EP1807208B1 - Anordnung zur integrierten und automatisierten dna- oder protein-analyse in einer einmal verwendbaren cartridge, herstellungsverfahren für eine solche cartridge und betriebsverfahren der dna- oder protein-analyse unter verwendung einer solchen cartridge - Google Patents

Anordnung zur integrierten und automatisierten dna- oder protein-analyse in einer einmal verwendbaren cartridge, herstellungsverfahren für eine solche cartridge und betriebsverfahren der dna- oder protein-analyse unter verwendung einer solchen cartridge Download PDF

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EP1807208B1
EP1807208B1 EP05801513A EP05801513A EP1807208B1 EP 1807208 B1 EP1807208 B1 EP 1807208B1 EP 05801513 A EP05801513 A EP 05801513A EP 05801513 A EP05801513 A EP 05801513A EP 1807208 B1 EP1807208 B1 EP 1807208B1
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EP
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cartridge
pcr
previous
dna
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Siegfried Birkle
Walter Gumbrecht
Daniela KÜHN
Peter Paulicka
Manfred Stanzel
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Definitions

  • the depressions may advantageously be filled with variable amounts of dry reagent. Through the combination of different dry reagent quantities and well spacing patterns, the desired concentration profiles of the final reagent solutions can be adjusted.
  • a detection module for the electrical detection of the hybridization processes is arranged in the cartridge.
  • the detection module advantageously consists of a precious metal / plastic composite or a semiconductor-processed Silicon chip with precious metal electrodes.
  • electrochemical, magnetic or piezoelectric measuring methods are suitable for electrical detection.
  • PCR for the PCR to be carried out in the cartridge according to the invention, especially for DNA analysis, there are also means for generating a magnetic field for fixing the DNA / magnetic bead complex in a PCR cavity.
  • the PCR cavity must be suitably sealed and must have means for thermal cycling.
  • reagents of this kind which in particular also contain magnetic beads for binding the released DNA, are distributed uniformly between the steps 112 via the flow channel 111.
  • Magnetic beads have DNA- and protein-binding properties, provided that they have been pretreated accordingly. They may interfere with DNA-binding properties.

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Description

  • Anordnung zur integrierten und automatisierten DNA- oder Protein-Analyse in einer einmal verwendbaren Cartridge, Herstellungsverfahren für eine solche Cartridge und Betriebsverfahren der DNA- oder Protein-Analyse unter Verwendung einer solchen Cartridge
  • Die Erfindung bezieht sich auf eine Anordnung zur integrierten und automatisierten DNA- oder Protein-Analyse in einer einmal verwendbaren Cartridge. Als Cartridge wird dabei eine flache Karte im Scheckkartenformat bezeichnet. Daneben bezieht sich die Erfindung auf die Herstellung einer solchen Cartridge. Schließlich bezieht sich die Erfindung auch auf ein Betriebsverfahren für eine DNA- oder Protein-Analyse unter Verwendung einer solchen Cartridge.
  • Zur Nukleinsäureanalytik, beispielsweise zur Analytik von weißen Blutzellen aus Vollblut, zwecks Beantwortung von humangenomischen Fragestellungen müssen zunächst in einer ersten Station als Probenvorbereitungsschritt die Zellen aufgebrochen und anschließend die dabei freigesetzte DNA isoliert werden. In einer zweiten Station erfolgt eine PCR (Polymerase Chain Reaction = Polymerase-Ketten-Reaktion) zur selektiven DNA-Vervielfältigung (Amplifikation), um die Konzentration der nachzuweisenden DNA soweit zu erhöhen, dass diese in einer dritten Station nachgewiesen werden kann.
  • Im Labor werden letztere Teilprozesse separat nach bekanntem Stand der Technik durchgeführt. Die vorstehend erläuterten drei Stationen beinhalten jeweils mehrere Arbeitsschritte und werden voneinander unabhängig mit unterschiedlichen Geräten durchgeführt. Die einzelnen Arbeitsschritte erfolgen weitgehend manuell.
  • Die Realisierung dieser Schritte ist vom Vorhandensein von Laborgeräten - wie einer Zellaufschluss-Apparatur, einem PCR-Gerät (sog. Thermocycler), evtl. einem PCR-Gerät, das für quantitative PCR geeignet ist, einer Elektrophorese-Apparatur, einer Hybridisierungsstation, einem optischen Reader, sog. Eppendorf-Tubes, mehreren Pipettier-Geräten sowie einem Kühlbehälter für Reagenzien - abhängig und muss von geschultem Personal unter Einhaltung von Sicherheitsvorschriften bezüglich Infektionsgefahr, Abfallentsorgung od. dgl. durchgeführt werden. Insbesondere müssen mehrere volumetrische, d.h. genaue, Dosierungen (Pipettieren) von Reagenzlösungen durchgeführt werden. Solche Arbeitsschritte sind zeitaufwendig und kostenintensiv.
  • Vom Stand der Technik sind Einrichtungen zur biochemischen Analyse bekannt, die entsprechend der WO 02/073153 A1 Verwendung von insbesondere siliziumbasierten Messmodulen machen, welche in eine Chipkarte integriert werden können. Dabei werden entsprechend der WO 02/072262 A1 bereits die zur Analyse verwendeten Reagenzien in trockengelagerter Form in das Analysemodul integriert.
