CN109576345A - 一种用于dna提取的微流控芯片及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及一种用于DNA提取的微流控芯片及其检测方法，包括：细胞破碎单元、核酸提取单元和LAMP扩增单元；其中，所述细胞破碎单元，用于破碎待检测样品溶液中的细胞并将破碎后得到的细胞液输送至核酸提取单元；所述核酸提取单元，从所述细胞液中提取核酸，分离所述核酸和提取核酸后剩余的细胞残液，并将所述核酸输送至LAMP扩增单元；所述LAMP扩增单元，供所述核酸进行LAMP扩增以及供核酸扩增后的产物进行显色反应，本发明的微流控芯片可以依次完成细胞破碎、核酸提取和扩增显色的过程，不需要借助大型仪器，方便携带，操作简单，效率高，方便于实验室以外的现场实施快速检测。

Description

一种用于DNA提取的微流控芯片及其检测方法

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及一种用于DNA提取的微流控芯片及其检测方法。

背景技术

DNA检测技术，是对DNA分子结构、含量和序列的检测和分析，是生物医药领域研究和应用的基础。DNA检测的一大挑战是获取非常稀少样本的DNA信息，如远古生物化石中的DNA，人类毛发、血液中的稀有DNA片段等，必须依赖DNA的扩增技术。环节导等温扩增技术(LAMP)是一种近年来发展较快的核酸扩增技术，根据链置换DNA聚合酶的扩增特性以及特异性引物(针对靶序列6个区域设计的4条特异性引物)，利用链置换DNA聚合酶保证引物在等温条件下顺利与模板结合并进行扩增反应，与聚合酶链式反应有等同的特异性和灵敏度，可实现在恒温条件下的连续快速扩增，同时还可添加环引物，提高扩增效率，优于PCR。

微流控技术是以微加工技术实现微体积反应，用以取代常规分子生物学、化学、免疫学或药物分析反应，并可实现多通量或高通量反应使得实验检测成本大幅降低，显著提高效率。

目前许多研究将环介导恒温扩增与微流控芯片结合，对病原体核酸、肿瘤标记基因、耐药位点等进行快速检测，但是以上研究仍然需要借助其他大型仪器，如离心机、荧光检测仪或者凝胶电泳等，而且工艺步骤繁多，如细胞破碎和DNA提取过程中需要反复处理细胞液和试剂，致使无法在实验室以外的现场(包括患者床旁、急诊科室、医师诊所、家庭内等场所)实施快速检测，因此，在实际应用中，开发一种方便携带，操作简单，高效率的检测DNA的芯片，具有重要意义。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的DNA检测设备体积大型、操作繁多、效率低下的缺陷，从而提供一种用于DNA提取的微流控芯片和检测方法。

