JP4639391B2 - 微小液滴の溶合による液滴の形成方法及びその装置 - Google Patents

Description

本発明は、微少量で２液混合や一分子、一細胞などの溶液交換などに利用できる微小液滴の溶合による液滴の形成方法及びその装置に関するものである。

従来、マイクロリアクターとして小さな容器が用いられていた（下記非特許文献１，２参照〕。また、液体微粒子の静電ハンドリング（下記特許文献１，２参照）、又はエレクトロウェッテイング−オン−誘電材料（ＥＷＯＤ）により液滴を移動させたり、分割したり、溶かしたりすることは可能であった。
ＷＯ ０２／０６６９９２ Ａ１ ＷＯ ０３／０５７８７５ Ａ１ Ｙ．Ｒｏｎｄｅｌｅｚ ｅｔ．ａｌ．，２００５，Ｎａｔｕｒｅ，４３３，ｐｐ．７７３−７７７ Ｐ．Ｓ．Ｄｉｔｔｒｉｃｈ ｅｔ．ａｌ．，２００４，μＴＡＳ ２００４，ｐｐ．５２−５４

しかしながら、マイクロリアクターとして小さな容器を用いる場合には、反応物を加えて、反応の開始を正確に制御することは困難であった。また、従来の装置は、本来、液滴と電極との間の接触が求められる。そのため、蛋白質の表面吸収に関する蛋白質の反応分析のためには適合しないものであった。
さらに、ナノおよびピコリッター（ｐｉｃｏｌｉｔｅｒ）のスケールでの液滴の操作のためには、電極の集積化及び制御が大幅に変更されるべきである。

本発明は、上記状況に鑑みて、微小液滴の溶合による液滴の形成にあたり、連続相中の異なった反応物を含む２つの液滴間の電気的融合を簡便に、的確に、しかもその融合の開始を正確に決定し制御することができる微小液滴の溶合による液滴の形成方法及びその装置を提供することを目的とする。

本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕微小液滴の溶合による液滴の形成方法において、両親媒性分子を含む連続相液中に第１の分散相液と第２の分散相液を供給し、前記第１の分散相液からなる第１の液滴と前記第２の分散相液からなる第２の液滴とを生成させ、この第１の液滴とこの第２の液滴の接触を促すように、その容積が連通する上流及び下流のチャンネルの容積より大きくなるように形成された融合チャンバーに前記第１の液滴と前記第２の液滴を導き、前記融合チャンバー内で前記第１の液滴と前記第２の液滴とを接触させ、前記融合チャンバーの両側に形成された電極を介して前記接触した第１の液滴と第２の液滴とに電界を印加して、前記第１の液滴と前記第２の液滴を融合させることを特徴とする。

〔２〕上記〔１〕記載の微小液滴の溶合による液滴の形成方法において、前記電界の印加は、前記電極へ２０−２００Ｖの直流電圧で１０μｓの間隔のパルスを印加することによって行うことを特徴とする。
〔３〕上記〔１〕又は〔２〕記載の微小液滴の溶合による液滴の形成方法において、前記第１の液滴はβ−ガラクトシダーゼ反応物を含み、前記第２の液滴はｄｉ−β−Ｄ−ガラクトピラノース（ＦＤＧ）反応物を含むことを特徴とする。

〔４〕微小液滴の溶合による液滴の形成装置において、両親媒性分子を含む連続相液中に第１の分散相液からなる第１の液滴と第２の分散相液からなる第２の液滴とを生成する手段と、前記第１の液滴と前記第２の液滴の接触を促すように、その容積が連通する上流及び下流のチャンネルの容積より大きくなるように形成され、前記第１の液滴と前記第２の液滴が導かれる融合チャンバーと、この融合チャンバー内で前記第１の液滴と前記第２の液滴とを接触させる手段と、前記融合チャンバーの両側に形成される電極と、前記電極を介して前記接触した第１の液滴と第２の液滴とを融合するために電界を印加する電界印加手段とを具備することを特徴とする。

〔５〕上記〔４〕記載の微小液滴の溶合による液滴の形成装置において、前記電界印加手段は、２０−２００Ｖの直流電圧で１０μｓの間隔のパルスを印加する手段であることを特徴とする。