  • Davon ausgehend ist Aufgabe der Erfindung die Realisierung eines preisgünstigen, einfach handhabbaren, kompletten DNA-oder Protein-Analyse-Vorganges in einer miniaturisierten Cartridge. Insbesondere sollen folgende Verbesserungen im Vergleich zur Labormethode realisiert werden:
    • Eine vollständige Integration aller Stoffe (evtl. außer Wasser) in einer geschlossenen einmal verwendbaren Cartridge;
    • eine Bevorratung der Reagenzien in einer bei Raumtemperatur lagerstabilen Form;
    • eine automatische Durchführung aller Prozesse in der Cartridge;
    • keine manuellen Arbeitsschritte, außer Injektion der zu analysierenden Probe, z.B. Blut;
    • Kein direkter Kontakt mit gesundheitsgefährdenden Stoffen (Blut und Reagenzien-Abfall verbleiben in der Cartridge);
    • Cartridge-Geometrie erlaubt eine effiziente und schnelle Thermozyklisierung;
    • alle Detektionsvorgänge sollen elektrisch ablaufen und einfach auszulesen sein;
    • die verwendete Cartridge ist klein und kostengünstig herzustellen.
  • Die Aufgabe ist erfindungsgemäß durch eine Anordnung mit einer Cartridge gemäß Patentanspruch 1 gelöst. Die Herstellung einer solchen Cartridge ist Gegenstand des Patentanspruches 33. Betriebsverfahren mit solchen Cartridges sind Gegenstand der nebengeordneten Patentansprüche 37 und 41. Dabei ist Anspruch 37 auf die DNA-Analyse und Anspruch 41 auf die Protein-Analyse gerichtet. Weiterbildungen der Anordnung, des Herstellungsverfahrens und der Betriebsweise bei der Analyse sind in den jeweiligen Unteransprüchen angegeben.
  • Die Erfindung geht insbesondere von der WO 02/072262 A1 und dem dort genannten weiteren Stand der Technik aus. Dort wird eine Analyseeinrichtung mit in Fluidkanälen trockengelagerten, bei Raumtemperatur stabilen Reagenzien beschrieben, die durch Zuführen von Wasser kurz vor ihrer bestimmungsgemäßen Verwendung in Lösung gebracht werden. Die Erfindung geht weiterhin von der nicht vorveröffentlichten DE 10 2004 021780 A1 und der nicht vorveröffentlichten DE 10 2004 021822 A1 aus. Daneben ist es auch bekannt, speziell elektrisch auslesbare Detektionsmodule zu verwenden.
  • Demgegenüber ist Gegenstand der Erfindung eine solche einmal verwendbare Cartridge mit einem System aus Mikrokanälen und/oder Mikrokavitäten für einen vorgegebenen Prozessablauf nach der Probenaufnahme, wobei die Cartridge Strukturen zur Aufnahme der Trockenreagenzien aufweist und diesen Strukturen Mittel zur Durchführung sowohl des Zellaufschlusses einerseits und der PCR andererseits, aber auch der elektrochemischen Detektion zugeordnet sind. Insbesondere haben dabei die Kanäle unterschiedliche, problemangepasste Strukturen. Speziell der Aufschlusskanal hat vorteilhafterweise gestufte Querschnitt zur optimalen Benetzung mit dem Trockenreagenz, während die PCR-Kammer und die Elisa-Reagenzkanäle töpfchenförmige Vertiefungen aufweisen.
  • Es kann somit erreicht werden, dass in einem Verfahrensablauf die Zuführung und Aufbereitung der Probe, die DNA-Amplifikation und die eigentliche Detektion der DNA möglich ist.
  • Durch das erfindungsgemäße System der geometrischen Strukturen in den Mikrokanälen bzw. Mikrokavitäten zur Aufnahme von Trockenreagenzien ergeben sich geeignete Randbedingungen für die DNA-Analyse einerseits und die Protein-Analyse andererseits. Folgende Merkmale und Maßnahmen sind wesentlich:
    • Die im Mikrokanal bzw. in der Mikrokavität eingebrachten Reagenzien sind trockenbare Substanzen mit vernachlässigbarem Dampfdruck. Durch die bei Raumtemperatur stabilen Substanzen bleiben deren Eigenschaften für Zellaufschluss und/oder PCR und/oder Detektion erhalten. Dabei können Gemische aus den Substanzen mit Hilfsstoffen Dünnfilme bilden und können die Gemische mit dünnen Paraffinschichten wasserdicht abgedeckt sein.
  • Bei der Erfindung werden die Reagenzien und Hilfsstoffe bereits bei der Herstellung der Cartridge als Trockensubstanzen in Vertiefungen der Cartridgekanäle4 eingebracht. Daraus ergeben sich folgende Vorteile:
    • einfache und präzise Applikation der Reagenzien bei der Herstellung der Cartridge
    • Schutz der Reagenzien beim Befüllen der Reagenzkanäle, d.h. die Reagenzien werden durch einen sog. Wasserflow nicht weggespült, sondern bleiben beim Füllen des gesamten Kanals erhalten. Erst nach dem Befüllen des Kanals lösen sich die Reagenz-Spots über Diffusionsvorgänge auf und es entsteht eine homogene Reagenzlösung.
  • In einer weiteren besonderen Ausführungsform sind die Vertiefungen in vordefinierten Abständen entlang des Reagenzkanals lokalisiert. Dabei können die Abstände äquidistant sein oder besonders vorteilhaft in variablen Abstandsmustern angeordnet sein.
