden.
Hat man eine Vielzahl von Proben auf ihre Säure- oder Basekonzentration hin zu
überprüfen, so sieht eine bevorzugte Form der Erfindung anders aus. Auf einem
geeigneten, mikrostrukturierbaren Träger befinden sich pro Analyse eine
Aufgabevorrichtung, die mit einem darunter liegenden engen Mikro-Kanal genauer
Abmessungen in Verbindung steht. Der gesamte Querschnitt dieses Kanals ist
lückenlos mit dem Titrator-Standard-Reagenz, dem auch noch ein geeigneter pH-
Indikator beigefügt ist, gefüllt. Die Bodenplatte kann wieder, wie oben gezeigt, optisch
durchlässig gewählt werden. Bei dieser Version wird die Analysenprobe mittels einer
genauen und speziellen Mikroliterspritze über das Aufgabe-Port-System in den Kanal
als kontinuierliche Mikro-Reaktionskammer gedrückt, wobei der Probepfropfen mittels
einer kurzen Nachspülung mit dergleichen oder einer zweiten Spritze in den Kanal
gedrückt wird. Hier läuft mit dem dort gleichmäßig immobilisierten Titrator die
Neutralisationsreaktion solange ab, bis der stöchiometrische Titratorüberschuß
abgebaut ist. Dies läuft wie im obigen Beispiel auf das Ausmessen einer Mikro-Kanal-
Strecke mit bekanntem Titer hinaus, was ein absolutes, an einer Skala ablesbares
Ergebnis ergibt. Alternativ kann man auch erst alle Probenports mit einem
Probenaliquot im Mikroliter-Maßstab füllen und dann die ganze Multi-Analysen-
Vorrichtung in eine Lösung tauchen, damit es zu einem Probentransport durch die
Reaktionskanäle mittels Kapillarkräften kommt. Die Art des Transportes ist
erfindungsgemäß unerheblich. Eine bevorzugte Ausführungsform benutzt dazu, wie in
Abb. 6 skizziert, entsprechend getränktes Fließpapier. Unter Zuhilfenahme eines
geeigneten Spacers läßt sich diese Ausführungsform auch in einer Heißklebefolie
einschweißen, was den Flächen-Titer stabilisiert.
In einer Vorrichtung wie unter Beispiel 2 oder 3 beschrieben, werden bei der
Bestimmung eines Oxidationsmittels die üblicherweise dazu verwendeten
Reduktionsmittel in den Mikro-Reaktoren immobilisiert. Bei der Bestimmung eines
Reduktionsmittels wird umgekehrt ein geeignetes Oxidationsmittel dort in bekannter
Menge untergebracht. Als Indikator werden die bekannten Redox-Indikatoren
verwendet. In einigen Fällen zeigt sich der chemisch umgesetzte oder noch im
Überschuß vorliegende Redox-Titrator auch selbst an. Beispiele dafür sind
Permanganat, Chromat, Jod usw . . Oxidationsmittel mit einem Standardpotential
positiver als + 0,35 V (GKE) lassen sich mit immobilisiertem Kaliumjodid und etwas
Stärke (z. B. 0,05 M KJ mit 5% Stärke) sehr gut mit beiden Vorrichtungen absolut
quantitativ bestimmen, wenn ein stärker reduzierend wirkendes Reduktionsmittel als
Titrator damit zusammen immobilisiert wird. Sehr häufig muß bei biochemischen
Verfahren Wasserstoffperoxid gemessen werden. Dies gelingt mit der hier
beschriebenen, erfindungsgemäßen Systemkonfiguration sehr genau. Erst nach
Überschreiten des Äquivalenzpunktes der Reaktion mit dem immobilisierten
Reduktionsmittel liegt freies Wasserstoffperoxid vor, das elementares Jod erzeugt, was
mit der Stärke zu einer intensiven Schwarzfärbung führt. Als Reduktionsmittel können
alle stabil in den Mikro-Reaktoren zu immobilisierenden Reduktionsmittel, wie z. B.
Titan(III)-, Eisen(II)-salze, Arsenit, Thiosulfat, Oxalat, Ascorbinsäure o. a. auch
zusammen mit geeigneten anderen Redox-Indikatoren verwendet werden. Eine
absolute quantitative Bestimmung von Wasserstoffperoxid ist für alle Biosensoren, die
auf Oxidasen beruhen sehr interessant.
Bei der quantitativen Bestimmung von Analyten mit reduzierenden Eigenschaften
werden erfindungsgemäß Oxidationsmittel mit einem entsprechend positiveren Redox-
Potential in den Mikro-Reaktionskammern immobilisiert. Besonders vorteilhafte,
einfache Ausführungsformen erhält man wenn man einen selbstindizierenden Stoff wie
etwa Kaliumpermanganat oder Ce(IV)-Salze, die im UV-Licht fluoreszieren, dazu
verwendet. Auch Chromat verändert dabei seine Farbe von gelb nach grün.
Hier wird als Titrator Aluminiumsulfat in einer sauren Umgebung verwendet. Die freien
Aluminiumionen ergeben mit immobilisierten Morin unter UV-Bestrahlung eine intensive
grüne Fluoreszenz. Werden die maßanalytischen Aluminium-Ionen zunehmend vom
Phosphat als unlöslicher Aluminiumphosphat-Niederschlag aus dem
Lösungsgleichgewicht entfernt, verlöscht diese Fluoreszenz. Kurz vor Erreichen des
Äquivalenzpunktes besteht hier eine lineare Beziehung zwischen der Fluoreszenz und
dem Restgehalt an Aluminium, die man bei einer quantitativen Intensitätsmessung zu
Extrapolations-Rechnungen verwenden kann (Prinzip: Standard-Subtraktion). Alternativ
kann aber der Endpunkt dieser maßanalytischen Fällungs-Titration auch mittels
bekannter Adsorptions-Indikatoren, die den Endpunkt empfindlicher anzeigen,
angezeigt werden.