本发明提供了一种用于DNA提取的微流控芯片，包括：细胞破碎单元、核酸提取单元和LAMP扩增单元；其中，

所述细胞破碎单元，用于破碎待检测样品溶液中的细胞并将破碎后得到的细胞液输送至核酸提取单元；

所述核酸提取单元，从所述细胞液中提取核酸，分离所述核酸和提取核酸后剩余的细胞残液，并将所述核酸输送至LAMP扩增单元；

所述LAMP扩增单元，供所述核酸进行LAMP扩增以及供核酸扩增后的产物进行显色反应。

所述细胞破碎单元包括：

破碎腔，用于容置所述待检测样品溶液；

第一叉指换能器，用于向所述破碎腔输出声表面波使破碎腔内的所述待检测样品溶液高速旋转；

若干微纳柱体，布置于所述破碎腔内，用于与所述待检测样品溶液进行碰撞。

所述微纳柱体为三棱柱形、四棱柱形或者六棱柱形。

所述核酸提取单元包括：

微流道，与所述破碎腔相连通；

第一微流控阀门，连通于所述微流道上靠近所述细胞破碎单元的一端，所述第一微流控阀门连通有缓冲池和清洗池；

第二微流控阀门，连通于所述微流道上靠近所述LAMP扩增单元的一端，所述第二微流控阀门连通有废液池；

磁珠，设于所述微流道内，用于吸附细胞液中的核酸，所述磁珠限位于所述第一微流控阀门和第二微流控阀门之间的微流道内。

所述第一微流控阀门沿轴向自下而上依次设置有主流道，第一流道和第二流道；

所述破碎腔通过所述主流道与所述微流道相连通；

所述清洗池通过所述第一流道与所述微流道相连通；

所述缓冲池通过所述第二流道与所述微流道相连通；

所述第二微流控阀门沿轴向自上而下依次设置有第三流道和第四流道；

所述微流道通过所述第三流道与所述LAMP扩增单元相连通；

所述微流道通过所述第四流道与所述废液池相连通。

所述核酸提取单元还包括：

第三叉指换能器，至少设置有两个，用于向所述微流道输出表面波使微流道内的细胞液高速旋转，所述第三叉指换能器交错设置于所述微流道的两侧，且位于所述第一微流控阀门和第二微流控阀门之间。

所述LAMP扩增单元，包括：

若干分流道，平行并列设置，所述若干分流道分流分别连通于所述微流道远离所述破碎腔的端部，用于对核酸溶液进行分流；

反应槽，连通于所述分流道远离微流道的端部，用于容置LAMP反应液和混合染料。

所述反应槽为圆柱形，所述反应槽的深宽比为5:1。

该微流控芯片还包括：

第二叉指换能器，用于沿细胞液的流动方向输出声表面波，以驱动所述破碎腔内的细胞液输送至微流道。

该微流控芯片还包括：

缓冲流道，连通于所述破碎腔与所述微流道之间，用于减缓细胞液从破碎腔进入微流道的流道阻力。

该微流控芯片还包括：

加热单元，用于为所述LAMP扩增单元提供反应温度；

温度检测单元，设置于所述LAMP扩增单元上，用于测定核酸扩增反应时的温度。

本发明还提供了一种所述的微流控芯片用于DNA检测的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)反应试剂的注入：将LAMP反应液和混合染料溶液混合均匀后，注入LAMP扩增单元，经干燥将LAMP反应液中的LAMP反应物和混合染料溶液中的混合染料固定于芯片内，将缓冲液和清洗液分别注入缓冲池和清洗池；

(2)细胞破碎、核酸提取和扩增：将待检测样品溶液注入细胞破碎单元，在毛细管作用下，待检测样品溶液中的细胞经过细胞破碎单元的破碎后，输送至核酸提取单元，通过核酸提取单元从破碎处理后的所述细胞液中提取核酸，然后分离核酸和提取核酸后剩余的细胞残液，并将所述核酸输送至LAMP扩增单元，进行等温扩增反应；

(3)结果判读：直接肉眼判读和/或利用设备进行颜色判读。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的用于DNA提取的微流控芯片，通过细胞破碎单元能够破碎待检测样品溶液中的细胞，并将破碎后得到的细胞液输送至核酸提取单元；通过核酸提取单元能够从上述细胞液中提取核酸，分离所述核酸和提取核酸后剩余的细胞残液，并将所述核酸输送至LAMP扩增单元；通过LAMP扩增单元，能够供所述核酸进行LAMP扩增以及使扩增后产物显色，因此，通过细胞破碎单元、核酸提取单元和LAMP扩增单元的设置，使得本发明的微流控芯片可以依次完成细胞破碎、核酸提取和扩增显色的过程，而且检测过程不需要借助大型仪器，方便携带，而且在细胞破碎和DNA提取步骤也不需要对细胞液和各种试剂进行反复手动处理，简化操作，同时通过肉眼即可检测，整个DNA提取和检测时间短，效率高，方便于实验室以外的现场实施快速检测。

2.本发明提供的用于DNA提取的微流控芯片，通过第一叉指换能器向破碎腔内输出声表面波，声表面波使破碎腔内的待检测样品溶液高速旋转，待检测样品溶液中的细胞能够与破碎腔内布置的微纳柱体不断碰撞，细胞破碎，得到破碎后的细胞液；进一步地，通过使用三棱柱形、四棱柱形或者六棱柱形的微纳柱体，待检测样品溶液中的细胞能够与微纳柱体的各个棱进行碰撞，从而加速了细胞的破碎。