  • Die Vertiefungen können vorteilhafterweise mit variablen Trockenreagenzmengen befüllt sein. Durch die Kombination von verschiedenen Trockenreagenzmengen und Abstandsmustern der Vertiefungen können die gewünschten Konzentrationsprofile der fertigen Reagenzlösungen eingestellt werden.
  • Für bestimmte Funktionen wie z.B. Zellaufschluss in Gegenwart von Magnet-Beads und Lyse-Reagenzien ist eine gleichmäßige Verteilung der unlöslichen Komponenten, d.h. der Beads, im Trockenreagenz erforderlich. Dazu werden die Magnet-Beads als Suspension in den Lyse-Kanal dispensiert. Beim Verdampfen des Lösungsmittels wird beobachtet, dass sich die Beads in die Randbereiche des Lyse-Kanals zurückziehen und eine gleichmä-βige Verteilung dadurch nicht gegeben ist. Durch stufenartige Strukturierung des Lyse-Kanal-Querschnittes verteilen sich die Magnet-Beads über die Stufen und eine gleichmäßige Verteilung wird erreicht.
  • Damit mit der erfindungsgemäßen Cartridge gleichermaßen ein Zellaufschluss, eine PCR und ein so genannter DNA-/Protein-ELISA-Test durchgeführt werden kann, ist es vorteilhaft, dass in den Mikrokanälen bzw. Mikrokavitäten Substrate mit DNA-bindenden Eigenschaften, insbesondere die DNA-bindenden Magnet-Beads, vorhanden sind. Dabei können die Lyse-Reagenzien und die Magnet-Beads zusammen in einer einzigen Trockenmatrix enthalten sein. Weiterhin sind in der Karte auch die Reagenzien für einen ELISA-Assay vorhanden. Im Einzelnen werden für das ELISA-Assay zwei Reagenzien benötigt, d.h. als erstes Reagenz ein Label-Enzym und als zweites Reagenz ein Enzym-Substrat.
  • Insbesondere ist in der Cartridge ein Detektionsmodul zur elektrischen Detektion der Hybridisierungsvorgänge angeordnet. Das Detektionsmodul besteht vorteilhafterweise aus einem Edelmetall/Plastik-Verbund oder einem halbleiterprozessierten Siliziumchip mit Edelmetallelektroden. Für eine elektrische Detektion geeignet sind dabei insbesondere elektrochemische, magnetische oder piezoelektrische Messverfahren.
  • Zur Anwendung der Erfindung der erfindungsgemäßen Cartridge ist insbesondere ein Eingabeport für eine Vollblutprobe vorhanden. Weiterhin sind Mittel zur Zufuhr von Wasser vorhanden, beispielsweise Zufluss-Ports zum Anschluss an eine externe Wasserzufuhr oder ein integriertes Wasserreservoir. In den Mikrokanälen bzw. Mikrokavitäten haben trockene Puffersubstanzen definierte Ionenstärke nach der Wasserzufuhr.
  • Bei Anwendung der Erfindung zur Analytik von weißen Blutzellen aus Vollblut sind vorteilhafterweise Mittel zum Mischen einer Vollblutprobe mit Wasser bzw. einer Pufferlösung vorhanden. Dabei sind Mittel zum Durchströmen des mit Lyse-/Bead/Reagenz beschichteten Mikrokanals bzw. Mikrokavität mit Blut bzw. Blut/Wasser- oder Blut/Puffer-Gemische vorhanden.
  • Für die in der erfindungsgemäßen Cartridge bei Anwendung speziell zur DNA-Analyse durchzuführende PCR sind weiterhin Mittel zum Generieren eines Magnetfeldes zum Fixieren des DNA-/Magnetbead-Komplexes in einer PCR-Kavität vorhanden. Für diesen Zweck muss die PCR-Kavität geeignet verschlossen werden können und müssen Mittel zur Thermozyklisierung vorhanden sein.
  • Schließlich ist es bei der erfindungsgemäßen Cartridge wesentlich, dass Mittel zum Lagern von verbrauchtem Probenmaterial und verbrauchten Reagenzien vorhanden sind, die Abfall-Reservoirs bilden. Dabei müssen die Mittel zur keimdichten, zell- bzw. partikelfreien Entlüftung von mindestens einem Abfallreservoir geeignet sein. Zum Auslesen der Cartridge in einem Auslesegerät, das nicht Gegenstand der Erfindung ist, müssen schließlich Mittel zur Fixierung der Cartridge vorhanden sein.
  • Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Figurenbeschreibung von Ausführungsbeispielen anhand der Zeichnung in Verbindung mit den Patentansprüchen. Es zeigen in jeweils schematischer Darstellung
    • Figur 1
    eine Cartridge mit einer Übersicht über einzelne Mikrokanal-/ Kavitäten-Systeme mit den zugehörigen Funktionsbezeichnungen,
    Figur 2
    die Draufsicht auf einen Zellaufschlusskanal,
    Figur 3
    den Querschnitt durch den Zellaufschlusskanal gemäß Figur 5,
    Figur 4
    zwei Alternativen des Durchflusskanalquerschnittes in vergrößerter Darstellung,
    Figur 5
    die Draufsicht auf die PCR-Kammer in Figur 1,
    Figuren 6
    und 7 den Querschnitt durch die PCR-Kammer gemäß Figur 5,
    Figur 8
    die Draufsicht auf einen ELISA-Reagenzkanal in Figur 1,
    Figuren 9, 10
    den Querschnitt des ELISA-Reagenzkanals gemäß Figur 8 sowie die
    Figuren 11 bis 23
    die Draufsicht auf die Cartridge gemäß Figur 1 in verschiedenen Verfahrenszuständen während einer automatisierten Auswertung.