Als Titrator wird entsprechend immobilisiertes EDTA verwendet. Der Titer pro Mikro-
Reaktor muß bei Proben-Aliquoten von 0,1 mL im Nano-Äquivalent-Bereich liegen,
wenn Proben im ppm Bereich gemessen werden sollen. Der ebenfalls mit zu
immobilisierende Puffer soll bei pH < 9 liegen. Als Indikator wird das Reagenz-Cocktail
verwendet, das auch bei der trockenchemischen kolorimetrischen Teststreifen-Methode
verwendet wird. In der oben erwähnten Literatur sind noch weitere selektive Indikatoren
für Cadmium erwähnt.
Als Titrator dient in diesem Fall das intensiv rot gefärbte Eisen(III)rhodanid, das im
Verlaufe der zweidimensionalen Titration durch die Bildung eines starken Eisen-Fluor-
Komplexes entfärbt wird. Der Titrator ist also selbstindizierend. Soll das Fluorid im ppm-
Bereich gemessen werden, so sind Probenvolumina von 0,1 mL und Titrator-
Konzentrationen im Nano-Mol-Bereich pro Mikro-Reaktor erforderlich.
Diese Ausführungsvariation entspricht einer Fällungs- oder komplexometrischen
Titration. Bei der quantitativen Bestimmung eines Antikörpers dient das Antigen
immobilisiert auf einer Oberfläche als Titrator. Es liegt in den Mikro-Reaktions-
Kammern oder Kanälen als Assoziat mit einem farblich markierten Antikörper mit
niedrigerer Affinitätskonstante als der Analyt vor, so daß es durch letzteren freigesetzt
wird und wegdiffundieren kann, wodurch es zu einem Verschwinden der
Kammeranfärbung kommt. Die Wegdiffusion läßt sich unter Ausnutzung von kapillaren
Saugkräften beschleunigen. Aus Gründen der Empfindlichkeit wird zur Markierung
vorzugsweise eine fluoreszierende Verbindung verwendet.
Ein Antigen als Analyt wird analog mit dem dazugehörigen Antikörper als Titrator
bestimmt. Letzterer wird abgesättigt mit einem markierten Antikörper, der eine kleinere
Alfinitätskonstante als der eigentliche Analyt aufweist.
Hier wird nach dem Probennahme-Modul ein Immunoreaktor-Modul geschaltet. In den
Mikro-Reaktoren diese Moduls befindet sich der Analyt in enzymmarkierter Form an
seinen Partner gebunden. Letzterer ist selbst kovalent an einer Oberfläche gebunden.
Nach Öffnung der Verbindungskanäle zuwischen beiden Modulen, verdrängt der stärker
gebundene Analyt sein enzymmarkiertes Derivat aus den Bindungsstellen, wodurch die
Enzymmarkierung mobil wird und mit einer kleinen Menge Flüssigkeit in das
Quantifizierungs-Modul gefördert werden kann. Dort reagiert es eine bestimmte Zeit mit
dem dazugehörigen Substrat bevor die dabei erzeugten oder verbrauchten Substanzen
im Titrations-Modul genau erfaßt werden. Bei Verwendung von Glucose-Oxidase als
Markierungs-Enzym kann der Titrations-Modul wieder aus einem Bestehen, das auch
zur Messung von Wasserstoffperoxid verwendet wird.
Eine besondere Ausführungsform einer säure- und hitzebeständigen, mit Dichromat
beladenen Probenvorbereitungs-Modul kann die extrem umweltbelastende klassische
CSB-Bestimmung nach DIN ersetzen und gleichzeitig auch den TOC-Wert liefern. Die
einzelnen Mikro-Reaktoren enthalten variable Chromat-Mengen im Mikro-Mol Bereich.
Sie können durch eine geeignete Mikro-Verbindungskanal-Schaltung durch
kontrolliertes Verschieben der Module gegeneinander und entsprechender Spacer mit
Mikro-Gaswäscher-Reaktoren zur Messung des entstandenen Kohlendioxids in
Verbindung gebracht werden. Die Mikro-Gaswäscher enthalten in diesem Fall variable
Mengen NaOH mit dem Indikator Phenolphthalein. Nach der Probennahme einer
angesäuerten Probe werden die Aliquote (Anzahl entsprechend der gewünschten
Genauigkeit) in den Oxidations-Modul überführt. Dann wird durch Verschiebung des
letzteren die Verbindung zu den Kapillar-Pipetten unterbrochen und die zu den
einzelnen Mikro-Gaswäschern geöffnet. Dann wird das System für zwei Stunden (DIN)
in den Trockenschrank bei 100°C deponiert. Um ein Eintrocknen zu verhindern, muß
Wasser angeboten werden. Dazu wird entweder eine Wanne um die Probenahme-
Kapillare gelegt, die Vorrichtung in ein Wasserbad gestellt oder die Erwärmung mit
Wasserdampf durchgeführt. Während der Erwärmungsphase oxidiert das Dichromat die
in dem Proben-Aliquot vorhandenen oxidierbaren Bestandteile, u. a. auch organische
Verbindungen und wird dabei selbst zu einer grünen Chrom(III)-Verbindung reduziert.
Dies passiert in allen Mikro-Reaktions-Kammern, in denen das Chromat in einem
stöchiometrischen Unterschuß vorliegt. Zur Steigerung der Empfindlichkeit können
auch noch geeignete Indikatoren für Chromat oder redox-empfindlich zugesetzt werden.
Der CSB-Wert kann direkt an einer Skala, die sich neben dem Array der Mikro-
Oxidations-Kammern befindet, in mg O₂/L abgelesen werden. Dieses Verfahren
reduziert den Sondermüllabfall des DIN-Verfahrens um mehrere Größenordnungen.
Simultan kann aber auch der Mikro-Gaswäscher lokalisiert werden, wo das
Phenolphthalein gerade farblos wird. Hier kann dann an einer separaten Skala der
TOC-Wert in absoluten Einheiten abgelesen werden.