3.本发明提供的用于DNA提取的微流控芯片，通过设有微流道、第一微流控阀门和第二微流控阀门的核酸提取单元，磁珠限位于所述第一微流控阀门和第二微流控阀门之间的微流道内，初始状态下，破碎腔通过第一微流控阀门上的主流道与微流道相连通，废液池通过第二微流控阀门上的第四流道与微流道相连通，当经过细胞破碎单元处理后的细胞液进入微流道时，细胞液中的核酸被磁珠吸附，向下按压第一微流控阀门，使得清洗池与微流道相连通，清洗池内的清洗液输送至微流道，并与磁珠吸附核酸后剩余的细胞残夜一起输送至废液池，使得细胞残液排出微流道；然后，再次向下按压第一微流控阀门和第二微流控阀门，使缓冲池与微流道相连通，微流道与LAMP扩增单元连通，缓冲池内的缓冲液输送至微流道将DNA从磁珠上洗脱下来溶于缓冲液中，并输送至LAMP扩增单元进行扩增反应；整个DNA提取过程，无需反复冲洗和离心操作，只需手动控制第一微流控阀门和第二微流控阀门，操作简单，高效，同时也降低了人为操作误差。

4.本发明提供的用于DNA提取的微流控芯片，由于现有技术中的微流道内液体流动是通过毛细管作用驱动的，而毛细管作用为层流运动，不利于细胞液中的DNA与磁珠充分接触，通过第三叉指换能器的设置，向微流道内输出声表面波，使微流道内的细胞液高速旋转，不断搅动，从而增加了磁珠与核酸的接触几率，使得更多的核酸吸附到磁珠上，而且在缓冲液洗脱核酸时，也更容易将核酸从磁珠上洗脱下来，使得能够将更多的核酸输送至LAMP扩增单元。

5.本发明提供的用于DNA提取的微流控芯片，通过第二叉指换能器的设置，使得破碎腔内的细胞液声表面波和毛细管作用的双重驱动下，输送至微流道，通过第二叉指换能器使细胞液高速旋转，不仅促进破碎腔内细胞的破碎，进一步扩大细胞破碎范围，避免出现死角，提高细胞破碎率，而且使细胞液在输送过程中维持混匀状态，从而增大了核酸提取过程中细胞液中的核酸与磁珠的接触几率。

6.本发明提供的用于DNA提取的微流控芯片，通过包括若干分流道的设置，对主流道中的细胞液进行分流，细胞液进入各个分流道对应的反应槽中进行LAMP扩增反应，使得通过一次进样即可实现多次检测，提高检测效率和准确性，而且通过分流道的设置，避免了各个反应槽中的细胞液相互干扰，进一步提高检测的准确性，进一步地，LAMP反应体系为15-20μl，通过控制反应槽的深宽比为5:1，不仅能够从俯视角度看到更加明显的颜色变化情况，提高检测的准确度，同时也有利于提高LAMP反应的受热均匀性，使数据更加可靠。

7.本发明提供的用于DNA提取的微流控芯片，通过加热单元为核酸扩增反应提供反应温度；温度检测单元测定LAMP扩增单元的温度，LAMP扩增反应的温度为63±2℃，进行扩增反应时，当温度检测单元检测到LAMP扩增单元的温度低于63±2℃时，启动加热单元使LAMP扩增单元升温，当LAMP扩增单元的温度达到或者超过63±2℃，关闭加热单元，使得LAMP扩增单元的温度维持在63±2℃，以保证LAMP扩增反应的顺利进行。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例中提供的一个具体实施方式的微流控芯片的结构示意图；