本発明によれば、以下のような効果を奏することができる。
（１）液滴の形成にあたって、その反応の開始を正確に決定し制御することができる。
（２）簡便、的確に、微小液滴の溶合による液滴の形成を行うことができる。
（３）反応の連続的な観察が可能である。実際に、β−ガラクトース液滴とｄｉ−β−Ｄ−ガラクトピラノース（ＦＤＧ）液滴との融合を行い、蛍光顕微鏡を用いて酸素化反応を観察した。

本発明の微小液滴の溶合による液滴の形成方法は、両親媒性分子を含む連続相液中に第１の分散相液と第２の分散相液を供給し、前記第１の分散相液からなる第１の液滴と前記第２の分散相液からなる第２の液滴とを生成させ、この第１の液滴とこの第２の液滴の接触を促すようにその容積が連通する上流及び下流のチャンネルの容積より大きくなるように形成された融合チャンバーに前記第１の液滴と前記第２の液滴を導き、前記融合チャンバー内で前記第１の液滴と前記第２の液滴とを接触させ、前記融合チャンバーの両側に形成された電極を介して前記接触した第１の液滴と第２の液滴とに電界を印加して、前記第１の液滴と前記第２の液滴を融合させる。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
図１は本発明の実施例を示す微小液滴の融合による液滴の形成装置の模式図である。
この図において、１は両親媒性分子を含む連続相液〔両親媒性分子を含む有機連続相液（例えば、ヘキサデカン、リキッドパラフィンなどの油）〕２を供給する第１のチャンネル、３は第１のチャンネル１に対して垂直に交わり第１の分散相液（第１の反応物を含む第１の水溶液）４を供給する第２のチャンネルであり、連続相液２中に第１の分散相液４が供給されることにより第１の分散相液４からなる液滴５が生成される。一方、６は第１のチャンネル１に対して垂直に交わり第２の分散相液（第２の反応物を含む第２の水溶液）７を供給する第３のチャンネルであり、連続相液２中に第２の分散相液７が供給されることにより第２の分散相液７からなる液滴８が生成される。９は第１のチャンネル１に連通される融合チャンバー、１０，１１は融合チャンバー９を挟むように対向して配置されるシリコン電極、１２は融合チャンバー９に連通される排出のための第４のチャンネル、１３はシリコン電極１０，１１に接続されるパルス電圧発生器（電界発生器）、１４は制御装置である。ここで、第１のチャンネル１から融合チャンバー９に移動した第１の分散相液４からなる液滴５と第２の分散相液７からなる液滴８は幅の広い容積が大きい融合チャンバー９内で互いに接触する。このとき、第１の分散相液４からなる液滴５と第２の分散相液７からなる液滴８とは、連続相液２の両親媒性分子（界面活性剤的機能を有する）が介在することにより容易には融合しないが、制御装置１４によって制御したパルス電圧発生器１３から５０−２００Ｖの直流電圧で１０μｓの間隔のパルスを、シリコン電極１０と１１の間に、印加すると、接触した第１の分散相液４からなる液滴５と第２の分散相液７からなる液滴８は、印加されたパルス状の電界により初めて融合し、融合液滴１５が生成される。なお、図示しないが、連続相液及び分散相液はシリンジポンプにより本装置内に導入されている。

以下、その微小液滴の溶合による液滴の形成装置の製造について説明する。
図２は本発明の微小液滴の溶合による液滴の形成装置のシリコン電極の製造方法を示す断面図、図３はＳＵ−８の型にＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を入れてチャンネルを生成している際の断面図、図４はそれらが組み合わされた液滴の形成装置の断面図、図５はその液滴の形成装置の外面を示す図面代用写真、図６はその液滴の形成装置の内部の構造を示す図面代用写真である。

図２（ａ）に示すように、パイレックス（登録商標）ガラス板２１上に陽極ボンディングシリコン膜２２を積層する。次に、図２（ｂ）に示すように、シリコン膜２２をアルミニウム２３でマスクしてドライエッチングによりパターニングする。すると、図２（ｃ）に示すように、パイレックス（登録商標）ガラス板２１上に一対のシリコン電極２４が形成される。