  • In den Figuren haben gleiche bzw. gleichwirkende Elemente gleiche Bezugszeichen. Insbesondere die Figuren 1 bis 10 einerseits und die Figuren 11 bis 23 andererseits werden gemeinsam beschrieben.
  • In Figur 1 ist eine Cartridge 100 für einen ELISA ("Enzyme Linked Immuno Sorbent ASSAY") - Test mit einem Aufriss des darin vorhandene Mikrokanal- bzw. Kavitäten-System dargestellt, wobei der Übersicht halber die zugehörigen Funktionsbezeichnungen zusätzlich bezeichnet sind. Die Cartridge 100 besteht im Einzelnen aus einem Kunststoff-Grundkörper 101 mit dort eingebrachten Fluidik-Strukturen, die von einer Kunstofffolie abgedeckt sind. Die Strukturen werden anhand der Figuren 2 bis 10 weiter unten beschrieben.
  • Aus der Draufsicht gemäß Figur 1 ist ein Probenport 102 mit daran anschließender Dosierstrecke 105, über den definiert flüssige Proben zur insbesondere Nukleinsäureanalytik, beispielsweise zur Analytik von weißen Blutzellen aus Vollblut, zwecks Beantwortung von humangenomischen Fragestellungen eingebracht werden können, ersichtlich. Es schließt sich ein Kanalbereich 110 für den Zellaufschluss der Probe und weiterhin speziell für eine der DNA-Analyse ein Bereich 120 für eine PCR (Polymerase Chain Reaction = Polymerase-Ketten-Reaktion) zur selektiven DNA-Vervielfältigung (Amplifikation) an, um die Konzentration der nachzuweisenden DNA soweit zu erhöhen, dass diese in einer dritten Station nachgewiesen werden kann. Die eigentliche PCR-Kammer ist durch Ventile 122, 122' verschließbar. Die Detektion der so aufbereiteten Probe, insbesondere gemäß dem ELISA-Verfahren, erfolgt dann im Bereich 130.
  • Aus Figur 1 sind weiterhin Wasserports 103 bis 103"' ersichtlich. Darüber ist bei der Aufbereitung einer Probe Wasser als Transport- und Lösungsmittel in die Cartrridge 100 einbringbar. Weiterhin sind Entlüftungsports 104 bis 104"' vorhanden.
  • Wie erwähnt hat die Cartridge 100 insbesondere einen EingabePort 102 für eine Vollblutprobe. Dazu sind Mittel zur Zufuhr von Wasser vorhanden. Es kann ein Zuflussport zum Anschluss an eine externe Wasserzufuhr vorhanden sein oder der Zuflussport kann an ein integriertes Wasser-Reservoir angeschlossen werden.
  • Die Mikrokanäle bzw. Mikrokavitäten 101 bis 131 sind im Normalfall mit trockenen Puffersubstanzen gefüllt, die eine definierte Ionenstärke nach Wasserzufuhr gewährleisten. Für die Blutanalyse sind Mittel zum Mischen von Vollblutprobe und Wasser bzw. der Pufferlösung und/oder Mittel zum Durchströmen eines mit einem Lyse-Bead-Reagenz beschichteten Mikrokanals bzw. der Mikrokavität mit Blut oder mit Blut-Wasser- bzw. Blut-Puffer-Gemisch vorhanden.
  • Im Kanalsystem sind weite Bereich 106, 107, 108, 109 als Reservoirs für die Aufnahme von Abfall ("Waste") vorgesehen. Daneben ist ein Bereich mit Kanälen 131 bzw. 131' für die Aufnahme unterschiedlicher ELISA-Reagenzien vorhanden.
  • In den Figuren 2 bis 4 kennzeichnen jeweils Bezugszeichen 101 wieder den Cartridge-Grundkörper. Der Körper beinhaltet speziell für einen Zellaufschluss ("Lyse") einen in besonderer Weise ausgeformten Durchflusskanal 111 mit durch die Seitenkanten gebildeten stufenförmigen Vertiefungen 112 zur Aufnahme von Trockenreagenzien. Die Vertiefungen 112 weisen dabei mehrere Stufen mit Stufenhöhen von 10 bis 500 µm auf und haben eine Ausdehnung von ca. 1 mm und eine Tiefe von etwa 100 µm.
  • Speziell in der Darstellung gemäß der Figur 4a ergibt sich die alternative Möglichkeit, bei einem Durchflusskanal ohne Zusatzvertiefungen die Aufnahme der Lyse-Reagenzien nur im Bereich 113 der Kanten des Durchflusskanals 111 vorzusehen. In Figur 4b sind dagegen derartige Reagenzien, die insbesondere auch Magnet-Beads zur Bindung der freigesetzen DNA enthalten, gleichmäßig zwischen den Stufen 112 über den Durchflusskanal 111 verteilt. Magnet-Beads haben DNA- und Protein-bindende Eigenschaften, sofern sie entsprechend vorbehandelt sind. Sie können mit DNA-bindenden Eigenschaften u. gegebenenfalls auch mit Antikörpern beschichtet sein. Zum Einbringen von Trockensubstanzen als Matrix mit Lyse-Reagenz und Magnet-Beads wird insbesondere auf die ältere DE 10 2004 021780 A1 und die ältere DE 10 2004 021822 der Anmelderin verwiesen.