图2为本发明实施例中提供的一个具体实施方式的第一微流控阀门的结构示意图；

图3为本发明实施例中提供的一个具体实施方式的第二微流控阀门的结构示意图；

图4为本发明实施例中提供的一个具体实施方式的LAMP扩增单元的组成框图；

图5为本发明实施例中提供的一个具体实施方式的破碎腔和微流道的结构示意图；

附图标记说明：

1、细胞破碎单元；11、第一叉指换能器；12、破碎腔；13、微纳柱体；14、第二叉指换能器；15、缓冲流道；2、核酸提取单元；21、微流道；22、第一微流控阀门；221、主流道；222、第一流道；223、第二流道；23、第二微流控阀门；231、第三流道；232、第四流道；24、第三叉指换能器；25、缓冲池；26、清洗池；27、废液池；3、LAMP扩增单元；31、分流道；32、反应槽；4、加热单元；5、温度检测单元；6、细胞液注入泵。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

实施例

本发明实施例提供一种用于DNA提取的微流控芯片，如图1所示，包括细胞破碎单元1、核酸提取单元2和LAMP扩增单元3；其中，细胞破碎单元1，用于破碎待检测样品溶液中的细胞并将破碎后得到的细胞液输送至核酸提取单元2；核酸提取单元2，从细胞液中提取核酸，分离核酸和提取核酸后剩余的细胞残液，并将核酸输送至LAMP扩增单元3；LAMP扩增单元3，供核酸进行LAMP扩增反应以及供扩增后得到的产物进行显色反应。

通过上述细胞破碎单元1、核酸提取单元2和LAMP扩增单元3，本发明实施例提供的微流控芯片能够依次完成细胞破碎、核酸提取和扩增显色的过程，检测过程不需要借助大型仪器，方便携带，而且在细胞破碎过程和DNA提取过程中也不需要对细胞液和清洗液、缓冲液等各种试剂进行反复处理，简化操作，同时通过肉眼即可检测，检测时间短，效率高。

具体地，如图1所示，本发明实施例中，上述细胞破碎单元1包括：

破碎腔12，用于容置待检测样品溶液；第一叉指换能器11，用于向所述破碎腔12输出声表面波使破碎腔12内的所述待检测样品溶液高速旋转；若干微纳柱体13，布置于所述破碎腔12内，用于与待检测样品溶液进行碰撞。

其中，所述微纳柱体13为三棱柱形、四棱柱形或者六棱柱形，细胞破碎过程中，待检测样品溶液中的细胞能够与微纳柱体13的各个棱进行碰撞，加速了细胞破碎，为了提高细胞的破碎率，如图1所示，优选三棱柱形的微纳柱体13。

本发明的实施例中，多个微纳柱体13平行阵列布置于破碎腔12内，微纳柱体13的边长均为100微米，相邻的微纳柱体13的间距为50微米，各个微纳柱体13的高度与破碎腔12的深度相同。

在其他实施例中，细胞破碎单元1可以包括多个第一叉指换能器11，各个第一叉指换能器11的输出端均指向破碎腔12，向破碎腔12输出声表面波。

细胞破碎单元1的工作过程主要包括：当第一叉指换能器11接通电源后，第一叉指换能器11中的叉指电极发出声表面波，输送至破碎腔12，带动破碎腔12内的细胞液高速旋转，细胞液中的细胞与微纳柱体13碰撞，使得细胞膜破碎。

为了便于向破碎腔12内注入待检测样品溶液，细胞破碎单元1还包括细胞液注入泵6，所述细胞液注入泵6的样品出口与破碎腔12相连通，通过细胞液注入泵6提供动力，将待检测样品溶液泵入破碎腔12中。

如图1所示，所述核酸提取单元2包括：

微流道21，与所述破碎腔12相连通；

第一微流控阀门22，连通于所述微流道21上靠近所述细胞破碎单元1的一端，所述第一微流控阀门22分别连通有缓冲池25和清洗池26；第一微流控阀门22用于控制微流道21与细胞破碎单元1、缓冲池25或者清洗池26中的一个相连通。