Eine weitere besondere Ausführungsform stellt auch eine Vorrichtung zur
Wasserbestimmung in organischen Lösungsmitteln dar. Hier werden die bekannten
Karl-Fischer-Reagenzien in den Mikro-Reaktoren unter wasserfreien Bedingungen in
variabler Menge immobilisiert. Die in die Kammern eindringenden Wasserspuren in den
zu prüfenden Flüssigkeiten reagieren stöchiometrisch mit dem Karl Fischer Reagenz,
wobei Jod vierwertigen Schwefel zu sechswertigem aufoxidiert und dabei zu Jodid
reduziert wird. Sobald also ein stöchiometrisch äußerst geringer Überschuß an
elementarem Jod vorliegt, hat alles Wasser in den Proben-Aliquoten ausreagiert.
Dieser Punkt wird durch die Verwendung von Stärke noch ausgeprägter angezeigt.
Zur Demonstration der überaus großen Bandbreite von Möglichkeiten, absolut
messende Testanordnungen im Sinne der vorliegenden Erfindung herzustellen, wird
hier stellvertretend ein Glucose-Sensor beschrieben. Wegen der gewünschten
Kalibrationsfreiheit muß die gesamte, in dem genommenen Proben-Aliquot vorhandene
Glucose mit Hilfe des Enzyms Glucose-Oxidase (GOD) zu Gluconsäure und
Wasserstoffperoxid umgesetzt werden. Daher ist eine entsprechend kleine Blutmenge
(im Mikroliterbereich) und eine ausreichende Menge GOD im Enzym-Mikro-Reaktor zu
verwenden. Als Mikro-Reaktions-Kammer eignet sich hier wegen der meist limitierten
Probenmenge (1 Tropfen Blut) besonders die Version der Erfindung, die auf einer
Mikro-Kanal-Anordnung beruht. Die Blutprobe wird über eine Kapillar-Füll-Pipette
aliquotisiert und in die Vorrichtung eingebracht. Von dort aus fließt die Probe analog
Abb. 6 durch eine Zone mit immobilisierter GOD, die sich auch bereits innerhalb des
Mikro-Reaktions-Kanals befinden kann. In diesem Kanal soll die stöchiometrisch aus
Glucose entstandene Wasserstoffperoxid-Menge quantitativ durch "Titration" mit
Standard-Reduktions-Äquivalenten bestimmt werden. Als Reduktionsmittel wird
vorzugsweise ein Gel mit einem definierten Kaliumjodid-Gehalt verwendet. Als Indikator
wird vorzugsweise Stärke verwendet. Die Blutprobe strömt filtriert oder unfiltriert (der
GOD-beladene Mikro-Reaktor wirkt für die roten Blutkörperchen wie ein Filter) in den
Titrations- und Meß-Kanal. Dort reagiert das gebildete Wasserstoffperoxid mit dem
maßanalytischen Reduktionsmittel zu elementarem Jod, das durch die bekannte Jod-
Stärke-Reaktion tiefschwarz gefärbt ist, solange bis die Gesamtmenge an
Wasserstoffperoxid umgesetzt ist. Dabei wird eine der Konzentration streng
proportionale Strecke des Titrationskanals schwarz gefärbt. Die in der Blutprobe
vorhandene Glucosekonzentration kann an einer aufgedruckten Skala in mg/dl oder
einer anderen Konzentration abgelesen werden (Ende der Schwarzfärbung). Alternativ
kann das Wasserstoffperoxid auch durch einen Standard aus Kaliumpermanganat
aufoxidiert werden, wobei das Kaliumpermanganat zu farblosem Mangan(II) entfärbt
wird.
Da z. B. Kaliumjodid und Kaliumpermanganat Urtitersubstanzen sind, ergeben sich
hierdurch generische und absolut anzeigende Testvorrichtungen für eine große
Vielzahl von Stoffen, die mit ihren Oxidasen selektiv unter Bildung von
Wasserstoffperoxid oxidiert werden können.
Selbstverständlich müssen die Mikro-Reaktoren in beiden oben skizzierten
Anwendungebeispielen neben einer Standardmenge an Titrationsreagenz auch noch
ein geeignetes Puffer- und Stabilisierungs-Cocktail enthalten, deren optimale
Zusammensetzung zu finden aber für einen Fachmann kein Problem darstellt. Alternativ
kann bei Oxidasen auch die Abnahme der Sauerstoffkonzentration mittels eines
Fluoreszenz-Signales eines Farbstoffes, das durch Sauerstoff gequenscht wird,
gemessen werden.
Hierbei wird ein spezielles Probennahme-Modul mit engen, langen Difusions-Mikro-
Röhrchen verwendet. Sie stehen im unmittelbaren Kontakt zu einer Sammelphase in
einem weiteren Modul, in dem der gasförmige Analyt chemisch gebunden wird. Nach
einer vorgeschriebenen Sammelzeit wird der Analyt in seiner neuen Verbindungsform
durch Füllen der Diffusions-Röhrchen mit einer geeigneten Flüssigkeit aus der
Sammelphase gewaschen und die Menge der aus dem Gas neu gebildeten Verbindung
mit oder ohne chromatographische Trenn-Operationen titrimetrisch erfindungsgemäß
durch eine geeignete stöchiometrische Reaktion mit Äquivalenzpunkt-Anzeige
bestimmt.
Beispielsweise läßt sich ein Ozon-Dosimeter einfach dadurch aufbauen, daß als
Sammelphase ein maßanalytisches Reduktions-Äquivalent gewählt wird und als
Indikator KJ plus Stärke. Der Mikro-Reaktor im Titrations-Modul, der schwarz gefärbt
ist, zeigt an, daß die gesammelte Ozon-Konzentration dem letzten, benachbarten
Reduktions-Äquivalent entspricht.