  • In den Figuren 5 bis 7 ergibt sich die Struktur einer PCR-Kammer 120 im Cartridge-Grundkörper 101 mit Strömen-gaskanal 111. Die Ventilanordnung zum Abschluss der PCR-Kammer bei bestimmungsgemäßer Anwendung ist hier nicht dargestellt. Wesentlich ist, dass in der PCR-Kammer 120 rundzylindrische Vertiefungen 124, 124' zur Aufnahme spezifischer Reagenzien 127, 127', die bei der Durchführung der PCR benötigt werden, vorhanden sind. Speziell in Figur 7 ist dazu dargestellt, dass ein trocken lagerbares, bei Raumtemperatur stabiles PCR-Reagenz 127, 127' zunächst von einer Paraffinschicht 128, 128' abgedeckt ist.
  • Die sachgerechte Durchführung der PCR mit ventilgesteuerter Thermozyklisierung innerhalb einer Cartridge wird im Einzelnen in den parallelen Anmeldungen DE 10 2004 050576.4 und DE 10 2004 050510.1 Anmelderin mit gleicher Anmeldepriorität beschrieben, auf die im vorliegenden Zusammenhang ausdrücklich verwiesen wird ("Incorporation by Reference"). Insbesondere wird darin die Verwendung von Magnet-Beads zur DNA-Bindung und die Konzentration der Magnet-Beads mit der DNA in der PCR-Kammer 120 durch steuerbare Magnetfelder beschrieben, worauf hier nicht mehr im Einzelnen eingegangen wird.
  • Aus den Figuren 8 bis 10 ergibt sich der Aufbau und die Struktur der ELISA-Reagenz-Kanäle 131 und 131' aus Figur 1. Es sind jeweils näpfchenförmige Vertiefungen 132 bis 1326' vorhanden, die zur Aufnahme von vordosierten und vorportionierten Mengen an Reagenzien für den ELISA-Prozess entsprechend Figur 9 geeignet sind. Dies ist im Einzelnen in der eingangs bereits als Stand der Technik genannten WO 02/072262 A1 beschrieben, auf die im vorliegenden Zusammenhang ebenfalls ausdrücklich verwiesen wird ("Incorporation by Reference"). In Figur 10 sind die kreiszylindrischen Vertiefungen 132 bis 1326' mit Trockenreagenzien 133 bis 1336' befüllt dargestellt. Dabei realisiert ein erstes Reagenz ein Markierungsenzym und ein zweites Reagenz ein Enzymsubstrat, wie es bekanntermaßen bei der Hybridisierung der gegebenenfalls durch eine PCR aufbereiteten Probe mit spezifischen Fängersonden benötigt wird. Im nur schematisch angedeuteten Bereich 130 der Detektion können sich in einem Modul aus einem Edelmetall-/Plastik-Verbund unterschiedliche Sensoren zur Erfassung biochemischer Reaktionen befinden. Speziell bei elektrochemischen Messungen mit halbleiterprozessierten Chips, d.h. insbesondere siliziumbasierten Sensoren, können die Signale elektrisch erfasst und unmittelbar weiterverarbeitet werden. Neben elektrochemischen sind auch magnetische und/oder piezoelektrische Messmethoden mit diesbezüglichen Sensoren möglich.
  • In den Figuren 11 bis 23 ist jeweils die Cartridge 100 gemäß Figur 1 in der Draufsicht dargestellt, wobei der jeweils beim Analysevorgang aktive Bereich der Cartridge 100 markiert ist: Dazu wird die Cartridge 100 in ein Analysegerät, das in den Figuren nicht im Einzelnen dargestellt ist und nicht Gegenstand vorliegender Patentanmeldung ist, eingeschoben.
  • Die Auswertung wird nachfolgend anhand elf konkreter Verfahrens-Teilschritte a) bis m) verdeutlicht, nachdem die Cartridge in ein Auswertegerät mit Mitteln zur Aufnahme der Cartridge eingeschoben und das Auswertegerät bei darin fixierter Cartridge aktiviert ist. Unter Bezugnahme auf Figur1 ergeben sich im Einzelnen folgende Teilschritte:
    1. a) Es wird ca. 10 µl Blut als Messprobe eingefüllt. Über die Dosierkapillare 105 wird 1 µl automatisch dosiert.
    2. b) Das überschüssige Blut wird in den Leerraum 106 (Waste 1) gewaschen.
    3. c) Anschließend werden 1 µl Blutprobe mit Wasser verdünnt und in den Zellaufschlusskanal 110 transferiert. Dort finden der Zellaufschluss (Lyse) der Blutzellen sowie das Binden der freigesetzten DNA an die Magnet-Beads statt.
    4. d) Anschließend werden die Magnet-Beads in die PCR-Kammer transferiert und dort gesammelt. Es findet ein Waschvorgang statt, wobei die Waschlösung im Leerraum 107 (Waste 2) gesammelt wird.
    5. e) Nunmehr ist der Waschvorgang abgeschlossen.
    6. f) Anschließend werden die PCR-Kammerventile 122, 122' geschlossen und die PCR durchgeführt.
    7. g) Während der PCR wird gleichermaßen der ELISA-Reagenzkanal 131, der das Enzymsubstrat enthält, mit Wasser gefüllt.
    8. h) Gleichermaßen wird während der PCR der ELISA-Reagenz kanal 131', der das Label-Enzym enthält, mit Wasser gefüllt.