第二微流控阀门23，连通于所述微流道21上靠近所述LAMP扩增单元3的一端，所述第二微流控阀门23连通有废液池27；第二微流控阀门23用于控制微流道21与废液池27或者LAMP扩增单元3中的一个相连通。

磁珠，设于所述微流道21内，用于吸附细胞液中的核酸，所述磁珠限位于所述第一微流控阀门22和第二微流控阀门23之间的微流道21内。磁珠的粒径大于第一微流控阀门22和第二微流控阀门23的通道的大小。

本发明实施例中，如图1所示，缓冲池25和清洗池26分别设置于所述微流道21的两侧。

具体地，如图2和3所示，所述第一微流控阀门22沿轴向自下而上依次设置有主流道221，第一流道222和第二流道223；

所述破碎腔12通过所述主流道221与所述微流道21相连通；

所述清洗池26通过所述第一流道222与所述微流道21相连通；

所述缓冲池25通过所述第二流道223与所述微流道21相连通；

所述第二微流控阀门23沿轴向自上而下依次设置有第三流道231和第四流道232；

所述微流道21通过所述第三流道231与所述LAMP扩增单元3相连通；

所述微流道21通过所述第四流道232与所述废液池27相连通。

进一步地，废液池27与微流道21在高度上分层设置，废液池27位于微流道21的下方。

核酸提取单元2的工作情况，初始状态，破碎腔12通过第一微流控阀门22上的主流道221与微流道21相连通，废液池27通过第二微流控阀门23上的第四流道232与微流道21相连通；当经过细胞破碎单元1处理后的细胞液进入微流道21时，细胞液的核酸被磁珠吸附，向下按压第一微流控阀门22，使得清洗池26经第一流道222与微流道21相连通，然后清洗池26内的清洗液向微流道21方向流动，将磁珠吸附核酸后剩余的细胞残液一起输送至废液池27，使得细胞残液排出微流道21；然后，再次向下按压第一微流控阀门22和第二微流控阀门23，使缓冲池25经第二流道223与微流道21相连通，微流道21经第四流道231与LAMP扩增单元3连通，缓冲池25内的缓冲液向微流道21方向流动，将DNA从磁珠上洗脱下来溶于缓冲液中，并输送至LAMP扩增单元3，整个DNA提取过程，无需反复冲洗和离心操作，只需手动控制第一微流控阀门22和第二微流控阀门23，操作简单，高效，同时降低人为操作产生的误差。

为了促进磁珠对核酸的吸附以将更多的核酸输送至LAMP扩增单元3进行扩增反应，如图1所示，所述核酸提取单元2还包括：

第三叉指换能器24，至少设置有两个，用于向所述微流道21输出表面波使微流道21内的细胞液高速旋转，所述第三叉指换能器24者设置于所述微流道21的两侧，且位于所述第一微流控阀门22和第二微流控阀门23之间，本发明中两个第三叉指换能器24交错设置于所述微流道21的两侧。

为了扩大破碎范围、避免出现死角而提高细胞破碎率，该微流控芯片还包括：

第二叉指换能器14，用于沿细胞液的流动方向输出声表面波，以驱动所述破碎腔12内的细胞液输送至微流道21。

为了减缓细胞液从破碎腔12进入微流道21的流道阻力，使更多的细胞输送至微流道21，该微流控芯片还包括：缓冲流道15，连通于所述破碎腔12与所述微流道21之间。

本发明的实施例中，缓冲流道15为三角形流道，缓冲流道15的两端分别与破碎腔12与所述微流道21的宽度相匹配，在其他实施例中，也可以在缓冲流道15与微流道21的接触处、缓冲流道15与破碎腔12的接触处设置圆角，进一步降低细胞液的流动阻力。

如图5所示，破碎腔12的高度在50-500μm之间，微流道21的高度在50-100μm之间，且破碎腔12的高度大于微流道21的高度，破碎腔12的底面和微流道21的底面位于同一水平面上，不仅能够扩大破碎腔12的空间，进而提供细胞高速旋转和冲撞破碎腔壁的空间，使细胞破裂更加充分，而且通过破碎腔12与微流道21之间的高度差还能为细胞液向微流道21方向流动提供重力流体支持。