Claims (37)
1. Verfahren und Vorrichtungen für ein modulares Mikrosystem
für hochgenaue chemische Schnell-Analysen und Verfahren
zur Herstellung,
dadurch gekennzeichnet,
daß zur Quantifizierung des zu bestimmenden Stoffes (Analyt)
maßanalytische, parallel und stöchiometrisch bekannt
ablaufende Mikro-Reaktionen von genau bekannten Proben-
Aliquoten mit oder ohne zusätzliche, integrierte, empfind
lichkeits- und selektivitäts-steigernde Analyt-Erkennungs
reaktionen und/oder Mikro-Trenn-Operationen mit genau bekann
ten chemischen Äquivalenten eines geeigneten, chemisch sta
bilen und hinreichend selektiven Reagenzes (maßanalytischer
Titrator) und einer geeigneten Indikator-Hilfsstoff-Mischung inkrementell
in Mikro-Reaktionsräumen an unterschiedlichen Orten mit
unterschiedlichen Mengen (ortsabhängiger Titer) durchgeführt
werden und die Quantifizierung auf die Ortsbestimmung eines
optisch leicht zu erkennenden Indikator-Umschlages oder
mikro-elektrochemisch feststellbaren Punkt hinausläuft, wo
die aktuell vorliegende chemische Äquivalenz- Menge des
Analyten in absoluten Mol-Einheiten einfach und genau,
entsprechend der gewählten Graduierung des immobilisierten
Titrators abzulesen ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß als selektivitätssteigernde Analyt-Erkennungs-Reaktion
biochemische Reaktionen, die nach dem Schlüssel-Schloß-
Prinzip ablaufen, insbesondere eine enzymatische oder
immunologische mit Redox-Derivaten und/oder ELISA-verfahrens
analog und/oder amplifizierende (beispielsweise durch
Substrat Zyklisierung oder mittels der PCR-Technik o. ä.), der
maßanalytischen Quantifizierung vorgeschaltet sind, und ein
dabei stöchiometrisch freigesetzter, analyt-äquivalenter,
d. h. mengenmäßig streng proportionaler, weiterer Stoff nach
dem vorliegenden Verfahren bestimmt wird, was in den beiden
erstgenannten biochemischen Reaktionsarten einen 100%igen
Stoff-Umsatz des Analyten erfordert.
3. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß der inkrementellen maßanalytischen Analyt-Quantifizierung der
Proben-Aliquote eine anwendungsspezifische, unterschiedliche
Operation vorgeschaltet ist, welche die bekannten,
analytisch-chemischen "Unit-Operations", wie gasflüssig,
flüssig-fest Trennungen über entsprechende Membranen oder
Filter aber auch chromatographischer Art (z. B. GC, LC, IC,
RP-LC, Gel, Affinität etc.) oder Extraktionen, Gaswäsche etc. in
speziellen Modulen in integrierter Mikrotechnik durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß die inkrementellen maßanalytischen, mikrochemischen
Quantifizierungs-Reaktionen eines aufgegebenen, bekannten
Proben-Aliquots mittels optischer Äquivalenzpunkts-Ermittlung und
eines ortsabhängigen Reagenz-Titers kontinuierlich (bekannter
Titer pro Strecke) durchführt, was beim Vorschalten
chromatographischer Trenn-Operationen oder biochemischer
Analyt-Erkennungsreaktionen vorteilhaft ist, weil
in diesen Fällen eine geeignete mobile Phase injiziert wird,
die den Analyten nach der Abtrennung von störenden
Begleitstoffen oder nach quantitativer Umsetzung einem
geeigneten Mikro-Bioreaktor in die Quantifiziersäule
transportiert, wo er oder sein biochemisches Äquivalent längs
eines genau dimensionierten Mikro-Kanals ein dort immobili
siertes, maßanalytisches Reagenz konstanter oder ansteigender
Äquivalenzmenge aber bekannter Menge (Titer pro Strecke) mit
bekannter Stöchiometrie zu 100% umsetzt und dadurch eine
Indikator-Umschlag bis zu diesem Punkt erzeugt.
5. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß der maßanalytische, chemische Umsatz mit einem geeigneten
Analyt-Titrator und Indikator in Präzisions-Mikro-Kanälen in
beiden Längsrichtungen durch Diffusion erfolgt und zur
Auswertung die Anfärbe- oder Indikator-Umschlags-Breite,
anstelle einer Intensitätsmessung genommen wird, wobei Multi-
Analyt-Anordnungen teststreifenförmig gestaltet werden, so
daß die analytkonzentrations-proportionale Farbstreifen-
Breiten mit Bar-Code-ähnlichen Lesern einfach, schnell und
zuverlässig ausgewertet werden und bei Verwendung von
fluoreszierenden Indikatoren im Bereich 800-1100 nm implantierbare,
von außen ablesbare, medizinische Test-Vorrichtungen ermöglicht werden.
6. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß die inkrementellen maßanalytische, mikrochemische Quantifizierungs-
Reaktion von parallel, mittels eines Arrays von Mikro-
Pipetten (oder Mikro-Gas-Mäusen) genommenen Proben-Aliquoten
bekanntem Volumens diskontinuierlich aber simultan in
eng begrenzten, voneinander chemisch isolierten Mikro-
Reaktionsräumen an unterschiedlichen Orten durchgeführt
wird, wobei die in den einzelnen Mikro-Reaktoren
immobilisierte Menge eines chemisch stabilen und
stöchimetrisch mit dem Analyten reagierenden Maß-Reagenzes
von Mikro-Reaktor zu Mikro-Reaktor graduell variiert wird,
so daß die Äquivalenz-Menge des Analyten örtlich dort
in der Absolut-Einheit Mol abgelesen werden kann, wo sich die
Indikatorfärbung zwischen zwei Mikro-Reaktoren verändert.
7. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Durchführungs-Operationen der Schnell-Test Varianten
in modularen, kompakten und integrierten, mikrochemischen
Verfahrenseinheiten: Probennahme, Vorbereitung und Messung, die
systembedingt beliebig kombiniert werden können,
durchgeführt wird und die parallel gezogenen Probennahme-
Volumina graduell und in bekannter Weise variiert werden,
wobei die Mikro-Reaktoren einen konstanten oder variablen
Titer enthalten, können so daß im letzten Fall bei
gegenläufiger Graduierung sehr große Meßbereiche möglich
werden.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß die bekannten Verfahren für einen trockenchemischen
Schnell-Test dahingehend verbessert werden, daß zur
Steigerung der Zuverlässigkeit und Genauigkeit genaue
Mikropipetten verwendet werden und die Auswerttechniken
der Standard-Addition oder -Subtraktion reflexions
photometrisch automatisch angewandt werden.