一方、チャンネル３１は、図３に示すように、ＰＤＭＳをＳＵ−８モールド３２により成形したＰＤＭＳスラブ３３からなる。
そこで、図４に示すように、図２（ｃ）に示したパイレックス（登録商標）ガラス板２１上の一対のシリコン電極２４の上に、図３に示したＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）スラブ３３を配置する。ここで、ＰＤＭＳスラブ３３は顕微鏡を用いて下部のシリコン電極２４に位置決めされる。そして、リード線４１は導電性の接着剤を用いてシリコン電極２４に接続される。分散相液及び連続相液チャンネルの幅は、それぞれ１００μｍ及び２５０μｍであり、融合チャンバーの大きさは７５０μｍ×１０００μｍである。全てのチャンネルが深さ２００μｍである。チャンネルはヘキサデカンによってＰＤＭＳが膨張するのを防止するためにＣＹＴＯＰ（商標）で被覆されている。被覆することで実験の時間中（略１時間）著しい膨張を招くことなく使用できる。これらの装置は、図４に示すように、２枚のアクリル板４２の間に挟まれる。

そして、連続相液２には両親媒性分子（界面活性剤的機能を有する）が有機連続相液に加えられ、接触によって不必要に分散相液からなる液滴が融合するのを防止する。連続相中で、異なった反応物を含んでいる水溶性液滴がＴ字路で形成され、下流の融合チャンバー９へと流れる。図１のような融合チャンバー９の形状とすることにより、（１）接触させる２つの液滴５，８を一定距離内に導き、（２）並列に位置決めされた２つの液滴５，８に融合のための電界を印加することができる。ここでは、直流電圧信号（５０−２００Ｖで１０μｓの間隔のパルス信号）を印加する。それにより接触している２つの液滴５，８は融合し、融合液滴１５が形成される。これは、電界の印加により２つの液滴５，８の界面で両親媒性分子（界面活性剤的機能を有する）が分解されるためと思われる。液滴５，８の融合によってもたらされる反応の連続監視のために、融合チャンバー９において液滴５，８の接触がもたらされた後に、連続相液２の流れを停止してもよい。本発明の装置により、上記のような電界印加によって融合反応の開始を正確に制御可能にする。このような閉じたチャンネル中での操作であるため、開放空気中における望ましくないマイクロ液滴の蒸発や汚染の問題は全くない。

以下、融合チャンバーで電界が印加されない場合（図７）と本発明のように融合チャンバーで電界が印加される場合（図８）とを対比して説明する。
図７より分かるように、電界が印加されない場合、第１の分散相液４からなる液滴５（黒矢印）と第２の分散相液７からなる液滴８（白矢印）は融合チャンバー９で接触はするが、融合することなく、第４のチャンネル１２から排出される。一方、図８に示すように、電界が印加される場合は、第１の分散相液４からなる液滴５と第２の分散相液７からなる液滴８は融合チャンバー９で接触し、シリコン電極１０，１１間に印加された電界によって第１の分散相液４からなる液滴５と第２の分散相液７からなる液滴８が融合し、融合液滴１５を得ることができる。ここでは、５０Ｖ以上の電圧の印加で融合を達成した。高電圧を印加した方が融合の成功率が上がる。なお、移動している液滴よりも静止している液滴の方が低電圧で融合できる（２０Ｖ程の低い電圧で融合できる）。

図９はその２つの液滴の融合のプロセスを高速度カメラで撮像した図である。
この図に示すように、０ｍｓでは２つの液滴は接触している。０．５ｍｓから４．０ｍｓへと移行するにつれて融合が進み、６．０ｍｓになると略球状の融合液滴となることがわかる。
図１０は本発明の液滴の反応による蛍光の強さと時間との関係を示す図である。

ここでは、２種類の分散相液として、β−ガラクトシダーゼとＦＤＧを反応物としてそれぞれ含む水溶液を用意し、それらが融合する場合を示している。約１分の間隔で反応を観察するために蛍光顕微鏡法が用いられた。
この図から明らかなように、融合液滴を明確に捕らえることができた。
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づき種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。

本発明の微小液滴の溶合による液滴の形成方法及びその装置は、ナノリッタースケールの液滴の融合及びその制御に好適であり、特に化学反応速度論（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）研究のツールとして貢献するところは大である。また、ＤＮＡ，ＲＮＡ，リボソーム、酵素などの物質を液滴の生成に用いれば、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でのタンパク質の発現のような生物学的な解析にも役立つ。