具体地，所述LAMP扩增单元3，包括：若干分流道31，平行并列设置，所述分流道31分流分别连通于所述微流道21远离所述破碎腔12的端部，用于对核酸溶液进行分流；反应槽32，连通于所述分流道31远离微流道21的端部，用于容置LAMP反应液和混合染料供所述核酸进行LAMP扩增反应和显色反应。通过分流道31对主流道221进行分流，细胞液经分流道31进入各个分流道31连通的反应槽32中进行LAMP扩增反应，使得通过一次进样即可实现多次检测，提高检测效率和准确性，而且通过分流道的设置，避免了各个反应槽中的样本相互干扰，进一步提高检测的准确性。

进一步，所述反应槽32为圆柱形，所述反应槽32的深宽比为5:1，通过控制反应槽32的深宽比为5:1，不仅能够从俯视角度看到更加明显的颜色变化情况，提高检测的准确度，同时也有利于提高LAMP反应的受热均匀性，使数据更加可靠。

本发明的微流控芯片采用硅基片加工而成，不仅加工方便，也有利于各种叉指换能器的电源接头的溅射和扩散工艺，其中微流控芯片还包括顶部的盖片，盖片与硅基片键合在一起，盖片为透明玻璃或者透明塑料，有助于观察液体的流动位置和反应现象等。

本发明中，第一叉指换能器11和第三叉指换能器24为表面横波叉指换能器，用于对流体进行搅拌，使细胞液高速旋转，第二叉指换能器14为瑞利波叉指换能器，用于对流体的驱动，促使细胞液在声波传播路径上移动。表面横波叉指换能器和瑞利波叉指换能器的工作频率不同。

还包括：加热单元4，用于为LAMP扩增单元3提供反应温度；温度检测单元5，设置于所述LAMP扩增单元3上，用于测定核酸扩增反应时的温度。

本发明实施例中，加热单元4可以为微型加热板，设置于微流控芯片上对应于反应槽32的位置，为反应槽32进行加热，以提供核酸扩增反应所需的温度，温度检测单元5可以为微型温度传感器，检测反应槽32内液体的温度。

LAMP扩增反应的温度为63±2℃，当微型温度传感器检测到反应槽32内液体的温度小于63±2℃时，通过启动微型加热板对反应槽32进行加热，当反应槽32的温度达到63±2℃时，关闭加热单元4，使得LAMP扩增单元3的温度维持在63±2℃，以保证LAMP扩增反应的顺利进行。

在其他实施例中，也可以将微流控芯片放置于恒温装置上，为核酸扩增反应提供反应温度。

本实施例还提供上述微流控芯片用于DNA检测的检测方法，包括如下步骤：

(1)反应试剂的注入：将LAMP反应液和混合染料溶液混合均匀后，注入LAMP扩增单元3，晾干，真空干燥30-60min，使LAMP反应液中的LAMP反应物和混合染料溶液中的混合染料固定于芯片内，然后将缓冲液注入缓冲池25，清洗液注入清洗池26中；

(2)细胞破碎、核酸提取和扩增：将待检测样品溶液注入微流控芯片，在毛细管作用下，样品溶液中的细胞经过细胞破碎单元1的破碎后，输送至核酸提取单元2，通过核酸提取单元2从破碎处理后的所述细胞液中提取核酸，然后分离核酸和提取核酸后剩余的细胞残液，并将所述核酸输送至LAMP扩增单元3，进行等温扩增反应；

(3)结果判读：直接肉眼判读和/或利用设备进行颜色判读。

LAMP反应过程中产生大量的焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼直接观察，但是不易判断，通过添加染料的方式可以达到肉眼直接判断的目的，目前常用的染料主要有钙黄绿素、羟基萘酚黄(HNB)等，HNB是一种金属指示剂，原理是镁离子与HNB结合使得反应体系的初始颜色为紫罗兰色，随着反应的进行，镁离子与析出的焦磷酸根离子反应生成焦磷酸镁沉淀，HNB失去镁离子使得体系颜色变成天蓝色，而阴性体系则仍保持罗蓝色，以此判断LMAP反应的结果。为了更容易判断，使阴、阳性反应体系结果间颜色差异显著明显，减少对结果误判的情况，本发明采用钙黄绿素、氯化锰和羟基萘酚蓝的去核酸酶溶液的混合染料，阳性反应液为绀蓝色，阴性反应液为浅灰色。