    9. i) Nach der PCR werden die PCR-Kammerventile 122, 122' geöffnet und das PCR-Produkt wird über das Detektionsmodul 130 (in den Waste 3, Kanal 108) geleitet, wo die Hybridisierung mit den spezifischen Fängersonden erfolgt.
    10. j) Der Enzym-Substrat-Kanal wird in den Abfallkanal 108 (Waste 3) entlüftet.
    11. k) Der Label-Enzym-Kanal wird in den Abfallkanal 108 (Waste 3) entlüftet.
    12. l) Die Label-Enzym-Lösung fließt über das Detektionsmodul 130 zum Labeln in den Abfallbereich 109 (Waste 4).
    13. m) Die Enzym-Substrat-Lösung fließt über das Detektionsmodul 130 zur enzymatisch-elektrochemischen Detektion der Hybridisierung in den Abfallbereich 109 (Waste 4).
  • Damit ist das Analyseverfahren abgeschlossen. Insbesondere bei einer elektrochemischen Detektion können die anfallenden Signale elektrisch ausgelesen und prozessorgestützt gemäß vorgegebenem Programm ausgewertet werden.
  • Die anhand der Figur 1 im Einzelnen mit Kanälen und Kavitäten beschriebene Cartridge wird aus einem Polymermaterial, wie z.B. Polycarbonat, beispielsweise in Spritzgusstechnik, hergestellt. Dabei wird zunächst der Karten-Grundkörper 101 mit nach oben offenen Strukturen hergestellt und es werden die Reagenzien in die zunächst offenen Kanäle bzw. Kavitäten gespottet und anschließend getrocknet. Das Detektionsmodul wird in geeigneter Weise in die Cartridge eingebracht, insbesondere eingeklebt. Zum Abschluss werden die Kanäle und die Kavitäten z.B. mit einer elastischen Folie als obere Abdeckung versehen und ist damit für den bestimmungsgemäßen Gebrauch abgeschlossen.
  • Es ist auch möglich, dass auf den offenen Kartengrundkörper 101 vor dem abdeckseitigen Abschluss und Fertigstellung der Cartridge bestimme Sondereinrichtungen, beispielsweise als Dichtungsmaterialien und/oder Entlüftungsmaterialien, aufgebracht werden.
  • Das konkrete Messverfahren wurde anhand der Figuren 11 bis 23 für einen spezifischen Fall der DNA-Analyse einer Probe aus Vollblut erläutert. Allgemein ist vorgesehen, die beschriebene Cartridge für die DNA-Analyse einerseits und/oder die Proteinanalyse andererseits einzusetzen, wobei - wie vorstehend bereits erwähnt - ein entsprechendes Auslesegerät und zugehörige Auswertealgorithmen zu Hilfe genommen werden. Damit ergeben sich definierte Betriebsverfahren, welche die anhand der Beispiele beschriebene Cartridge erst praxistauglich zum dezentralen Einsatz im Rahmen einer medizinischen "Point of Care"-Anwendung machen.
  • Abschließend wird speziell für die DNA-Analyse nochmals das integrierte Betriebsverfahren der oben im Einzelnen beschriebenen Cartridge als Kombination bzw. in der Abfolge der einzelnen Teilschritte zusammengefasst:
    • Aufgeben der Probe in Cartridge
    • Einschieben der Cartridge in Auslesegerät,
    • Starten des vollautomatischen Assays
      • Proben-Dosierung über Dosierstrecke
      • Waschen der Dosierstrecke
      • Verdünnen der Probe und Einbringen in Lyse-Kanal
      • Verweilen im Lyse-Kanal
      • Sammeln des DNA-Bead-Komplexes durch Beadsammler in der PCR-Kammer
      • Waschen des DNA-Bead-Komplexes mit Wasser
      • Verschließen der PCR-Kammer
      • Durchführung der PCR
      • Während der PCR: Füllen der beiden ELISA-Reagenzkanäle mit Wasser
      • Öffnen der PCR-kammer
      • Transport des PCR-Produkts in Detektionskammer
      • Hybridisierung in der Detektionskammer
      • Entlüften der beiden ELISA-Reagenzkanäle
      • Füllen und Spülen der Detektionskammer mit ELISA Reagenz 1
      • Füllen und Spülen der Detektionskammer mit ELISA-Reagenz 2
      • Durchführung der elektrochemischen Messungen.
  • Bei den elektrochemischen Messungen erfolgt zunächst das Durchspülen der Detektionskammer mit einer ein Enzymlabel tragenden Antikörperlösung (ELISA-Reagenz 1). Dann erfolgt das Durchspülen der Detektionskammer mit Enzymsubstrat (ELISA-Reagenz 2). Die elektrochemischen Messungen werden in an sich bekannter Weise bei vorgebbaren, unterschiedlichen Temperaturen und änderbarer Fließgeschwindigkeiten der Enzym-substrat-Lösung durchgeführt.
  • Für die Protein-Analyse werden entsprechende Vorgehensweisen angewandt, wobei in diesem Fall die PCR nicht zum Tragen kommt.