本発明の実施例を示す微小液滴の溶合による液滴の形成装置の模式図である。 本発明の微小液滴の溶合による液滴の形成装置のシリコン電極の製造方法を示す断面図である。 ＳＵ−８の型にＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を入れてチャンネルを生成している際の断面図である。 本発明の微小液滴の溶合による液滴の形成装置の断面図である。 本発明の微小液滴の溶合による液滴の形成装置の外面を示す図面代用写真である。 本発明の微小液滴の溶合による液滴の形成装置の内部の構造を示す図面代用写真である。 本発明の融合チャンバーで電界が印加されない場合の液滴の動きを示す図である。 本発明の融合チャンバーで電界が印加された場合の液滴の動きを示す図である。 本発明の融合チャンバーでの２つの液滴の融合のプロセスを高速カメラで撮像した図である。 本発明の液滴の反応による蛍光の強さと時間との関係を示す図である。

１ 第１のチャンネル
２ 両親媒性分子を含む連続相液〔有機連続相液（例えば、油）〕
３ 第２のチャンネル
４ 第１の分散相液（第１の反応物を含む第１の水溶液）
５ 第１の分散相液からなる液滴
６ 第３のチャンネル
７ 第２の分散相液（第２の反応物を含む第２の水溶液）
８ 第２の分散相液からなる液滴
９ 融合チャンバー
１０，１１，２４ シリコン電極
１２ 第４のチャンネル
１３ パルス電圧発生器（電界発生器）
１４ 制御装置
１５ 融合液滴
２１ パイレックス（登録商標）ガラス板
２２ 陽極ボンディングシリコン膜
２３ アルミニウム
３１ チャンネル
３２ ＳＵ−８モールド
３３ ＰＤＭＳスラブ
４１ リード線
４２ ２枚のアクリル板

Claims (5)

1. （ａ）両親媒性分子を含む連続相液中に第１の分散相液と第２の分散相液を供給し、前記第１の分散相液からなる第１の液滴と前記第２の分散相液からなる第２の液滴とを生成させ、
   （ｂ）該第１の液滴と該第２の液滴の接触を促すように、その容積が連通する上流及び下流のチャンネルの容積より大きくなるように形成された融合チャンバーに前記第１の液滴と前記第２の液滴を導き、
   （ｃ）前記融合チャンバー内で前記第１の液滴と前記第２の液滴とを接触させ、
   （ｄ）前記融合チャンバーの両側に形成された電極を介して前記接触した第１の液滴と第２の液滴とに電界を印加して、前記第１の液滴と前記第２の液滴を融合させることを特徴とする微小液滴の溶合による液滴の形成方法。
2. 請求項１記載の微小液滴の溶合による液滴の形成方法において、前記電界の印加は、前記電極へ２０−２００Ｖの直流電圧で１０μｓの間隔のパルスを印加することによって行うことを特徴とする微小液滴の溶合による液滴の形成方法。
3. 請求項１又は２記載の微小液滴の溶合による液滴の形成方法において、前記第１の液滴はβ−ガラクトシダーゼ反応物を含み、前記第２の液滴はｄｉ−β−Ｄ−ガラクトピラノース（ＦＤＧ）反応物を含むことを特徴とする微小液滴の溶合による液滴の形成方法。
4. （ａ）両親媒性分子を含む連続相液中に第１の分散相液からなる第１の液滴と第２の分散相液からなる第２の液滴とを生成する手段と、
   （ｂ）前記第１の液滴と前記第２の液滴の接触を促すように、その容積が連通する上流及び下流のチャンネルの容積より大きくなるように形成され、前記第１の液滴と前記第２の液滴が導かれる融合チャンバーと、
   （ｃ）該融合チャンバー内で前記第１の液滴と前記第２の液滴とを接触させる手段と、
   （ｄ）前記融合チャンバーの両側に形成される電極と、
   （ｅ）前記電極を介して前記接触した第１の液滴と第２の液滴とを融合するために電界を印加する電界印加手段とを具備することを特徴とする微小液滴の溶合による液滴の形成装置。
5. 請求項４記載の微小液滴の溶合による液滴の形成装置において、前記電界印加手段は、２０−２００Ｖの直流電圧で１０μｓの間隔のパルスを印加する手段であることを特徴とする微小液滴の溶合による液滴の形成装置。