9. Vorrichtung zur Durchführung der Verfahrens nach einem der
Ansprüche 1 bis 8 und Verfahren zur Herstellung,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie mikrochemisch, kompakt und modular entsprechend den
Verfahrensschritten: a) Probennahme, b) Vorbereitung mit
selektivitäts-steigernder Analyt-Erkennung und/oder
biochemischer Amplifikation, c) weiteren "Unit-Operations"
Funktionen, d) quantifizierende maßanalytische Messung
modulartig aus einem geeigneten, preiswerten, recyclebaren
Material oder verschiedenen Materialien aufgebaut ist, in dem
die erforderlichen Hohlräume für die inkrementelle Maßanalyse
mit hochpräzisen Abmessungen für a) die Mikro-Pipetten,
b) die Mikro-Bioreaktoren und/oder Mikro-Chromatographie-Säulen,
c) für weitere, notwendige chemische Reaktionen und für
d) die Titrationsräume mitphotolithographischen Präzisions-Verfahren
oder siebdruck-basierende Dickschicht-Technik einfach und in höchster
Maß-Genauigkeit massenweise produziert werden, wobei die
einzelnen Funktions-Einheiten oder Module vorzugsweise
getrennt hergestellt und kontrolliert gegeneinander
verschiebbar laminatartig, je nach dem speziellen Schnell-
Test, zu einem multifunktionellen Mikrosystem vereinigt
werden und hochgenaue, vorzugsweise steckbare Paßformen eine
Vielfalt an Kombinationen der Grundmodule ermöglichen, wobei
die einzelnen Funktions-Module auch einzeln einer Spezial
behandlung unterziehbar sind, bzw. das Titrations-Modul
auch alleine auswertbar ist.
10. Vorrichtung nach Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet,
daß als geeignetes, recyclefähiges Material Kunststoffe,
wie z. B. Plexiglas, Polypropylen, PET, Polycarbonat, PE
und andere, präzise herstellbare und/oder bearbeitbare Sorten
aber auch Silizium, Keramik (Green-Tape Technik), Papier oder
papier-ähnliche Träger verwendet werden, wobei die Form und
die Anordnung der funktionellen Hohlräume (in Serien,
planaren Arrays, zeilen- und spaltenförmig, schnecken-,
kreis- oder helixförmig, etc.) sowie die geometrische Form
der gesamten Schnell-Test-Vorrichtung (Röhrchen, streifen- oder
scheckkartenförmig, Würfel oder Polyeder mit multidimen
sionalen Funktionen) unerheblich ist.
11. Vorrichtung nach den Ansprüchen 9 und 10,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Transport der genau bekannten Proben-Aliquote von den
Pipetten im Probennahme-Modul durch die Analyt-Erkennungs-
oder Amplifikations-Säulen im Vorbereitungs-Modul oder direkt
in die jeweiligen Mikro-Titrationsräume im Titrations-Modul
im Mikro- und/oder Millimetermaßstab erfolgt und auf
kürzestem Wege mittels vorbereiteter, paßgenauer Mikro-Kanäle
in den Modulen durch Kapillarkräfte und/oder Schwer- oder
Zentrifugalkraft und/oder Druckunterschiede oder einer
Transportlösung geschieht, und der Analyt in den maßanaly
tischen Mikroreaktoren chemisch und stöchiometrisch mit einem
dort positionierten (immobilisierten) maßanalytischen
Reagenz, dessen Menge ortsabhängig variiert, unter Verwendung
eines geeigneten Farbindikators sowie weiterer Hilfs
reagenzien wie Puffer, Maskierungsstoffe etc., selektiv
umgesetzt wird und der Ort dieser Farbänderung durch die
Grundplatte leicht feststellbar ist.
12. Vorrichtung nach den Ansprüchen 9 bis 11,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Probennahme-Vorrichtung (Modul) aus einer oder
mehreren Mikro-Pipetten besteht, die in einem geeigneten
Material mit einer hydrophoben Oberfläche als Hohlraum
eingelassen sind, und die einen konstanten oder variablen
aber bekannten Inhalt aufweisen, wobei sie vorteilhaft mit
der Präzision der massenproduktionstauglichen Mikrosystem
technik, wie dem LIGA-Verfahren oder der Siliziumtechnologie
herstellt werden und in ihrer einfachsten Version aus
röhrenförmigen Vertiefungen mit Abmessungen in der
Größenordnung Mikro- oder Millimeter bestehen, die passend zu
den darunter befindlichen weiteren Funktions-Modulen
angeordnet sind, wodurch Hohlräume geschlossen werden.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12,
dadurch gekennzeichnet,
daß bei der Version mit diskontinuierlicher maßanalytischer
Reaktion in voneinander isolierten Mikro-Reaktoren die Mikro-
Pipetten in Probennahme Modul vorzugsweise in Arrayform
angeordnet sind und dadurch genau bekannte Proben-Aliquote
automatisch gezogen werden, in dem die Pipetten-Öffnungen mit
der flüssigen Probe in Berührung gebracht werden, wobei sie
sich bis zur maximalen Füll-Volumen (= Überfließen) spontan
füllen und die überschüssige Probenmenge wegen einer
hydrophoben Oberfläche neben den Öffnungen nicht haften
bleibt und die Mikropipetten am anderen Ende vorzugsweise
zur hochgenauen Dosierung während der Probennahme
verschlossen sind.