Claims (43)

  1. Anordnung zur integrierten und automatisierten DNA- oder Protein-Analyse einer Messprobe in einer mit Trockenreagenzien befüllten einmal verwendbaren Cartridge (Karte), mit folgenden Merkmalen zur automatischen Durchführung aller für die Prozessanalytik aus einzelnen Teilprozessen in der Cartridge notwendigen Maßnahmen:
    - In der Cartridge (100) ist ein System von Mikrokanälen und/oder Mikrokavitäten (101 bis 131) für eine mikrofluidische Prozesstechnik vorhanden;
    - die Mikrokanäle bzw. die Mikrokavitäten (101 bis 131) weisen vorgegebene Vertiefungen auf, um Reagenzien aufzunehmen, wobei
    - die Reagenzien an bestimmten Stellen in den Mikrokanälen bzw. die Mikrokavitäten (101 bis 131) der Cartridge (100) in einer lagerstabilen Form bevorratet sind;
    - es sind Mittel vorhanden, um die trockengelagerten Reagenzien für den jeweiligen Teilprozess in geeigneter Form, insbesondere als flüssiges Reagenz, bereit zu stellen.
  2. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vertiefungen mindestens eine Stufe mit Stufenhöhen von 10 bis 500 µm aufweisen.
  3. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vertiefungen eine Ausdehnung von ca. 1 mm und eine Tiefe von etwa 100 µm haben.
  4. Anordnung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Vertiefungen Zylindrisch sind, wobei die Ausdehnung den Durchmesser darstellt.
  5. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in den Mikrokanälen bzw. in den Mikrokavitäten (101 bis 131) eingebrachte Reagenzien folgende Eigenschaften aufweisen:
    - Es sind trockenbare Substanzen mit vernachlässigbarem Dampfdruck, die bei Raumtemperatur stabil sind, so dass die Eigenschaften für einen Zellaufschluss bzw. eine PCR bzw. zur Detektion biochemischer Größen erhalten bleiben.
  6. Anordnung nach Anspruch 5 , dadurch 6. Anordnung nach Anspruch 5 , dadurch gekennzeichnet, dass Gemische aus der jeweiligen Substanz mit Hilfsstoffen dünne Filme bilden, die an den Wandungen haften.
  7. Anordnung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet dass in Teile der Mikrokanäle bzw. Mikrokavitäten (101 bis 131) eingebrachten Substanzen bzw. Gemische mit dünnen Paraffinschichten wasserdicht abgedeckt sind.
  8. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 5-7 durch gekennzeichnet, dass die in Teile der Mikrokanäle bzw. Mikrokavitäten (101 bis 131) eingebrachten Substanzen DNA- oder Protein-bindende Eigenschaften aufweisen.
  9. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 5-8, dadurch gekennzeichnet, dass die in Teile der Mikrokanäle bzw. Mikrokavitäten (101 bis 131) eingebrachten Substanzen Magnet-Beads mit spezifischen Bindungseigenschaften sind.
  10. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Magnet-Beads mit Antikörpern beschichtet sind.
  11. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Magnet-Beads mit DNA-bindende Substanzen beschichtet sind.
  12. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 9-11, wobei gleichermaßen Lyse-Reagenzien und Magnet-Beads vorhanden sind, dadurch gekennzeichnet, dass die Lyse-Reagenzien und die Magnet-Beads in einer einzigen Trockenmatrix enthalten sind.
  13. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein so genannter DNA-ELISA-Assay oder Protein-ELISA-Assay (130, 131) durchführbar ist, wobei als Reagenzien für das ELISA-Assay (130, 131) ein Label-Enzym (Reagenz 1) und ein Enzymsubstrat (Reagenz 2) vorhanden sind.
  14. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Detektionsmodul (130) zur elektrischen Detektion der Hybridisierungsvorgänge vorhanden ist.
  15. Anordnung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionsmodul (130) aus einem Edelmetall/Plastik-Verbund besteht.
  16. Anordnung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionsmodul aus einem halbleiterprozessierten Siliziumchip mit Edelmetallelektroden besteht.
  17. Anordnung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass als Mittel für die elektrische Detektion elektrochemische, magnetische und/oder piezoelektrische Messmethoden eingesetzt werden.
  18. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Cartridge (100) einen EingabePort (102) für eine Vollblutprobe hat.
  19. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel (103 bis 103"') zur Zufuhr von Wasser, insbes ein Zuflussport, vorhanden ist.
  20. Anordnung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass ein Zuflussport zum Anschluss an eine externe Wasserzufuhr vorhanden ist.
  21. Anordnung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Zuflussport an ein integriertes Wasser-Reservoir angeschlossen ist.
  22. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrokanäle bzw. Mikrokavitäten (101 bis 131) mit trockenen Puffersubstanzen definierter Ionenstärke nach Wasserzufuhr gefüllt sind.
  23. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zum Mischen von Vollblutproben und Wasser bzw. der Pufferlösung vorhanden sind.
  24. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zum Durchströmen des mit Lyse-Bead-Reagenz beschichteten Mikrokanals bzw. der Mikrokavität mit Blut oder mit Blut-Wasser- bzw. Blut-Puffer-Gemisch vorhanden sind.
  25. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zum Generieren eines Magnetfeldes zwecks Fixierung des DNA-/Magnet-Bead- oder Protein-Magnet-Bead Komplexes vorhanden sind.
  26. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zum Generieren eines Magnetfeldes zwecks Fixierung des DNA/Magnet-Bead-Komplexes in einer PCR-Kavität vorhanden sind.
  27. Anordnung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zum Verschließen der PCR-Kavität vorhanden sind.
  28. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zur Thermozyklisierung der Probe vorhanden sind.