作为上述检测方法的另一种可替换的实施方式，包括如下步骤：

(1)反应试剂的注入：将LAMP反应液和的混合染料溶液混合均匀后，注入LAMP扩增单元3，晾干，真空干燥30-60min，LAMP反应物和混合染料固定于芯片内，然后将缓冲液注入缓冲池25，将清洗液注入清洗池26中，其中LAMP反应液包括甜菜碱，dNTP、硫酸镁溶液、等温扩增缓冲液、引物、DNA聚合酶和DNA模板；混合染料包括钙黄绿素、氯化锰和羟基萘酚蓝的去核酸酶溶液。

(2)细胞破碎、核酸提取和扩增：将待检测样品溶液加入细胞注入泵6中，通过细胞注入泵6向破碎腔12中注入待检测样品溶液，待检测样品溶液中的细胞经过细胞破碎单元1的破碎后，然后在微流控芯片的毛细管作用和第二叉指换能器14的双重驱动下，经缓冲流道15输送至微流道21；

在第三叉指换能器24的声表面波作用下，微流道21中的细胞液高速旋转，同时磁珠对细胞液中的核酸不断进行吸附，吸附完成后，向下按压第一微流控阀门22，使得清洗池26经第一流道222与微流道21相连通，然后清洗池26内的清洗液向微流道21方向流动，将磁珠吸附核酸后剩余的细胞残液一起输送至废液池27，使得细胞残液排出微流道21；然后，再次向下按压第一微流控阀门22和第二微流控阀门23，使缓冲池25经第二流道223与微流道21相连通，微流道21经第四流道231与LAMP扩增单元3连通，缓冲池25内的缓冲液向微流道21方向流动，将DNA从磁珠上洗脱下来溶于缓冲液中，并输送至分流道31，经过分流道31输送至反应槽32，通过微型温度传感器和微型加热板，使反应槽32的温度维持在63±2℃，核酸进行扩增反应，1小时后结束反应。

(3)结果判读：在自然光下，直接肉眼判读进行颜色判读，根据反应混合物显示的反应槽32浊度的变化对检测结果进行判断，通过观察反应槽32有无颜色变化，反应体系为绀蓝色，则判断检测结果为阳性，反应体系为浅灰色则为阴性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (12)

1.一种用于DNA提取的微流控芯片，其特征在于，包括：细胞破碎单元(1)、核酸提取单元(2)和LAMP扩增单元(3)；其中，

所述细胞破碎单元(1)，用于破碎待检测样品溶液中的细胞并将破碎后得到的细胞液输送至核酸提取单元(2)；

所述核酸提取单元(2)，从所述细胞液中提取核酸，分离所述核酸和提取核酸后剩余的细胞残液，并将所述核酸输送至LAMP扩增单元(3)；

所述LAMP扩增单元(3)，供所述核酸进行LAMP扩增以及供核酸扩增后的产物进行显色反应。

2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述细胞破碎单元(1)包括：

破碎腔(12)，用于容置所述待检测样品溶液；

第一叉指换能器(11)，用于向所述破碎腔(12)输出声表面波使破碎腔(12)内的所述待检测样品溶液高速旋转；

若干微纳柱体(13)，布置于所述破碎腔(12)内，用于与所述待检测样品溶液进行碰撞。

3.根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述微纳柱体(13)为三棱柱形、四棱柱形或者六棱柱形。