14. Vorrichtung nach Anspruch 13,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Verschluß der Mikro-Pipetten im Probennahme-Modul
der Schnell-Test-Vorrichtung durch geeignete mikromechanische
Ventile gebildet wird oder von geeigneten Membranen, die
durch geeignete Mikrodorne von außen oder innen durchstoßen
werden können, wobei sich die Membran auch auf dem anderen
Modul (z. B. Schutzmembran für Titrator) befinden kann,
oder der Pipetten-Verschluß aus einer sich in der
Probenmatrix nach wenigen Sekunden von selbst auflösenden
Membran nach dem Prinzip entsprechender pharmakologischer
Entwicklungen (z. B. aus einer nicht störenden Verbindung,
wie Dextrin, Zucker, Salz o. ä.) besteht.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14,
dadurch gekennzeichnet,
daß eine intelligente mikromechanische Ventilgebung und
Steuerung dadurch entsteht, daß die einzelnen Funktions-
Module der Schnell-Test-Anordnung mit oder ohne Gleit
spacer, der zusätzliche Strömungskanäle und Umleitungen
bilden kann, gegeneinander exakt kontrolliert verschiebbar
sind, wodurch Verbindungen zwischen ihnen geschlossen oder
geöffnet werden können.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15,
dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei den parallel durchgeführten Titrationen der
im Probenahme-Modul parallel gezogenen und genau bekannten
und gleich großen Proben-Aliquote um mikrochemische
Reaktionen mit bekannter Stöchiometrie in dazu geeigneten
Mikro-Reaktoren im Titrations-Modul handelt, in denen die
entsprechenden, genau bekannten Mikro-Äquivalente eines
stabilen, mit dem Analyten selektiv reagierenden Reagenzes
(Titrator) haltbar zusammen mit weiteren Hilfsreagenzien, wie
geeigneter, selektiver Indikator(en), Puffersubstanzen,
Maskierungsstoffe, Stabilisierer, Beschleuniger u. a.,
platziert sind und der Analyt-Titer pro benachbartem Mikro-
Reaktor abgestuft graduell zu- oder abnimmt wobei bei Bedarf
inkrementell noch Abstufungen unter 1 Promille vom Meßbereich
möglich sind.
17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Mikro-Reaktoren im Quantifizierungs- oder Titrations-
Modul erst während der Durchführung des Schnell-Tests mit dem
Probennahme-Modus, vorzugsweise mit Mikro-Pipetten bestückt,
mit oder ohne Kapillar-Ansaugwirkung oder Mikro-Gas-Mäusen in
Verbindung gebracht wird, wobei die so parallel und
automatisch gezogenen, genau bekannten Proben-Aliquote mit
oder ohne selektivitätserhöhende Mikro-Bioreaktoren im
Vorbereitungs-Modul in die entsprechenden Mikro-Reaktoren mit
genau bekanntem Titer überführt werden, wo sie mit der dort
befindlichen Maßreagenz-Mischung chemisch und analyt-selektiv
reagieren und der Äquivalenz-Punkt (Titrations-Endpunkt)
leicht dadurch feststellbar ist, daß er gramm-äquivalenz
mäßig zwischen den Mikro-Reaktoren liegt, zwischen denen eine
geeignet gewählte optische Indizierung sich stark verändert
(Indikatorumschlag) wobei analoge Vorgänge auch bei der
Version mittels eines kontinuierlichen, kanalförmigen
Titrations-Reaktors ablaufen und hier u. U. eine genauere
Ablesung möglich ist, wenn der Indikator geeignet fixiert
ist.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17,
dadurch gekennzeichnet,
daß anstelle der konstant gehaltenen Proben-Aliquote im
Probennahme-Modul dort eine simultane, Probennahme mit
jeweils genau bekanntem, aber graduell zu- oder abnehmendem
Pipettenvolumen durchgeführt wird und der genau bekannte
Titer der Mikro-Reaktoren im Titrations-Modul konstant
gehalten wird, wobei letzterer Modul in einer besonders
preiswerten Papiertechnologie produziert wird und der
Probenahme-Modus nach Durchspülen durch Proben-Injektion von
wenigen mL wiederverwendet werden kann.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 18,
dadurch gekennzeichnet,
daß sowohl die bekannten Proben-Aliquote im Probennahme-Modus
als auch die Titer im Titrations-Modul im Verlaufe der der
Serie von Mikro-Reaktoren gegenläufig verändert werden, was
zu besonders großen Meßbereichen für Übersichtsmessungen
führt.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 19,
dadurch gekennzeichnet,
daß sich die Anzahl der parallelen Mikro-Titrationen und
die entsprechende gleichmäßige Abstufung der Graduierung
maßanalytische Inkremente der in den Mikro-Reaktoren
immobilisierten Titratoren im Titrations-Modul nach dem speziellen
Anwendungsfall richtet und zwischen über 1000 und 1
(letzteres zur nicht-redundanten Überprüfung einer Grenzwert-Überschreitung)
liegen kann.
21. Vorrichtung nach Anspruch 20,
dadurch gekennzeichnet,
daß speziell eng abgestufte Titrator-Graduierungen im
Titrations-Modul zur genaueren Überprüfung von Toleranz
bereichsgrenzen in zwei Analytkonzentrations-Bereichen
vorgesehen werden und daß zur Erhöhung der statistischen
Sicherheit bei der Schnell-Test-Überprüfung auf Einhaltung
bestimmter Grenzwert vorzugsweise redundante Messungen
durchgeführt werden, die dadurch ermöglicht werden, daß
mit dem Probennahme-Modul unterschiedliche, aber genau
bekannte Proben-Aliquote gezogen werden, die aber durch
entsprechend veränderte Titer in den Mikro-Reaktoren
im Titrations-Modul äquivalentmäßig kompensiert werden, so
daß dies auf echte Parallel-Bestimmungen hinausläuft.