  29. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in der Cartridge (Karte) Mittel zum Lagern von verbrauchtem Probenmaterial und/oder verbrauchten Reagenzien vorhanden sind.
  30. Anordnung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zum Lagern von verbrauchtem Probenmaterial und/oder verbrauchten Reagenzien Abfallreservoirs bilden.
  31. Anordnung nach Anspruch 30 , dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zum keimdichten, partikel- bzw. zellfreien Entlüften der Abfall-Reservoirs vorhanden sind.
  32. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zur Fixierung der Cartridge in einem Auslesegerät vorhanden sind.
  33. Verfahren zur Herstellung einer bei der Anordnung gemäß Anspruch 1 oder einem der Ansprüche 2 bis 32 verwendeten Cartridge, mit folgenden Verfahrensschritten:
    - Ein Cartridge-Grundkörper mit Kanälen und/oder Kavitäten wird aus Polymer gefertigt,
    - in die offenen Kanäle, welche geometrische Strukturen in Form von Vertiefungen umfassen, werden Reagenzien gespottet und dort getrocknet,
    - die Kanäle und/oder Kavitäten werden durch eine Folie verschlossen.
  34. Herstellungsverfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass der Karten-Grundkörper durch Spritzgusstechnik hergestellt wird.
  35. Herstellungsverfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass Sondermaterialien, wie beispielsweise Dichtungsmembranen, Entlüftungsmembranen od. dgl., auf den Kartenkörper aufgebracht werden.
  36. Herstellungsverfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Abdichten des Kartenkörpers ein Detektionsmodul mit Messmitteln eingebracht, insbesondere eingeklebt, wird.
  37. Betriebsverfahren für eine DNA-Analyse in einer Anordnung gemäß Anspruch 1 oder einem der Ansprüche 2 bis 32, mit folgenden Maßnahmen:
    - Aufgeben der Probe in die Cartridge,
    - Einschieben der Cartridge in ein Auslesegerät,
    - Starten des vollautomatischen Assays.
  38. Betriebsverfahren nach Anspruch 37, mit folgenden Schritten beim Betrieb des vollautomatischen Assays:
    - Über eine Dosierstrecke erfolgt eine Probendosierung,
    - die Dosierstrecke wird gewaschen,
    - die Messprobe wird verdünnt und in den Lysekanal eingebracht,
    - durch Verweilen im Lysekanal erfolgt ein Zellaufschluss,
    - der gebildete DNA-Bead-Komplex wird durch einen Flüssigkeitsstrom in die PCR-Kammer gebracht und durch einen BeadSammler in die PCR-Kammer gehalten
    - es erfolgt ein Waschen des DNA-Bead-Komplexes mit Wasser,
    - die PCR-Kammer wird verschlossen,
    - die PCR wird durchgeführt,
    - nach Beendigung der PCR wird das PCR-Produkt in die Detektionskammer transportiert
    - in der Detektionskammer finden Hybridisierungsvorgänge mit spezifischen Fängersonden statt,
    - es erfolgt das Durchspülen der Detektionskammer mit Markierungsenzym
    - es erfolgt das Durchspülen der Detektionskammer mit Enzymsubstrat
    - es erfolgt die Durchführung der elektrochemischen Messungen
    - die elektrochemischen Messungen werden bei verschiedenen Temperaturen und verschiedenen Fließgeschwindigkeiten der Enzymsubstrat-Lösung durchgeführt.
  39. Betriebsverfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass während der PCR die ELISA-Reagenzkanäle mit Wasser gefüllt werden.
  40. Betriebsverfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Hybridisierung die beiden ELISA-Kanäle entlüftet werden, dass anschließend die Detektionskammer zunächst mit dem ersten ELISA-Reagenz gasblasenfrei gespült und anschließend mit dem zweiten ELISA-Reagenz gasblasenfrei gespült wird, und dass anschließend die elektrochemische Messung durchgeführt wird.
  41. Betriebsverfahren für eine Protein-Analyse in einer Anordnung gemäß Anspruch 1 oder einem der Ansprüche 2 bis 32, mit folgenden Maßnahmen:
    - Aufgeben der Probe in die Cartridge,
    - Einschieben der Cartridge in ein Auslesegerät,
    - Starten des vollautomatischen Assays.
  42. Betriebsverfahren nach Anspruch 41, mit folgenden Schritten beim Betrieb des vollautomatischen Assays:
    - Über eine Dosierstrecke erfolgt eine Probendosierung,
    - die Dosierstrecke wird gewaschen,
    - die Messprobe wird verdünnt und durch einen Flüssigkeitsstrom in die Detektionskammer transportiert
    - in der Detektionskammer finden Bindungsvorgänge zwischen den Proteinen der Messprobe und spezifischen Fängerantikörpern bzw. Fängerproteinen statt,
    - es erfolgt, das Durchspülen der Detektionskammer mit einer ein Enzymlabel tragenden Antikörperlösung (ELISA-Reagenz 1),
    - es erfolgt das Durchspülen der Detektionskammer mit Enzymsubstrat (ELISA-Reagenz 2)
    - es erfolgt die Durchführung der elektrochemischen Messungen.
  43. Betriebsverfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Hybridisierung die beiden ELISA-Kanäle entlüftet werden, dass anschließend die Detektionskammer zunächst mit dem ersten ELISA-Reagenz gasblasenfrei gespült und anschließend mit dem zweiten ELISA-Reagenz gasblasenfrei gespült wird, und dass anschließend die elektrochemische Messung durchgeführt wird.
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