4.根据权利要求2或3所述的微流控芯片，其特征在于，所述核酸提取单元(2)包括：

微流道(21)，与所述破碎腔(12)相连通；

第一微流控阀门(22)，连通于所述微流道(21)上靠近所述细胞破碎单元(1)的一端，所述第一微流控阀门(22)连通有缓冲池(25)和清洗池(26)；

第二微流控阀门(23)，连通于所述微流道(21)上靠近所述LAMP扩增单元(3)的一端，所述第二微流控阀门(23)连通有废液池(27)；

磁珠，设于所述微流道(21)内，用于吸附细胞液中的核酸，所述磁珠限位于所述第一微流控阀门(22)和第二微流控阀门(23)之间的微流道(21)内。

5.根据权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于，所述第一微流控阀门(22)沿轴向自下而上依次设置有主流道(221)，第一流道(222)和第二流道(223)；

所述破碎腔(12)通过所述主流道(221)与所述微流道(21)相连通；

所述清洗池(26)通过所述第一流道(222)与所述微流道(21)相连通；

所述缓冲池(25)通过所述第二流道(223)与所述微流道(21)相连通；

所述第二微流控阀门(23)沿轴向自上而下依次设置有第三流道(231)和第四流道(232)；

所述微流道(21)通过所述第三流道(231)与所述LAMP扩增单元(3)相连通；

所述微流道(21)通过所述第四流道(232)与所述废液池(27)相连通。

6.根据权利要求4或5所述的微流控芯片，其特征在于，所述核酸提取单元(2)还包括：

第三叉指换能器(24)，至少设置有两个，用于向所述微流道(21)输出表面波使微流道(21)内的细胞液高速旋转，所述第三叉指换能器(24)交错设置于所述微流道(21)的两侧，且位于所述第一微流控阀门(22)和第二微流控阀门(23)之间。

7.根据权利要求4或5所述的微流控芯片，其特征在于，所述LAMP扩增单元(3)，包括：

若干分流道(31)，平行并列设置，所述若干分流道(31)分流分别连通于所述微流道(21)远离所述破碎腔(12)的端部，用于对核酸溶液进行分流；

反应槽(32)，连通于所述分流道(31)远离微流道(21)的端部，用于容置LAMP反应液和混合染料。

8.根据权利要求7所述的微流控芯片，其特征在于，所述反应槽(32)为圆柱形，所述反应槽(32)的深宽比为5:1。

9.根据权利要求4或5所述的微流控芯片，其特征在于，该微流控芯片还包括：

第二叉指换能器(14)，用于沿细胞液的流动方向输出声表面波，以驱动所述破碎腔(12)内的细胞液输送至微流道(21)。

10.根据权利要求4或5所述的微流控芯片，其特征在于，该微流控芯片还包括：

缓冲流道(15)，连通于所述破碎腔(12)与所述微流道(21)之间，用于减缓细胞液从破碎腔(12)进入微流道(21)的流道阻力。

11.根据权利要求4或5所述的微流控芯片，其特征在于，该微流控芯片还包括：

加热单元(4)，用于为所述LAMP扩增单元(3)提供反应温度；

温度检测单元(5)，设置于所述LAMP扩增单元(3)上，用于测定核酸扩增反应时的温度。

12.一种如权利要求1-11中任一项所述的微流控芯片用于DNA检测的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)反应试剂的注入：将LAMP反应液和混合染料溶液混合均匀后，注入LAMP扩增单元(3)，经干燥将LAMP反应液中的LAMP反应物和混合染料溶液中的混合染料固定于芯片内，将缓冲液和清洗液分别注入缓冲池(25)和清洗池(26)；

(2)细胞破碎、核酸提取和扩增：将待检测样品溶液注入细胞破碎单元(1)，在毛细管作用下，待检测样品溶液中的细胞经过细胞破碎单元(1)的破碎后，输送至核酸提取单元(2)，通过核酸提取单元(2)从破碎处理后的所述细胞液中提取核酸，然后分离核酸和提取核酸后剩余的细胞残液，并将所述核酸输送至LAMP扩增单元(3)，进行等温扩增反应；

(3)结果判读：直接肉眼判读和/或利用设备进行颜色判读。