22. Verfahren und Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 21,
dadurch gekennzeichnet,
daß nach diesem Verfahren einer mikrosystemtechnischen Mikro-
Tüpfel-Platte bzw. "Linear-Titration" in engen Mikro-Kanälen
zusätzlich zu der Gesamtsumme der maßanalytisch erfaßbaren
Stoffe über Neutralisations-, Fällungs- oder Assoziations-
(Antigen-Antikörper-Präzipitation), Komplexbildungs- oder
Redox-Reaktionen auch alle die flüssigen oder gasförmigen Analyte
kalibrationsfrei bestimmt werden können, für die eine traditionelle selektive,
konzentrationsproportionale Indizierung und Quantifizierung
in Form bekannter Schnell-Test-Kits oder im Rahmen klas
sischer Test-Stäbchen(Trockenchemie) und/oder Gasprüfröhr
chen bereits bekannt ist, wobei diese Indizierung erfindungs
gemäß aber hier nur zur Äquivalenz-Punkt-Feststellung
herangezogen wird und als Titrator in den isolierten oder
linearen kanalförmigen Mikro-Reaktoren ein Reagenz verwendet
wird, daß den betreffenden Analyten selektiv und
stöchiometrisch aus dem Lösungsgleichgewicht durch
Komplexierung, Fällungs-, Anbindungs- oder ähnlich wirkende
Reaktionen entfernt (maßanalytisches Analyt-Abfangreagenz),
so daß die traditionelle konzentrationsproportionale
Indizierung (Anfärbung) der Trockenchemie erst nach
Überschreiten des Äquivalenz-Punktes auftritt und letzterer
über eine Intensitäts-Messung eine genauigkeitssteigernde
Konzentrations-Extrapolation ermöglicht.
23. Verfahren und Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 22,
dadurch gekennzeichnet,
daß der erfindungsgemäßen Version mittels des Titrations-
Mikro-Kanals im Titrations-Modul eine chromatographische
Trennoperation dergestalt vorgeschaltet ist, daß die
Stofftrennungen ebenfalls in engen gepackten oder ungepackten
Mikro-Kanal-Säulen mit den üblichen stationären Phasen
ablaufen, die oben mit einem lichtdurchlässigen Träger
bedeckt werden, der die analytspezifischen Reagenzien für
maßanalytische Analyt-Titration an der Stelle der Trennzone
enthält, an der eine Auftrennung von den Störkomponenten
stattgefunden hat, oder wo sie direkt im Anschluß an die
stationäre Phase im Mikro-Kanal eingebracht sind, wobei die
so markierte Strecke streng konzentrationsproportional (z. B.
Mikro-Äquivalent Analyt pro mm bis zum Farbumschlag) ist.
24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 23,
dadurch gekennzeichnet,
daß die planaren Mikro-Titrations-Arrays einschließlich der
dazugehörigen Mikro-Pipetten auf einem flexiblen Substrat
aufgebracht sind, welches beispielsweise aufgerollt
und damit kompakt mit der Probe in Kontakt gebracht wird und
zum Ablesen der betreffenden Analytkonzentration ausgerollt
wird.
25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 24,
dadurch gekennzeichnet,
daß besonders preiswerte Schnell-Test-Anordnung aus flexiblen
Substraten (Kunststoff-Folien, Papier, etc.) hergestellt
werden, wobei die notwendigen Mikrostrukturen mit modernen
Techniken der Präzisions-Massenproduktion, hier vorzugsweise
mittels der Dickfilmtechnik über reproduzierbare Siebdrucke
erzeugt werden, wobei die Titrations-Räume durch Ringe oder Kanäle
aus einem flüssigkeitsundurchlässigen Material gestaltet werden,
die mit unterschiedlichen oder gleichen Reagenz-Äquivalenten
mittels Imprägnierung, Mehrfachdruck oder auch mittels automatisch
arbeitender Dispenser gefüllt werden.
26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 25,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Füllung der Mikro-Titrations-Kammern im Titrations-
Modul mit einer graduell veränderten Menge einer geeigneten
Standard-Reagenz-Mischung dadurch durchgeführt wird, daß die
Mikro-Reaktoren mit entsprechend variierten Füll-Volumen
hochpräzise hergestellt werden und bei der Herstellung bis
zum Rand mit der verdickten Reagenzmischung aufgefüllt werden,
wobei eine Schutzfolie eine natürliche Absperrung bilden kann
und überschüssige Titrator-Mischung mittels einer durch
sichtigen Bodenabdeckung abgestreift werden.
27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 26,
dadurch gekennzeichnet,
daß eine wiederverwendbare Multi-Mikro-Pipetten Anordnung mit
variablen, genau bekannten Volumina dadurch erzielt wird, daß
in einer keilförmigen Ausführungsform unterschiedlich lange
und breite Kanäle untergebracht sind, die mittels dünner, mit
einem geeigneten Spacer gefüllten Abdeckungen versehen sind,
wobei zur Verbindung zweier benachbarter Pipettenkanäle auf
beiden Seiten abwechselnd entsprechende Aussparungen im
Spacer vorhanden sind, so daß die Multi-Vario-Mikro-Pipette
von einer Seite komplett gefüllt werden kann und die
Dosierung durch eine Verschiebung dieses Spacers, der auch
in Kombination mit anderen Modulen benutzt werden kann, mittels
eines Hebels bewirkt wird, was die Mikro-Pipetten auf beiden
Seiten öffnet.
28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 27,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Probenahme bei flüssigen oder gasförmigen Proben
mittels Mikroventile, die die Kontaktzeit und damit die Zeit
der Diffusion des Analyten durch die Reagenzschichten der
Testanordnung kontrollieren, durchgeführt wird.
29. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 28,
dadurch gekennzeichnet,
daß ein ventilähnlicher Verschluß der Eintrittsöffnungen oder
Kontaktzonen dadurch erzielt wird, daß eine quellfähige
Substanz eine Sperrschicht bewegt oder selber bildet.
30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 29,
dadurch gekennzeichnet,
daß das quantifizierende Titrations-Modul aus einem
transparenten Material mittels einer stark vergrößernden
Projektionseinrichtung ausgewertet wird, wobei die
Codierung der Äquivalenz-Konzentrationen und auch der Analyt
deutlich sichtbar angezeigt wird.
31. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 30,
dadurch gekennzeichnet,
daß sich durch eine geeignete Kombination von Funktions-
Modulen und einer speziellen Gassammelvorrichtung des
Prinzips "Passiv-Sammler" mit einem Array röhrenförmiger
Gas-Diffusions-Strecken im Mikromaßstab eine Klasse neu
artiger, tragbarer und hochgenauer Dosimeter für prinzipiell alle
Schadstoffe wie z. B. Ozon, Kohlenmonoxid, Schwefelwasserstoff,
Arsin, Phosphin, u. a. auch organischer Natur, Stoffe mit MAK-Werten
ergibt und das Dosimeter jederzeit ohne Laborarbeit vom Träger
ablesbar ist.
32. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 31,
dadurch gekennzeichnet,
daß im Vorbereitungs-Modul enzymbeladene Mikro-Bioreaktoren
verwendet werden, die beispielsweise mit analyt-spezifische
Oxidasen, Dehydrogenasen, Phosphatasen etc. beladen sind und
die bei der Reaktion mit dem Analyten stöchiometrisch Stoffe
freisetzen, wie beispielsweise Wasserstoffperoxid oder NADH
oder Phenol, die einer maßanalytischen Redox-Titration im
Titrations-Modul zugänglich sind.
33. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 32,
dadurch gekennzeichnet,
daß im Vorbereitungs-Modul immunologische Mikro-Bioreaktoren
in Form von Affinitätssäulen verwendet werden, die analyt
selektive Antikörper oder entsprechende Antikörperfragmente
kovalent gebunden enthalten und bei denen die Analyt-
Bindungsstelle mit einem Analyt-Derivat abgesättigt ist, das
a) eine niedrigere Affinitätskonstante als der Analyt
aufweist und b) eine maßanalytisch erfaßbare Gruppe, vor
zugsweise ein reversibles Redox-System (z. B. Ferrocen,
Chinon/Hydrochinon, o. ä.) oder ein Enzym (ELISA-analog)
enthält, das eine redoxaktive Substanz mit Hilfe eines
Substrates erzeugt, was dann vom Analyten quantitativ aus der
Bindungsstelle verdrängt wird, wodurch das markierte Analyt-
Derivat in das Titrations-Modul transportiert wird und dort
direkt oder im ELISA-Fall nach einer gewissen Reaktionszeit
mit einem dort ebenfalls immobilisierten, geeigneten
Substrat, hochgenau bestimmt werden kann.
34. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 33,
dadurch gekennzeichnet,
daß in einem geeigneten Titrations-Modul der Äquivalenz-
Punkt mittels elektrochemischer Indizierung über Leit
fähigkeits, pH- oder redox-sensitiver Mikro-Elektroden in
entsprechenden Mikro-Reaktoren angezeigt wird, wobei dazu
dieses Modul in einen entsprechenden Auswerteleser
gegeben wird, der die Elektrodenkontakte elektrisch mit einer
Auswertungssoftware verbindet und dieses Modul nur dann verwendet
wird, wenn die maßanalytische Reagenz-Mischung in einem anderen Modul
mit dem Probenaliquot umgesetzt wird, wodurch es wieder
verwendbar wird.
35. Verfahren und Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 34,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Schnell-Test den chemischen Sauerstoffbedarf (CSB-
Wert) zu ermitteln gestattet, wozu ein Probenahme-Modul
mit oder ohne besondere Berücksichtigung von Grenzbereichen
mit einem Titrations-Modul vereinigt wird und a) das letzte
unterschiedliche Gramm-Äquivalenzen an stark saurem Kalium
dichromat (entsprechend dem DIN-Verfahren) sowie einen
geeigneten Indikator enthält, oder b) ein weiteres
Oxidations-Modul mit Mikro-Reaktoren mit Chromat-Überschuß
enthält und letzterer nach vorgeschriebener Erhitzung in
einem Trockenschrank durch Öffnen der Verbindungen, zum
Titrations-Modul mit entsprechend gewählten Reduktions-
Äquivalenten und unter Verwendung eines geeigneten Redox-
Indikators "zurücktitriert" wird wobei die Erhitzungsstufe
ggfs. auch mit dem Oxidations-Modul allein durchgeführt
werden kann.
36. Verfahren und Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 35,
dadurch gekennzeichnet,
das der Schnell-Test die Bestimmung des Total Organic Carbon
(TOC) dadurch durchführt, daß neben dem Probennahme-Modul
ein spezielles Oxidations-Modul eingeführt wird in dem die
organischen Bestandteile der Probe durch starke Oxidations
mittel, wie Dichromat, Cer(IV)., Wasserstoffperoxid plus
UV-Licht, usw. bei einem geeigneten pH-Wert zu Kohlendi
oxid oxidiert werden und danach letzteres mittels einer
gaspermeablen Membran in den Titrations-Modul überführt
wird, wo es maßanalytisch als Hydrogencarbonat "titriert"
wird.
37. Verfahren und Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 36,
dadurch gekennzeichnet,
daß alle für eine komplette Blut-, Serum-, oder Urin-Analyse
wichtigen Analyte als Poly-Analyt-Anordnung mittels eines
Verfahrens erfolgt, wo die Strecke einer Verfärbung (oder
Streifenbreite) für die absolute Konzentration steht, was
in einer speziellen Kombination des Probennahme-Moduls, das
hierbei einen Kammeraufsatz mit Luer-Verschluß zur Proben-
Injektion enthält, mit einem speziellen Reaktions-Modul,
welches entweder nur Verbindungskanäle oder Mikro-Bio-
Reaktoren für beispielsweise Glucose, Lactat u. a. enthält,
wobei der Titrations-Modul mittels kontinuierlicher
Titration in Präzisions-Mikro-Kanälen durch Diffusion in
zwei Vorzugsrichtungen erfolgt, wodurch beispielsweise
neben Glucose, Lactat u.w. auch die Elektrolyte über die
Reagenzien der Trockenchemie und selektiven Komplexbildnern
zuverlässig bestimmt werden.
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